KR20150067597A

KR20150067597A - 오미자 추출물을 포함하는 근육 항산화 및 면역 활성 증진용 조성물과 그 제조방법

Info

Publication number: KR20150067597A
Application number: KR1020130153240A
Authority: KR
Inventors: 최영현; 황혜진; 김병우; 김주완; 한민호; 박규열; 구세광; 김성구; 김기영; 김철민
Original assignee: 동의대학교 산학협력단
Priority date: 2013-12-10
Filing date: 2013-12-10
Publication date: 2015-06-18
Also published as: KR101616170B1

Abstract

본 발명은 오미자 추출물을 포함하는 근육 항산화 및 면역 활성 증진용 조성물과 그 제조방법에 관한 것으로, 본 발명은 오미자 추출물을 포함하고, 근육 내 지질 과산화를 억제하고 근육 항산화 효과를 가지는 오미자 추출물을 포함하는 근육 항산화 및 면역 활성 증진용 조성물일 수 있다.
본 발명에 의하는 경우, 근육 내 지질 과산화 및 항산화 방어 시스템이 저하되는 것을 현저하게 억제시키는 효과를 가지는 오미자 추출물을 포함하는 근육 항산화 및 면역 활성 증진용 조성물을 제공할 수 있다.

Description

오미자 추출물을 포함하는 근육 항산화 및 면역 활성 증진용 조성물과 그 제조방법{Maximowiczia Chinensis Extracts For improvement Of Muscel Antioxidant Activity And Manufacturing Method of thereof}

오미자 추출물을 포함하는 근육 항산화 및 면역 활성 증진용 조성물과 그 제조방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 오미자 추출물을 사용하여 MDA 및 ROS 효소의 활성 감소와 GSH, SOD 및 CAT 효소의 활성 증가효과 및 nitrotyrosine 면역반응성 근육 섬유 및 4-HNE 면역반응성 근육 섬유의 감소효과를 확인하여 근육 내 지질 과산화 및 항산화 방어 시스템이 저하되는 것을 현저하게 억제시키는 효과를 가지는 오미자 추출물을 포함하는 근육 항산화 및 면역 활성 증진용 조성물과 그 제조방법에 관한 것이다.

일반적으로 근육은 지속적으로 운동하지 않을 경우 노화에 따라 근육 기능이 저하되고 근육량 및 근육신경연접(neuromuscular junction, motor unit)의 감소가 일어나 쉽게 피로를 느끼며 무기력해져서 생활의 활력이 감소됨으로써 삶의 질이 급격히 떨어진다(Dohergy TJ, J Appl. Physiol., 95:1717-1727, 2003; Eric E, et al.,Physiol. Behav., 92(1-2):129-135, 2007).

이를 방지하기 위해서 저항력 운동(resistance training)과 같은 적절한 운동을 지속적으로 실시하는 것과 함께 적절한 식이 요법을 함께하는 것이 권장되고 있다. 또한 상기 저항력 운동화 함께 근육 항산화 효과를 가지는 천연물의 섭취를 통하여 근육의 노화를 방지하고 항산화력을 유지하려는 노력이 지속되고 있다. 이에 본 발명자는 근육 항산화 천연물로 오미자를 후보물질로 선정하고, 다양한 제형의 오미자 추출물을 제조하여 근육 항산화 효과를 연구하였다.

지질과산화(lipid peroxidation)는 지질 성분인 불포화지방산에 산소가 첨가되어 과산화 된 지질이다. 이것은 유리기(free radical)로부터 세포나 조직막이 손상된 것을 의미한다. 생체 내에서의 과산화현상은 세포막의 주요구성성분인 인지질을 구성하는 불포화지방산이 산소유리기와 결합하여 생기게 되는데, 이와 같은 현상은 불포화지방산 구성 성분이 많고 인지질 함량이 풍부한 미토콘드리아, 마이크로좀, 적혈구, 혈소판 등의 막에서 쉽게 일어날 수 있다. 과산화지질은 세포막의 다중불포화지방산과 지단백질에서 유리기와 연쇄 반응하여 부산물로 MDA(malondialdehyde)를 생산하며, MDA는 지질과산화의 지표로 사용된다.

운동시 활동근육의 산소소비증가에 기인하여 프리라디칼이 생성되는데, 이것은 산화적 스트레스와 지질과산화를 유도한다. 운동으로 인한 MDA농도의 증가는 운동시 증가하는 산소유리기의 증가에 의한 산화스트레스를 의미한다.

오미자는 해발이 200 내지 1,600m에 걸쳐 분포하며 지리산, 속리산, 태백산에서 많이 자라는 덩굴성 낙엽 활엽수이다. 키는 6~9m이고, 잎은 길이가 7~10㎝, 폭이 3~5㎝로 뒷면 맥 위에 털이 있고 가장자리에 작은 치아상의 톱니가 있으며 넓은 타원형으로 어긋난다. 꽃은 약간 붉은빛이 도는 황백색이며 지름이 약 1.5㎝로 3~5송이가 새로 나온 짧은 가지의 잎 겨드랑이에 한 송이씩 핀다. 열매는 신맛이 강하고 8~9월에 홍색으로 익으며 길이는 0.6 내지 1.2㎝이고 여러 개가 포도 송이 모양으로 밑으로 처져 달린다. 관상용으로 쓰이며, 열매는 약용으로 쓰인다.

구체적인 선행기술을 보면, 선행기술 1(KR 10-2010-0072390 A, 공개일자: 2010년 07월 01일)은 오미자 추출물을 포함하는 생막걸리에 대한 구성을 개시하고 있다. 그러나 이는 오미자가 가진 맛과 향에 기초한 것이고, 천연 열매 추출물이므로 오미자가 가진 유용한 성분이 건강을 증진할 수 있다고 할 뿐, 맛 이외에 구체적인 효과상 특징적 사항의 연구가 이루어진 것은 아니라고 볼 수 있다.

선행기술 2(KR 10-2006-0119081 A, 공개일자: 2006년 11월 24일)은 항균활성이 있는 오미자(Schizandra chinensis) 추출물에 관한 사항이 개시되어 있으나, 이는 단순히 오미자 추출물이 향균활성을 가진다는 정도에 불과하고, 상기 오미자 추출물을 활용한 근육 항산화와 관련 효과에 대하여는 개시된 바 없다.

