JPH0494679A - 細胞培養支持体材料 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、生化学、医学および免疫学等における細胞類
の培養用支持体材料に関するものである。

（従来の技術） 従来、細胞培養は、ガラス表面上あるいは種々の処理を
行った合成高分子材料の表面上にて行われていた。例え
ば、ポリスチレンを材料とする表面処理（例えば、γ線
照射、シリコンコーティング等）を行った種々の容器が
細胞培養用容器として普及している。従来、このような
細胞培養用容器を用いて培養・増殖した細胞は、トリプ
シンのような蛋白分解酵素や化学薬品により処理するこ
とで容器表面から剥離・回収されていた。しかしながら
、上述のような処理を施して増殖した細胞を回収する場
合、■処理工程が煩雑になり、不純物混入の可能性が多
くなること、■増殖した細胞が上記処理により変性し、
細胞本来の機能が損なわれる例があること、等の欠点が
指摘されている。

（発明が解決しようとする課題） 本発明は、上記のような問題を解決するためになされた
ものであり、トリプシン、ＥＤＴＡのような蛋白分解酵
素や化学薬品による処理を施さずに、環境温度を変化さ
せることで、培養・増殖させた細胞を支持体表面から剥
離・回収することが可能となるような細胞培養に使用す
る材料を提供することを目的とする。

（課題を解決するための手段） 本研究者らは、以上のような点に鑑み、鋭意研究を重ね
た結果、細胞支持体表面を特定の水溶性高分子、即ち、
臨界溶解温度（水にある物質を混合するとき、ある温度
では部分的にしか溶けないため２層に分離しているが、
温度を上げるかまたは下げて、ある一定の温度を過ぎる
と完全に溶解して１層になることがある。温度を上げて
完全溶解に達する場合の温度を上＠臨界溶解温度、温度
を下げて完全に溶解する場合の温度を下限臨界溶解温度
という。）を示すようなポリマーにより処理することに
より、細胞培養終了後、温度を変化させるだけで増殖細
胞を回収することが可能であり、しかもこの現象は細胞
を培養した培養液中においても可能であることを見い出
した。さらにその剥離した細胞は集合状態を保持、して
いることも見い出した。

即ち、本発明は細胞付着性基材表面上Ｉこ、水に対する
臨界溶解温度が０〜８０℃の範囲にあるホモポリマーも
しくはコポリマーを被覆してなり、その総被覆率が５〜
９０％である細胞培養支持体材料を提供するものである
。

水に対する臨界溶解温度は、通常、水（イオン交換水ま
たは蒸留水）との溶解相図を作成して求める。水との溶
解相図は臨界溶解温度を求めるポリマーの種々の濃度（
重量分率、容積分率、モル分率、モル比等いずれの単位
を用いても構わない。）の水溶液を調製し、各々の温度
を上下させ、■目視により２相分離を確認する方法の他
、■臨界タンパク光の観測による方法、■散乱光強度の
観測による方法、■透過光レーザー光の観測による方法
、等一般に知られている方法のいずれかを用いて、また
、組み合わせて用いて作成される。

被覆に用いられる物質は水溶液中で臨界溶解温度を有す
る化合物であればすべて用いることができるが、好まし
くは０〜８０℃、より好ましくは０〜５０℃の臨界溶解
温度を有するものである。

臨界溶解温度が８０’Ｏを越えると細胞が死゛滅する可
能性があるので好ましくない。また、臨界溶解温度がＯ
′Ｃより低いと一般に細胞増殖速度が極度に低下するか
、または細胞が死滅してしまうため好ましくない。

