KR20150015874A - 으름열매에서 올레아놀릭산을 분리정제하는 방법 및 분리정제된 올레아놀릭산을 포함하는 항산화, 항염증 및 항암 조성물 - Google Patents

으름열매에서 올레아놀릭산을 분리정제하는 방법 및 분리정제된 올레아놀릭산을 포함하는 항산화, 항염증 및 항암 조성물 Download PDF

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KR20150015874A
KR20150015874A KR1020130091838A KR20130091838A KR20150015874A KR 20150015874 A KR20150015874 A KR 20150015874A KR 1020130091838 A KR1020130091838 A KR 1020130091838A KR 20130091838 A KR20130091838 A KR 20130091838A KR 20150015874 A KR20150015874 A KR 20150015874A
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건국대학교 산학협력단
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Abstract

본 발명은 으름열매의 메탄올 추출물에서 올레아놀릭산을 분리정제하는 방법 및 분리정제된 올레아놀릭산을 포함하는 조성물에 관한 것으로, (a) 동결건조 및 분말화된 으름열매 준비단계; (b) 준비된 으름열매를 메탄올 추출하는 단계; (c) 추출된 으름열매 분획물을 에틸아세테이트 가용부, 부탄올 가용부와 물가용부로 분리하는 단계; (d) 상기 부탄올 가용부를 가수분해시키는 단계; (e) 상기 가수분해된 부탄올 가용부의 혼합물을 에틸아세테이트로 재추출한 후 증류수에 세척하는 단계; 및 (f) 세척된 혼합물을 실리카겔를 사용하여 분리하는 단계;를 포함하여 구성된 것이 특징이며, 으름열매의 메탄올 추출물에서 분리정제된 올레아놀릭산은 NO생성 억제능, 농도에 따라 유의적으로 항산화능이 증가되었고, 항염증과 항암활성효과를 가졌음을 확인하였다.

Description

으름열매에서 올레아놀릭산을 분리정제하는 방법 및 분리정제된 올레아놀릭산을 포함하는 항산화, 항염증 및 항암 조성물{Method for separate refining Oleanolic acid from Akebia quinata DECNE and Antioxidant, Anti-inflammatory and Anti-cancer Composition including this Oleanolic acid}
본 발명은 으름열매에서 올레아놀릭산을 분리정제하는 방법 및 분리정제된 올레아놀릭산을 포함하는 항산화, 항염증 및 항암 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 으름열매에서 종양유전자의 발현에 대한 효과를 보이는 올레아놀릭산을 분리정제하고, 으름에서 분리정제된 올레아놀릭산을 포함하는 조성물이 분화된 HL60 세포에서 TPA로 유도된 과산화물(O2 -) 생성 억제 효과와 RAW 264.7 세포에서 lipopolysaccharide (LPS)로 유도된 NO(Nitrite Oxide) 생성 억제 효과가 있음을 입증함으로써 항염증과 항암효과를 규명할 수 있는 으름열매에서 올레아놀릭산을 분리정제하는 방법 및 분리정제된 올레아놀릭산을 포함하는 항산화, 항염증 및 항암 조성물에 관한 것이다.
Oleanolic acid(올레아놀릭산)은 항당뇨, 진통제, 화학적 암예방, 항혈관치료, 항산화와 항염증 활성과 같은 생리활성이 알려져 있으며, HONE-1(비인두암세포), KB(구강표피양암종), HT29(결장암), K562(백혈병　세포), HL-60(전골수구성백혈병 세포), MCF-7 (유방암세포)와 Hep-G2(간암세포)에 대한 억제활성에 대한 연구가 논문으로 보고된 바 있다.
특히, 최근 논문에서는 빈크리스틴 (vincristine) 저항력이 있는 K562 (백혈병세포)에서 세포자살효과를 유도한다는 것이 발표되었다. 그리고 In vivo 피부암 모델 연구에 따르면, 우르솔릭산(ursolic acid)과 올레아놀릭산(Oleanolic acid)은 피부암 발암 작용을 하는 TPA (12-tetradecanoylphorbol-13-acetate)의 억제효과가 있으며, 올레아놀릭산의 항암 효과는 TPA와 대상이 되는 유전자의 활성이 관련된 것으로 보고되었다. 그러나 으름열매 추출물에서 분리정제된 올레아놀릭산(Oleanolic acid)의 활성산소종에 억제 효과 및 종양세포 사멸에서 자가사멸(apoptosis)에 관여되는 기전에 대한 연구는 매우 미비한 실정이다.
