BRPI0509888B1

BRPI0509888B1 - Compostos miméticos de direção inversa, composição farmacêutica e usos terapêuticos dos mesmos

Info

Publication number: BRPI0509888B1
Application number: BRPI0509888-2A
Authority: BR
Inventors: Sung Hwan Moon; Jae Uk Chung; Sung Chan Lee; Masakatsu Eguchi; Michael Kahn; Kwang Won Jeong; Cu Nguyen; Soo Jin Lee
Original assignee: Choongwae Pharma Corporation
Priority date: 2004-04-16
Filing date: 2005-04-15
Publication date: 2021-10-13
Also published as: MXPA06011983A; RU2006140383A; JP5021459B2; BRPI0509888A; US8729262B2; KR20070008637A; US20070021425A1; CN1942472B; WO2005116032A3; AU2005247859A1; US20110257185A1; AU2005247859B2; NZ550691A; CA2562693C; CA2562693A1; US7576084B2; KR101257824B1; US8101751B2; US20150057283A1; RU2434017C2

Abstract

miméticos de direção inversa e método relacionado aos mesmos. são divulgados compostos comprimidos de maneira conformacional que copiam a estrutura secundária de regiões de direção inversa de peptídeos e proteínas biologicamente ativos. tais estruturas miméticas de direção inversa têm utilidade sobre uma ampla faixa de campos, incluindo o uso como agentes diagnósticos e terapêuticos. são também divulgadas bibliotecas contendo as estruturas miméticas de direção inversa desta invenção, assim como métodos para a triagem das mesmas para identificar membros biologicamente ativos. a invenção também se relaciona ao uso de tais compostos para inibir ou tratar distúrbios modulados pela via de sinalização de wnt, tais como o câncer, especialmente o câncer colorretal, a reestenose associada com a angioplastia, a doença do rim policístico, a doença da angiogênese anormal, a doença de artrite reumatóide, o complexo de esclerose tuberosa, a doença de alzheimer, o crescimento ou a perda em excesso de cabelo, ou a colite ulcerativa.

Description

REFERÊNCIAS CRUZADAS A PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido é uma continuação em parte do pedido de patente U.S. co- pendente No de série 10/826.972, depositado em 16 de abril de 2004, que é uma continuação em parte do pedido de patente U.S. co-pendente No de série 10/803.179, depositado em 17 de março de 2004, que é uma continuação em parte do pedido de patente U.S. No de série 10/411.877, depositado em 9 de abril de 2003 (agora abandonado), que é uma continuação em parte do pedido de patente U.S. No de série 10/087.443, depositado em 01 de março de 2002 (agora abandonado), que é uma continuação em parte do pedido de patente U.S. No de série 09/976.470, depositado em 12 de outubro de 2001 (agora abandonado). Este pedido também reivindica prioridade para o pedido PCT No de série PCT/KR02/01901, depositado em 11 de outubro de 2002. As divulgações destes pedidos são incorporadas aqui por referência em suas totalidades.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO Campo da Invenção

[002] A presente invenção relaciona-se, de um modo geral, a estruturas miméticas de direção inversa e a uma biblioteca química que se relaciona às mesmas. A invenção também se relaciona a aplicações no tratamento de condições médicas, p.ex., doenças de câncer, e a composições farmacêuticas compreendendo os miméticos.

Descrição da Técnica Relacionada

[003] A triagem aleatória de moléculas quanto a uma atividade possível como agentes terapêuticos tem ocorrido por muitos anos e resultou em diversas descobertas de drogas importantes. Embora os avanços na biologia molecular e na química computacional tenham resultado em interesse aumentado no que tem sido chamado “projeto de droga racional”, tais técnicas não provaram ser tão rápidas ou confiáveis quanto inicialmente predito. Assim, nos anos recentes, tem havido um interesse renovado e um retorno à triagem aleatória de drogas. Para esta finalidade, têm sido feitos progressos particulares em novas tecnologias baseadas no desenvolvimento de bibliotecas combinatórias de química, e na triagem de tais bibliotecas na busca por membros biologicamente ativos.

[004] Em geral, as bibliotecas combinatórias de química são simplesmente uma coleção de moléculas. Tais bibliotecas variam pelas espécies químicas dentro da biblioteca, bem como pelos métodos empregados tanto para gerar os membros da biblioteca quanto para identificar quais membros interagem com os alvos biológicos de interesse. Embora este campo ainda seja novo, os métodos para gerar e examinar as bibliotecas já se tornaram bem diversos e sofisticados. Por exemplo, uma revisão recente de várias bibliotecas combinatórias químicas identificou diversas tais técnicas (Dolle, J. Com. Chem., 2(3): 383-433, 2000), incluindo o uso de membros da biblioteca tanto visados quanto não visados (Janda, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10779-10785, 1994).

[005] Inicialmente, as bibliotecas combinatórias de química eram geralmente limitadas aos membros de origem peptídica ou nucleotídica. Para esta finalidade, as técnicas de Houghten e col. ilustram um exemplo do que é chamado um método “iterativo duplamente definido” para agrupar bibliotecas combinatórias de peptídeos solúveis via técnicas de síntese de divisão (Nature (Londres) 354:84-86, 1991; Biotechniques 13:412-421, 1992; Bioorg. Med. Chem. Lett. 3:405-412, 1993). Por esta técnica, foram obtidas bibliotecas de peptídeos solúveis contendo dezenas de milhões de membros. Tais bibliotecas têm sido mostradas serem efetivas na identificação de peptídeos opióides, tais como metionina- e leucina-encefalina (Dooley e Houghten, Life Sci. 52, 1509-1517, 1993), e uma biblioteca de peptídeo N- acilado tem sido usada para identificar acetalinas, que são antagonistas de opióides potentes (Dooley e col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10811-10815, 1993). Mais recentemente, uma biblioteca de peptídeos opióides de aminoácidos todos D foi construída e examinada quanto à atividade analgésica contra o receptor de opióide mu (“μ“) (Dooley e col, Science 266:2019-2022, 1994).

[006] Embora as bibliotecas combinatórias contendo membros de origem peptídica e nucleotídica sejam de valor significativo, há ainda uma necessidade na técnica por bibliotecas contendo membros de origem diferente. Por exemplo, as bibliotecas de peptídeos tradicionais até uma grande proporção variam meramente a seqüência de aminoácidos para gerar os membros das bibliotecas. Embora seja bem reconhecido que as estruturas secundárias dos peptídeos são importantes para a atividade biológica, tais bibliotecas de peptídeos não conferem uma estrutura secundária comprimida aos seus membros das bibliotecas.

[007] Para este fim, alguns pesquisadores têm ciclizado os peptídeos com pontes de dissulfeto em uma tentativa de proporcionar uma estrutura secundária mais comprimida (Tumelty e col., J.Chem.Soc. 1067-68, 1994; Eichler e col., Peptide Res. 7:300-306, 1994). Entretanto, tais peptídeos ciclizados ainda são geralmente bem flexíveis e estão insatisfatoriamente biodisponíveis, e assim têm obtido somente sucesso limitado.

[008] Mais recentemente, foram desenvolvidos compostos não peptídicos que copiam mais proximamente a estrutura secundária de direções inversas encontradas em proteínas ou peptídeos biologicamente ativos. Por exemplo, a Pat. U.S. No 5.440.013 para Kahn e os pedidos PCT publicados nos WO94/03494, WO01/00210A1, e WO01/16135A2 para Kahn, cada um, divulgam compostos não peptídicos, comprimidos de maneira conformacional, que copiam a estrutura tridimensional de direções inversas. Além disso, a Pat. U.S. No 5.929.237 e a sua continuação em parte Pat. U.S. No 6.013.458, ambas para Kahn, divulgam compostos comprimidos de maneira conformacio-nal que copiam a estrutura secundária de regiões de direção inversa de peptídeos e proteínas biologicamente ativos. A síntese e a identificação de miméticos da direção inversa, comprimidos de maneira conformacional, e a sua aplicação a doenças foram bem revistas por Obrecht (Advances in Med. Chem., 4, 1-68, 1999).

[009] Embora tenham sido feitos avanços significativos na síntese e na identificação de miméticos da direção inversa, comprimidos de maneira conformacional, permanece uma necessidade na técnica por pequenas moléculas que copiem a estrutura secundária dos peptídeos. Há também uma necessidade na técnica por bibliotecas contendo tais membros, assim como técnicas para a síntese e a triagem dos membros da biblioteca contra alvos de interesse, particular-mente os alvos biológicos, para identificar membros bioativos da biblioteca.

[0010] A presente invenção também preenche estas necessi-dades, e proporciona vantagens relacionadas adicionais pro-porcionando compostos comprimidos de maneira conformacional que copiam a estrutura secundária de regiões de direção inversa inversas de peptídeos e proteínas biologicamente ativos.

[0011] A via de sinalização de Wnt regula uma variedade de processos, incluindo o crescimento, a oncogênese, e o desenvolvimento da célula (Moon e col., 1997, Trends Genet. 13, 157-162; Miller e col., 1999, Oncogene 18, 7860-7872; Nusse e Varmus, 1992, Cell 69, 1073-1087; Cadigan e Nusse, 1997, Genes Dev. 11, 3286-3305; Peifer e Polakis, 2000 Science 287, 1606-1609; Polakis 2000, Genes Dev. 14, 1837-1851). A via de sinalização de Wnt tem sido intensamente estudada em uma variedade de organismos. A ativação da transcrição mediada por TCF4/β- catenina por transdução de sinal de Wnt foi verificada desempenhar um papel-chave em suas funções biológicas (Molenaar e col., 1996, Cell 86:391-399; Gat e col., 1998 Cell 95:605-614; Orford e col., 1999 J. Cell Biol. 146:855-868: Bienz e Clevers, 2000, Cell 103:311-20).

[0012] Na ausência de sinais de Wnt, o gene supressor de tumor adenomatous polyposis coli (APC) simultaneamente interage com a serina cinase glicogênio sintase cinase (CSK)-3β e a β-catenina (Su e col., 1993, Science 262, 1734-1737; Yost e col., 1996 Genes Dev. 10, 1443-1454: Hayashi e col., 1997, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 94, 242-247: Sakanaka e col., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 3020-3023: Sakanaka e William, 1999, J.Biol. Chem 274, 14090-14093). A fosforilação do APC pela GSK-3β regula a interação do APC com a β-catenina, que por sua vez regula a função de sinalização da β-catenina (B. Rubinfeld e col., Science 272, 1023, 1996). A sinalização de Wnt estabiliza a β-catenina, permitindo a sua translocação para o núcleo, onde ela interage com os membros da família de fatores de transcrição fator intensificador de linfóide (LEF1)/fator de células T (TCF4) (Behrens e col., 1996 Nature 382, 638-642: Hsu e col., 1998, Mol. Cell. Biol. 18, 4807-4818: Roose e col., 1999 Science 285, 1923-1926).

[0013] Recentemente, o c-myc, um oncogene conhecido, foi mostrado ser um gene-alvo para a transcrição mediada por β-catenina/TCF4 (He e col., 1998 Science 281 1509-1512: Kolligs e col., 1999 Mol. Cell. Biol. 19, 5696-5706). Muitos outros genes importantes, incluindo a ciclina D1, e a metaloproteinase, que estão também envolvidos na oncogênese, foram sido identificados serem regulados pela via transcricional de TCF4/beta-catenina (Crawford e col., 1999, Oncogene 18, 2883-2891: Shtutman e col., 1999, Proc.Natl. Acad.Sci., USA, 11, 5522-5527 : Tetsu e McCormick, 1999 Nature, 398, 422-426).

[0014] Além disso, a superexpressão de diversos mediadores a jusante da sinalização de Wnt foi verificada regular a apoptose (Moris e col., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 7950-7954 : He e col., 1999, Cell 99, 335-345 : Orford e col., 1999 J. Cell. Biol., 146, 855-868: Strovel e Sussman, 1999, Exp. Cell. Res., 253, 637-648). A superexpressão do APC em células de câncer colorretal humanas induziu a apoptose (Moris e col., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 7950-7954), a expressão ectópica da β-catenina inibiu a apoptose associada com a perda de ligação à matriz extracelular (Orford e col., 1999, J. Cell Biol. 146, 855-868). A inibição da transcrição por TCF4/β-catenina por expressão do mutante dominante- negativo de TCF4 bloqueou a sobrevivência da célula mediada por Wnt-1 e tornou as células sensíveis aos estímulos apoptóticos, tais como o agente anticâncer (Shaoqiong Chen e col., 2001, J. Cell. Biol., 152, 1, 87-96), e a mutação de APC inibe a apoptose, permitindo a expressão da survivina constitutiva, uma proteína antiapoptótica bem conhecida (Tão Zhang e col., 2001, Cancer Reserach, 62, 86648667).

[0015] Embora não tenham sido encontradas mutações no gene de Wnt no câncer humano, uma mutação no APC ou na β-catenina, conforme é o caso na maior parte dos tumores colorretais, resulta na ativação inapropriada do TCF4, na superexpressão de c-myc e na produção de crescimento neoplástico (Bubinfeld e col., 1997, Science, 275, 1790-1792 : Morin e col., 1997, Science, 275, 1787-1790 : Casa e col., 1999, Cell. Growth. Differ. 10, 369-376). O gene supressor de tumor (APC) está perdido ou desativado em 85% dos cânceres colorretais e em uma variedade de outros cânceres também (Kinzler e Vogelstein, 1996, Cell 87, 159-170). A função principal do APC é aquela de um regulador negativo da cascata de transdução de sinal de Wnt. Uma característica central desta via envolve a modulação da estabilidade e a localização de uma coleção citossólica de β-catenina por interação com um complexo à base de Axina grande que inclui o APC. Esta interação resulta na fosforilação da β-catenina, desse modo objetivando-a para a degradação.

[0016] As proteínas de ligação ao CREB (CBP)/p300 foram identificadas inicialmente em ensaios de interação de proteínas, primeiramente através de sua associação com o fator de transcrição CREB (Chrivia e col., 1993, Nature, 365, 855-859) e posteriormente através de sua interação com a proteína transformadora adenoviral E1A (Stein e col., 1990, J. Viol. 64, 4421-4427 : Eckner e col., 1994, Genes. Dev., 8, 869-884). A CBP tinha um potencial para participar em uma variedade de funções celulares, incluindo a função de co-ativador transcricional (Shikama e col., 1997, Trends. Cell. Biol., 7, 230-236 : Janknecht e Hunter, 1996, Nature, 383, 22-23). A CBP/p300 potencializa a ativação mediada pela β-catenina do promotor de siamois, um alvo conhecido de Wnt (Hecht e col., 2000, EMBO J. 19, 8, 1839-1850). A β-catenina interage diretamente com o domínio de ligação de CREB da CBP e a β-catenina sinergiza com a CBP para estimular a ativação transcricional de TCF4/β-catenina (Ken-Ichi Takemaru e Randall t. Moon, 2000 J. Cell. Biol., 149, 2, 249-254).

BREVE RESUMO DA INVENÇÃO

[0017] A partir destes antecedentes, é visto que o complexo de TCF- 4/β-catenina e CBP da via de Wnt pode ser considerado como moléculas-alvo para a regulação do cresci-mento da célula, oncogênese e apoptose das células, etc. Desse modo, a presente invenção dirige uma necessidade por compostos que bloqueiam a via transcricional de TCF4/β-catenina por inibição da CBP, e portanto pode ser usada para o tratamento de câncer, especialmente o câncer colorretal.

[0018] Em resumo, a presente invenção é dirigida a um novo tipo de compostos comprimidos de maneira conformacional, que copiam a estrutura secundária das regiões de direção inversa de peptídeos e proteínas biologicamente ativas. Esta invenção também divulga bibliotecas contendo tais compostos, bem como a síntese e a triagem das mesmas.

[0019] Os compostos da presente invenção têm a seguinte fórmula geral (I):

em que A é -(CHR3)- ou -(C=O)-, B é -(CHR4)-, -(C=O)-, D é -(CHR5)- ou - (C=O)-, E é -(ZR6)- ou -(C=O)-, G é -(XR7)n-, -(CHR7)-(NR8)-, -(C=O)-(XR9)-, ou - (C=O)-, W é -Y(C=O)-, -(C=O)NH-, -(SO2)- ou está ausente, Y é oxigênio, enxofre, ou -NH-, X e Z são independentemente nitrogênio ou CH, n = 0 ou 1; e R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8 e R9 são iguais ou diferentes e independentemente selecionados a partir de uma porção de cadeia lateral de aminoácido ou seu derivado, o restante da molécula, um ligante e um suporte sólido, e seus estereoisômeros.

[0020] Em uma modalidade em que A é -(CHR3)-, B é -(C=O)-, D é - (CHR5)-, E é -(C=O)-, e G é -(XR7)n-, os compostos desta invenção têm a seguinte fórmula (II):

em que W, X, Y e n são como definidos acima, e R1, R2, R3, R5 e R7 são como definidos na descrição detalhada que segue.

[0021] Em uma modalidade em que A é -(C=O)-, B é -(CHR4)-, D é - (C=O)-, E é -(ZR6)-, e G é -(C=O)-(XR9)-, os compostos desta invenção têm a seguinte fórmula (III):

em que W, X e Y são como definidos acima, Z é nitrogênio ou CH (com a condição que quando Z for CH, então X seja nitrogênio), e R1, R2, R4, R6 e R9 são como definidos na descrição detalhada que segue.

[0022] Em uma modalidade em que A é -(C=O)-, B é -(CHR4)-, D é - (C=O)-, E é -(ZR6)-, e G é (XR7)n-, os compostos desta invenção têm a seguinte fórmula geral (IV):

em que W, Y e Z são como definidos acima, Z é nitrogênio ou CH (quando Z for nitrogênio, então n é zero, e quando Z for CH, então X é nitrogênio e n não é zero), e R1, R2, R4, R6 e R7 são como definidos na descrição detalhada que segue.

[0023] Em certas modalidades, os compostos desta invenção têm a

em que Ra é um grupo fenila; um grupo fenila substituído tendo um ou mais substituintes, em que um ou mais substituintes são independentemente selecionados a partir de um ou mais de grupos amino, amidino, guanidino, hidrazino, amidazonila, C1-4 alquila amino, C1-4 dialquila amino, halogênio, perflúor C1-4 alquila, C1-4 alquila, C1-3 alcóxi, nitro, carbóxi, ciano, sulfurila, e hidroxila; um grupo benzila; um grupo benzila substituído com um ou mais substituintes, onde um ou mais substituintes são independentemente selecionados a partir de um ou mais de grupo amino, amidino, guanidino, hidrazino, amidazonila, C1-4 alquila amino, C1-4 dialquila amino, halogênio, perflúor C1-4 alquila, C1-3 alcóxi, nitro, carbóxi, ciano, sulfurila, e hidroxila; ou um grupo arila bicíclico tendo 8 a 11 membros no anel, o qual pode ter 1 a 3 heteroátomos selecionados a partir de nitrogênio, oxigênio ou enxofre; Rb é um grupo arila monocíclico tendo 5 a 7 membros no anel, o qual pode ter 1 a 2 heteroátomos selecionados a partir de nitrogênio, oxigênio ou enxofre, e o anel arila no composto pode ter um ou mais substituintes selecionados a partir de um grupo consistindo em grupos halogeneto, hidróxi, ciano, alquila inferior, e alcóxi inferior; Rc é um grupo C1-6 alquila, C1-6 alcóxi, perflúor C1-6 alquila saturado ou insaturado; e X1, X2, e X3 podem ser iguais ou diferentes e são independentemente selecionados a partir de hidrogênio, hidroxila, e haloge-neto.

[0024] A presente invenção também está relacionada aos pró- medicamentos que utilizam as bibliotecas contendo um ou mais compostos de fórmula (I). Um pró-medicamento é tipicamente projetado para liberar a droga ativa no corpo, durante ou após a absorção por hidrólise enzimática e/ou química. A abordagem de pró-medicamentos é um meio efetivo de melhorar a biodisponibilidade oral ou a administração i.v. de drogas insatisfatoriamente solúveis em água por derivação química até compostos mais solúveis em água. A abordagem de pró-medicamentos mais comumente utilizada para aumentar a solubilidade aquosa das drogas contendo um grupo hidroxila é produzir ésteres contendo um grupo ionizável; p.ex., o grupo fosfato, o grupo carboxilato, o grupo alquilamino (Fleisher e col., Advanced Drug Delivery Reviews, 115-130, 1996; Davis e col., Cancer Res., 7247-7253, 2002, Golik e col., Bioorg. Méd. Chem. Lett., 1837-1842, 1996).

[0025] Em certas modalidades, os pró-medicamentos da presente invenção têm a seguinte fórmula geral (VII): (VI)-Y-R10 onde (VI) é a fórmula geral (VI) como descrita acima; Y é oxigênio, enxofre, ou nitrogênio de um grupo selecionado a partir de Ra, Rb, Rc, X1, X2 e X3: R10 é fosfato, hemissuccinato, hemimalato, fosforiloximetiloxicarbonila, acetato de dimetilamino, carbamatos de dimetilaminoalquila, hidroxialquilas, aminoácido, glicosila, piperidina oxicarbonila substituída ou não substituída, ou um sal destes; e onde os pró-medicamentos são capazes de atuar como um substrato para uma fosfatase ou uma carboxilase e são, desse modo, convertidos nos compostos tendo a fórmula geral (VI).

[0026] Em algumas modalidades, R10 da fórmula geral (VII) não é um grupo aminoácido ou um grupo fosfo-aminoácido.

[0027] A presente invenção também é dirigida às bibliote-cas contendo um ou mais compostos de fórmula (I) acima descritos, bem como aos métodos para sintetizar tais bibliotecas e aos métodos para examinar as mesmas para identificar os compostos biologicamente ativos. As composi-ções contendo um composto desta invenção em combinação com um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável são também divulgadas.

[0028] A presente invenção também é relacionada aos métodos para identificar um composto biologicamente ativo usando as bibliotecas contendo um ou mais compostos de fórmula (I). Em um aspecto relacionado, a presente invenção proporciona um método para efetuar um ensaio de ligação, compreendendo (a) proporcionar uma composição compreendendo um primeiro co-ativador e uma proteína de interação, o dito primeiro co-ativador compreendendo um motivo de ligação de LXXLL, LXXLI ou FXXFF, em que X é qualquer aminoácido; (b) combinar o primeiro co-ativador e a proteína de interação com um composto de teste; e (c) detectar alteração na ligação entre o primeiro co-ativador e a proteína de inte-ração na presença do composto tendo a fórmula geral (I).

[0029] A presente invenção também proporciona métodos para prevenir ou tratar distúrbios associados com a via de sinalização de Wnt. Os distúrbios que podem ser tratados ou prevenidos usando um composto ou composição da presente invenção incluem o tumor ou o câncer (p.ex., o tumor associado ao KSHV), a reestenose associada com angioplastia, a doença do rim policístico, a doença de angiogênese anormal, a doença de artrite reumatóide, o colite ulcerativa, o complexo de esclerose tuberosa, a perda de cabelo, e a doença de Alzheimer. Tais métodos compreendem administrar a um paciente estando em necessitada do mesmo um composto ou composição da presente invenção em uma quantidade efetiva para atingir o resultado desejado.

[0030] Em um aspecto relacionado, a presente invenção adicionalmente proporciona métodos para promover o desenvol-vimento de neuritos, a diferenciação de uma célula-tronca neural, e a apoptose em células de câncer. Tais métodos compreendem administrar a células apropriadas um composto ou composição da presente invenção em uma quantidade efetiva para atingir o resultado desejado.

[0031] Estes e outros objetivos desta invenção serão aparentes em referência à figura em anexo e à descrição detalhada que segue. Para esta finalidade, são apresentadas diversas referências aqui, que descrevem em mais detalhe certos procedimentos, compostos e/ou composições, e são incorporadas por referência em sua totalidade.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0032] A Figura 1 proporciona um esquema sintético geral para preparar os miméticos de direção inversa da presente invenção.

[0033] A Figura 2 proporciona um esquema sintético geral para preparar os miméticos de direção inversa da presente invenção.