本発明に用いるホモポリマーまたはコポリマーは、以下
の七ツマ−の重合または共重合により得られる。使用し
得る七ツマ−は、これらの化合物に限定されるものでは
ないが、例えば、アクリルアミド、メタクリルアミドな
どの（メタ）アクリルアミド化合物、Ｎ−エチルアクリ
ルアミド（単独重合体の下限臨界溶解温度７２℃）、Ｎ
−ｎ−プロピルアクリルアミド（同２１’Ｃ）、Ｎ−ｎ
−プロピルメタクリルアミド（同２７℃）、Ｎ−イソプ
ロピルアクリルアミド（同３２℃）、Ｎ−イソプロピル
アクリルアミド（同４３℃）、Ｎ−シクログロピルアク
リルアミド（同４５°Ｏ）、Ｎ−シクロプロピルメタク
リルアミド（同６０℃り、Ｎ−二トキシエチルアクリル
アミド（同約３５℃）、Ｎ−エトキシエチルメタクリル
アミド（同約４５℃）、Ｎ−テトラヒドロフルフリルア
クリルアミド（同約２８℃）、Ｎ−テトラヒドロフルフ
リルメタクリルアミド（同約３５℃）等のＮ−アルキル
置換（メタ）アクリルアミド誘導体、Ｎ、Ｎ−ジメチル
（メタ）アクリルアミド、Ｎ−エチル−Ｎ−メチルアク
リルアミド（単独重合体の下限臨界溶解温度５６℃）、
Ｎ、Ｎジエチルアクリルアミド（同３２℃）等のＮ、Ｎ
ジアルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体、さらに
、Ｎ−アクリロイルピロリジン（単独重合体の下限臨界
溶解温度５６℃）、Ｎ−アクリロイルピペリジン（同約
６℃）等を代表とする１−（１オキソ−２−プロペニル
）−ピロリジン類、１（ｌ−オキソ−２−プロペニル）
−ピペリジン類、４−（１−オキソ−２−プロペニル）
−七ルホリン、１−（１−オキソ−２−メチル−２−プ
ロペニル）−ピロリジン、１−（Ｉ−オキソ−２−メチ
ル−２−プロペニル）−ピペリジン、４−（１−オキソ
２−メチル−２−プロペニル）−七ルホリン等の環状基
を有する（メタ）アクリルアミド誘導体、メチルビニル
エーテル（単独重合体の下限臨界溶解温度３５℃）等の
ビニルエーテル誘導体等である。また、増殖細胞の種類
によって臨界溶解温度を調節する必要がある場合や、被
覆物質と細胞培養支持体との相互作用を高める必要が生
じた場合や、細胞支持体の親木、疎水性のバランスを調
整する場合などに、上記以外の七ツマー類との共重合体
、ポリマー同士のグラフトまたはブロック共重合体、あ
るいはホモポリマー、コポリマーの混合物を用いてもよ
い。また、ポリマー本来の性質が損なわれない範囲で架
橋することも可能である。

被覆を施される細胞付着性基材は細胞が付着する材質な
らばいずれでも良く、その材質としては通常細胞培養に
用いられるガラス、改質ガラス、ポリスチレン、ポリメ
チルメタクリレート等の高分子化合物、あるいはセラミ
ックス、金属等が挙げられる。その際、基材表面はオゾ
ン処理、プラズマ処理、スパッタリング等の処理技術を
用いて親水化を施されたものでも良い。形状は、ペトリ
ディッシュに限定されることはなく、プレート、ファイ
バー、（多孔質）粒子、また、一般に細胞培養等に用い
られる容器の形状（フラスコ等）を付与されていても構
わない。

本発明においては、このような細胞付着性基材表面上に
、上記０〜８０℃の臨界溶解温度を有するホモポリマー
もしくはコポリマーを被覆するが、その被覆とは基材表
面を上部から観察して、被覆されている部分の総面積が
付着性基材表面総面積の５〜９０％に相当するものであ
り、細胞の剥離性を考えると１０〜７０％が好ましい。

被覆部分を上部から観察して、その形態は何ら限定され
るものではないが、例えば、ラインとスペースからなる
パターン、水玉模様状のパターン、格子状のパターン、
その他特殊な形のパターン、あるいはこれらが混ざって
いる状態等の微細なパターンが好ましい。また、その被
覆部の大きさ、さらに横から見た形は何ら限定されるも
のではない。さらに、その被覆部分と非被覆部分の配置
は規則的であっても、不規則的であっても良いが、その
２者は微細に分散されていることが好ましい。

