KR101731569B1 - 으름덩굴 추출물을 유효성분으로 포함하는 구강세균 독성에 의한 염증을 예방, 개선 또는 치료하는 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 으름덩굴 추출물을 유효성분으로 포함하는 구강세균 독성에 의한 염증을 예방, 개선 또는 치료하는 조성물에 관한 것이다.
더욱 구체적으로는 구강세균인 스트렙토코커스 뮤탄스 (Streptococcus mutans)의 부착 부위(adhesin)이며 독소, 즉 독력 인자(virulence factor)인 AgⅠ/Ⅱ로 인한 염증을 예방, 개선 또는 치료하는 효능을 보유하는 으름덩굴 추출물을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 조성물은 AgⅠ/Ⅱ를 2.5 ug/mL 처리한 RAW 264.7 세포(1×106 cell/well) 대상으로 으름덩굴 추출물을 7.8~256 ug/mL로 포함하는 것을 특징으로 하는 구강세균 독성에 의한 염증을 예방, 개선 또는 치료하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 조성물은 세포 독성이 없으며, AgⅠ/Ⅱ로 인한 NO 및 PGE2의 생성을 저해하고, 전구염증매개 효소인 iNOS, COX-2 및 NF-κB의 발현을 저해하며, 염증성 사이토카인 TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 발현을 저해하고, 항염성 사이토카인 IL-10의 발현을 촉진 시키는 효능을 보유하고 있다.
더욱 구체적으로는 구강세균인 스트렙토코커스 뮤탄스 (Streptococcus mutans)의 부착 부위(adhesin)이며 독소, 즉 독력 인자(virulence factor)인 AgⅠ/Ⅱ로 인한 염증을 예방, 개선 또는 치료하는 효능을 보유하는 으름덩굴 추출물을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 조성물은 AgⅠ/Ⅱ를 2.5 ug/mL 처리한 RAW 264.7 세포(1×106 cell/well) 대상으로 으름덩굴 추출물을 7.8~256 ug/mL로 포함하는 것을 특징으로 하는 구강세균 독성에 의한 염증을 예방, 개선 또는 치료하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 조성물은 세포 독성이 없으며, AgⅠ/Ⅱ로 인한 NO 및 PGE2의 생성을 저해하고, 전구염증매개 효소인 iNOS, COX-2 및 NF-κB의 발현을 저해하며, 염증성 사이토카인 TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 발현을 저해하고, 항염성 사이토카인 IL-10의 발현을 촉진 시키는 효능을 보유하고 있다.
Description
본 발명은 으름덩굴 추출물을 유효성분으로 포함하는 구강세균 독성에 의한 염증을 예방, 개선 또는 치료하는 조성물에 관한 것이다.
더욱 구체적으로는 구강세균인 스트렙토코커스 뮤탄스 (Streptococcus mutans)의 부착 부위(adhesin)이며 독소, 즉 독력 인자(virulence factor)인 AgⅠ/Ⅱ로 인한 염증을 예방, 개선 또는 치료하는 효능을 보유하는 으름덩굴 추출물을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 조성물은 AgⅠ/Ⅱ를 2.5 ug/mL 처리한 RAW 264.7 세포(1×106 cell/well) 대상으로 으름덩굴 추출물을 7.8~256 ug/mL로 포함하는 것을 특징으로 하는 구강세균 독성에 의한 염증을 예방, 개선 또는 치료하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 조성물은 세포 독성이 없으며, AgⅠ/Ⅱ로 인한 NO 및 PGE2의 생성을 저해하고, 전구염증매개 효소인 iNOS, COX-2 및 NF-κB의 발현을 저해하며, 염증성 사이토카인 TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 발현을 저해하고, 항염성 사이토카인 IL-10의 발현을 촉진 시키는 효능을 보유하고 있다.
사람의 구강에는 다양한 종류의 세균들이 군집을 형성하고 있다. 구강의 타액과 분비물에는 다양한 단백질이 존재하는데, 예를 들어 입안에는 라이소자임(Lysozyme)이라는 효소를 포함하고 있는 침이 지속적으로 분비되어 미생물을 제어하고 있지만, 영양분이 가득한 구강 환경은 미생물 성장에 최적의 조건이 될 수 있기에 완전한 사멸을 유도하지는 못한다. 특히 구강의 혀나 치태(dental plaque)는 병원성 미생물들의 도피처로 이용되고 있다.
