KR20060119081A - 항균활성을 갖는 오미자 추출물을 함유하는 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 오미자(Schizandra chinensis) 추출물 및 사료용 첨가제를 포함하는 동물 사료용 조성물에 관한 것으로, 상세하게는 오미자 조추출물, 극성용매 및 비극성용매 가용추출물을 포함하는 항균제, 동물사료용 조성물 또는 동물사료 첨가제에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 항균 효과와 면역 증진 효과를 가지고 있어 농가소득 증대에 기여할 수 있다.

오미자, 동물 사료용 조성물, 동물 사료용 첨가제, 항균제, 항균, 면역 증진.

Description

항균활성을 갖는 오미자 추출물을 함유하는 조성물 {composition comprising an extract of Schizandra chinensis showing antibacterial activity}

도 1a는 장 조직의 대조군으로 장벽의 허혈성괴사와 장벽의 위축을 나타내는 도이 고, 도 1b는 장 조직에 오미자가 처리된 군으로 정상조직과 큰 차이 없음을 나타내는 도이며,

도 2a는 비장 조직의 대조군으로 울혈 및 출혈이 심하고 일부 괴사 소견까지 동반된 것을 나타내는 도이고, 도 2b는 비장 조직에 오미자가 처리된 군으로 울혈이 미약한 것을 나타내는 도이며,

도 3a는 간 조직의 대조군으로 중심정맥 또는 문맥정맥에 울혈이 심한 것을 나타내는 도이고, 도 3b는 간 조직에 오미자가 처리된 군으로 상대적으로 울혈이 미약한 것을 나타내는 도이며,

도 4a는 신장 조직의 대조군으로 울혈, 허혈성 괴사 등을 나타내는 도이고, 도 4b는 신장 조직에 오미자가 처리된 군으로 울혈, 허혈성 괴사 등의 조직 소견이 미약한 것을 나타내는 도이다.

현재 의약품의 점유율 15%, 1조 5000억원의 항생제시장 규모에 대응하기 위하여 신종의 항균제제의 개발은 시급하다. 또한, 한국에서도 경제적 그리고 문화적으로 국제교류가 활발해지고 더불어 외국의 병원성 세균들의 유입 가능성이 더욱 많고 축산물 수입이 증가됨에 따라 이를 통한 신종세균의 국내 확산이 가속화될 전망이다. 현재 우리나라 축산에 상재하는 세균들은 대부분 기존 항생제에 내성을 나타내 고 있어 그 치료가 점차 어려워지고 있다. 이들 치료 문제점은 이들 세균에 감염된 축산물을 통한 인체에 전파가 심각할 것이다. 최근 보고에 의하면 인체의 전염성 질병 중 50% 이상이 인수공통전염병으로 나타나고 있어 안전한 축산물 공급은 공중보건 상 가장 신중하게 해결해야 될 선결 문제이다. 세균들의 항생제 내성 발현은 일부 국한된 항생제에 나타나지 않고 현재 사용되고 있는 거의 모든 약제에 발현되고 있어, 세균의 생리적 그리고 유전학적 성상 분석 결과 어떤 약제도 저항할 수 있는 능력을 가질 것으로 예상하고 있다. 항생제 내성을 가지는 여러 가지 세균들 중 대표적으로 메티실린-저항 S.아우레우스(methicillin-resistant S. aureus; MRSA), 반코마이신-저항 엔테로코시( vancomycin-resistant enterococci; VRE), 반코마이신-매개 S. 아우레우스( vancomycin intermediate S. aureus; VISA), 그리고 최소 6종 이상의 항생제 내성을 가진 대장균(E.coli) O157:H7 등이다. 우리나라에서만도 MRSA는 병원의 감염 병원체(nosocomial infection agent)로 대형 종합병원에서 80%가까이 상재하고 있다. VRE와 VISA의 경우도 1990년대부터 만연하기 시작하여 전국적으로 확산하여 있는 상태이다. 대장균 O157:H7 경우에도 다수의 병원체 저항(multiple agent resistant)으로 이미 여러 종류의 항생제에 내성을 가지며 아직까지 완벽한 치료항생제가 없는 상태이다. 이 대장균의 경우 이미 미국, 유럽 그리고 가까운 일본에서 빈번히 발생하여 사회적 문제가 되어 있고, 우리나라에서 산발적으로 사람과 가축에서 발생하였다. 그리고 2001년부터 소의 수입이 자유화되면서 이 대장균 상제지역으로부터 축산물이나 생우 수입 시 우리나라에 이 대장균의 만연이 확실하다. 이들 내성균들은 우리나라의 경우 특별한 항생제 선택체계가 없 고, 급격한 내성증가 요인은 다른 나라보다 훨씬 크다. 항생제 내성증가는 새로운 고가 항생제 사용증가, 치료기간 증가, 사망률 등을 증가시켜, 결국 경제적 그리고 사회적 문제를 증가시키는 악순환이 되고 있다. 따라서 이러한 문제를 해결하기 위해서는 현재 발생되고 있는 내성기전을 이해하고 내성을 일으키지 않는 구조의 신종항생제의 개발이 절실히 요구된다.

