KR20060096035A - 인공 세포 조직의 작성 방법 및 그를 위한 기재 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 기재 상에 세포 접착성 양호 영역과 세포 접착성 저해 영역이 패턴화된 세포 접착성 변화 패턴을 갖는 세포 배열용 기재 표면에 세포를 접착시키는 공정, 접착한 세포를 세포 배양용 기재에 패턴화된 상태로 전사하는 공정, 및 전사된 세포를 배양하는 공정을 포함하는 세포 배양 방법에 관한 것이다.
세포 배양 방법

Description

인공 세포 조직의 작성 방법 및 그를 위한 기재{METHOD OF CONSTRUCTING ARTIFICIAL CELL TISSUE AND BASE MATERIAL THEREFOR}
본 발명은 세포를 패턴화된 상태로 배양하는 방법, 그 방법에 의해 작성되는 세포 조직 및 세포가 패턴화된 상태로 접착된 기재(基材)에 관한 것이다.
최근, 인공 대체물이나 세포를 배양하여 조직화시킨 것을 그대로 이식하려는 기술이 주목받고 있다. 그 대표적인 예로서, 인공 피부, 인공 혈관 및 배양 세포 조직 등을 들 수 있다. 합성 고분자를 사용한 인공 피부 등은 거절 반응 등이 생길 가능성이 있어 이식용으로서 바람직하지 못하다. 한편, 배양 세포 조직은 본인의 세포를 배양하여 조직화한 것이므로 거절 반응의 걱정이 없어 이식용으로서 바람직하다. 이러한 배양 세포 조직은 본인으로부터 세포를 채취하고, 이것을 배양함으로써 작성된다.
많은 동물 세포는 무엇인가에 접착하여 생육하는 접착 의존성을 갖고 있고, 생체 외의 부유 상태로는 장시간 생존할 수 없기 때문에, 상기와 같은 세포 조직을 작성하기 위한 세포 배양에 있어서는, 예를 들어 표면 처리에 의해 세포 접착성을 높인 개질 폴리스티렌 등의 고분자 재료나, 또는 콜라겐이나 피브로넥틴 등의 세포 접착성 단백질을 유리나 고분자 재료에 균일하게 도포한 배양 접시가 담체로서 사 용되어 왔다. 이러한 담체에 평면상으로 접착한 세포는 배양성은 양호하지만, 통상 조직화하기 어렵기 때문에, 세포 본래의 기능이 얻어지지 않는다. 예를 들어 조직화되어 있지 않은 배양 간세포의 알부민 생성능은 조직화 간세포 (간 스페로이드) 의 수분 (數分) 의 일로 저하된다는 연구 보고가 있다.
이에 대하여, 세포의 조직화를 촉진하기 위해, 배양 세포를 기재 상의 미소한 부분에만 접착시키고, 배열시키는 기술이 보고되어 있다. 배양 세포를 배열시키는 방법으로는 세포에 대하여 접착의 용이성이 다른 표면이 패턴을 이루고 있는 기재를 사용하고, 이 표면에서 세포를 배양하고, 세포가 접착하도록 가공한 표면에만 세포를 접착시킴으로써 세포를 배열시키는 방법이 사용되고 있다.
예를 들어, 일본 공개특허공보 평2-245181호에는 회로상으로 신경 세포를 증식시키는 등의 목적으로, 정전하 패턴을 형성시킨 전하 유지 매체를 세포 배양에 응용하고 있다. 또한, 일본 공개특허공보 평3-7576호에서는 세포 비접착성 또는 세포 접착성의 광감수성 친수성 고분자를 포토리소그래피법에 의해 패터닝한 표면 상으로의 배양 세포의 배열을 시도하고 있다.
또한, 일본 공개특허공보 평5-176753호에서는 세포의 접착률이나 형태에 영향을 주는 콜라겐 등의 물질이 패터닝된 세포 배양용 기재와, 이 기재를 포토리소그래피법에 의해 작성하는 방법에 대하여 개시하고 있다. 이러한 기재 상에서 세포를 배양함으로써, 콜라겐 등이 패터닝된 표면에 보다 많은 세포를 접착시켜 세포의 패터닝을 실현하고 있다.
그러나, 이러한 세포 배양 부위의 패터닝은 용도에 따라서는 고정세(高精細) 한 것이 요구되는 경우가 있다. 상기 기술한 감광성 재료를 사용한 포토리소그래피법 등에 의한 패터닝을 실시하는 경우에는 고정세한 패턴을 얻을 수는 있지만, 세포 접착성 재료가 감광성을 가질 필요가 있고, 예를 들어 생체 고분자 등에 이러한 감광성을 부여하기 위한 화학적 수식을 실시하는 것이 곤란한 경우가 많고, 세포 접착성 재료의 선택성의 폭을 매우 좁게 하는 등의 문제가 있었다. 포토레지스트를 사용한 포토리소그래피법에서는 현상액 등을 사용할 필요성이 있고, 이들이 세포 배양시 악영향을 미치는 경우가 있었다. 또한, 세포의 배양능이 높은 생체 재료 등은 일반적으로 플라즈마에 의해 분해되기 어려우므로, 플라즈마 에칭법을 사용한 패터닝도 공업 생산성이 낮아 실용적이지 않다.
또한, 상기와 같이 패터닝하여 배양된 세포는 트립신과 같은 단백질 분해 효소나 화학 약품으로 처리함으로써 회수되므로, 처리 공정이 번잡해지고, 콘타미네이션의 가능성이 높아지는 것, 세포가 변성 또는 손상되어 세포 본래의 기능이 손상될 가능성이 있는 등의 문제가 있었다.
그래서, 일본 공개특허공보 2003-38170호에서는 기재 상에 온도 응답성 폴리머에 의한 패턴을 형성한 세포 배양 지지체를 작성하고, 그 세포 배양 지지체 상에서 세포를 배양하고, 이것을 고분자막에 밀착시켜 온도를 변화시킴으로써 세포를 손상시키지 않고 고분자막과 함께 세포를 박리하여 세포 시트를 제조하는 방법을 개시하고 있다. 그러나, 여기에서 개시되는 방법으로는 미세한 패턴을 효율적으로 형성하는 것은 곤란하고, 또한 세포를 지지체로부터 박리할 때 온도를 변화시킬 필요가 있어 공정이 번잡하다. 또한, 장기 등의 생체 재료 상에 직접 패터 닝하는 것도 곤란하다.
한편, 특정한 세포 배양법에 의해 인공 장기를 구축하는 방법도 알려져 있다 (일본 공개특허공보 2003-24351호). 이것은 관상(管狀)의 세포 배양 기재에 혈관 내피 세포 등을 접착함으로써 인공 혈관을 형성시키는 것이다. 그러나, 이 방법으로 다수의 인공 혈관을 작성하기 위해서는 미세 가공된 세포 배양 기재를 다수 준비할 필요가 있고, 조직의 형성에 시간을 요하는 점에서 그 공업 생산성은 낮다.
발명의 개시
본 발명은 상기와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하는 것을 의도하여 이루어진 것이다. 즉, 본 발명의 과제는 세포에 손상을 주지 않고 간편한 방법에 의해 세포를 미세한 패턴상으로 배열하여 배양하는 것, 이에 의해 배양 세포의 조직화를 촉진하는 것이다.
본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해 예의 연구한 결과, 세포 접착성을 갖는 영역이 패턴화된 세포 배열용 기재에 대하여 세포를 뿌리고, 세포를 패턴상으로 접착시킴으로써 세포를 배열하고, 그 배열화된 세포를 세포 배양용 기재에 전사함으로써 세포를 배열 상태로 배양할 수 있는 것을 발견하고, 본 발명을 완성시키기에 이르렀다.
본 발명은 기재 상에 세포 접착성 양호 영역과 세포 접착성 저해 영역이 패턴화된 세포 접착성 변화 패턴을 갖는 세포 배열용 기재 표면에 세포를 접착시키는 공정, 접착한 세포를 세포 배양용 기재에 패턴화된 상태로 전사하는 공정, 및 전사된 세포를 배양하는 공정을 포함하는 세포 배양 방법에 관한 것이다.
본 발명의 세포 배양 방법의 하나의 양태에 있어서, 세포 접착성 변화 패턴에 있어서의 세포 접착성 양호 영역의 수접촉각은 10 ∼ 40°이다.
본 발명의 세포 배양 방법의 하나의 양태에 있어서, 세포 접착성 변화 패턴은 에너지 조사에 따른 광촉매의 작용에 의해 세포의 접착성이 변화하는 세포 접착성 변화 재료를 함유하는 세포 접착성 변화층에 의해 형성된다.
본 발명의 세포 배양 방법의 하나의 양태에 있어서, 세포 접착성 변화층은 광촉매 및 세포 접착성 변화 재료를 함유하는 광촉매 함유 세포 접착성 변화층이다.
본 발명의 세포 배양 방법의 하나의 양태에 있어서, 세포 접착성 변화층은 광촉매를 함유하는 광촉매 처리층과, 그 광촉매 처리층 상에 형성된 세포 접착성 변화 재료를 함유하는 세포 접착성 변화 재료층을 갖는다.
본 발명의 세포 배양 방법의 하나의 양태에 있어서, 세포 접착성 변화 패턴은 세포 접착성 변화 재료를 함유하는 세포 접착성 변화층과 광촉매를 함유하는 광촉매 함유층을 대향하도록 배치한 후, 에너지 조사함으로써 형성된다.
본 발명의 세포 배양 방법의 하나의 양태에 있어서, 세포 배양용 기재는 생체 재료이다. 본 발명의 세포 배양 방법의 하나의 양태에 있어서, 세포 접착성 변화 패턴은 세포 접착성 저해 영역에 라인상의 세포 접착성 양호 영역이 배치된 패턴이다. 본 발명의 세포 배양 방법의 하나의 양태에 있어서, 세포 접착성 변화 패턴은 라인상의 세포 접착성 양호 영역과 세포 접착성 저해 영역의 스페이스가 교대로 배치된 패턴이고, 세포 접착성 양호 영역의 라인폭이 20 ∼ 200㎛ 이고, 라인간의 스페이스폭이 300 ∼ 1000㎛ 이고, 세포가 혈관 내피 세포이다. 본 발명은 또한 상기 세포 배양 방법에 의해 형성되는 세포 조직에 관한 것이다. 본 발명은 또한 기재 상에 세포 접착성 양호 영역과 세포 접착성 저해 영역이 패턴화된 세포 접착성 변화 패턴을 갖는 세포 배열용 기재에 있어서, 그 세포 접착성 변화 패턴의 세포 접착성 양호 영역에 세포가 접착된 세포 접착 기재에 관한 것이다.
본 발명의 세포 접착 기재의 하나의 양태에 있어서, 세포 접착성 변화 패턴에 있어서의 세포 접착성 양호 영역의 수접촉각은 10 ∼ 40°이다.
본 발명의 세포 접착 기재의 하나의 양태에 있어서, 세포 접착성 변화 패턴은 에너지 조사에 따른 광촉매의 작용에 의해 세포의 접착성이 변화하는 세포 접착성 변화 재료를 함유하는 세포 접착성 변화층에 의해 형성된다.
본 발명의 세포 접착 기재의 하나의 양태에 있어서, 세포 접착성 변화층은 광촉매 및 세포 접착성 변화 재료를 함유하는 광촉매 함유 세포 접착성 변화층이다.
본 발명의 세포 접착 기재의 하나의 양태에 있어서, 세포 접착성 변화층은 광촉매를 함유하는 광촉매 처리층과, 그 광촉매 처리층 상에 형성된 세포 접착성 변화 재료를 함유하는 세포 접착성 변화 재료층을 갖는다.
본 발명의 세포 접착 기재의 하나의 양태에 있어서, 상기 세포 접착성 변화 패턴은 세포 접착성 변화 재료를 함유하는 세포 접착성 변화층과 광촉매를 함유하는 광촉매 함유층을 대향하도록 배치한 후, 에너지 조사함으로써 형성된다.
본 발명은 또한 상기 세포 접착 기재 상에 접착된 피검체 유래의 세포를 피검체의 생체 조직에 패턴화된 상태로 전사하여 세포를 증식시킴으로써, 피검체의 조직을 재생하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 의해, 세포에 손상을 주지 않고 간편한 방법에 의해 세포를 미세한 패턴상으로 배열하여 배양할 수 있다.
본 발명의 세포 배양 방법은 세포 배열용 기재 표면에 세포를 접착시키고, 접착한 세포를 세포 배양용 기재에 패턴화된 상태로 전사하고 전사된 세포를 배양하는 것을 특징으로 한다. 이하, 세포 배열용 기재, 그 제조 방법, 세포 배열용 기재의 세포 접착성 양호 영역에 세포가 접착한 세포 접착 기재, 및 세포 배양용 기재로의 전사 및 전사후의 배양에 대하여 각각 설명한다.
I. 세포 배열용 기재
먼저, 본 발명의 세포 배열용 기재에 대하여 상세하게 설명한다. 본 발명의 세포 배열용 기재는 기재 상에 세포 접착성 양호 영역과 세포 접착성 저해 영역이 패턴화된 세포 접착성 변화 패턴을 갖는 것을 특징으로 하는 것이다.
세포 접착성이란, 세포를 접착하는 강도, 즉 세포의 접착 용이성을 의미한다. 세포 접착성 양호 영역이란, 세포 접착성이 양호한 영역을 의미하고, 세포 접착성 저해 영역이란, 세포의 접착성이 나쁜 영역을 의미한다. 따라서, 세포 접착성 변화 패턴을 갖는 세포 배열용 기재 상에 세포를 뿌리면, 세포 접착성 양호 영역에는 세포가 접착하지만, 세포 접착성 저해 영역에는 세포가 접착하지 않기 때문에, 세포 배열용 기재 표면에는 세포가 패턴상으로 배열되게 된다.
세포 접착성은 접착하고자 하는 세포에 따라 다른 경우도 있으므로, 세포 접착성이 양호하다는 것은 어떤 종류의 세포에 대한 세포 접착성이 양호한 것을 의미한다. 따라서, 세포 배열용 기재 상에는 복수종의 세포에 대한 복수의 세포 접착성 양호 영역이 존재하는 경우, 즉 세포 접착성이 다른 세포 접착성 양호 영역이 2 수준 이상 존재하는 경우도 있다.
세포 접착성 변화 패턴으로는 에너지의 조사에 따라 세포의 접착성이 변화하는 세포 접착성 변화 재료를 포함하는 세포 접착성 변화층을 기재 상에 형성하고, 특정한 영역에 에너지 조사함으로써 세포 접착성을 변화시켜 세포 접착성이 다른 영역을 패턴상으로 형성시킨 것을 들 수 있다. 세포의 접착성이 변화하는 재료에는 에너지의 조사에 따라 세포 접착성을 획득 또는 증가시키는 재료 및 세포 접착성이 감소 또는 소실되는 재료의 쌍방이 포함된다.
본 발명의 세포 배열용 기재에 사용되는 기재로는 그 표면에 세포 접착성 변화 패턴을 형성하는 것이 가능한 재료로 형성된 것이면 특별히 한정되지 않는다. 구체적으로는 금속, 유리 및 규소 등의 무기 재료, 플라스틱 (예를 들어, 폴리에스테르 수지, 폴리에틸렌 수지, 폴리프로필렌 수지, ABS 수지, 나일론, 아크릴 수지, 불소 수지, 폴리카보네이트 수지, 폴리우레탄 수지, 메틸펜텐 수지, 페놀 수지, 멜라민 수지, 에폭시 수지, 염화 비닐 수지) 으로 대표되는 유기 재료를 들 수 있다. 그 형상도 한정되지 않고, 예를 들어 평판, 평막, 필름, 다공질막 등의 형상을 들 수 있다. 필름을 사용하는 경우, 그 두께는 특별히 제한되지 않지만, 통상 0.1 ∼ 1000㎛, 바람직하게는 1 ∼ 500㎛, 보다 바람직하게는 20 ∼ 200㎛ 이다.
세포 접착성 변화 재료, 세포 접착성 변화층에 대해서는 광촉매를 사용하는 실시 양태에서 설명한다.
또한, 세포 접착성 변화 패턴에는 세포 접착성을 갖지 않는 세포 비접착 재료를 포함하는 세포 비접착층과 그 위에 형성된 세포 접착성을 갖는 세포 접착 재료를 포함하는 세포 접착층으로 형성되고, 에너지의 조사에 따라 세포 접착층이 분해되어 소실됨으로써 세포 비접착층이 노출되어 세포 접착성의 다른 영역이 형성되는 경우도 포함된다. 마찬가지로, 세포 접착층과 그 위에 형성되는 세포 비접착층으로 형성되고, 에너지 조사에 따라 세포 비접착층이 분해되어 소실됨으로써 세포 접착층이 노출되어 세포 접착성의 다른 영역이 형성되는 경우도 포함된다.