[0034] A Figura 3 mostra um gráfico baseado na medição da IC50 para o Composto A da presente invenção usando as células SW480, em que a inibição do crescimento celular nas células SW480 foi medida em diversas concentrações de Composto A preparado no Exemplo 4, para obter o valor de IC50. Especificamente, foi determinado o grau de inibição nas atividades da luciferase do vaga-lume e da renila pelo Composto A. Como um resultado, a IC50 do Composto A contra o crescimento das células SW480 foi verificada, como divulgado na Tabela 4. Os procedimentos detalhados são os mesmos como divulgados no Exemplo 6.

[0035] Figura 4. As células PC-12 foram cultivadas sobre placas revestidas, e diferenciadas por 10 dias em 50 ng/ml de fator do crescimento nervoso (NGF) (como descrito no Exemplo 7). (A, B) As células PC-12 transfectadas com vetor (A) e as células PC-12 superexpressando wt PS-1 (B) exibem desenvolvimento de neuritos extensos após 10 dias em NGF. (C) As células PC-12 expressando PS- 1/L286V mutante não mostram neuritos significativos sob as mesmas condições de cultura. (D, E) A análise de imunofluorescência de GAP-43 (como descrito no Exemplo 7), um marcador molecular de desenvolvimento de neuritos, demonstra coloração intensa para GAP-43 nos neuritos (D) de células transfectadas com vetor e PS-1/WT em PC-12 de superexpressão (E). (F) A ausência de desenvolvimento de neuritos corresponde a uma imunocoloração fraca de GAP-43 nas células mutantes. Os dados representam pelo menos dois experimentos independentes. (G) As células diferenciadas foram transfectadas com Topflash, uma construção de relator de TCF/β-catenina. As células foram lisadas, e a atividade da luciferase medida 6 horas após a transfecção (como descrito no Exemplo 7). Os dados representam a média de três experimentos independentes (±DP). Os asteriscos indicam P< 0,05.

[0036] Figura 5. O composto D corrige de modo fenotípico a diferenciação neuronal deficiente em células PC-12 superexpressando PS-1/L286V mutante. As células mutantes foram expostas a 10 μM de Composto D, além do NGF, durante o período de diferenciação (Misner e col., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 98, 11714 (2001)). (A) O alongamento e a extensão dos neuritos são observados nas células PC-12 superexpres-sando PS-1/L286V no tratamento com o Composto D. (B) O GAP-43 (verde) é significativamente elevado nas células mutantes, e é visto nos neuritos. (C) Quantificação do desenvolvimento de neuritos em células PC-12. O número de células mutantes com comprimentos de neuritos maiores do que dois diâmetros de células foi menos do que 10% daquele das células transfectadas com vetor e PS-1/WT em PC-12 de superex-pressão. O número de células PS-1/L286V mutantes que tinham os comprimentos definidos de neuritos foi significativamente aumentado, após o tratamento com 10 μM de Composto D. Os resultados são a média (± DP) de três determinações independentes. Os asteriscos indicam P< 0,05.

[0037] Figura 6. Expressão do receptor de Efrina B2 (EphB2). As análises de imunofluorescência e de RT-PCR foram efetuadas para detectar a expressão do receptor de EphB2 (como descrito no Exemplo 7). (A, B) Os receptores de EphB2 estão claramente demonstrados nos neuritos de células PS- 1/WT transfectadas com vetor e de superexpressão. A intensidade da coloração correlaciona-se com o alto nível de expressão. (C) Em contraste, as células PS- 1/L286V PC-12 têm uma expressão do receptor de EphB2 marcadamente reduzida. (D) O tratamento das células mutantes com o Composto D resulta na expressão aumentada do receptor de EphB2, que está focada em pontos do desenvolvimento dos neuritos. (E) A expressão do receptor de EphB2 tinha sido anteriormente mostrada ser regulada de modo transcricional (Guo e col., J. Neurosci. 17, 4212 (1997).). Raia 1, células PC-12 transfec-tadas com vetor, raia 2, células PS-1/WT de superexpressão, raia 3, células PS-1/L286V mutantes de superexpressão, raia 4, células mutantes tratadas com Composto D. A análise por RT-PCR indica que a mensagem para o receptor de EphB2 em células superexpressando PS-1/L286V mutante é diminuída comparada àquelas em ambas as células transfectadas com vetor e wt PS-1 PC-12 de superexpressão. O tratamento com 10 μM de Composto D supra-regula a mensagem de EphB2. O GAPDH é usado como um controle interno.

[0038] Figura 7. A. O composto D retém as células em G1. A análise por FACS foi efetuada em células SW480 (painel inferior) e HCT116 (painel superior) tratadas por 24 horas com o Composto D (25 μM) (direita) ou o controle (0,5% de DMSO) (esquerda). 5,5 X 106 células foram fixadas e tingidas com iodeto de propídio (PI). B. O composto D ativa seletiva-mente as caspases em linhagens de células de carcinoma do cólon. As células SW480 e HCT116 (gráfico da esquerda) (105), juntamente com os colonócitos normais CCD18Co (gráfico da direita), foram tratadas com o controle (0,5% de DMSO) ou o Composto D (25 μM). 24 horas após o tratamento, as células foram lisadas e as atividades enzimáticas das caspases-3/7 foram medidas. As unidades de fluorescência relativa (RFU) foram calculadas subtraindo-se os valores de unidades do branco (controle, sem células) das amostras tratadas (Composto D ou controle) e plotadas.

[0039] Figura 8. O composto D reduz o crescimento de colônias em ágar mole em um modo dependente da dose. Concentrações crescentes de 5- fluorouracil (5-FU) (0,5-32 μm) e Composto D (0,25-5 μM) foram adicionadas à SW480 (5000 células/poço) de poços em triplicata. As células foram lavadas e suspensas em meio de crescimento de ágar mole. O número de colônias após 8 dias (colônias acima de 60 μM de diâmetro) foi contado e plotado contra a concentração de composto. A média ± EP de três determinações é indicada. O número de colônias de controle na ausência do composto foi 1.637 ± 71.

[0040] Figura 9. A. O composto C reduz o crescimento do tumor no modelo de camundongo nu. B. O composto C reduz ligeiramente o peso do corpo no modelo de camundongo nu.

[0041] Figura 10. A atividade transcricional da survivina é supra- regulada por Wnt1, porém derrubada pelo Composto D. As porcentagens das atividades das luciferases foram medidas em células 3T3 do tipo selvagem, CPB+/-, e p300+/- na ausência de Wnt1 e Composto D, ou na presença de Wnt1, Composto D ou ambos.

[0042] Figura 11. O Composto A (gráfico da direita) e o Composto D (gráfico da esquerda) inibem a atividade de um relator de luciferase de survivina em células SW480. As atividades das luciferases sob o controle do promotor de survivina foram medidas em células SW480 tratadas com o composto A ou o Composto D em concentrações diversas.

[0043] Figura 12. A análise por RT-PCR indica que o tratamento com o Composto D diminui o nível de expressão do gene de survivina.

[0044] Figura 13. O Composto D diminui a associação de diversas proteínas com o promotor de survivina. Os ensaios de ChIP em células SW480 tratadas com o Composto D (25 μM) ou o controle (0,5% de DMSO) por 18 horas foram efetuados.

[0045] Figura 14. O Composto D diminui a expressão da survivina no nível translacional. A. A análise de Western blot dos extratos das células tratadas com veículo (0,5% de DMSO) sozinho, 10 μM ou 25 μM de Composto D, ou 5 μM de 5-FU foi efetuada usando o anticorpo monoclonal 6E4 de survivina (Cell Signaling Technology). B. Microscopia de imunofluores-cência de survivina. As células de câncer cultivadas foram fixadas e tingidas com verde anti-survivina. C. Microscopia de imunofluorescência de survivina. As células SW480 tratadas com o Composto D foram fixadas e tingidas com verde anti-survivina.

[0046] Figura 15. O Composto D ativa a atividade da caspase 3 (porém não a atividade da caspase 2) via supressão da expressão da survivina. As células cultivadas, com ou sem transfecção de uma construção contendo o gene de survivina, foram tratadas com estausporina (0,5 μM), Composto D (2,5 μM ou 5,0 μM), ou ambos. As atividades da caspase 2 e da caspase 3 nestas células foram medidas.

[0047] Figura 16. O Composto D promove a morte celular via supressão da expressão da survivina. As células de câncer cultivadas, com ou sem transfecção de uma construção contendo o gene de survivina, foram tratadas com estausporina (0,5 μM), Composto D (5,0 μM), ou ambos. A morte celular destas células foi medida.

[0048] Figura 17. O Composto D aumenta o número de células em G0. As células de câncer cultivadas, com ou sem a transfecção de uma construção contendo o gene de survivina, foram tratadas com estausporina (0,5 μM), Composto D (5 μM), ou ambos. A análise por FACS foi efetuada sobre estas células e as porcentagens das células em G0 são indicadas.

[0049] A Figura 18 mostra as alterações das concentrações do pró- medicamento A e de seu composto de origem, no plasma de camundongo, com o aumento do tempo após injeção de bolo i.v. do pró-medicamento A. Quadrado: composto de origem; Losango: pró-medicamento A.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0050] A presente invenção é dirigida aos compostos comprimidos de maneira conformacional que copiam a estrutura secundária de regiões de direção inversa de peptídeos e proteínas biológicos (também referidos aqui como “miméticos de direção inversa”), e é também dirigida às bibliotecas químicas que se relacionam aos mesmos.

[0051] As estruturas miméticas de direção inversa da presente invenção são úteis como agentes bioativos, incluindo (porém não limitado ao) o uso como agentes diagnósticos, profiláticos e/ou terapêuticos. As bibliotecas das estruturas miméticas de direção inversa desta invenção são úteis na identificação de agentes bioativos tendo tais usos. Na prática da presente invenção, as bibliotecas podem conter dezenas a centenas a milhares (ou mais) de estruturas de direção inversa individuais (também referidas aqui como “membros”).

[0052] Em um aspecto da presente invenção, é divulgada uma estrutura mimética de direção inversa tendo a seguinte fórmula (I):

em que A é -(CHR3)- ou -(C=O)-, B é -(CHR4)-, -(C=O)-, D é -(CHR5)- ou - (C=O)-, E é -(ZR6)- ou -(C=O)-, G é -(XR7)n-, -(CHR7)-(NR8)-, -(C=O)-(XR9)-, ou - (C=O)-, W é -Y(C=O)-, -(C=O)NH-, -(SO2)- ou nada, Y é oxigênio, enxofre, ou -NH-, X e Z são independentemente nitrogênio ou CH, n = 0 ou 1; e R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8 e R9 são iguais ou diferentes e independentemente selecionados a partir de uma porção de cadeia lateral de aminoácido ou seu derivado, o restante da molécula, um ligante e um suporte sólido, e seus estereoisômeros.

[0053] Em uma modalidade, R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8 e R9 são independentemente selecionados a partir do grupo consistindo em C2-5 aminoalquila, guanidina C2-5 alquila, C1-4 alquila C2-5 guanidinoalquila, C1-4 dialquila C2-5 guanidino-alquila, C2-5 amidinoalquila, C1-4 alquila C2-5 amidinoalquila, C1-4 dialquila C2-5 amidinoalquila, C1-3 alcóxi, fenila, fenila substituída (onde os substituintes são independentemente selecionados a partir de um ou mais de amino, amidino, guanidino, hidrazino, amidazonila, C1-4 alquila amino, C1-4 dialquila amino, halogênio, perflúor C1-4 alquila, C1-4 alquila, C1-3 alcóxi, nitro, carbóxi, ciano, sulfurila ou hidroxila), benzila, benzila substituída (onde os substituintes da benzila são independentemente selecionados a partir de um ou mais de amino, amidino, guanidino, hidrazino, amidazonila, C1-4 alquila amino, C1-4 dialquila amino, halogênio, perflúor C1-4 alquila, C1-3 alcóxi, nitro, carbóxi, ciano, sulfurila ou hidroxila), naftila, naftila substituída (onde os substituintes são independentemente selecionados a partir de um ou mais de amino, amidino, guanidino, hidrazino, amidazonila, C1-4 alquila amino, C1-4 dialquila amino, halogênio, perflúor C1-4 alquila, C1-4 alquila, C1-3 alcóxi, nitro, carbóxi, ciano, sulfurila ou hidroxila), bis-fenil metila, bis-fenil metila substituída (onde os substituintes são independentemente selecionados a partir de um ou mais de amino, amidino, guanidino, hidrazino, amidazonila, C1-4 alquila amino, C1-4 dialquila amino, halogênio, perflúor C1-4 alquila, C1-4 alquila, C1-3 alcóxi, nitro, carbóxi, ciano, sulfurila ou hidroxila), piridila, piridila substituída (onde os substituintes são independentemente selecionados a partir de um ou mais de amino, amidino, guanidino, hidrazino, amidazonila, C1-4 alquila amino, C1-4 dialquila amino, halogênio, perflúor C1-4 alquila, C1-4 alquila, C1-3 alcóxi, nitro, carbóxi, ciano, sulfurila ou hidroxila), C1-4 piridilalquila, C1-4 piridilalquila substituída (onde os substituintes da piridina são independentemente selecionados a partir de um ou mais de amino, amidino, guanidino, hidrazino, amidazonila, C1-4 alquila amino, C1-4 dialquila amino, halogênio, perflúor C1-4 alquila, C1-4 alquila, C1-3 alcóxi, nitro, carbóxi, ciano, sulfurila ou hidroxila), C1-4 pirimidilalquila, C1-4 pirimidi-lalquila substituída (onde os substituintes da pirimidina são independentemente selecionados a partir de um ou mais de amino, amidino, guanidino, hidrazino, amidazonila, C1-4 alquila amino, C1-4 dialquila amino, halogênio, perflúor C1-4 alquila, C1-4 alquila, C1-3 alcóxi, nitro, carbóxi, ciano, sulfurila ou hidroxila), triazin-2-il- C1-4 alquila, triazin-2-il- C1-4 alquila substituída (onde os substituintes da triazina são independentemente selecionados a partir de um ou mais de amino, amidino, guanidino, hidrazino, amidazonila, C1-4 alquila amino, C1-4 dialquila amino, halogênio, perflúor C1-4 alquila, C1-4 alquila, C1-3 alcóxi, nitro, carbóxi, ciano, sulfurila ou hidroxila), C1-4 imidazoalquila, imidazol C1-4 alquila substituída (onde os substituintes do imidazol são independentemente selecionados a partir de um ou mais de amino, amidino, guani-dino, hidrazino, amidazonila, C1-4 alquila amino, C1-4 dialquila amino, halogênio, perflúor C1-4 alquila, C1-4 alquila, C1-3 alcóxi, nitro, carbóxi, ciano, sulfurila ou hidroxila), C1-4 imidazolinilalquila, N-amidinopipera-zinil-N- C0-4 alquila, C2-5 hidroxialquila, C1-5 alquila C2-5 aminoalquila, C2-5 hidroxialquila, C1-5 alquila C2-5 aminoalquila, C1-5 dialquila C2-5 aminoalquila, N-amidinopiperidinil C1-4 alquila e 4-aminocicloexil C0-2 alquila.

[0054] Em uma modalidade, R1, R2, R6 de E, e R7, R8 e R9 de G são iguais ou diferentes e representam o restante do composto, e R3 de A, R4 de B ou R5 de D é selecionado a partir de uma porção de cadeia lateral de aminoácido ou seu derivado. Como usado aqui, o termo “restante do composto” significa qualquer porção, agente, composto, suporte, molécula, ligante, aminoácido, peptídeo ou proteína covalen-temente ligada à estrutura mimética de direção inversa nas posições de R1, R2, R5, R6, R7, R8 e/ou R9. Este termo também inclui as porções de cadeias laterais de aminoácidos e seus derivados.

[0055] Em uma outra modalidade, R3 de A, R5 de D, R6 de E, e R7, R8, e R9 de G são iguais ou diferentes e representam o restante do composto, ao passo que um ou mais de, e em um aspecto todos de, R1, R2 e R4 de B representam uma cadeia lateral de aminoácido. Neste caso, o termo “restante do composto” significa qualquer porção, agente, composto, suporte, molécula, ligante, aminoácido, peptídeo ou proteína covalentemente ligada à estrutura mimética de direção inversa nas posições de R3, R5, R6, R7, R8 e/ou R9. O termo também inclui as porções de cadeias laterais de aminoácidos e seus derivados.

[0056] Como usado aqui, o termo “restante do composto” significa qualquer porção, agente, composto, suporte, molécula, átomo, ligante, aminoácido, peptídeo ou proteína covalentemente ligada à estrutura mimética de direção inversa. Este termo também inclui as porções de cadeias laterais de aminoácidos e os seus derivados. Em um aspecto da invenção, qualquer uma ou mais das posições de R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8 e/ou R9 podem representar o restante do composto. Em um aspecto da invenção, um ou mais de R1, R2 e R4 representam uma porção de cadeia lateral de aminoácido ou um seu derivado.

[0057] Como usado aqui, o termo “porção de cadeia lateral de aminoácido” representa qualquer porção de cadeia lateral de aminoácido presente em proteínas de ocorrência natural, incluindo (porém não limitada) as porções de cadeias laterais de aminoácidos de ocorrência natural identificadas na Tabela 1. As outras porções de cadeias laterais de aminoácidos de ocorrência natural desta invenção incluem (porém não estão limitadas) as porções de cadeias laterais de 3,5- dibromotirosina, 3,5-diiodotirosina, hidroxilisina, y-carboxiglutamato, fosfotirosina e fosfosserina. Ademais, as cadeias laterais de aminoácidos glicosilados também podem ser usadas na prática desta invenção, incluindo (porém não limitadas) a treonina, a serina e a asparagina glicosiladas. TABELA 1

[0058] Além das porções de cadeias laterais de aminoácidos de ocorrência natural, as porções de cadeias laterais de aminoácidos da presente invenção também incluem diversos derivados das mesmas. Como usado aqui, um “derivado” de uma porção de cadeia lateral de aminoácido inclui modificações e/ou variações às porções de cadeias laterais de aminoácidos de ocorrência natural. Por exemplo, as porções de cadeias laterais de aminoácidos de alanina, valina, leucina, isoleucina e fenilalanina geralmente podem ser classificadas como porções de alquila, arila, ou arilalqula de cadeia inferior. Os derivados de porções de cadeias laterais de aminoácidos incluem outras porções de alquila, arila ou arilalquila de cadeia inferior saturadas ou insaturadas, substituídas ou não substituídas, cíclicas ou não cíclicas, de cadeia reta ou ramificadas.

[0059] Como usado aqui, as “porções de alquila de cadeia inferior” contêm de 1-12 átomos de carbono, as “porções de arila de cadeia inferior” contêm de 6-12 átomos de carbono e as “porções de aralquila de cadeia inferior” contêm de 7-12 átomos de carbono. Assim, em uma modalidade, o derivado da cadeia lateral de aminoácido é selecionado a partir de uma C1-12 alquila, uma C6-12 arila e uma C712 arilalquila, e em uma modalidade mais preferida, a partir de uma C1-7 alquila, uma C6-10 arila e uma C7-11 arilalquila.

[0060] Os derivados da cadeia lateral de amino desta invenção adicionalmente incluem os derivados substituídos das porções de alquila, arila, e arilalquila de cadeia inferior, em que o substituinte é selecionado a partir de (porém não está limitado a) uma ou mais das porções químicas que seguem: -OH, -OR, - COOH, -COOR, -CONH2, -NH2, -NHR, -NRR, -SH, -SR, -SO2R, -SO2H, -SOR e halogênio (incluindo F, Cl, Br e I), em que cada ocorrência de R é independentemente selecionada a partir de porções de alquila, arila e aralquila de cadeia inferior saturadas ou insaturadas, substituídas ou não substituídas, cíclicas ou não cíclicas, de cadeia reta ou ramificadas. Além disso, as porções de alquila, arila e arilalquila de cadeia inferior cíclicas desta invenção incluem o naftaleno, bem como os compostos heterocíclicos, tais como tiofeno, pirrol, furano, imidazol, oxazol, tiazol, pirazol, 3-pirrolina, pirrolidina, piridina, pirimidina, purina, quinolina, isoquinolina e carbazol. Os derivados das cadeias laterais de aminoácidos adicionalmente incluem os derivados de heteroalquila da porção de alquila das porções de alquila e aralquila de cadeia inferior, incluindo (porém não limitados aos) os fosfonatos e os silanos de alquila e aralquila.

[0061] As porções de R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8 e R9 representativas especificamente incluem (porém não estão limitadas a) -OH, -OR, -COR, -COOR, - CONH2, -CONR, -CONRR, -NH2, -NHR, -NRR, -SO2R e -COSR, em que cada ocorrência de R é como acima definido.

[0062] Em uma modalidade adicional, e além de serem uma porção de cadeia lateral de aminoácido ou derivado da mesma (ou o restante do composto no caso de R1, R2, R3, R5, R6, R7, R8 e R9), R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8 ou R9 pode ser um ligante facilitando a ligação do composto a uma outra porção ou composto. Por exemplo, os compostos desta invenção podem ser ligados a um ou mais compostos conhecidos, tais como a biotina, para uso em ensaio diagnóstico ou de triagem. Além disso, R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8 ou R9 pode ser um ligante unindo o composto a um suporte sólido (tal como um suporte usado na síntese de peptídeo de fase sólida), ou alternativamente, pode ser o próprio suporte. Nesta modali-dade, a ligação a uma outra porção ou composto, ou a um suporte sólido, é preferível na posição de R1, R2, R7 ou R8, ou R9, e mais preferivelmente na posição de R1 ou R2.

[0063] Em uma modalidade em que A é -(CHR3)-, B é -(C=O)-, D é - (CHR5)-, E é -(C=O)-, e G é -(XR7)n-, o composto mimético de direção inversa desta invenção tem a seguinte fórmula (II):

em que R1, R2, R3, R5, R7, W, X e n são como definidos acima. Em uma modalidade preferida, R1, R2 e R7 representam o restante do composto, e R3 ou R5 é selecionado a partir de uma porção de cadeia lateral de aminoácido.

[0064] Na modalidade em que A é -(C=O)-, B é -(CHR4)-, D é -(C=O)-, E é -(ZR6)-, G é -(C=O)-(XR9)-, o composto mimético de direção inversa desta invenção tem a seguinte fórmula geral (III):

em que R1, R2, R4, R6, R9, W e X são como definidos acima, Z é nitrogênio ou CH (quando Z for CH, então X é nitrogênio). Em uma modalidade preferida, R1, R2, R6 e R9 representam o restante do composto, e R4 é selecionado a partir de uma porção de cadeia lateral de aminoácido.

[0065] Em uma modalidade mais específica, em que A é -(C=O)-, B é - (CHR4)-, D é -(C=O)-, E é -(ZR6)-, e G é (XR7)n-, o composto mimético de direção inversa desta invenção tem a seguinte fórmula (IV):

em que R1, R2, R4, R6, R7 W, X e n são como definidos acima, e Z é nitrogênio ou CH (quando Z for nitrogênio, então n é zero, e quando Z for CH, então X é nitrogênio e n não é zero). Em uma modalidade preferida, R1, R2, R6 e R7 representam o restante do composto, e R4 é selecionado a partir de uma porção de cadeia lateral de aminoácido. Em um aspecto, R6 ou R7 é selecionado a partir de uma porção de cadeia lateral de aminoácido quando Z e X forem ambos CH.

[0066] Estes compostos podem ser preparados utilizando moléculas de componentes de partida apropriadas (daqui por diante referidas como “pedaços de componentes”). Resumida-mente, na síntese das estruturas miméticas de direção inversa tendo a fórmula (I), o primeiro e o segundo pedaços de componentes são acoplados para formar um primeiro-segundo intermediário combinado, se necessário, o terceiro e/ou o quarto pedaços de componentes são acoplados para formar um terceiro-quarto intermediário combinado (ou, se comercial-mente disponível, pode ser usado um único terceiro interme-diário), o primeiro-segundo intermediário e o terceiro-quarto intermediário (ou terceiro intermediário) combinados são então acoplados para proporcionar um primeiro-segundo-terceiro-quarto intermediário (ou primeiro-segundo-terceiro intermediário), que é ciclizado para produzir as estruturas miméticas de direção inversa desta invenção. Alternativa-mente, as estruturas miméticas de direção inversa de fórmula (I) podem ser preparadas por acoplamento seqüencial dos pedaços de componentes individuais em etapas em solução, ou por síntese de fase sólida como praticado comumente na síntese de peptídeo de fase sólida.