현재 급격히 증가하는 세균의 약제 내성에 대처하고 다양한 세균을 효과적으로 치료하기 위해서는 기존의 항생제와는 다른(분자구조, 약제의 효능 등) 신약 개발이 절실히 요구된다. 특히 최근에는 항생제에 대해 내성을 갖는 슈퍼 박테리아들의 출현으로 인하여 새로운 항생제의 개발이 시급히 요청되고 있는 실정이다. 또한 이 신약의 구비해야 할 조건은 살균의 효과뿐만 아니라 사람과 동물의 세포에 부작용이 없는 안전한 약물이어야 한다. 항생제는 아무리 효능이 우수하다 하더라도 시간이 지나면 내성이 생기는데, 천연약물을 이용한다면 충분히 이런 문제를 해결할 수 있으리라 확신한다. 그 이유는 천연물은 현재까지 알려지지 않은 새로운 성분이며, 개개의 작용이 다양한 단일성분의 혼합물이므로, 복합물상호간의 약리 작용으로 내성 등의 부작용을 감소하리라 확신한다.

현재 축산에 사용되는 많은 항생제의 경우 내성률 심각한 수준에 있으며 일부의 항생제의 경우 100% 근접해 있다. 현재 축산에서 항생제는 주로 사료 첨가제로 또는 육계의 경우 7일에서 10일 사이에 정기적으로 클리닝(Cleaning) 목적으로 사용된다. 보고에 의하면 전국 도축장에 온 소, 돼지, 닭에서 분리한 살모넬라, 장내구균 따위의 식중독 균의 항생제 내성률을 조사한 결과 닭 분변에서 나온 대장균은 퀴놀론계 항생제에 57%를 웃도는 내성률을 보였다. 이와 같이 현재 축산에 사용되고 항생제는 대부분 세균들이 내성을 지니고 있어 축산에 효과적으로 사용할 수 있는 새로운 항생제 개발이 시급하다.

최근 의약품의 연구동향은 여러 가지 부작용이나 독성 및 내성 등이 심각해지고 있으므로 세계적으로 천연물로부터의 의약품 개발에 관한 연구가 활발히 추진되고 있다. 한편, 우리나라를 위시한 동양에서는 장구한 시일을 통하여 천연약물의 하나인 전통약물의 꾸준한 발전을 도모해 온 배경을 갖고 있다. 항생물질은 1941년 페리실린이 임상적으로 사용된 후 현재까지 5500여종이 발견되었고, 이중 100여종만이 발효 생산되고 있으며, 대부분은 화학적으로 합성된다. 이것들이 질병치료에 효과적으로 이용되기 위해서는 치료용량이 숙주에 대해서는 독성을 주지 않고 감염원에 대해서는 항균효과가 매우 커야 하나 독작용이나 특이한 부작용을 가지고 있으며, 임상적으로 사용된 후 오래지 않아 내성균주가 증가하는 현상이다. 따라서 독성이 적으며 내성균에 유효한 새로운 항생물질을 연구개발하고, 병용투여와 같은 방법으로 내성균의 출현 및 독성을 감소시키기 위한 연구가 요구된다. 천연약품자원으로부터 항균력이 우수하고 독성이 적은 새로운 항생물질 및 내성균에 유효한 새로운 항생물질을 검색하여 신약개발을 할 수 있다.

우리나라의 세균성 질병 중 가장 많은 발병률을 보이는 것으로 특히 사람에게는 식품에 매개가 많은 것이 살모넬라증이다. 2,300여종이 넘는 혈청형이 보고되어 있으며 이들의 증상 또한 거의 비슷하다. 살모넬라(Salmonella)는 균체내 독소, 세포 독소, 장 독소 등 다양한 독소가 존재하고 있어 여러 가지의 임상 증상을 유발할 수 있다. 특히 이 병원균은 장내 상피세포를 투과하여 숙주세포에 침입할 수 있으며 거의 모든 포유동물에 감염되고 사람의 식중독을 일으키는 병원균 중 가장 흔한 균으로 인수공통전염병을 일으키는 대표적이 균은 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium) 이다. 주로 오염된 식육을 통해 사람에 전파되고 대개 급성장염, 고열, 패혈증 등으로 증상이 나타난다.