사람의 구강(oral cavity) 내에 생존하는 것으로 추측되는 미생물은 대략 600 내지 800종 이상으로 알려져 있고, 이 중 박테리아(bacteria)가 대부분을 차지하고 있지만, 고세균(archaea)이나 진핵미생물(fungi and yeast)도 많이 포함되어 있는 것으로 알려져 있다.
이들 중 대부분은 무해한 일반세균이거나, 이들과 공생관계에 있는 미생물이지만, 일부의 미생물들은 기회 병원균(opportunistic pathogen)으로서, 치아우식증(dental cavities; 충치)과 치주질환(periodontal disease; 풍치)와 같은 질환의 원인이 된다.
치아우식증은, 플라크(dental plaque; 치태)를 형성하는 미생물들이 입속의 영양분을 이용해 발효대사를 진행하여 젖산과 같은 다양한 유기산을 만들고 치아 표면의 칼슘을 제거함으로써 유발된다. 상기 플라크는, 침 속에 있는 단백질이 치아에 얇은 막을 형성하고, 그 위에 연쇄상구균의 일종인 스트렙토코쿠스 소브리누스(Streptococcus sobrinus)균 및 스트렙토코쿠스 뮤탄스(Streptococcus mutans)가 순서대로 부착해 바이오 필름(biofilm)을 형성함으로써 만들어지고, 푸조박테리움(Fusobacterium)에 의해 더욱 두꺼워진다.
일단 치아표면 에나멜층이 유기산에 의해 파괴되면 그 아래의 치아층도 미생물이 분비한 단백질 분해효소에 의해 파괴되고 결국 치아우식증이 심해진다.
치주질환은 치주조직의 염증과 구조의 소실을 야기 시키는 질환으로서, 풍치라고도 불린다. 구체적으로, 치주질환은 치아를 떠받들고 있는 치아주위의 조직에 염증이 생기는 질환으로서, 임상적으로 치은출혈(gingival bleeding)과 종창(swelling), 치주낭(periodontal pocket)의 형성 및 치조골의 파괴 등으로 치아의 상실을 가져오게 된다
이러한 치주질환의 주요 원인은 플라크로서, 이러한 플라크가 치주낭 내에 기계적으로 축적되면 주변에 존재하는 세균들의 서식처가 되며, 이러한 서식은 점차 호기성, 통기성, 그람 양성세균으로 점차 이행되어, 치주낭의 심부로 증식되게 된다. 이때 함께 증식된 혐기성 그람음성 세균의 독소 및 모든 산물은 직접 조직을 파괴하거나 면역계를 자극하여, 자극된 면역계에서부터 여러 가지 작용에 의한 치주조직 파괴와 더불어 염증을 유발하게 된다.
이러한 구강질환의 개선 또는 치료를 위한 방법으로는, 우식 부위를 제거하고 다른 충전재로 채우는 방법, 항생제를 사용하여 구강 내 세균을 박멸하는 방법 또는 잇몸 속의 세균성 치석 등을 제거하고 다시 봉합하는 방법 등이 수행되고 있다.
그러나 위와 같은 방법들은 치료 방법이 복잡하며, 비용과 시간이 많이 소요된다. 또한, 항생제를 사용하여 구강 내 세균을 살균하는 경우, 구강 내 세균 분포의 균형이 무너져 구강 내의 면역력이 감소하고 구강 건조증 등의 질환이 유발될 수 있으며, 항생제에 대한 구강 세균의 내성이 발생할 수도 있다.
따라서 치아우식증 및 치주질환과 같은 구강 질환을 예방, 개선 또는 치료할 수 있는 대체물질의 개발이 필요한 실정이다.
이에 본 발명자들은 으름덩굴 추출물이 포함된 조성물을 제공함으로써 구강세균 독성에 따른 염증과 상기 염증으로 인해 유발되는 질환을 예방, 개선 또는 치료할 수 있는 조성물을 안출하였다.
한편, 대표적인 구강 세균들로는 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans), 포피로모나스 긴기발리스(Porphyromonas gingivalis) 및 프레보텔라 인터메디아(Prevotella intermedia) 등이 있으며, 본 발명자들은 스트렙토코커스 뮤탄스에서 유래한 염증 유발 효능을 보유한 재조합 단백질 AgⅠ/Ⅱ-N에 대하여 밝혀낸 바가 있다(출원번호 제10-2013-0167008호).