세포 접착 재료로는 각종 타입의 콜라겐, 피브로넥틴, 라미닌, 비트로넥틴, 카드헤린 등의 세포외 기질, RGD 펩티드, 그 외에 세포 접착성 부여를 위해 코로나 처리, 이온 빔 조사 처리, 전자선 조사 처리 등의 수법에 의해 카르보닐기나 카르복실기를 도입한 폴리올레핀 수지를 들 수 있고, 세포 비접착 재료로는 폴리테트라플루오로에틸렌 (PTFE) 등의 불소계 재료, 폴리이미드, 인지질 등을 들 수 있다. 또한, 잉크젯법 등의 방법을 사용함으로써, 세포 비접착층 상에 세포 접착 재료를 패턴상으로 부착 형성하는 경우, 및 세포 접착층 상에 세포 비접착 재료를 패턴상으로 부착 형성하는 경우도 포함된다. 또는 부가적으로 기재 상에 에너지의 조사에 따라 세포 접착 재료에 대한 친화성이 변화하는 친화성 변화 재료를 함유하는 층을 형성하고, 에너지를 조사함으로써 세포 접착 재료에 대한 친화성을 갖는 영역과 갖지 않는 영역으로 이루어지는 패턴을 형성하고, 여기에 세포 접착 재료를 포함하는 용액을 도입한 후 세정함으로써, 세포 접착 재료가 존재하는 영역 (세포 접착성 양호 영역) 과 세포 접착 재료가 존재하지 않는 영역 (세포 접착성 저해 영역) 을 갖는 세포 접착성 변화 패턴을 형성할 수도 있다. 이러한 양태에 있어서는, 기재 상에서 직접 패턴을 형성할 수 없는 세포 접착 재료에 의해 패턴을 형성할 수 있다. 예를 들어, 도 8 에 나타내는 바와 같이, 유리 등의 친수성을 갖는 기재 (1) 에 발수성 재료를 포함하는 층을 갖는 영역 (20) 과 갖지 않는 영역으로 이루어지는 패턴을 형성한다. 여기에 발수성 재료에 흡착하기 어려운 친수성 세포 접착 재료 (21) 를 도입하고, 그 후 세정한다. 이에 의해 친수성 세포 접착 재료가 존재하는 영역 (세포 접착성 양호 영역) 과 발수성 재료가 존재하는 영역 (세포 접착성 저해 영역) 이 패턴상으로 형성된다. 이 경우의 친수성 세포 접착 재료로는 콜라겐 등의 세포외 기질을 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서는, 세포 배열용 기재 상에 패턴상으로 배열된 세포를 세포 배양용 기재에 전사하므로, 상기 세포 접착성 양호 영역의 세포 접착력은 적당한 강도인 것이 바람직하다. 적당한 접착 강도로 함으로써, 세포를 특정한 영역에만 접착하여 세포 패턴을 형성할 수 있는데, 이것을 세포 배양용 기재에 용이하게 전사하는 것이 가능해지기 때문이다. 따라서, 세포 배열용 기재에서의 세포 접착성 양호 영역의 세포 접착력은 세포 접착성 저해 영역의 세포 접착력보다 강한데, 세포 배양용 기재 표면의 세포 접착력보다 약한 것이 바람직하다.
이러한 세포 접착력은 표면의 수접촉각에 의해 평가할 수 있다. 본 발명에 있어서의 세포 접착성 변화 패턴의 세포 접착성 양호 영역에서의 수접촉각은 10 ∼ 40°인 것이 바람직하다. 수접촉각을 이러한 범위로 함으로써, 세포를 세포 배열용 기재에 접착시키고, 추가로 세포 배양용 기재에 전사하는 경우, 세포를 세포 배열용 기재에 단층상으로 접착할 수 있음과 함께, 세포 배열용 기재로의 접착이 약한 점에서 세포 배양용 기재에도 용이하게 전사할 수 있다. 접촉각이란, 정지 액체의 자유 표면이 개체벽에 접하는 장소에서 액면(液面)과 고체면이 이루는 각 (액의 내부에 있는 각을 취함) 을 의미한다.
상기 수접촉각이란, 통상 대기압 하에서 재료 표면에 시린지 등의 기구를 사용하여 미소한 물방울을 적하하고, 물방울 단부의 기액 계면과 고체면이 이루는 각도를 확대경 등으로 관찰하는 정지 접촉각 측정법으로 측정한 값을 의미한다.
상기와 같은 세포 접착성 양호 영역과 세포 접착성 저해 영역이 패턴상으로 배치된 세포 접착성 변화 패턴을 형성하는 수단으로는 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어 그라비아 인쇄법, 스크린 인쇄법, 오프셋 인쇄법, 플렉소 인쇄법 및 컨택트 프린팅법 등의 각종 인쇄법에 의한 방법, 각종 리소그래피법을 사용하는 방법, 및 잉크젯법에 의한 방법, 그 외에 미세한 홈을 조각하는 등 입체 정형의 수법 등을 들 수 있다. 본 발명에 있어서는, 광촉매를 사용한 리소그래피법, 즉 에너지 조사에 따른 광촉매의 작용에 의해 세포의 접착성이 변화하는 세포 접착성 변화 재료 및 광촉매를 사용하고, 필요로 하는 패턴을 따라 에너지를 조사함으로써 세포 접착성 변화 패턴을 형성하는 방법이 바람직하다. 이러한 양태에 있어서는, 고정세한 패턴을 세포에 대하여 악영향을 미치는 처리액을 사용하지 않고, 간편한 공정에 의해 형성할 수 있다. 또한, 세포 접착성 변화 재료의 변성의 필요성이 없는 점에서, 재료 선택의 폭을 확대하는 것이 가능하고, 후술하는 특이적인 접착성을 발현하는 생물학적 세포 접착성 변화 재료도 문제 없이 사용할 수 있다.
형성시키는 패턴은 2 차원의 패턴이면 특별히 제한되지 않고, 세포 배열용 기재 상에 배열하여 전사후 배양하는 세포의 종류, 형성시키는 조직 등에 따라 선택할 수 있다. 예를 들어, 라인상, 트리상 (나무상), 그물코상, 격자상, 원형, 사각형의 패턴, 원형 및 사각형 등의 도형의 내부가 모두 세포 접착성 양호 영역 또는 세포 접착성 저해 영역으로 되어 있는 패턴 등을 형성할 수 있다. 혈관 내피 세포 또는 신경 세포를 배양하여 조직을 형성하는 경우에는 라인상, 트리상 (나무상), 그물코상 또는 격자상의 패턴으로 세포가 접착하는 패턴을 형성하는 것이 바람직하다. 이것을 세포 배양용 기재에 전사하여 배양하면, 혈관 내피 세포의 경우에는 라인상, 트리상 (나무상), 그물코상 또는 격자상으로 배열됨으로써 조직화가 촉진되어 혈관의 형성이 촉진된다. 라인상, 트리상 (나무상), 그물코상 또는 격자상의 패턴을 형성하는 경우, 패턴에 있어서의 선폭은 통상 20 ∼ 200㎛, 바람직하게는 50 ∼ 100㎛ 이다. 특히, 혈관 내피 세포를 라인상으로 배치하여 배양함으로써 모세 혈관을 형성하는 경우에는 라인상의 세포 접착성 양호 영역과 세포 접착성 저해 영역의 스페이스가 교대로 배치된 세포 접착성 변화 패턴을 형성하고, 혈관 내피 세포를 라인상으로 접착시키는 것이 바람직하다. 이러한 양태에 있어서는, 세포가 1 ∼ 10 개, 바람직하게는 1 ∼ 5 개 수용할 정도의 라인폭으로 세포가 접착되는 패턴을 형성하는 것이 바람직하다. 구체적으로는, 세포 접착성 양호 영역의 라인폭은 통상 20 ∼ 200㎛, 바람직하게는 50 ∼ 80㎛ 이고, 라인과 라인 사이에 해당하는 세포 접착성 저해 영역의 스페이스폭은 통상 300 ∼ 1000㎛, 바람직하게는 400 ∼ 800㎛ 이다. 라인폭을 상기 수치 범위로 함으로써, 혈관 내피 세포가 효율적으로 관(管)조직화될 수 있다. 이러한 세포 접착성 변화 패턴을 형성함으로써, 라인상으로 접착되어 전사된 혈관 내피 세포는 조직화하여 라인상의 모세 혈관을 효율적으로 형성한다. 복수의 라인이 교차하지 않고 늘어서는 세포 패턴을 형성하고자 하는 경우에는, 세포가 접착한 라인과 라인 사이의 스페이스폭을 상기와 같이 일정한 값 이상으로 함으로써, 세포가 조직화될 때 라인과 라인 사이에서 세포로부터 의족(擬足)이 신장되어 라인에 변형이 생기는 것을 방지할 수 있다.
또한, 혈관 내피 세포를 격자상으로 배치하여 배양함으로써 모세 혈관을 형성하는 경우에는 상기와 같이 라인상의 세포 접착성 양호 영역과 세포 접착성 저해 영역의 스페이스가 교대로 배치됨과 함께, 그 라인과 교차하는 라인상의 세포 접착성 양호 영역이 추가로 배치된 세포 접착성 변화 패턴을 형성하고, 혈관 내피 세포를 격자상으로 접착시키는 것이 바람직하다. 이 경우, 서로 교차하는 라인의 라인폭은 상기와 동일하다. 또한, 라인간의 스페이스폭은 통상 0.03 ∼ 5㎝, 바람직하게는 0.04 ∼ 3㎝ 이다.
상기 광촉매를 사용한 리소그래피법에 의해 작성되는 세포 배열용 기재로서, 예를 들어 이하의 3 개의 실시 양태를 들 수 있다. 이들에 대하여 각각 설명한다.
A. 제 1 실시 양태
본 발명의 세포 배열용 기재의 제 1 실시 양태는 기재 상에 형성되고, 에너지의 조사에 따른 광촉매의 작용에 의해 세포의 접착성이 변화하는 세포 접착성 변화 재료를 갖는 세포 접착성 변화층을 기판 상에 가지며, 상기 세포 접착성 변화층에는 세포의 접착성이 변화한 세포 접착성 변화 패턴이 형성되어 있는 세포 배열용 기재로서, 상기 세포 접착성 변화층이 광촉매와 상기 세포 접착성 변화 재료를 갖는 광촉매 함유 세포 접착성 변화층인 점에 특징을 갖는 것이다.
본 실시 양태에 있어서는, 이와 같이 세포 접착성 변화층이 광촉매와 상기 세포 접착성 변화 재료를 갖는 광촉매 함유 세포 접착성 변화층이기 때문에, 에너지가 조사되었을 때, 광촉매 함유 세포 접착성 변화층내의 광촉매의 작용에 의해 세포 접착성 변화 재료의 세포 접착성이 변화하고, 에너지가 조사된 부분과 조사되지 않은 부분에서 세포와의 접착성이 다른 세포 접착성 변화 패턴을 형성할 수 있다.
이러한 본 실시 양태의 세포 배열용 기재를 사용되는 부재로 나눠 각각 설명한다.
1. 광촉매 함유 세포 접착성 변화층
본 실시 양태는 기재 상에 광촉매 함유 세포 접착성 변화층이 형성되어 있는 점에 특징을 갖는다. 이 광촉매 함유 세포 접착성 변화층은 적어도 광촉매와 세포 접착성 변화 재료를 갖는 것이다.
(1) 세포 접착성 변화 재료
본 실시 양태에 사용되는 세포 접착성 변화 재료는 에너지의 조사에 따른 광촉매의 작용에 의해 세포의 접착성이 변화하는 재료이면 특별히 한정되지 않는다. 세포의 접착성이 변화한다는 것은 에너지의 조사에 따른 광촉매의 작용에 의해 세포 접착성을 획득 또는 증가시키는 재료 및 세포 접착성이 감소 또는 소실되는 재료의 쌍방이 포함된다.
이러한 세포 접착성 변화 재료에는 세포와의 접착성을 제어하는 양태에 의해, 물리 화학적 특성에 의해 세포와 접착하는 물리 화학적 세포 접착성 변화 재료와 생물학적 특성에 의해 세포와 접착하는 생물학적 세포 접착성 변화 재료의 주로 2 개의 양태가 있다.
a. 물리 화학적 세포 접착성 변화 재료
세포를 그 표면에 접착시키기 위한 물리 화학적인 인자로는 표면 자유 에너지에 관한 인자와, 소수성 상호 작용 등에 의한 인자 등을 들 수 있다.
이와 같은 인자에 의해 물리 화학적 세포 접착성을 갖는 물리 화학적 세포 접착 재료로는 주골격이 광촉매의 작용에 의해 분해되지 않는 높은 결합 에너지를 갖는 것으로서, 광촉매의 작용에 의해 분해되는 유기 치환기를 갖는 것이 바람직하고, 예를 들어 (1) 졸겔 반응 등에 의해 클로로 또는 알콕시실란 등을 가수 분해, 중축합하여 큰 강도를 발휘하는 오르가노폴리실록산, (2) 반응성 실리콘을 가교한 오르가노폴리실록산 등을 들 수 있다.
상기 (1) 의 경우, 일반식 :
YbSiX(4-n)
(여기에서, Y 는 알킬기, 플루오로알킬기, 비닐기, 아미노기, 페닐기 또는 에폭시기를 나타내고, X 는 알콕실기, 아세틸기 또는 할로겐을 나타낸다. n 은 0 ∼ 3 까지의 정수이다) 로 나타나는 규소 화합물의 1 종 또는 2 종 이상의 가수 분해 축합물 또는 공가수 분해 축합물인 오르가노폴리실록산인 것이 바람직하다. 또, 여기에서 Y 로 나타나는 기의 탄소수는 1 ∼ 20 의 범위내인 것이 바람직하고, 또한 X 로 나타나는 알콕시기는 메톡시기, 에톡시기, 프로폭시기, 부톡시기인 것이 바람직하다.
또, 유기기로서 특히 플루오로알킬기를 함유하는 폴리실록산을 바람직하게 사용할 수 있고, 구체적으로는 하기 플루오로알킬실란의 1 종 또는 2 종 이상의 가수 분해 축합물, 공가수 분해 축합물을 들 수 있고, 일반적으로 불소계 실란 커플링제로서 알려진 것을 사용할 수 있다.
Figure 112006025954230-PCT00001
Figure 112006025954230-PCT00002
상기와 같은 플루오로알킬기를 함유하는 폴리실록산을 물리 화학적 세포 접착 재료로서 사용함으로써, 광촉매 함유 세포 접착성 변화층의 에너지 미조사부에서는, 표면에 불소를 갖는 부분이 존재하기 때문에 세포 접착성을 갖지 않는 면이 되지만, 에너지 조사된 부분에 있어서는 불소 등이 제거되어 표면에 OH 기 등을 갖는 부분이 존재하기 때문에 세포 접착성을 갖는 면이 된다. 따라서, 에너지 조사부와 에너지 미조사부에 있어서, 세포의 접착성이 다른 영역을 패턴상으로 형성할 수 있다.
또한, 상기 (2) 의 반응성 실리콘으로는 하기 일반식으로 표시되는 골격을 갖는 화합물을 들 수 있다.
Figure 112006025954230-PCT00003
단, n 은 2 이상의 정수이고, R1, R2 는 각각 탄소수 1 ∼ 10 의 치환 또는 비치환 알킬, 알케닐, 아릴기이고, 치환기로는 할로겐, 시아노 등을 들 수 있다. R1, R2 의 구체예로는 메틸, 에틸, 프로필, 비닐, 페닐, 할로겐화 페닐, 시아노메틸, 시아노에틸, 시아노프로필 등을 들 수 있다. 비닐, 페닐, 할로겐화 페닐은 몰비로 전체의 40% 이하인 것이 바람직하다. 또한, R1, R2 가 메틸기인 것이 표면 에너지가 가장 작아지므로 바람직하고, 몰비로 메틸기가 60% 이상인 것이 바람직하다. 또한, 사슬 말단 또는 측쇄에는 분자 사슬 중에 적어도 1 개 이상의 수산기 등의 반응성기를 갖는다.
또한, 상기 오르가노폴리실록산과 함께, 디메틸폴리실록산과 같은 가교 반응을 하지 않는 안정적인 오르가노규소 화합물을 별도 혼합해도 된다.
한편, 분해 물질 타입의 물리 화학적 세포 접착 재료로는 광촉매의 작용에 의해 분해하고, 또한 분해됨으로써 광촉매 함유 극성 변화층 표면의 극성을 변화시키는 기능을 갖는 계면 활성제를 들 수 있다. 구체적으로는 닛코 케미컬즈 (주) 제조의 NIKKOL BL, BC, BO, BB 의 각 시리즈 등의 탄화수소계, 듀퐁사 제조의 ZONYL FSN, FSO, 아사히가라스 (주) 제조의 사프론 S-141, 145, 다이닛폰 잉크 화학 공업 (주) 제조의 메가팍 F-141, 144, 네오스 (주) 제조의 프타젠트 F-200, F251, 다이킹 공업 (주) 제조의 유니다인 DS-401, 402, 쓰리엠 (주) 제조의 플로라드 FC-170, 176 등의 불소계 또는 실리콘계 비이온 계면 활성제를 들 수 있고, 또한 양이온계 계면 활성제, 음이온계 계면 활성제, 양성 계면 활성제를 사용할 수도 있다.
또, 이와 같이 물리 화학적 세포 접착 재료를 분해 물질 타입으로서 사용한 경우에는 통상 별도의 바인더 성분을 사용하는 것이 바람직하다. 이 때 사용되는 바인더 성분으로는 주골격이 상기 광촉매의 작용에 의해 분해되지 않는 높은 결합 에너지를 갖는 것이면 특별히 한정되지 않는다. 구체적으로는 유기 치환기를 갖지 않거나 또는 다소 유기 치환기를 갖는 폴리실록산을 들 수 있고, 이들은 테트라메톡시실란, 테트라에톡시실란 등을 가수 분해, 중축합함으로써 얻을 수 있다.
또, 본 실시 양태에 있어서는, 이러한 바인더 타입의 물리 화학적 세포 접착 재료와 분해 물질 타입의 물리 화학적 세포 접착 재료를 병용하도록 해도 된다.
또한, 정전적 상호 작용의 제어에 의해 세포와의 접착성을 변화시키는 물리 화학적 세포 접착성 변화 재료도 있다. 이러한 재료의 경우, 에너지 조사에 따른 광촉매의 작용에 의해 재료가 함유하는 정전하를 갖는 관능기가 분해된 결과, 표면에 존재하는 정전하량이 변화하고, 이에 의해 세포와의 접착성을 변화시켜 세포 접착성 변화 패턴을 형성하는 것이다. 예를 들어, 이러한 재료로서 폴리 L 리신 등을 들 수 있다.
b. 생물학적 세포 접착성 변화 재료
세포를 그 표면에 접착시키기 위한 생물학적인 인자로는 많은 세포종에 대하여 피접착성을 가질 수 있는 재료, 특정한 세포종에만 피접착성을 갖는 재료가 있다. 전자는 예를 들어 콜라겐 I 형이고, 후자는 예를 들어 간 실질 세포를 선택적으로 접착하는 폴리(N-p-비닐벤질-[O-β-D-갈락토피라노실-(1→4)-D-글루콘아미드]) (이하, PVLA) 등이 있다. PVLA 의 경우, 간 실질 세포가 특이 인식을 하는 갈락토오스기를 구조 중에 가짐으로써, 재료-세포간의 선택적 또한 특이적인 접착이 행해지는 것으로 추측된다.