균의 조절을 위해 항생제가 도처에 지속적으로 사용되어 왔으며, 이러한 항생제나 항균 물질 등의 오, 남용으로 인해 최근 항생제 내성균들이 등장하여 사회적으로 큰 문제가 되고 있다. 이러한 문제 인식이 확산됨에 따라 항생제나 항균 물질의 사용을 자제하는 사회적 분위기가 조성되고 있으며, 이와 더불어 항생제를 대체할 수 있는 물질에 대한 연구 또한 활발하여 오래전부터 민간요법으로 사용되어 오던 식물이나 생균제(probiotics) 등을 이용하여 항균 효과나 면역 증진 효과 등을 얻고자 하는 연구가 활발히 진행되고 있다.

본 발명의 목적은 생체에 독성 및 내성이 적고 항균활성이 있는 오미자(Schizandra chinensis) 추출물을 유효성분으로 포함하는 동물 사료용 조성물, 동물사료 첨가제 또는 항균제를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 생체에 독성 및 내성이 적고 항균활성이 있는 오미자(Schizandra chinensis) 추출물을 유효성분으로 하는 동물 사료용 조성물 또는 동물사료 첨가제를 제공한다.

상기 오미자의 추출물은 당업계에 잘 알려진 첨가제, 예를들어 β-글루칸(β-glucan), 비타민 E, 효모 배양물(yeast culture) 또는 L-카르니틴(L-carnitin) 등을 추가적으로 포함할 수 있다.

상기 추출물은 물, C₁ 내지 C₄의 탄소수를 갖는 저급 알콜 또는 이들의 혼합용매로부터 선택되어진 혼합용매, 바람직하게 메탄올에 가용된 추출물을 포함한다.

상기 동물은 돼지, 소, 염소 등의 포유류; 잉어, 금붕어 등의 어류; 및 꿩, 닭, 오리, 칠면조 등의 가금류를 포함한다.

이하, 상기 오미자 추출물들을 수득하는 방법을 상세히 설명한다.

본 발명의 오미자 추출물은, 건조된 오미자의 뿌리 또는 지상부(잎, 줄기)를 세절하여 무게(㎏)의 약 1배 내지 20배, 바람직하게는 약 3배 내지 10배의 물, C₁ 내지 C₄의 저급 알콜 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는 물 또는 메탄올로, 20℃ 내지 100℃, 바람직하게는 50℃ 내지 100℃ 추출온도에서 약 1시간 내지 10일, 바람직하게는 약 2시간 내지 5시간동안 냉침, 열수추출, 초음파 추출, 환류 냉각 추출방법을 이용하여 수득한 추출액을 여과, 감압농축 또는 건조하여 본 발명의 오미자 추출물을 수득할 수 있다.

본 발명은 상기의 제조 방법으로 수득된 오미자 추출물을 유효성분으로 하는 항균활성이 있는 동물 사료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물은 오미자 추출물을 0.01 ~ 99.9% 함유하는 것이 바람직하고, 0.1 ~ 90% 함유하는 것이 더욱 바람직하다. 그러나 상기와 같은 조성은 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.

상기의 오미자 추출물은 20 내지 90 % 고 농축액, 분말 또는 과립 형태일 수 있다.

상기 오미자 추출물은 구연산, 후말산, 아디핀산, 젖산, 사과산 등의 유기산이나 인산나트륨, 인산칼륨, 산성피로인산염, 폴리인산염(중합인산염) 등의 인산염이나 폴리페놀, 카테친(catechin), 알파-토코페롤, 로즈마리 추출물(rosemary extract), 비타민 C, 녹차 추출물, 감초 추출물, 키토산, 피틴산 등의 천연 항산화제 중 어느 하나 또는 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 오미자 추출물을 함유하는 동물용 사료 조성물은 보조성분으로 아미노산, 무기염류, 비타민, 항생물질, 항균물질, 항산화, 항곰팡이, 효소, 살아있는 미생물 제제 등과 같은 각종 보조제를 첨가할 수 있다.