상기 재조합 단백질 AgⅠ/Ⅱ-N은 AgⅠ/Ⅱ-N 항체 또는 MAPKs 통로 저해제 전처리시에도 니트레이트, COX-2, iNOS, c-fos, c-jun, IκB-α, HuR, pERK, ERK, pp38, p38, pJNK 및 JNK의 발현이 감소하지 않으며, 2~9 ug/mL 투여시 기존 염증 유도 물질인 LPS보다 니트레이트의 생성량이 높다.
따라서 본 발명에 따른 으름덩굴 추출물을 포함하는 조성물은, 기존의 염증 유도 물질인 LPS 이외에 AgⅠ/Ⅱ-N도 함께 이용하여 실험함으로써, 구강세균 독성에 따른 염증과 상기 염증으로 인해 유발되는 질환을 예방, 개선 또는 치료할 수 있다.
이하 본 발명의 소재로써 사용된 으름덩굴에 대해 간략하게 설명하면 다음과 같다.
으름덩굴(Akebia quinata)은 으름덩굴과에 속하는 낙엽 덩굴식물로, 한방이름으로는 목통이라고 하며, 으름은 이 덩굴에 달리는 열매를 가리키는 말이다.
산 50~1,2000 m 고지의 양지나 음지쪽 골짜기나 계곡가에 주로 서식하고, 이웃나무에 감아 올라가거나 바위에 기대어 자라며, 군락이 있다.
으름덩굴은 콩팥 사구체의 여과기능을 좋게 하고, 콩팥 세뇨관에서 재흡수를 억제하기 때문에 별다른 부작용 없이 소변을 잘 나가게 하는 효과가 있다. 또한, 모유분비를 촉진하는 효과와 고혈압에 좋은 으름의 팔미틴(palmitin), 올레인(olein), 리놀레인(linolein) 등의 성분이 혈압을 낮춰주는 효과가 있다.
본 발명과 관련된 선행문헌을 살펴보면, 대한민국 등록특허공보 제10-0816264호(선행문헌 1)에는 목통 추출물을 유효 성분으로 함유하는 피부자극 완화용화장료 조성물에 관하여 기재되어 있다. 대한민국 공개특허공보 제10-2014-0012456호(선행문헌 2)에는 으름덩굴 유래 아케비아 사포닌-디를 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 조성물에 관하여 기재되어 있다. 대한민국 공개특허공보 제10-2015-0015874호(선행문헌 3)에는 으름 열매의 메탄올 추출물에서 분리 정제된 올레아놀릭산을 포함하는 항산화, 항염증 및 항암 조성물에 관하여 기재되어 있다.
선행문헌 1의 내용을 살펴보면, 목통 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물에 관하여 기재되어 있으나, 대상을 피부병 내지는 알레르기 증상이 없는 사람으로 한정하여 피부의 홍반을 측정함으로써 피부에서의 항염 효과를 확인함을 알 수 있다.
본 발명의 대상질환인 구강질환은 구강세균으로 인하여 유발되는 질환이며, 구강세균은 구강 외의 기타 기관에서는 수분 농도, 영양분 공급 정도 및 온도 등의 조건이 적합하지 않으므로 서식할 수 없다. 따라서 피부에서의 항염 효과를 확인한 선행문헌 1로부터는 피부에서 서식하기 어려운 구강세균에 대한 항염효과까지 이르기 어렵다.
선행문헌 2의 내용을 살펴보면, 으름덩굴유래 아케비아 사포닌-디를 유효성분으로 함유하는 조성물에 관하여 기재되어 있으며, 대상 세포를 각질형성 세포인 HaCaT 세포에 한정하여 COX 활성억제능을 측정함으로써 항염 효과를 확인함을 알 수 있다. 이에 대한 본 발명과의 상이점은 선행문헌 1에서처럼 대상질환이 상이함을 알 수 있다.
또한, 선행문헌 2에는 LPS 및 PMA(포르볼미리스테이트 아세테이트, phorbol myristate acetate)를 사용하여 염증을 유도한 후, 유효성분을 함유하는 조성물을 투여하는 사항에 관하여 기재되어 있다.
이에 비하여 본 발명은 실제 치주질환을 발생시키는 구강세균 독성 인자인 AgⅠ/Ⅱ를 저해하는 실험을 수행하였다.