이러한 재료와 광촉매를 혼합하고, 광촉매 함유 세포 접착성 변화층으로서 사용하는 경우에는 이하의 사용 형태를 생각할 수 있다. 콜라겐 I 형을 효소 처리에 의해 가용화한 가용화 콜라겐 I 과 미리 소성 처리, 분쇄 처리한 TiO2 입자 등의 광촉매를 혼합하고, 광촉매 함유 세포 접착성 변화층용 재료로 한다. 다음으로, 기재 상에 광촉매 함유 세포 접착성 변화층용 재료를 도포하여 광촉매 함유 세포 접착성 변화층을 형성한다. 이 광촉매 함유 세포 접착성 변화층에 소량의 에너지를 조사한 경우에는 콜라겐의 측쇄에 있는 세포 접착성 펩티드 구조의 일부가 파괴되어 세포 접착성을 감소시킬 수 있다. 또한, 에너지 조사량을 늘림으로써 세포 접착성 펩티드 구조를 서서히 잃게 할 수 있어 세포 접착성을 더욱 감소시킬 수 있다.
또한, 과대한 에너지를 조사함으로써 콜라겐의 주쇄 구조를 파괴할 수 있고, 그 세포 접착성을 완전히 잃게 할 수 있다.
(2) 광촉매
본 실시 양태에 사용되는 광촉매로는 광반도체로서 알려진 예를 들어 이산화 티탄 (TiO2), 산화 아연 (ZnO), 산화 주석 (SnO2), 티탄산 스트론튬 (SrTiO3), 산화 텅스텐 (WO3), 산화 비스무트 (Bi2O3) 및 산화 철 (Fe2O3) 을 들 수 있고, 이들로부터 선택하여 1 종 또는 2 종 이상을 혼합하여 사용할 수 있다.
본 실시 양태에 있어서는, 특히 이산화 티탄이 밴드갭 에너지가 높고, 화학적으로 안정적이고 독성도 없고, 입수도 용이하므로 바람직하게 사용된다. 이산화 티탄에는 아나타아제형과 루틸형이 있고 본 양태에서는 어느것이나 사용할 수 있지만, 아나타아제형 이산화 티탄이 바람직하다. 아나타아제형 이산화 티탄은 여기 파장이 380㎚ 이하에 있다.
이러한 아나타아제형 이산화 티탄으로는, 예를 들어 염산 해교형 아나타아제형 티타니아졸 (이시하라 산업 (주) 제조의 STS-02 (평균 입경 7㎚), 이시하라 산업 (주) 제조의 ST-K01), 질산 해교형의 아나타아제형 티타니아졸 (닛산 화학 (주) 제조의 TA-15 (평균 입경 12㎚)) 등을 들 수 있다.
광촉매의 입경은 작을수록 광촉매 반응이 효과적으로 일어나기 때문에 바람직하고, 평균 입경이 50㎚ 이하인 것이 바람직하고, 20㎚ 이하의 광촉매를 사용하는 것이 특히 바람직하다.
본 실시 양태에 사용되는 광촉매 함유 세포 접착성 변화층 중의 광촉매의 함유량은 5 ∼ 60 중량%, 바람직하게는 20 ∼ 40 중량% 의 범위로 설정할 수 있다.
2. 기재
본 발명의 세포 배열용 기재에 사용되는 기재로는 표면에 광촉매 함유 세포 접착성 변화층을 형성하는 것이 가능한 재료로 형성된 것이면 특별히 한정되지 않고, 노광 처리에 의한 표면 처리가 가능하면 그 형태는 상관 없다. 구체적으로는 금속, 유리 및 규소 등의 무기 재료, 플라스틱으로 대표되는 유기 재료를 들 수 있다. 그 형상도 한정되지 않고, 예를 들어 평판, 평막, 필름, 다공질막 등의 형상을 들 수 있다.
3. 세포 접착성 변화 패턴
본 실시 양태에 있어서는, 상기 기재 상에 상기 기술한 광촉매 함유 세포 접착성 변화층을 형성하고, 추가로 에너지를 패턴상으로 조사함으로써, 세포와의 접착성이 변화한 패턴인 세포 접착성 변화 패턴이 형성되어 있다.
이러한 세포 접착성 변화 패턴은 통상은 세포 접착성이 양호한 세포 접착성 양호 영역과 세포 접착성이 나쁜 세포 접착성 저해 영역으로 형성된다. 그리고, 이 세포 접착성 양호 영역에 세포가 접착됨으로써, 고정세한 패턴상으로 세포를 접착시킬 수 있다. 이러한 세포 접착성 양호 영역과 세포 접착성 저해 영역은 사용하는 세포 접착성 변화 재료의 종류에 따라 결정되는 것이다.
예를 들어, 세포 접착성 변화 재료가 표면 자유 에너지를 변화시켜 세포의 접착성을 변화시키는 물리 화학적 세포 접착성 변화 재료인 경우, 세포의 접착성은 소정의 범위내의 표면 자유 에너지이면 양호하고, 그 범위를 벗어나면 세포와의 접착성이 저하되는 경향이 있다. 이러한 표면 자유 에너지에 의한 세포의 접착성의 변화로는 예를 들어 CMC 출판 바이오머티리얼의 최첨단 이카다 요시토 (감수) p.109 하부에 나타나는 실험 결과가 알려져 있다.
또한, 상기 재료의 표면 자유 에너지 뿐만 아니라, 어떠한 세포종을 어떠한 재료종에 접촉시키는지 등에 따라서도 세포의 접착성을 결정할 수 있다.
여기에서, 이 세포 접착성 변화 패턴은 상기 기술한 세포 접착성 양호 영역과 세포 접착성 저해 영역을 포함하는 패턴이지만, 용도에 따라서는 세포 접착성 변화 패턴이 표면의 세포 접착성이 적어도 3 수준 이상 다른 영역을 갖는 세포 접착성 변화 패턴인 경우도 포함된다.
예를 들어, 생물학적 세포 접착성 변화 재료를 사용한 광촉매 함유 세포 접착성 변화층을 사용하고 있는 경우로서, 세포의 접착성이 양호한 상태가 미확정인 경우 등에 있어서는, 연속적으로 광촉매 함유 세포 접착성 변화층의 표면 상태를 변화시킴으로써, 접착성에 최적인 상태를 발견할 수 있는 등의 이점을 갖는 경우가 있기 때문이다.
이와 같이, 본 발명에서는 3 수준 이상이란 연속적으로 세포의 접착성이 변화한 상태를 포함하는 것이고, 어느 정도의 수준으로 하는지는 상황에 따라 적당히 선택되어 결정된다.
이러한 다수준의 접착성이 다른 영역을 형성하는 경우에는 광촉매 함유 세포 접착성 변화층에 대한 에너지의 조사량을 변화시킴으로써 행할 수 있다. 구체적으로는 투과율이 다른 하프톤의 포토마스크를 사용하는 등의 방법을 들 수 있다.
또한, 본 실시 양태에 있어서는, 에너지가 조사된 부분과 미조사 부분의 광촉매 활성의 차이를 이용한 세포 접착성 변화 패턴을 사용할 수 있다. 즉, 예를 들어 분해 물질로서 광촉매 함유 세포 접착성 변화층내에 도입된 생물학적 세포 접착성 변화 재료를 사용한 경우, 광촉매 함유 세포 접착성 변화층 표면에 에너지를 패턴상으로 조사하면, 조사 부분의 표면에 스며 나온 생물학적 세포 접착성 변화 재료는 분해되고, 미조사 부분의 생물학적 세포 접착성 변화 재료는 잔존한다. 따라서, 이 생물학적 세포 접착성 변화 재료가 특정한 세포와 접착성이 양호한 재료, 혹은 많은 세포와 접착성이 양호한 세포인 경우, 미조사 부분이 세포 접착성 양호 영역이 되지만, 에너지가 조사된 부분은 세포와의 접착성이 양호한 생물학적 세포 접착성 변화 재료가 존재하지 않을 뿐만 아니라, 에너지 조사에 의해 활성화된 멸균성을 갖는 광촉매가 노출한 영역이 된다. 따라서, 에너지 조사 부분이 세포 접착성 저해 영역이 되는 경우에는, 특히 본 실시 양태의 세포 배열용 기재를 사용하여 소정 기간 배양한 경우, 패턴이 굵어지는 등의 문제가 생기지 않는다는 이점을 갖는 것이다.
B. 제 2 실시 양태
본 발명의 세포 배열용 기재의 제 2 실시 양태는 기재와, 상기 기재 상에 형성되고, 에너지의 조사에 따른 광촉매의 작용에 의해 세포의 접착성이 변화하는 세포 접착성 변화 재료를 갖는 세포 접착성 변화층을 갖고, 상기 세포 접착성 변화층에는 세포의 접착성이 변화한 세포 접착성 변화 패턴이 형성되어 있는 세포 배열용 기재로서, 상기 세포 접착성 변화층이 광촉매를 갖는 광촉매 처리층과, 상기 광촉매 처리층 상에 형성되고, 상기 세포 접착성 변화 재료를 함유하는 세포 접착성 변화 재료층을 갖는 것을 특징으로 하는 것이다.
본 실시 양태에 있어서는, 이와 같이 세포 접착성 변화층이 기재 상에 형성된 광촉매 처리층과, 이 광촉매 처리층 상에 형성된 세포 접착성 변화 재료층을 갖는 것이기 때문에, 에너지가 조사되었을 때, 광촉매 처리층내의 광촉매의 작용에 의해 세포 접착성 변화 재료층내의 세포 접착성 변화 재료의 세포 접착성이 변화하고, 에너지가 조사된 부분과 조사되지 않은 부분에서 세포와의 접착성이 다른 세포 접착성 변화 패턴을 형성할 수 있다.
이러한 본 실시 양태의 세포 배열용 기재를 사용되는 부재로 나눠 각각 설명한다.
1. 세포 접착성 변화 재료층
본 실시 양태의 세포 배열용 기재는 기재 상에 형성된 광촉매 처리층 상에 세포 접착성 변화 재료층이 형성된다. 이 세포 접착성 변화 재료층은 상기 제 1 실시 양태에서 설명한 세포 접착성 변화 재료를 사용함으로써 형성되는 층을 사용할 수 있다. 이하, 물리 화학적 세포 접착성 변화 재료를 사용한 세포 접착성 변화 재료층과 생물학적 세포 접착성 변화 재료를 사용한 세포 접착성 변화 재료층으로 나눠 설명한다.
(1) 물리 화학적 세포 접착성 변화 재료를 사용한 경우
본 실시 양태에 있어서, 물리 화학적 세포 접착성 변화 재료에 의해 형성되는 세포 접착성 변화 재료층은 상기 제 1 실시 양태에서 설명한 재료와 동일한 재료를 사용한 층으로 할 수 있다. 이러한 재료를 사용한 경우에는 광촉매의 유무를 제외하고 상기 기술한 것과 동일하다. 또, 본 실시 양태에서는 원칙적으로는 세포 접착성 변화 재료층내에 광촉매를 함유할 필요성은 없지만, 감도 등의 관계에서 소량 함유된 것이어도 된다.
또한, 본 실시 양태에 있어서는, 광촉매 처리층 상에 광촉매의 작용에 의해 분해 제거되는 분해 제거층으로서 세포 접착성 변화 재료층을 형성하고, 에너지 조사에 따른 광촉매의 작용에 의해 세포 접착성 변화 재료층이 분해된 영역, 즉 광촉매 처리층이 노출된 영역과, 세포 접착성 변화 재료층이 잔존하는 영역을 형성하고, 이에 의해 세포 접착성 변화 패턴으로 하는 타입의 세포 접착성 변화 재료층을 사용할 수 있다.
구체적으로는 표면 자유 에너지에 의해 세포의 접착성을 제어하는 경우에는 표면 자유 에너지가 세포 접착성에 적당한 물리 화학적 세포 접착성 변화 재료를 사용하고, 이 재료를 전면에 도포하여 세포 접착성 변화 재료층을 형성하고, 그 후 에너지를 패턴 조사하여 세포 접착성 변화 재료층의 유무의 패턴을 형성하고, 이에 의해 세포 접착성 변화 패턴으로 하는 것이다.
이러한 분해 제거층으로서의 물리 화학적 세포 접착성 변화 재료층으로서, 표면 자유 에너지에 의해 세포의 접착성을 제어하는 경우에 사용할 수 있는 재료로는, 예를 들어 재생 셀룰로오스, 나일론 11 등을 들 수 있다.
또한, 정전적 상호 작용에 의해 세포의 접착성을 제어하는 경우에는 정전하를 갖는 물리 화학적 세포 접착성 변화 재료를 사용하고, 상기와 동일한 방법에 의해 세포 접착성 변화 패턴으로 할 수 있다.
이러한 분해 제거층으로서의 물리 화학적 세포 접착성 변화 재료층으로서, 정전적 상호 작용에 의해 세포의 접착성을 제어하는 경우에 사용할 수 있는 재료로는 폴리아민그래프트폴리(2-히드록시메틸메타크릴레이트) (HA-x) 등을 들 수 있다.
이들 수지는 용매에 용해시키고, 예로서 스핀코트법 등의 일반적인 막형성 방법에 의해 형성하는 것이 가능하다. 또한, 본 발명에 있어서는, 기능성 박막, 즉 자기 조직화 단분자막, 랑뮤어-블로젯막 및 교대 흡착막 등을 사용함으로써, 결함이 없는 막을 형성하는 것이 가능하므로, 이러한 막형성 방법을 사용하는 것이 보다 바람직하다고 할 수 있다.
이러한 분해 제거층으로서의 세포 접착성 변화 재료층을 사용하여 세포 접착성 변화 패턴을 형성한 경우에는 분해 제거된 영역은 후술하는 광촉매 처리층이 노출되어 있으므로, 세포의 배양이 크게 저해되는 영역이 된다. 따라서, 이러한 방법에 의해 얻어지는 세포 배열용 기재는 장기간 세포를 유지해도 고정세한 패턴을 유지할 수 있는 등의 이점을 갖는 것이다.
(2) 생물학적 세포 접착성 변화 재료를 사용한 경우
본 실시 양태에 있어서, 생물학적 세포 접착성 변화 재료에 의해 형성되는 세포 접착성 변화 재료층은 제 1 실시 양태에서 설명한 것과 동일한 것을 사용할 수 있고, 예를 들어 콜라겐 Ⅰ형 등을 들 수 있다.
2. 광촉매 처리층
다음으로, 본 발명에 사용되는 광촉매 처리층에 대하여 설명한다. 본 발명에 사용되는 광촉매 처리층은 광촉매 처리층 중의 광촉매가 그 위에 형성된 세포 접착성 변화 재료층의 세포 접착 특성을 변화시키는 구성이면, 특별히 한정되지 않고, 광촉매와 바인더로 구성되어 있는 것이어도 되고, 광촉매 단체로 막제조된 것이어도 된다. 또한, 그 표면의 특성은 특별히 친액성이어도 발액성(撥液性)이어도 되는데, 이 광촉매 처리층 상에 세포 접착성 변화 재료층 등을 형성하는 사정상 친액성인 것이 바람직하다.
이 광촉매 처리층에 있어서의 후술하는 산화 티탄으로 대표되는 광촉매의 작용 기구는 반드시 명확한 것은 아니지만, 광의 조사에 의해 생성된 캐리어가 근방의 화합물과의 직접 반응, 또는 산소, 물의 존재 하에서 생긴 활성 산소종에 따라 유기물의 화학 구조에 변화를 미치는 것으로 생각되고 있다. 본 발명에 있어서는, 이 캐리어가 광촉매 처리층 상에 형성된 세포 접착성 변화 재료층 중의 화합물에 작용을 미치는 것이라고 생각된다. 이러한 광촉매로는 제 1 실시 양태에서 상세하게 기술한 것과 동일하다.
본 실시 양태에 있어서의 광촉매 처리층은 상기 기술한 바와 같이 광촉매 단독으로 형성된 것이어도 되고, 또한 바인더와 혼합하여 형성된 것이어도 된다.
광촉매만으로 이루어지는 광촉매 처리층의 경우에는 세포 접착성 변화 재료층의 세포 접착 특성의 변화에 대한 효율이 향상되고, 처리 시간의 단축화 등의 비용 면에서 유리하다. 한편, 광촉매와 바인더로 이루어지는 광촉매 처리층의 경우에는 광촉매 처리층의 형성이 용이하다는 이점을 갖는다.
광촉매만으로 이루어지는 광촉매 처리층의 형성 방법으로는, 예를 들어 스퍼터링법, CVD 법, 진공 증착법 등의 진공 막제조법을 사용하는 방법을 들 수 있다. 진공 막제조법에 의해 광촉매 처리층을 형성함으로써, 균일한 막으로 또한 광촉매만을 함유하는 광촉매 처리층으로 하는 것이 가능하고, 이에 의해 세포 접착성 변화 재료층의 특성을 균일하게 변화시키는 것이 가능하고, 또한 광촉매만으로 이루어지므로, 바인더를 사용하는 경우와 비교하여 효율적으로 세포 접착성 변화층의 세포 접착성을 변화시키는 것이 가능해진다.
또한, 광촉매만으로 이루어지는 광촉매 처리층의 형성 방법의 다른 예로는, 예를 들어 광촉매가 이산화 티탄인 경우에는 기재 상에 무정형 티타니아를 형성하고, 이어서 소성에 의해 결정성 티타니아로 상변화시키는 방법 등을 들 수 있다. 여기에서 사용되는 무정형 티타니아로는, 예를 들어 사염화 티탄, 황산 티탄 등의 티탄의 무기염의 가수 분해, 탈수 축합, 테트라에톡시티탄, 테트라이소프로폭시티탄, 테트라-n-프로폭시티탄, 테트라부톡시티탄, 테트라메톡시티탄 등의 유기 티탄 화합물을 산 존재 하에서 가수 분해, 탈수 축합에 의해 얻을 수 있다. 이어서, 400℃ ∼ 500℃ 에서의 소성에 의해 아나타아제형 티타니아로 변성하고, 600℃ ∼ 700℃ 의 소성에 의해 루틸형 티타니아로 변성할 수 있다.