[0067] Os pedaços de componentes específicos e o seu agrupamento para preparar os compostos da presente invenção são ilustrados na Figura 1. Por exemplo, um “primeiro pedaço de componente” pode ter a seguinte fórmula S1:

em que R2 é como definido acima, e R é um grupo protetor adequado para uso na síntese de peptídeo, onde este grupo de proteção pode ser unido a um suporte polimérico para capacitar a síntese de fase sólida. Os grupos R adequados incluem os grupos alquila e, em uma modalidade preferida, R é um grupo metila. Na Figura 1, um dos grupos R é um suporte polimérico (sólido), indicado por “Pol” na Figura. Tais primeiros pedaços de componentes podem ser prontamente sintetizados por aminação redutiva de H2N-R2 com CH(OR)2-CHO, ou por uma reação de substituição entre H2N-R2 e CH(OR)2-CH2-LG (em que LG refere-se a um grupo abandonador, p.ex., um grupo de halogênio (Hal)).

[0068] Um “segundo pedaço de componente” pode ter a seguinte fórmula S2:

onde P é um grupo de proteção de amino adequado para uso na síntese de peptídeo, L1 é hidroxila ou um grupo de ativação de carboxila, e R4 é como definido acima. Os grupos de proteção preferidos incluem a t-butil dimetilsilila (TBDMS), a t- butiloxicarbonila (BOC), a metiloxicarbonila (MOC), a 9H-fluorenilmetiloxicarbonila (FMOC), e a aliloxi-carbonila (Alloc). Os aminoácidos protegidos em N estão comercialmente disponíveis; por exemplo, os FMOC aminoácidos estão disponíveis a partir de uma variedade de fontes. A fim de que o segundo pedaço de componente seja reativo com o primeiro pedaço de componente, L1 é um grupo de ativação de carboxila, e a conversão de grupos carboxila em grupos carboxila ativados pode ser prontamente obtida por métodos conhecidos na técnica para a ativação dos grupos carboxila. Os grupos de ácidos carboxílicos ativados adequados incluem os halogenetos de ácidos, onde L1 é um halogeneto, tal como o cloreto ou o brometo, e os anidridos de ácidos, onde L1 é um grupo acila, tal como a acetila, os ésteres reativos, tais como os ésteres de N-hidroxissuccinimida e os ésteres de pentafluorfenila, e os outros intermediários ativados, tais como o intermediário ativo formado em uma reação de acoplamento usando uma carbodiimida, tal como a diciclo-exilcarbodiimida (DCC). Desse modo, os aminoácidos protegidos em N comercialmente disponíveis podem ser convertidos em formas ativadas carboxílicas por meios conhecidos para alguém de habilidade na técnica.

[0069] No caso do derivado de azido de um aminoácido servindo como o segundo pedaço de componente, tais compostos podem ser preparados a partir do aminoácido correspondente pela reação divulgada por Zaloom e col. (J. Org. Chem. 46:5173-76, 1981).

[0070] Alternativamente, o primeiro pedaço de componente da invenção pode ter a seguinte fórmula S1’:

em que R é como definido acima e L2 é um grupo abandonador, tal como o átomo de halogênio ou o grupo tosila, e o segundo pedaço de componente da invenção pode ter a seguinte fórmula S2’:

em que R2, R4 e P são como definidos acima.

[0071] Um “terceiro pedaço de componente” desta invenção pode ter a seguinte fórmula S3:

onde G, E, L1 e L2 são como definidos acima. Os terceiros pedaços de componentes adequados estão comercial-mente disponíveis a partir de uma variedade de fontes ou podem ser preparados por métodos bastante conhecidos na química orgânica.

[0072] Na Figura 1, o composto de fórmula (1) tem -(C=O)- para A, - (CHR4)- para B, -(C=O)- para D, e -(CR6)- para E. Os compostos de fórmula (1) nos quais um grupo carbonila está na posição B e um grupo R está na posição B, i.e., os compostos nos quais A é -(CHR3)- e B é -(C=O)-, podem ser preparados em um modo análogo àquele mostrado na Figura 1, conforme ilustrado na Figura 2. A Figura 2 também ilustra adicionar um quarto pedaço de componente ao primeiro- segundo-terceiro intermediário componente, em vez de ligar o quarto pedaço de componente ao terceiro pedaço de componente antes da reação com o primeiro- segundo pedaço intermediário. Além disso, a Figura 2 ilustra a preparação dos compostos da presente invenção nos quais D é -(CHR5)- (em vez de -(C=O)- como na Figura 1), e E é -(C=O)- (em vez de -(CHR6)- como na Figura 1). Finalmente, a Figura 2 ilustra a preparação dos compostos nos quais G é NR7.

[0073] Assim, conforme ilustrado acima, os compostos miméticos de direção inversa de fórmula (I) podem ser sintetizados por reação de um primeiro pedaço de componente com um segundo pedaço de componente, para produzir um primeiro-segundo intermediário combinado, seguida por reação do primeiro-segundo intermediário combinado com os terceiros pedaços de componentes seqüencialmente, para proporcionar um primeiro-segundo-terceiro-quarto intermediário combinado, e então a ciclização deste intermediário para produzir a estrutura mimética de direção inversa.

[0074] As sínteses dos pedaços de componentes representa-tivos desta invenção são descritas nos Exemplos de Preparação e nos Exemplos de trabalho.

[0075] As estruturas miméticas de direção inversa de fórmulas (III) e (IV) podem ser feitas por técnicas análogas à síntese de componente modular discutida acima, porém com modificações apropriadas aos pedaços de componentes.

[0076] As estruturas miméticas de direção inversa da presente invenção são úteis como agentes bioativos, tais como os agentes diagnósticos, profiláticos, e terapêuticos. Por exemplo, as estruturas miméticas de direção inversa da presente invenção podem ser usadas para modular uma célula sinalizando peptídeos relacionados ao fator de transcrição em um animal de sangue quente, por um método compreendendo administrar ao animal uma quantidade efetiva do composto de fórmula (I).

[0077] Ademais, as estruturas miméticas de direção inversa da presente invenção também podem ser efetivas para inibir a ligação do peptídeo aos domínios de PTB em um animal de sangue quente; para modular o receptor acoplado à proteína G (GPCR) e o canal iônico em um animal de sangue quente; para modular as citocinas em um animal de sangue quente.

[0078] Entretanto, foi verificado que os compostos da fórmula (I), especialmente os compostos de fórmula (VI), são efetivos para inibir ou tratar distúrbios modulados pela via de sinalização de Wnt, tais como o câncer, especialmente o câncer colorretal.

[0079] Em um outro aspecto, é um objetivo da presente invenção proporcionar uma composição farmacêutica compreen-dendo uma quantidade segura e efetiva do composto tendo fórmula geral (VI) e um veículo farmaceuticamente aceitável, que pode ser usada para o tratamento de distúrbios modulados pela via de sinalização de Wnt, especialmente pelo complexo de TCF4-β- catenina-CBP.

[0080] Ademais, a presente invenção é proporcionar um método para inibir o crescimento de células de tumor por utilização da composição da presente invenção acima descrita; um método para induzir a apoptose das células de tumor por utilização da composição da presente invenção acima descrita; um método para tratar um distúrbio modulado pelo complexo de TCF4-β catenina-CBP por utilização da composição da presente invenção acima descrita; e um método de tratar câncer, tal como o câncer colorretal, por administração da composição da presente invenção juntamente com outro agente anticâncer, tal como a 5-fluorouracil (5-FU), o taxol, a cisplatina, a mitomicina C, o tegafur, o raltitrexed, a capecitabina, e o irinotecano, etc.

[0081] Em uma modalidade preferida da presente invenção, o composto da presente invenção tem uma configuração (6S,10R) como se segue:

em que Ra e Rb têm os mesmos significados como definidos acima.

[0082] Em um outro aspecto desta invenção, são divulgados pró- medicamentos derivados dos compostos tendo a fórmula geral (I). Os pró- medicamentos geralmente aumentam a solubilidade aquosa e, desse modo, a biodisponibilidade dos compostos tendo a fórmula geral (I). Em certas modalidades, os pró-medicamentos da presente invenção têm a seguinte fórmula geral (VII): (VI)-Y-R10 onde (VI) é a fórmula geral (VI) como descrita acima; Y é oxigênio, enxofre, ou nitrogênio de um grupo selecionado a partir de Ra, Rb, Rc, X1, X2 e X3: R10 é fosfato, hemissuccinato, hemimalato, fosforiloximetiloxicarbonila, acetato de dimetilamino, carbamato de dimetilaminoalquila, hidroxialquila, aminoácido, glicosila, piperidina oxicarbonila substituída ou não substituída, ou um sal destes; e onde os pró-medicamentos são capazes de atuar como um substrato para uma fosfatase ou uma carboxilase e são, desse modo, convertidos nos compostos tendo a fórmula geral (VI). Em algumas modalidades, R10 da fórmula geral (VII) não é um grupo aminoácido ou um grupo fosfo-aminoácido.

[0083] Em um outro aspecto desta invenção, são divulgadas bibliotecas contendo as estruturas miméticas de direção inversa da presente invenção. Uma vez agrupadas, as bibliotecas da presente invenção podem ser examinadas para identificar os membros individuais tendo bioatividade. Tal triagem das bibliotecas quanto aos membros bioativos pode envolver, por exemplo, a avaliação da atividade de ligação dos membros da biblioteca ou a avaliação do efeito que os membros da biblioteca têm sobre um ensaio funcional. A triagem é normalmente efetuada contatando os membros da biblioteca (ou um subgrupo de membros da biblioteca) com um alvo de interesse, tal como, por exemplo, um anticorpo, enzima, receptor ou linhagem de célula. Os membros da biblioteca que são capazes de interagir com o alvo de interesse são referidos aqui como “membros da biblioteca bioativos” ou “miméticos bioativos”. Por exemplo, um mimético bioativo pode ser um membro da biblioteca que seja capaz de ligar-se a um anticorpo ou receptor, ou que seja capaz de inibir uma enzima, ou que seja capaz de fazer surgir ou antagonizar uma resposta funcional associada, por exemplo, com uma linhagem de célula. Em outras palavras, a triagem das bibliotecas da presente invenção determina quais membros da biblioteca são capazes de interagir com um ou mais alvos biológicos de interesse. Ademais, quando a interação de fato ocorre, o mimético (ou miméticos) bioativo pode então ser identificado a partir dos membros da biblioteca. A identificação de um número único (ou limitado) de mimético(s) bioativo(s) a partir da biblioteca produz estruturas miméticas de direção inversa que são, elas próprias, biologicamente ativas e, assim, são úteis como agentes diagnósticos, profiláticos ou terapêuticos, e podem ser adicionalmente usadas para a identificação significati-vamente antecipada de compostos de vanguarda nestes campos.

[0084] A síntese de miméticos peptídicos da biblioteca da presente invenção pode ser efetuada usando técnicas conhecidas de síntese de peptídeos, em combinação com o primeiro, o segundo e o terceiro pedaços de componentes desta invenção. Mais especificamente, qualquer seqüência de aminoácidos pode ser adicionada ao N terminal e/ou ao C terminal do mimético de direção inversa comprimido de modo conformacional. Para esta finalidade, os miméticos podem ser sintetizados sobre um suporte sólido (tal como a resina PAM) por técnicas conhecidas (ver, p.ex., John M. Stewart e Janis D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 1984, Pierce Chemical Comp., Rockford, III.) ou sobre uma resina ligada à silila por ligação de álcool (ver Randolph e col., J. Am Chem. Soc. 117:5712-14, 1995).

[0085] Além disso, pode ser utilizada uma combinação de técnicas de síntese tanto em solução quanto de fase sólida para sintetizar os miméticos peptídicos desta invenção. Por exemplo, um suporte sólido pode ser utilizado para sintetizar a seqüência peptídica linear até o ponto que a direção inversa comprimida de modo conformacional seja adicionada à seqüência. Uma estrutura mimética de direção inversa comprimida de modo conformacional adequada, que tenha sido previamente sintetizada por técnicas de síntese em solução, pode então ser adicionada como o “aminoácido” seguinte à síntese de fase sólida (i.e., o mimético de direção inversa comprimido de maneira conformacional, que tem tanto uma extremidade de N quanto uma extremidade de C, pode ser utilizado como o aminoácido seguinte a ser adicionado ao peptídeo linear). Com a incorporação das estruturas miméticas de direção inversa comprimidas de maneira conformacional na seqüência, podem então ser adicionados aminoácidos adicionais para completar o peptídeo ligado ao suporte sólido. Alterna-tivamente, as seqüências peptídicas protegidas na extremi-dade de N e na extremidade de C podem ser sintetizadas sobre um suporte sólido, removidas do suporte, e então acopladas às estruturas miméticas de direção inversa comprimidas de maneira conformacional em solução usando técnicas conhecidas de acoplamento em solução.

[0086] Em um outro aspecto desta invenção, são divulgados métodos para construir as bibliotecas. As técnicas combina-tórias tradicionais de química (ver, p.ex., Gallop e col., J. Med. Chem. 37:1233-1251, 1994) permitem que um grande número de compostos seja rapidamente preparado pela combinação seqüencial de reagentes com um andaime molecular básico. As técnicas combinatórias têm sido usadas para construir bibliotecas de peptídeos derivadas dos aminoácidos de ocorrência natural. Por exemplo, tomando-se 20 misturas de 20 aminoácidos adequadamente protegidos e diferentes e acoplando-se cada com um dos 20 aminoácidos, é criada uma biblioteca de 400 (i.e., 202) dipeptídeos. A repetição do procedimento sete vezes resulta na preparação de uma biblioteca de peptídeos compreendida de cerca de 26 bilhões (i.e., 208) de octapeptídeos.

[0087] Especificamente, a síntese dos miméticos peptídicos da biblioteca da presente invenção pode ser efetuada usando técnicas conhecidas de síntese de peptídeo, por exemplo, o Esquema Geral da Biblioteca de Miméticos de Direção Inversa [4,4,0] como se segue:

[0088] A síntese dos miméticos peptídicos das bibliotecas da presente invenção foi efetuada usando um Bloco Reator FlexChem que tem placas com 96 poços por técnicas conhecidas. No esquema acima mencionado, ‘Pol’ representa uma resina de bromoacetal (Advanced ChemTech) e o procedimento detalhado é ilustrado abaixo.

Etapa 1

[0089] Uma resina de bromoacetal (37 mg, 0,98 mmol/g) e uma solução de R2-amina em DMSO (1,4 mL) foram colocadas em um bloco da Robbins (FlexChem) tendo placas com 96 poços. A mistura de reação foi agitada a 60°C usando um forno rotativo [Robbins Scientific] por 12 horas. A resina foi lavada com DMF, MeOH, e então DCM.

Etapa 2

[0090] Uma solução de FmocAminoácidos comercialmente disponíveis (4 equiv.), PyBob (4 equiv.), HOAt (4 equiv.), e DIEA (12 equiv.) em DMF foi adicionada à resina. Após a mistura de reação ser agitada por 12 horas, na temperatura ambiente, a resina foi lavada com DMF, MeOH, e então DCM.

Etapa 3

[0091] À resina intumescida por DMF antes da reação foi adicionada a piperidina a 25% em DMF e a mistura de reação foi agitada por 30 min, na temperatura ambiente. Esta etapa de desproteção foi repetida novamente e a resina foi lavada com DMF, Metanol, e então DCM. Uma solução de ácido de hidrazina (4 equiv.), HOBt (4 equiv.), e DIC (4 equiv.) em DMF foi adicionada à resina e a mistura de reação foi agitada por 12 horas, na temperatura ambiente. A resina foi lavada com DMF, MeOH, e então DCM.

Etapa 4a (Onde o ácido de hidrazina for o carbamato de MOC)

[0092] A resina obtida na Etapa 3 foi tratada com ácido fórmico (1,2 mL em cada poço) por 18 horas, na temperatura ambiente. Após a resina ser removida por filtração, o filtrado foi condensado sob uma pressão reduzida usando SpeedVac [SAVANT] para dar o produto como óleo. O produto foi diluído com 50% de água/acetonitrila e então liofilizado após congelamento.

Etapa 4b (Onde o ácido de FMOC hidrazina for usado para preparar a Uréia através do isocianato)

[0093] À resina intumescida por DMF antes da reação foi adicionada a piperidina a 25% em DMF e a mistura de reação foi agitada por 30 min, na temperatura ambiente. Esta etapa de desproteção foi repetida novamente e a resina foi lavada com DMF, Metanol, então DCM. À resina intumescida por DCM antes da reação foi adicionado o isocianato (5 equiv.) em DCM. Após a mistura de reação ser agitada por 12 horas, na temperatura ambiente, a resina foi lavada com DMF, MeOH, então DCM. A resina foi tratada com ácido fórmico (1,2 mL em cada poço) por 18 horas, na temperatura ambiente. Após a resina ser removida por filtração, o filtrado foi condensado sob uma pressão reduzida usando SpeedVac [SAVANT] para dar o produto como óleo. O produto foi diluído com 50% de água/acetonitrila e então liofilizado após congelamento.

Etapa 4c (Onde o ácido de FMOC-hidrazina for usado para preparar a Uréia através do carbamato ativo)

[0094] À resina intumescida por DMF antes da reação foi adicionada a piperidina a 25% em DMF e a mistura de reação foi agitada por 30 min, na temperatura ambiente. Esta etapa de desproteção foi repetida novamente e a resina foi lavada com DMF, Metanol, e então DCM. Foram adicionados à resina intumescida por DCM antes da reação o cloroformato de p-nitrofenila (5 equiv.) e a diisopropil etilamina (5 equiv.) em DCM. Após a mistura de reação ser agitada por 12 horas, na temperatura ambiente, a resina foi lavada com DMF, MeOH, e então DCM. À resina foram adicionadas aminas primárias em DCM por 12 horas, na temperatura ambiente, e a resina foi lavada com DMF, MeOH, e então DCM. Após a reação, a resina foi tratada com ácido fórmico (1,2 mL em cada poço) por 18 horas, na temperatura ambiente. Após a resina ser removida por filtração, o filtrado foi condensado sob uma pressão reduzida usando SpeedVac [SAVANT] para dar o produto como óleo. O produto foi diluído com 50% de água/acetonitrila e então liofilizado após congelamento.

[0095] Para gerar estas bibliotecas de blocos, os ácidos de hidrazina intermediários-chave foram sintetizados de acordo com o procedimento ilustrado nos Exemplos de Prepa-ração.

[0096] As Tabelas 2A e 2B mostram uma biblioteca de miméticos de direção inversa [4,4,0] que pode ser preparada de acordo com a presente invenção, a preparação representa-tiva dos mesmos sendo dada no Exemplo 4. TABELA 2A A BIBLIOTECA DE MIMÉTICOS DE DIREÇÃO INVERSA [4,4,0]

[0097] Além disso, a síntese dos miméticos peptídicos da biblioteca da presente invenção pode ser efetuada usando o Esquema Geral da Biblioteca de Miméticos de Direção Inversa [4,3,0], como se segue:

[0098] A síntese dos miméticos peptídicos das bibliotecas de modelos bicíclicos da presente invenção foi efetuada usando o Bloco Reator FlexChem, que tem placa com 96 poços, por técnicas conhecidas. No esquema acima descrito, ‘Pol’ representa a resina de Bromoacetal (Advanced ChemTech) e o procedimento detalhado é ilustrado abaixo.

Etapa 1

[0099] A resina de bromoacetal (1,6 mmol/g) e uma solução de R1 amina em DMSO (solução a 2M) foram colocadas no bloco da Robbins com 96 poços (Flexchem). A mistura de reação foi agitada a 60°C usando forno rotativo [Robbins Scientific] por 12 horas. A resina foi lavada com DMF, MeOH, e então DCM.

Etapa 2

[00100] Uma solução de Fmoc-Aminoácidos comercialmente disponíveis (4 equiv.), PyBob (4 equiv.), HOAt (4 equiv.), e DIEA (12 equiv.) em DMF foi adicionada à resina. Após a mistura de reação ser agitada por 12 horas, na temperatura ambiente, a resina foi lavada com DMF, MeOH, e então DCM.

Etapa 3

[00101] À resina intumescida por DMF antes da reação foi adicionada a piperidina a 25% em DMF. Depois a mistura de reação foi agitada por 30 min, na temperatura ambiente. Esta etapa de desproteção foi repetida novamente e então lavada com DMF, Metanol, então DCM. Uma solução de cloreto de hidrazina carbamoíla (4 equiv.), HOBt (4 equiv.), e DIC (4 equiv.) em DMF foi adicionada à resina. Após a mistura de reação ser agitada por 12 horas, na temperatura ambiente, a resina foi lavada com DMF, MeOH, e então DCM.

Etapa 4

[00102] À resina intumescida por DMF antes da reação foi adicionada a piperidina a 25% em DMF. Depois a mistura de reação foi agitada por 30 min, na temperatura ambiente. Esta etapa de desproteção foi repetida novamente e então lavada com DMF, Metanol, então DCM. À resina intumescida por DCM antes da reação foi adicionado o isocianato de R1 (5 equiv.) em DCM. Após a mistura de reação ser agitada por 12 horas, na temperatura ambiente, a resina foi lavada com DMF, MeOH, então DCM.

Etapa 5

[00103] A resina foi tratada com ácido fórmico (1,2 mL em cada poço) por 18 horas, na temperatura ambiente. Após a resina ser removida por filtração, o filtrado foi condensado sob pressão reduzida usando SpeedVac [SAVANT] para dar o produto como óleo. Estes produtos foram diluídos com 50% de água/acetonitrila e então liofilizados após congelamento.

[00104] A Tabela 3 mostra uma biblioteca de miméticos de direção inversa [4,3,0] que pode ser preparada de acordo com a presente invenção, a preparação representativa dos mesmos sendo dada no Exemplo 5. TABELA 3 A BIBLIOTECA DE MIMÉTICOS DE DIREÇÃO INVERSA [4,3,0]

[00105] Em um aspecto adicional desta invenção, a presente invenção proporciona métodos para examinar as bibliotecas quanto à bioatividade e isolar os membros bioativos das bibliotecas.

[00106] Em mais um outro aspecto, a presente invenção proporciona um método para realizar um ensaio de ligação. O método inclui proporcionar uma composição que incluir um primeiro co-ativador, uma proteína de interação, e um composto de teste. A estrutura de aminoácido do primeiro co-ativador inclui um motivo de ligação de LXXLL, LXXLI ou FxxFF, em que X é qualquer aminoácido. O método adicional-mente inclui detectar uma alteração na ligação entre o primeiro co- ativador e a proteína de interação devido à presença do composto, e então caracterizar o composto de teste em termos de seu efeito sobre a ligação.

[00107] O ensaio pode ser realizado por qualquer meio que possa medir o efeito de um composto de teste sobre a ligação entre as duas proteínas. Muitos tais ensaios são conhecidos na técnica e podem ser utilizados no método da presente invenção, incluindo os assim chamados sistemas de Dois Híbridos e Híbrido Rompido.

[00108] O sistema de Dois Híbridos e os diversos meios para realizar um ensaio usando este sistema estão descritos, p.ex., na Patente U.S. 6.410.245. O sistema de Híbrido Separado foi descrito, p.ex., por Hsiu-Ming Shiu e col. Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 93:13896-13901, novembro de 1996; e John D. Crispino, e col. Molecular Cell, 3:1-20, fevereiro de 1999. No sistema de Híbrido Rompido, uma proteína de fusão é utilizada, onde a proteína X é fundida aos domínios de ligação de DNA lexA (pLexA) e a proteína Y é fundida ao ativador de transcrição VP16 (pSHM.1-LacZ). A interação entre lexA-X e VP16-Y resulta na expressão da proteína repressora de Tetraciclina (TetR). A TetR impede a trans-crição do gene receptor de HIS3, tornado as células incapazes de crescerem sobre meios não tendo histidina. O rompimento da interação entre proteína-proteína restabelecerá a capaci-dade das células de crescerem sobre tais meios, reprimindo a expressão do repressor de tetraciclina. Desse modo, os compostos da presente invenção podem ser adicionados às células em crescimento, e se a adição do composto restabe-lecer a capacidade das células de crescerem sobre os meios, o composto pode ser visto como um rompedor efetivo da interação entre proteína-proteína.