선행기술 3(KR KR 10-0854567 B1, 공고일자: 2008년 08월 26)는 오매, 황련과 함께 오미자를 포함하는 항균제 조성물에 관한 것으로, 동물 사료용 첨가제 조성물로서 향균효과가 높은 범위를 제시하고 있는데, 이는 오미자를 활용하여 근육 항산화와 관련된 효과에 대한 인식이 없다.

따라서 종래의 선행기술은 오미자의 독특한 향미와 식감을 기초로 한 식품 조성물이거나, 상기 오미자가 가진 향균성에 기초하여 제조된 향균조성물로 활용되는 것이고, 오미자가 가진 새로운 효과에 대한 연구는 미흡한 실정이다. 이에 오미자의 새로운 효과상 특징을 연구하면서 오미자의 근육 항산화에 대한 효과상 특징을 기초로 본 발명을 완성하게 되었다.

KR 10-2010-0072390 A KR 10-2006-0119081 A KR 10-0854567 B1

본 발명의 목적은 MDA 및 ROS 효소의 활성 감소와 GSH, SOD 및 CAT 효소의 활성 증가효과 및 nitrotyrosine 면역반응성 근육 섬유 및 4-HNE 면역반응성 근육 섬유의 감소효과를 확인하여 근육 내 지질 과산화 및 항산화 방어 시스템의 억제를 현저하게 억제시키는 효과를 가지는 오미자 추출물을 포함하는 근육 항산화 및 면역 활성 증진용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 오미자 추출물을 포함하는 근육 항산화 및 면역 활성 증진용 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 오미자 추출물을 포함하는 근육 항산화 및 면역 활성 증진용 조성물은 오미자 추출물을 포함하고, 근육 내 지질 과산화를 억제하고 근육 항산화 효과를 가지는 것이다.

상기 오미자 추출물은 150 내지 210℃에서 건조 후 동결건조된 오미자를 탄소수 1 내지 4개의 저급 알코올 또는 이들의 50 내지 200 부피% 알코올 수용액과 혼합하여 추출된 것일 수 있다.

상기 오미자 추출물은 오미자에 바실러스 리체니포르미스(Bacillus lichenifomis) 또는 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) 중 1종 이상의 미생물을 접종하여 제조된 것일 수 있다.

상기 바실러스 리체니포르미스는 건조된 오미자의 질량 대비 0.0001 내지 0.05%(w/v)로 접종된 것일 수 있다.

상기 오미자 추출물을 포함하는 근육 항산화 및 면역 활성 증진용 조성물은 상기 오미자 추출물을 0.1 내지 10 중량%로 포함하는 것일 수 있다.

상기 오미자 추출물은 MDA 및 ROS 효소의 활성 감소시키고, GSH, SOD 및 CAT 효소의 활성은 증가시키며, nitrotyrosine 면역반응성 근육 섬유 및 4-HNE 면역반응성 근육 섬유의 감소시키는 것일 수 있다.

본 발명의 다른 일 실시예에 따른 식품 조성물은 상기 오미자 추출물을 포함하는 근육 항산화 및 면역 활성 증진용 조성물을 포함하는 것이다.

본 발명의 또 다른 일 실시예에 따른 오미자 추출물을 포함하는 근육 항산화 및 면역 활성 증진용 조성물의 제조방법은 오미자를 150 내지 210℃에서 건조하여 건조된 오미자를 제조하는 오미자 건조단계; 상기 건조된 오미자를 분쇄하여 오미자 분말을 제조하는 오미자 분쇄단계; 상기 오미자 분말을 동결 건조하여 동결건조 된 오미자 분말을 제조하는 동결건조 단계 및 상기 동결건조 된 오미자 분말을 탄소수 1 내지 4개의 저급 알코올 또는 이들의 50 내지 200 부피% 알코올 수용액과 1 : 3 내지 3 : 1의 부피비로 혼합하여 15 내지 35℃에서 10 내지 30 시간 동안 오미자 추출물을 제조하는 오미자 추출단계를 포함하는 것이다.

상기 오미자 추출물을 포함하는 근육 항산화 및 면역 활성 증진용 조성물의 제조방법은 상기 오미자 건조단계 및 오미자 추출단계 사이에, 상기 오미자 건조단계를 거친 건조된 오미자에 바실러스 리체니포르미스(Bacillus lichenifomis) 또는 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) 중 1종 이상의 미생물을 접종하고, 배양하는 오미자 발효단계를 더 포함하는 것일 수 있다.

이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 이하의 설명은 본 발명의 명확한 이해를 돕기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 이하의 내용으로 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에 따른 오미자 추출물을 포함하는 근육 항산화 및 면역 활성 증진용 조성물은 오미자 추출물을 포함하고, 근육 내 지질 과산화를 억제하고 근육 항산화 효과를 가지는 것이다.

바람직하게 상기 오미자는 오미자 종자일 수 있다. 오미자는 그 향미가 독특하고, 우수한 향균력을 가지만, 실험결과 오미자를 사용한 추출물은 근육 과산화 방지 및 근육 항산화 효과가 크지 않았지만, 오미자 종자 추출물을 사용하는 경우 적은 사용량으로 근육내 지질 과산화 및 항산화 방어 시스템의 억제를 현저히 억제하는 것으로 관찰되어, 오미자 종자 추출물은 근육의 항산화 방어 시스템을 활성화 하는 것으로 확인되었다. 특히, 상기 오미자 종자 추출물은 상대적으로 적은 사용량으로도 근육 항산과 효과 높아 본 발명의 목적에 따른 근육 항산화 활성 증진을 위한 조성물로 사용하는 것이 더 바람직하고, 그 사용량이 적기 때문에 세포독성 등의 문제도 없는 장점이 있다. 따라서 상기 오미자 추출물은 오미자 종자 추출물일 수 있다.