또한 본 발명의 오미자 추출물을 함유하는 동물용 사료 조성물은 곡물, 예를 들면 분쇄 또는 파쇄된 밀, 귀리, 보리, 옥수수 및 쌀; 식물성 단백질 사료, 예를 들면 평지, 콩 및 해바라기를 주성분으로 하는 것; 동물성 단백질 사료, 예를 들면 혈분, 육분, 골분 및 생선분; 당분 및 유제품, 예를 들면 각종 분유 및 유장 분말로 이루어지는 건조 성분, 건조 첨가제를 모두 혼합한 후, 액체 성분과, 가열 후에 액체가 되는 성분, 즉, 지질, 예를 들면 가열에 의해 임의로 액화시킨 동물성 지방 및 식물성 지방 등과 같은 주성분 이외에 영양 보충제, 소화 및 흡수 향상제, 성장 촉진제, 질병 예방제 등과 같은 물질과 함께 사용될 수 있다.

본 발명은 포유류, 가금 및 어류를 포함하는 다수의 동물 식이에 적용할 수 있다. 보다 상세하게, 식이는 상업상 중요한 포유류, 예를 들어 돼지, 소, 양, 염소, 실험용 설치 동물(예: 랫트, 마우스, 햄스터 및 게르빌루스쥐 등), 모피 소유 동물(예: 밍크 및 여우 등), 및 동물원 동물(예: 원숭이 및 꼬리 없는 원숭이 등), 뿐만 아니라 가축(예: 고양이 및 개 등)에게 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 조성물을 포함한 동물사료 조성물의 배합 방법은, 본 발명의 조성물을 동물 사료에 건조 중량 기준으로 사료 1 ㎏당 약 1g 내지 100 g의 양으로 혼입한다.

또한, 사료 혼합물은 완전히 혼합한 후, 성분들의 분쇄 정도에 따라 경점성의 조립 또는 과립 물질이 얻어진다. 이것을 메시(mesh)로서 공급하거나, 또는 추가 가공 및 포장을 위해 원하는 분리된 형상으로 형성시킬 수 있으며, 이 경우에 저장 중의 분리를 방지하기 위해, 동물 사료에 물을 첨가하고, 이어서 통상의 펠릿화, 팽창화, 또는 압출 공정을 거치는 것이 바람직하며 과잉의 물은 건조 제거될 수 있다.

본 발명은 오미자 추출물을 유효성분으로 하는 독성 및 내성이 적은 항균활성이 있는 항균제를 제공한다.

본 발명의 오미자 추출물을 포함하는 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 추출물을 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 추출물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 추출물 또는 분획물의 바람직한 투여량은 동물의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 추출물은 1일 0.01 mg/kg 내지 10 g/kg으로, 바람직하게는 1 mg/kg 내지 1 g/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수 있다. 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 쥐, 생쥐, 가축 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 주사에 의해 투여될 수 있다.

이상, 본 발명에 따른 오미자 추출물을 함유하는 동물 사료용 조성물, 동물사료 첨가제 또는 항균제에 대하여 설명하였으며, 이하 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 오미자 추출물의 제조방법

1-1. 오미자 분말의 제조

경동시장에서 구입한 오미자를 서늘한 곳에서 1주일 가량 실온에서 건조시킨 후, 건조된 오미자를 분쇄기를 이용하여 입자의 크기가 30메시(mesh) 이하가 되도록 분쇄하여 오미자 분말을 제조하였다. 상기의 방법으로 수득된 오미자 분말은 본 발명의 주 원료로 사용하였다.

1-2. 오미자 조추출물의 제조

상기 실시예 1-1로부터 얻은 건조된 오미자 분말(300g) 질량의 3배에 해당하는 100% 메탄올 용액을 가하여 100℃에서 24시간동안 환류 냉각 추출하고 여과 및 동결건조하 과정을 통해 3.2g의 오미자 조추출물을 수득하였다.

1-3. β-글루칸(β-glucan) 함유 추출물의 제조

상황버섯을 채취하여 물로 깨끗이 수세한 다음, 분쇄기를 이용하여 입자의 크기가 30메시가 되도록 분말화 하였다. 건조된 상황버섯 분말(300g) 질량의 3배에 해당하는 70% 메탄올 용액을 -20℃에서 가하여 20분간 혼합 한 후, 여과하였다. 상기의 과정을 3회 반복 수행하여 추출한 다음, 추출된 여액을 모두 합하여 2M K2HPO4 용액을 소량 가하여 3000rpm에서 20분간 원심분리하였다. 원심분리 후 남아있는 부분은 메탄올로 세척하고 1.2N 염산 용액 1ℓ에 용해시킨 후, 탄산나트륨 포화용액 1ℓ를 가하여 pH를 4.0으로 중화시킨 다음, 36시간 동안 투석액에서 투석시켰다. 투석액에 동일한 양의 카페인(caffeine) 포화 용액을 첨가하여 3000rpm에서 다시 20분간 원심분리하였다. 분리되어 남아있는 부분은 1% 염산-디메틸포름아미드(HCl-dimethylformamide) 용액에 용해 시킨 후, 세파덱스 LH-20 컬럼(Sephadex LH-20 column)에 주입하여 70% DMFA 용액을 전개용매로 하여 전개시킨 다음 동결 건조하여, β-글루칸 함유 추출물 30g을 수득하였다.

