KR20050105509A - 비동물성 세포 배양법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 일차적 동물 기원의 외생 성분의 부재하에서의 동물, 바람직하게는 인간 이배체 부착 의존성 세포 배양을 위한 방법, 및 상기 방법을 수행하기에 적절한 일차적 동물 기원의 외생 성분이 실질적으로 결여된 세포 배양 배지에 관한 것이다. 특히 본 발명은 하나 이상, 더욱 바람직하게는 여러개의 외생 비동물 성장 인자를 포함하는 세포 배양 배지에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명에 따른 배지내에서 인간, 바람직하게는 인간 이배체 부착 의존성 세포를 배양하는 방법에 관한 것으로, 이는 세포를 계대하기 위한 비동물 기원의 대체물로 트립신을 사용하는 것을 수반한다. 본 발명은 추가로 바이러스, 바이러스 백신 등을 생성하기 위한 방법에 관한 것이다.

Description

비동물성 세포 배양법{ANIMAL-FREE CELL CULTURE METHOD}
본 발명은 일차적 동물 기원의 외생 성분의 부재하에서 동물, 예컨대 포유동물 세포 배양, 특히 동물, 예컨대 포유동물, 바람직하게는 인간 이배체 부착 의존성 세포 배양을 위한 방법, 및 상기 방법을 수행하기에 적절한 일차적 동물 기원의 외생 성분이 실질적으로 결여된 세포 배양 배지에 관한 것이다. 특히 본 발명은 하나 이상, 더욱 바람직하게는 여러개의 외생성 비동물성 성장 인자를 포함하는 세포 배양 배지에 관한 것이다. 이러한 배지는 특히 동물, 예컨대 포유동물, 바람직하게는 인간 이배체 부착 의존성 세포를 배양하도록 적합되는데, 예컨대 상기 세포형을 위해 적절한 혈청으로 보충된 기본 배지의 성능과 동등한 성능을 지닌다. 본 발명은 또한 본 발명에 따른 배지내에서 동물, 예컨대 포유동물, 바람직하게는 인간 이배체 부착 의존성 세포를 배양하기 위한 방법에 관한 것으로, 이는 세포를 계대하기 위한 비동물 기원의 트립신 대체물을 사용하는 것을 수반한다. 본 발명은 추가로 바이러스, 바이러스 백신 등을 생성하기 위한 방법에 관한 것이다.
부착 의존성 세포, 특히 이배체 부착 의존성 세포는 대규모 생물공정에서의 건강 관리 제품, 예컨대 백신 및 재조합 단백질의 생산, 인간의 상해의 치료에 사용되는 인공 조직의 생성, 실험적 연구, 시험관내 독성학, 신규 약제의 스크리닝(screening) 및 테스트 등과 같은 광범위한 방법에 사용된다.
통상적으로, 부착 의존성 세포는 우 혈청 알부민(BSA) 또는 단백질 가수분해물과 같은 혈청 또는 혈청의 대체물로서 다른 동물 기원 성분을 함유하는 배지에서 배양된다. 혈청 또는 동물 기원 성분은 또한 세포 계대배양(subcultivation) 및 세포 냉동보존 동안에 사용된다. 혈청은 대사물질, 호르몬, 비타민, 철(트랜스페린), 수송 단백질, 부착 인자(예컨대, 피브로넥틴), 확산 및 성장 인자에 대한 주요한 공급원이다. 이는 시험관내에서의 많은 동물 세포의 증식에 요구된다. 게다가, 혈청은 여러 불안정하고 유해한 효과, 예컨대 pH 변화, 중금속 이온, 단백질 분해 활성 또는 내독소의 존재에 대해 완충제로 작용한다. 알부민은 혈청의 주요 단백질 성분으로, 배양에 있어서 세포의 성장 및 유지에 기여하는 여러 효과를 발휘한다: 이는 일정 범위의 소분자에 대한 담체 단백질로 작용하고, 세포에 필수적이지만 결합되지 않은 형태로는 유해한 지방산에 대한 운반체로 작용한다.