오미자를 건조시키는 경우 제품화에 유리한 장점이 있고, 바람직하게는 오미자 종자를 건조시키는 경우 근육 항산화 효과를 가지는 유효성분이 보다 활성화 된다. 즉, 오미자 종자를 건조과정 없이 바로 동결 건조하여 추출물을 제조하는 경우보다 오미자 종자를 건조하여 추출하는 경우 오미자 종자를 동일한 농도로 사용하는 경우에도 오미자 종자를 건조하여 추출하는 경우가 보다 근육 항산화 효과를 나타내는데 더 유리한 효과가 나타난다.

특히 150℃ 미만의 온도로 건조시키는 경우 상기의 효과가 거의 없으며, 210℃를 초과하는 경우 오미자 종자 추출물의 근육 항산화 물질이 오히려 감소하는데 상대적으로 고온에 의해 근육 항산화 효과를 가지는 유효성분이 파괴되는 것으로 추정된다.

더 바람직하게는 상기 오미자 종자를 170 내지 190℃에서 건조 후 동결건조한 것일 수 있다. 상기 온도 범위에서 오미자 종자를 건조하는 경우 오미자 종자 추출물이 근육 내 과산화물의 생성 억제 및 근육에 대한 항산화 효과가 가장 우수하여 근육 항산화를 위한 유효성분이 가장 많이 함유될 수 있는 것으로 추정된다.

탄소수 1 내지 4개의 저급 알코올은 70 내지 100 중량% 농도의 에탄올일 수 있다. 상기 에탄올을 사용하는 경우 오미자에 포함된 근육 항산화를 위한 유효성분이 효과적으로 추출될 수 있고, 상기 에탄올 농도가 70 중량% 미만인 경우 오미자 추출물의 근육 항산화 효과가 저하될 수 있다.

상기 미생물 접종에 의하는 경우 상기 미생물의 발효에 의하여 근육 항산화물의 활성이 증대하여 근육 내 지질 과산화 및 항산화 방어 시스템이 붕괴되는 것을 억제하는 효과가 크게 증대한다. 특히 상기 미생물 접종은 오미자 종자에 접종하여 발효시키는 경우 그 효과가 매우 우수하다.

0.01%(w/v) 미만으로 접종시키는 경우 발효과정이 진행되지 않거나 발효기간이 너무 길어지는 문제가 있고, 0.05%(w/v)을 초과하여 접종시키는 경우 과발효로 인하여 근육 내 지질 과산화 효과를 가지는 유효성분의 활성 저하되므로 근육에 대한 항산화 효과가 오히려 저하되는 문제가 있다.

바람직하게는 상기 미생물 접종은 바실러스 리체니포르미스(Bacillus lichenifomis)을 사용한 것으로 건조된 오미자의 질량 대비 0.01 내지 0.03%(w/v)로 접종시킨 것일 수 있다.

상기 미생물은 바실러스 리체니포르미스(Bacillus lichenifomis)를 단독으로 사용한 경우에 오미자 추출물에 포함된 근육 항산화의 활성에 도움을 주는 유효성분이 가장 많이 함유될 수 있고, 상기 범위에 의하는 경우 근육 내 과산화물 생성 억제 효과가 가장 우수할 수 있다.

상기 발효는 1일 내지 7일 동안 이루어지는 것이 바람직하다. 상기 발효가 1일 미만으로 이루어지는 경우 미생물 활성에 따른 근육 항산화 효과를 나타낼 수 있는 유효성분의 증가 효과가 미미하고, 7일 이상 발효가 진행되는 경우 상기 유효물질의 함량이 오히려 감소하는 문제가 있다.

더 바람직하게는 상기 건조된 오미자는 오미자 종자를 건조한 후에 증숙시키는 것일 수 있다. 증숙된 오미자 종자를 사용하거나 증숙된 오미자를 상기 미생물을 사용하여 발효시키는 경우 상기 오미자 추출물에 포함된 근육 항산화 물질이 크게 증가하여 근육 내 과산화 억제 시스템을 방어하는 효과가 우수할 수 있다.

상기 오미자 추출물을 포함하는 근육 항산화 및 면역 활성 증진용 조성물은 상기 오미자 추출물을 0.1 내지 10 중량%로 포함하는 것일 수 있다. 0.1 중량% 미만으로 포함되는 경우 근육 내 지질 과산화 및 항산화 방어 시스템의 저하를 억제시키는 효과가 미미하고, 10 중량% 이상으로 포함되는 경우 더 이상 근육 항산화 활성이 높아지지 않기 때문이다.

상기 오미자 추출물은 MDA(levels of malondialdehyde) 효소 및 ROS(reactive oxygen species) 효소의 활성 감소시키고, GSH(reduced glutathione) 효소, SOD(superoxide dismutase) 효소 및 CAT(catalase) 효소의 활성은 증가시키며, nitrotyrosine 면역반응성 근육 섬유 및 4-HNE(4-hydroxy-2-nonenal) 면역반응성 근육 섬유의 감소시키는 것일 수 있다.

본 발명의 다른 일 실시예에 따른 식품 조성물은 상기 오미자 추출물을 포함하는 근육 항산화 및 면역 활성 증진용 조성물을 포함하는 것이다. 상기 식품 조성물은 상기 오미자 추출물을 0.1 내지 10 중량%로 포함하는 것일 수 있다.

바람직하게는 상기 건조단계는 오미자 또는 오미자 종자를 증숙 하는 것 또는 증숙 후 열풍 건조하는 것일 수 있다. 상기 증숙에 의하는 경우 일반 건조에 의하는 경우에 비하여 오미자에 추출물에 함유된 근육 항산화 효과를 가지는 유효성분이 훨씬 더 많이 포함될 수 있어 상기 오미자 추출물의 사용에 따른 근육 내 지질 과산화 및 항산화 방어 시스템이 저하되는 것을 현저하게 억제시키는 효과가 매우 높아질 수 있다는 장점 있다.

본 발명의 오미자 추출물을 포함하는 근육 항산화 및 면역 활성 증진용 조성물은 MDA 및 ROS 효소의 활성 감소와 GSH, SOD 및 CAT 효소의 활성 증가효과 및 nitrotyrosine 면역반응성 근육 섬유 및 4-HNE 면역반응성 근육 섬유의 감소효과가 있어 근육의 항산화 활성 및 면역기능 개선에 효과를 나타나게 할 수 있다.