더욱이, 본 발명에 이용되는 으름은 쌍떡잎식물 미나리아재비속 으름덩굴과의 낙엽 덩굴식물로서 학명은 Akebia quinata DECNE이다. 예로부터 약용으로 사용되어온 Akebia quinata DECNE의 열매는 소염제, 이뇨제 그리고 해독제의 용도로 알려져 왔다. 또한, 목통이라 불리는 으름 줄기는 이뇨제, 소염제로 민간요법 약품으로 사용되어왔다. 으름의 줄기 성분으로 트라터핀(Triterpenes), 사포닌(Saponin), 스테롤(Sterols) 등이 들어있다고 보고되었고, 과피의 성분으로는 사포닌(Saponin), 올레아놀릭산(Oleanolic acid), 아르주놀릭산(Arjunolic acid), 노르아르주놀릭산 글리코시드(Norarjunolic acid glycosides) 등이 분리되었다고 보고 되었다. 이와 같이 으름열매의 이러한 생물학적 활성이 알려져 있음에도 유효성분에 대한 연구가 미흡한 것 또한 현실정이다.
본 발명의 제1 목적은 으름으로부터 종양유전자의 발현에 효과를 보이는 올레아놀릭산을 분리정제하는 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 제2 목적은 으름에서 분리 정제된 종양유전자의 발현에 대한 올레아놀릭산의 효과를 보이기 위해, 분화된 HL60 세포에서 TPA로 유도된 과산화물(O2 -) 생성 억제 효과와 RAW 264.7 세포에서 lipopolysaccharide (LPS)로 유도된 NO(Nitrite Oxide) 생성 억제 효과를 입증함으로써, 으름열매에서 추출된 올레아놀릭산의 항염증과 항암효과를 규명하는 것이다.
본 발명에 따른 목적을 달성하기 위하여,
본 발명에 따른 으름열매에서 올레아놀릭산을 분리정제하는 방법은,
(a) 동결건조 및 분말화된 으름열매 준비단계;
(b) 준비된 으름열매를 메탄올 추출하는 단계;
(c) 추출된 으름열매 분획물을 에틸아세테이트 가용부, 부탄올 가용부와 물가용부로 분리하는 단계;
(d) 상기 부탄올 가용부를 가수분해시키는 단계;
(e) 상기 가수분해된 부탄올 가용부의 혼합물을 에틸아세테이트로 재추출한 후 증류수에 세척하는 단계; 및
(f) 세척된 혼합물을 실리카겔를 사용하여 분리하는 단계;를 포함하여 구성된 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 따른 으름열매에서 올레아놀릭산을 분리정제하는 방법은,
상기 동결건조 및 분말화된 으름 열매 10kg를 메탄올에 침지시켜 실온에서 30일 동안 추출하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 따른 으름열매에서 올레아놀릭산을 분리정제하는 방법은,
상기 추출된 으름열매 분획물 1kg을 에틸아세테이트 가용부, 부탄올 가용부와 물가용부로 분리하고, 이중 부탄올 가용부 20g을 5% HCl(MeOH/H2O)에서 4시간 동안 가수분해시키는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 따른 으름열매에서 올레아놀릭산을 분리정제하는 방법은,
상기 가수분해된 혼합물을 에틸아세테이트로 800ml로 재추출한 후 증류수에 세척하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 따른 으름열매에서 올레아놀릭산을 분리정제하는 방법은,
상기 세척된 혼합물을 실리카겔(silica gel) 450-580mesh를 사용하여 올레아놀릭산과 트라이터페노익산으로 분리하고 올레아놀릭산을 정제하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 따른 올레아놀릭산을 포함하는 항산화, 항염증 및 항암 조성물은, 상술한 어느 한 방법에 따라 제조된 올레아놀릭산을 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 따른 항산화, 항염증 및 항암 조성물은, 으름열매 추출물을 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 따른 으름열매 추출물을 포함하는 항산화, 항염증 및 항암 조성물은, 으름열매 추출물의 NO 생성억제능의 IC50 값은 207.53~704.45 ㎍/㎖ 이고, 그 중 메탄올 추출물의 NO 생성억제능의 IC50 값은 207.53㎍/㎖ 인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 따른 항산화, 항염증 및 항암 조성물은, 으름열매 추출물에서 분리정제된 올레아놀릭산을 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 따른 으름열매 추출물에서 분리정제된 올레아놀릭산을 포함하는 항산화, 항염증 및 항암 조성물에서,