통상적으로, 이배체 부착 의존성 세포는 플라스틱 표면, 유리 표면 또는 미세담체(microcarrier)상에서 성장한다. 이러한 세포는 피브로넥틴과 같은 부착 인자에 의해 부착되고 퍼진다(F. Grinnel & M.K. Feld Cell, 1979, 17, 117-129). 트립신은 세포 계대 동안 세포를 분리하게 위해 사용되는 가장 일반적인 동물 유래 성분중 하나이다(M. Schroeder & P. Friedl, Methods in Cell Science, 1997, 19, 137-147; O.W. Mertens, Dev Biol Stand., 1999, Vol 99, pp 167-180). 이는 세포 손상을 피하기 위해 세포 분리 후에 혈청 또는 콩의 트립신 억제제에 의해 억제되어야 한다. 분리 후, 세포는 다음 계대배양 전에 증식하여 컨플루언트 세포층을 형성할수 있는 새로운 표면상에 저밀도로 시딩(seeding)된다. 부착성 세포를 계대하는 목적은 전술한 방법을 실행하기 위해 세포를 증식시키고 충분한 양의 세포를 수득하는 데에 있다.
이러한 방법에서 혈청 및 동물 유래 성분의 사용과 관련된 여러 불이익이 존재하는데, 이는 주로 이들의 비용, 이들의 조성에 있어서의 배치(batch) 대 배치 변이성, 외래 작용제에 의한 높은 오염 위험성과의 관련성 및 후속 다운스트림 처리(downstream processing)(예컨대, 혈청-단백질 및 도입된 동물 유래 단백질을 제거하기 위한 정제)에서 조우되는 곤란함이다. 더욱이, 상기에 언급한 바와 같이, 혈청 비함유 배지는 부착 의존성 이배체 세포에 적절하지 않다는 것이 보고되어 있다(O. W. Mertens, Dev Biol Stand., 1999, Vol 99, pp 167-180; O. W. Merten, Dev. Biol. 2002, 101, 233-257).
다수의 저수준 혈청 및 혈청 비함유 배지 포뮬레이션이 부착 의존성 세포 배양, 특히 이배체 부착 의존성 세포 배양에 대해 개발되었다(M. Kan & I. Yamane, Journal of Cellular Physiology, 1982, 111, 155-162; S.P. Forestell et al. Biotechnology and Bioengineering, 1992, Vol 40, pp 1039-1044). 이러한 배지를 제조하려는 시도는 만족스럽지 않았는데, 이는 주로 형질전환되지 않은 이배체 부착 의존성 세포가 여러 성장 인자 및 호르몬으로 보충된 다소 복잡한 혈청 비함유 배지를 필요로 하기 때문이고, 또한 일반적으로 이러한 세포에 대한 생산 방법이 최소한 바이오매스(biomass) 생산 단계 동안에 혈청을 사용하기 때문이다(O.W. Merten, Dev. Biol. 2002, 101, 233-257). 더욱이, 이러한 배지는 여전히 동물 기원의 성분, 예컨대 BSA, 단백질 가수분해물, 성장 인자, 수송 단백질, 아미노산, 비타민 등을 함유한다. 동물 기원의 성분이 전혀 없는 부착 의존성 세포를 위한 배지 포뮬레이션을 개발하기 위한 극소수의 시도가 이루어졌다. 거의 비동물성인 포뮬레이션은 혈청을 사용하여 관찰된 세포 성장률과 동등하게 세포 성장률을 유지할 수 없고, 단지 초기 노쇠가 관찰되기 전 소수의 계대배양 단계를 가능하게 하는 것으로 보고되어 있다(B.J. Walthall & R. Ham Experimental Cell Research (1981) 134 303-311). 더욱이, 부착 의존성 세포로부터의 일차 세포배양(primary cell culture)은 거의 항상 동물 기원의 프로테아제, 주로 세린 프로테아제를 사용하는 세포층 또는 조직의 분해를 수반하여, 외래 바이러스에 의해 세포 배양물이 오염될 위험성을 수반하고 프로테아제의 효소적 활성에 있어서 배치 대 배치 변이로 인한 세포 성장의 용인할 수 없는 변이성을 야기시킨다. 예를들어, 부착 의존성 세포 배양물의 계대에 있어서 돼지/우 트립신의 사용은 널리 공지된 기술이다(O.W. Mertens, Cytotechnology, 2000, 34, 181-183).