또한, 근육 항산화 효과를 극대화 시킬 수 있는 상기 오미자 추출물의 함량 범위를 제시하고, 근육 항산화 효과가 가장 높은 유효물질이 포함되는 오미자 추출물을 포함하는 근육 항산화 및 면역 활성 증진용 조성물의 제조방법을 제공할 수 있어 그 활용범위가 높다고 할 수 있다.

도 1은 비복근의 MDA 함량변화에 관한 그래프이다.
도 2는 비복근의 ROS 함량변화에 관한 그래프이다.
도 3은 비복근의 glutathione 함량변화에 관한 그래프이다.
도 4는 비복근의 SOD함량변화에 관한 그래프이다.
도 5는 비복근의 catalase 함량변화에 관한 그래프이다.
도 6은 하지거상법에 의한 근위축모델에서 장딴지근에서의 말론디알데하이드의 수치변화에 관한 것이다.
도 7은 하지거상법에 의한 근위축모델에서 장딴지근에서의 활성산소종의 수치변화에 관한 것이다.
도 8은 하지거상법에 의한 근위축모델에서 장딴지근에서의 글루타치온의 수치변화에 관한 것이다.
도 9는 하지거상법에 의한 근위축모델에서 장딴지근에서의 초과산화물불균등화효소의 수치변화에 관한 것이다.
도 10은 하지거상법에 의한 근위축모델에서 장딴지근에서의 과산화수소분해효소의 수치변화에 관한 것이다.
도 11은 비복근에서4-HNE 면역반응성 변화에 관한 것이다.

이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.

[제조예: 오미자 추출물의 제조]

오미자 종자를 수집하여 이물질을 제거하는 등 선별과정을 거쳐 선별된 상기 오미자를 세척하였다. 상기 오미자를 증숙기에 넣어 60℃에서 40분간 1차 증숙하고, 다시 90℃ 이하에서 2시간 동안 2차 증숙하였다. 상기 증숙된 오미자를 열풍건조한 뒤 상기 오미자의 중량 대비 0.015%(w/v)로 바실러스 리체니포르미스(Bacillus lichenifomis)를 접종시켜 15 내지 37℃를 유지하면서 3일간 발효하였다. 이후 상기 발효된 오미자를 0.15 내지 0.2mm로 분쇄하고 상기 분쇄된 오미자와 60부피%의 에탄올 수용액을 1 : 3 내지 3 : 1의 부피비로 혼합하여 추출하였다.

상기 추출은 20 내지 30℃를 유지하면서 20 내지 25시간 동안 침전물을 침전시킨 뒤 여과하고, 상기 여과로 모아진 여과액을 rotary vacuum evaporator (Buchi Rotavapor R-144, Switzerland) 농축한 다음 190℃ 3시간 동안 hydrodistillation을 통해 분리하여 오미자 추출물(이하, SSE라 한다)을 제조하였다.

[실험예 1: 오미자 추출물의 항산화 효과 시험조건]

1. 실험동물

60마리의 건강한 SD rat(SPF 6 주령 수컷 ICR 종 마우스)를 입수하여, 7일간 순화시킨 다음 NTX(대퇴신경절단술) 2 주 후 체중 (위수술 대조군: 41.11±3.71g, 33.00~47.10g; NTX 근육위축 유발군: 41.51±3.54g, 34.30~49.50 g) 및 종아리 두께 (위수술 대조군: 4.50±0.41mm, 4.03~5.28mm; NTX 근육 위축 유발군 3.26±0.18mm, 3.00~3.60mm)가 일정한 실험동물을 군당 10마리씩 선정하여 실험에 사용하였다. 모든 실험동물은 NTX 수술일, 약물 투여시작일 및 최종 부검일에 각각 18시간 정도 절식을 실시하였으며(이 기간에도 음수는 자유롭게 공급하였다), picric acid로 개체를 식별하였다

2. 군 분리 (총 6개군; 군 당 10마리)

(1) Sham vehicle control: 위수술 매체 대조군

(2) NTX control: 좌골신경 절단 및 멸균 증류수 투여 대조군

(3) Oxymetholone: 좌골신경 절단 및 oxymetholone 50mg/kg 투여 대조 약물군

(4) SSE 300: 좌골신경 절단 및 오미자 추출물 300mg/kg 투여 대조 약물군

(5) SSE 150: 좌골신경 절단 및 오미자 추출물 150mg/kg 투여 대조 약물군

(6) SSE 75: 좌골신경 절단 및 오미자 추출물 75mg/kg 투여 대조 약물군.

3. 근육 위축의 유발

이전의 방법들 [Ogawa et al., 2005; Nagpal et al., 2012]에 따라, 우측 대퇴부의 근육을 가로로 절개하여, 좌골신경을 노출시킨 다음 약 5mm 정도의 좌골 신경을 절단 및 절제하였다. 위수술 대조군에서는 좌골 신경을 노출시킨 다음 절제를 실시하지 않고, 창강을 폐쇄하였다.

4. 약물투여

오미자 추출물(SSE)를 멸균 증류수에 현탁시켜 동물 체중 kg 당 10ml의 용량으로 NTX 2주 후부터, 매일 1회씩 28일간 금속제 zonde가 부착된 1ml 주사기 (syringe)를 이용하여 강제 경구투여 하였으며, oxymetholone 역시 오미자 추출물과 동일하게 멸균 증류수에 현탁시켜 경구투여하였고, 위수술 및 NTX 대조군에서는 오미자 추출물 또는 oxymetholone 대신 동일한 용량의 멸균 증류수만을 경구 투여하였다. 본 실험에 사용한 oxymetholone 투여용량은 이전의 동물 실험 결과를 바탕으로 50 mg/kg [Pavlatos et al., 2001; Isaacs et al., 2011]을 투여용량으로 선정하였으며, 오미자 추출물은 300, 150 및 75mg/kg으로 선정하였다.