[00109] As cepas de leveduras requeridas para fazer o trabalho do sistema de Híbrido Rompido podem ser empregadas com duas construções híbridas LexA/VP16, tais como aquelas descritas por Stanley M. Hollenberg, e col. Molecular and Cellular Biology 15(7):3813-3822, julho de 1995. Uma modifi-cação útil do sistema de Híbrido Rompido foi utilizada por Takemaru, K.I. e Moon, R.T.J. of Cell Biol. 149:249-254, 2000.

[00110] Outros formatos de ensaio são também adequados. Por exemplo, os ensaios de gene relator para AP-1, ELISA, por exemplo, bloqueando a produção de IL-2 por uma linhagem de células T após estimulação com CD3 e CD28, para buscar inibidores da transcrição de IL-2. Os ensaios de ligação direta (entre co-ativadores e os seus pares) podem ser efetuados por espectroscopia de ressonância de plasmônio de superfície (Biacore, Suécia, fabricantes de instrumentos adequados) ou ELISA.

[00111] Os reguladores transcricionais ilustrativos incluem, sem limitação, VP16, VP64, p300, CBP, PCAF, SRC1 PvALF, AtHD2A e ERF-2. Ver, por exemplo, Robyr e col. (2000) Mol. Endocrinol. 14:329-347; Collingwood e col. (1999) J. Mol. Endocrinol. 23:255-275; Leo e col. (2000) Gene 245:1-11; Manteuffell-Cymborowska (1999) Acta Biochim. Pol. 46:77-89; McKenna e col. (1999) J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 69:3-12; Malik e col. (2000) Trends Biochem. Sci. 25:277-283; e Lemon e col. (1999) Curr. Opin. Genet. Dev. 9:499-504. Os outros fatores de transcrição ilustrativos incluem, sem limitação, OsGAI, HALF-1, C1, AP1, ARF-5, -6, -7, e -8, CPRF1, CPRF4, MYC-RP/GP, e TRAB1. Ver, por exemplo, Ogawa e col. (2000) Gene 245:21-29; Okanami e col. (1996) Genes Cells 1:87-99; Goff e col. (1991) Genes Dev. 5:298-309; Cho e col. (1999) Plant Mol. Biol. 40:419-429; Ulmason e col. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:5844-5849; Sprenger-Haussels e col. (2000) Plant J. 22:1-8; Gong e col. (1999) Plant Mol. Biol. 41:33-44; e Hobo e col. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:15.348-15.353.

[00112] Em uma modalidade preferida, o co-ativador trans-cricional é um co-ativador transcricional humano. Em uma outra modalidade preferida, o co- ativador transcricional é um membro da família p300/CBP de co-ativadores que têm atividade de histona acetiltransferase. A p300 é descrita, por exemplo, por Eckner e col., 1994, e a CBP por Bannister e Kouzarides, 1996. Para os propósitos da presente invenção, a referência a p300/CBP refere-se às variantes humanas alélicas e sintéticas da p300, e a outras variantes mamíferas e suas variantes alélicas e sintéticas, bem como aos frag-mentos das ditas formas humanas e mamíferas de p300. Em um aspecto do ensaio, a proteína de interação é um fator de transcrição ou um segundo co-ativador.

[00113] Em um aspecto do ensaio, a proteína de interação é qualquer uma de RIP140; SRC-1 (NCoA-1); TIF2 (GRIP-1; SRC-2); p (CIP; RAC3; ACTR; AIB-1; TRAM-1; SRC-3); CBP (p300); TRAPs (DRIPs); PGC-1; CARM-1; PRIP (ASC-2; AIB3; RAP250; NRC); GT-198; e SHARP (CoAA; p68; p72). Em um outro aspecto do ensaio, a proteína de interação é qualquer uma de TAL 1; p73; MDm2; TBP; HIF-1; Ets-1; RXR; p65; AP-1; Pit-1; HNF-4; Stat2; HPV E2; BRCA1; p45 (NF- E2); c-Jun; c-myb; Tax; Sap 1; YY1; SREBP; ATF-1; ATF-4; Cubitus; Interruptus; Gli3; MRF; AFT-2; JMY; dMad; PyLT; HPV E6; CITTA; Tat; SF-1; E2F; junB; RNA helicase A; C/EBP β; GATA-1; Neuro D; Microftalimia; E1A; TFIIB; p53; P/CAF; Twist; Myo D; pp9O RSK; c-Fos; e SV40 Large T. Em um outro aspecto do ensaio, a proteína de interação é qualquer uma de ERAP140; RIP140; RIP160; Trip1; SWI1 (SNF); ARA70; RAP46; TIF1; TIF2; GRIP1; e TRAP. Em um outro aspecto da invenção, a proteína de interação é qualquer uma de VP16; VP64; p300; CBP; PCAF; SRC1 PvALF; AtHD2A; ERF-2; OsGAI; HALF-1; C1; AP-1; ARF-5; ARF-6; ARF-7; ARF-8; CPRF1; CPRF4; MYC-RP/GP; e TRAB1. Em um outro aspecto da invenção, o primeiro co-ativador é a CBP ou a p300.

[00114] O composto de teste é selecionado a partir dos compostos como descritos aqui. Por exemplo, os compostos tendo as fórmulas (I), (I), (III), (IV), (VI) e (VIa). Tipicamente, um composto de teste será avaliado em diversas concentrações diferentes, onde estas concentrações serão selecionadas, em parte, com base nas condições do ensaio, p.ex., as concentrações do primeiro co-ativador e da proteína de interação. As concentrações na faixa de cerca de 0,1 a 10 μM são típicas. Em um aspecto, o ensaio avalia a eficácia relativa de dois compostos de afetar a interação de ligação entre duas proteínas, onde pelo menos um destes dois compostos é um composto da presente invenção. O composto mais efetivo pode então servir como um composto de referência em um estudo da relação entre a estrutura do composto e a atividade do composto.

[00115] As bibliotecas da presente invenção foram exami-nadas quanto à bioatividade por diversas técnicas e métodos. Em geral, o ensaio de triagem pode ser efetuado (1) contatando os miméticos de uma biblioteca com um alvo biológico de interesse, tal como um receptor, para permitir que a ligação entre os miméticos da biblioteca e o alvo ocorra, e (2) detectando a ocorrência de ligação por um ensaio apropriado, tal como o ensaio calorimétrico divulgado por Lam e col. (Nature354:82-84, 1991) ou Griminski e col. (Biotechnology 12:1008-1011, 1994) (ambos os quais são incorporados aqui por referência). Em uma modalidade prefe-rida, os membros da biblioteca estão em solução e o alvo está imobilizado sobre uma fase sólida. Alternativamente, a biblioteca pode ser imobilizada sobre uma fase sólida e pode ser sondada contatando-a com o alvo em solução.

[00116] A Tabela 4 abaixo mostra compostos para o teste de bioatividade, selecionados a partir da biblioteca da presente invenção, e os seus valores de IC50, que são medidos pelo Ensaio de gene relator, conforme descrito no Exemplo 6. TABELA 4 IC50 (uM) DOS COMPOSTOS DA BIBLIOTECA SELECIONADOS

[00117] Foi verificado, de acordo com a presente invenção, que os compostos de fórmula geral (I), e especialmente os compostos de fórmula geral (VI), podem inibir a ativação transcricional mediada pela CBP em células de câncer, devido à sua ligação específica à CBP. Esta conclusão é suportada pela imunoprecipitação da CBP de células SW480 com os compostos da presente invenção.

[00118] Os compostos da presente invenção também podem inibir a expressão da survivina nas células SW480, e portanto, inibem a atividade oncogênica nas células de câncer. Os compostos da presente invenção podem ser usados para inibir as células de câncer, e assim, seriam úteis para a regulação do crescimento da célula. Suportando tais resultados, os compostos da presente invenção mostram adicionalmente que podem induzir a ativação da caspase-3 em células SW480, e portanto, induzem a atividade apoptótica nas células. Os compostos da presente invenção podem ser também vantajosamente usados para induzir a apoptose nas células.

[00119] Para confirmar a atividade oncogênica na célula de câncer em MTS in vitro, o ensaio de citotoxicidade foi testado pelo seguinte método.

(1) Teste de citotoxicidade

[00120] As células SW480 ou HCT116 foram colocadas em microplaca com 96 poços (104 células/poço) e incubadas por 24 horas a 37°C. As células foram tratadas com o composto TCF4 em várias concentrações, por 24 horas. 20 μl de solução de MTS (Promega) foram adicionados a cada poço e incubados por 2 horas a 37°C. A viabilidade da célula foi medida lendo-se a absorbância a 490 nm, usando a leitora de microplaca (Molecular Device), e a citotoxicidade de um composto em cada concentração foi calculada.

(2) Ensaio de inibição do crescimento

[00121] As células SW480 ou HCT116 foram colocadas em microplaca com 96 poços (104 células/poço) e incubadas por 24 horas a 37°C. 20 μl de solução de [sal interno de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H- tetrazólio] (MTS) (Promega) foram adicionados a cada poço e a absorbância, após incubação por 2 horas a 37°C (controle negativo), foi lida. E então, as células foram tratadas com composto TCF4 em diversas concentrações, por 48 horas. 20 μl de solução de MTS (Promega) foram adicionados a cada poço e incubados por 2 horas a 37°C. A viabilidade da célula foi medida lendo-se a absorbância a 490 nm, usando uma leitora de microplaca (Molecular Device), e a citotoxicidade de um composto em cada concentração foi calculada.

[00122] Os resultados da atividade oncogênica para os compostos da biblioteca selecionados foram mostrados na Tabela 5. Os números dos compostos na Tabela 5 não estão relacionados aos números dos compostos na Tabela 4. TABELA 5 ATIVIDADE ONCOGÊNICA POR ENSAIO DE MTS OU SULFORRODAMINA B PARA OS COMPOSTOS DA BIBLIOTECA SELECIONADOS

[00123] Em outros aspectos, a presente invenção propor-ciona composições farmacêuticas contendo um composto tendo a fórmula geral (I), ou a fórmula geral (II), ou a fórmula geral (III), ou a fórmula geral (IV), ou a fórmula geral (VI). Estas composições podem ser usadas em diversos métodos (p.ex., tratamento de câncer ou doença de Alzheimer) da presente invenção, conforme descrito em detalhe abaixo.

[00124] A composição farmacêutica da presente invenção é formulada para ser compatível com a sua rota pretendida de administração. Os exemplos de rotas de administração incluem a administração parenteral, p.ex., intravenosa, intradérmica, subcutânea, oral (p.ex., inalação), transdérmica (tópica), transmucosa, e retal. As soluções ou as suspensões usadas para a aplicação parenteral, intradérmica, ou subcutânea podem incluir os seguintes componentes: um diluente estéril, tal como a água para injeção, a solução salina, os óleos fixos, os polietileno glicóis, a glicerina, o propileno glicol ou outros solventes sintéticos; os agentes antibacte-rianos, tais como o álcool benzílico ou os metil parabenos; os antioxidantes, tais como o ácido ascórbico ou o bissulfito de sódio; os agentes quelantes, tais como o ácido etilenodiaminotetracético; os tampões, tais como os acetatos, os citratos ou os fosfatos e os agentes para o ajuste da tonicidade, tais como o cloreto de sódio ou a dextrose. Além disso, o pH pode ser ajustado com ácidos ou bases, tais como o ácido clorídrico ou o hidróxido de sódio. A preparação parenteral pode ser incluída em ampolas, seringas descartáveis ou frascos pequenos de vidro ou plástico de múltiplas doses.

[00125] As composições farmacêuticas adequadas para uso injetável incluem as soluções (onde solúveis em água) ou as dispersões aquosas estéreis e os pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersão injetáveis estéreis. Para a administração intravenosa, os veículos adequados incluem a solução salina fisiológica, a água bacteriostática, o Cremophor EL® (BASF, Parsippany, NJ) ou a solução salina tamponada com fosfato. Em todos os casos, a composição deve ser estéril e deve ser fluida na medida que exista a fácil capacidade de seringar. Ela deve ser estável sob as condições de manufatura e armazenagem e deve ser conservada contra a ação contaminante de microorganismos, tais como bactérias e fungos. O veículo pode ser um meio de solvente ou dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol, e polieti-leno glicol líquido, e similares), e suas misturas adequadas. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento, tal como a lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula requerido, no caso da dispersão, e pelo uso de tensoativos. A prevenção da ação de microorganismos pode ser obtida por diversos agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal, e similares. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois, tais como manitol, sorbitol, cloreto de sódio, na composição. A absorção prolongada das composições injetáveis pode ser realizada por inclusão na composição de um agente que retarde a absorção, por exemplo, o monoestearato de alumínio e a gelatina.

[00126] As soluções injetáveis estéreis podem ser prepa-radas por incorporação do composto ativo (i.e., um composto tendo a fórmula geral (I), (II), (III), (IV), ou (VI)) na quantidade requerida, em um solvente apropriado, com um ou uma combinação de ingredientes enumerados acima, conforme requerido, seguida por esterilização filtrada. Geralmente, as dispersões são preparadas por incorporação do composto ativo em um veículo estéril que contém um meio de dispersão e os outros ingredientes requeridos a partir daqueles enumerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos preferidos de preparação são a secagem a vácuo e a liofilização, que produz um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente desejado adicional a partir de uma solução previamente filtrada estéril do mesmo.

[00127] As composições orais geralmente incluem um diluente inerte ou um veículo comestível. Elas podem ser incluídas em cápsulas gelatinosas ou prensadas em comprimidos. Para o propósito de administração oral terapêutica, o composto ativo pode ser incorporado com excipientes e usado na forma de comprimidos, trociscos, ou cápsulas. As composições orais também podem ser preparadas usando um veículo fluido para uso como um colutório, em que o composto no veículo fluido é aplicado oralmente e bochechado e expectorado ou engolido. Os agentes de ligação farmaceuticamente compatíveis e/ou os materiais adjuvantes podem ser incluídos como parte da composição. Os comprimidos, as pílulas, as cápsulas, os trociscos e similares podem conter quaisquer dos seguintes ingredientes, ou compostos de uma natureza similar: um ligante, tal como a celulose microcristalina, a goma do tragacanto ou a gelatina; um excipiente, tal como o amido ou a lactose, um agente desintegrante, tal como o ácido algínico, o Primogel, ou o amido de milho; um lubrificante, tal como o estearato de magnésio ou Sterotes; um agente de deslizamento, tal como o dióxido de silício coloidal; um agente adoçante, tal como a sacarose ou a sacarina; ou um agente aromatizante, tal como a essência de hortelã-pimenta, salicilato de metila, ou laranja.

[00128] Para a administração por inalação, os compostos são distribuídos na forma de um spray aerossol a partir de recipiente ou dosador pressurizado que contém um propulsor adequado, p.ex., um gás, tal como o dióxido de carbono, ou um nebulizador.

[00129] A administração sistêmica também pode ser por meio transmucoso ou transdérmico. Para a administração transmucosa ou transdérmica, são usados na formulação penetrantes apropriados para a barreira a ser permeada. Tais penetrantes são geralmente conhecidos na técnica, e incluem, por exemplo, para a administração transmucosa, os detergentes, os sais biliares, e os derivados de ácido fusídico. A administração transmucosa pode ser efetuada através do uso de sprays nasais ou supositórios. Para a administração transdérmica, os compostos ativos são formulados em ungüentos, pomadas, géis, ou cremes, conforme geralmente conhecido na técnica.

[00130] Os compostos também podem ser preparados na forma de supositórios (p.ex., com as bases convencionais de supositórios, tais como a manteiga de cacau e outros glicerídeos) ou enemas de retenção para a distribuição retal.

[00131] Em uma modalidade, os compostos ativos são preparados com veículos que protegerão o composto contra a rápida eliminação do corpo, tais como uma formulação de liberação controlada, incluindo os implantes e os sistemas de distribuição microencapsulados. Os polímeros biocompatíveis, biodegradáveis, podem ser usados, tais como etileno acetato de vinila, polianidridos, poli(ácido glicólico), colágeno, poliortoésteres, e poli(ácido láctico). Os métodos para a preparação de tais formulações serão aparentes para aqueles versados na técnica. Os materiais também podem ser obtidos comercialmente da Alza Corporation e Nova Pharmaceuticals, Inc. As suspensões lipossômicas (incluindo os lipossomos visados para as células infectadas com anticorpos monoclonais para antígenos virais) também podem ser usadas como veículos farmaceuticamente aceitáveis. Estas podem ser preparadas de acordo com métodos conhecidos para aqueles versados na técnica, por exemplo, como descrito na Patente U.S. No 4.522.811.

[00132] É especialmente vantajoso formular as composições orais ou parenterais na forma de unidade de dosagem para a facilidade de administração e a uniformidade de dosagem. A forma de unidade de dosagem, como usada aqui, refere-se às unidades fisicamente discretas, adequadas como dosagens unitárias para o paciente a ser tratado; cada unidade contendo uma quantidade predeterminada de composto ativo, calculada para produzir o efeito terapêutico desejado, em associação com o veículo farmacêutico requerido. A especificação para as formas de unidades de dosagens da invenção é ditada pelas, e diretamente dependente das, características únicas do composto ativo e pelo efeito terapêutico particular a ser atingido, e pelas limitações inerentes na técnica de combinar um tal composto ativo para o tratamento de indivíduos.

[00133] A toxicidade e a eficácia terapêutica de tais compostos pode ser determinada por procedimentos-padrão farmacêuticos em culturas de células ou animais experimentais, p.ex., para determinar a LD50 (a dose letal para 50% da população) e a ED50 (a dose terapeuticamente efetiva em 50% da população). A razão de doses entre os efeitos tóxicos e terapêuticos é o índice terapêutico e pode ser expressa como a razão LD50/ED50. Os compostos que exibem grandes índices terapêuticos são preferidos. Embora os compostos que exibem efeitos colaterais possam ser usados, deve ser tomado cuidado para projetar um sistema de distribuição que objetive tais compostos para o local do tecido afetado, a fim de minimizar o dano potencial às células não infectadas e, desse modo, reduzir os efeitos colaterais.

[00134] Os dados obtidos a partir dos ensaios de culturas de células e dos estudos de animais podem ser usados na formulação de uma faixa de dosagem para uso em seres humanos. A dosagem de tais compostos situa-se preferivelmente dentro de uma faixa de concentrações circulantes que incluem a ED50 com pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem pode variar dentro desta faixa, dependendo da forma de dosagem empregada e da rota de administração utilizada. Para qualquer composto usado no método da invenção, a dose terapeuticamente efetiva pode ser estimada inicialmente a partir de ensaios de culturas de células. Uma dose pode ser formulada em modelos de animais para obter uma faixa de concentrações plasmáticas circulantes que inclui a IC50 (i.e., a concentração do composto de teste que atinge uma inibição semimáxima dos sintomas), como determinada na cultura de células. Tal informação pode ser usada para determinar mais precisamente as doses úteis em seres humanos. Os níveis no plasma podem ser medidos, por exemplo, através de cromatografia líquida de alta performance.

[00135] Por exemplo, em certas modalidades, uma composição farmacêutica da presente invenção é uma adequada para a administração oral na forma de dosagem de unidade, tal como um comprimido ou uma cápsula, que contém de cerca de 1 mg a cerca de 1 g do composto desta invenção. Em algumas outras modalidades, uma composição farmacêutica da presente invenção é uma adequada para a injeção intravenosa, subcutânea ou intramuscular. Um paciente pode receber, por exemplo, uma dose intravenosa, subcutânea ou intramuscular de cerca de 1 μg/kg a cerca de 1 g/kg do composto da presente invenção. A dose intravenosa, subcutânea e intramuscular pode ser dada por meio de uma injeção de bolo ou por infusão contínua durante um período de tempo. Alternativamente, um paciente receberá uma dose oral diária aproximadamente equivalente à dose parenteral diária, a composição sendo administrada 1 a 4 vezes por dia.

[00136] A tabela que segue ilustra as formas de dosagens farmacêuticas representativas contendo o composto ou o seu sal farmaceuticamente aceitável para substâncias . terapêuticas ou uso profilático em . seres humanos:

[00137] A composição farmacêutica contendo o composto de fórmulas gerais (I) ou (II) ou (III) ou (IV) ou (VI) pode ser usada para o tratamento de distúrbios modulados pela via de sinalização de Wnt, especialmente o câncer, mais especi-almente o câncer colorretal.

[00138] Em um aspecto, a presente invenção proporciona compostos que inibem a ligação de um derivado de encefalina radiomarcado aos receptores de opiato δ e μ. Desse modo, os miméticos de direção inversa da presente invenção podem ser usados como agonistas de receptores e como agentes analgésicos potenciais.

[00139] Em um outro aspecto, a presente invenção propor-ciona métodos para inibir o crescimento do tumor. Tais métodos compreendem a etapa de administrar a um paciente (p.ex., um paciente mamífero) tendo um tumor um composto com a fórmula geral (I), especialmente a fórmula geral (VI), em uma quantidade efetiva para inibir o crescimento do tumor. Um composto ou uma composição inibe o crescimento do tumor se os tamanhos dos tumores forem estatística e significati-vamente menores nos pacientes com o tratamento do composto ou da composição do que aqueles sem o tratamento.

[00140] O efeito inibitório de um composto ou uma composição particular da presente invenção sobre o cresci-mento do tumor pode ser caracterizado por quaisquer métodos apropriados, conhecidos na técnica. Por exemplo, o efeito do composto ou da composição sobre a expressão da survivina pode ser medido. Os compostos ou as composições que infra-regulam a expressão da survivina são prováveis de terem efeitos inibitórios sobre o crescimento do tumor. Ademais, os ensaios usando linhagens de células de tumor (p.ex., os ensaios de ágar mole usando as células SW480) e modelos de animais para o crescimento do tumor (p.ex., camundongos nus enxertados com células de tumor e modelo de camundongo Min) também podem ser usados para avaliar o efeito inibitório sobre o crescimento do tumor de um dado composto ou composição, como descrito em detalhe nos exemplos. Os outros modelos de animais ou xenoenxertos ilustrativos para o crescimento do tumor incluem aqueles para câncer de mama (Guo e col., Cancer Res. 62: 4678-84, 2002; Lu e col., Breast Cancer Res. Treat. 57: 183-92, 1999), câncer pancreático (Bouvet e col., Cancer Res. 62: 1534-40, 2002), tumor ovariano (Nilsson e col., Cancer Chemother. Pharmacol. 49: 93-100, 2002; Bao e col., Gynecol. Oncol. 78: 373-9, 2000), melanoma (Demidem e col., Cancer Res. 61: 2294-300, 2001), câncer colorretal (Brown e col., Dig. Dis. Sci. 45: 1578-84, 2000; Tsunoda e col., Anticancer Res. 19: 1149-52, 1999; Cao e col., Clin. Cancer Res. 5: 267-74, 1999; Shawler e col., J. Immunother. Emphasis tumor Immunol. 17: 201-8, 1995; McGregor e col., Dis. Colon. Rectum. 36: 834-9, 1993; Verstijnen e col., Anticancer Res. 8: 1193-200, 1988), câncer hepatocelular (Labonte e col., Hepatol Res. 18: 72-85, 2000), e câncer gástrico (Takahashi e col., Int. J. Cancer 85: 243-7, 2000).