상기 으름열매 추출물로부터 분리정제된 올레아놀릭산 50~500 ㎍/㎖ 농도의 NO 생성억제능은 10.7~61.8%로 농도에 따라 증가하며, 상기 올레아놀릭산의 IC50 값은 318.15 ㎍/㎖ 이고, 시토코롬씨(cytochorome c)로 측정된 올레아놀릭산의 O2 - 생성억제능은 50㎍/㎖과 500 ㎍/㎖ 농도에서 각각 91.35과 51.04%인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 따른 으름열매 추출물에서 분리정제된 올레아놀릭산을 포함하는 항산화, 항염증 및 항암 조성물에서,
상기 으름열매 추출물로부터 분리정제된 올레아놀릭산 50 μg/ml를 암세포에 처리시, S기의 HeLa 세포는 11.24% 감소 유도, MCF-7 세포는 G0-G1주기에서 대조군 29.75%에 비해 45.65%로 정체, U87 세포는 S기에서 대조군에 비해 0.71%가 억류되는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 따른 으름열매 추출물에서 분리정제된 올레아놀릭산을 포함하는 항산화, 항염증 및 항암 조성물에서,
상기 암세포에 대한 올레아놀릭산의 IC50 값은 24.79~31.83㎍/㎖ 인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 으름열매 추출물 또는 으름열매 추출물에서 분리 정제된 종양유전자의 발현에 대해 효과를 보이는 올레아놀릭산은 항산화, 항염증 및 항암효과가 있다.
도 1은 본 발명에 따른 으름열매로부터 올레아놀릭산을 추출하고 분리정제하는 것을 나타낸 분획도와 구조도,
도 2는 대조군과 비교하여 각 용매제의 으름열매 추출물의 농도에 따른 DPPH Radical 소거능 결과를 나타내는 그래프,
도 3의(a),(b)는 본 발명에 따른 으름열매로부터 추출되어 분리정제된 올레아놀릭산의 RAW264.7 세포에서의 NO와 O2 - 생성억제능 결과를 나타내는 그래프,
도 4는 본 발명에 따른 으름열매로부터 추출되어 분리정제된 올레아놀릭산의 농도에 따른 암세포에서의 세포독성 결과를 나타내는 그래프,
도 5a는 본 발명에 따른 으름열매로부터 추출되어 분리정제된 올레아놀릭산(0,50,250㎍/㎖)으로 처리된 암세포에서의 자가사멸 검출결과를 나타내는 그래프, 도 5b는 세포주기 중 G0/G1, S, G2/M기에서의 밀집도를 보여주는 히스토그램,
도 6은 본 발명에 따른 으름열매로부터 추출되어 분리정제된 올레아놀릭산(0,50㎍/㎖)으로 처리된 암세포에서의 자가사멸 검출결과를 나타내는 그래프,
도 7의 a~c는 본 발명에 따른 으름열매로부터 추출되어 분리정제된 올레아놀릭산 50㎍/㎖와 대조군에서의 면역염색법에 의한 Bax와 caspase-3의 발현 결과를 나타내는 그래프.
이하, 실시예에 의해 본 발명을 보다 상세하게 설명하나, 하기 실시예 및 제조예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐으로, 본 발명의 내용이 하기 실시예나 제조예에 의해 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 도면에 표기된 용어 'Con'은 대조군을 나타내는 것이고, 'OA'는 올레아놀릭산을 나타내는 것이다.
실험재료
본 발명의 으름열매는 충청남도 홍성군 광천읍 담산리 부근의 자생열매를 채취하여 사용하였다.
제조예 : 으름열매에서 올레아놀릭산을 분리정제
으름열매에서 올레아놀릭산을 분리정제하는 방법을 하기에서 간략하게 나타내었고, 이것을 도1에서 분획도와 구조표로 나타내었다.
(a) 동결건조 및 분말화된 으름열매 준비단계
동결건조 및 분말화된 으름 열매를 10kg 준비한다.
(b) 준비된 으름열매를 메탄올 추출하는 단계
준비된 으름열매를 메탄올에 침지시켜 실온에서 30일 동안 추출한다.