또한, 바인더를 사용하는 경우에는 바인더의 주골격이 상기 광촉매의 작용에 의해 분해되지 않는 높은 결합 에너지를 갖는 것이 바람직하고, 예를 들어 이와 같은 바인더로는 상기 기술한 오르가노폴리실록산 등을 들 수 있다.
이와 같이 오르가노폴리실록산을 바인더로서 사용한 경우에는 상기 광촉매 처리층은 광촉매와 바인더인 오르가노폴리실록산을 필요에 따라 다른 첨가제와 함께 용제 중에 분산하여 도포액을 조제하고, 이 도포액을 투명 기재 상에 도포함으로써 형성할 수 있다. 사용하는 용제로는 에탄올, 이소프로판올 등의 알코올계 유기 용제가 바람직하다. 도포는 스핀코트, 스프레이코트, 딥코트, 롤코트, 비드코트 등의 공지된 도포 방법에 의해 실시할 수 있다. 바인더로서 자외선 경화형 성분을 함유하고 있는 경우, 자외선을 조사하여 경화 처리함으로써 광촉매 처리층을 형성할 수 있다.
또한, 바인더로서 무정형 실리카 전구체를 사용할 수 있다. 이 무정형 실리카 전구체는 일반식 SiX4 로 표시되고, X 는 할로겐, 메톡시기, 에톡시기 또는 아세틸기 등인 규소 화합물, 그들의 가수 분해물인 실란올, 또는 평균 분자량 3000 이하의 폴리실록산이 바람직하다.
구체적으로는 테트라에톡시실란, 테트라이소프로폭시실란, 테트라-n-프로폭시실란, 테트라부톡시실란, 테트라메톡시실란 등을 들 수 있다. 또한, 이 경우에는 무정형 실리카의 전구체와 광촉매의 입자를 비수성 용매 중에 균일하게 분산시키고, 투명 기재 상에 공기 중의 수분에 의해 가수 분해시켜 실란올을 형성시킨 후, 상온에서 탈수 축중합함으로써 광촉매 처리층을 형성할 수 있다. 실란올의 탈수 축중합을 100℃ 이상에서 실시하면, 실란올의 중합도가 증가하여 막 표면의 강도를 향상시킬 수 있다. 또한, 이들 결착제는 단독 또는 2 종 이상을 혼합하여 사용할 수 있다.
바인더를 사용한 경우의 광촉매 처리층 중의 광촉매의 함유량은 5 ∼ 60 중량%, 바람직하게는 20 ∼ 40 중량% 의 범위로 설정할 수 있다. 또한, 광촉매 처리층의 두께는 0.05 ∼ 10㎛ 의 범위내가 바람직하다.
또한, 광촉매 처리층에는 상기 광촉매, 바인더 외에 계면 활성제를 함유시킬 수 있다. 구체적으로는 닛코 케미컬즈 (주) 제조의 NIKKOL BL, BC, BO, BB 의 각 시리즈 등의 탄화수소계, 듀퐁사 제조의 ZONYL FSN, FSO, 아사히가라스 (주) 제조의 사프론 S-141, 145, 다이닛폰 잉크 화학 공업 (주) 제조의 메가팍 F-141, 144, 네오스 (주) 제조의 프타젠트 F-200, F251, 다이킹 공업 (주) 제조의 유니다인 DS-401, 402, 쓰리엠 (주) 제조의 플로라드 FC-170, 176 등의 불소계 또는 실리콘계의 비이온 계면 활성제를 들 수 있고, 또한 양이온계 계면 활성제, 음이온계 계면 활성제, 양성 계면 활성제를 사용할 수도 있다.
또한, 광촉매 처리층에는 상기 계면 활성제 외에도, 폴리비닐알코올, 불포화 폴리에스테르, 아크릴 수지, 폴리에틸렌, 디알릴프탈레이트, 에틸렌프로필렌디엔모노머, 에폭시 수지, 페놀 수지, 폴리우레탄, 멜라민 수지, 폴리카보네이트, 폴리염화비닐, 폴리아미드, 폴리이미드, 스티렌부타디엔 고무, 클로로프렌 고무, 폴리프로필렌, 폴리부틸렌, 폴리스티렌, 폴리아세트산비닐, 폴리에스테르, 폴리부타디엔, 폴리벤즈이미다졸, 폴리아크릴니트릴, 에피클로르히드린, 폴리술파이드, 폴리이소프렌 등의 올리고머, 폴리머 등을 함유시킬 수 있다.
3. 기재
본 실시 양태에 사용되는 기재는 상기 광촉매 처리층을 형성 가능하면, 특별히 한정되지 않고, 제 1 실시 양태에서 설명한 것과 동일한 것을 사용할 수 있다.
4. 세포 접착성 변화 패턴
본 실시 양태에 있어서는, 상기 기술한 세포 접착성 변화 재료층에 패턴상으로 에너지를 조사함으로써, 광촉매 처리층 중의 광촉매의 작용에 의해 세포 접착성 변화 재료층 표면의 세포와의 접착성이 변화한 패턴인 세포 접착성 변화 패턴이 형성되어 있다.
C. 제 3 실시 양태
본 실시 양태의 세포 배열용 기재는 기재와, 상기 기재 상에 형성되고, 에너지의 조사에 따른 광촉매의 작용에 의해 세포의 접착성이 변화하는 세포 접착성 변화 재료를 갖는 세포 접착성 변화층을 가지며, 상기 세포 접착성 변화층에는 세포의 접착성이 변화한 세포 접착성 변화 패턴이 형성되어 있는 세포 배열용 기재로서, 상기 세포 접착성 변화층이 상기 세포 접착성 변화 재료를 함유하는 세포 접착성 변화 재료층이고, 상기 접착성 변화 패턴이 광촉매를 함유하는 광촉매 함유층과 상기 세포 접착성 변화 재료층이 대향하도록 배치한 후, 소정의 방향으로부터 에너지를 조사함으로써 형성된 것임을 특징으로 하는 것이다.
본 실시 양태에 있어서는, 이와 같이 세포 접착성 변화층이 세포 접착성 변화 재료층이고, 상기 접착성 변화 패턴이 광촉매를 함유하는 광촉매 함유층과 상기 세포 접착성 변화 재료층이 대향하도록 배치한 후, 소정의 방향으로부터 에너지를 조사함으로써 형성된 것이기 때문에, 에너지가 조사되었을 때, 광촉매 함유층내의 광촉매의 작용에 의해 세포 접착성 변화 재료층내의 세포 접착성 변화 재료의 세포 접착성이 변화하고, 에너지가 조사된 부분과 조사되지 않은 부분에서 세포와의 접착성이 다른 세포 접착성 변화 패턴을 형성할 수 있다.
이와 같은 본 실시 양태의 세포 배열용 기재를 사용되는 부재로 나눠 각각 설명한다.
1. 세포 접착성 변화 재료층
본 실시 양태의 세포 배열용 기재는 기재 상에 세포 접착성 변화 재료층이 형성된다. 이 세포 접착성 변화 재료층은 상기 제 2 실시 양태에서 설명한 재료를 사용함으로써 형성되는 층과 동일하다. 또, 본 실시 양태에 있어서는, 원칙적으로는 세포 접착성 변화 재료층내에 광촉매를 함유할 필요성은 없지만, 감도 등의 관계에서 소량 함유된 것이어도 된다.
또, 본 실시 양태에 있어서는, 상기 기술한 제 2 실시 양태과 마찬가지로, 기재 상에 광촉매의 작용에 의해 분해 제거되는 분해 제거층으로서 세포 접착성 변화 재료층을 형성해도 된다. 이 경우, 세포 접착성 변화 재료층은 광촉매 함유층측 기판을 사용하여 에너지 조사함으로써, 에너지 조사에 따른 광촉매의 작용에 의해 세포 접착성 변화 재료층이 분해된 영역, 즉 기재가 노출된 영역과, 세포 접착성 변화 재료층이 잔존하는 영역을 형성하고, 이에 의해 세포 접착성 변화 패턴으로 하는 타입의 것이 사용된다.
2. 기재
본 실시 양태에 사용되는 기재는 상기 기술한 세포 접착성 변화 재료층을 형성할 수 있으면, 특별히 한정되지 않고, 제 1 실시 양태에서 설명한 것과 동일한 것을 사용하는 것이 가능하다.
3. 광촉매 함유층
다음으로, 본 실시 양태에 사용되는 광촉매 함유층에 대하여 설명한다. 본 실시 양태에 사용되는 광촉매 함유층은 광촉매를 함유하는 층이고, 통상은 유리 등의 기체(基體) 상에 형성되어 사용된다. 본 실시 양태에 있어서는, 이러한 광촉매 함유층을 상기 기술한 세포 접착성 변화 재료층과 대향시켜 배치하고, 에너지 조사함으로써 광촉매 함유층 중에 함유되는 광촉매의 작용에 의해, 세포 접착성 변화 재료층의 세포 접착성을 변화시킬 수 있는 것이다. 본 실시 양태에 있어서는, 이 광촉매 함유층을 에너지 조사시에 소정의 위치에 배치하고, 세포 접착성 변화 패턴을 형성하는 것이 가능하므로, 상기 세포 접착성 변화 재료층 중에 광촉매를 함유시킬 필요가 없고, 세포 접착성 변화 재료층이 시간이 경과함께 따라 광촉매의 작용을 받지 않는 것으로 할 수 있다는 이점을 갖는다.
이와 같은 광촉매 함유층으로는 상기 제 2 실시 양태에서 광촉매 처리층에 대하여 설명한 층과 동일하다.
4. 세포 접착성 변화 패턴
본 실시 양태에 있어서는, 상기 기술한 세포 접착성 변화 재료층에 상기 광촉매 함유층을 사용하고, 패턴상으로 에너지를 조사함으로써, 광촉매 함유층 중의 광촉매의 작용에 의해 세포 접착성 변화 재료층 표면의 세포와의 접착성이 변화한 패턴인 세포 접착성 변화 패턴이 형성되어 있다.
Ⅱ. 세포 배열용 기재의 제조 방법
다음으로, 본 발명의 세포 배열용 기재의 제조 방법에 대하여 설명한다. 본 발명의 세포 배열용 기재의 제조 방법에는, 예를 들어 상기와 같은 3 개의 실시 양태가 있는데, 어느 실시 양태에서도 기재와, 그 기재 상에 형성되고, 또한 에너지 조사에 따른 광촉매의 작용에 의해 세포의 접착성이 변화하는 층을 갖는 패턴 형성체용 기재를 형성하고, 이 패턴 형성체용 기재에 에너지를 조사함으로써, 광촉매를 작용시켜 세포의 접착성이 변화한 세포 접착성 변화 패턴을 형성하는 것을 특징으로 하는 것이다.
본 발명의 세포 배열용 기재의 제조 방법에 의하면, 상기 에너지 조사에 따른 광촉매의 작용에 의해 세포의 접착성이 변화하는 층을 형성하는 점에서, 이 층에 필요로 하는 패턴 상에 에너지를 조사함으로써, 용이하게 고정세한 패턴상으로 세포의 접착성이 변화한 세포 접착성 변화 패턴이 형성된 세포 배열용 기재를 제조하는 것이 가능해진다. 따라서, 고정세한 패턴을 세포에 대하여 악영향을 미치는 처리액을 사용하지 않고, 간편한 공정에 의해 세포 배열용 기재를 제조할 수 있다. 또한, 세포 접착성 변화 재료의 변성의 필요성이 없으므로, 재료 선택의 폭을 확대하는 것이 가능하고, 후술하는 특이적인 접착성을 발현하는 생물학적 세포 접착성 변화 재료도 문제 없이 사용할 수 있는 것이다.
이하, 본 발명의 세포 배열용 기재를 상기 1 ∼ 3 의 실시 양태별로 설명한다.
A. 제 1 실시 양태
먼저, 본 발명의 세포 배열용 기재의 제 1 실시 양태에 대하여 설명한다. 본 발명의 세포 배열용 기재의 제 1 실시 양태는 기재와, 상기 기재 상에 형성되고, 또한 광촉매 및 에너지의 조사에 따른 광촉매의 작용에 의해 세포의 접착성이 변화하는 세포 접착성 변화 재료를 함유하는 광촉매 함유 세포 접착성 변화층을 갖는 패턴 형성체용 기재를 형성하는 패턴 형성체용 기재 형성 공정과, 상기 광촉매 함유 세포 접착성 변화층에 에너지를 조사하고, 상기 광촉매 함유 세포 접착성 변화층의 세포의 접착성이 변화한 세포 접착성 변화 패턴을 형성하는 세포 접착성 변화 패턴 형성 공정을 갖는 것이다.
본 실시 양태의 세포 배열용 기재의 제조 방법은, 예를 들어 도 1 에 나타내는 바와 같이, 먼저 기재 (1) 와, 그 기재 (1) 상에 형성된 광촉매 함유 세포 접착성 변화층 (2) 을 갖는 패턴 형성체용 기재 (3) 를 형성한다 (패턴 형성체용 기재 형성 공정 (도 1(a)). 다음으로, 상기 광촉매 함유 세포 접착성 변화층 (2) 에, 예를 들어 포토마스크 (4) 를 사용하여 에너지 (5) 를 조사하고 (도 1(b)), 광촉매 함유 세포 접착성 변화층 (2) 의 세포의 접착성이 변화한 세포 접착성 변화 패턴 (6) 을 형성하는 (도 1(c)) 세포 접착성 변화 패턴 형성 공정을 실시하는 것이다.
본 실시 양태에 있어서는, 광촉매와 상기 세포 접착성 변화 재료를 갖는 광촉매 함유 세포 접착성 변화층을 형성하므로, 세포 접착성 변화 패턴 형성 공정에서 에너지를 조사함으로써, 광촉매 함유 세포 접착성 변화층내의 광촉매의 작용에 의해 세포 접착성 변화 재료의 세포 접착성이 변화하고, 에너지가 조사된 부분과 조사되지 않은 부분에서 세포와의 접착성이 다른 세포 접착성 변화 패턴을 형성할 수 있는 것이다. 이하, 본 실시 양태의 각 공정에 대하여 설명한다.
1. 패턴 형성체용 기재 형성 공정
먼저, 본 실시 양태에 있어서의 패턴 형성체용 기재 형성 공정에 대하여 설명한다. 본 실시 양태에 있어서의 패턴 형성체용 기재 형성 공정은 기재와, 상기 기재 상에 형성되고, 또한 광촉매 및 에너지의 조사에 따른 광촉매의 작용에 의해 세포의 접착성이 변화하는 세포 접착성 변화 재료를 함유하는 광촉매 함유 세포 접착성 변화층을 갖는 패턴 형성체용 기재를 형성하는 공정이다.
본 공정은 기재 상에 광촉매 및 세포 접착성 변화 재료를 함유하는 도공액을, 예를 들어 스핀코트, 스프레이코트, 딥코트, 롤코트, 비드코트 등의 공지된 도포 방법에 의해 도포하고, 광촉매 함유 세포 접착성 변화층을 형성함으로써 실시할 수 있다. 또한 바인더로서 자외선 경화형 성분을 함유하고 있는 경우, 자외선을 조사하여 경화 처리함으로써 광촉매 함유층을 형성할 수 있다.
2. 세포 접착성 변화 패턴 형성 공정
다음으로, 본 실시 양태에 있어서의 세포 접착성 변화 패턴 형성 공정에 대하여 설명한다. 본 실시 양태에 있어서의 세포 접착성 변화 패턴 형성 공정은 상기 광촉매 함유 세포 접착성 변화층에 에너지를 조사하고, 상기 광촉매 함유 세포 접착성 변화층의 세포의 접착성이 변화한 세포 접착성 변화 패턴을 형성하는 공정이다.
본 공정에 의해 목적으로 하는 패턴상으로 에너지를 조사함으로써, 에너지 조사된 영역만의 광촉매 함유 세포 접착성 변화층의 세포의 접착성을 변화시킬 수 있고, 고정세한 세포 접착성이 양호한 영역과 나쁜 영역의 패턴인, 세포 접착성 변화 패턴을 형성할 수 있는 것이다.
여기에서, 본 실시 양태에서 말하는 에너지 조사 (노광) 란, 광촉매 함유 세포 접착성 변화층 표면의 세포 접착성을 변화시키는 것이 가능한 어떠한 에너지선의 조사도 포함하는 개념이고, 가시광의 조사에 한정되는 것은 아니다.
통상 이러한 에너지 조사에 사용하는 광의 파장은 400㎚ 이하의 범위, 바람직하게는 380㎚ 이하의 범위로부터 설정된다. 이것은 상기 기술한 바와 같이 광촉매 함유 세포 접착성 변화층에 사용되는 바람직한 광촉매가 이산화 티탄이고, 이 이산화 티탄에 의해 광촉매 작용을 활성화시키는 에너지로서 상기 기술한 파장의 광이 바람직하기 때문이다.
이와 같은 에너지 조사에 사용할 수 있는 광원으로는 수은 램프, 메탈할라이드 램프, 크세논 램프, 엑시머 램프, 그 외에 여러 광원을 들 수 있다.
상기 기술한 광원을 사용하고, 포토마스크를 통한 패턴 조사에 의해 실시하는 방법 외에, 엑시머, YAG 등의 레이저를 사용하여 패턴상으로 묘화 조사하는 방법을 사용하는 것도 가능하다.
또한, 에너지 조사시의 에너지의 조사량은 광촉매 함유 세포 접착성 변화층 중의 광촉매의 작용에 의해 광촉매 함유 세포 접착성 변화층 표면의 세포의 접착성의 변화가 행해지는데 필요한 조사량으로 한다.