[00141] O composto ou a composição que inibe o crescimento do tumor pode ser administrado a um paciente com um tumor via uma rota apropriada, que depende, por exemplo, do tecido no qual o tumor reside. A dosagem apropriada pode ser determinada usando o conhecimento e as práticas conhecidas na técnica, como acima descrito. O efeito do tratamento do composto ou da composição sobre o crescimento do tumor também pode ser monitorado usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, podem ser usados diversos métodos para monitorar a progressão e/ou o crescimento de câncer colorretal, incluindo a colonoscopia, a sigmoidoscopia, a biopsia, a tomografia computadorizada, o ultra-som, a imagem de ressonância magnética, e a tomografia de emissão de pósitron. Os métodos para monitorar a progressão e/ou o crescimento do câncer ovariano incluem, por exemplo, o ultra-som, a tomografia computadorizada, a imagem de ressonância magnética, os raios X do tórax, a laparoscopia, e a amostragem de tecido.

[00142] Em um aspecto relacionado, a presente invenção proporciona um método para tratar ou prevenir o câncer. Tais métodos compreendem a etapa de administrar a um paciente estando necessitado do mesmo um composto ou uma composição tendo a fórmula geral (I), especialmente o composto de fórmula geral (VI), em uma quantidade efetiva para tratar ou prevenir o câncer no paciente. Tratar o câncer é entendido incluir a redução ou a eliminação da progressão do câncer (p.ex., o crescimento e a metástase do câncer). Prevenir o câncer é entendido incluir a prevenção ou o retardo do início do câncer. Diversos tipos de câncer podem ser tratados ou prevenidos pela presente invenção. Eles incluem, porém não estão limitados ao, câncer de pulmão, câncer de mama, câncer colorretal, câncer do estômago, câncer pancreático, câncer do fígado, câncer do útero, câncer ovariano, gliomas, melanoma, linfoma, e leucemia.

[00143] Um paciente estando necessitado de tratamento pode ser um primata humano ou não humano ou outro animal com diversos tipos de câncer. Um paciente estando necessitado de prevenção pode ser um primata humano ou não humano ou outro animal que esteja correndo risco de desenvolver câncer. Os métodos para diagnosticar o câncer e examinar os indivíduos com alto risco de câncer são conhecidos na técnica e podem ser usados na presente invenção. Por exemplo, o câncer colorretal pode ser diagnosticado por teste de sangue oculto fecal, sigmoidoscopia, colonoscopia, enema de bário com contraste de ar, e colonoscopia virtual. Um indivíduo com alto risco de câncer colorretal pode ter um ou mais fatores de risco de câncer colorretal, tais como forte história familiar de câncer colorretal ou pólipos, uma história familiar conhecida de síndromes de câncer colorretal hereditário, uma história pessoal de pólipos adenomatosos, e uma história pessoal de doença inflamatória crônica do intestino.

[00144] Um composto com a fórmula geral (I) útil no tratamento ou na prevenção de câncer pode ser identificado por métodos apropriados, conhecidos na técnica. Os métodos que podem ser usados para selecionar os compostos quanto ao efeito inibitório sobre o crescimento do tumor, como descrito acima, também podem ser usados. A rota de administração, a dosagem de um dado composto, a eficácia do tratamento podem ser determinadas usando o conhecimento e as práticas conhecidas na técnica. Os fatores que podem ser considerados ao fazer uma tal determinação incluem, por exemplo, o tipo e o estágio do câncer a ser tratado.

[00145] O composto com a fórmula geral (I) útil no tratamento e na prevenção do câncer pode ser administrado em combinação com um agente antineoplástico. Um agente antineo-plástico refere-se a um composto que inibe o crescimento do tumor. Os agentes antineoplásticos ilustrativos incluem o Fluorouracil; a 5-flúor-2,4(1H, 3H)-pirimidinadiona (5-FU), o taxol, a cisplastina, a mitomicina C, o tegafur, o raltitrexed, a capecitabina, e o irinotecano (Arango e col., Cancer Research 61, 2001 4910-4915). Um composto com a fórmula geral (I) administrado em combinação com um agente antineoplástico não necessariamente requer que o composto e o agente antineoplástico sejam administrado simultaneamente. O composto e o agente podem ser administrados separadamente, contanto que ambos tenham efeitos sobre células de câncer iguais.

[00146] Em um aspecto relacionado adicional, a presente invenção proporciona métodos para promover a apoptose em células de câncer. Tais métodos compreendem a etapa de contatar as células de câncer com um composto tendo a fórmula geral (I), especialmente um composto tendo a fórmula geral (VI), em uma quantidade efetiva para promover a apoptose nestas células. Um composto promove a apoptose se o número de células de câncer sofrendo apoptose for estatística e significativamente maior na presença do composto do que aquele na ausência do composto. Tais compostos podem ser identificados por métodos conhecidos na técnica (p.ex., medir as atividades das caspases e/ou a morte da célula) usando linhagens de células de câncer cultivadas, xenoenxer-tos, ou modelos de câncer de animais. De preferência, o composto é mais ativo na promoção da apoptose nas células de câncer do que nas células normais. As células de câncer tratáveis pelo presente método podem ser a partir de diversas origens de tecidos.

[00147] Em um outro aspecto da presente invenção, é divul-gado um método para tratar um distúrbio modulado pela via de sinalização de Wnt, em que o método compreende administrar a um paciente uma quantidade segura e efetiva dos compostos tendo a fórmula geral (I), especialmente o composto de fórmula geral (VI). A composição farmacêutica contendo o composto da presente invenção pode ser também usada para este propósito. Com relação a isto, é verificado na presente invenção que os compostos tendo a fórmula geral (I), especialmente o composto de fórmula geral (VI), ou a composição farmacêutica contendo os mesmos, podem ser usados para o tratamento de distúrbio modulado pelo complexo de TCF4 - β catenina -CBP, que é acreditado ser responsável pelo início da superexpressão das células de câncer relacionadas à via de sinalização de Wnt. Assim, é um outro aspecto da presente invenção proporcionar um método para o tratamento de distúrbio modulado pelo complexo de TCF4 - β cateina - CBP, usando os compostos tendo a fórmula geral (I), especialmente o composto de fórmula geral (VI).

[00148] A presente invenção também proporciona compostos e métodos para inibir a expressão da survivina. A survivina é um gene-alvo da via de TCF/beta- catenina, e mais especificamente é um gene-alvo da via de TCF/beta-catenina/ CBP. Ela é um membro da família de proteínas IAP (Inibidor da Proteína de Apoptose). A atividade biológica associada com a survivina inclui: altamente expressa em G2/M, regulando a entrada e a saída do ciclo celular; associada com microtúbulo, centrossomas, centrômeros e corpo médio dependendo das fases do ciclo celular; e antiapoptose via interação direta ou indiretamente com as caspases (p.ex., caspase 3, 7 e 9). Em conexão com o câncer, a survivina é ampla e altamente expressa em células de tumor, porém é expressa até pouco ou nenhum grau em células normais de tecidos. Também tem sido observado que pacientes com câncer, cujos tumores expressavam a survivina, tinham uma sobrevivência global diminuída. Além disso, o grau de expressão da survivina tem sido correlacionado com outros marcadores de câncer, p.ex., Ki67, PNCA, p53, APC, etc.

[00149] O efeito de um composto particular da presente invenção sobre a expressão da survivina pode ser caracterizado por métodos conhecidos na técnica. Tais métodos incluem os métodos para caracterizar a expressão da survivina no nível transcricional ou translacional. Os métodos ilustrativos para caracterizar a expressão da survivina no nível transcricional são: microarranjo de DNA, transcrição invertida-reação em cadeia por polimerase (RT-PCR), imunoprecipitação de cromatina (ChIP), e ensaios para atividades de relatores efetuados por promotor de survivina. Os métodos ilustrativos para caracterizar a expressão da survivina no nível translacional são: análise de Western blot, imunoquímica e atividades das caspases. As descrições detalhadas dos métodos ilustrativos acima mencionados podem ser encontradas nos exemplos abaixo.

[00150] Conforme acima descrito, a presente invenção proporciona métodos para inibir a expressão da survivina. Tais métodos compreendem a etapa de contatar uma célula de expressão da survivina com um composto da presente invenção, em uma quantidade efetiva para inibir a expressão da survivina. Um composto inibe a expressão da survivina se a expressão da survivina em uma célula for diminuída na presença do composto, comparada à expressão da survivina na ausência do composto. As células de expressão de survivina incluem as células de tumor que expressam, tais como as células em ou de câncer de pulmão, câncer de mama, câncer de estômago, câncer pancreático, câncer de fígado, câncer de útero, câncer ovariano, gliomas, melanoma, câncer colorretal, linfoma e leucemia. A etapa de contatar as células de expressão de survivina com o composto pode ser efetuada in vitro, ex vivo, ou in vivo. Um composto útil na inibição da expressão da survivina pode ser identificado, e os efeitos de um composto particular da presente invenção podem ser caracterizados, por métodos apropriados conhecidos na técnica, como descritos em detalhe abaixo.

[00151] Os compostos da presente invenção têm sido mostrados inibirem a expressão da survivina. Blanc-Brude e col., Nat. Medicine 8:987 (2002), mostraram que a survivina é um regulador crítico da apoptose de células do músculo liso, que é importante na remodelagem patológica da parede dos vaso. Assim, um outro aspecto da presente invenção proporciona um método de tratar ou prevenir a reestenose associada com a angioplastia, compreendendo administrar a um paciente estando necessitado do mesmo uma quantidade segura e efetiva de um mimético de direção inversa da presente invenção. Em uma modalidade, a invenção trata a reestenose, i.e., a administração de um mimético de direção inversa da presente invenção a um paciente tendo reestenose atinge uma redução na gravidade, proporção, ou grau, etc. da reestenose. Em uma outra modalidade, a invenção impede a reestenose, i.e., a administração de um mimético de direção inversa da presente invenção a um paciente, que é esperado desenvolver reestenose nova ou adicional, atinge uma redução na gravidade, proporção, ou grau, etc. esperados da reestenose. Opcionalmente, o paciente é um paciente mamífero.

[00152] Os compostos da presente invenção têm sido mostrados inibirem a transcrição de TCF/B-catenina. Rodova e col., J. Biol. Chem. 277:29577 (2002), mostraram que o promotor de PKD-1 é um alvo da via de B-catenina/TCF. Desse modo, um outro aspecto da presente invenção proporciona um método de tratar ou prevenir a doença do rim policístico, compreendendo administrar a um paciente estando necessitado do mesmo uma quantidade segura e efetiva de um mimético de direção inversa da presente invenção. Em uma modalidade, a invenção trata a doença do rim policístico, i.e., a administração de um mimético de direção inversa da presente invenção a um paciente tendo doença de rim policístico atinge uma redução na gravidade, proporção, ou grau, etc. da doença do rim policístico. Em uma outra modalidade, a invenção impede a doença do rim policístico, i.e., a administração de um mimético de direção inversa da presente invenção a um paciente, que é esperado desenvolver uma doença do rim policístico nova ou adicional, atinge uma redução na gravidade, proporção, ou grau, etc. esperados da doença do rim policístico. Opcionalmente, o paciente é um paciente mamífero.

[00153] Os compostos da presente invenção têm sido mostrados inibirem a expressão da sinalização de Wnt. Hanai e col., J. Cell Bio. 158:529 (2002), mostraram que a endostatina, um conhecido fator antiangiogênico, inibe a sinalização de Wnt. Desse modo, um outro aspecto da presente invenção proporciona um método de tratar ou prevenir a doença de angiogênese anormal, compreendendo administrar a um paciente estando necessitado do mesmo uma quantidade segura e efetiva de um mimético de direção inversa da presente invenção. Em uma modalidade, a invenção trata a doença de angiogênese anormal, i.e., a administração de um mimético de direção inversa da presente invenção a um paciente tendo doença de angiogênese anormal atinge uma redução na gravidade, proporção, ou grau, etc. da doença de angiogênese anormal. Em uma outra modalidade, a invenção impede a doença de angiogênese anormal, i.e., a administração de um mimético de direção inversa da presente invenção a um paciente, que é esperado desenvolver uma doença de angiogênese anormal nova ou adicional, atinge uma redução na gravidade, proporção, ou grau, etc. esperados da doença de angiogênese anormal. Opcionalmente, o paciente é um paciente mamífero.

[00154] Os compostos da presente invenção têm sido mostrados inibirem a expressão da sinalização de Wnt. Sen e col., P.N.A.S. (USA) 97:2791 (2000), mostraram que os mamíferos com artrite reumatóide demonstram expressão aumentada de Wnt e Fz no tecido sinovial com AR. Desse modo, um outro aspecto da presente invenção proporciona um método de tratar ou prevenir a doença de artrite reumatóide, compreendendo administrar a um paciente estando necessitado do mesmo uma quantidade segura e efetiva de um mimético de direção inversa da presente invenção. Em uma modalidade, a invenção trata a doença de artrite reumatóide, i.e., a administração de um mimético de direção inversa da presente invenção a um paciente tendo doença de artrite reumatóide atinge uma redução na gravidade, proporção, ou grau, etc. da doença de artrite reumatóide. Em uma outra modalidade, a invenção impede a doença de artrite reumatóide, i.e., a administração de um mimético de direção inversa da presente invenção a um paciente, que é esperado desenvolver uma doença de artrite reumatóide nova ou adicional, atinge uma redução na gravidade, proporção, ou grau, etc. esperados da doença de artrite reumatóide. Opcionalmente, o paciente é um paciente mamífero.

[00155] Os compostos da presente invenção têm sido mostrados inibirem a expressão da sinalização de Wnt. Uthoff e col., Int. J. Oncol. 19:803 (2001), mostraram que a supra-regulação diferencial de fz desordenada (moléculas da via de Wnt) ocorre em colite ulcerativa (em comparação com os pacientes com doença de Chron). Desse modo, um outro aspecto da presente invenção proporciona um método de tratar ou prevenir a colite ulcerativa, compreendendo administrar a um paciente estando necessitado do mesmo uma quantidade segura e efetiva de um mimético de direção inversa da presente invenção. Em uma modalidade, a invenção trata a colite ulcerativa, i.e., a administração de um mimético de direção inversa da presente invenção a um paciente tendo colite ulcerativa atinge uma redução na gravidade, proporção, ou grau, etc. da colite ulcerativa. Em uma outra modalidade, a invenção impede a colite ulcerativa, i.e., a administração de um mimético de direção inversa da presente invenção a um paciente, que é esperado desenvolver colite ulcerativa nova ou adicional, atinge uma redução na gravidade, proporção, ou grau, etc. esperados da colite ulcerativa. Opcionalmente, o paciente é um paciente mamífero.

[00156] Os compostos da presente invenção têm sido mostrados inibirem a sinalização de Wnt TCF/catenina. Desse modo, um outro aspecto da invenção proporciona um método de tratar ou prevenir o complexo de esclerose tuberosa (TSC), compreendendo administrar a um paciente estando necessitado do mesmo uma quantidade segura e efetiva de um mimético de direção inversa da presente invenção. Os pacientes tendo TSC tipicamente desenvolvem lesões focais múltiplas no cérebro, coração, rim e outros tecidos (ver, p.ex., Gomez, M.R. Brain Dev. 17(supl.): 55-57 (1995)). Os estudos em células mamíferas mostraram que a superexpressão de TSC1 (que expressa a hamartina) e TSC2 (que expressa a tuberina) regula negativamente a proliferação de células e induz a retenção de G1/S (ver, p.ex., Miloloza, A. e col., Hum. Mol. Genet. 9: 1721-1727 (2000)). Outros estudos mostraram que a hamartina e a tuberina funcionam no nível do complexo de degradação de β-catenina, e mais especificamente que estas proteínas regulam negativamente a estabilidade e a atividade da beta-catenina participando no complexo de degradação de beta-catenina (ver, p.ex, Mak, B.C., e col. J. Biol. Chem. 278(8): 5947-5951, (2003)). A beta-catenina é uma proteína de 95 kDa que participa na adesão da célula através de sua associação com membros da família de caderina ligada à membrana, e na proliferação e na diferenciação da célula como um componente-chave da via de Wnt/Wingless (ver, p.ex., Daniels, D.L., e col., Trends Biochem. Sci. 26: 672-678 (2001)). A regulação errada desta via tem sido mostrada ser oncogênica em seres humanos e rodentes. A presente invenção proporciona compostos que modulam a atividade da β-catenina, e particularmente as suas interações com outras proteínas, e desse modo pode ser usada no tratamento de TSC. Assim, em uma modalidade, a invenção trata o TSC, i.e., a administração de um mimético de direção inversa da presente invenção a um paciente tendo TSC atinge uma redução na gravidade, propor-ção, ou grau, etc. do TSC. Em uma outra modalidade, a invenção impede o TSC, i.e., a administração de um mimético de direção inversa da presente invenção a um paciente, que é esperado desenvolver TSC novo ou adicional, atinge uma redução na gravidade, proporção, ou grau, etc. esperados do TSC. Opcionalmente, o paciente é um paciente mamífero.

[00157] Os compostos da presente invenção têm sido mostrados inibirem a expressão da sinalização de Wnt. O antígeno nuclear associado à latência (LANA) do vírus do herpes associado ao sarcoma de Kaposi (KSHV) é expresso em todos os tumores associados ao KSHV, incluindo o sarcoma de Kaposi (KS) e as malignidades das células β, tais como o linfoma de efusão primário (PEL) e a doença de Castleman multicêntrica. Fujimoro, M. e col., Nature Medicine 9(3): 300-306 (2003), mostraram que o LANA atua para estabilizar a β-catenina, aparentemente por redistribuição da GSK-3 β regular negativa. A presente invenção proporciona compostos e métodos para inibir as interações da proteína β-catenina, p.ex., a formação do complexo de β-catenina/TCF. Assim, os compostos da presente invenção impedem o acúmulo induzido pelo LANA do complexo de β-catenina/TCF e, pelo menos em parte, as conseqüências da infecção pelo KSHV. Desse modo, um outro aspecto da presente invenção proporciona um método de tratar ou prevenir as condições devidas à infecção pelo vírus do herpes associado ao sarcoma de Karposi (KSHV). Tais condições incluem os tumores associados ao KSHV, incluindo o sarcoma de Kaposi (KS) e o linfoma de efusão primário (PEL). O método compreende administrar a um paciente estando necessitado do mesmo uma quantidade segura e efetiva de um mimético de direção inversa da presente invenção. Em uma modalidade, a invenção trata o tumor associado ao KSHV, i.e., a administração de um mimético de direção inversa da presente invenção a um paciente tendo um tumor associado ao KSHV atinge uma redução na gravidade, proporção, ou grau, etc. do tumor. Em uma outra modalidade, a invenção impede um tumor associado ao KSHV, i.e., a administração de um mimético de direção inversa da presente invenção a um paciente, que é esperado desenvolver tumores associados ao KSHV novos ou adicionais, atinge uma redução na gravidade, proporção, ou grau, etc. esperados do tumor. Opcionalmente, o paciente é um paciente mamífero.

[00158] As proteínas de ligação ao DNA de LEF/TCF atuam de comum acordo com a β-catenina ativada (o produto da sinalização de Wnt) para transativar os genes-alvo a jusante. DasGupta, R. e Fuchs, E. Development 126(20):4557-68 (1999) demonstraram a importância dos complexos ativados de LEF/TCF em tempos distintos no desenvolvimento e na ciclização de pelos quando ocorrem mudanças nas práticas de ruína e diferenciação da célula. Além disso, na morfogênese da pele, a β-catenina tem sido mostrada ser essencial para a formação de folículo piloso, sua superexpressão causando o fenótipo “peludo” em camundongos (Gat, U., e col., Cell 95:605-614 (1998) e Fuchs, E. Harvey Lect. 94:47-48 (1999)). Ver também Zia, X. e col. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:10863-10868 (2001). Os compostos da presente invenção têm sido mostrados inibirem a expressão da sinalização de Wnt, e interferem com a formação de complexos de β-catenina. Desse modo, a presente invenção proporciona um método para modular o crescimento de pelos, compreendendo administrar a um paciente estando necessitado do mesmo uma quantidade segura e efetiva de um mimético de direção inversa da presente invenção, onde a quantidade é efetiva para modular o crescimento de pelos no paciente. Opcionalmente, o paciente é um paciente mamífero.

[00159] A presente invenção proporciona compostos úteis no tratamento ou na prevenção da doença de Alzheimer. A doença de Alzheimer (AD) é uma doença neurodegenerativa com demência progressiva. Esta doença é acompanhada por três mudanças estruturais principais no cérebro, a saber, i) depósitos de proteínas intracelulares (também conhecidos como emaranhamentos neurofibrilares, ou NFT), ii) depósitos de proteínas extracelulares chamados placas amilóides que são circundadas por neurite distrófica, e iii) perda difusa de neurônios.

[00160] Os compostos ou as composições da presente invenção resgatam os defeitos na diferenciação neuronal causada por uma mutação da presenilina-1 e podem diminuir o número ou a taxa na qual as populações precursoras neuronais diferen-ciam-se em neurônios nos cérebros de Alzheimer. As presenilinas são proteínas de transmembrana cujas funções estão relacionadas ao tráfego, renovação e clivagem da Proteína Precursora Notch e Amilóide. As mutações de sentidos equívocos na presenilina 1 (PS-1) estão associadas com a doença de Alzheimer familiar de início antecipado (Fraser e col, Biochem. Soc. Symp. 67, 89 (2001)). Os compostos da presente invenção podem ser aplicáveis não somente aos indivíduos com mutações na PS-1 relativas ao Alzheimer familiar, como também aos pacientes de Alzheimer gerais.

[00161] Além disso, a presente invenção proporciona um método para tratar ou prevenir a doença de Alzheimer, compreendendo administrar a um paciente estando necessitado do mesmo uma quantidade segura e efetiva de um mimético de direção inversa da presente invenção, onde a quantidade é efetiva para tratar ou prevenir a doença de Alzheimer no paciente. Tratar a doença de Alzheimer é entendido incluir a redução ou a eliminação da manifestação de sintomas característicos da doença de Alzheimer, ou o retardo da progressão desta doença. Prevenir a doença de Alzheimer é entendido incluir a prevenção ou o retardo do início desta doença.

[00162] Um paciente estando necessitado de tratamento pode ser um primata humano ou não humano ou outro animal que esteja em diversos estágios da doença de Alzheimer. Os métodos para diagnosticar a doença de Alzheimer são conhecidos na técnica (ver, p.ex., Dinsmore, J. Am. Osteopath. Assoc. 99(9 Suppl.):S1-6, 1999; Kurz e col., J. Neural Transm. Suppl. 62: 127-33, 2002; Storey e col., Front Viosci. 7: e155-84, 2002; Marin e col., Geriatrics 57: 36-40, 2002; Kril e Halliday, Int. Rev. Neurobiol. 48: 167-217, 2001; Gurwitz, Trends Neurosci. 23: 386, 2000; Muller-Spahn e Hock, Eur. Arch. Psychiatry Clin. Neurosci. 249 Suppl. 3: 3742; Fox e Rossor, Rev. Neuro. (Paris) 155 Suppl. 4: S33-7, 1999), incluindo o uso de medições neuropsicológicas, medições de imagem funcional, marcadores biológicos, e autopsia do tecido do cérebro. Um paciente estando necessi-tado de prevenção pode ser um primata humano ou não-humano ou outro animal que esteja correndo risco de desenvolver a doença de Alzheimer, tal como um indivíduo tendo uma mutação de certos genes responsáveis por esta doença (p.ex., os genes codificando a proteína precursora amilóide, presenilina 1, e presenilina 2), e/ou um gene envolvido na patogênese desta doença (p.ex., o gene de apolipoproteína E) (Rocchi e col., Brain Res. Bull. 61: 1-24, 2003).

[00163] Os compostos com as estruturas como apresentadas na fórmula (I) podem ser examinados quanto as suas atividades no tratamento ou na prevenção da doença de Alzheimer por quaisquer métodos apropriados, conhecidos na técnica. Tal triagem pode ser inicialmente efetuada usando células cultivadas in vitro (p.ex., as células PC-12 como descritas no Exemplo 8). Os compostos capazes de resgatarem os defeitos na diferenciação neuronal causada por uma mutação na presenilina 1 podem ser adicionalmente examinados usando diversos modelos de animais para a doença de Alzheimer. Alternativamente, os compostos com as estruturas como apresentadas na fórmula (I) podem ser diretamente testados em modelos de animais para a doença de Alzheimer. Muitos sistemas de modelos são conhecidos na técnica e podem ser usados na presente invenção (ver, p.ex., Rowan e col., Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 358: 821-8, 2003; Lemere e col., Neurochem. Res. 28: 1017-27, 2003; Sant’angelo e col., Neurochem. Res. 28: 1009-15, 2003; Weiner Harv. Rev. Psychiatry 4: 306-16, 1997). Os efeitos dos compostos selecionados sobre o tratamento ou a prevenção da doença de Alzheimer podem ser caracterizados ou monito-rados por métodos conhecidos na técnica para a avaliação do progresso da doença de Alzheimer, incluindo aqueles descritos acima para diagnosticar esta doença.