(c) 추출된 으름열매 분획물을 에틸아세테이트 가용부, 부탄올 가용부와 물가용부로 분리하는 단계
추출된 열매 분획물 1kg을 에틸아세테이트(ethyl acetate), 부탄올(butanol)과 물 가용부로 분리한다.
(d) 부탄올 가용부를 가수분해시키는 단계
이 중 butanol 가용부 20g을 5% HCl(MeOH/H2O)에서 4시간 동안 가수분해를 시킨다.
(e) 가수분해된 부탄올 가용부의 혼합물을 에틸아세테이트로 재추출한 후 증류수에 세척하는 단계
가수분해된 부탄올 가용부의 혼합물을 에틸아세테이트(ethyl acetate) 800ml로 다시 재추출한 후 증류수에 세척을 한다.
(f) 세척된 혼합물을 실리카겔를 사용하여 분리하는 단계
세척된 혼합물을 실리카겔(silica gel) 450-580mesh를 사용하여 올레아놀릭산과 트라이터페노익산으로 분리하고 올레아놀릭산을 정제한다.
실시예1 : 세포독성평가( Cytotoxicity assay )
으름열매 추출물의 암세포 성장억제능을 확인하기 위하여 50~500 ㎍/㎖의 농도로 암세포에 으름열매 추출물을 처리하였다.
3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl) -2, 5-diphenyltetrazolium bromide (MTT test)는 살아있는 미토콘드리아 내 탈수소효소가 노란색의 수용성물질인 MTT에 의해서 formazan 으로 전환된 양을 나타내며, 생존하는 세포수와 비례한다. 5×104 cells/ml의 세포가 분주된 96well plate를 24시간 배양 후, drog를 처리하고 24시간을 추가로 배양한다. 그 후 각 well에 MTT용액을 (5mg/ml)을 첨가하고 4시간 동안 배양하였다. 그 후 배양액을 제거한 후, 생성된 formazan 결정을 DMSO에 용해시켜 Elasa reader를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 이 때 측정된 흡광도는 생존하는 세포의 미토콘드리아 탈수소효소에 의해 MTT가 formazan으로 전환된 양을 나타내며 생존하는 세포수와 비례한다.
그 결과는 아래 [표1] 및 도 4에 나타낸 바와 같이, 7가지의 추출물 중에서 에틸아세테이트 추출물이 HeLa 세포에서 가장 높은 성장억제효과를 보여주었다 (IC50 278.9 ㎍/㎖). 또한, 으름열매 추출물은 HeLa, MCF-7와 U87에 대한 확실한 생장억제능과 NO 생성억제능을 보여주었다. 따라서 으름열매로부터 추출한 올레아놀릭산은 암에 대한 치료 및 예방에 효과가 있는 것으로 판단된다.
실시예2 : Free radical - scavenging activity ( DPPH )
으름열매 추출물의 항산화능을 알아보기 위하여, 항산화 반응은 활성산소 제거능을 관찰할 수 있는 DPPH방법을 사용하여 관찰하였는 바, 시료에 0.2 mM DPPH solutions을 200 μL 넣어 혼합 후 37℃, 30분간 암반응시켰으며, 그 후 그 혼합물의 흡광도를 microplate reader를 사용하여 520nm에서 측정하고, DPPH 활성은 반응시키지 않은 DPPH solution을 기준으로 하여 활성을 계산하였다.
그 결과, 대조군과 비교하여 각 용매제의 으름열매 추출물의 농도에 따른 DPPH Radical 소거능 결과를 나타내는 그래프인 도 2에 나타낸 바와 같이 으름열매의 메탄올추출물에서 농도에 따라 유의적으로 항산화능이 증가됨을 확인하였다.
실시예3 : Nitric Oxide ( NO ) assay
NO 측정은 cell의 supernatant에서의 nitric oxide(NO)의 량을 nitrite and nitrate로서 측정을 하였다. Nitrite에 대한 nitrate로 환원된 후의 안전한 형태인 griess reagent를 사용하였으며, 96 well plate에 1×106 개의 cell을 confluence가 80% 일 때, PBS로 2번 washing한 후에 무혈청 배지로 교체 후 LPS, L-arginine, tetrahydrobropterin, IF-N-r를 well에다 넣어서 자극시켰다. 그 배지에 시료를 처리하여 실험하였다. NO 생성량은 supernatant를 모아 griess reagent로 10분간 반응시킨 후에 540 nm에서 흡광도로 측정하였다.