광촉매 함유 세포 접착성 변화층 표면의 세포의 접착성의 변화는 에너지의 조사량에 의존하여 변화하기 때문에, 예를 들어 에너지 조사 시간을 조절함으로써 접착성을 조정할 수 있다. 그렇게 함으로써, 적당한 접착성을 갖는 표면으로 할 수 있다. 세포 접착성에 대해서는 이미 기술한 바와 같이 표면의 수접촉각으로 평가할 수 있기 때문에, 적당한 수접촉각을 갖는 표면이 얻어지도록 에너지 조사 시간을 조절함으로써, 적당한 접착성을 갖는 표면으로 할 수 있다. 예를 들어, 세포 접착성 변화 재료로서 플루오로알킬실란을 사용하고, 365㎚ 의 자외선을 강도 25.0mW/초로 조사하는 경우, 포토마스크의 기재에 석영을 사용한 예에서는 통상 120 ∼ 600초, 바람직하게는 240 ∼ 480초 조사함으로써 바람직한 접착성을 갖는 표면으로 할 수 있다. 에너지 조사 시간 및 조사 강도 등에 대해서는 사용하는 기재의 재료나 세포 접착성 변화 재료 등에 따라 적당히 조절할 수 있다.
이 때, 광촉매 함유 세포 접착성 변화층을 가열하면서 에너지 조사함으로써, 감도를 상승시키는 것이 가능해져 효율적인 세포의 접착성의 변화를 행할 수 있는 점에서 바람직하다. 구체적으로는 30℃ ∼ 80℃ 의 범위내에서 가열하는 것이 바람직하다.
본 실시 양태에 있어서의 에너지 조사 방향은 상기 기술한 기재가 투명한 경우에는 기재측 및 광촉매 함유 세포 접착성 변화층측의 어느 방향으로부터 포토마스크를 통한 패턴 에너지 조사 또는 레이저의 묘화 조사를 해도 된다. 한편, 기재가 불투명한 경우에는 광촉매 함유 세포 접착성 변화층측으로부터 에너지를 조사할 필요가 있다.
B. 제 2 실시 양태
다음으로, 본 발명의 세포 배열용 기재의 제 2 실시 양태에 대하여 설명한다. 본 발명의 세포 배열용 기재의 제 2 실시 양태는 기재와, 상기 기재 상에 형성된 광촉매를 함유하는 광촉매 처리층과, 상기 광촉매 처리층 상에 형성되고, 또한 에너지의 조사에 따른 광촉매의 작용에 의해 세포의 접착성이 변화하는 세포 접착성 변화 재료를 함유하는 세포 접착성 변화 재료층을 갖는 패턴 형성체용 기재를 형성하는 패턴 형성체용 기재 형성 공정과, 상기 세포 접착성 변화 재료층에 에너지를 조사하고, 상기 세포 접착성 변화 재료층의 세포의 접착성이 변화한 세포 접착성 변화 패턴을 형성하는 세포 접착성 변화 패턴 형성 공정을 갖는 것이다.
본 실시 양태의 세포 배열용 기재의 제조 방법은, 예를 들어 도 2 에 나타내는 바와 같이, 먼저 기재 (1) 와, 그 기재 (1) 상에 형성된 광촉매 처리층 (7) 과, 그 광촉매 처리층 (7) 상에 형성된 세포 접착성 변화 재료층 (8) 을 갖는 패턴 형성체용 기재 (3) 를 형성한다 (패턴 형성체용 기재 형성 공정 (도 2(a)). 다음으로, 상기 세포 접착성 변화 재료층 (8) 에, 예를 들어 포토마스크 (4) 를 사용하여 에너지 (5) 를 조사하고 (도 2(b)), 세포 접착성 변화 재료층 (8) 의 세포의 접착성이 변화한 세포 접착성 변화 패턴 (6) 을 형성하는 (도 2(c)) 세포 접착성 변화 패턴 형성 공정을 실시하는 것이다.
본 실시 양태에 있어서는, 광촉매 처리층과, 상기 세포 접착성 변화 재료층을 형성하므로, 세포 접착성 변화 패턴 형성 공정에서 에너지를 조사함으로써, 광촉매 처리층 중에 함유되는 광촉매의 작용에 의해 세포 접착성 변화 재료층내의 세포 접착성이 변화하고, 에너지가 조사된 부분과 조사되지 않은 부분에서 세포와의 접착성이 다른 세포 접착성 변화 패턴을 형성할 수 있는 것이다. 이하, 본 실시 양태의 각 공정에 대하여 설명한다.
1. 패턴 형성체용 기재 형성 공정
먼저, 본 실시 양태에 있어서의 패턴 형성체용 기재 형성 공정에 대하여 설명한다. 본 실시 양태에 있어서의 패턴 형성체용 기재 형성 공정은 상기 기재 상에 형성된 광촉매를 함유하는 광촉매 처리층과, 상기 광촉매 처리층 상에 형성되고, 또한 에너지의 조사에 따른 광촉매의 작용에 의해 세포의 접착성이 변화하는 세포 접착성 변화 재료를 함유하는 세포 접착성 변화 재료층을 갖는 패턴 형성체용 기재를 형성하는 공정이다.
본 공정에서 형성되는 광촉매 처리층은 광촉매만으로 이루어지는 것이어도 되고, 또한 바인더와 혼합하여 형성되는 것이어도 된다.
광촉매만으로 이루어지는 광촉매 처리층의 형성 방법으로는, 예를 들어 스퍼터링법, CVD 법, 진공 증착법 등의 진공 막제조법이나, 예를 들어 광촉매가 이산화 티탄인 경우에는 기재 상에 무정형 티타니아를 형성하고, 이어서 소성에 의해 결정성 티타니아에 상변화시키는 방법 등을 들 수 있다. 진공 막제조법에 의해 광촉매 처리층을 형성함으로써, 균일한 막으로 또한 광촉매만을 함유하는 광촉매 처리층으로 하는 것이 가능하고, 이에 의해 세포 접착성 변화 재료층 상의 세포 접착성을 균일하게 변화시키는 것이 가능하고, 또한 광촉매만으로 이루어지므로, 바인더를 사용하는 경우와 비교하여 효율적으로 세포 접착성 변화 재료층 상의 세포 접착성을 변화시키는 것이 가능해진다.
또한, 광촉매 처리층이 광촉매와 바인더를 혼합시킨 것인 경우에는 광촉매와 바인더를 필요에 따라 다른 첨가제와 함께 용제 중에 분산하여 도포액을 조제하고, 이 도포액을 투명 기재 상에 도포함으로써 형성할 수 있다. 사용하는 용제로는 에탄올, 이소프로판올 등의 알코올계 유기 용제가 바람직하다. 도포는 스핀코트, 스프레이코트, 딥코트, 롤코트, 비드코트 등의 공지된 도포 방법에 의해 실시할 수 있다. 바인더로서 자외선 경화형 성분을 함유하고 있는 경우, 자외선을 조사하여 경화 처리함으로써 광촉매 처리층을 형성할 수 있다.
이어서, 상기 광촉매 처리층 상에 상기 기술한 세포 접착성 변화 재료를 함유하는 도공액을, 예를 들어 스핀코트, 스프레이코트, 딥코트, 롤코트, 비드코트 등의 공지된 도포 방법에 의해 도포하고, 세포 접착성 변화 재료층을 형성할 수 있다. 또한 바인더로서 자외선 경화형 성분을 함유하고 있는 경우, 자외선을 조사하여 경화 처리함으로써 광촉매 처리층을 형성할 수 있다.
여기에서, 본 공정에 사용되는 기재나 광촉매 처리층 및 세포 접착성 변화 재료층에 대해서는 상기 기술한 「I. 세포 배열용 기재」 의 제 2 실시 양태의 항에서 설명한 것과 동일하다.
2. 세포 접착성 변화 패턴 형성 공정
다음으로, 본 실시 양태에 있어서의 세포 접착성 변화 패턴 형성 공정에 대하여 설명한다. 본 실시 양태에 있어서의 세포 접착성 변화 패턴 형성 공정은 상기 세포 접착성 변화 재료층에 에너지를 조사하고, 상기 세포 접착성 변화 재료층의 세포의 접착성이 변화한 세포 접착성 변화 패턴을 형성하는 공정이다.
본 공정에 의해 목적으로 하는 패턴상으로 에너지를 조사함으로써, 에너지 조사된 영역만의 세포 접착성 변화 재료층의 세포의 접착성을 변화시킬 수 있고, 고정세한 세포 접착성이 양호한 영역과 나쁜 영역의 패턴인, 세포 접착성 변화 패턴을 형성할 수 있는 것이다.
본 공정에서의 에너지 조사 방법이나, 조사하는 에너지, 에너지 조사량에 대해서는 상기 기술한 제 1 실시 양태과 동일하다.
C. 제 3 실시 양태
다음으로, 본 발명의 세포 배열용 기재의 제 3 실시 양태에 대하여 설명한다. 본 발명의 세포 배열용 기재의 제 3 실시 양태는 기재와, 상기 기재 상에 형성되고, 에너지의 조사에 따른 광촉매의 작용에 의해 세포의 접착성이 변화하는 세포 접착성 변화 재료를 함유하는 세포 접착성 변화 재료층을 갖는 패턴 형성체용 기재를 형성하는 패턴 형성체용 기재 형성 공정과, 상기 패턴 형성체용 기재와, 광촉매를 함유하는 광촉매 함유층 및 기체를 갖는 광촉매 함유층측 기판을 상기 세포 접착성 변화 재료층과 상기 광촉매 함유층이 대향하도록 배치한 후, 소정의 방향으로부터 에너지를 조사하고, 상기 세포 접착성 변화 재료층의 세포의 접착성이 변화한 세포 접착성 변화 패턴을 형성하는 세포 접착성 변화 패턴 형성 공정을 갖는 것이다.
본 실시 양태의 세포 배열용 기재의 제조 방법은, 예를 들어 도 3 에 나타내는 바와 같이, 먼저 기재 (1) 와, 그 기재 (1) 상에 형성된 세포 접착성 변화 재료층 (8) 을 갖는 패턴 형성체용 기재 (3) 를 형성한다 (패턴 형성체용 기재 형성 공정 (도 3(a)). 다음으로, 기체 (11) 와, 그 기체 (11) 상에 형성된 광촉매 함유층 (12) 을 갖는 광촉매 함유층측 기판 (13) 을 준비한다. 이 광촉매 함유층측 기판 (13) 에 있어서의 광촉매 함유층 (12) 과 상기 세포 접착성 변화 재료층 (8) 이 대향하도록 배치하고, 예를 들어 포토마스크 (4) 를 사용하여 에너지 (5) 를 조사하고 (도 3(b)), 세포 접착성 변화 재료층 (8) 의 세포의 접착성이 변화한 세포 접착성 변화 패턴 (6) 을 형성하는 (도 3(c)) 세포 접착성 변화 패턴 형성 공정을 실시하는 것이다.
본 실시 양태에 있어서는, 상기 세포 접착성 변화 재료층을 형성하므로, 세포 접착성 변화 패턴 형성 공정에서, 광촉매 함유층측 기판을 사용하여 에너지를 조사함으로써, 광촉매 함유층 중에 함유되는 광촉매의 작용에 의해 세포 접착성 변화 재료층내의 세포 접착성이 변화하고, 에너지가 조사된 부분과 조사되지 않은 부분에서 세포와의 접착성이 다른 세포 접착성 변화 패턴을 형성할 수 있는 것이다. 이하, 본 실시 양태의 각 공정에 대하여 설명한다.
1. 패턴 형성체용 기재 형성 공정
먼저, 본 발명에 있어서의 패턴 형성체용 기재 형성 공정에 대하여 설명한다. 본 발명에 있어서의 패턴 형성체용 기재 형성 공정은 기재와, 상기 기재 상에 형성되고, 에너지의 조사에 따른 광촉매의 작용에 의해 세포의 접착성이 변화하는 세포 접착성 변화 재료를 함유하는 세포 접착성 변화 재료층을 갖는 패턴 형성체용 기재를 형성하는 공정이다.
본 공정은 기재 상에 세포 접착성 변화 재료를 함유하는 도공액을, 예를 들어 스핀코트, 스프레이코트, 딥코트, 롤코트, 비드코트 등의 공지된 도포 방법에 의해 도포하고, 세포 접착성 변화 재료층을 형성함으로써 실시할 수 있다. 또한 바인더로서 자외선 경화형 성분을 함유하고 있는 경우, 자외선을 조사하여 경화 처리함으로써 광촉매 함유층을 형성할 수 있다.
여기에서, 본 공정에 사용되는 기재 및 세포 접착성 변화 재료에 대해서는 상기 기술한 「I. 세포 배열용 기재」 의 제 1 실시 양태의 항에서 설명한 것과 동일한 것을 사용할 수 있다.
2. 세포 접착성 변화 패턴 형성 공정
다음으로, 본 실시 양태에 있어서의 세포 접착성 변화 패턴 형성 공정에 대하여 설명한다. 본 실시 양태에 있어서의 접착성 변화 패턴 형성 공정은 상기 패턴 형성체용 기재와, 광촉매를 함유하는 광촉매 함유층 및 기체를 갖는 광촉매 함유층측 기판을 상기 세포 접착성 변화 재료층과 상기 광촉매 함유층이 대향하도록 배치한 후, 소정 방향으로부터 에너지 조사하고, 상기 세포 접착성 변화 재료층의 세포의 접착성이 변화한 세포 접착성 변화 패턴을 형성하는 공정이다.
본 공정에서, 광촉매 함유층측 기판에 있어서의 광촉매 함유층 및 세포 접착성 변화 재료층을 대향하도록 배치하고, 목적으로 하는 패턴상으로 에너지를 조사함으로써, 에너지 조사된 영역만의 세포 접착성 변화 재료층의 세포의 접착성을 변화시킬 수 있고, 고정세한 세포 접착성이 양호한 영역과 나쁜 영역의 패턴인, 세포 접착성 변화 패턴을 형성할 수 있는 것이다.
이하, 본 공정에 사용되는 광촉매 함유층측 기판 및 에너지 조사에 대하여 각각 설명한다.
(1) 광촉매 함유층측 기판
먼저, 본 실시 양태에 사용되는 광촉매 함유층측 기판에 대하여 설명한다.
본 실시 양태에 사용되는 광촉매 함유층측 기판은 적어도 광촉매 함유층과 기체를 갖는 것이고, 통상은 기체 상에 소정의 방법으로 형성된 박막상의 광촉매 함유층이 형성되어 이루어지는 것이다. 또한, 이 광촉매 함유층측 기판에는 패턴상으로 형성된 광촉매 함유층측 차광부나 프라이머층이 형성된 것도 사용할 수 있다.
본 실시 양태에 있어서는, 에너지를 조사할 때, 상기 세포 접착성 변화 재료층과, 상기 광촉매 함유층측 기판에 있어서의 광촉매 함유층을 소정의 틈을 두고 대향시키고, 광촉매 함유층측 기판의 광촉매 함유층의 작용에 의해 세포 접착성 변화 재료층의 세포 접착성을 변화시키고, 에너지 조사후, 광촉매 함유층측 기판을 분리시킴으로써 세포 접착성 변화 패턴이 형성되는 것이다. 이하, 이 광촉매 함유층측 기판의 각 구성에 대하여 설명한다.
a. 광촉매 함유층
본 실시 양태에 사용되는 광촉매 함유층은 적어도 광촉매를 함유하는 것이고, 바인더를 갖고 있어도, 갖고 있지 않아도 되고, 상기 기술한 제 2 실시 양태의 광촉매 처리층과 동일하다.
여기에서, 본 실시 양태에 있어서 사용되는 광촉매 함유층은, 예를 들어 도 3 에 나타내는 바와 같이, 기체 (11) 상에 전면에 형성된 것이어도 되는데, 예를 들어 도 4 에 나타내는 바와 같이, 기체 (11) 상에 광촉매 함유층 (12) 이 패턴상으로 형성된 것이어도 된다.
이와 같이 광촉매 함유층을 패턴상으로 형성함으로써, 에너지를 조사할 때, 포토마스크 등을 사용하여 패턴을 조사할 필요가 없고, 전체면에 조사함으로써, 세포 접착성 변화 재료층 상에 세포 접착성 변화 패턴을 형성할 수 있다.
이 광촉매 함유층의 패터닝 방법은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어 포토리소그래피법 등에 의해 실시하는 것이 가능하다.
또한, 광촉매 함유층과 세포 접착성 변화 재료층을 예를 들어 밀착시켜 에너지 조사하는 경우에는 실제로 광촉매 함유층이 형성된 부분만의 특성이 변화하는 것이므로, 에너지의 조사 방향은 상기 광촉매 함유층과 세포 접착성 변화 재료층이 대향하는 부분에 에너지가 조사되는 것이면, 어떠한 방향으로부터 조사되어도 되고, 또한 조사되는 에너지도 특별히 평행광 등의 평행한 것에 한정되지 않는다는 이점을 갖는 것이 된다.
b. 기체
본 실시 양태에 있어서는, 도 3 에 나타내는 바와 같이, 광촉매 함유층측 기판 (13) 은 적어도 기체 (11) 와 이 기체 (11) 상에 형성된 광촉매 함유층 (12) 을 갖는 것이다. 이 때, 사용되는 기체를 구성하는 재료는 후술하는 에너지의 조사 방향이나, 얻어지는 세포 배열용 기재가 투명성을 필요로 하는지 등에 따라 적당히 선택된다.
또한 본 실시 양태에 사용되는 기체는 가요성(可撓性)을 갖는 것, 예를 들어 수지제 필름 등이어도 되고, 가요성을 갖지 않는 것, 예를 들어 유리 기재 등이어도 된다. 또한, 다른 형태의 기체로서, 광섬유 등의 광도파로를 사용할 수도 있다. 이들은 에너지 조사 방법에 따라 적당히 선택되는 것이다.