1-4. 효모 배양물(yeast culture)의 제조

박토이스트(BactoYeast) 추출물 10g을 1000㎖의 증류수에 녹인 다음, 오토클레이브(autoclave)하였다. 오토클레이브된 추출물에 한천(Agar) 20g을 첨가하여 녹인 다음, 37℃에서 YPD 배양기에 넣어 배양하였다. 배양이 끝난 후 수분이 10% 이하가 되도록 1주일간 서늘한 곳에서 건조시킨 후, 다시 40℃ 이하의 낮은 온도에서 온풍 건조시켰다. 건조된 효모는 1㎏당 함량이 17%이상이 되도록 하여 동물 사료용 조성물을 제조하는데 사용하였다.

실시예 2. 동물용 사료 조성물의 제조

상기 실시예 1-1 내지 1-4로부터 얻은 오미자 분말, 오미자의 조추출물에 β-글루칸 함유 추출물 및 효모 이외에 비타민 E 및 L-카르니틴(L-carnitin)을 첨가하여 동물 사료용 조성물을 제조하였다. 오미자는 분말은 5 내지 15%, 오미자 메탄올 가용추출물은 50 내지 80%, 효모는 1㎏ 당 10 내지 20% 함유되도록 하였다. L-카르니틴, β-글루칸 및 비타민 E는 소량 첨가하여 본 발명의 동물용 사료 조성물을 제조하였다. 본 발명의 동물 사료 조성물의 비율을 표 1에 예시하였다.

조성물 예	W%	조성물 예	W%
오미자 분말	11.5	비타민 E	0.5
오미자 메탄올 가용추출물	70	L-카르니틴	0.5
β-글루칸	0.5	효모 배양물	17

실험예 1. 항균력 검사

1-1. 공시 균주 및 배지와 균주배양

항균력 측정에 사용된 균주는 인체나 동물에서 분리 야외균주와 ATCC 표준균주이다 (표 2참조). 균주들은 Tryptic Soy broth^ⓡ (TSB; Difco, USA)에 접종되어 37℃ 항온기에서 24시간동안 배양하여 실험에 사용하였으며 육안의 관찰을 위해서는 뮬러-힌톤(Muller-Hinton; Difco, USA) 한천 배지를 사용하였다.

박테리아 균주의 목록

균주	묘 사	유래
JOL 375	비브리오 콜레라(Vibrio cholera) O1	사람
JOL 376	비브리오 콜레라(Vibrio cholera) O139 ATCC 51394
JOL 377	시겔라 디센터리애(Shigella dysenteriae)	사람
JOL 378	시겔라 플렉세너리(Shigella flexeneri)	사람
JOL 379	대장균(Escherichia coli) O157:H7 ATCC 43890
JOL 380	살모넬라 티피(Salmonella typhi)	사람
JOL 381	살모넬라 파라티피(Salmonella paratyphi) A	사람
MRSA 104	메티실린(Methicillin)내성 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus Aureus)	사람
MRSA 6	스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)	동물 (병아리)
ATCC	살모넬라 갈리나리움(Salmonella gallinarium) ATCC
JOL 284	대장균(Escherichia coli) O157	동물

항균력 측정에 사용된 살모넬라균은 인체나 동물에서 분리된 자연 균주와 ATCC 균주이다 (표 3참조). 균주들은 Tryptic Soy broth^ⓡ (TSB; Difco, USA)에 접종되어 37℃ 항온기에서 24시간동안 배양하여 실험에 사용하였으며 육안의 관찰을 위해서는 뮬러-힌톤 한천 배지를 사용하였다.