따라서, 이배체 부착 의존성 세포 배양의 분야에는, 동물 유래 성분이 실질적으로 없거나, 바람직하게는 동물 유래 성분이 전혀 없고, 혈청 함유 방법으로 수득한 경우에 비해 예컨대, 세포 성장률, 노쇠, 세포 형태, 바이러스 또는 단백질 생산의 견지에서 이배체 부착 의존성 세포형을 위해 적합한 혈청으로 보충된 기본 배지의 성능과 동등한 성능으로 이배체 부착 의존성 세포 배양을 위한 방법을 수행하기에 적절한 세포 배양 배지를 개발할 필요가 있다.
도 1은 세포 분리를 위해 피신 및 브로멜라인 프로테아제를 사용하고 실시예 Ⅰ.1에 정의된 배지를 사용하는 MRC-5 세포 노쇠 테스트 동안의 세포 밀도를 도시한다.
도 2는 세포 분리를 위해 피신 및 브로멜라인 프로테아제를 사용하고 실시예 Ⅰ.1에 정의된 배지를 사용하는 MRC-5 세포 노쇠 테스트 동안의 세포 생존도를 도시한다.
도 3은 세포 분리를 위해 피신 및 브로멜라인 프로테아제를 사용하고 실시예 Ⅰ.1에 정의된 배지를 사용하는 MRC-5 세포 노쇠 테스트 동안의 세포 성장을 도시한다.
도 4는 실시예 Ⅰ.1(개별적 성분) 및 실시예 Ⅰ.2(보충된 울트라-MEM 배지)에 정의된 배지로 수득한 MRC-5 세포 노쇠 테스트 동안의 세포 밀도를 비교한 도면이다.
도 5는 실시예 Ⅰ.1(개별적 성분) 및 실시예 Ⅰ.2(보충된 울트라-MEM 배지)에 정의된 배지로 수득한 MRC-5 세포의 노쇠 테스트 동안의 세포 생존도를 도시한다.
도 6은 실시예 Ⅰ.1(개별적 성분) 및 실시예 Ⅰ.2(보충된 울트라-MEM 배지)에 정의된 배지로 수득한 MRC-5 세포의 노쇠 테스트 동안의 세포 성장을 도시한다.
도 7은 세포 분리를 위해 피신 및 브로멜라인 프로테아제를 사용함으로써 증식된 MRC-5 세포 상에서의 HAV 생성을 도시한다.
도 8은 세포 분리를 위해 피신 및 브로멜라인 프로테아제를 사용함으로써 증식된 MRC-5 세포 은행 생성 동안의 세포 밀도를 도시한다.
도 9는 세포 분리를 위해 피신 및 브로멜라인 프로테아제를 사용함으로써 증식된 MRC-5 세포 은행 생성 동안의 세포 생존도를 도시한다.
도 10은 세포 분리를 위해 피신 및 브로멜라인 프로테아제를 사용함으로써 증식된 MRC-5 세포 은행 생성 동안의 세포 성장을 도시한다.
도 11은 세포 분리를 위해 트립진(Prodigen) 또는 알프로테아제(Invitrogen)을 사용함으로써 증식된 MRC-5 세포의 세포 은행 생성 동안의 세포 밀도를 도시한다.
도 12는 세포 분리를 위해 트립진(Prodigen) 또는 알프로테아제(Invitrogen)에 의해 증식된 MRC-5 세포의 세포 은행 생성 동안의 세포 생존도를 도시한다.
도 13은 세포 분리를 위해 트립진(Prodigen) 또는 알프로테아제(Invitrogen)에 의해 증식된 MRC-5 세포의 세포 은행 생성 동안의 세포 성장을 도시한다.