따라서 선행 문헌 2에서의 LPS 또는 PMA로 유도된 염증을 저해하는 효능은 본 발명에서의 으름덩굴 추출물을 통한 구강세균 독성 AgI/Ⅱ를 저해하는 효능에 이를 수 없다.
선행문헌 3의 내용을 살펴보면, 으름열매에서 분리정제된 올레아놀릭산을 유효성분으로 함유하는 조성물에 관하여 기재되어 있으며, LPS를 사용하여 염증을 유도한 후, 유효성분을 함유하는 조성물을 투여하는 사항에 관하여 기재되어 있다.
이에 비하여 본 발명은 실제 치주질환을 발생시키는 구강세균 독성 인자인 AgⅠ/Ⅱ를 저해하는 실험을 수행하였다.
따라서 선행 문헌 3에서의 LPS로 유도된 염증을 저해하는 효능은 본 발명에서의 으름덩굴 추출물을 통한 구강세균 독성 AgI/Ⅱ를 저해하는 효능에 이를 수 없다.
본 발명의 목적은 구강세균 독성에 의한 염증을 예방, 개선 또는 치료하는 조성물을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 목적은 구강세균 독성에 의한 염증으로 인하여 유발되는 질환인 구강질환 등을 예방, 개선 또는 치료하는 조성물을 제공하는 데에 있다.
본 발명은 AgⅠ/Ⅱ를 2.5 ug/mL 처리한 RAW 264.7 세포(1×106 cell/well) 대상으로 구강세균인 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)의 부착 부위(adhesin)이며 독소, 즉 독력 인자(virulence factor)인 AgⅠ/Ⅱ로 인한 염증을 예방, 개선 또는 치료하는 효능을 보유한 으름덩굴 추출물을 7.8~256 ug/mL 포함하는 조성물을 제공함으로써 기술적 과제를 해결하고자 한다.
본 발명에 따른 조성물은 세포 독성이 없으며, AgⅠ/Ⅱ로 인한 NO 및 PGE2의 생성을 저해하고, 전구염증매개 효소인 iNOS, COX-2, NF-κB의 발현을 저해하며, 염증성 사이토카인 TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 발현을 저해하고, 항염성 사이토카인 IL-10의 발현을 촉진 시키는 효능을 보유한 조성물을 제공함으로써 기술 과제를 해결하고자 한다.
본 발명에 따른 조성물은 세포 독성이 없는 효능을 보유하고 있다.
본 발명에 따른 조성물은 구강세균에 의한 NO의 생성을 저해하는 효능을 보유하고 있다.
본 발명에 따른 조성물은 구강세균에 의한 PGE2의 생성을 저해하는 효능을 보유하고 있다.
본 발명에 따른 조성물은 전구염증매개 효소인 iNOS와 COX-2의 발현을 저해하는 효능을 보유하고 있다.
본 발명에 따른 조성물은 NF-κB의 발현을 저해하는 효능을 보유하고 있다.
본 발명에 따른 조성물은 염증성 사이토카인 TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 발현을 저해하는 효능을 보유하고 있다.
본 발명에 따른 조성물은 항염성 사이토카인 IL-10의 발현을 촉진하여 염증의 발생을 억제할 수 있는 효능을 보유하고 있다.
도 1은 RAW 264.7 세포에서 으름덩굴 추출물을 농도별로 처리하였을 때의 세포 독성을 비교한 결과이다.
도 2는 RAW 264.7 세포에서 으름덩굴 추출물을 농도별로 처리하였을 때의 NO 생성량을 비교한 결과이다.
도 3은 RAW 264.7 세포에서 으름덩굴 추출물을 농도별로 처리하였을 때의 PGE2생성량을 비교한 결과이다.
도 4는 RAW 264.7 세포에서 으름덩굴 추출물을 농도별로 처리하였을 때의 iNOS 및 COX-2의 발현을 비교한 웨스턴 블롯 결과이다.
도 5는 RAW 264.7 세포에서 으름덩굴 추출물을 농도별로 처리하였을 때 NF-κB p65의 발현을 비교한 웨스턴 블롯 결과이다.
도 6은 RAW 264.7 세포에서 으름덩굴 추출물을 농도별로 처리하였을 때의 TNF-α 생성량을 나타낸 결과이다.
도 7은 RAW 264.7 세포에서 으름덩굴 추출물을 농도별로 처리하였을 때의 IL-1β 생성량을 나타낸 결과이다.