5. 관찰항목- 비복근의 항산화 방어 시스템의 변화를 관찰

근육의 무게를 측정후, 비복근을 분리한다. 그리고 MDA, ROS, GSH, SOD, catalase효소의 활성을 각각 측정한다. Del Rio et al. [2005]의 방법에 따라 분리된 비복근의 무게를 측정후 ice-cold 0.01M Tris-HCl (pH 7.4)에서 균질화 후 12,000g에서 15분 동안 원심분리한다. thiobarbituric acid test를 이용하여 525nm 흡광도에서 MDA(nM/g)를 측정한다 [Jamall and Smith, 1985].

총단백질 함량은 Lowry et al. [1951]법에 따라 소혈청알부민(Invitrogen, CA, USA) 을 기준으로 측정하였다.

ROS측정은 2',7' dichlorofluorescein diac-etate fluorescent 염색법으로 490/520nm 흡광도로 측정하였으며ROS assay kit; Abcam, Cambridge, MN, USA) 단위는 상대적형광도(relative fluorescence unit; RFU)로 나타내었으며 단백질 농도로 보정하여 사용하였다. RFU/μg protein [He et al., 2012].

GSH 함량은 using 2-nitrobenzoic acid (Sigma, MO, USA)를 사용하여 412nm 흡광도에서 측정하였다[Sedlak and Lindsay, 1968].

catalase는 과산화수소 분해능을 240nm[Aebi et al., 1974]에서 측정하였다.

1nM의 과산화수소를 25℃, pH 7.8 상태에서 분당 분해하는 결과를 U/mg protein으로 표시하였다.

SOD 활성은 Sun et al. [1988]의 방법에 따라 측정하였다.

nitrotertrazolium blue와의 반응을 통한 formazan 염색을 통하여 560nm에서 반응도를 측정하였으며 U/mg protein으로 표현하였다.

6. 면역조직학적 검사

파라핀에 고정된 비복근절단 샘플을 탈파라핀화후 citrate buffer antigen(epitope)로 회복 전처리한다 [Shi et al., 1993].

10mM citrate buffer(pH6.0)가 든 staining dish를 수조에 넣어 온도가 95-100?가 되도록한다. 슬라이드를 staining dish에 넣고 뚜겅을 느슨하게 닫아 20분간 배양한다. 이후 staining dish를 꺼내어 상온에 두고 20분간 냉각한다. 항원결정인자(epitope)를 회복후 슬라이드 샘플을 avidin-biotin complex(ABC) 방법을 이용하여 nitrotyrosine, 4-HNE 를 측정한다[Ki et al., 2013].

7. 통계분석

one way ANOVA test로서 유의성을 검증하였다.

[실험예 1: 오미자 추출물의 항산화 효과 시험결과]

1. 비복근MDA 함량의 변화

위수술 매체 대조군에 비해 NTX 대조군에서는 유의성 있는 (p<0.01) 비복근내 지질 과산화의 증가, 즉 MDA 함량의 증가가 인정되었으나, oxymetholone, 오미자 추출물 300, 150 및 75mg/kg 투여군에서는 각각 NTX 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) MDA 함량의 감소가 인정되었다 (하기의 도 1 참조, 수치는 평균±표준편차, ** P<0.01ANOVA test를 통한 shame 대조군과의 비교검정, ##, # P<0.01, P<0.05 ANOVA test를 통한 NTX대조군과의 비교검정).

NTX대조군에서는 최종 희생일의 비복근 조직내 MDA 함량이 위수술 매체 대조군에 비해 367.74%의 변화를 나타내었으며, oxymetholone, 오미자 추출물300, 150 및 75mg/kg 투여군에서 각각 NTX 대조군에 비해 -50.16, -49.68, -39.25 및 -30.43%의 변화를 나타내었다.

2. 비복근ROS 함량의 변화

위수술 매체 대조군에 비해 NTX 대조군에서는 유의성 있는 (p<0.01) 비복근내 ROS의 증가가 인정되었으나, oxymetholone, 오미자 추출물300, 150 및 75mg/kg 투여군에서는 각각 NTX 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) ROS 함량의 감소가 인정되었다 (하기의 도 2 , 수치는 평균±표준편차, ** , * P<0.01, P<0.05 ANOVA test를 통한 sham대조군과의 비교검정, ##, # P<0.01, P<0.05 ANOVA test를 통한 NTX대조군과의 비교검정참조).

NTX대조군에서는 최종 희생일의 비복근 조직내 ROS함량이 위수술 매체 대조군에 비해 85.63%의 변화를 나타내었으며, oxymetholone, 오미자 추출물 300, 150 및 75mg/kg 투여군에서 각각 NTX 대조군에 비해 -27.94, -27.79, -21.11 및 -18.40%의 변화를 나타내었다.

3. 비복근 GSH 함량의 변화

위수술 매체 대조군에 비해 NTX 대조군에서는 유의성 있는 (p<0.01) 비복근 조직내 내인성 항산화제인 GSH 함량의 감소가 인정되었으나, oxymetholone, 오미자 추출물 300 및 150mg/kg 투여군에서는 각각 NTX 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 근육 조직내 GSH 함량의 증가가 인정되었다. 한편 오미자 추출물 75mg/kg 투여군에서도 유의성은 인정되지 않았으나, NTX 대조군에 비해 현저한 GSH 함량의 증가가 인정되었다 (하기의 도 3 참조, 수치는 평균±표준편차, ** P<0.01 ANOVA test를 통한 shame 대조군과의 비교검정, ##, # P<0.01, P<0.05 ANOVA test를 통한 NTX대조군과의 비교검정).

NTX대조군에서는 최종 희생일의 비복근 조직내 GSH 함량이 위수술 매체 대조군에 비해 -56.67%의 변화를 나타내었으며, oxymetholone, 오미자 추출물 300, 150 및 75mg/kg 투여군에서 각각 NTX 대조군에 비해 60.22, 57.61, 47.46 및 29.35%의 변화를 나타내었다.