被覆率は、Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）による元素分析
、被覆部もしくは非被覆部への染料や蛍光物質の染色に
よる分析、さらに接触角測定等による表面分析を単独あ
るいは併用して求めることができる。

細胞付着性基材への被覆方法は、細胞付着性基材と上記
被覆物質を■化学的な反応によって結合させる方法、■
物理的な相互作用を利用する方法、を単独でまたは併用
して行うことかできる。被覆時に七ツマ−を用いて重合
させる場合、そのモノマーは気体、液体、固体いずれの
状態でも阜い。

また、ホモポリマー又はコポリマーを用いて被覆する場
合、そのポリマーは、液体、固体状態のいずれの状態で
も良い。これらのものを■化学的な反応によって結合さ
せる場合、電子線照射（ＥＢ）、γ線照射、紫外線照射
、プラズマ処理、コロナ処理、さらに細胞付着性基材と
被覆材料が適当な反応性官能基を有する場合は、ラジカ
ル反応、アニオン反応、カチオン反応等の一般に用いら
れる有機反応を用いることができる。■物理的な相互作
用による方法としては、被覆材料自身または細胞付着性
基材との相溶性の良いマトリックス（例えば細胞付着性
基材を形成するキモツマ−１またはこれと相溶性の良い
モノマーと被覆材料とのグラフトポリマー、ブロックポ
リマー等）を媒体とし、塗布、混練等の物理的吸着を用
いる方法等があるがこれらに限られるわけではない。

本発明での微細に被覆する方法とは、例えば、■被覆時
にマスクとなるものを置き非被覆部を設ける方法、■被
覆物質を噴霧し部分的に被覆部を作成する方法、あるい
は、■被覆物質をあらかじめ溶媒中に分散、あるいは乳
化させ、これを塗布することで部分的に被覆部を作成す
る方法、■被覆物質をあらかじめ溶液状態にしておき、
被覆時に溶媒の蒸発速度と重合速度をコントロールして
部分的な被覆部を作成する方法、■被覆物質を細胞付着
性基材上に部分的に結晶化させ、その結晶部を化学的な
反応によって結合させ、部分的な被覆部を作成する方法
、■被覆時に走査型電子ビム等で代表されるような走査
型機器を利用し部分的な被覆部を作成する方法、さらに
、■被覆後に超音波等により洗浄し部分的な被覆部を作
成する方法、■被覆物質をオフセット印刷し、部分的に
被覆部を作成する方法、等を単独または併用する方法が
挙げられるが、本発明は細胞付着性基村上に被覆部と非
被覆部とが上記割合で存在していればその方法は何ら制
限されるものではない。

また、細胞支持体上にて培養した細胞を支持体から剥離
させ回収するには、上限臨界溶解温度以上もしくは下限
臨界溶解温度以下にするだけで良く、細胞を培養してい
た培養液においてもその他の等張渡においても可能であ
り、目的に合わせて選択することができる。

本発明の細胞培養支持体材料によれば、細胞増殖時には
、細胞は非被覆部である細胞付着性基村上に接着し、増
殖をする。細胞剥離時には、被覆部である臨界溶解温度
が０〜８０℃の範囲にあるホモポリマーもしくはコポリ
マーにおいて水分子の占める体積分率が上昇するため細
胞は剥離することになる。

本発明の作用をポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド
を例にとって説明する。ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリ
ルアミドは水溶液中で約３２℃に下限臨界溶解温度を有
することが知られている。

例えば、一般に細胞培養用ペトリディッシュ材料として
用いられるポリスチレン上でＮ−イソプロピルアクリル
アミドを電子線照射（ＥＢ）により重合を行うと、下限
臨界溶解温度である３２℃以上ではポリ−Ｎ−イソプロ
ピルアクリルアミドの占有体積は小さくなり、ポリマー
中の水分子を排除するため、支持体表面は疎水性を示し
、逆に３２０Ｃ以下ではポリ−Ｎ−イソプロピルアクリ
ルアミドの占有体積は大きくなるのでポリマー中の水分
子の占める体積分率が上昇するため、支持体表面は親水
性を示すようになる。