또, 기체 표면과 광촉매 함유층의 밀착성을 향상시키기 위해, 기체 상에 앵커층을 형성하도록 해도 된다. 이러한 앵커층으로는, 예를 들어 실란계, 티탄계의 커플링제 등을 들 수 있다.
c. 광촉매 함유층측 차광부
본 실시 양태에 사용되는 광촉매 함유층측 기판에는 패턴상으로 형성된 광촉매 함유층측 차광부가 형성된 것을 사용해도 된다. 이와 같이 광촉매 함유층측 차광부를 갖는 광촉매 함유층측 기판을 사용함으로써, 에너지 조사시, 포토마스크를 사용하거나, 레이저광에 의한 묘화 조사할 필요가 없다. 따라서, 광촉매 함유층측 기판과 포토마스크의 위치 맞춤이 필요 없으므로, 간편한 공정으로 하는 것이 가능하고, 또한 묘화 조사에 필요한 고가의 장치도 필요 없으므로, 비용적으로 유리해진다는 이점을 갖는다.
이러한 광촉매 함유층측 차광부를 갖는 광촉매 함유층측 기판은 광촉매 함유층측 차광부의 형성 위치에 따라 하기 2 개의 양태으로 할 수 있다.
하나가, 예를 들어 도 5 에 나타내는 바와 같이, 기체 (11) 상에 광촉매 함유층측 차광부 (14) 를 형성하고, 이 광촉매 함유층측 차광부 (14) 상에 광촉매 함유층 (12) 을 형성하여 광촉매 함유층측 기판으로 하는 양태가다. 또 하나는, 예를 들어 도 6 에 나타내는 바와 같이, 기체 (11) 상에 광촉매 함유층 (12) 을 형성하고, 그 위에 광촉매 함유층측 차광부 (14) 를 형성하여 광촉매 함유층측 기판으로 하는 양태가다.
어느 양태에 있어서도, 포토마스크를 사용하는 경우와 비교하면, 광촉매 함유층측 차광부가 상기 광촉매 함유층과 세포 접착성 변화 재료층의 배치 부분의 근방에 배치되므로, 기체내 등에 있어서의 에너지의 산란의 영향을 적게 할 수 있기 때문에, 에너지의 패턴 조사를 매우 정확하게 실시하는 것이 가능해진다.
또한, 상기 광촉매 함유층 상에 광촉매 함유층측 차광부를 형성하는 양태에 있어서는, 광촉매 함유층과 세포 접착성 변화 재료층을 소정의 위치에 배치할 때, 이 광촉매 함유층측 차광부의 막두께를 이 틈의 폭과 일치시켜 둠으로써, 상기 광촉매 함유층측 차광부를 상기 틈을 일정한 것으로 하기 위한 스페이서로서도 사용할 수 있다는 이점을 갖는다. 또한, 스페이서로서의 높이가 부족한 경우, 차광부에 별도의 스페이서를 형성해도 된다.
즉, 소정의 틈을 두고 상기 광촉매 함유층과 세포 접착성 변화 재료층을 대향시킨 상태로 배치할 때, 상기 광촉매 함유층측 차광부와 세포 접착성 변화 재료층을 밀착시킨 상태로 배치함으로써, 상기 소정의 틈을 정확하게 하는 것이 가능해지고, 그리고 이 상태로 광촉매 함유층측 기판으로부터 에너지를 조사함으로써, 세포 접착성 변화 재료층 상에 세포 접착성 변화 패턴을 정밀도 좋게 형성하는 것이 가능해지는 것이다.
이러한 광촉매 함유층측 차광부의 형성 방법은 특별히 한정되지 않고, 광촉매 함유층측 차광부의 형성면의 특성이나, 필요로 하는 에너지에 대한 차폐성 등에 따라 적당히 선택되어 사용된다.
예를 들어, 스퍼터링법, 진공 증착법 등에 의해 두께 1000 ∼ 2000Å 정도의 크롬 등의 금속 박막을 형성하고, 이 박막을 패터닝함으로써 형성되어도 된다. 이 패터닝 방법으로는 스퍼터 등의 통상의 패너팅 방법을 사용할 수 있다.
또한, 수지 바인더 중에 카본 미립자, 금속 산화물, 무기 안료, 유기 안료 등의 차광성 입자를 함유시킨 층을 패턴상으로 형성하는 방법이어도 된다. 사용되는 수지 바인더로는 폴리이미드 수지, 아크릴 수지, 에폭시 수지, 폴리아크릴아미드, 폴리비닐알코올, 젤라틴, 카세인, 셀룰로오스 등의 수지를 1 종 또는 2 종 이상 혼합한 것이나, 감광성 수지, 또한 O/W 에멀전형의 수지 조성물, 예를 들어 반응성 실리콘을 에멀전화한 것 등을 사용할 수 있다. 이러한 수지제 차광부의 두께로는 0.5 ∼ 10㎛ 의 범위내에서 설정할 수 있다. 이와 같은 수지제 차광부의 패터닝 방법은 포토리소그래피법, 인쇄법 등 일반적으로 사용되고 있는 방법을 사용할 수 있다.
또, 상기 설명에 있어서는, 광촉매 함유층측 차광부의 형성 위치로서 기체와 광촉매 함유층의 사이, 및 광촉매 함유층 표면의 2 개의 경우에 대하여 설명했지만, 그 외에 기체의 광촉매 함유층이 형성되어 있지 않은 측의 표면에 광촉매 함유층측 차광부를 형성하는 양태도 채택하는 것이 가능하다. 이 양태에 있어서는, 예를 들어 포토마스크를 이 표면에 착탈 가능한 정도로 밀착시키는 경우 등을 생각할 수 있고, 세포 접착성 변화 패턴을 작은 로트로 변경하는 경우에 바람직하게 사용할 수 있다.
d. 프라이머층
다음으로, 본 실시 양태의 광촉매 함유층측 기판에 사용되는 프라이머층에 대하여 설명한다. 본 실시 양태에 있어서, 상기 기술한 바와 같이 기체 상에 광촉매 함유층측 차광부를 패턴상으로 형성하고, 그 위에 광촉매 함유층을 형성하여 광촉매 함유층측 기판으로 하는 경우에 있어서는, 상기 광촉매 함유층측 차광부와 광촉매 함유층의 사이에 프라이머층을 형성해도 된다.
이 프라이머층의 작용·기능은 반드시 명확한 것은 아니지만, 광촉매 함유층측 차광부와 광촉매 함유층의 사이에 프라이머층을 형성함으로써, 프라이머층은 광촉매의 작용에 의한 세포 접착성 변화 재료층의 세포 접착성 변화를 저해하는 요인이 되는 광촉매 함유층측 차광부 및 광촉매 함유층측 차광부 사이에 존재하는 개구부로부터의 불순물, 특히 광촉매 함유층측 차광부를 패터닝할 때 생기는 잔류물이나, 금속, 금속 이온 등의 불순물의 확산을 방지하는 기능을 나타내는 것으로 생각된다. 따라서, 프라이머층을 형성함으로써, 고감도로 세포 접착성 변화의 처리가 진행되고, 그 결과, 고해상도의 패턴을 얻는 것이 가능해지는 것이다.
또, 본 실시 양태에서 프라이머층은 광촉매 함유층측 차광부 뿐만 아니라 광촉매 함유층측 차광부 사이에 형성된 개구부에 존재하는 불순물이 광촉매의 작용에 영향을 주는 것을 방지하는 것이기 때문에, 프라이머층은 개구부를 포함시킨 광촉매 함유층측 차광부 전체면에 걸쳐 형성되어 있는 것이 바람직하다.
본 실시 양태에 있어서의 프라이머층은 광촉매 함유층측 기판의 광촉매 함유층측 차광부와 광촉매 함유층이 접촉하지 않도록 프라이머층이 형성된 구조이면 특별히 한정되는 것은 아니다.
이 프라이머층을 구성하는 재료로는 특별히 한정되는 것은 아니지만, 광촉매의 작용에 의해 분해되기 어려운 무기 재료가 바람직하다. 구체적으로는 무정형 실리카를 들 수 있다. 이와 같은 무정형 실리카를 사용하는 경우에는 이 무정형 실리카의 전구체는 일반식 SiX4 로 나타나고, X 는 할로겐, 메톡시기, 에톡시기 또는 아세틸기 등인 규소 화합물이고, 그들의 가수 분해물인 실란올, 또는 평균 분자량 3000 이하의 폴리실록산이 바람직하다.
또한, 프라이머층의 막두께는 0.001㎛ 내지 1㎛ 의 범위내인 것이 바람직하고, 특히 0.001㎛ 내지 0.1㎛ 의 범위내인 것이 바람직하다.
(2) 에너지 조사
다음으로, 본 공정에서의 에너지 조사에 대하여 설명한다. 본 실시 양태에 있어서는 상기 세포 접착성 변화 재료층과, 상기 광촉매 함유층측 기판에 있어서의 광촉매 함유층을 대향하도록 배치하고, 소정의 방향으로부터 에너지를 조사함으로써, 세포 접착성 변화 재료층의 세포 접착성이 변화한 패턴을 형성할 수 있다.
상기 배치란, 실질적으로 광촉매의 작용이 세포 접착성 변화 재료층 표면에 미치는 상태로 배치된 상태를 의미하는 것으로 하고, 실제로 물리적으로 접촉하고 있는 상태 외에, 소정의 간격을 두고 상기 광촉매 함유층과 세포 접착성 변화 재료층이 배치된 상태로 한다. 이 틈은 200㎛ 이하인 것이 바람직하다.
본 실시 양태에 있어서 상기 틈은 패턴 정밀도가 매우 양호하고, 광촉매의 감도도 높고, 따라서 세포 접착성 변화 재료층의 세포 접착성 변화의 효율이 양호한 점을 고려하면, 특히 0.2㎛ ∼ 10㎛ 의 범위내, 바람직하게는 1㎛ ∼ 5㎛ 의 범위내로 하는 것이 바람직하다. 이러한 틈의 범위는 특히 틈을 높은 정밀도로 제어하는 것이 가능한 소면적의 세포 접착성 변화 재료층에 대하여 특히 유효하다.
한편, 예를 들어 300㎜ × 300㎜ 이상과 같은 대면적의 세포 접착성 변화 재료층에 대하여 처리하는 경우에는 접촉하지 않고, 또한 상기 기술한 미세한 틈을 광촉매 함유층측 기판과 세포 접착성 변화 재료층의 사이에 형성하는 것은 매우 곤란하다. 따라서, 세포 접착성 변화 재료층이 비교적 대면적인 경우에는 상기 틈은 10 ∼ 100㎛ 의 범위내, 특히 10 ∼ 20㎛ 의 범위내로 하는 것이 바람직하다. 틈을 이러한 범위내로 함으로써, 패턴이 희미해지는 등의 패턴 정밀도의 저하의 문제나, 광촉매의 감도가 악화되어 세포 접착성 변화의 효율이 악화되는 등의 문제가 생기지 않고, 또한 세포 접착성 변화 재료층 상의 세포 접착성 변화에 편차가 발생하지 않는 등의 효과를 갖기 때문이다.
이와 같이 비교적 대면적의 세포 접착성 변화 재료층을 에너지 조사할 때에는 에너지 조사 장치내의 광촉매 함유층측 기판과 세포 접착성 변화 재료층의 위치 결정 장치에 있어서의 틈의 설정을 10㎛ ∼ 200㎛ 의 범위내, 특히 10㎛ ∼ 20㎛ 의 범위내로 설정하는 것이 바람직하다. 설정값을 이러한 범위내로 함으로써, 패턴 정밀도의 대폭적인 저하나 광촉매의 감도의 대폭적인 악화를 초래하지 않고, 또한 광촉매 함유층측 기판과 세포 접착성 변화 재료층이 접촉하지 않고 배치하는 것이 가능해지기 때문이다.
이와 같이 광촉매 함유층과 세포 접착성 변화 재료층 표면을 소정의 간격으로 거리를 두고 배치함으로써, 산소와 물 및 광촉매 작용에 의해 생긴 활성 산소종이 탈착하기 쉬워진다. 즉, 상기 범위보다 광촉매 함유층과 세포 접착성 변화 재료층의 간격을 좁게 한 경우에는 상기 활성 산소종이 탈착되기 어려워지고, 결과적으로 세포 접착성 변화 속도를 느리게 할 가능성이 있어 바람직하지 않다. 또한, 상기 범위보다 간격을 두고 배치한 경우에는 생긴 활성 산소종이 세포 접착성 변화 재료층에 닿기 어려워지고, 이 경우에도 세포 접착성 변화의 속도를 느리게 할 가능성이 있어 바람직하지 않다.
이러한 매우 좁은 틈을 균일하게 형성하여 광촉매 함유층과 세포 접착성 변화 재료층을 배치하는 방법으로는, 예를 들어 스페이서를 사용하는 방법을 들 수 있다. 그리고, 이와 같이 스페이서를 사용함으로써, 균일한 틈을 형성할 수 있음과 함께, 이 스페이서가 접촉하는 부분은 광촉매의 작용이 세포 접착성 변화 재료층 표면에 미치지 않으므로, 이 스페이서를 상기 기술한 세포 접착성 변화 패턴과 동일한 패턴을 갖는 것으로 함으로써, 세포 접착성 변화 재료층 상에 소정의 세포 접착성 변화 패턴을 형성하는 것이 가능해진다.
본 실시 양태에 있어서는, 이러한 배치 상태는 적어도 에너지를 조사하는 동안에만 유지되면 된다.
여기에서, 조사되는 에너지의 종류나, 조사 방법, 조사량 등에 대해서는 상기 기술한 제 1 실시 양태에서 설명한 것과 동일하다.
또, 본 발명은 상기 실시 형태에 한정되는 것은 아니다. 상기 실시 형태는 예시이고, 본 발명의 특허 청구의 범위에 기재된 기술적 사상과 실질적으로 동일한 구성을 가지며, 동일한 작용 효과를 나타내는 것은 어떠한 것이어도 본 발명의 기술적 범위에 포함된다.
Ⅲ. 세포 접착 기재
본 발명의 세포 배양 방법은 세포 배열용 기재에 세포가 패턴상으로 접착되어 이루어지는 세포 접착 기재를 세포 배양용 기재와 밀착시켜 세포 배열용 기재에 접착하고 있는 세포를 세포 배양용 기재 상에 패턴화된 상태로 전사하는 공정을 포함한다. 이하에 세포 접착 기재로부터의 세포 전사 공정 및 배양 공정에 대하여 설명한다.
예를 들어, 하나의 양태로서 개요를 도 7 에 나타내면, 세포 접착성 양호 영역 (17) 과 세포 접착성 저해 영역 (18) 이 패턴상으로 형성된 세포 배열용 기재 (15) 에 세포를 파종하여 세포를 패턴상으로 접착시킴으로써 세포 접착 기재로 한다. 이어서 이 세포 접착 기재를 세포 배양용 기재 (16) 에 밀착시키고 세포를 전사하여 배양한다. 그리고 필요에 따라 세포 자극 인자 (22) 로 세포를 자극한다.
다음으로, 본 발명의 세포 접착 기재에 대하여 설명한다. 본 발명의 세포 접착 기재는 도 13(c) 에 나타내는 바와 같이, 기재 상에 세포 접착성 양호 영역과 세포 접착성 저해 영역으로 이루어지는 세포 접착성이 다른 영역이 패턴화된 세포 접착성 변화 패턴을 갖는 상기 세포 배열용 기재의 세포 접착성 양호 영역에 세포가 접착되어 있는 것이다.
본 발명에 의한 세포 접착 기재의 작성 방법의 순서를 도 12 에, 이 순서의 각 단계마다의 세포 접착 기재의 상태를 도 13 에 나타낸다. 본 발명의 세포 배열용 기재는 상기와 같이 세포 접착성 양호 영역과 세포 접착성 저해 영역으로 이루어지는 세포 접착성 변화 패턴을 갖는 것이므로, 도 13(a) 에 나타내는 바와 같이, 세포 배열용 기재의 표면에 세포를 균일하게 뿌리고 (단계 1), 도 13(b) 에 나타내는 바와 같이, 일정 시간 세포를 배양하고 (단계 2), 세포 접착성 저해 영역에 있는 여분의 세포를 제거하기 위해 세정하면 (단계 3), 도 13(c) 에 나타내는 바와 같이 세포 접착성 양호 영역에는 세포가 접착하고 있지만, 세포 접착성 저해 영역에는 세포가 접착하고 있지 않은 세포 패턴이 형성된 세포 접착 기재가 얻어진다.
본 발명의 세포 접착 기재 상의 패턴은 특별히 한정되지 않지만, 사용 목적이나 사용 대상에 따라 결정된다. 예를 들어, 모세 혈관망이나 신경망에 대해서는 인공적으로 설계된 패턴이어도 되고, 실제로 생체내에 있는 패턴을 기초로 설계된 패턴이어도 된다. 예를 들어 피이식 대상의 크기나 형태에 따라 임의로 설계된 패턴이어도 된다. 세포 접착성 양호 영역의 주위 전체나 일부에 세포 접착성 저해 영역을 갖는 단순한 패턴도, 시술자가 사용하기 편하다는 관점에서 바람직한 예로서 들 수 있다. 세포가 접착하고 있지 않은 영역이 적당한 면적으로 존재하면, 당해 영역을 의료 기구 등으로 집을 수 있기 때문에, 시술하거나 다음 공정으로 옮길 때에 유리하다.
세포 배열용 기재에 파종하는 세포는 특별히 제한되지 않지만, 본 발명은 접착성을 갖는 세포에 대하여 바람직하게 사용된다. 그와 같은 세포로는, 예를 들어 간장의 실질 세포인 간세포, 혈관 내피 세포나 각막 내피 세포 등의 내피 세포, 섬유아세포, 표피 각화 세포 등의 표피 세포, 기관 상피 세포, 소화관 상피 세포 및 자궁 경부 상피 세포 등의 상피 세포, 유선 세포, 평활근 세포 및 심근 세포 등의 근세포, 신장 세포, 췌장 란겔한스씨도 세포, 말초 신경 세포 및 시신경 세포 등의 신경 세포, 연골 세포, 골세포 등을 들 수 있다. 본 발명은 혈관 내피 세포에 대하여 특히 바람직하게 사용된다. 혈관 내피 세포는 기존의 혈관으로부터 단리·배양한 세포이어도 되고, 배양 하에서 혈관 내피 세포로 분화시킨 것이어도 된다. 기존의 혈관이란 구체적으로는 경동맥, 제대 정맥, 체망 중의 혈관 등 대혈관으로부터 미소 혈관까지를 포함하고, 배양 하에서 내피 세포로 분화시키는 세포로는 골수 및 제대혈이나 말초혈에 존재하는 혈관 내피 세포 전구 세포나 지방 세포, ES 세포 등을 들 수 있다.