4. 비복근 SOD 활성의 변화

위수술 매체 대조군에 비해 NTX 대조군에서는 유의성 있는 (p<0.01) 비복근 조직내 내인성 항산화 효소인 SOD 활성의 감소가 인정되었으나, oxymetholone 및 모든 세용량의 오미자 추출물 투여군에서는 각각 NTX 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 근육 조직내 SOD 활성의 증가가 인정되었다 (하기의 도 4 참조, 수치는 평균±표준편차, ** , * P<0.01, P<0.05 ANOVA test를 통한shame 대조군과의 비교검정, ##, # P<0.01, P<0.05 ANOVA test를 통한 NTX대조군과의 비교검정).

NTX대조군에서는 최종 희생일의 비복근 조직내 SOD 활성은 위수술 매체 대조군에 비해 -59.03%의 변화를 나타내었으며, oxymetholone, 오미자 추출물 300, 150 및 75mg/kg 투여군에서 각각 NTX 대조군에 비해 72.97, 68.97, 57.05 및 36.68%의 변화를 나타내었다.

5. 비복근 CAT 활성의 변화

위수술 매체 대조군에 비해 NTX 대조군에서는 유의성 있는 (p<0.01) 비복근 조직내 내인성 항산화 효소인 CAT활성의 감소가 인정되었으나, oxymetholone, 오미자 추출물300, 150 및 75mg/kg 투여군에서는 각각 NTX 대조군에 비해 현저한 근육 조직내 CAT 활성의 증가가 인정되었다 (하기의 도 5 참조, 수치는 평균±표준편차, ** P<0.01 ANOVA test를 통한shame 대조군과의 비교검정, ##, # P<0.01, P<0.05 ANOVA test를 통한 NTX대조군과의 비교검정).

NTX대조군에서는 최종 희생일의 비복근 조직내 CAT 활성은 위수술 매체 대조군에 비해 -71.78%의 변화를 나타내었으며, oxymetholone, 오미자 추출물 300, 150 및 75mg/kg 투여군에서 각각 NTX 대조군에 비해 84.35, 85.89, 64.80 및 52.55%의 변화를 나타내었다.

6. 비복근 nitrotyrosine 면역반응성 근육섬유의 변화

NTX 대조군에서는 위수술 매체 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 비복근 다발 단위 면적당 (mm²) nitrotyrosine 면역반응 섬유의 수적 증가가 인정되었으나, oxymetholone, 오미자 추출물 300, 150 및 75mg/kg 투여군에서는 각각 NTX 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) nitrotyrosine 면역반응성 근육 섬유의 수적 감소가 인정되었다 (하기의 표1 및 도11 참조, A = 정상대조군; B = NTX 대조군; C = Oxymetholone 50mg/kg treated mice; D = SSE 300mg/kg orally treated mice; E = SSE 150mg/kg orally treated mice; F = SSE 75mg/kg orally treated mice, SSE = 오미자종자추출물; NTX = 대퇴신경절단술; 4-HNE = 4-hydroxynonenal; All ABC methods; Scale bars = 40㎛.). NTX 대조군의 비복근에서 지질과산화 마커인 4-HNE 면역반응성 섬유의 증가가 보이나, 이러한 증가는 오미자종자추출물의 투여로 용량의존적으로 감소하였다.

Group	비복근섬유다발에서 면역반응성 섬유수
Group	4-HNE (fibers/mm²)
Controls
Sham	4.30±1.77
NTX	72.30±11.39^a
Oxymetholone	44.70±10.34^ab
SSE treated
300mg/kg	46.10±10.09^ab
150mg/kg	54.70±9.29^ab
75mg/kg	57.40±12.07^ac

비복근에서의 면역조직형택학적 분석(수치는 평균±표준편차, SSE = 오미자종자추출물; NTX = 대퇴신경절단술, NT = Nitrotyrosine; 4-HNE = 4-hydroxynonenal; Oxymetholone was orally administered at 50mg/kg levels, suspended in distilled water, ^ap<0.01 as compared with sham control by ANOVA test, ^bp<0.01 and ^cp<0.05 as compared with NTX control by ANOVA test)

NTX대조군에서는 비복근 다발 단위 면적당 nitrotyrosine 면역반응 섬유의 수가 위수술 매체 대조군에 비해 597.10%의 변화를 나타내었으며, oxymetholone, 오미자 추출물 300, 150 및 75mg/kg 투여군에서 각각 NTX 대조군에 비해 -38.46, -39.50, -30.56 및 -21.62%의 변화를 나타내었다.

7. 비복근 4-HNE 면역반응성 근육섬유의 변화

NTX 대조군에서는 위수술 매체 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 비복근 다발 단위 면적당 (mm²) 4-HNE 면역반응 섬유의 수적 증가가 인정되었으나, oxymetholone, 오미자 추출물 300, 150 및 75mg/kg 투여군에서는 각각 NTX 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 4-HNE 면역반응성 근육 섬유의 수적 감소가 인정되었다 (상기 표1 및 도 11 참조).

NTX대조군에서는 비복근 다발 단위 면적당 4-HNE 면역반응 섬유의 수가 위수술 매체 대조군에 비해 1581.40%의 변화를 나타내었으며, oxymetholone, 오미자 추출물 300, 150 및 75mg/kg 투여군에서 각각 NTX 대조군에 비해 -38.17, -36.24, -24.34 및 -20.61%의 변화를 나타내었다.

[실험예 2: 오미자 추출물의 항산화 방어시스템에 대한 효과시험]

1. 실험동물

60마리의 7개월령 SPF ICR 암컷 마우스를 입수하여, 37일간 순화시킨 다음 체중 (정상 매체 대조군: 53.131±5.24g, 48.00~61.40g; HS(하지거상법) 근육위축 유발군: 52.77±5.83g, 43.50~64.70g) 및 종아리 두께 (정상 매체 대조군: 3.42±0.17mm, 3.13~3.64mm; HS 근위축유발군: 3.42±0.14mm, 3.16~3.68mm)가 일정한 실험동물을 군당 6마리씩 선정하여 실험에 사용하였다. 모든 실험동물은 약물 투여시작일 및 최종 부검일에 각각 18시간 정도 절식을 실시하였으며, picric acid로 개체를 식별하였다.