通常の細胞培養では、トリプシン、ＥＤＴＡ等の蛋白分
解酵素、化学薬品で処理することにより培養・増殖後の
細胞を支持体表面から剥離・回収するが、上述したよう
な物性を有するポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド
を表面コーティングされた支持体では、温度を制御する
ことにより支持体表面の親木・疎水性がコントロールで
き細胞の細胞支持体への接着性が変化する。そのため、
温度を変化させるだけで培養・増殖後の細胞を破壊する
ことなく細胞支持体から容易に剥離、回収することが可
能である。

この方法によれば、トリプシン、ＥＤＴＡのような蛋白
分解酵素、化学薬品による処理を経ずに細胞培養支持体
から培養した細胞を剥離・回収することができるので、
■処理工程が簡略化される、■不純物等の混入の可能性
が完全になくなる、■増殖した細胞が化学的処理により
細胞膜が障害され細胞本来の機能が損なわれることがな
い、■剥離した細胞が集合状態を保持している等の顕著
な特徴を獲得することが可能である。

（実施例） 以下、本発明を実施例により説明するが、本発明はこれ
ら実施例に限定されるものではない。

実施例１，２．３．４ 細胞培養支持体基材として、ベクトン・デイキンラン０
ラブウエア（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ　Ｌａ
ｂｗａｒｅ）社製ファルコン（ＦＡＬＣＯＮ）３００２
ペトリデイツシユを用い、培養する細胞としては、ウシ
大動脈血管内皮細胞を採用した。Ｎ−イソプロピルアク
リルアミド（七ツマ−又はポリマー）を表−１に示す濃
度で、イソプロピルアルコールに溶解して、ペトリディ
ッシュに０．３５ｍ（ｌ添加後、各々表＝１に示すマス
ク（ステンレス製網）を用い、電子線を照射することに
より、ペトリディッシュ表面にポリ−Ｎ−インプロピル
アクリルアミドを微細なパターンとして被覆した。電子
線照射終了後、イオン交換水によりペトリディッシュを
洗浄し、残存上ツマ−およびペトリディッシュ表面に結
合していないポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドを
取り除き、クリーンベンチ内で乾燥して、細胞培養支持
体を得た。

得られた細胞培養支持体表面上の被覆率は、Ｘ線光電子
分光法（ＸＰＳ）を用い、入射角３０度の分析値より下
式に従って求めた。得られた結果を表−２に示す。

また、得られた細胞培養支持体材料は、細胞培養前にエ
チレンオキサイドガスで滅菌し、十分に脱気した。

ウシ大動脈血管内皮細胞の培養は、得られた細胞支持体
上にて、ウシ胎児血清（Ｆｅ２）を１０％含むダルベツ
コ−改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を培地として、５％
二酸化炭素中、３７℃で行った。

十分、細胞が増殖したのを確認後、５℃に冷却し、放置
して、付着培養細胞を剥離させ、増殖細胞剥離回収率を
下式に従って求めた。結果を表−２に示す。

総数 実施例５．６ 被覆物質としてＮ−イソプロピルアクリルアミドの代わ
りに、Ｎ、Ｎ−ジエチルアクリルアミドを使用する点以
外は、実施例１．２と同様にして、細胞培養支持体を得
、被覆率を求め、さらに、細胞培養し、これを剥離、回
収し、増殖細胞剥離回収率を求めた。結果を表−２に示
す。

比較例１ 細胞培養支持体として、ベクトン・ディキンソン・ラブ
ウェア社製ファルコン３００２　ベトリゾイソシュを用
い、表面処理を全く行わずに、実施例と同様の実験を行
った。結果を表−２に示す。

比較例２ 細胞培養支持体として、細胞付着性のないベクトン・デ
ィキンソン・ラブウェア社製、一般細菌用フアルコン１
００７　ペトリディッシュヲ用′い、表面処理を全く行
わずに、実施例と同様の実験を行った。結果を表−２に
示す。

比較例３．４ 細胞培養用支持体として、細胞付着性のないベクトン・
ディキンソン・ラブウェア社製、一般細菌用フアルコン
ｌ　００７　　ベトリゾイソシュを用い、実施例１，２
と同様にして、細胞培養支持体を得、被覆率を求め、さ
らに、細胞培養し、これを剥離、回収し、増殖細胞剥離
回収率を求めた。