도 8은 RAW 264.7 세포에서 으름덩굴 추출물을 농도별로 처리하였을 때의 IL-6 생성량을 나타낸 결과이다.
도 9는 RAW 264.7 세포에서 으름덩굴 추출물을 농도별로 처리하였을 때의 IL-10 생성량을 나타낸 결과이다.
도 2는 RAW 264.7 세포에서 으름덩굴 추출물을 농도별로 처리하였을 때의 NO 생성량을 비교한 결과이다.
도 3은 RAW 264.7 세포에서 으름덩굴 추출물을 농도별로 처리하였을 때의 PGE2생성량을 비교한 결과이다.
도 4는 RAW 264.7 세포에서 으름덩굴 추출물을 농도별로 처리하였을 때의 iNOS 및 COX-2의 발현을 비교한 웨스턴 블롯 결과이다.
도 5는 RAW 264.7 세포에서 으름덩굴 추출물을 농도별로 처리하였을 때 NF-κB p65의 발현을 비교한 웨스턴 블롯 결과이다.
도 6은 RAW 264.7 세포에서 으름덩굴 추출물을 농도별로 처리하였을 때의 TNF-α 생성량을 나타낸 결과이다.
도 7은 RAW 264.7 세포에서 으름덩굴 추출물을 농도별로 처리하였을 때의 IL-1β 생성량을 나타낸 결과이다.
도 8은 RAW 264.7 세포에서 으름덩굴 추출물을 농도별로 처리하였을 때의 IL-6 생성량을 나타낸 결과이다.
도 9는 RAW 264.7 세포에서 으름덩굴 추출물을 농도별로 처리하였을 때의 IL-10 생성량을 나타낸 결과이다.
본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 안 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.
따라서 본 명세서에 기재된 실험예와 참고예는 본 발명의 가장 바람직한 일실시예에 불과한 뿐이고 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.
실시예
1. 으름덩굴 추출물의 제조
으름덩굴 추출물을 추출할 시 추출 부위는 잎, 줄기, 열매 또는 뿌리가 이용될 수 있으며, 바람직하게는 줄기를 이용할 수 있다.
으름덩굴 추출물을 추출할 시 추출 방법에는 용매 추출법, 수증기 증류법, 이산화탄소 초임계 추출법, 마이크로 웨이브 공정 추출법, 퍼콜레이션 추출법 등의 다양한 추출 방법이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 용매 추출법을 이용할 수 있다.
용매 추출시, 추출 용매의 종류에 따라 추출 온도, 추출 시간, 용매의 양 및 잔류 성분 처리 방식 등을 달리하여 처리한다. 추출 용매 또한 다양한 용매가 사용될 수 있다. 추출 가능한 용매에는 물, 에탄올(ethanol), 메탄올(methanol), 지방유(fatty oil), 글리세린(glycerin), 마유, 플로필렌글리콜(propylene glycol), 에테르(ether), 클로르포름(chloroform), 석유에테르(petroleum ether), 헥산(hexane), 벤젠(benzene), 메틸렌클로라이드(methylene chloride), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 아세톤(acetone), 부탄올(butanol) 및 이소프로판올(isopropanol) 등이 있으며, 바람직하게는 에탄올을 사용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 추출시 시간 및 온도가 달라질 수 있으며, 용매의 농도 역시 달라질 수 있다.
또한, 설계 조건에 따라 추출 후 농축, 여과 및 동결건조 등의 과정을 1회 이상 수행할 수 있으며, 상기 공정을 수행한 후 용매에 용해할 수도 있다.
실험예
1. 세포 독성 측정
1-1. 실험 준비
1) 세포 배양
실험은 마우스의 대식세포주(murine macrophage cell line)인 RAW264.7 세포주를 사용하였다.
세포주는 10% 소태아혈청(fetal bovine serum), 100 units/mL 페니실린, 100 ug/mL 스트렙토마이신(streptomycin)을 함유한 Dulbecco's modified eagles medium(Gibco, USA) 완전배지를 사용하여 37℃ CO2 배양기에서 배양하였다.
이후 모든 실험예에서 사용한 세포주는 위와 동일한 과정으로 배양되었음을 밝혀둔다.
1-2. 실험 과정
으름덩굴 추출물을 16~256 ug/mL 농도로 처리하고 MTT 검정법(methylthiazol tetrazolium bromide)을 통해 으름덩굴 추출물의 세포 독성을 측정하였다.