[00164] A presente invenção também proporciona métodos para promover o desenvolvimento de neuritos. Tais métodos compreendem a etapa de contatar um neurônio com um composto de acordo com a fórmula (I), em uma quantidade efetiva para promover o desenvolvimento de neuritos. Estes métodos são úteis no tratamento de doenças neurodegenerativas (p.ex., glaucoma, degeneração macular, Doença de Parkinson, e doença de Alzheimer) e lesões ao sistema nervoso. Um composto promove o desenvolvimento de neuritos se os comprimentos dos neuritos dos neurônios forem estatística e significativamente mais longos na presença do composto do que aqueles na ausência do composto. Um tal composto pode ser identificado usando células cultivadas in vitro (p.ex., as células PC-12, a célula B104 de neuroblastoma) (Bitar e col., Cell Tissue Res. 298: 233-42, 1999; Pellitteri e col., Eur. J. Histochem. 45: 367-76, 2001; Satoh e col., Biochem. Biophys. Res. Commun. 258: 50-3, 1999; Hirata e Fujisawa, J. Neurobiol. 32:415-25, 1997; Chauvet e col., Glia 18: 211-23, 1996; Vetter e Bishop, Curr. Biol. 5: 168-78, 1994; Koo e col., Proc. natl. Acad. Sci. USA 90: 4748-52, 1993; Skubitz e col., J. Cell Biol. 115: 1137-48, 1991; O’Shea e col., Neuron 7: 231-7, 1991; Rydel e Greene, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 1257-61, 1988) ou usando explantes (Kato e col., Brain Res. 31: 143-7, 1983; Vanhems e col., Eur. J. Neurosci. 2: 776-82, 1990; Carri e col., Int. J. Dev. Neurosci. 12: 567-78, 1994). O contato de um neurônio com um composto de acordo com a presente invenção pode ser realizado in vitro ou in vivo. O neurônio tratado resultante, se gerado in vitro, pode ser transplantado para um tecido estando necessitado dele (Lacza e col., Brain Res. Brain Res. Protoc. 11: 14554, 2003; Chu e col., Neurosci. Lett. 343: 129-33, 2003; Fukunaga e col., Cell Transplant 8: 435-41, 1999).

[00165] A presente invenção também proporciona métodos para promover a diferenciação de uma célula-tronco neural, compreendendo contatar uma célula-tronco neural com um composto de acordo com a fórmula (I), em uma quantidade efetiva para promover a diferenciação de uma célula-tronco neural. Tais métodos são também úteis no tratamento de doenças neurodegenerativas (p.ex., glaucoma, degeneração macular, Doença de Parkinson, e doença de Alzheimer) e lesões ao sistema nervoso. A “célula-tronco neural” refere-se a uma célula multipotente, indiferenciada, clonogênica, capaz de diferenciar-se em um neurônio, um astrócito ou um oligodendrócito sob condições apropriadas. Um composto promove a diferenciação das células-tronco neurais se as células-tronco neurais exibirem um grau estatística e significativamente maior de diferenciação na presença do composto do que na ausência do composto. Um tal composto pode ser identificado usando ensaios envolvendo as células-tronco cultivadas in vitro ou os modelos de animais (Albranches e col., Biotechnol. Lett. 25: 725-30, 2003; Deng e col., Exp. Neurol. 182: 373-82, 2003; Munoz-Elias e col., Stem Cells 21: 437-48, 2003; Kudo e col., Biochem. Pharmacol. 66: 289-95, 2003; Wan e col., Chin Med. J. 116: 428-31, 2003; Kawamorita e col., Hum. Cell 15: 178-82, 2002; Stavridis e Smith, Biochem. Soc. Trans. 31: 45-9, 2003; Pachernik e col., Reprod. Nutr. Dev. 42: 31726, 2002; Fukunaga e col., supra). A célula-tronco neural pode ser uma célula-tronco cultivada, uma célula-tronco recentemente isolada de seu tecido-fonte, ou uma célula-tronco dentro de seu organismo-fonte. Assim, o contato da célula-tronco neural com um composto de acordo com a presente invenção pode ser realizado in vitro (para uma célula-tronco cultivada ou recentemente isolada) ou in vivo (para uma célula-tronco dentro de seu organismo-fonte). A célula neural diferenciada resultante, se gerada in vitro, pode ser transplantada para um tecido estando necessitado da mesma (Lacza e col., supra; Chu e col., supra; Fukunaga e col., supra). Um tal tecido inclui um tecido do cérebro ou outro tecido nervoso que sofra de um trauma ou uma doença neurodegenerativa.

[00166] Os exemplos não limitativos que se seguem ilustram os compostos, as composições, e os métodos de uso desta invenção. EXEMPLOS EXEMPLO DE PREPARAÇÃO 1 PREPARAÇÃO DO ÁCIDO (N -FMOC-N’ -R3-HIDRAZINO)-ACÉTICO (1) Preparação da N -Fmoc-N’-Metil Hidrazina

[00167] Um frasco de fundo redondo, com dois gargalos, de 2 L, foi adaptado com uma rolha de vidro e um tubo de cálcio. Uma solução de sulfato de metil hidrazina (20 g, 139 mmols, onde R3 é metila) em THF (300 mL) foi adicionada e uma solução de DiBoc (33 g, 153 mmols) em THF foi adicionada. A solução aquosa saturada de bicarbonato de sódio (500 mL) foi adicionada, gota a gota, via funil de adição, durante 2 horas, com agitação vigorosa. Após 6 horas, uma solução de Fmoc-Cl (39 g, 153 mmols) em THF foi adicionada lentamente. A suspensão resultante foi agitada por 6 horas a 0°C. A mistura foi extraída com acetato de etila (EA, 500 mL) e a camada orgânica foi retida. A solução foi secada com sulfato de sódio e evaporada in vacuo. A etapa seguinte processou-se sem purificação.

[00168] Um frasco de fundo redondo, com dois gargalos, de 1 L, foi adaptado com uma rolha de vidro e um tubo de cálcio. Uma solução do produto da etapa anterior em MeOH (300 mL) foi adicionada e o HCl conc. (30 mL, 12 N) foi adicionado lentamente, via funil de adição, com agitação magnética, em banho de água gelada, e agitado durante a noite. A mistura foi extraída com EA (1000 mL) e a camada orgânica foi retida. A solução foi secada com sulfato de sódio e evaporada in vacuo. O resíduo foi purificado por recristalização com n-hexano e EA para dar a N-Fmoc-N’-metil hidrazina (32,2 g, 83%). RMN 1H (DMSO-de) δ 7,90~7,88 (d, J = 6 Hz, 2H), δ 7,73~7,70 (d, J = 9 Hz, 2H), 7,44~7,31 (m, 4H), 4,52~4,50 (d, J = 6 Hz, 2H), 4,31~4,26 (t, J = 6 Hz, 1H), 2,69 (s, 1H). (2) Preparação do éster t-butílico do ácido (N-Fmoc-N’-metil-hidrazino)- acético

[00169] Um frasco de fundo redondo, com dois gargalos, de 1 L, foi adaptado com uma rolha de vidro e condensador de refluxo conectado a um tubo de cálcio. Uma solução de N-Fmoc-N’-metil hidrazina (20 g, 75 mmols) em tolueno (300 mL) foi adicionada. Uma solução de bromo acetato de t-butila (22 g, 111 mmols) em tolueno (50 mL) foi adicionada lentamente. O Cs2CO3 (49 g, 149 mmols) foi adicionado lentamente. O NaI (11 g, 74 mmols) foi adicionado lentamente, com agitação vigorosa. A mistura de reação foi agitada na temperatura de refluxo, durante 1 dia. A mistura de produtos foi filtrada e extraída com EA (500 mL). A solução foi secada sobre sulfato de sódio e evaporada in vacuo. O produto foi purificado por cromatografia com solução de hexano:EA = 2 : 1 para dar o éster t- butílico do ácido (N-Fmoc-N’-metil-hidrazino)-acético (19,8 g, 70%).

[00170] RMN-1H (CDCl3-d) δ 7,78~7,75 (d, J = 9 Hz, 2H), δ 7,61~7,59 (d, J = 6 Hz, 2H), 7,43~7,26 (m, 4H), 4,42~4,40 (d, J = 6 Hz, 2H), 4,23 (b, 1H), 3,57 (s, 2H), 2,78 (s, 3H), 1,50 (s, 9H). (3) Preparação do ácido (N -Fmoc-N’-metil-hidrazino)-acético

[00171] Um frasco de fundo redondo, com dois gargalos, de 1 L, foi adaptado com uma rolha de vidro e condensador de refluxo conectado a um tubo de cálcio. O éster t-butílico do ácido (N-Fmoc-N’-metil-hidrazino)-acético (20 g, 52 mmols) foi adicionado. Uma solução de HCl (150 mL, solução a 4 M em dioxana) foi adicionada lentamente, com agitação vigorosa, em um banho de água gelada. A mistura de reação foi agitada na TA durante 1 dia. A solução foi concentrada completamente sob pressão reduzida, a 40°C. Uma solução aq. saturada de NaHCO3 (100 mL) foi adicionada e a camada aquosa foi lavada com éter dietílico (100 mL). O HCl conc. foi adicionado, gota a gota, lentamente, a 0°C (pH 2-3). A mistura foi extraída e a camada orgânica foi retida (500 mL, MC). A solução foi secada com sulfato de sódio e evaporada in vacuo. O resíduo foi purificado por recristalização com n-hexano e acetato de etila para dar o ácido (N-Fmoc-N’-metil- hidrazino)-acético (12 g, 72%). RMN-1H (DMSO-d6) δ 12,38 (s, 1H), 8,56 (b, 1H), 7,89~7,86 (d, J = 9 Hz, 2H), 7,70~7,67 (d, J = 9 Hz, 2H), 7,43~7,29 (m, 4H), 4,29~4,27 (d, J = 6 Hz, 2H), 4,25~4,20 (t, J = 6 Hz, 1H), 3,47 (s, 2H), 2,56 (s, 3H). EXEMPLO DE PREPARAÇÃO 2 PREPARAÇÃO DO ÁCIDO (N -MOC-N’-R7-HIDRAZINO)-ACÉTICO (1) Preparação do éster etílico do ácido (N’-metoxicarbonil-hidrazino)- acético

[00172] A MOC-NH-NH2 (50 g, 0,55 mol) foi dissolvida em DMF (300 ml), e então o bromoacetato de etila (68 ml, 0,555 mol) e o carbonato de potássio (77 g, 0,555 mol) foram adicionados ao vaso de reação. A mistura foi aquecida até 50°C por 5 horas. Após a reação estar completada, a mistura foi filtrada, e diluída com EtOAc, e lavada com salmoura (3 vezes). O produto bruto foi purificado por coluna (eluente : Hex/EtOAc = 4/1) para proporcionar 72 de óleo incolor. (2) Éster etílico do ácido [ N-R7-N’-metoxicarbonil -hidrazino]-acético

[00173] O éster etílico (10 g, 0,05 mol), o carbonato de potássio (6,9 g, 0,05 mol), e o brometo de R7 (14,1 g, 0,06 mol) foram dissolvidos em DMF (200 ml), e a mistura foi aquecida para 50°C por 5 horas. Após a reação estar completada, a mistura foi filtrada, e diluída com EA, e lavada com salmoura (3 vezes). O produto bruto foi purificado por Cromatografia (eluente : Hex/EtOAc = 4/1). (3) Ácido [ N -R7-N’-metoxicarbonil-hidrazino]-acé-tico

[00174] O éster etílico alquilado (9,5 g, 0,03 mol) foi dissolvido em THF/água (1/1, ml), e adicionou-se a solução de NaOH a 2N (28,3 ml), a 0°C. A mistura foi agitada na TA por 2 horas. Após o éster de partida não ser detectado em UV, a solução foi diluída com EA, então separada. A camada aquosa foi acidificada para pH 3~4 por HCl a 1N, e o composto foi extraído por DCM (3 vezes). A camada orgânica combinada foi secada sobre MgSO4, e evaporada para dar um sólido amarelo EXEMPLO 1

(1) Preparação da MMMoc-M^-benzil-hidrazinoglicina

Este composto foi preparado de acordo com o procedimento da literatura. (Cheguillaume e col., Synlett 2000, 3, 331) (2) Preparação da 1-Metoxicarbonil-2,8-dibenzil-6-metil-4,7-dioxo- hexaidro-pirazino[2,1-c][1,2,4]triazina

[00175] A resina de bromoacetal (60 mg, 0,98 mmol/g) e uma solução de benzil amina em DMSO (2,5 ml, 2 M) foram colocadas em frasco pequeno com tampão roscado. A mistura de reação foi agitada a 60°C usando forno rotativo [Robbins Scientific] por 12 horas. A resina foi coletada por filtração, e lavada com DMF, então DCM, para proporcionar um primeiro pedaço de componente.

[00176] Uma solução de Fmoc-alanina (4 equiv., comercial-mente disponível, o segundo pedaço de componente), HATU (PerSeptive Biosystems, 4 equiv.), e DIEA (4 equiv.) em NMP (Advanced ChemTech) foi adicionada à resina. Após a mistura de reação ser agitada por 4 horas, na temperatura ambiente, a resina foi coletada por filtração e lavada com DMF, DCM, e então DMF.

[00177] À resina foi adicionada piperidina a 20% em DMF. Após a mistura de reação ser agitada por 8 min, na temperatura ambiente, a resina foi coletada por filtração e lavada com DMF, DCM, e então DMF.

[00178] Uma solução de N^-Moc-N“-benzil-hidrazinoglicina (4 equiv., composto (3) no exemplo preparativo 2, onde R7 é benzila, 3o pedaço de componente), HOBT [Advanced ChemTech] (4 equiv.), e DIC (4 equiv.) em DMF foi adicionada à resina preparada acima. Após a mistura de reação ser agitada por 3 horas na temperatura ambiente, a resina foi coletada por filtração e lavada com DMF, DCM, e então MeOH. A resina foi secada in vacuo na temperatura ambiente.

[00179] A resina foi tratada com ácido fórmico (2,5 ml) por 18 horas, na temperatura ambiente. Após a resina ser removida por filtração, o filtrado foi condensado sob pressão reduzida para dar o produto como um óleo. RMN-1H (400 MHz, CDCl3) δ ppm; 1,51 (d, 3H), 2,99 (m, 1H), 3,39 (d, 1H), 3,69 (m, 1H), 3,75 (m, 1H), 3,82 (s, 3H), 4,02 (d, 1H), 4,24 (d, 1H), 4,39 (d, 1H), 4,75 (d, 1H), 5,14 (q, 1H), 5,58 (dd, 1H), 7,10-7,38 (m, 10H). EXEMPLO 2

(1) Preparação do cloreto de N’-Fmoc-N-metil-hidrazinocarbonila

[00180] Uma mistura bifásica esfriada com gelo de éster 9H-fluoren-9- ilmetílico do ácido N-metil hidrazina carboxí-lico (107 mg, 0,4 mmol) em 15 ml de CH2Cl2 e 15 ml de NaHCO3 aq. saturado foi rapidamente agitada, ao mesmo tempo em que o fosgênio a 1,93 M em tolueno (1,03 ml, 2 mmols) era adicionado como uma única porção. A mistura de reação foi agitada por 30 min, a fase orgânica foi coletada, e a fase aquosa foi extraída com CH2Cl2. As camadas orgânicas combinadas foram secadas sobre MgSO4, filtradas, e concentradas in vacuo para proporcionar 128 mg (97%) de cloreto de carbamoíla como um sólido espumoso. [Cuidado: O vapor de fosgênio é altamente tóxico. Use-o em uma coifa]. Este produto foi usado para a síntese de fase sólida seguinte, sem purificação adicional.

(2) Preparação de Benzilamida de ácido 2,5-dimetil-7-benzil-3,6-dioxo- hexaidro-[1,2,4]triazolo[4,5-a]pirazina-1 -carboxílico

[00181] A resina de bromoacetal (30 mg, 0,98 mmol/g) e uma solução de benzil amina em DMSO (1,5 ml, 2 M) foram colocadas em frasco pequeno com tampão roscado. A mistura de reação foi agitada a 60°C usando forno rotativo [Robbins Scientific] por 12 horas. A resina foi coletada por filtração, e lavada com DMF, então DCM, para proporcionar o primeiro pedaço de componente.

[00182] Uma solução de Fmoc-alanina (3 equiv., segundo pedaço de componente, comercialmente disponível), HATU (PerSeptive Biosystems, 3 equiv.), e DIEA (3 equiv.) em NMP (Advanced ChemTech) foi adicionada à resina. Após a mistura de reação ser agitada por 4 horas, na temperatura ambiente, a resina foi coletada por filtração e lavada com DMF, DCM, e então DMF, para desse modo adicionar o segundo pedaço de componente ao primeiro pedaço de componente.

[00183] À resina foi adicionada piperidina a 20% em DMF. Após a mistura de reação ser agitada por 8 min, na temperatura ambiente, a resina foi coletada por filtração e lavada com DMF, DCM, e então DMF.

[00184] Uma solução de cloreto de N’-Fmoc-N-metil-hidrazinocarbonila (terceiro e quarto pedaços de componentes combinados, 5 equiv.) obtido na etapa (1) acima descrita, DIEA (5 equiv.) em DCM foi adicionada à resina preparada acima. Após a mistura de reação ser agitada por 4 horas na temperatura ambiente, a resina foi coletada por filtração e lavada com DMF, DCM, e DMF.

[00185] À resina foi adicionada piperidina a 20% em DMF (10 ml para 1 g da resina). Após a mistura de reação ser agitada por 8 min, na temperatura ambiente, a resina foi coletada por filtração e lavada com DMF, DCM, e então DMF.

[00186] A resina foi tratada com uma mistura de isocianato de benzila (4 equiv.) e DIEA (4 equiv.) em DCM por 4 horas, na temperatura ambiente. Então, a resina foi coletada por filtração e lavada com DMF, DCM, e então MeOH. A resina foi secada in vacuo na temperatura ambiente.

[00187] A resina foi tratada com ácido fórmico por 14 horas na temperatura ambiente. Após a resina ser removida por filtração, o filtrado foi condensado sob pressão reduzida para dar o produto como um óleo. RMN-1H (400 MHz, CDCI3) δ ppm; 1,48 (d, 3H), 2,98 (s, 3H), 3,18 (m, 1H), 3,46 (m, 1H), 4,37-4,74 (m, 5H), 5,66 (dd, 1H), 6,18 (m, 1H), 7,10-7,40 (m, 10H).

EXEMPLO 3 PREPARAÇÃO DE BENZILAMIDA DE ÁCIDO 2,5,7-TRIMETIL-3,6-DIOXO- HEXAIDRO-[1,2,4]TRIAZOLO[4,5-A]PIRAZINA-1-CARBOXÍLICO

[00188] O composto do título é preparado de acordo com o mesmo procedimento conforme descrito no Exemplo 2, porém reagindo a resina de bromoacetal com uma solução de metil amina, em vez de benzil amina. RMN-1H (400 MHz, CDCl3) δ ppm; 1,48 (d, 3H), 2,99 (s, 3H), 3,03 (s, 3H), 3,38 (m, 1H), 3,53 (dd, 1H), 4,36 (dd, 1H), 4,52 (q, 1H), 4,59 (dd, 1H), 5,72 (dd, 1H), 6,19 (br.t, 1H), 7,10-7,38 (m, 5H).

EXEMPLO 4 PREPARAÇÃO DE BENZILAMIDA DE ÁCIDO 2-METIL-5-( P- HIDROXIFENILMETIL)-7-NAFTILMETIL-3,6-DIOXO-HEXAIDRO- [1,2,4]TRIAZOLO[4,5-A]PIRAZINA-1-CARBOXÍLICO

[00189] A resina de bromoacetal (30 mg, 0,98 mmol/g) e uma solução de naftilmetil amina em DMSO (1,5 ml, 2 M) foram colocadas em frasco pequeno com tampão roscado. A mistura de reação foi agitada a 60°C usando forno rotativo [Robbins Scientific] por 12 horas. A resina foi coletada por filtração, e lavada com DMF, então DCM, para proporcionar o primeiro pedaço de componente.

[00190] Uma solução de Fmoc-Tyr(OBut)-OH (3 equiv.), HATU (PerSeptive Biosystems, 3 equiv.), e DIEA (3 equiv.) em NMP (Advanced ChemTech) foi adicionada à resina. Após a mistura de reação ser agitada por 4 horas, na temperatura ambiente, a resina foi coletada por filtração e lavada com DMF, DCM, e então DMF, para desse modo adicionar o segundo pedaço de componente ao primeiro pedaço de componente.

[00191] À resina foi adicionada piperidina a 20% em DMF. Após a mistura de reação ser agitada por 8 min, na temperatura ambiente, a resina foi coletada por filtração e lavada com DMF, DCM, e então DMF.

[00192] Uma solução de cloreto de N’-Fmoc-N-metil-hidrazi-nocarbonila (5 equiv.), DIEA (5 equiv.) em DCM foi adicionada à resina preparada acima. Após a mistura de reação ser agitada por 4 horas na temperatura ambiente, a resina foi coletada por filtração e lavada com DMF, DCM, e DMF.

[00193] À resina foi adicionada piperidina a 20% em DMF (10 ml para 1 g da resina). Após a mistura de reação ser agitada por 8 min, na temperatura ambiente, a resina foi coletada por filtração e lavada com DMF, DCM, e então DMF.

[00194] A resina foi tratada com uma mistura de isocianato de benzila (4 equiv.) e DIEA (4 equiv.) em DCM por 4 horas, na temperatura ambiente. Então, a resina foi coletada por filtração e lavada com DMF, DCM, e então MeOH. A resina foi secada in vacuo na temperatura ambiente.

[00195] A resina foi tratada com ácido fórmico por 14 horas na temperatura ambiente. Após a resina ser removida por filtração, o filtrado foi condensado sob pressão reduzida para dar o produto como um óleo.

[00196] RMN-1H (400 MHz, CDCI3) δ ppm; 2,80-2,98 (m, 5H), 3,21-3,37 (m, 2H), 4,22-4,52 (m, 2H), 4,59 (t, 1H), 4,71 (d, 1H), 5,02 (dd, 1H), 5,35 (d, 1H), 5,51 (d, 1H), 6,66 (t, 2H), 6,94 (dd, 2H), 7,21-8,21 (m, 12H).

EXEMPLO 5 PREPARAÇÃO DE BENZILAMIDA DE ÁCIDO 2-METIL-6-( P- HIDROXIFENILMETIL)-8-NAFTIL-4,7-DIOXO-HEXAIDRO-PIRAZINO[2,1- Cir1,2,41TRIAZINA-1-CARBOXÍLICO

[00197] A resina de bromoacetal (60 mg, 0,98 mmol/g) e uma solução de naftilmetil amina em DMSO (2,5 ml, 2 M) foram colocadas em frasco pequeno com tampão roscado. A mistura de reação foi agitada a 60°C usando forno rotativo [Robbins Scientific] por 12 horas. A resina foi coletada por filtração, e lavada com DMF, então DCM.

[00198] Uma solução de Fmoc-Tyr(OBut)-OH (4 equiv.), HATU [PerSeptive Biosystems] (4 equiv.), e DIEA (4 equiv.) em NMP (Advanced ChemTech) foi adicionada à resina. Após a mistura de reação ser agitada por 4 horas, na temperatura ambiente, a resina foi coletada por filtração e lavada com DMF, DCM, e então DMF.

[00199] À resina foi adicionada piperidina a 20% em DMF. Após a mistura de reação ser agitada por 8 min, na temperatura ambiente, a resina foi coletada por filtração e lavada com DMF, DCM, e então DMF.