살모넬라의 목록

균주	묘 사	유 래
표준균주	살모넬라 갈리나리움(Salmonella gallinarium) ATCC
JOL 380	살모넬라 티피(Salmonella typhi)	사람
JOL 381	살모넬라 파라티피(Salmonella paratyphi) A	사람
JOL 386	살모넬라 엔터리티디스(Salmonella enteritidis)	닭
JOL 387	살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium)	돼지
JOL 388	살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium)	돼지
JOL 389	살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium)	닭
JOL 407	살모넬라 엔터리티디스 살(Salmonella enteritidis Sal)-36	검역원
JOL 408	살모넬라 티피무리움 살(Salmonella typhimurium Sal)-13	검역원
JOL 409	살모넬라 두블린 살(Salmonella dublin Sal)-37	검역원
JOL 410	살모넬라 덜비 살(Salmonella derby Sal)-9	검역원
JOL 411	살모넬라 콜레라 수이스(Salmonella cholerae-suis) ATCC 7001
JOL 419	살모넬라 갈리나리움(Salmonella gallinarium)	닭
JOL 420	살모넬라 갈리나리움(Salmonella gallinarium)	닭
JOL 421	살모넬라 갈리나리움(Salmonella gallinarium)	닭
JOL 422	살모넬라 갈리나리움(Salmonella gallinarium)	닭

1-2. 디스크 검사법 (Bauer-Kirby test)

세균 배양액을 뮬러-힌톤 한천 배지 위에 접종하고 이 위에 천연물질에서 추출한 약제를 디스크에 주입하면 배지에 항생제 농도구배가 생긴다. 이때 디스크 주위로 생기는 억제환이 항균력을 나타낸다. 억제환은 항생제의 용해도와 세균의 민감성정도에 따라 크기가 나타나며 각 항생제에 대한 민감성은 항생제마다 일정한 억제환의 크기에 따라 감수성(sensitive, S), 중간내성(intermeditely sensitive, I), 내성(resistant, R)으로 나눈다.

1-2-1. 오미자 추출물의 항균력

오미자의 0.5mg/ml농도로 처리한 후, 디스크 확산법으로 항균성을 조사한 결과 오미자에서 모든 세균에 감수성을 보였다(표 4참조).

오미자 추출물의 박테리아 성장 억제 활성

식물학적명칭	깨끗한 부분의 지름(mm)
	JOL375	JOL376	JOL377	JOL378	JOL379	MRSA104	MRSA6	ATCC	JOL284
오미자(Schizandra chinesis)	28	24	16	24	17	18	16	18	16

1-2-2. 살모넬라에 대한 오미자 추출물의 항균력시험

살모넬라에 대한 한약재 추출물의 0.5mg/ml농도로 처리한 후의 항균성을 조사한 결과 오미자에서 높은 항균성을 보였다 (표 5참조).

약용식물 추출물의 살모넬라 성장 억제 활성

샘플	깨끗한 부분의 지름 (mm)
	오미자(Schizandra chinensis)
표준균주	11
JOL380	19
JOL381	17
JOL386	14
JOL387	19
JOL388	12
JOL389	12
JOL407	14
JOL408	13
JOL409	16
JOL410	14
JOL411	23
JOL419	23
JOL420	25
JOL421	21
JOL422	20

1-3. 최소 억제 농도 (Minimum inhibitiry concentration, MIC)

1-3-1. 실험과정

항균력이 나타난 한약재의 최소 억제 농도 측정도 뮬러-힌톤 한천배지를 이용하였다. TSB에 증균된 균을 같은 배지를 이용하여 재증균 후 590nm에서 흡광도를 측정하여 CFU (개/㎖)를 계산 후, 0.85% 생리식염수를 이용하여 1X 105개/㎖로 희석한다.

측정 농축물은 55~60℃의 뮬러-힌톤 브로스(broth)로 녹이고 희석된 균과 동량으로 넣어 37℃ 항온기에서 24시간 배양한다. 배양된 균을 멸균된 증류수를 이용하여 100배 희석한다. 뮬러-힌톤 한천배지에 100㎕ 희석액을 도말하여 37℃ 항온기에서 18시간 배양한 후, 육안으로 관찰하여 군집 수가 100개 미만인 농도를 최소 억제 농도로 결정하였다.

1-3-2. 실험결과

항균력이 확인된 3종의 한약재, 즉 오미자, 오매, 황련의 100% 메탄올 추출물을 대상으로 살모넬라 균주에 대한 최소억제농도(MIC)를 검사한 결과 오미자 처리군에서 대체적으로 저농도의 범위에서 항균성을 나타나는 것을 보여주고 있다. (표 6참조).