본 발명은 하기의 비제한적인 실시예에 의해 추가로 기재될 것이다.
발명의 개요
일차적 동물 기원의 외생 성분이 실질적으로 없고 하나 이상의 이차적 비동물 기원의 외생 성장 인자를 포함하는 세포 배양 배지를 사용하면 외생의 일차적 및/또는 이차적 동물 기원으로부터의 성분을 함유하는 것으로 공지된 통상적인 배양 배지 및 혈청 비함유 배지를 이롭게 대체할 수 있는 것으로 이제 밝혀졌다.
또한, 상기 배양 배지의 사용을 수반하고, 동물, 예컨대 포유동물, 바람직하게는 인간 세포, 바람직하게는 부착 의존성 세포를 동물 기원이 아닌 프로테아제 대체물의 존재하에서 1회 이상 계대하는 것을 추가로 포함하는 세포 배양 방법이, 또한 상기 세포형을 위해 적절한 혈청으로 보충된 기본 배지를 사용하여 종래의 방법으로 수득되는 성능과 동등한 수준의 성능으로 수행될 수 있는 것으로 밝혀졌다.
따라서, 첫번재 양태에서, 본 발명은 EGF, FGF, 트리-요오도-L 티로닌 및 히드로코르티손 및 이차적 비동물 기원의 IGF-1 및/또는 인슐린중 하나 이상으로 구성되는 목록으로부터 선택된 하나 이상, 바람직하게는 하나 보다 많은 이차적 비동물 기원의 외생 성장 인자를 포함하는, 일차적 동물 기원의 외생 성분이 실질적으로 없고, 바람직하게는 결여된 세포 배양 배지에 관한 것이다. 적절하게는, 상기 배양 배지는 동물, 예컨대 포유동물, 바람직하게는 인간 부착 의존성 세포, 바람직하게는 이배체 세포의 배양을 위해 적합되는데, 이는 예컨대 상기 세포형을 위해 적절한 혈청으로 보충된 기본 배지의 성능과 동등한 성능을 지닌다.
임의적으로, 본 발명에 따른 배양 배지는 비동물 기원의 단백질 가수분해물을 추가적으로 포함한다. 바람직하게는 단백질 가수분해물이 존재한다. 적절하게는, 단백질 가수분해물은 밀 가수분해물이다.
추가로, 본 발명은 동물, 예컨대 포유동물, 바람직하게는 인간 부착 의존성 세포, 바람직하게는 부착 의존성 이배체 세포의 배양을 위한 상기 배지의 용도에 관한 것으로, 상기 배지는 상기 세포형을 위해 적절한 혈청으로 보충된 기본 배지에서 수득한 성능과 동등한 성능을 지닌다.
놀랍게도, 본 발명자들은 본 발명에 따른 배지가 동물, 예컨대 포유동물, 바람직하게는 인간 부착 의존성 세포, 특히 부착 의존성 이배체 세포를 배양하기 위해 특히 적합되고, 상기 배지는 예컨대, 상기 세포형을 위해 혈청과 같은 동물 유래 성분이 보충된 기본 배지로 수득되는 성능과 동등한 성능(예컨대, 세포 성장률, 노쇠, 세포 형태, 바이러스 또는 단백질 생산)을 지님을 확정했다.
따라서, 본 발명은 특히 본 발명에 따른 세포 배양 배지에서, 동물, 예컨대 포유동물, 바람직하게는 인간 부착 의존성 세포, 바람직하게는 이배체 세포를 생산하기 위한 방법에 관한 것이다:
a) 본원에 정의된 세포 배양 배지에 세포를 시딩하고, 세포가 기질에 부착되도록 하는 단계,
b) 단계 a)로부터 생성된 조정된(conditioned) 배지를 수거하고, 비동물 기원의 프로테아제로 기질로부터 세포층을 떼어내고 세포를 해리시켜 세포 현탁액을 형성시키는 단계,
c) 세포 부착을 가능하게 하는 부착 지지물을 포함하는 배양 장치내에서, 단계 b)의 세포의 현탁액을 배양 배지에 접종시키는 단계, 및
d) 배양 배지내에서 세포를 성장시키는 단계를 포함한다.