[00200] Uma solução de N^-Fmoc-N“-benzil-hidrazinoglicina (4 equiv.), HOBT [Advanced ChemTech] (4 equiv.), e DIC (4 equiv.) em DMF foi adicionada à resina preparada acima. Após a mistura de reação ser agitada por 3 horas na temperatura ambiente, a resina foi coletada por filtração e lavada com DMF, e então DCM. À resina foi adicionada piperidina a 20% em DMF (10 ml para 1 g da resina). Após a mistura de reação ser agitada por 8 min, na temperatura ambiente, a resina foi coletada por filtração e lavada com DMF, DCM, e então DMF.

[00201] A resina foi tratada com uma mistura de isocianato de benzila (4 equiv.) e DIEA (4 equiv.) em DCM por 4 horas, na temperatura ambiente. Então, a resina foi coletada por filtração e lavada com DMF, DCM, e então MeOH. Após a resina ser secada in vacuo na temperatura ambiente, a resina foi tratada com ácido fórmico (2,5 ml) por 18 horas, na temperatura ambiente. A resina foi removida por filtração, e o filtrado foi condensado sob pressão reduzida para dar o produto como um óleo.

[00202] RMN-1H (400 MHz, CDCb) δ ppm; 2,73 (s, 3H), 3,13 (d, 1H), 3,21-3,38 (m, 3H), 3,55 (d, 1H), 3,75 (t, 1H), 4,22 (dd, 1H), 4,36 (dd, 1H), 4,79 (d, 1H), 5,22 (t, 1H), 5,47 (m, 2H), 6,68 (d, 2H), 6,99 (d, 2H), 7,21-8,21 (m, 12H); EM (m/z, ESI) 564,1 (MH+) 586,3 (MNa+).

EXEMPLO 6 BIOENSAIO PARA A MEDIÇÃO DA IC50 CONTRA CÉLULAS SW480 E TESTE DE CITOTOXICIDADE SOBRE AS LINHAGENS DE CÉLULAS

[00203] O composto de teste (Composto A) usado neste exemplo foi preparado no Exemplo 4.

a. Ensaio do Gene Relator

[00204] As células SW480 foram transfectadas com o uso do reagente de transfectar Superfect® (Qiagen, 301307). As células foram tripsinizadas rapidamente 1 dia antes da transfecção e preparadas sobre placa com 6 poços (5 x 105 células/poço), de modo que elas estivessem 50-80% confluentes no dia da transfecção.

[00205] Quatro microgramas (TOPFlash) e um micrograma (pRL-null) de DNAs foram diluídos em 150 μl de meio sem soro, e 30 μl de reagente de transfectar Superfect® foram adicionados. A mistura de DNA-Superfect foi incubada na temperatura ambiente por 15 min, e então, 1 ml de DMEM com 10% de FBS foi adicionado a este complexo por umas 3 horas adicionais de incubação. Enquanto os complexos estavam se formando, as células eram lavadas com PBS duas vezes, sem antibióticos.

[00206] Os complexos de DNA-reagente de transfectar Superfect® foram aplicados às células antes de incubar a 37°C em 5% de CO2, por 3 horas. Após a incubação, foi adicionado o meio de recuperação com 10% de FBS para levar o volume final para 1,18 ml. Após 3 horas de incubação, as células foram coletadas e semeadas novamente para a placa com 96 poços (3 x 104células/poço). Após incubação durante a noite a 37°C em 5% de CO2, as células foram tratadas com o Composto A por 24 horas. Finalmente, a atividade foi checada por meio do ensaio de luciferase (Promega, E1960).

A Figura 3 ilustra os resultados da medição da IC50 do Composto A para as células SW480. b. Ensaio de sulforrodamina B (SRB)

[00207] O efeito inibitório do crescimento do Composto A sobre as células listadas abaixo foi medido pelo ensaio de sulforrodamina B. As células SW480 em 100 μl de meio foram preparadas em cada poço da placa com 96 poços e deixadas ligarem-se por 24 horas. O Composto A foi adicionado aos poços para produzir as concentrações finais desejadas, e as placas foram incubadas a 37°C por 48 horas. As células foram então fixadas por adição suave de 100 μl de ácido tricloroacético a 10% gelado (4°C) a cada poço, seguido por incubação a 4°C por 1 hora. As placas foram lavadas com água deionizada cinco vezes e deixadas secarem ao ar. As células foram então coloridas por adição de 100 μl de solução de SRB (0,4% de SRB (p/v) em 1% de ácido acético (v/v)) aos poços, por 15 min. Após coloração, as placas foram rapidamente lavadas cinco vezes com 1% de ácido acético para remover qualquer corante não ligado, e deixadas secarem ao ar. O corante ligado foi solubilizado com 10 mmols/L de base de Tris (pH 10,5), antes da leitura das placas. A densidade óptica (DO) foi lida em uma leitora de placa em um comprimento de ondas de 515 nm com Molecular Device. A inibição do crescimento foi expressa como viabilidade relativa (% de controle) e a GI50 foi calculada a partir das curvas de resposta à concentração após a transformação de log/probit.

[00208] A Tabela 6 mostra os dados do ensaio de citotoxicidade (SRB) in vitro para o Composto A obtido no Exemplo 4. Os valores na Tabela 6 são em μg/ml. TABELA 6

EXEMPLO 7 MODELO DE CAMUNDONGO MIN

[00209] Os compostos selecionados da presente invenção (Composto B e Composto C) foram avaliados no modelo de camundongo min para avaliar a sua eficácia como agentes anticâncer.

Composto B

Composto C

[00210] O modelo de camundongo min é um modelo amplamente usado para testar este tipo de eficácia. Foram medidos os números de pólipo formado no intestino delgado e no cólon destes camundongos após diversos tratamentos (Tabela 7). Os dados mostraram que ambos os compostos, quando administrados em torno de 300 mpk, reduzem o número de pólipo nos camundongos min comparados àqueles nos camundongos de controle, tratados com veículo somente. TABELA 7 DADOS DO MODELO DE CAMUNDONGO MIN

EXEMPLO 8 A INIBIÇÃO QUIMIOGENÔMICA DA INTERAÇÃO ENTRE CBP/β- CATENINA RESGATA OS DEFEITOS NA DIFERENCIAÇÃO NEURONAL CAUSADA POR UMA MUTAÇÃO NA PRESENILINA-1 O seguinte composto (Composto D) foi usado neste exemplo:

Materiais e Métodos

[00211] Plasmídios. As construções de relatores de TOPFLASH e FOPFLASH foram transformadas em células competen-tes DH5a por protocolo- padrão. Os plasmídios usados para os ensaios de transfecção foram isolados e purificados usando o Kit EndoFree Maxi (Qiagen, Valencia, CA).

[00212] Cultura de Células PC-12. As células PC-12 foram mantidas em RPMI 1640 suplementado com 10% de soro de cavalo, 5% de soro bovino fetal, 4,5 g/L de glicose, L-glutamina a 2 mM, piruvato de sódio a 1,0 mM e 10 μg/ml de penicilina-estreptomicina.

[00213] Diferenciação da Célula. As placas de cultura de células foram pré-revestidas durante a noite com 0,25 mg/ml de colágeno (Cohesion, CA), 10 μg/ml de Poli-L-Lisina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) e 12 μg/ml de Polietilenoimina (ICN, La Mesa, CA). As células foram cultivadas sobre placas revestidas a 15.000 células/cm2, e diferenciadas em um fenótipo semelhante ao neurônio por incubação em meio com soro reduzido (1% de soro bovino fetal), contendo 50 ng/ml de fator de crescimento nervoso (NGF) (Sigma-Aldrich) por 10 dias. O meio contendo NGF foi trocado a cada 2-3 dias.

[00214] Tratamento com Composto D. O Composto D, um inibi-dor de molécula pequena da interação entre β-catenina/CBP, foi dissolvido em DMSO em uma concentração de estoque de 100 mM. As células PC-12/L286V diferenciadas foram tratadas com concentrações crescentes deste composto por 4 horas. A transfecção foi então iniciada após este período de tratamento. Para os experimentos de diferenciação da célula, o Composto D foi adicionado em uma concentração de 10 μM, juntamente com o NGF, pelo período inteiro de diferenciação.

[00215] Transfecção. As células PC-12 foram cultivadas e diferenciadas sobre placas de 60 mm. No final do período de diferenciação de 10 dias, as células foram transfectadas com 2 μg de construções de relatores, TOPFLASH e FOPFLASH, por placa de 60 mm. As transfecções foram efetuadas usando Superfect (Qiagen) de acordo com as instruções do fabricante.

[00216] Ensaios de Luciferase. As células foram lisadas, 6 horas após as transfecções, em 100 μl de Reagente de Lise de Cultura de Células (Promega, Madison, WI), e esfregadas para tubos de microcentrífuga. Os tubos foram então centrifugados brevemente (aproximadamente 10 segundos) a 12000 rpm até fragmentos de células em pelotas. A atividade da luciferase foi medida sobre 20 μl de lisado de célula e 100 μl de substrato a partir do Sistema de Ensaio de Luciferase (Promega). A atividade da luciferase foi medida usando Packard LumiCount (Hewlett Packard). A quantificação da luciferase foi efetuada em triplicatas, e repetida em pelo menos três experimentos independentes.

[00217] Imunofluorescência. As células foram preparadas em uma densidade de 10.000 células/cm2 sobre lamínulas de 22 x 22 mm, revestidas, estéreis, em uma placa de cultura com 6 poços. A diferenciação foi iniciada, conforme anteriormente descrito, por 10 dias. As células diferenciadas foram então fixadas em metanol por 15 minutos, a -20°C. Isto é seguido por uma incubação de 15 minutos com PBS + 0,1% de Triton X-100. As lamínulas foram incubadas com anticorpos produzidos contra o Receptor de Efrina B2 (Santa Cruz Biotechnology) e Gap-43 (Novus Biologicals) por 40 minutos, a 37°C. Após uma série de lavagens com PBS-Triton X-100, o anticorpo secundário conjugado ao FITC (Jackson ImmunoResearch, Westgrove, PA) foi aplicado. Todas as imagens das lâminas foram adquiridas usando um Microscópio Confocal de Varredura a Laser PCM2000 da Nikon, montado sobre um microscópio vertical Eclipse E600 da Nikon (Nikon, Melville, NY).

[00218] Quantificação do Desenvolvimento de Neuritos. As contagens de células foram obtidas de seis campos microscó-picos escolhidos aleatoriamente (10x). Em cada campo, foi determinado o número total de células, bem como as células que mostraram neuritos maiores do que duas vezes o comprimento do corpo da célula. O número de células com tais desenvolvimentos foi então expresso como uma porcentagem do número total de células. Os valores obtidos foram de duplicatas de três experimentos independentes.

[00219] RT-PCR. Para analisar os níveis de mRNA para o receptor de Efrina B2 (EphB2), o RNA total foi isolado usando Trizol (Invitrogen-GIBCO-BRL, Baltimore, MD) a partir de células diferenciadas. 2 μg de RNA foram transcritos invertidos em um volume total de 20 μl com hexâmero aleatório (50 ng), e usando o sistema de transcrição invertida Superscript II (Invitrogen-GIBCO-BRL), de acordo com as linhas-guia do fabricante. A PCR foi realizada em um volume de 50 μl contendo 5 μl de cDNA, 100 pmols de primers, dNTPs a 100 μM, 1X tampão de Taq e MgCl2 a 1,5 mM. As misturas de reação foram aquecidas para 80°C por 10 min, após o que o Taq foi adicionado. Os cDNAs foram amplificados por 25 (receptor de EphB2) ou 15 (GAPDH) ciclos. Uma rodada de amplificação consistia em 1 min a 94°C, 2 min a 60°C, e 2 min a 72°C, com um tempo de extensão final de 10 min a 72°C. Os produtos da PCR foram resolvidos e visualizados por eletroforese em um gel a 2%, coloridos com brometo de etídio. Os primers da PCR para o receptor de EphB2 usados foram 5’-CACTACTGGACCGCACGATAC-3’ e 5’- TCTACCGACTGGATCTGGTTCA-3’. Os pares de primers para GAPDH foram 5’- GGTGCTGAGTATGTCGTGGA-3’ e 5’-ACAGTGTTCTGGGTGGCAGT-3’.

Resultados

[00220] As células PC-12 de ratos são derivadas da linhagem da crista neural e, sob tratamento de fator do crescimento nervoso (NGF), sofrem diferenciação para um neurônio semelhante ao simpático contendo neuritos (Greene e Tischler, Proc Natl Acad Sci U S A 73, 2424 (1976)). Utilizando um modelo à base de células PC-12, foram caracterizados os efeitos de uma mutação na PS-1 associada ao FAD de início antecipado, PS-1/L286V, sobre a transcrição mediada por TCF/β-catenina e a diferenciação neuronal. Foi demonstrado que bloqueando especificamente a transcrição mediada por TCF/β-catenina/CBP alivia os defeitos induzidos pela PS-1 na diferenciação neuronal.

[00221] As células PC-12 superexpressando estavelmente a PS-1 do tipo selvagem (PS-1/WT) ou a PS-1 mutante (PS-1/L286V) e uma linhagem de células de controle transfectada com vetor (Guo e col., Neuroreport, 8, 379 (1996)) foram preparadas sobre placas revestidas com colágeno, poli-L-lisina e polietilenoimina. A diferenciação foi induzida por tratamento com 50 ng/ml de NGF por 10 dias. As células PS-1/WT de superexpressão ou as células transfectadas com vetor tiveram formação de neuritos extensos (similares aos clones de células PC-12 da ATCC), ao passo que as células mutantes PS-1/L286V tiveram somente formação de neuritos atarracados (Fig. 4 A-C). Adicionalmente, as células de controle de PC-12 transfectadas com vetor e PS-1/WT mostraram expressão extensa do marcador de diferenciação neuronal GAP-43 (Gorgels e col., Neurosci Lett. 83, 59 (1987)) (Fig. 4 D,E), ao passo que as células PS-1/L286V estavam essencialmente destituídas deste marcador (Fig. 4 F).

[00222] Para avaliar os efeitos da mutação PS-1/L286V sobre a sinalização de Wnt/β-catenina canônica, nós transfectamos transientemente as células PC-12 tratadas com NGF com Topflash, uma construção de relator de sinalização de Wnt/β-catenina (Morin e col., Science 275, 1787 (1997)). Conforme visto na Figura 4F, as células PS-1/WT de superexpressão tinham níveis similares de sinalização de TCF/β-catenina comparadas às células de controle com vetor. Entretanto, as células mutantes PS/1/L286V mostraram uma expressão de Topflash significativamente aumentada (10 vezes). Em contraste, a construção de relator de controle negativo Fopflash não mostrou quaisquer diferenças significativas.

[00223] Foi concluído por hipótese que a sinalização de TCF/β-catenina desregulada nas células mutantes PS/1/L286V era responsável pela diferenciação e pelo desenvolvimento de neuritos defeituosos. Para testar esta hipótese, foi usado um inibidor de molécula pequena específico da sinalização de TCF/β-catenina, o Composto D (Emami e col., Cancer Cell, em impressão). Esta molécula pequena bloqueia seletivamente a interação entre β-catenina/CBP, porém não a interação entre β-catenina/p300, desse modo interrompendo um subgrupo de transcrição de TCF/β-catenina. O tratamento das células mutantes PS-1/L286V com o Composto D a10 μM mais NGF diminuiu a transcrição do gene relator de TCF/β-catenina, e resultou no desenvolvimento de neuritos essencialmente normais e na diferenciação (Fig. 5A), similar àquilo visto nas células PS-1/WT de superexpressão (Figs. 5 A, B), em comparação com as células não tratadas (Fig. 4 C). Além disso, os mutantes PS- 1/L286V tratados com o Composto D mostraram coloração de GAP-43 intensa similar às células PS-1/WT e transfectadas com vetor (Fig. 4 B). Para demonstrar que as células mutantes tratadas com o Composto D desenvolvem neuritos similares àquele das células de controle com vetor ou PS-1/WT, foram contadas as células que tinham neuritos maiores do que duas vezes o comprimento do corpo da célula. O tratamento com o Composto D aumentou substancialmente a porcentagem de células contendo neuritos até níveis similares àquele das células transfectadas com vetor e PS-1/WT de superexpressão (Fig. 5 C). É concluído que o bloqueio da transcrição mediada por TCF/β-catenina/CBP corrige muitos dos defeitos fenotípicos no desenvolvimento de neuritos e na diferenciação neuronal devido à mutação PS- 1/L286V.

[00224] Os receptores de Efrina B2 (EphB2) têm estado implicados na formação de sinapse (Wilkinson, Nat. Rev. Neurosci. 2, 155 (2001)) e a família da Efrina A foi recentemente mostrada desempenhar uma função na morfologia da espinha dendrítica hipocampal (Murai e col., Nat. Neurosci. 6, 153 (2003)). A expressão da EphB2 focada foi observada, que foi localizada com processos neuronais nas células transfectadas com vetor e PS-1/WT (Fig. 6 A, B), ao passo que as células mutantes PS-1/L286V demonstraram sinal de EphB2 muito fraco e difuso (Fig. 6 C). A sinalização de TCF/β-catenina aumentada nas células mutantes PS-1/L286V se manifestou na expressão da EphB2 diminuída, conforme avaliado por RT-PCR (Fig. 6 E, raia 3). Além disso, a adição de Composto D a 10 μM resultou na mensagem de EphB2 aumentada (Fig. 6 E, raia 4), bem como na expressão de EphB2 nestas células (Fig. 6 D). Estes resultados estão consisten-tes com os dados de Batlle e colegas (Battle e col., Cell 111, 251 (2002)), que recentemente mostraram que a expressão de receptores de EphB2/EphB3 e sua efrina-B1 ligante é inversamente controlada em criptas colônicas via transcrição de TCF/β-cateina, e que a regulação adequada é importante para a proliferação, a diferenciação e a classificação apropriadas das células. Nós apresentamos evidência que a mutação PS-1/L286V via sinalização de TCF/β-catenina aumentada diminuiu a expressão de receptores de EphB2 e isto é corrigido pela inibição mediada pelo Composto D da interação entre β-catenina/CBP.

EXEMPLO 9 O COMPOSTO CAUSA UMA RETENÇÃO DA FASE G1/S E ATIVA A ATIVIDADE DA CASPASE Análise Citométrica de Fluxo (FACS)

[00225] Para a análise por FACS, aprox. 5 X 106 células de tratadas com Composto D e tratadas com veículo foram fixadas com etanol a 70% esfriado e armazenadas a -20°C por pelo menos 30 minutos. As células foram lavadas uma vez com 1x PBS e incubadas com solução de iodo propídio (PI) (85 μg/ml de iodo propídio, 0,1% de Nonidet P-40, 10 mg/ml de RNAse) por 30 minutos, na temperatura ambiente. 10.000 células coloridas para cada amostra foram adquiridas usando Citometria de Fluxo EPICS XL-MCL da Beckman Coulter e a porcentagem de células em fase diferente do ciclo celular foi determinada pelo software Expo32 ADC (Coulter Corporation, Miami, Flórida, 33196).

Ensaio de Atividade da Caspase-3

[00226] As células SW480, HCT116, e CCD18Co foram preparadas a 105células por poço (placas com 96 poços) por 24 horas antes do tratamento. 25 μM do Composto D ou do controle (0,5% de DMSO) foram adicionados a cada poço. 24 horas após o tratamento, as células foram lisadas e a atividade da caspase foi medida usando um kit de atividade das caspases-3/7 (ensaio das caspases-3/7 Apo-One Homogeneous, no G77905, Promega). As unidades de fluorescência relativa (RFU) foram obtidas subtraindo os valores de unidades do branco (controle, sem células) dos valores medidos experimentais.

O Composto D Causa uma Retenção da Fase GI/S e Ativa a Atividade da Caspase

[00227] Tem sido mostrado que a inibição da expressão do gene de cyclina D1 causa a retenção na fase G1/S do ciclo celular (Shintani e col., “Infrequent alternations of RB pathway (Rb-p16INK4A-cyclin D1) in adenoid cystic carcinoma of salivary glands”, Anticancer Res. 20:2169-75 (2000)). As células HCT116 (Figura 7A, painel superior) e SW480 (Figura 7A, painel inferior) foram tratadas com o Composto D (25 μM) (Figura 7A, direita) ou o controle (0,5% de DMSO) (Figura 7A, esquerda) por 24 horas. As células foram subseqüentemente coloridas com iodeto de propídio (PI) e analisadas quanto ao teor de DNA por citofluorometria FACS. Conforme esperado, as células de controle, (Figura 7A, esquerda), estavam em ciclo normalmente, ao passo que as células tratadas com o Composto D (Figura 7A, direita) mostram acúmulo aumentado na fase G1/S do ciclo celular. Assim, pode ser visto que o Composto D causa a retenção das células na fase G1.

[00228] As caspases são cisteína proteases que são geralmente ativadas em uma dada população de células desencadeada por estímulos apoptóticos. Para avaliar a indução apoptótica em SW480, HCT116, e colonócitos do tipo selvagem (células CCD18Co), as células foram tratadas com Composto D (25 μM) ou controle (0,5% de DMSO) por 24 horas, seguido por um ensaio quanto à atividade das caspases-3/7. Como mostrado na Figura 7B, o Composto D específica e significativamente ativou a via das caspases-3/7 nas células SW480 e HCT116, comparadas às células CCD18Co.

EXEMPLO 10 O COMPOSTO D REDUZ A PROLIFERAÇÃO DE CÉLULAS COLORRETAIS TRANSFORMADAS Ensaios de Ágar Mole

[00229] O ensaio de formação de colônias em ágar mole foi conduzido com células SW480 por alguma modificação do proce-dimento anteriormente descrito (Moody e col., “A vasoactive intestinal peptide antagonist inhibits non-small cell lung cancer growth”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90:4345-49 (1993)).

[00230] Cada poço (35 mm) de uma placa com 6 poços (Nalge Nunc International, Roskide, Dinamarca) foi revestido com 1 ml de ágar de fundo a 0,8% em meio DMEM contendo 10% de soro bovino fetal. Após ser solidificado, 1 ml de meio DMEM contendo 0,4% de ágar de topo, 10% de soro bovino fetal, composto duplamente concentrado, e 5.000 células viáveis individuais foi adicionado a cada poço. As culturas foram incubadas a 37°C em incubadora de 5% de CO2 umidificada. As colônias em ágar mole foram monitoradas diariamente e fotografadas após incubação por 8 dias. As colônias > 60 μm de diâmetro foram contadas.

O Composto D Reduz a Proliferação de Células Colorretais Transformadas

[00231] Os ensaios de formação de colônias em ágar mole foram efetuados usando células SW480 tratadas com Composto D (0,25-5 μM) e 5- fluorouracil (5-FU) (0,5-32 μM). Como mostrado na Figura 8A, o Composto D mostra uma diminuição dependente da dose no número de colônias formadas. O valor de IC50 do Composto D e de 5-FU foi 0,87 ± 0,11 μM e 1,98 ± 0,17 μM, respectivamente. Assim, o Composto D aumentou a atividade da caspase e reduziu o crescimento in vitro de células colorretais que são transformadas por mutações que ativam a sinalização de β-catenina.

EXEMPLO 11 O COMPOSTO C REDUZ O CRESCIMENTO DO TUMOR EM MODELO DE CAMUNDONGO NU

[00232] As células SW620 (9 X 106 células/camundongo) foram enxertadas em camundongos nus de modo subcutâneo no Dia 0. Os camundongos receberam 200 mg/kg de Composto C de modo intraperitoneal dia sim, dia não, até o Dia 21 após 4 vezes de 300 mg/kg dia sim, dia não, começando no Dia 1. O Composto C reduz o crescimento do tumor nos camundongos testados comparados aos camundongos de controle com veículo (Figura 9A), e reduz ligeiramente os pesos dos corpos dos camundongos tratados comparados àqueles dos camundongos de controle com veículo (Figura 9B).