이들 세포를 세포 배양용 기재에 전사하여 배양함으로써 기능화하는 목적에 맞춰 적당한 세포를 선택할 수 있다. 이들 세포는 조직이나 기관으로부터 직접 채취한 초대 세포이어도 되고, 또는 그들을 몇 대 계대시킨 것이어도 된다. 또한, 본 발명에 있어서 배양하는 세포는 미분화 세포인 ES 세포, 다분화능을 갖는 다기능성 줄기 세포, 단분화능을 갖는 단일기능성 줄기 세포, 분화가 종료된 세포의 어느것이어도 된다.
목적으로 하는 세포를 포함하는 배양 시료는 미리 생체 조직을 미세하게 하여 액체 중에 분산시키는 분산 처리나, 생체 조직 중의 목적으로 하는 세포 이외의 세포, 기타 세포 파편 등의 불순 물질을 제거하는 분리 처리 등을 해 두는 것이 바람직하다.
세포 배열용 기재로의 세포의 파종에 앞서 목적으로 하는 세포를 포함하는 배양 시료를 미리 각종 배양 방법으로 예비 배양하고, 목적으로 하는 세포를 늘리는 것이 바람직하다. 예비 배양에는 단층 배양, 코트 접시 배양, 겔상 배양 등의 통상의 배양 방법을 채용할 수 있다. 예비 배양에 있어서, 세포를 지지체 표면에 접착시켜 배양하는 방법의 하나로 이른바 단층 배양법으로서 이미 알려져 있는 수단이 있다. 구체적으로는, 예를 들어 배양 용기에 배양 시료와 배양액을 수용하여 일정한 환경 조건으로 유지해 둠으로써, 특정한 생세포만이 배양 용기 등의 지지체 표면에 접착한 상태로 증식한다. 사용하는 장치나 처리 조건 등은 통상의 단층 배양법 등에 준하여 실시한다. 세포가 접착하여 증식하는 지지체 표면의 재료로서 폴리리신, 폴리에틸렌이민, 콜라겐 및 젤라틴 등의 세포의 접착이나 증식이 양호하게 실시되는 재료를 선택하거나, 유리 샬레, 플라스틱 샬레, 슬라이드 유리, 커버 유리, 플라스틱 시트 및 플라스틱 필름 등의 지지체 표면에 세포의 접착이나 증식이 양호하게 실시되는 화학 물질, 이른바 세포 접착 인자를 도포해 두는 것도 실시된다.
배양후에 배양 용기 중의 배양액을 제거함으로써, 배양 시료 중의 지지체 표면에 접착하지 않는 괴상이나 섬유상의 불순물 등의 불필요 성분이 제거되고, 지지체 표면에 접착한 생세포만을 회수할 수 있다. 지지체 표면에 접착한 생세포의 회수에는 EGTA-트립신 처리 등의 수단을 적용할 수 있다.
상기와 같이 예비 배양한 세포를 도 13(a) 에 나타내는 바와 같이, 배양액 중의 세포 배열용 기재 상에 파종한다. 세포의 파종 방법이나 파종량에 대해서는 특별히 제한은 없고, 예를 들어 아사쿠라 서점 발행 「일본 조직 배양 학회편 조직 배양의 기술 (1999년)」 266 ∼ 270 페이지 등에 기재되어 있는 방법을 사용할 수 있다. 세포를 세포 배열용 기재 상에서 증식시킬 필요가 없을 정도로 충분한 양으로, 세포가 단층으로 접착하도록 파종하는 것이 바람직하다. 통상, 배양액 1㎖ 당 104 ∼ 106 개의 오더로 세포가 포함되도록 파종하는 것이 바람직하고, 또한 기재 1㎠ 당 104 ∼ 106 개의 오더로 세포가 포함되도록 파종하는 것이 바람직하다. 세포가 응집하면 세포의 조직화가 저해되고, 세포 배양용 기재에 전사하여 배양해도 기능이 저하되기 때문이다. 구체적으로는 400㎟ 당 2 × 105 개 정도로 파종한다.
세포를 파종한 세포 배열용 기재를 배양액 중에서 배양함으로써, 세포를 세포 접착성 양호 영역에 접착시키는 것이 바람직하다. 배양액으로는 당 기술 분야에서 통상 사용되는 배지를 사용할 수 있고, 예를 들어 사용하는 세포의 종류에 따라 MEM 배지, BME 배지, DME 배지, αMEM 배지, IMEM 배지, ES 배지, DM-160 배지, Fisher 배지, F12 배지, WE 배지 및 RPMI 배지 등 아사쿠라 서점 발행 「일본 조직 배양 학회편 조직 배양의 기술 제3판」 581 페이지에 기재된 기초 배지를 사용할 수 있다. 또한, 이들 배지에 혈청 성분 (소 태아 혈청 등) 등을 첨가한 것, 및 Gibco 무혈청 배지 (인비트로젠사) 등의 시판되는 무혈청 배지 등을 사용할 수 있다.
도 13(b) 에 나타내는 바와 같이, 세포를 배양하는 공정은 세포 배열용 기재의 세포 접착성 양호 영역에 세포를 접착하는 것을 목적으로 한다. 배양하는 시간은 통상 18 ∼ 30 시간, 바람직하게는 20 ∼ 24 시간이다. 적당한 시간으로 배양함으로써, 씻어 냈을 때 세포 배열용 기재의 세포 접착성 저해 영역의 세포가 흐름과 함께, 세포 접착성 양호 영역의 세포는 적절한 접착력으로 세포 배열용 기재 상에 남기 때문에, 남은 세포를 세포 배양용 기재에 용이하게 전사하는 것이 가능하게 된다.
배양하는 온도는 통상 37℃ 이다. CO2 세포 배양 장치 등을 이용하여 CO2 분위기 하에서 배양하는 것이 바람직하다. 배양한 후, 세포 배열용 기재를 세정함으로써, 접착하고 있지 않은 세포가 씻겨 나가고, 세포가 패턴상으로 배열된 본 발명의 세포 접착 기재를 제작할 수 있다.
세포 배열용 기재에 있어서, 패턴상으로 배열하고자 하는 세포마다 최적인 세포 접착성을 갖는 영역이 형성된 세포 접착성 변화 패턴으로 함으로써, 복수종의 세포를 동일한 세포 배열용 기재 상에서 목적으로 하는 패턴으로 접착시킬 수도 있다.
Ⅳ. 세포의 전사 및 배양
본 발명에 의한 세포의 전사 및 배양 방법의 순서를 도 14 에, 이 순서의 각 단계마다의 세포 접착 기재 및 세포 배양용 기재의 상태를 도 15 에 나타낸다.
도 15(a) 에 나타내는 바와 같이, 세포 배열용 기재의 세포 접착성 양호 영역에 세포가 접착하고 있는 세포 접착 기재를 세포 배양용 기재의 세포 배양층에 밀착시킨다 (단계 4). 이어서, 도 15(b) 에 나타내는 바와 같이, 세포를 배양함으로써 세포 배양용 기재의 세포 배양층에 세포를 접착시킨다 (단계 5). 또한, 세포의 세포 접착성 양호 영역으로의 접착력은 세포 배양층으로의 접착력에 비교하여 크므로, 도 15(c) 에 나타내는 바와 같이, 세포 배열용 기재를 세포 배양용 기재로부터 박리하면, 세포 배양용 기재에 세포가 전사된다 (단계 6). 이 전사된 세포를 추가로 배양하면, 도 15(d) 에 나타내는 바와 같이 세포가 기능화되고, 혈관 내피 세포이면 고리형 구조가 재현된다 (단계 7).
세포가 전사되는 세포 배양용 기재로는 세포를 접착 가능하고 또한 배양 가능한 것이면 특별히 제한되지 않지만, 세포 배열용 기재에 있어서 세포가 접착하고 있는 세포 접착성 양호 영역보다 세포에 대한 접착성이 강한 세포 배양층을 갖는 것이 바람직하다. 예를 들어, 세포의 조직화를 안정적으로 실시하기 위해서는 세포 배양용 기재의 표면이 부드럽고, 또한 세포 피접착성이 너무 높지 않은 것이 바람직한 것이 다음의 참고 문헌에 나타나 있다. Mechanochemical switching between growth and differentiation during fibroblast growth factor-stimulated angiogenesis in vitro : Role of extracellular matrix. Donald E.Ingber 외, J. of cell biol. (1989) p.317.
세포가 접착 가능하고 또한 배양 가능한 세포 배양용 기재로는 콜라겐 시트 등을 사용할 수 있다. 또한, 후술하는 세포 배양층을 형성하는 경우에는 세포 배양층 상의 세포의 배양을 저해하지 않는 재료이면 되고, 예를 들어 유리, 폴리스티렌, 폴리에틸렌테레프탈레이트, 폴리카보네이트, 폴리이미드 등을 사용할 수 있다. 세포 배열용 기재에 사용되는 기재에 대하여 예시한 것을 사용할 수도 있다.
세포 배양층은 그 표면에 세포의 접착이나 증식이 양호하게 행해지는 화학 물질이나 세포 접착 인자를 포함하는 것이 바람직하다. 구체적으로는 각종 타입의 콜라겐, 피브로넥틴, 라미닌, 비트로넥틴, 카드헤린, 젤라틴, 펩티드 및 인테그린 등의 세포외 기질을 들 수 있고, 이들은 1 종만을 사용해도, 2 종 이상 병용해도 된다. 세포 접착성이 높다는 점에서, 각종 콜라겐을 사용하는 것이 보다 바람직하고, 각종 콜라겐 중에서도 타입 I 콜라겐이나 타입 Ⅳ 콜라겐을 사용하는 것이 특히 바람직하다. 골아(骨芽) 세포 등의 세포외 기질 생성 세포를 배양하여 세포외 기질을 생성시킴으로써 세포 배양층을 형성할 수도 있다.
세포 배양용 기재의 형상은 특별히 한정되지 않고, 세포를 전사할 수 있는 표면을 구비하고 있으면 된다. 예를 들어, 페트리 접시나 멀티 접시 등의 배양 접시를 사용할 수 있다. 또한, 유리나 상기 기술한 플라스틱으로 이루어지는 배양 플레이트를 사용할 수도 있다.
세포 접착 기재로부터 세포 배양용 기재로의 세포의 전사는 세포 접착 기재의 세포 접착면과 세포 배양용 기재의 표면, 예를 들어 세포 배양층을 접촉시킴으로써 실시할 수 있다. 이와 같이 세포 접착 기재와 세포 배양용 기재를 접촉시킨 상태에서 배양함으로써 세포를 전사할 수 있다. 배양은 통상 CO2 농도 5%, 37℃ 에서 3 ∼ 96 시간 실시한다.
그 후, 배양액 중에서 세포 배양하는데, 세포 접착 기재와 세포 배양용 기재를 접촉시킨 상태에서 세포 배양해도 되고, 세포 접착 기재를 제거하고 세포 배양용 기재만으로 세포 배양해도 된다. 세포 접착 기재와 세포 배양용 기재를 접촉시킨 상태에서 일정 시간 세포 배양한 후, 세포 접착 기재를 제거하고 추가로 세포 배양하는 것이 바람직하다. 배양 조건으로는 특별히 제한은 없고, 배양하는 세포종에 따라 선택할 수 있다. 배양액으로는 상기와 동일한 것을 사용할 수 있다.
본 발명의 세포 접착 기재는 패턴상으로 접착하고 있는 세포를 세포 배양용 기재에 패턴화된 상태에서 용이하게 전사할 수 있음과 함께, 전사한 후에는 세정하여 다시 세포를 파종하는 세포 배열용 기재로 할 수 있으므로, 다시 세포 패턴을 형성하고, 이것을 전사하여 배양할 수 있다. 따라서, 종래 기술과 같이 세포를 패턴상으로 배양하기 위한 패턴 형성된 배양 기재를 배양할 때마다 작성할 필요가 없고, 패턴을 갖지 않는 통상의 배양 기재에 전사하는 것 만으로 세포를 패턴상으로 배열시킬 수 있다. 따라서, 세포 패턴을 저렴하게 또한 효율적으로 작성할 수 있다. 또한, 세포 배양용 기재에는 특별한 패턴을 형성시킬 필요가 없기 때문에, 세포 배양을 위해 통상 사용되는 것을 사용할 수 있고, 재료 선택의 폭도 넓어짐과 함께, 현상액 등의 세포에 있어서 유해한 물질의 영향을 받지도 않는다.
본 발명의 세포 배양용 기재에는 생체 재료도 포함된다. 생체 재료란 생체 유래의 재료를 의미하고, 예를 들어 생체 유래의 조직 및 기관 등이 포함된다. 구체적으로는 폐, 심장, 간장, 신장, 뇌, 위, 소장, 대장 등의 장기, 뼈, 연골, 피부, 근육, 안구, 혀, 복막 등의 조직 등을 들 수 있다. 또한, 세포 시트나 스페로이드 등의 세포 집합체도 또한 세포 배양 기재로서 사용할 수 있다. 세포 집합체를 구성하는 세포로는 세포외 기질을 생성하는 세포, 예를 들어 간질계 세포, 상피 세포, 실질 세포 등을 들 수 있다. 구체적으로는 골아 세포, 섬유아세포, 간 실질 세포, 피더세포 등의 집합체를 바람직하게 사용할 수 있다.
세포 배열용 기재 상의 세포를 이들 생체 재료에 직접 전사함으로써, 조직 및 기관 상에서 직접 세포를 패턴상으로 배양할 수 있다. 세포가 전사되는 생체 재료와 그 생체 재료에 전사되어 배양되는 세포의 조합으로는, 예를 들어 간장과 혈관 내피 세포, 진피와 혈관 내피 세포, 골아 세포층과 혈관 내피 세포, 섬유아세포층과 간 실질 세포, 내피 세포층과 간 실질 세포, 피더세포층과 각막 상피 세포를 들 수 있다.
이러한 양태에 있어서는, 기관 등의 생체 재료에 직접 세포를 전사하여 배양할 수 있으므로, 종래 기술과 같이 세포 배양용의 담체로부터 세포를 효소 처리 등에 의해 벗겨 회수할 필요가 없어 세포의 손상을 방지할 수 있다. 이와 같이 생체 조직 및 기관 상에 형성된 세포 조직도 역시 본 발명의 범위에 포함된다.
장기 이식에 있어서는, 이식후, 당해 장기의 표면에 모세 혈관이 형성되는데, 이 모세 혈관을 이식하는 장기의 표면에 미리 형성시키고 나서 이식함으로써, 이식을 효과적으로 실시하는 기술이 알려져 있다. 그러나, 이식전에 모세 혈관을 형성하고 이것을 장기 표면에 부착시키는 종래 기술의 방법에서는 모세 혈관의 작성에 시간이 걸려 신속한 이식이 불가능하다. 또한, 배양용 기재 등으로 미리 형성한 혈관을 기재로부터 벗겨 장기 표면에 옮길 때 조직이 손상된다. 본 발명의 방법에서는 세포 접착 기재에 패턴상으로 배치된 세포를 장기 표면에 전사한 후, 모세 혈관이 완전히 형성되는 것을 기다리지 않고 이식할 수 있기 때문에, 신속한 이식이 가능하게 된다. 장기 표면에 선상 또는 그물코상으로 전사된 혈관 내피 세포는 조직화되기 쉬우므로, 체내에 있어서의 모세 혈관의 형성이 촉진된다. 또한, 본 발명에서는 세포를 옮길 때, 세포 배열용 기재로부터 세포를 벗기기 위한 처리가 필요 없기 때문에, 조직의 손상이 문제가 되는 경우도 없다.
본 발명은 또한 피검체 유래의 세포를 본 발명의 세포 배열용 기재에 패턴상으로 접착한 후, 이것을 피검체의 생체 조직, 예를 들어 상기와 같은 장기, 피부 및 뼈 등의 표면에 패턴화된 상태로 전사하고, 그 세포를 증식시킴으로써 피검체의 조직을 재생하는 방법에 관한 것이다.
피검체로는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 포유 동물을 들 수 있고, 바람직하게는 인간을 들 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법에 의해 진피 섬유아세포나 상피 세포를 생체에 있어서의 피부 손상 부분에 직접 전사하여 세포를 증식시킴으로써, 피검체에서 피부 조직을 재생할 수 있다. 또한, 피검체에 있어서 피부가 손상된 부분에 혈관 내피 세포를 패턴상으로 전사하여 증식시킴으로써 모세 혈관을 형성시키고, 피부의 재생을 촉진하는 것도 가능하다. 또한, 신경 세포를 패턴상으로 배열하여 배양함으로써, 신경 회로나 신경 세포 컴퓨터를 작성하는 것도 가능하게 된다.
전사한 세포의 배양에 있어서는 필요에 따라 세포 자극 인자를 첨가함으로써, 세포 활성을 높이거나, 세포가 본래 갖는 기능을 발현시켜 조직화를 촉진할 수 있다. 세포 자극 인자로는 세포의 조직화를 촉진하는 활성을 갖는 물질이면 어느것이나 사용할 수 있고, 예를 들어 혈관 내피 세포 증식 인자 (DEGF), 섬유아세포 증식 인자 (FGF), 신경 성장 인자 (NGF), 상피 세포 증식 인자 (EGF), 인슐린 유사 증식 인자 (IGF) 등을 들 수 있다.
도 1 은 본 발명의 세포 배열용 기재의 제조 방법의 일례를 나타내는 공정도이다.
도 2 는 본 발명의 세포 배열용 기재의 제조 방법의 다른 예를 나타내는 공정도이다.
도 3 은 본 발명의 세포 배열용 기재의 제조 방법의 다른 예를 나타내는 공정도이다.