結果を表−２に示す。

比較例５ 細胞培養用支持体として、ベクトン・ディキンソン・ラ
ブウェア社製　ファルコン３００２　ベトリゾイソシュ
を用い、被覆物質として、Ｎ−イソプロピルアクリルア
ミドさらに、架橋剤として、Ｎ、Ｎ−メチレンビスアク
リルアミド（対Ｎ−イソプロピルアクリルアミドＱ、５
ｗｔ％）を用い、マスクを用いずに電子線を照射するこ
とにより支持体表面全体にポリマーを被覆し、細胞支持
体を得、被覆率を求め、さらに、細胞培養し、これを剥
離、回収し、増殖細胞剥離回収率を求めた。結果を表＝
２に示す。

表−１ 表−２ 表−３ なお、実施例、比較例とも支持体の親・疎水性をｍべる
ために、フェース（ＦＡＣＥ）接触角計（ＣＡ　−Ｄ型
）［協和界面科学株式会社製］および付属品として、三
態系測定装置を用い液滴法で接触角を測定した。結果を
表−３に示す。

以上の実施例および比較例の結果より、細胞付着性基材
表面上にＮ−イソプロピルアクリルアミドまたはＮ、Ｎ
−ジエチルアクリルアミドで表面、処理を行った実施例
１．２．３．４．５．６では、表−３に示されるように
、支持体材料周囲の温度を３７℃から５℃に下げること
で接触角が減少しており、これは、微細なパターンとし
て被覆されたポリＮ−イソプロピルアクリルアミドまた
はポリＮ、Ｎ−ジエチルアクリルアミドにより、支持体
材料表面が疎水性から親水性へと変化していることを示
している。このような材料を使用した実施例１．２．３
．４．５．６の場合、表−２に示されるように、温度を
低下させると、付着細胞は、培養支持体から良好に剥離
し、回収することが可能であった。

一方、比較例１のように、細胞付着性基材上に表面処理
を施さない場合は、表−３ｊこ示されるように、周りの
温度を下げても接触角はほとんど変化せず、支持体材料
表面は疎水性のままであった。

この支持体材料では、表−２に示されるように、温度を
低下させても付着細胞の剥離現象は観察されなかった。

また、比較例２のように、細胞付着性の認められない基
材を用いた場合、表−２に示すように、細胞は付着／増
殖ともに認められず、また、この表面に比較例３．４の
ように、実施例１．２と同様にポリマーを被覆しても、
細胞の付着は認められなかった。

さらに、比較例５のように、細胞付着性基材表面全体に
、ポリマーを被覆した場合においても、表−２で示す通
り、細胞は付着しなかった。

実施例７ 細胞培養支持体基材として、ベクトン・ディキンソン・
ラブウェア社製　ファルコン３００２ペトリディッシュ
を用い、その表面に、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド
３Ｑｗｔ％イソプロピルアルコール溶液を０．１ｍΩ噴
霧後、２０Ｍｒａｄの電子線を照射し、ベトリディッシ
ュ表面にポリ−Ｎイソプロピルアクリルアミドを微細な
パターンとして被覆した。後の操作は、実施例Ｌ　２．
３．４．５．６と同様に細胞培養支持体を得、被覆率、
接触角を求め、さらに細胞を培養、これを剥離、回収し
て、増殖細胞剥離回収率を求めＩ；。結果を表−４に示
す。

実施例８ 被覆物質として、Ｎ−イソプロビルアクリルアミドの代
わりに、Ｎ　　ｎ−プロピルアクリルアミドを使用する
点以外は、実施例７と同様に細胞支持体を得、被覆率、
接触角を求め、さらに細胞を培養し、これを剥離、回収
して増殖細胞剥離回収率を求めた。結果を表−４に示す
。