으름열매의 추출물들의 RAW 264.7 세포에서의 NO 생성 저하능을 관찰하기 위하여 NO asaay를 실험하였으며, 그 결과는 [표1]에 나타내었다.
Figure pat00001
으름열매 추출물의 NO 생성억제능의 IC50 값은 207.53~704.45 ㎍/㎖ 으로 계산되었고 RAW 264.7의 생존율에는 영향이 없었다. 메탄올 추출물에서 가장 효과적인 NO생성 억제능이 보였으며, [표1]에 나타낸 바와 같이, 70% ethanol과 methanol 추출물이 가장 높은 NO 생성저하 능력이 있음이 확인되었다.
< 올레아놀릭산의 NO 와 O 2 - 생성억제능 >
도 3의(a),(b)는 본 발명에 따른 으름열매로부터 추출되어 분리정제된 올레아놀릭산의 RAW264.7 세포에서의 NO와 O2 - 생성억제능 결과를 나타내는 그래프로서,
도 3의 (a)에 나타낸 바와 같이, 으름열매 추출물로부터 분리정제된 올레아놀릭산을 RAW 264.7 세포에 50~500 ㎍/㎖의 농도로 처리하였을 때, 그 억제능은 10.7~61.8%로 농도에 따라 증가하는 결과를 보여주었다. 즉, 올레아놀릭산의 NO 생성억제능이 확인되었다. 그리고 세포 생존율에는 영향을 미치지 않았으며, IC50 값은 318.15 ㎍/㎖ 으로 측정되었다. NO는 다양한 생물학적 활성을 가지고 있으며 특히 바이러스, 세균에 대한 면역활성과 관련된 역할을 하고 있다.
또한, 도 3의 (b)에 나타낸 바와 같이, O2 - 생성을 유도한 HL60 세포에서 관찰한 올레아놀릭산의 O2 - 생성억제능과 apoptosis 활성은 올레아놀릭산의 암예방물질로서의 가능성을 보여주었다. 시토크롬씨(cytochrome c) 양으로 측정된 올레아놀릭산의 O2 - 생성억제능은 50과 500 ㎍/㎖ 농도에서 각각 91.35과 51.04%를 보여주었다. 본 발명으로 올레아놀릭산의 항산화능뿐아니라 NO와 O2 - 생성억제능이 확인됨에 따라 올레아놀릭산의 식물화학물질(phytochemicals)로서의 가능성을 보여주었다.
실시예4 : 세포주기 분석
Sample을 24시간 처리한 세포를 2000rpm에서 10분간 원심분리한 후, 상층액을 제거하고 70% 에탄올로 4℃에서 1시간 동안 고정시킨다. PBS로 두번 세척한 후 300㎕의 Propidium iodid staistain 용액에 세포를 분산시킨 후 37℃ 암실에서 30분간 방치하고 flow cytometry를 사용하여 세포주기를 분석하였다.
세포주기 진행 억류는 암세포성장의 또 다른 중요한 방법 중 하나로서, 본 발명에 따른 으름열매로부터 추출되어 분리정제된 올레아놀릭산(0, 50㎍/㎖)으로 처리된 암세포에서의 자가사멸 검출결과를 나타내는 그래프인 도 6에 나타낸 바와 같이, 으름열매 추출물에서 분리정제된 올레아놀릭산(oleanolic acid) 처리는 강한 S기 억류 효과를 가짐이 확인되었다. 올레아놀릭산의 S기 억류는 HeLa세포에서 가장 효과적으로 일어났고, 올레아놀릭산은 S기의 HeLa 세포를 11.24% 감소를 유도하였음을 확인할 수 있다. 또한, MCF-7 세포는 50 μg/ml 농도로 올레아놀릭산을 처리하였을 때 세포들이 G0-G1주기에서 45.65%로 대조군(29.75%)에 비해 확연히 정체되어 있음을 확인할 수 있다. U87 세포주에서는 올레아놀릭산을 50 μg/ml 농도로 처리하였을 때 S기에서 대조군에 비해 0.71%가 억류되었음을 확인할 수 있었다.