단계 b) 내지 d)는 여러 차례 반복될 수 있다.
임의적으로, 이러한 방법은 세포 은행(cell bank)을 생성하기 위해 단계 b)에서 수거한 세포를 동결시키는 단계를 추가로 포함한다.
또한, 세포를 생산하기 위한 상기 방법이 외생의 동물 유래 성분이 없는 배지에서 세포를 배양하기 전에 임의의 적응 단계를 필요로 하지 않고, 세포의 노쇠가 이러한 적응 단계의 부재에 의해 영향을 받지 않는 것으로 밝혀졌다.
따라서, 본 발명의 또 다른 양태는 본 발명에 따른 배양 배지에서 성장을 위해 적합된 세포주, 특히 동물, 예컨대 포유동물, 바람직하게는 인간 이배체 부착 의존성 세포주를 제공하는 것이고, 특히 생물학적 활성 생성물, 바람직하게는 바이러스, 특히 백신으로 사용되는 생바이러스의 생성을 위해 적합된 세포주, 특히 동물, 예컨대 포유동물, 바람직하게는 인간 이배체 부착 의존성 세포주를 제공하는 것이다.
본 발명은 또한 하기의 단계를 포함하는, 바이러스 생성에 적절한 세포 배양 배지 중의 동물, 예컨대 포유동물, 바람직하게는 인간 부착 의존성 세포내에서 바이러스를 생성하기 위한 방법에 관한 것으로, 상기 배지는 일차적 동물 기원의 성분이 결여되고, 하나 이상의 이차적 동물 기원의 외생 성장 인자, 및 임의로 비동물 기원의 단백질 가수분해물을 포함한다:
a) 세포를 바이러스로 감염시키는 단계,
b) 바이러스를 증식시키는 단계, 및
c) 바이러스를 수거하는 단계.
이러한 방법은 수거한 바이러스를 1회 이상의 정제 단계에 적용시키는 것을 포함할 수 있다. 바이러스는 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 및/또는 애쥬번트와 함께 백신으로 적절하게 제형화될 수 있다.
상세한 설명
특히 바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 세포 배양 배지는 일차적 동물 기원의 외생 성분이 실질적으로 없고, 바람직하게는 일차적 동물 기원의 외생 성분이 완전히 결여되고, 바람직하게는 일차적 및 이차적 동물 기원의 외생의 동물 유래 성분이 없다. 적절하게는, 상기 배지는 동물, 예컨대 포유동물, 바람직하게는 인간 부착 의존성 세포, 특히 부착 의존성 이배체 세포를 배양하기에 적합되고, 이는 예컨대, 세포 성장률, 세포 형태, 노쇠 또는 바이러스 생성의 견지에서 상기 세포형을 위해 적절한 혈청으로 보충된 기본 배지로 수득된 성능과 동등한 성능을 지닌다. 예를들어, 동물, 예컨대 포유동물, 바람직하게는 인간 세포를 위한 기본 배지는 ATCC의 카탈로그에서 발결될 수 있고, 주어진 세포형을 위한 기본 배지의 예는 표 1에 추가적으로 주어져 있다. 통상적으로, 비교 목적을 위해 사용되는 혈청은 우 혈청, 특히 우 태아 혈청이다. 따라서, 동등성은 통상적으로 10 % v/v의 농도로 우 혈청을 함유하는 표 1에 따른 기본 배지와 비교하여 가장 잘 평가된다.