EXEMPLO 12 O COMPOSTO D SUPRIME A EXPRESSÃO DA SURVIVINA

[00233] O efeito do Composto D sobre a expressão da survivina foi estudado nos níveis tanto transcricionais quanto translacionais. Os métodos usados no nível transcri-cional incluem a análise de microarranjo de cDNA, RT-PCR, ensaios de relator de survivina e imunoprecipitação de cromotina (ChIP). Os métodos usados nos níveis transla-cionais incluem a análise de Western blot e a imunoquímica.

[00234] Um plasmídio contendo luciferase sob o controle de promotor de survivina foi construído e transfectado em células 3T3 do tipo selvagem, CBP+/-, ou p300+/-. Os resultados (Figura 10) mostram que Wnt 1 estimula a expressão do gene de survivina em todos os três tipos de células, ao passo que o Composto D reduz a expressão do gene de survivina e diminui o estímulo da expressão do gene de survivina por Wnt1 nestas células. Similarmente, o Composto D e o seu análogo (Composto A) foram mostrados inibirem a expressão da survivina em células SW480 (Figura 11).

[00235] A análise por transcrição invertida-PCR em tempo real foi efetuada de acordo com o protocolo fornecido com o Kit SYBR Green PCR Master Mix (Perkin Elmer Biosystems, Shelton, ST). Os moldes de RNA total para as reações de RT-PCR foram extraídos com o Kit RNeasy Midi (Qiagen) a partir de células tratadas com o Composto D (25 μM) ou o controle (0,5% de DMSO) 24 horas após o tratamento. Os primers usados para as reações de RT-PCR foram 5’- AGCCCTTTCTCAAGGACCAC-3’ e 5’-CGACTTTCTTCGCAGTTTCC-3’. A Tabela 8 mostra os resultados da análise. Uma razão menor do que 0,5 indica uma diminuição significativa da expressão do gene devida ao tratamento do Composto D, ao passo que uma razão maior do que 1,5 indica um aumento significativo da expressão do gene. Uma razão aproximadamente 1 indica nenhuma alteração. Conforme indicado na Tabela 8 e na Figura 12, a expressão do gene de survivina é significativamente reduzida na presença do Composto D comparado ao controle. TABELA 8 EXPRESSÃO DO GENE COM E SEM O COMPOSTO D

[00236] Os ensaios de ChIP nas células SW 480 tratadas com o Composto D (25 μM) ou o controle (0,5% de DMSO) foram efetuados. Conforme mostrado na Figura 13, o promotor de survivina está associado com CBP, β- catenina, Tcf4 e histona acetilada nas células tratadas com controle. O tratamento com o Composto D diminui a associação de todas estas proteínas com o promotor de survivina.

[00237] Para caracterizar o efeito do Composto D sobre a expressão da survivina no nível translacional, foi efetuada a análise de Western blot de extratos de células tratadas com o veículo (0,5% de DMSO) sozinho, o Composto D a 10 μM ou 25 μM, ou 5-FU a 5 μM usando o anticorpo monoclonal 6E4 de survivina (Cell Signaling Technology). Os resultados (Figura 14A) mostram que os tratamentos com o Composto D em ambas as concentrações e o tratamento com 5-FU reduziram a quantidade da proteína survivina. Os tratamentos com o Composto D em ambas as concentrações foram mais efetivos na redução da expressão da survivina do que o tratamento com 5-FU, e o tratamento com o Composto D na concentração mais elevada (i.ex., 25 μM) foi mais efetivo.

[00238] O efeito do Composto D sobre a expressão da survivina no nível translacional foi adicionalmente caracte-rizado usando microscopia de imunofluorescência. Na ausência de Composto D, a survivina localiza-se no mecanismo de fuso mitótico, consistente com a noção que a survivina está envolvida na separação cromossômica (Figura 14B). Este padrão de expressão não foi observado nas células SW480 após o tratamento do Composto D, visto que pouca ou nenhuma proteína survivina foi detectada (Figura 14C).

EXEMPLO 13 EFEITOS DE DIVERSOS COMPOSTOS SOBRE A EXPRESSÃO DA SURVIVINA E DO TCF4

[00239] Os efeitos de diversos compostos tendo a fórmula geral (I) sobre a expressão da survivina e do TCF4 foram caracterizados. Os resultados são mostrados na Tabela 9. TABELA 9 Efeitos dos compostos so bre a expressão da survivina e do TCF4

EXEMPLO 14 O COMPOSTO D PROMOVE A APOPTOSE VIA SUPRESSÃO DA EXPRESSÃO DA SURVIVINA

[00240] Para determinar o efeito do Composto D sobre a apoptose e a função da survivina em um tal efeito, foram medidas as atividades das caspases 2 e 3 em células de tumor cultivadas, tratadas com Composto D ou controle. Os resultados (Figura 15) mostram que (1) o Composto D (a 2,5 μM ou 5,0 μM) ativou a atividade da caspase 3, porém não a atividade da caspase 2; (2) a estausporina (0,5 μM) aumentou as atividades tanto da caspase 2 quanto da caspase 3; (3) o co- tratamento de estausporina e Composto D produziu um estímulo sinérgico da atividade da caspase 3, porém não um estímulo sinérgico da atividade da caspase 2; e (4) a transfecção do gene de survivina diminuiu a ativação da atividade da caspase 3 induzida pelo tratamento de estausporina ou Composto D, e o estímulo sinérgico da atividade da caspase 3 induzida pelo co-tratamento de estausporina e Composto D. Os resultados acima sugerem que o Composto D estimula a atividade da caspase 3 via supressão da expressão do gene de survivina.

[00241] O efeito do composto D sobre a apoptose e a função da survivina em um tal efeito foram adicionalmente caracterizados por medição da morte celular de células de tumor cultivadas, tratadas com estaurosporina (0,5 μM), Composto D (5,0 μM) ou ambos. Os resultados (Figura 16) mostraram que tanto o Composto D quanto a estausporina promovem a morte celular, e que a transfecção do gene de survivina diminuiu o aumento na morte celular induzida pelo tratamento de estausporina, Composto D, ou ambos. Os resultados acima sugerem que o Composto D promove a apoptose via supressão da expressão do gene de survivina.

[00242] Para determinar o efeito do Composto D sobre o ciclo celular e a função da survivina em um tal efeito, a análise por FACS foi efetuada sobre células de tumor cultivadas, com ou sem a transfecção de uma construção contendo o gene de survivina, e adicionalmente tratadas com estausporina (0,5 μM), Composto D (5 μM), ou ambos. Os resultados (Figura 17) mostram que tanto a estausporina quanto o Composto D aumentam o número de células em G0, e que a superexpressão da survivina nas células diminui o efeito do tratamento de estausporina, Composto D, ou ambos. Estes resultados sugerem que o efeito do Composto D sobre o ciclo celular pode ser pelo menos parcialmente via supressão da expressão do gene de survivina.

EXEMPLO 15 PREPARAÇÃO E ATIVIDADE DOS PRÓ-MEDICAMENTOS (1) Procedimento geral para a preparação dos pró-medicamentos por fosforilação do grupo fenol

[00243] O fenol de partida (26,06 mmols) foi dissolvido em tetraidrofurano (130 ml), seguido por adição de trietilamina (TEA) (10,9 ml, 78,18 mmols), na temperatura ambiente. A mistura de reação foi esfriada para 5 °C, e então o POCl3 (12,2 ml, 130,3 mmols) foi adicionado lentamente. Após a adição ter acabado, a mistura foi deixada aquecer até a temperatura ambiente, e agitada nesta temperatura por 5 horas. Após a reação estar completa, a mistura foi vertida em funil de filtro com recheio de celite, para remover o sal de TEA-HCl. Os orgânicos foram diluídos com água (130 ml) a 5°C, seguido por ajuste do pH 7~8 usando bicarbonato de sódio (50 g), e a solução básica resultante foi agitada durante a noite, na temperatura ambiente. A camada aquosa resultante foi lavada com EtOAc (100 ml), e então liofilizada. O produto bruto foi dissolvido em cloreto de metileno (100 ml), seguido por 1 hora na temperatura ambiente. Os sais inorgânicos foram removidos por filtração usando recheio de celite, então o solvente foi evaporado. O produto bruto foi purificado por recristalização (EA/Éter) para obter 9,5 g de produto fosforilado como um sólido não totalmente branco.

(2) Procedimento de preparação típico para a forma livre de fosfato

[00244] Após lavar a camada aquosa básica resultante, a solução foi acidificada para pH 3~4 usando HCl a 1N, e então a forma livre de fosfato foi extraída duas vezes com clorofórmio (300 ml). A camada orgânica foi secada sobre sulfato de sódio, e o produto bruto foi purificado por recristalização.

(3) Método de conversão da forma livre para a forma de dissódio A. Método de titulação

[00245] A forma livre do fosfato pode ser transformada na forma de sal dissódico por titulação, que poderia usar muitas bases inorgânicas. Por exemplo, o carbonato de sódio, o bicarbonato de sódio, e o hidróxido de sódio são usados neste experimento para produzir a forma de dissódio. Podem ser usados outros cátions para preparar diferentes formas de dissal. 1. Método analítico e instrumento para a titulação a. Instrumento: TitraLab (RADIOMETER COPENHAGEN) Eletrodo: eletrodo de vidro de pH pHG201 (RADIOMETER COPENHAGEN, 945-462) Eletrodo de referência REF201 com solução de ponte de sal de KCl (RADIOMETER COPENHAGEN, 945-463) Titulante: Na2CO3 a 10 M Velocidade da bureta (velocidade de titulação): 15% (= 1,5 ml/min) Amostra: 50 mg dissolvidos em água destilada (30 ml) b. Resultados pH 4 (pH de partida = 2)

B. Utilizando doador de sódio orgânico

[00246] A desvantagem básica da titulação usando base inorgânica é que a água deve ser usada para o solvente. Assim, a pesquisa do doador de sódio dissolvido livremente no solvente orgânico normal é o modo mais fácil de resolver o problema. Diversos reagentes, tais como o acetato de sódio e o ácido etilexanóico sódico foram testados e verificados serem úteis para preparar uma forma de sal dissódico.

[00247] A Tabela 10 mostra os compostos para o teste de bioatividade, selecionados a partir dos pró-medicamentos da presente invenção e os seus valores de IC50, que são medidos pelo ensaio do gene relator (RGA) e atividade oncogênica por MTS ou ensaio da Sulforrodamina B, como descritos no Exemplo 6. Os números dos compostos na Tabela 10 não estão relacionados àqueles na Tabela 4 ou 5. Tabela 10 O ENSAIO DO GENE RELATOR E ATIVIDADE ONCOGÊNICA POR MTS OU ENSAIO DA SULFORRODAMINA B PARA COMPOSTOS DE PRÓ- EDICA MENTOS SELECIO NADOS

EXEMPLO 16 SOLUBILIDADE DOS PRÓ-MEDICAMENTOS SELECIONADOS Procedimento geral para o Teste de solubilidade dos Pró-medicamentos

[00248] Aproximadamente 2 mg de cada pró-medicamento foram dissolvidos em 1 ml de solução de JP1 ou JP2, como indicado abaixo. Incubação em uma temperatura de 37°C, 200 ul das amostras foram retirados em 0 hora, 2 horas e 20 horas. As amostras retiradas foram filtradas através de filtros de seringas de 0,45 μm e analisadas pelo sistema de HPLC. Composição dos fluidos gastrointestinais artificiais (JP1, JP2)

[00249] A Tabela 11 abaixo mostra os resultados do teste de solubilidade dos pró-medicamentos selecionados. Os números dos compostos na Tabela 11 não estão relacionados àqueles na Tabela 4, 5 ou 10. Tabela 11 SOLUBILIDADE AQUOSA PARA OS COMPOSTOS DE PRÓ- MEDICAMENTOS SELECIONADOS

EXEMPLO 17 PREPARAÇÃO DO ÉSTER 4-[2-ALIL-1-BENZILCARBAMOIL-8-(2,4- DIFLÚOR-BENZIL)-4,7-DIOXO-OCTAIDRO-PIRAZINO[2,1-c] [1,2,4]TRIAZIN-6- ILMETIL]-FENÍLICO DO ÁCIDO DIMETIL-CARBÂMICO

[00250] A uma solução agitada de material de partida (SM) (8,0 g, 13,9 mmols) e carbonato de potássio (5,8 g, 41,7 mmols) em dimetilformamida foi adicionado o cloreto de dimetilcarbamila (3,0 g, 27,8 mmols). A mistura de reação foi agitada durante a noite e então dissolvida em EtOAc, lavada com água cinco vezes. A camada orgânica combinada foi lavada com salmoura, secada sobre sulfato de sódio, concentrada in vacuo. O resíduo foi cromatografado sobre sílica gel com EtOAc puro, para proporcionar o produto (4,2 g, 32%). Os dados a partir da análise do produto resultante por espectrometria de massa e RMN são: EM (ESI): m/e 647 (M+1), 669 (M+Na).

[00251] RMN-1H (300 MHz, CDCI3) δ 7,27-7,39 (6H, m), 6,78-7,13 (6H, m), 6,68 (1H, t, J = 6,0 Hz), 5,61-5,70 (2H, m), 5,34 (1H, t, J = 6,0 Hz), 5,06-5,20 (2H, m), 4,31-4,69 (4H, m), 3,24-3,58 (8H, m), 3,07 (3H, s) e 2,99 (3H, s). EXEMPLO 18 PREPARAÇÃO DO ÉSTER 4-NITRO-FENÍLICO DO ÉSTER 4-[2-ALIL-1- BENZILCARBAMOIL-8-(2,4-DIFLÚOR-BENZIL)-4,7-DIOXO-OCTAIDRO- PIRAZINO[2,1-c][1,2,4]TRIAZIN-6-ILMETIL]-FENÍLICO DO ÁCIDO CARBÔNICO (2)

[00252] A uma solução agitada de Benzilamina de ácido 2-alil-8-(2,4- diflúor-benzil)-6-(4-hidróxi-benzil)-4,7-dioxoexaidro-pirazino[2,1-c][1,2,4]triazina- carboxílico (1) (2 g, 3,47 mmols) em THF (40 ml) foram adicionados a Trietilamina (0,97 ml, 6,95 mmols) e o cloroformato de 4-nitrofenila (0,7 g, 3,47 mmols). Após agitar na temperatura ambiente durante a noite, o solvente foi removido sob pressão reduzida. O composto bruto foi purificado por cromatografia (Hexano, EtOAc a 1:1) para dar o composto (1,59 g, 62%). Os dados a partir da análise do composto purificado pelo sistema de TLC e por RMN são: Sistema de TLC: Rf = 0,3 (n-Hexano:EtOAc a 1:1) RMN 1H (300 MHz, CDCI3): δ 3,25-3,60 (m, 8H), 4,35 (dd, J = 14,9 Hz, 5,7 Hz, 1H), 4,43 (dd, J = 14,8 Hz, 6,1 Hz, 1H), 4,52 (d, 14,5 Hz, 1H), 4,68 (d, 14,1H), 5,10 (d, 17,1 Hz, 1H), 5,21 (d, 10,3 Hz, 1H), 5,34 (t, J = 6,1 Hz, 1H), 5,58 (dd, J = 11,1 Hz, 4,1 Hz, 1H), 5,67 (m, 1H), 6,71 (t, J = 6,1 Hz, NH), 6,75-6,98 (m, 2H), 7,13 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 7,21 (d, J = 8,7 Hz, 2H), 7,23-7,39 (m, 6H), 7,46 (d, J = 9,5 Hz, 2H), e 8,30 (d, J = 9,5 Hz, 2H).

EXEMPLO 19 PREPARAÇÃO DO SAL DE CLORIDRATO DO ÉSTER 4-[2-ALIL-1- BENZILCARBAMOIL-8-(2,4-DIFLÚOR-BENZIL)-4,7-DIOXO-OCTAIDRO- PIRAZINA[2,1-c][1,2,4]TRIAZINA-6-ILMETIL]-FENÍLICO DO ÁCIDO (2- DIMETILAMINO-ETIL)-CARBÂMICO (3)

[00253] A uma solução agitada do éster 4-nitro-fenílico do éster 4-[2-alil- 1-benzilcarbamoil-8-(2,4-diflúor-benzil)-4,7-dioxo-octaidro-pirazino[2,1- c][1,2,4]triazin-6-ilmetil]-fenílico do ácido carbônico (2) (1,2 g, 1,62 mmol) em DMF (25 ml) foi adicionada a N,N-Dimetiletilenodiamina (0,26 ml, 2,43 mmols). Após agitar na temperatura ambiente durante a noite, o solvente foi removido sob pressão reduzida. O resíduo foi diluído com EtOAc e lavado com água, salmoura. A camada orgânica foi secada com Na2SO4 e concentrada em vácuo. O composto bruto foi purificado por cromatografia (n-Hexano:EtOAc, 1:1; EtOAc; CH2Cl2: MeOH, 9:1). O composto foi vertido com a água e foi mantido em pH 5-6 com o HCl aq. a 1N para preparar o sal de HCl e então liofilizado para obter o composto (0,75 g, 60%). Os dados a partir da análise do composto resultante pelo sistema de TLC e por RMN são: Sistema de TLC: Rf = 0,35 (CH2Cl2:MeOH, 9:1) ESI-EM: M + H+ 690,39

[00254] RMN 1H (300 MHz, CDCI3): δ 2,56 (d, J = 4,6 Hz, 6H), 3,18 (bm, 4H), 3,41-3,58 (m, 4H), 3,75 (t, J = 10,3 Hz, 1H), 4,21 (bt, 2H), 4,35 (d, J = 14,9 Hz, 1H), 4,70 (d, J = 14,9 Hz, 1H), 5,05 (m, 1H), 5,12 (m, 1H), 5,42 (m, 6H), 5,80 (m, 1H), 6,91 (d, J = 7,6 Hz, 2H), 7,04 (d, J = 7,3, 2H), 7,09 (m, 1H), 7,18-7,26 (m, 6H), 7,31 (d, J = 6,9 Hz, 2H), 7,33 (m, 1H), 7,84 (bt, NH), 7,98 (bt, NH), 10,7 (bs, 1H)

EXEMPLO 20 ESTUDO DE PK IN VIVO EM CAMUNDONGO DO PRÓ-MEDICAMENTO A APÓS INJEÇÃO DE BOLO I.V. INDIVIDUAL Experimento com animal

[00255] As drogas foram preparadas 10 mg/kg/5 ml em 10% de Tween 80. Os estudos foram efetuados em camundongos ICR. Após a injeção de bolo i.v. através da veia da cauda, as amostras de sangue foram adquiridas da veia cava inferior em diversos pontos de tempo e separadas para plasma por centrifugação. As amostras de plasma foram conservadas a -20°C até elas serem analisadas. Os pontos de tempo de sangramento foram 3, 6, 9, 17, 34, 67, 134, 202, 302 min. N=4.

Preparação da amostra

[00256] Para a curva de calibração, foram adicionados 2 ul de solução de estoque de droga e adicionados 2 ul de solução de estoque padrão interna, 5 ug/ml de padrão interno, às alíquotas de 98 ul do plasma de camundongo de controle. As concentrações finais das amostras de calibração foram 1, 10, 100, 1000 ng/ml e 10 ug/ml. Para a amostra de plasma do experimento com animal, foram adicionados 2 ul de padrão interno a 100 ul de plasma. Então, foram adicionados 500 ul de acetonitrila, 500 ul de acetato de etila e 100 ul de AD a todas as amostras. As amostras foram misturadas por 10 min e centrifugadas. Os sobrenadantes foram transferidos para outros tubos e evaporados. Adicionar 200 ul de 40% de acetonitrila, elas foram reconstituídas e analisadas pelo sistema de LC-EM.

Resultados

[00257] As alterações das concentrações do pró-medicamento A e de seu composto de origem, no plasma de camundongo, com o aumento de tempo após injeção de bolo i.v. do pró-medicamento A são mostradas na Figura 18. Quadrado: composto de origem; Losango: pró-medicamento A.

[00258] Será apreciado que, embora modalidades específicas da invenção tenham sido descritas aqui para os propósitos de ilustração, diversas modificações podem ser feitas, sem sair do espírito e do escopo da invenção. Desse modo, a invenção não está limitada, exceto pelas reivindicações em anexo.

[00259] Todas as patentes U.S., publicações de pedidos de patentes U.S., pedidos de patentes U.S., patentes estrangeiras, pedidos de patentes estrangeiras e publicações que não sejam patentes acima mencionados, referidos neste relatório descritivo e/ou listados nas Folhas de Dados do Pedido, incluindo o pedido de patente U.S. no de série 10/087.443, depositado em 01 de março de 2002, e o pedido de patente U.S. no de série 09/976.470, depositado em 12 de outubro de 2001, são incorporados aqui por referência.

[00260] A partir do precedente será apreciado que, embora modalidades específicas da invenção tenham sido descritas aqui para os propósitos de ilustração, diversas modificações podem ser feitas, sem desviar do espírito e do escopo da invenção. Desse modo, a invenção não está limitada, exceto pelas reivindicações em anexo.

Claims

1. Composto CARACTERIZADO pelo fato de que tem a seguinte fórmula geral (VII):

Ra é um grupo fenila; um grupo fenila substituído tendo um ou mais substituintes, em que o um ou mais substituintes são independentemente selecionados a partir de um ou mais dentre grupos amino, amidino, guanidino, hidrazino, C1-4 alquilamino, C1-4 dialquilamino, halogênio, perflúor C1-4 alquila, C1-4 alquila, C1-3 alcóxi, nitro, carbóxi, ciano, sulfurila, e hidroxila; um grupo benzila; um grupo benzila substituído com um ou mais substituintes, em que o um ou mais substituintes são independentemente selecionados a partir de um ou mais dentre grupos amino, amidino, guanidino, hidrazino, C1-4 alquilamino, C1-4 dialquilamino, halogênio, perflúor C1-4 alquila, C1-3 alcóxi, nitro, carbóxi, ciano, sulfurila e hidroxila; ou um grupo arila bicíclico tendo 8 a 11 membros no anel, o qual pode ter 1 a 3 heteroátomos selecionados a partir de nitrogênio, oxigênio ou enxofre; Rb é fenila; Rc é um grupo alila; X é -OP(O)(OXa)(OXb); e Xa e Xb são independentemente selecionados de H ou Na.

2. Composto, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o grupo arila bicíclico tendo 8 a 11 membros no anel compreende um ou mais substituintes selecionados do grupo que consiste em flúor, cloro, 2- aminobenzila, 3-aminobenzila, 4-aminobenzila, 2-nitrobenzila, metila, alila, dimetilaminoetila, propinila, etoxicarbonila, 2-metoxicarbonil-benzila, 4-hidroxifenila, morfolin-1-ila, morfolin-1-il-etila ou piperidin-1-ila.

3. Composto, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que é selecionado do grupo que consiste nos seguintes compostos:

4. Composição farmacêutica CARACTERIZADA pelo fato de que compreende um composto, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

5. Uso de um composto, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, ou de uma composição, como definida na reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que é na preparação de um medicamento para inibir o crescimento de tumor.

6. Uso, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que o tumor é canceroso.

7. Uso, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que o tumor é câncer colorretal.

8. Uso de um composto, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, ou de uma composição, como definida na reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que é na preparação de um medicamento para tratar ou prevenir câncer.

9. Uso, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que o câncer é câncer colorretal.

10. Uso de um composto, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, ou de uma composição, como definida na reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que é na preparação de um medicamento para tratar ou prevenir reestenose associada com angioplastia.

11. Uso de um composto, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, ou de uma composição, como definida na reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que é na preparação de um medicamento para tratar ou prevenir doença do rim policístico.

12. Uso de um composto, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, ou de uma composição, como definida na reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que é na preparação de um medicamento para tratar ou prevenir doença de angiogênese anormal.

13. Uso de um composto, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, ou de uma composição, como definida na reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que é na preparação de um medicamento para tratar ou prevenir doença de artrite reumatoide.

14. Uso de um composto, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, ou de uma composição, como definida na reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que é na preparação de um medicamento para tratar ou prevenir colite ulcerativa.

15. Uso de um composto, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, ou de uma composição, como definida na reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que é na preparação de um medicamento para tratar ou prevenir tumor associado ao KSHV.