약용식물의 살모넬라 최소 억제 농도

	최소억제농도 (㎍/㎕)
	오미자(Schizandra chinensis)
표준균주	-
JOL380	500
JOL381	15.6
JOL387	-
JOL388	31.3
JOL389	-
JOL408	125
JOL409	-
JOL410	125
JOL411	62.5
JOL419	31.3
JOL420	31.3
JOL421	31.3
JOL422	31.3

1-4. 마우스 접종실험

1-4-1. 실험동물

5주령 ICR 마우스 수컷 17마리를 본 실험에 사용하였으며, 실험에 사용되기 전 살모넬라의 비감염임을 확인하기 위해 미생물학적 검사를 실시하여 육안으로 관찰한 후, 확인하여 실시하였다. 음성 대조군 5마리, 2종류의 약제 투여군 6마리씩을 임의로 택하여 케이지에 분리 사육하였으며 3일간의 적응기간을 둔 후 실험을 실시하였다. 적응기간동안 음수로 5g/ℓ의 스트렙토마이신을 넣은 증류수를 사용하였고 사료, 깔짚등을 날마다 갈아주며 사육하였다.

1-4-2. 마우스 접종실험 방법

마우스 접종실험에는 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium)을 스트렙토마이신(Sigma, USA)이 들어있는 TSB에 접종하여 37℃ 진동 배양기에서 24시간 배양 후 2,500rpm에서 30분간 원심분리하여 균체를 회수하였다. 균체를 인산염 완충액 염수(PBS)로 1회 세척 후, 1X PBS내에 20% 수크로스에 재부유시켜 1X 104cfu/㎖로 맞추어 균액 0.5㎖을 존대(zondae)를 이용하여 경구 접종하였다.

실험은 총 3군으로 나누어 실시하였다. 음성 대조군은 공시균주가 아닌 1X PBS내에 20% 수크로스를 접종하고 실험기간동안 5g/ℓ의 스트렙토마이신을 넣은 증류수만을 음수로 제공하였다. 약제투여군은 공시균주를 접종하고 한약재 추출물을 5g/ℓ의 스트렙토마이신을 넣은 증류수에 희석시킨 것을 음수로 제공하였다. 한약재 추출물 오미자는 메탄올 추출물을 5㎎/㎖의 농도로 하였다. 그리고 실험 기간동안 케이지와 깔짚은 날마다 갈아주며 사육하였다.

1-4-3. 마우스에서의 오미자 추출물 치료효과 조사

분변으로 배출되는 살모넬라의 양상을 분석하기 위해 각 군의 마우스로부터 분변을 수집하였다. 균주 접종 전 1회, 접종 후 1일, 3일, 6일째에 각각 1회씩 모두 4회 각 군의 마우스에서 분변을 0.85% 생리식염수로 십진 희석하고 SSⓡ (Difco, USA) 한천 배지에 100㎕ 희석액을 도말하여 37℃ 항온기에서 24시간정도 배양하여 살모넬라의 수를 측정한다.

1-4-4. 마우스의 생존여부와 분변에서 살모넬라의 검출에 의한 효과측정

살모넬라 티피무리움을 공격 접종한 후 마우스 분변으로 살모넬라의 수를 측정한 결과 오미자 투여 마우스는 생존율이 대조군에 비해 월등히 높았으며 균의 수가 현저히 감소하는 경향을 나타내었다 (표 7참조).

그룹	분변 실험일
	0일	1일	3일	4일
대조군-1	0	0	2.7X104	사멸
대조군-2	0	3.0X105	2.0X105	사멸
대조군-3	0	5.0 X108	사멸
대조군-4	0	2.0X103	9.0X105	사멸
대조군-5	0	6.0X107	사멸
오미자-1	0	3.0X102	3.0X103	0
오미자-2	0	2.5X102	3.0X102	2.0X102
오미자-3	0	0	4.7X103	사멸
오미자-4	0	0	0	0
오미자-5	0	0	30	4.4X102

실험예 2. 약제의 안전성 조사

2-1. 실험동물 모델 확립과 이를 이용한 약제의 효과 안전성 조사.

약제의 효과와 안전성을 생체 내에서 조사하기 위하여 다양한 세균 (대장균, 살모넬라 spp, 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus); MRSA 등) 감염에 대한 균을 죽이거나 억제하는 기전,을 마우스 (SPF ICR, 암컷, 5-6주)나 돼지 등을 실험동물로 설정하여 세균을 투여한 후 분리된 약제를 투여한 후 임상증상과 조직검사를 통하여 투여 후 세균에 의한 병원성 변화, 세균 잔여량, 사망률(생존률) 등을 조사한다. 생존율은 한 군당 8 마리이상의 동물에 치사량50 혹은 그 이상 (40배까지)의 균을 경구로 투여하고 24시간을 방치한 다음 분리약제를 경구 혹은 복강내로 주사하여 20일간 동물을 관찰 생존률을 산정한다.