実施例９ 細胞培養支持体基材として、ベクトン・ディキンソン・
ラブウェア社製　ファルコン３００２ベトリディッシュ
を用い、その表面に、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド
結晶微粉末１０ｇ（平均粒径ＩＯμ）をヘキサン５０ｇ
中に分散させ、その懸濁液をペトリディッシュに０　、
１　ｍ１２添加後、１５Ｍｒａｄの電子線を照射し、ペ
トリディッシュ表面にポリ−Ｎ−イソプロピルアクリル
アミドを微細なパターンとして被覆した。後の操作は、
実施例１．２．３．４．５．６と同様に細胞培養支持体
を得、被覆率、接触角を求め、さらに細胞を培養し、こ
れを剥離、回収して、増殖細胞剥離回収率を求めた。結
果を表−４に示す。

実施例１０ 被覆物質として、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドの代
わりに、Ｎ−イソプロピルメタクリルアミドを使用する
点以外は、実施例９と同様に細胞支持体を得、被覆率、
接触角を求めた。次にこのものに対しては４５℃で細胞
を培養し、以下は実施例９と同様にこれを剥離、回収し
て、増殖細胞剥離回収率を求めた。結果を表−４に示す
。

実施例１１ 細胞培養支持体基材として、ベクトン・ディキンソン・
ラブウェア社製　ファルコン３００２ベトリゾイソシュ
を用い、その表面に、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド
５５ｗｔ％イソプロピルアルコール溶液を０．３５ｍ（
２添加後、２５Ｍｒａｄの電子線を照射する。その際、
照射部付近の温度を４０℃とし、さらにその部分へ窒素
ガスを毎時９１Ｒ３導入した。イソプロピルアルコール
溶液は、照射中に突沸し、ペトリディッシュの表面は見
かけ上、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドが発泡
、乾燥した状態で得られた。その後、イオン交換水によ
り、洗浄し、残存モノマーおよびペトリディッシュ表面
に結合していないポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミ
ドを取り除き、クリーンベンチ内で乾燥することにより
ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドが微細なパター
ンとして被覆した細胞培養支持体を得た。後の操作は、
実施例１．２．３．４．５．６と同様に、被覆率、接触
角を求め、さらに細胞を培養し、これを剥離、回収して
、増殖細胞剥離回収率を求めた。結果を表−４に示す。

実施例１２ 被覆物質として、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドの代
わりに、Ｎ−エトキシエチルアクリルアミドを使用する
点以外は、実施例１１と同様に、細胞支持体を得、被覆
率、接触角を求め、さらに細胞を培養し、これを剥離、
回収して増殖細胞剥離回収率を求めた。結果を表−４に
示す。

実施例１３ 細胞培養支持体基材として、ベクトン・ディキンソン・
ラブウェア社製　ファルコン３００２ペトリディッシュ
を用い、その表面に、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド
５０ｗｔ％イソプロピルアルコール溶液をＯ、ｌ　ｒｔ
ｒＱ添加後、２６℃クリーンベンチ内で４０分間放置し
、溶解しているＮ−イソプロピルアクリルアミドを部分
的に結晶析出させた後、１５Ｍｒａｄの電子線を照射し
、ペトリディッシュ表面にポリ−Ｎ−イソプロピルアク
リルアミドを微細なパターンとして被覆した。後の操作
１２．３．４．５．６と同様にして、細胞培養支持体を
得、被覆率、接触角を求め、さらに細胞を培養し、これ
を剥離、回収して、増殖細胞剥離回収率を求めた。結果
を表−４に示す。

比較例６ クリーンベンチ内の放置時間を４時間とし、ペトリディ
ッシュ表面全体に、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドを
結晶析出させる点以外は、実施例１３と同様にして、ベ
トリディッシュ表面全体にポリ−Ｎ−イソプロピルアク
リルアミドが被覆された細胞培養支持体を得、被覆率、
接触角を求め、さらに細胞を培養し、これを剥離、回収
して、増殖を細胞剥離回収率を求めた。結果を表−４に
示す。