MTT 검정법은 살아있는 세포의 미토콘드리아에 있는 탈수소효소에 의해 생성된 blue formazan 결정을 DMSO(dimethyl sulfoxide)로 녹여서 발색 시켜 그 흡광도를 측정하는 방법이다.
Well당 MTT 용액(2 mg/ml)을 50 ul씩 넣어 37℃, 5% CO2 항온기에서 2시간 반응시킨 후 배지는 제거하고 DMSO를 well당 100 ul씩 넣어 5분간 plate shaker에서 blue formazan 결정을 용해 시킨 다음 ELISA reader(Techan, Germany) 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
1-3. 실험 결과
도 1은 RAW 264.7 세포에서 으름덩굴 추출물을 농도별로 처리하였을 때의 세포 독성을 비교한 결과이다.
실험 결과, 으름덩굴 추출물을 16~256 ug/mL 농도별로 처리하였을 때의 시간에 따른 세포 생존율은 모두 100% 이상으로 확인되었다.
통상적으로 특정 조성물을 처리하였을시 세포 생존율이 60% 이상이면 세포 독성이 없는 것으로 판단한다. 따라서 으름덩굴 추출물은 세포 독성이 없다는 결론을 도출할 수 있다.
실험예
2. NO 생성 측정
2-1. 실험 과정
으름덩굴 추출물의 구강세균 독성에 의한 염증을 억제하는 효능을 알아보기 위해, NO 생성능을 RAW264.7 대식세포를 이용하여 관찰하였다.
각 RAW 264.7 대식세포를 1×106 세포/mL의 농도로 분취하고 37℃ CO2 배양기에서 4시간 동안 배양한 후, Ag Ⅰ/Ⅱ(2.5 ug/mL)과 으름덩굴 추출물(7.8~256 ug/mL)을 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 배양 종료 후 배양 상등액 중의 아질산염(nitrite, NO의 안정한 수화합물)의 농도를 Griess assay 방법(Griess. P., Chem. Ber. 12:426-428, 1897)으로 측정하였다. 즉 NaNO2를 표준물질로 하고 그리스 시약(Griess reagent, 0.5% sulfanilyamide, 0.05% N-(1-naphthyl) ethylene diamine dihydrochloride/2.5% H3PO4)을 이용하여 540 nm에서 시료의 흡광도를 측정하였다.
2-2. 실험 결과
도 2는 RAW 264.7 세포에서 으름덩굴 추출물을 농도별로 처리하였을 때의 NO 생성량을 비교한 결과이다.
실험 결과, 으름덩굴 추출물을 7.8~256 ug/mL 농도별로 처리하였을 때의 시간에 따른 NO 생성능은 감소하는 경향을 보였다.
따라서 으름덩굴 추출물이 농도 의존적으로 NO 생성량을 감소시킨다는 결론을 도출할 수 있다.
실험예
3.
PGE
2
생성 측정
3-1. 실험 과정
으름덩굴 추출물의 구강세균 독성에 의한 염증을 억제하는 효능을 알아보기 위해, PGE2 생성능을 RAW264.7 대식세포를 이용하여 관찰하였다.
실험과정은 상기 NO 생성 측정 실험과정과 동일하다.
3-2. 실험 결과
도 3은 RAW 264.7 세포에서 으름덩굴 추출물을 농도별로 처리하였을 때의 PGE2 생성량을 비교한 결과이다.
실험 결과, 으름덩굴 추출물을 7.8~256 ug/mL 농도별로 처리하였을 때의 시간에 따른 PGE2 생성능은 감소하는 경향을 보였다.
따라서 으름덩굴 추출물이 농도 의존적으로 PGE2 생성량을 감소시킨다는 결론을 도출할 수 있다.
실험예
4.
전구염증매개
효소 발현 정도 측정
4-1. 실험 과정
염증을 유발하는 전구염증매개 효소인 iNOS(inducible nitric oxide synthase)와 COX-2(cyclooxygenase-2)의 발현 정도를 웨스턴 블롯 실험으로 측정함으로써, 으름덩굴 추출물의 구강세균의 독성에 의한 염증을 개선하는 효능을 확인하였다.