이는 다른 식물로부터 추출된 올레아놀릭산이 세포주기의 G0-G1기를 억류하는 결과를 보인 것과 달리, 으름열매에서 추출된 올레아놀릭산의 경우 S기를 정체시키는 활성을 보여주는 것으로, 으름열매에서 추출된 올레아놀릭산의 경우에는 다른 식물에서 추출된 것과 다른 매카니즘을 통해 세포주기 정체를 유도시키는 것으로 판단된다.
실시예5 : 자가사멸( apoptosis ) 분석 및 면역염색
자가사멸(apoptosis) 분석을 위하여 BD Pharmingen의 FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit 1 제품을 사용하여 측정하였다. 실험은 제공된 제조사의 실험방법에 따라 진행되었다.
실험방법은 시료 처리 후 24시간된 세포를 차가운 PBS를 사용하여 두번 세척한다. 그리고 1X binding buffer에 1×106 cell/ml 으로 세포를 분산시킨다. 세포를 분산시킨 용액 100㎕ (1×105 cells)을 5㎖ 실험관에 옮긴다. 여기에 5㎕의 FITC Anenexin V 와 5㎕ PI용액을 넣어 준다. 가볍게 혼합시켜준 후, 15분간 암실에서 반응시킨다. 400㎕의 binding buffer를 추가하여 flow cytometry를 사용하여 분석하였다.
또한, 면역염색을 위하여, 세포를 포르말린으로 고정 시킨 후, Triton X-100으로 1시간 반응시킨다. 그 다음 5% bovine serum albumin (BSA)로 1시간 반응시킨 다음 4℃에서 1차 항체를 붙인다. 그 세포를 0.5% BSA로 세척한 후 2차 항체로 2시간 암반응시킨다. 그리고 DAPI　로 세포핵을　면역염색하여 형광현미경으로 관찰하였다.
< 올레아놀릭산이 암세포 생존율에 미치는 영향>
으름열매에서 추출된 올레아놀릭산이 암세포 생존율에 미치는 영향을 관찰하기 위하여, 암세포에 올레아놀릭산을 5㎍/㎖, 25㎍/㎖ 과 50 ㎍/㎖ 의 농도로 처리하여 MTT법을 사용하여 세포독성(Cytotoxicity)을 확인하였다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 암세포에 대한 올레아놀릭산의 IC50 값은 24.79~31.83㎍/㎖ 으로 계산되었다. 그 중 U87 세포가 올레아놀릭산에 대해 가장 민감하게 반응하여 가장 낮은 IC50 값이 확인되었다. 약용식품에 포함된 사포닌의 비당성분인 올레아놀릭산은 다양한 생리활성물질로 보고되어왔는바, 본 발명에서 으름열매 추출물로부터 분리정제된 올레아놀릭산이 항염증과 항암활성뿐만 아니라 다양한 생리활성 효과를 가졌음이 확인되었다.
< 올레아놀릭산의 암세포에 대한 성장억제능이 자가사멸( apoptosis )과 관련있 는지 여부 확인>
올레아놀릭산의 암세포에 대한 성장억제능이 자가사멸(apoptosis)과 관련되어있는지를 확인하기 위하여 세가지 암세포에 대해 Annexine V-FITC 염색법으로 이를 확인하였다.
즉, 모든 암세포에 으름열매 추출물로부터 분리정제된 올레아놀릭산을 50㎍/㎖과 250 ㎍/㎖의 농도로 처리하고 24 시간 반응시켰고, 그 결과 도 5a, 및 도 5b에 나타낸 바와 같이, 올레아놀릭산은 apoptotic 세포의 수를 농도에 따라 증가시키는 결과를 보여주었다. 특히, 올레아놀릭산은 U87세포에서 가장 강력한 apoptosis 반응을 보여주었다. HeLa 세포의 경우에는, 대조군에서는 세포의 0.17%에서만 apoptosis가 나타낸 것과 달리, 50㎍/㎖과 250㎍/㎖의 농도로 처리된 암세포에서는 세포의 각각 15.4% 과 36.59%의 apoptosis가 나타났다. MCF-7세포에서 실험된 apoptosis 결과에 따르면, oleanolic acid농도가 0㎍/㎖, 50㎍/㎖, 250㎍/㎖ 로 증가함에 따라 0.6%, 88.76% 그리고 59.59%으로 apoptotic 세포의 수가 증가하였다. 이 결과는 으름열매에서 추출된 올레아놀릭산이 Coleus tuberosus L.에서 추출된 올레아놀릭산보다 더 효과적으로 apoptosis를 유도시킨다는 것을 보여준다.