実施例１４ 細胞培養支持体基材として、ベクトン・デイキンソン・
ラブウェア社製　ファルコン３００２ペトリディッシュ
を用い、その表面にＮ−イソプロピルアクリルアミド４
５ｗｔ％イソプロピルアルコール溶液を０．２ｍＱ添加
後、２０Ｍｒａｄ電子線を照射し、その後、イオン交換
水中で超音波洗浄を３０分間行い、残存上ツマ−および
ペトリデイツシュ表面に結合していない、ポリ−Ｎ−イ
ソプロピルアクリルアミドを取り除き、クリーンベンチ
内で乾燥することにより、ポリ−Ｎ−イソプロピルアク
リルアミドが微細なパターンとして被覆した細胞培養支
持体を得た。後の操作は、実施例１．２．３．４．５．
６と同様に、被覆率、接触角を求め、さらに、細胞を培
養し、これを剥離、回収して、増殖細胞剥離回収率を求
めた。結果を表−４に示す。

実施例１５ 細胞培養支持体基材として、ベクトン・デイキンソン・
ラブウェア社製　　ファルコン３００２ペトリディッシ
ュを用い、その表面に、Ｎ−イソプロピルアクリルアミ
ド２０ｗｔ％イソプロピルアルコール溶液をオフセット
印刷し、２０　Ｍｒａｄの電子線を照射し、ペトリディ
ッシュ表面にポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドを
微細なパターンとして被覆した。後の操作は、実施例１
．２．３．４．５．６と同様に細胞培養支持体を得、被
覆率、接触角を求め、さらに、細胞を培養し、これを剥
離、回収して、増殖細胞剥離回収率を求めた。結果を表
−４に示す。

表−４ 実施例７から１５の結果より、ベトリデイツシュ表面上
に非被覆部として細胞付着性基材部分が微゛細なパター
ン状に存在していれば、増殖細胞剥離回収率は９０％以
上の値が得られ、この現象を実現するｔ：めの方法は、
いずれの方法によっても可能であることが分かる。

また、比較例６においては、比較例５と同様、細胞付着
性基村上に被覆されているものの、ポリ−Ｎ−イソプロ
ピルアクリルアミドがペトリディッシュ表面上を９５％
被覆しているため、細胞は付着せず増殖も認められなか
った。

実施例１６ 実施例１で得られた剥離細胞の損傷度合を確認するため
、これを遠心分離（６００Ｇ、５分）により回収し、得
られた２Ｘ１０’個の細胞をベクトンΦディキンソンＯ
ラブウェア社製　ファルコン３００２　ペトリディッシ
ュ上で再び培養させた。

細胞の培養は実施例１と同様の方法を採用した。

結果を表−５に示す。

比較例７ 比較例１で培養した付着細胞を０．０５％トリプシン−
０，０２％ＥＤＴＡ処理し、剥離させた細胞の損傷度合
を確認するため、これを遠心分離（６００Ｇ１５分）す
ることにより回収し、得られた２ＸｌＯ’個の細胞をペ
クトン・デイキンソン・ラブウェア社製　ファルコン３
００２　ペトリディッシュ上で再び培養させた。培養は
実施例１と同様の方法を採用した。結果を表−５に示す
。

表−５ 実施例Ｉ６と比較例７の結果から、剥離回収細胞の損傷
度合については、表−５に示すように、実施例１６では
培養開始時の１０倍まで再増殖させることが可能である
が、比較例７では５倍までしか再増殖させることができ
なかった。このことは、本発明の剥離回収細胞は従来の
それよりも損傷度が小さいことを意味する。

（発明の効果） 本発明は、低温処理という簡便な操作で、不純物等を全
く混入させることなく、シかも、従来の方法と比較する
と細胞機能を十分に保持しながら、培養・回収の繰り返
し操作を行うことができる。

平成

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）細胞付着性基材表面上に、水に対する臨界溶解温
   度が０〜８０℃の範囲にあるホモポリマーもしくはコポ
   リマーを被覆してなり、その総被覆率が５〜９０％であ
   る細胞培養支持体材料。
2. （２）細胞付着性基材表面上に、該ホモポリマーもしく
   はコポリマーが、規則的、或は不規則的な微細なパター
   ンとして被覆している請求記１載の細胞培養支持体材料
   。