2. 실험군 (총 6개군; 군 당 6마리)

(1) Intact vehicle control: 정상 매체 대조군

(2) HS control: HS 및 멸균 증류수 투여 대조군

(3) Oxymetholone: HS 및 oxymetholone 50mg/kg 투여 대조 약물군

(4) SSE 150: HS 및 오미자 추출물 150mg/kg 투여군

(5) SSE 100: HS 및 오미자 추출물 100mg/kg 투여군

(6) SSE 50: HS 및 오미자 추출물 50mg/kg 투여군

3. 실험모델

이전의 방법들 [Desaphy et al., 2010; Onda et al., 2011]에 따라, 꼬리의 끝부분에 elastic tape를 이용하여, 가느다란 실을 부착시킨 다음 반대쪽 끝을 마우스 케이지의 상단 철망에 클립을 이용하여 고정시켜, 후지를 수평에서 30 내지 40°정도 상향되도록 위치시켰다. HS는 투여시작일에서부터 28일간 실시하여 후지 근육의 불용성 위축을 유발하였고, 정상 매체 대조군에서는 HS를 실시하지 않고, 후지의 움직임을 자유롭게 하였다.

4. 약물투여

오미자 추출물을 멸균 증류수에 현탁시켜 동물 체중 kg 당 10ml의 용량으로 HS 시작일에서부터, 매일 1회씩 28일간 금속제 zonde가 부착된 1ml 주사기 (syringe)를 이용하여 강제 경구투여 하였으며, oxymetholone 역시 오미자 추출물과 동일하게 멸균 증류수에 현탁시켜 경구 투여하였고, 정상 매체 및 HS 대조군에서는 오미자 추출물 또는 oxymetholone 대신 동일한 용량의 멸균 증류수만을 경구 투여하였다. 본 실험에 사용한 oxymetholone 투여용량은 이전의 동물 실험 결과를 바탕으로 50 mg/kg [Pavlatos et al., 2001; Isaacs et al., 2011]을 투여용량으로 선정하였으며, 오미자 추출물은 150, 100 및 50mg/kg으로 선정하였다.

5. 비복근의 항산화 방어 시스템의 변화를 관찰하여, 근육의 항산화에 미치는 오미자 추출물의 효과평가

비복근의 reactive oxygen species (ROS) 및 glutathione (GSH) 함량, superoxide dismutase (SOD) 및 catalase (CAT) 활성, 지질과산화 (lipid peroxidation; malondialdehyde (MDA) 함량을 평가하였다.

6. 비복근의 항산화 방어 시스템의 변화를 관찰

근육의 무게를 측정후, 비복근을 분리한다. 그리고 MDA, ROS, GSH, SOD, catalase효소의 활성을 각각 측정한다.

Del Rio et al. [2005]의 방법에 따라 분리된 비복근의 무게를 측정후 ice-cold 0.01M Tris-HCl (pH 7.4)에서 균질화 후 12,000g에서 15분 동안 원심분리한다. thiobarbituric acid test를 이용하여 525nm 흡광도에서 MDA(nM/g)를 측정한다 [Jamall and Smith, 1985].

ROS측정은 2', 7' dichlorofluorescein diac-etate fluorescent 염색법으로 490/520nm 흡광도로 측정하였으며ROS assay kit; Abcam, Cambridge, MN, USA) 단위는 상대적 형광도(relative fluorescence unit; RFU)로 나타내었으며 단백질 농도로 보정하여 사용하였다. RFU/μg protein [He et al., 2012].

1nM의 과산화수소를 25?, pH 7.8 상태에서 분당 분해하는 결과를 U/mg protein으로 표시하였다.

SOD 활성은 Sun et al. [1988]의 방법에 따라 측정하였다.

nitrotertrazolium blue와의 반응을 통한 formazan 염색을 통하여 560nm에서 반응도를 측정하였으ㅇ며 U/mg protein으로 표현하였다.

7. 통계분석

one way ANOVA test로 유의성을 검정하였다.

[실험예 2: 오미자 추출물의 항산화 방어시스템에 대한 효과시험결과]

1. 비복근MDA 함량의 변화

정상 매체 대조군에 비해 HS 대조군에서는 유의성 있는 (p<0.01) 비복근내 지질 과산화의 증가, 즉 MDA 함량의 증가가 인정되었으나, oxymetholone, 오미자 추출물 150, 100 및 50mg/kg 투여군에서는 각각 HS 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) MDA 함량의 감소가 인정되었다(하기의 도6 참조, 수치는 평균±표준편차, ** p<0.01 as compared with sham control by ANOVA test, ## p<0.01 and # p<0.05 as compared with HS control by ANOVA test).

HS대조군에서는 최종 희생일의 비복근 조직내 MDA 함량이 정상 매체 대조군에 비해 400.00%의 변화를 나타내었으며, oxymetholone, 오미자 추출물 150, 100 및 50mg/kg 투여군에서 각각 HS 대조군에 비해 -26.74, -43.11, -27.19 및 -19.93%의 변화를 나타내었다.

2. 비복근ROS 함량의 변화

정상 매체 대조군에 비해 HS 대조군에서는 유의성 있는 (p<0.01) 비복근내 ROS의 증가가 인정되었으나, oxymetholone, 오미자 추출물 150, 100 및 50mg/kg 투여군에서는 각각 HS 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) ROS 함량의 감소가 인정되었다 (하기의 도 7 참조, 수치는 평균±표준편차, ** p<0.01 as compared with sham control by ANOVA test, ## p<0.01 and # p<0.05 as compared with HS control by ANOVA test).

HS대조군에서는 최종 희생일의 비복근 조직내 ROS함량이 정상 매체 대조군에 비해 123.20%의 변화를 나타내었으며, oxymetholone, 오미자 추출물 150, 100 및 50mg/kg 투여군에서 각각 HS 대조군에 비해 -24.46, -41.02, -23.10 및 -18.91%의 변화를 나타내었다.

3. 비복근 GSH 함량의 변화

정상 매체 대조군에 비해 HS 대조군에서는 유의성 있는 (p<0.01) 비복근 조직내 내인성 항산화제인 GSH 함량의 감소가 인정되었으나, oxymetholone 및 세용량의 모든 오미자 추출물 투여군에서는 각각 HS 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 근육 조직내 GSH 함량의 증가가 인정되었다(하기의 도 8 참조, 수치는 평균±표준편차, ** p<0.01 as compared with sham control by ANOVA test, ## p<0.01 and # p<0.05 as compared with HS control by ANOVA test).