Ag Ⅰ/Ⅱ를 2.5 ug/mL 처리하여 염증이 유도된 Raw264.7 세포 1×106개를 100 ㎜ 페트리디쉬에서 24시간 배양 후, 배지를 제거한 다음에 세포를 배양용기로부터 떼어내어 단백질 분해효소 저해제(Proteaseinhibitor cocktail, Roche, USA)를 함유한 단백질 용출용액(CelLyticTM-MT Tissue Lysis Reagent, Sigma, USA)을 사용하여 균질화하였다. 추출액은 20분 동안 14000 rpm에서 원심분리한 뒤 상등액과 불용성 응집체를분리하였다.
분리된 상등액의 단백질 농도는 바이오-라드 단백질 분석 키트(Bio-Rad protein assay kit, Bio-Rad, USA)를 이용하여 측정하였다. 또한, 상등액을 5×SDS(0.156M Tris-HCl, pH 6.8, 2.5% SDS, 37.5% 글리세롤, 37.5 mM DTT)와 1:4로 섞어 100℃에서 10분간 끓였다. 끓인 시료에서 40 ug 단백질을 SDS 4-12% SDS-PAGE 겔에 로딩하였고 125 V에서 2시간 동안 전기영동 하여 분자량에 따라 분리하였다.
상기 분리된 단백질을 겔 한 장당 50 mA의 조건으로 1시간 동안 전기영동 하여 PVDF 막으로 옮겼다. 단백질이 옮겨진 막에서 단백질이 없는 부분을 탈지분유로 차단(blocking)시킨 다음, 1차 항체[항-iNOS 항체(1:1000, Santa Cruz Biotechnology, USA), 항-COX-2 항체(1:1000, Santa Cruz Biotechnology, USA),또 는 항-액틴 항체(Santa Cruz Biotechnology, USA)] 및 2차 항체(항토끼-IgG HRP; Amersham Biosciences, UK)를 순차적으로 결합시킨 후, ECL 검출 키트(Amersham Biosciences, UK)로 발광반응을 유발하였고 X-ray 필름에 노출 시켜 감광하였다.
4-2. 실험 결과
도 4은 RAW 264.7 세포에서 으름덩굴 추출물을 농도별로 처리하였을 때의 iNOS 및 COX-2의 발현을 비교한 웨스턴 블롯 결과이다.
실험 결과, 으름덩굴 추출물을 31.3~256 ug/mL 처리하였을시 처리 농도를 증가시킴에 따라 iNOS의 발현이 감소하기 시작하여, 으름덩굴 추출물 125 ug/mL을 처리한 시점부터 iNOS가 거의 발현되지 않는 것을 볼 수 있었다.
따라서 으름덩굴 추출물은 전구염증매개 효소인 iNOS의 발현을 저해한다는 결론을 도출할 수 있다.
실험예
5.
NF
-
κB
발현 정도 측정
5-1. 실험과정
염증을 유발하는 NF-κB의 발현 정도를 웨스턴 블롯 실험으로 측정함으로써, 으름덩굴 추출물의 구강세균의 독성에 의한 염증을 개선하는 효능을 확인하였다.
실험과정은 상기 전구염증매개 효소 발현 정도 측정 실험과정과 동일하다.
5-2. 실험결과
도 5는 RAW 264.7 세포에서 으름덩굴 추출물을 농도별로 처리하였을 때의 NF-κB의 구성요소인 p65의 발현을 비교한 웨스턴 블롯 결과이다.
실험 결과, 으름덩굴 추출물을 31.3~256 ug/mL 처리하였을시 p65의 발현이 감소하기 시작하였고, 으름덩굴 추출물 31.3 ug/mL을 처리한 시점부터 p65의 발현 정도가 현저히 감소함을 볼 수 있었다.
따라서 으름덩굴 추출물은 NF-κB의 발현을 저해한다는 결론을 도출할 수 있다.
실험예
6. 염증성 사이토카인 생성 측정
6-1. 실험 과정
염증반응의 지표가 되는 염증성 사이토카인의 생성량을 측정함으로써, 으름덩굴 추출물의 구강세균 독성에 의한 염증을 개선하는 효능을 확인하고자 하였다.
RAW 264.7 세포 1×106 cells/mL를 24 well plate 에 접종하고, 5% CO2 항 온기에서 18시간 전 배양하였다. 이후 배지를 제거하고 Ag Ⅰ/Ⅱ(2.5 ug/mL), 으름덩굴 추출물(15.6~256 ug/mL)을 처리하여 전 배양과 동일 조건에서 배양하였다. 24시간 후 배양 배지를 원심분리 (12,000 rpm, 3분)하여 얻어진 상층액의 염증성 사이토카인의 생성함량을 측정하였다. 염증성 사이토카인은 mouse enzyme-linked immnunosorbent assay (ELISA) kit (R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA)를 이용하여 정량하였다.