표 1
"세포 성장률"은 세포 은행으로부터의 세포의 해동 및 세포의 노쇠 사이에서 세포가 성장하는 평균 속도를 의미한다. 이는 세포수 배가(PD)/일로 나타내고 세포 해동 및 세포 노쇠 사이에서 경과된 시간(일수로 표현)에 대한 세포 해동 및 세포 노쇠 사이에서 관찰된 세포수 배가수의 비를 계산하여 수득된다. 본 발명에 따른 동등한 세포 성장률은 상기 세포형을 위해 적절한 혈청, 보통 10% 농도(대조군으로 사용됨)의 우 혈청으로 보충된 기본 배지에서 배양된 세포로 수득되는 세포 성장률의 80% 이상, 바람직하게는 90%, 더욱 바람직하게는 95% 이상 또는 그 이상의 세포 성장률을 의미한다. 혈청 함유 배지에서 배양된 세포로 수득되는 것 보다 높은 세포 성장률이 가장 바람직하다.
"세포 형태"는 광학 현미경 검사에 의한 평가된 세포의 형태를 의미한다. 형태의 견지에서의 동등한 성능은 세포가 우 혈청의 존재하에서 배양되는 경우에 관찰되는 형태를 보유함을 의미한다. 예를들어, MRC-5 세포는 본 발명의 배지에서의 배양 후에 섬유아세포 특성을 보유할 것이다.
"노쇠"는 일반적으로 헤이플릭 한계(hayflick limit)(HARRY Rubin, Nature Biotechnology, 2002, 20, 675-681)로 언급되는 균일하고 고정된 수의 세포수 배가(세포수 배가 수준, PDL)후에 관찰되는 세포의 복제 능력의 손실을 의미한다. 본 발명에 따른 동등한 노쇠는 상기 세포형을 위해 적절한 혈청, 보통 10% 농도(대조군으로 사용됨)의 우 혈청으로 보충된 기본 배지에서 배양된 세포로 수득되는 노쇠의 70% 이상, 바람직하게는 90%, 더욱 바람직하게는 95% 이상 또는 그 이상의 노쇠를 의미한다. 혈청 함유 배지에서 배양된 세포로 수득되는 것 보다 높은 PDL로 발생하는 노쇠가 가장 바람직하다. 통상적으로 MRC-5 세포에 대해서, 상기에 기재된 바와 같이 혈청의 존재하에서 배양된 세포에 대해서 수득되는 약 PDL60 및 약 PDL75 사이의 노쇠가 바람직하다.
"부착 의존성 동물 세포" 또는 "부착 의존성 인간 세포"는 보통 성장하고 증식하기 위해 고형의 지지체가 필요한 동물 또는 인간 조직으로부터 기원하는 세포주 또는 세포로 확립되는 세포를 의미한다. 고형의 지지체는 기본적으로 성장 표면, 예컨대 플라스틱 또는 유리 표면이다. 적절한 고형 지지체의 예는 페트리 접시, 조직 배양 플라스크, 세포 공장(cell factory), 롤러 병(roller bottle) 또는 미세담체(microcarrier)이다. 본 발명의 목적을 위해, 표면은 동물 기원의 임의의 단백질 또는 이러한 단백질 유래의 펩티드로 코팅되지 않는다. 세포는 부착에 의해, 즉 자가 분비 부착 인자의 분비에 의해 부착하고 퍼진다. 바람직한 부착 의존성 세포는 이배체 세포이다. 이배체 부착 의존성 세포의 비제한적인 예는 ATCC 카탈로그(WI 38: CCL-75, MRC-5: CCL-171, IMR-90: CCL-186, DBS-FRhL-2: CCL-160, MRC-9: CCL-212) 또는 NIA 카탈로그(NIA 노화 세포 보관소용으로 개발된 TIG-1 및 TIG-7, TIG-1 보관 번호 AG06173; IMR-91: I91L)에서 발견될 수 있다. 바람직한 세포는 MRC-5, WI-38, FRhL-2, MRC-9이고 가장 바람직한 세포주는 MRC-5이다.