더욱이, 이러한 결과는 U87 세포에서도 나타났다. 대조군의 결과에서는 오직 0.29%의 apoptosis가 일어난 반면, 50㎍/㎖의 농도로 으름열매 추출물로부터 분리정제된 올레아놀릭산을 처리한 결과에서는 94.2%의 apoptosis가 일어났고, 250㎍/㎖의 농도로 처리한 결과 98.52%의 결과를 보여주었다. 이 결과로 올레아놀릭산은 자궁경부암(HeLa), 유방암(MCF-7)과 뇌종양(U87) 세포에서 효과적인 apoptosis 유도 활성이 확인되었으며, 특히 MCF-7세포의 경우 올레아놀릭산의 농도가 50, 250㎍/㎖으로 증가함에 따라 각각 29.41, 41.33 %의 괴사(necrosis)가 증가되는 결과를 보여주었다.
이와 같은 으름열매에서 추출한 올레아놀릭산의 apoptosis 유도 활성에 대한 결과는 현재까지 거의 보고 된바 없었으며, 단지 최근에 꿀풀(Prunella Vulgaris)에서 추출된 올레아놀릭산이 SPA-1세포의 apoptosis를 유도한다고 발표된 사실이 있었을 뿐이고, 이전 논문에는 올리브 (O. europaea) 과일에서 추출된 올레아놀릭산이 1321N1 세포에서 농도에 따라 apoptosis 유도 활성과 G0-G1기에서 세포의 억류가 증가된다는 보고가 있었을 뿐이다.
< 올레아놀릭산의 처리에 따른 자가사멸( apoptosis)과 관련된 단백질의 발현>
자가사멸(Apoptosis)은 apoptosis 발현 현상으로 알려진 plasma 막 수포형성, 세포 수축, 염색질의 응축과 분열에 따른 카스파제(caspase)와 엔도뉴클레아제(endonuclease)의 분비로 세포단백질의 단백질 가수분해 분열이라고 한다. apoptosis 신호 전달에서 중요한 통로인 caspase는 단백질 관련 apoptosis 메커니즘에서 중요한 역할을 한다. 그리고 caspase-3는 세포 형태학적 변화와 관련 있으며 caspase의 발현 증가는 apoptosis 유발이 증가되는 것이라고 할 수 있다. Bax는 시토졸(cytosols)에서 시토코롬씨(cytochorome c) 의 생성에 따른 미토콘드리아의 파괴에 관여하여 apoptosis를 제어하며, cytochorome c 는 세포 사멸 단백질 분해 효소 - 활성화 인자 - 1 (APAF-1)와 상호 작용을 하고 caspase-3의 활성화와 apoptosis의 주요인자인 poly (ADPribose) polymerase (PARP)의 활성을 유도시킨다.
도 7의 a~c는 본 발명에 따른 으름열매로부터 추출되어 분리정제된 올레아놀릭산 50㎍/㎖와 대조군에서의 면역염색법에 의한 Bax와 caspase-3의 발현 결과를 나타내는 그래프이다.
본 발명에 따르면, 도 7에 나타낸 바와 같이, 암세포에 대한 으름열매 추출물로부터 분리정제된 올레아놀릭산의 apoptosis 유도활성은 Bax와 caspase-3의 활성과 관련되어 있음이 확인되었다. 또한 폐선암(SPC-A-1), 간암(HepG2, Hep3B), Huh7과 HA22T 세포에서도 올레아놀릭산이 Bax와 caspase-3의 발현을 유도시킨다고 확인되었다. 올레아놀릭산이 암세포에서의 백스(Bax)와 카스파제-3(caspase-3)의 발현 증가와 관련되었음이 확인되었고 따라서, 올레아놀릭산은 mitochondria-mediate apoptosis 에 관련된 전구 - 세포사멸유도 단백질의 변화를 유발시키므로 apoptosis을 유도하는 것으로 보여진다.
이와 같은 결과를 통해 으름열매의 메탄올 추출물에서 분리정제된 올레아놀릭산은 NO생성 억제능이 보였으며, 농도에 따라 유의적으로 항산화능이 증가되었고, 항염증과 항암활성뿐만 아니라 다양한 생리활성 효과를 가졌음을 확인하였다.