HS 대조군에서는 최종 희생일의 비복근 조직내 GSH 함량이 정상 매체 대조군에 비해 -60.13%의 변화를 나타내었으며, oxymetholone, 오미자 추출물 150, 100 및 50mg/kg 투여군에서 각각 HS 대조군에 비해 61.90, 82.54, 62.70 및 37.30%의 변화를 나타내었다.

4. 비복근 SOD 활성의 변화

정상 매체 대조군에 비해 HS 대조군에서는 유의성 있는 (p<0.01) 비복근 조직내 내인성 항산화 효소인 SOD 활성의 감소가 인정되었으나, oxymetholone 및 모든 세용량의 오미자 추출물 투여군에서는 각각 HS 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 근육 조직내 SOD 활성의 증가가 인정되었다(하기의 도 9 참조, 수치는 평균±표준편차, ** p<0.01 as compared with sham control by ANOVA test, ## p<0.01 and # p<0.05 as compared with HS control by ANOVA test).

HS 대조군에서는 최종 희생일의 비복근 조직내 SOD 활성은 정상 매체 대조군에 비해 -49.31%의 변화를 나타내었으며, oxymetholone, 오미자 추출물 150, 100 및 50mg/kg 투여군에서 각각 HS 대조군에 비해 34.49, 59.14, 36.18 및 22.79%의 변화를 나타내었다.

5. 비복근 CAT 활성의 변화

정상 매체 대조군에 비해 HS 대조군에서는 유의성 있는 (p<0.01) 비복근 조직내 내인성 항산화 효소인 CAT활성의 감소가 인정되었으나, oxymetholone, 오미자 추출물 150, 100 및 50mg/kg 투여군에서는 각각 HS 대조군에 비해 유의성 있는 (p<0.01 또는 p<0.05) 근육 조직내 CAT 활성의 증가가 인정되었다 (하기의 도 10 참조, 수치는 평균±표준편차, ** p<0.01 as compared with sham control by ANOVA test, ## p<0.01 and # p<0.05 as compared with HS control by ANOVA test).

HS 대조군에서는 최종 희생일의 비복근 조직내 CAT 활성은 정상 매체 대조군에 비해 -76.45%의 변화를 나타내었으며, oxymetholone, 오미자 추출물 150, 100 및 50mg/kg 투여군에서 각각 HS 대조군에 비해 63.03, 98.42, 61.45 및 40.44%의 변화를 나타내었다.

상기 오미자 추출물은 투여 용량 의존적으로 HS에 의한 근육내 지질 과산화 및 항산화 방어 시스템의 저하를 현저히 억제하는 것으로 관찰되어, 오미자 추출물은 근육에서 항산화 방어 시스템을 활성화시키는 것을 확인할 수 있었다.

이상에서 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본 발명의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본 발명의 권리범위에 속하는 것이다.

Claims

오미자 추출물을 포함하고,
근육 내 지질 과산화를 억제하고 근육 항산화 효과를 가지는
오미자 추출물을 포함하는 근육 항산화 및 면역 활성 증진용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 오미자 추출물은 150 내지 210℃에서 건조 후 동결건조된 오미자를 탄소수 1 내지 4개의 저급 알코올 또는 이들의 50 내지 200 부피% 알코올 수용액과 혼합하여 추출된 것인
오미자 추출물을 포함하는 근육 항산화 및 면역 활성 증진용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 오미자 추출물은 오미자에 바실러스 리체니포르미스(Bacillus lichenifomis) 또는 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) 중 1종 이상의 미생물을 접종하여 제조된 것인
오미자 추출물을 포함하는 근육 항산화 및 면역 활성 증진용 조성물.
제3항에 있어서,
상기 바실러스 리체니포르미스는 건조된 오미자의 질량 대비 0.0001 내지 0.05%(w/v)로 접종된 것인
오미자 추출물을 포함하는 근육 항산화 및 면역 활성 증진용 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 오미자 추출물은 0.1 내지 10 중량%로 포함되는 것인
오미자 추출물을 포함하는 근육 항산화 및 면역 활성 증진용 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 오미자 추출물은
MDA 및 ROS 효소의 활성 감소시키고, GSH, SOD 및 CAT 효소의 활성은 증가시키며, nitrotyrosine 면역반응성 근육 섬유 및 4-HNE 면역반응성 근육 섬유의 감소시키는 것인
오미자 추출물을 포함하는 근육 항산화 및 면역 활성 증진용 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 오미자 추출물을 포함하는 근육 항산화 및 면역 활성 증진용 조성물을 포함하는 것인
식품 조성물.
오미자를 150 내지 210℃에서 건조하여 건조된 오미자를 제조하는 오미자 건조단계;
상기 건조된 오미자를 분쇄하여 오미자 분말을 제조하는 오미자 분쇄단계;
상기 오미자 분말을 동결 건조하여 동결건조 된 오미자 분말을 제조하는 동결건조 단계 및
상기 동결건조 된 오미자 분말을 탄소수 1 내지 4개의 저급 알코올 또는 이들의 50 내지 200 부피% 알코올 수용액과 1 : 3 내지 3 : 1의 부피비로 혼합하여 15 내지 35℃에서 10 내지 30 시간 동안 오미자 추출물을 제조하는 오미자 추출단계를 포함하는 것인
오미자 추출물을 포함하는 근육 항산화 및 면역 활성 증진용 조성물의 제조방법.
제8항에 있어서,
상기 오미자 건조단계 및 오미자 추출단계 사이에,
상기 오미자 건조단계를 거친 건조된 오미자에 바실러스 리체니포르미스(Bacillus lichenifomis) 또는 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) 중 1종 이상의 미생물을 접종하고, 배양하는 오미자 발효단계를 더 포함하는 것인
오미자 추출물을 포함하는 근육 항산화 및 면역 활성 증진용 조성물의 제조방법.