"실질적으로 없는 배지"는 혈청 및 일차적 동물 기원의 임의의 외생 성분(예컨대 BSA)이 결여된 새로운 배지 및 조정된 배지를 포함하는 배지에 관하여 사용된다. 이러한 새로운 배지 및 조정된 배지는 미량의 이차적 동물 기원의 외생 성분을 함유할 수 있다. "동물 기원의 성분이 없는 배지"는 혈청 및 일차적 동물 기원(예컨대 BSA) 및 이차적 동물 기원 둘 모두의 임의의 외생 성분이 결여된 배지를 의미한다. 일차적 동물 기원의 외생 성분은 예컨대, 우(송아지를 포함), 인간(예컨대, 인간 혈청 알부민-HSA) 또는 돼지 기원의 성분을 포함한다. 이차적 동물 기원의 성분은 제조 단계중 하나에서 동물 기원의 생성물과 접촉하는 성분으로 정의된다. 특히, 빈번하게 사용되는 이차적 동물 유래의 성분은 재조합 성장 인자, 예컨대 인슐린, EGF 및 FGF 및 IGF-1이다. 대장균(E. coli)에서 생성될 수 있는 이러한 재조합 성장 인자는 발효 공급 및/또는 효소적 분해에 사용되는 우 또는 돈 성분과 접촉된다. 미량의 이차적 동물 기원의 성분은 1% 미만, 바람직하게는 0.5% 미만, 더욱 바람직하게는 0.01% 미만, 더욱 바람직하게는 0.001% 미만, 가장 바람직하게는 부재(0%)의 범위이다. 혈청 비함유 기본 배지 및 동물 기원 성분 비함유 배지는 시판되거나 각각의 개별적 성분을 혼합하여 제조될 수 있다. 이들은 비동물 기원의 성장 인자로 적절하게 보충된다. 본 발명에 따르면, 바람직하게는 동물 기원의 외생 성분이 완전히 결여된 배지가 사용된다. 동물 기원의 외생 성분이 전혀 없는 배지가 바람직한 구체예이지만, 상기의 모든 성분은 방법의 수행에 임의의 영향을 주지 않고 이차적 동물 기원 성분(예컨대, 상기에 언급된 바와 같은 성장 인자, 밀 펩톤, 아미노산, 프로테아제 등)으로 대체될 수 있다.
"동물 기원" 또는 "동물 유래"는 포유동물, 예컨대 인간 뿐만 아니라 비포유동물 예컨대, 곤충, 어류, 조류, 양서류 및 파충류를 의미한다.
용어 "외생"은 세포에 의해 분비되는 "내생"으로 언급되는 성분과 대조적으로 배지에 첨가되는 비동물 기원의 성분을 의미한다. 따라서, 대조적으로, 용어 "외생"은 적절한 기질 상의 부착, 스프레딩(spreading) 및 성장에 기여하기 위해 세포에 의해 합성되고 분비(자가분비)되는 성분(피브로넥틴, 콜라겐, 프로테오클리칸, 성장 인자...)을 의미한다(M.R. Koller & E.T. Papoutsakis, Bioprocess Technol., 1995, 60, 61-110).
바람직하게는, 세포 배양 배지는 일차적 동물 기원의 외생 성분이 결여되고, 하나 이상의 이차적 비동물 기원의 외생 성장 인자, 바람직하게는 2개 이상, 더욱 바람직하게는 3개 이상 또는 그 이상의 성장 인자를 포함한다. 적절하게는, 세포 배양 배지는 이차적 비동물 기원의 EGF, FGF, 트리-요오도-L 티로닌 및 히드로코르티손, 및 IGF-1 및/또는 인슐린중 하나 이상으로 구성되는 목록으로부터 선택된 하나 이상의 이차적 비동물 기원의 외생 성장 인자를 포함한다. 적절하게는, 배양 배지는 이차적 비동물 기원의 EGF, FGF, 트리-요오도-L 티로닌 및 히드로코르티손 및 이차적 비동물 기원의 IGF-1 및/또는 인슐린중 하나 이상의 배합물을 포함한다. 용어 "성장 인자"는 세포 성장에 필요하고, 배양 과정 동안에 세포의 의해 생성될 수 있고, 예컨대 세포 부착 및 성장을 촉진함으로써 그 세포 및/또는 다양한 다른 이웃한 또는 떨어진 세포에 영향을 줄 수 있는 사이토카인을 포함하는 단백질, 펩티드 또는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드의 복합체를 의미한다. 