도 4 는 본 발명에 있어서의 광촉매 함유층측 기판의 일례를 나타내는 개략 단면도이다.
도 5 는 본 발명에 있어서의 광촉매 함유층측 기판의 다른 예를 나타내는 개략 단면도이다.
도 6 은 본 발명에 있어서의 광촉매 함유층측 기판의 다른 예를 나타내는 개략 단면도이다.
도 7 은 본 발명의 방법의 일례를 나타내는 개략도이다.
도 8 은 본 발명의 방법의 일례를 나타내는 개략도이다.
도 9 는 세포 배열용 기재에 배열된 세포를 나타내는 사진이다.
도 10 은 본 발명에 의해 형성된 세포 조직을 나타내는 사진이다.
도 11 은 본 발명에 의해 형성된 세포 조직을 나타내는 사진이다.
도 12 는 본 발명에 의한 세포 접착 기재의 작성 방법의 순서를 나타낸다.
도 13 은 도 12 에 나타내는 순서의 각 단계마다의 세포 접착 기재의 상태를 나타낸다.
도 14 는 본 발명에 의한 세포의 전사 및 배양 방법의 순서를 나타낸다.
도 15 는 도 14 에 나타내는 순서의 각 단계마다의 세포 접착 기재 및 세포 배양용 기재의 상태를 나타낸다.
* 부호의 설명*
1 : 기재
2 : 광촉매 함유 세포 접착성 변화층
3 : 패턴 형성체용 기재
4 : 포토마스크
5 : 에너지
6 : 세포 접착성 변화 패턴
15 : 세포 배열용 기재
16 : 세포 배양용 기재
17 : 세포 접착성 양호 영역
18 : 세포 접착성 저해 영역
19 : 세포
20 : 발수성 재료
21 : 세포 접착 재료
본 명세서는 본원의 우선권의 기초인 일본 특허출원 2003-358397호의 명세서 및 도면에 기재된 내용을 포함한다.
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
이하, 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명하는데, 본 발명은 이 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
플루오로알킬실란 TSL8233 (GE 도시바 실리콘) 1.5g, 테트라메톡시실란 TSL8114 (GE 도시바 실리콘) 5.0g, 5.0 × 10-3 NHCl 2.4g 을 12 시간 혼합하고, 이것을 이소프로필알코올로 10 배 희석하였다.
다음으로, 이 용액 2.0g 을 1000rpm, 5 초로 스핀코터에 의해 10㎝ × 10㎝ 의 소다 유리 기재에 도포하고, 그 기재를 150℃ 의 온도에서 10 분간 건조시켰다.
다음으로, 이소프로필알코올로 3 배 희석한 산화 티탄졸액 (이시하라 산업 STK-03) 3.0g 을 광촉매 함유층용 조성물로 하였다.
상기 광촉매 함유층용 조성물을 폭 60㎛ 의 라인부 및 폭 300㎛ 의 스페이스부가 교대로 배치된 라인 & 스페이스의 네가티브형 포토마스크 (석영) 의 패턴면 상에 스핀코터에 의해 700rpm, 3 초로 도포하고, 150℃ 에서 10 분간 건조 처리함으로써, 투명한 광촉매 함유층을 갖는 포토마스크를 형성하였다.
상기 포토마스크의 광촉매 함유층면과 상기 기재의 세포 접착성 변화 재료층면을 10㎛ 의 틈으로 배치하고, 포토마스크측으로부터 수은 램프 (파장 365㎚) 에 의해 25.0mW/㎠ 의 조도로 소정 시간 자외선 노광하고, 폭 60㎛ 의 라인상의 세포 접착성 양호 영역 및 폭 300㎛ 의 세포 접착성 저해 영역의 스페이스가 교대로 배치된 세포 접착성 변화 패턴을 갖는 세포 배열용 기재를 얻었다.
이어서, 이 세포 배열용 기재의 노광 부분의 수접촉각을 접촉각계 (쿄와 계면 과학) 로 측정하였다.
또, 미리 배양한 소 대동맥 혈관 내피 세포를 세포 배열용 기재에 파종하고, 세포 접착성 양호 영역으로의 세포 접착성을 관찰하였다. 세포 배열용 기재 상부로부터 사진 촬영한 결과 (노광 시간 360 초인 것) 를 도 9 에 나타낸다.
각 노광 시간에 있어서의 수접촉각 및 노광 부분의 세포 접착성의 평가 결과를 이하의 표 1 에 나타낸다.
노광 시간 (초) 수접촉각 (°) 세포 접착
0 112.5 ×
120 62.3 ×
150 43.5 ×
180 39.8 △
240 34.0 △
360 23.9 ○
480 18.7 ○
600 15.4 ○
720 13.0 ××
900 ※ 측정 불가 ××
× 세포는 접착하지 않는다.
△ 세포는 단층 접착하지만 접착 밀도는 낮다.
○ 세포가 단층 또한 고밀도로 접착한다.
×× 세포는 접착하지만 단층이 아니라 입상으로 접착하고, 또한 비노광부로의 세포 접착도 많다.
※ 수접촉각이 매우 작기 때문에 측정 불가
이상의 결과로부터, 세포 접착 영역에서의 수접촉각이 10 ∼ 40°인 경우에 바람직한 세포 접착성이 얻어지는 것을 알았다.
실시예 2
배양 세포로서 소 경동맥 유래 혈관 내피 세포 (Onodera M, Morita I, Mano Y, Murota S : Differential effects of nitric oxide on the activity of prostaglandin endoperoxide h synthase-1 and -2 in vascular endothelial cells, Prostag Leukotress 62 : 161-167, 2000) 로 계대수 10 대 내지 17 대인 것을 사용하였다.
10㎝ 접시에서 융합 상태가 된 소 경동맥 유래 혈관 내피 세포를 0.05% 트립신-EDTA 처리하여 벗겼다. 컬터 카운터TM ZM (Coulter Counter) 로 세포수를 조사하고, 106개/㎖ 로 하였다. 실시예 1 에서 작성한 세포 배열용 기재 (노광 시간 360 초인 것) 를 오토클레이브로 멸균하였다. 이 세포 배열용 기재가 놓여 있는 배양 접시 (Heraeus QuadripremTM 76 × 26㎜, 1976㎟) 에 상기 내피 세포를 1 웰당 106개/5㎖ 로 뿌리고, 24 시간 CO2 세포 배양 장치에서 배양하였다.
새로운 배양 접시에 Growth Factor Reduced MatrigelTM 매트릭스 (BD Biosciences) (상온에서 경화) 를 섭씨 4 도의 상태로 0.5 ∼ 0.8㎖ 적하하고, 실온에서 수분 방치하여 세포 배양용 기재를 작성하였다. 혈관 내피 세포를 접착시킨 세포 배열용 기재의 세포 접착면과 상기 매트릭스가 접하도록 세포 배열용 기재를 세포 배양용 기재 상에 놓았다. 10 분간 CO2 세포 배양 장치 중에 넣었다. 이어서, 배양 접시를 꺼내고, 5㎖ 의 배양액 (5% 소 태아 혈청 함유 MEM 배지) 을 넣어 24 시간 배양하였다. 이 상태 그대로 핀셋으로 세포 배열용 기재를 제거하고, 추가로 1 ∼ 3 일간 배양하였다.
현미경으로 관찰하면, 세포가 패턴상으로 배치된 후, 관강 (管腔) 이 형성되어 있었던 것을 확인할 수 있었다. 사진 촬영한 결과를 도 10 및 도 11 에 나타낸다. 도 10 은 세포 배양용 기재 상의 세포 조직을 상부로부터 촬영한 것이다. 도 11 은 형성된 혈관 조직의 관의 단면도를 촬영한 것이고, 관 중앙의 흰 부분이 「관강」 이다.
실시예 3
불소계 코팅제 XC98-B2742 (GE 도시바 실리콘) 10g 을 이소프로필알코올로 10 배 희석하고, 추가로 고비점 용제로서 1,3-부탄디올을 5g 첨가하여 5 분 교반하였다.
이 용액을 A4 사이즈로 커트한 두께 150㎛ 의 폴리에스테르 필름 150-T60 (루미라, 도레) 에 스핀코팅하고, 그 후, 클린오븐에서 130℃, 10 분간 가열 처리하였다. 그 후, 물세정하고, 90℃ 에서 3 분간 건조시켰다.
한편, 폭 60㎛ 의 라인부 (개구부) 및 폭 300㎛ 의 스페이스부 (차광부) 가 교대로 배치되고, 또한, 이 라인 앤드 스페이스 패턴과 직교하는 폭 60㎛ 의 라인부 (개구부) 가 2.5㎝ 간격으로 형성된 네가티브형 포토마스크 (석영) 에 실시예 1 과 동일하게 광촉매층을 코팅하여 본 실시예에서 사용하는 광촉매 포토마스크를 작성하였다.
광촉매 포토마스크를 상기 코팅 처리된 필름의 코팅면 상에 그 광촉매면이 필름의 코팅면과 상대하도록 정치하였다. 포토마스크의 기재측으로부터, 노광기로부터 나오는 자외선을 12J·㎝-2 조사하고, 필름제 세포 배열용 기재를 작성하였다. 노광 시간은 7 분으로 하고, 얻어진 세포 배열용 기재의 세포 접착성 양호 영역에서의 수접촉각은 36.8°이었다.
실시예 4
인간 제대 정맥 내피 세포를 제대로부터 채취하여 배양하였다 (0.25% 트립신을 사용하고 분리하여 배양하였다). 본 실시예에서는 계대수 5 대까지의 배양 인간 제대 정맥 내피 세포를 사용하였다.
10㎝ 접시에서 융합 상태가 된 인간 제대 정맥 내피 세포를 0.05% 트립신-EDTA 처리하여 벗겼다. 컬터 카운터TM ZM (Coulter Counter) 로 세포수를 조사하고, 106개/㎖ 로 하였다. 실시예 3 에서 작성한 필름제 세포 배열용 기재를 오토클레이브로 멸균하고, 멸균 처리된 가위로 1.5㎝ × 2.5㎝ 사각으로 잘라 배양 기재의 소편을 얻었다. 이 때, 각 소편에 세포 접착성 부위의 라인 패턴의 크로스부가 들어가도록 잘랐다. 이 세포 배열용 기재를 배양 접시 (Heraeus QuadripremTM 76 × 26㎜) 에 배치하고, 상기 내피 세포를 1 웰당 106개/5㎖ 로 뿌리고, 24 시간 CO2 세포 배양 장치에서 배양하였다.
별도의 배양 접시에 Growth Factor Reduced MatrigelTM 매트릭스 (BD bioscience) 를 섭씨 4℃ 의 상태로 200㎕ 적하하고, 실온에서 수분 방치하여 세포 배양용 기재를 작성하였다. 전날에 인간 제대 정맥 내피 세포를 접착시켜 둔 세포 배열용 기재의 세포 접착면과 상기 매트릭스가 상대하도록 세포 배열용 기재를 세포 배양용 기재 상에 정치하였다. 2 분간 클린 벤치 내에서 방치하고, 2㎖ 의 배양액 (20% 소 태아 혈청 함유 RPMI 배지) 을 넣어 24 시간 배양하였다. 이 상태 그대로 핀셋으로 세포 배열용 기재만을 벗기고, 남은 세포를 추가로 1 ∼ 3 일 배양하였다.
현미경으로 관찰하면, 세포가 패턴상으로 배치된 후, 관강이 형성된 것을 확인할 수 있었다. 또, 크로스부의 세포 패턴도 유지되어 있었다. 형광 색소 용액을 인젝션한 결과, 관내를 색소 용액이 흐르는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 5
두께 25㎛ 의 폴리에스테르 필름 25-T60 (루미라, 도레) 을 사용한 것 이외에는 실시예 3 과 동일한 순서로 세포 배열용 기재를 작성하였다.
실시예 2 와 동일한 소 경동맥 유래 혈관 내피 세포를 사용하고, 실시예 2 와 동일하게 하여 세포 배열용 기재 상에서 배양하였다.
멸균 처리 하에서 누드 마우스 (태어난지 5 일 됨, ♂) 로부터 등부의 피부, 복막 및 간장을 각각 적출하고, 35㎜ 배양 접시에 넣고, 피부는 피하 조직, 간장은 장막을 박리하였다. 이들 적출 조직에 혈관 내피 세포를 접착시킨 세포 배열용 기재를 놓았다. 그 배양 접시에 3㎖ 의 배양액 (5% 소 태아 혈청 함유 MEM 배지) 을 넣고, 48 시간 배양하였다. 그 후 핀셋으로 세포 배열용 기재를 제거한 결과, 내피 세포는 모든 실험에 있어서 적출 조직 상에 유지되었다. 현미경 관찰한 결과, 적출 조직 상에 패턴상으로 관강이 형성되어 있는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 6
실시예 1 과 동일한 세포 배열용 기재를 사용하고, 실시예 2 와 동일하게 하여 소 경동맥 유래 혈관 내피 세포를 배양하였다.
새로운 배양 접시에 마우스 골아 세포 유사 세포 (MC3T3E1) 를 파종하고, 융합된 것을 확인한 후 추가로 2 일 이상 배양하고, 세포외 기질 생성을 촉진하였다. 혈관 내피 세포를 접착시킨 세포 배열용 기재의 세포 접착면과 상기 골아 세포가 접착하도록 세포 배열용 기재를 골아 세포 상에 놓았다. 5 분간 클린 벤치 내에서 방치하고, 5㎖ 의 배양액 (5% 소 태아 혈청 함유 MEM 배지) 을 넣어 48 시간 배양하였다. 이 상태 그대로 핀셋으로 세포 배열용 기재를 제거하고, 추가로 1 ∼ 3 일간 배양하였다.
현미경으로 관찰하면, 골아 세포 유사 세포층 상에 내피 세포가 패턴상으로 배치되고 또한 관강상을 되어 있는 것을 확인할 수 있었다.
본 명세서 중에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허 출원을 그대로 참고로서 본 명세서 중에 도입하는 것으로 한다.
본 발명에 의해 세포에 손상을 주지 않고 간편한 방법에 의해 세포를 미세한 패턴상으로 배열하여 배양할 수 있다.

Claims (17)

  1. 기재 상에 세포 접착성 양호 영역과 세포 접착성 저해 영역이 패턴화된 세포 접착성 변화 패턴을 갖는 세포 배열용 기재 표면에 세포를 접착시키는 공정, 접착한 세포를 세포 배양용 기재에 패턴화된 상태로 전사하는 공정, 및 전사된 세포를 배양하는 공정을 포함하는 세포 배양 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    세포 접착성 변화 패턴에 있어서의 세포 접착성 양호 영역의 수접촉각이 10 ∼ 40°인 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    세포 접착성 변화 패턴이 에너지 조사에 따른 광촉매의 작용에 의해 세포의 접착성이 변화하는 세포 접착성 변화 재료를 함유하는 세포 접착성 변화층에 의해 형성되는 방법.
  4. 제 3 항에 있어서,
    세포 접착성 변화층이 광촉매 및 세포 접착성 변화 재료를 함유하는 광촉매 함유 세포 접착성 변화층인 방법.
  5. 제 3 항에 있어서,
    세포 접착성 변화층이 광촉매를 함유하는 광촉매 처리층과, 그 광촉매 처리층 상에 형성된 세포 접착성 변화 재료를 함유하는 세포 접착성 변화 재료층을 갖는 방법.
  6. 제 3 항에 있어서,
    세포 접착성 변화 패턴이 세포 접착성 변화 재료를 함유하는 세포 접착성 변화층과 광촉매를 함유하는 광촉매 함유층을 대향하도록 배치한 후, 에너지 조사함으로써 형성되는 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    세포 배양용 기재가 생체 재료인 방법.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    세포 접착성 변화 패턴이 세포 접착성 저해 영역에 라인상의 세포 접착성 양호 영역이 배치된 패턴인 방법.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    세포 접착성 변화 패턴이 라인상의 세포 접착성 양호 영역과 세포 접착성 저해 영역의 스페이스가 교대로 배치된 패턴이고, 세포 접착성 양호 영역의 라인폭이 20 ∼ 200㎛ 이고, 라인간의 스페이스폭이 300 ∼ 1000㎛ 이고, 세포가 혈관 내피 세포인 방법.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 형성되는 세포 조직.
  11. 기재 상에 세포 접착성 양호 영역과 세포 접착성 저해 영역이 패턴화된 세포 접착성 변화 패턴을 갖는 세포 배열용 기재에 있어서, 그 세포 접착성 변화 패턴의 세포 접착성 양호 영역에 세포가 접착된 세포 접착 기재.
  12. 제 11 항에 있어서,
    세포 접착성 변화 패턴에 있어서의 세포 접착성 양호 영역의 수접촉각이 10 ∼ 40°인 세포 접착 기재.
  13. 제 11 항 또는 제 12 항에 있어서,
    세포 접착성 변화 패턴이 에너지 조사에 따른 광촉매의 작용에 의해 세포의 접착성이 변화하는 세포 접착성 변화 재료를 함유하는 세포 접착성 변화층에 의해 형성되는 세포 접착 기재.
  14. 제 13 항에 있어서,
    세포 접착성 변화층이 광촉매 및 세포 접착성 변화 재료를 함유하는 광촉매 함유 세포 접착성 변화층인 세포 접착 기재.
  15. 제 13 항에 있어서,
    세포 접착성 변화층이 광촉매를 함유하는 광촉매 처리층과, 그 광촉매 처리층 상에 형성된 세포 접착성 변화 재료를 함유하는 세포 접착성 변화 재료층을 갖는 세포 접착 기재.
  16. 제 13 항에 있어서,
    세포 접착성 변화 패턴이 세포 접착성 변화 재료를 함유하는 세포 접착성 변화층과 광촉매를 함유하는 광촉매 함유층을 대향하도록 배치한 후, 에너지 조사함으로써 형성되는 세포 접착 기재.
  17. 제 11 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 기재된 세포 접착 기재 상에 접착된 피검체 유래의 세포를 피검체의 생체 조직에 패턴화된 상태로 전사하여 세포를 증식시킴으로써 피검체의 조직을 재생하는 방법.
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