비록 본 발명이 상기에서 언급한 바람직한 실시예와 관련하여 설명되었지만, 본 발명의 요지와 범위로부터 벗어남이 없이 다른 다양한 수정이나 변형이 가능할 것이다. 따라서, 첨부된 청구범위는 본 발명의 진정한 범위 내에 속하는 그러한 수정 및 변형을 포함함은 물론이다.

Claims (12)

  1. (a) 동결건조 및 분말화된 으름열매 준비단계;
    (b) 준비된 으름열매를 메탄올 추출하는 단계;
    (c) 추출된 으름열매 분획물을 에틸아세테이트 가용부, 부탄올 가용부와 물가용부로 분리하는 단계;
    (d) 상기 부탄올 가용부를 가수분해시키는 단계;
    (e) 상기 가수분해된 부탄올 가용부의 혼합물을 에틸아세테이트로 재추출한 후 증류수에 세척하는 단계; 및
    (f) 세척된 혼합물을 실리카겔를 사용하여 분리하는 단계;를 포함하여 구성된 것을 특징으로 하는 으름열매에서 올레아놀릭산을 분리정제하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 동결건조 및 분말화된 으름 열매 10kg를 메탄올에 침지시켜 실온에서 30일 동안 추출하는 것을 특징으로 하는 으름열매에서 올레아놀릭산을 분리정제하는 방법.
  3. 제 2항에 있어서,
    상기 추출된 으름열매 분획물 1kg을 에틸아세테이트 가용부, 부탄올 가용부와 물가용부로 분리하고, 이중 부탄올 가용부 20g을 5% HCl(MeOH/H2O)에서 4시간 동안 가수분해시키는 것을 특징으로 하는 으름열매에서 올레아놀릭산을 분리정제하는 방법.
  4. 제 3항에 있어서,
    상기 가수분해된 혼합물을 에틸아세테이트로 800ml로 재추출한 후 증류수에 세척하는 것을 특징으로 하는 으름열매에서 올레아놀릭산을 분리정제하는 방법.
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 세척된 혼합물을 실리카겔(silica gel) 450-580mesh를 사용하여 올레아놀릭산과 트라이터페노익산으로 분리하고 올레아놀릭산을 정제하는 것을 특징으로 하는 으름열매에서 올레아놀릭산을 분리정제하는 방법.
  6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항의 방법에 따라 제조된 올레아놀릭산을 포함하는 것을 특징으로 하는 항산화, 항염증 및 항암 조성물.
  7. 으름열매 추출물을 포함하는 것을 특징으로 하는 항산화, 항염증 및 항암 조성물.
  8. 제 7항에 있어서,
    으름열매 추출물의 NO 생성억제능의 IC50 값은 207.53~704.45 ㎍/㎖ 이고, 그 중 메탄올 추출물의 NO 생성억제능의 IC50 값은 207.53㎍/㎖ 인 것을 특징으로 하는 항산화, 항염증 및 항암 조성물.
  9. 으름열매 추출물에서 분리정제된 올레아놀릭산을 포함하는 것을 특징으로 하는 항산화, 항염증 및 항암 조성물.
  10. 제 9항에 있어서,
    상기 으름열매 추출물로부터 분리정제된 올레아놀릭산 50~500 ㎍/㎖ 농도의 NO 생성억제능은 10.7~61.8%로 농도에 따라 증가하며, 상기 올레아놀릭산의 IC50 값은 318.15 ㎍/㎖ 이고, 시토코롬씨(cytochorome c)로 측정된 올레아놀릭산의 O2 - 생성억제능은 50㎍/㎖과 500 ㎍/㎖ 농도에서 각각 91.35과 51.04%인 것을 특징으로 하는 항산화, 항염증 및 항암 조성물.
  11. 제 9항에 있어서,
    상기 으름열매 추출물로부터 분리정제된 올레아놀릭산 50 ㎍/㎖를 암세포에 처리시, S기의 HeLa 세포는 11.24% 감소 유도, MCF-7 세포는 G0-G1주기에서 대조군 29.75%에 비해 45.65%로 정체, U87 세포는 S기에서 대조군에 비해 0.71%가 억류되는 것을 특징으로 하는 항산화, 항염증 및 항암 조성물.
  12. 제 11항에 있어서,
    상기 암세포에 대한 올레아놀릭산의 IC50 값은 24.79~31.83㎍/㎖ 인 것을 특징으로 하는 항산화, 항염증 및 항암 조성물.
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