2-2. 병리학적 조사 방법

사망한 마우스들의 간, 비장, 소장, 신장 등의 조직을 마우스가 죽은 뒤 잘라내고 10% NBF에 넣어 4℃에서 하루 동안 둔다. H&E 염색 후 병리학적인 변화를 관찰한다.

2-3. 수행 결과

2-3-1. 소장

대조군은 장벽의 허혈성 괴사(ischemic necrosis)와 함께 장벽의 위축(atrophy)이 있으며 특히 대조균은 심했다(도 1a). 그러나 오미자 처리군에서는 뚜렷한 조직 소견이 없었으며 정상 조직과 큰 차이가 없었다(도 1b).

2-3-2. 비장

대조군에서는 전반적으로 적색속질(red pulp)쪽에 울혈(congestion) 및 출혈(hemorrhage) 이 심하고 그리고 일부에서는 괴사 소견까지 동반되었으며(도 2a), 특히 대조균에서는 더욱 심했다. 반면에 오미자 처리군에서는 울혈이 대조군에 비해 미약했음을 알 수 있다(도 2b).

2-3-3. 간

대조군에서는 2차 대조군 II-2를 제외하고는 중심정맥(central vein) 또는 문맥정맥(portal vein)에 울혈이 심했으나(도 3a) 오미자 처리군에서 상대적으로 울혈이 미약했다(도 3b).

2-3-4. 신장

대조군(도 4a)이 오미자 처리군(도 4b)에 비해서 혈관의 울혈이 심했다. 결과적으로 대조군에 비해서 오미자 처리 군에서 울혈, 허혈성 괴사 등의 조직소견이 미약하여 효과가 있음이 인정되었다.

사료조성물 예 1. (표 1 참조)

실시예 1-2의 오미자 조추출물............................100 mg

실시예 1-1의 오미자 분말.................................16 mg

실시예 1-3의 β-글루칸(β-glucan) 함유 추출물.........0.7 mg

실시예 1-4의 효모 배양물(yeast culture)................24 mg

비타민 E..............................................0.7 mg

L-카르니틴............................................0.7 mg

제제예 1. 주사제제의 제조

실시예 1-2의 오미자 조추출물.........................100 ㎎

소디움 메타비설파이트................................3.0 ㎎

메틸파라벤...........................................0.8 ㎎

프로필파라벤.........................................0.1 ㎎

주사용 멸균증류수...................................적량

상기의 성분을 혼합하고 통상의 방법으로 최종 부피가 2㎖이 되도록 제조한 후, 2㎖용량의 앰플에 충전하고 멸균하여 주사제를 제조한다.

제제예 2. 환제의 제조

실시예 1-2의 오미자 조추출물.........................120㎎

옥수수 전분..........................................100㎎

멸균증류수...........................................적량

상기의 성분을 혼합하고, 통상의 환제 제조방법으로 0.3cm 지름으로 제환하여 환제를 제조한다.

제제예 3. 정제의 제조

실시예 1-2의 오미자 조추출물.........................200 ㎎

유당.................................................100 ㎎

전분.................................................100 ㎎

스테아린산 마그네슘....................................적량

통상의 정제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 4. 캡슐제의 제조

실시예 1-2의 오미자 조추출물.........................100 ㎎

유당..................................................50 ㎎

전분..................................................50 ㎎

탈크...................................................2 ㎎

스테아린산마그네슘.....................................적량

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 오미자 추출물은 독성 및 내성이 적고 항균활성을 갖고 있어, 항균효과 또는 면역 증진 효과로 인한 농가 소득 증대에 기여할 수 있다.

Claims (5)

1. 생체에 독성 및 내성이 적고 항균활성이 있는 오미자(Schizandra chinensis) 추출물을 유효성분으로 하는 동물 사료용 조성물.
2. 제 1항에 있어서, 상기 추출물은 C₁ 내지 C₄의 저급 알콜에 가용한 추출물인 조성물.
3. 제 1항에 있어서, 상기 오미자 추출물에 β-글루칸(β-glucan), 비타민 E, 효모 배양물(yeast culture) 또는 L-카르니틴(L-carnitin)을 추가적으로 포함하는 동물 사료용 조성물.
4. 오미자(Schizandra chinensis) 추출물을 유효성분으로 하는 동물 사료용 첨가제.
5. 오미자(Schizandra chinensis) 추출물을 유효성분으로 하는 항균제.

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