6-2. 실험 결과
도 6은 RAW 264.7 세포에서 으름덩굴 추출물을 농도별로 처리하였을 때의 TNF-α의 생성량을 나타낸 결과이다.
도 7은 RAW 264.7 세포에서 으름덩굴 추출물을 농도별로 처리하였을 때의 IL-1β의 생성량을 나타낸 결과이다.
도 8은 RAW 264.7 세포에서 으름덩굴 추출물을 농도별로 처리하였을 때의 IL-6의 생성량을 나타낸 결과이다.
실험 결과, 으름덩굴 추출물을 15.6~256 ug/mL 처리하였을시 처리 농도가 높아질수록 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 생성량이 감소하는 것을 볼 수 있다.
따라서 으름덩굴 추출물은 농도의존적으로 구강세균의 독성으로 인해 유발되는 염증을 억제 또는 완화하는 효능을 보유함을 알 수 있다.
실험예
7. IL-10 생성 측정
7-1. 실험 과정
염증 반응에 관여하는 사이토카인(TNF-α, IL-6)을 억제하는 항염성 사이토카인 IL-10의 생성량을 측정함으로써, 으름덩굴 추출물의 구강세균 독성에 의한 염증을 개선하는 효능을 확인하고자 하였다.
실험과정은 상기 염증성 사이토카인 생성 측정 실험과정과 동일하다.
7-2. 실험 결과
도 9는 RAW 264.7 세포에서 으름덩굴 추출물을 농도별로 처리하였을 때의 IL-10의 생성량을 나타낸 결과이다.
실험 결과, 으름덩굴 추출물을 15.6~256 ug/mL 처리하였을시 처리 농도가 높아질수록 항염성 사이토카인인 IL-10의 생성량이 증가하는 것을 볼 수 있다.
따라서 으름덩굴 추출물은 농도의존적으로 구강세균의 독성으로 인해 유발되는 염증을 억제 또는 완화하는 효능을 보유함을 알 수 있다.
Claims (5)
- 삭제
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- 으름덩굴(Akebia quinata) 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물로서,
상기 으름덩굴 추출물은,
에탄올로 추출된 추출물이고,
AgⅠ/Ⅱ를 2.5 ug/mL 처리한 RAW 264.7 세포(1×106 cells/well) 대상으로, 1회 처리시 7.8~256 ug/mL이며,
세포 독성이 없으며, AgⅠ/Ⅱ로 인한 NO 및 PGE2의 생성을 저해하고, 전구염증매개 효소인 iNOS, COX-2 및 NF-κB의 발현을 저해하며, 염증성 사이토카인 TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 발현을 저해하고, 항염성 사이토카인 IL-10의 발현을 촉진 시키는 효능을 보유하는 것을 특징으로 하는,
스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)의 독력 인자(virulence factor)인 AgⅠ/Ⅱ로 인한 염증을 예방 또는 개선하는 건강기능식품 조성물.
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Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020150093211A KR101731569B1 (ko) | 2015-06-30 | 2015-06-30 | 으름덩굴 추출물을 유효성분으로 포함하는 구강세균 독성에 의한 염증을 예방, 개선 또는 치료하는 조성물 |
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| KR1020150093211A KR101731569B1 (ko) | 2015-06-30 | 2015-06-30 | 으름덩굴 추출물을 유효성분으로 포함하는 구강세균 독성에 의한 염증을 예방, 개선 또는 치료하는 조성물 |
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| KR100816264B1 (ko) | 2006-08-22 | 2008-03-27 | 주식회사 코리아나화장품 | 목통 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부자극 완화용화장료 조성물 |
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-
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Non-Patent Citations (2)
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| Minjeong Lee et al, ‘Detection of Streptococcus mutans in Saliva using Monoclonal Antibodies’, J Korean Acad Pediatr Dent, 2015. 2, Vol.42, No.1, 10-21* |
| 이기돈 et al, ‘으름덩굴 열매 추출물이 구강 내 미생물의 항균활성과 부유세포사멸에 미치는 영향’, J Korean Acad dent Health, 2008, Vol.32, No.4, 485-494* |
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