전부는 아니지만 몇몇의 성장 인자는 호르몬이다. 예시적인 성장 인자는 인슐린, IGF-1을 포함하는 인슐린 유사 성장 인자(IGF), 표피 성장 인자(EGF), 염기성 FGF(bFGF)를 포함하는 섬유아세포 성장 인자(FGF), 과립구-대식구 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF), 전환 성장 인자 알파(TGF 알파), 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 신경 성장 인자(NGF), 각질세포 성장 인자(KGF), VEGF, 전환 성장 인자 베타(TGF 베타), 인터루킨-8(IL-8), 인터루킨 6(IL-6), 트리-요오도-L 티로닌 및 히드로코르티손이다. 바람직한 성장 인자는 예컨대 EGF, FGF(바람직하게는 bFGF), IGF-1 또는 인슐린, 트리-요오도-L 티로닌 및 히드로코르티손을 포함하고, 이는 단독, 바람직하게는 조합으로 사용될 수 있다. 바람직한 배양 배지는 비동물 유래 EGF, FGFb, IGF-1 또는 인슐린, 트리-요오도-L 티로닌 및 히드로코르티손을 함유한다. 더욱 바람직하게는, 표 3에 나열된 바와 같은 본 발명에 따른 세포 배양 배지의 모든 성분은 일차적 및 이차적 비동물 기원이다.
바람직한 구체예에서, 배양 배지는 비동물 유래 단백질 가수분해물, 바람직하게는 식물 또는 효모 유래 단백질 가수분해물을 추가적으로 함유한다. "단백질 가수분해물" 또는 "단백질 펩톤"은 또한 당 분야에서 널리 이해되는 바와 같이 단백질 가수분해물의 정제된 제조물 또는 이의 가공되지 않은 분획이므로 단백질을 비함유한다. 용어 "단백질을 비함유하는"은 임의의 기능적으로 활성인 단백질은 없으나, 단백질 가수분해물로부터 바로 유래될 수 있는 비기능성 펩티드는 제외되지 않을 수 있음을 의미한다. 특히 적절한 가수분해물 분획은 밀 펩톤 단백질 가수분해물, 예컨대 대다수 80%의 펩티드가 300 내지 1000 달톤인 10000 달톤 이하의 펩티드로 구성되는 효소 분해물을 함유한다. 존재하는 경우, 배양 배지 내의 단백질 가수분해물의 농도는 0 내지 10 g/ℓ, 존재하는 경우 바람직하게는 1 내지 5 g/ℓ, 특히 바람직하게는 2.5 g/ℓ이다. 특히, 단백질 가수분해물은 식물(예컨대, 벼, 옥수수, 밀, 콩, 완두콩, 목화, 감자) 또는 효모에서 유래된다. 본 발명에 따른 바람직한 식물 단백질 가수분해물은 밀 펩톤 단백질 가수분해물이다.
대안적으로, 본 발명에 따른 세포 배양 배지는 "새로운 배지", "조정된 배지", 또는 두 배지의 혼합물을 의미한다. "새로운 배지"는 임의의 세포를 배양하는데 사용되지 않은 시판되거나 각각의 개별적 성분으로부터 제조된 임의의 세포 배양 배지를 의미한다. 본 발명의 바람직한 양태에 따르면, 새로운 배지는 상기에 기재된 바와 같이 시판되는 배지 또는 개별적 성분으로부터 제조된 배지를 의미한다. 이는 본 발명에 따르면 일차적 동물 기원 성분이 결여되고 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 이차적 비동물 기원의 외생 성장 인자, 및 임의로는, 그러나 바람직하게는 밀 단백질 가수분해물과 같은 비동물 기원의 단백질 가수분해물로 보충된다.
"조정된 배지"는 하나의 세포 배양에 사용되었고 또 다른 세포에 의해 재사용되는 배지를 의미한다. 이러한 조정된 배지는 첫번째 배양에 의해 내생의 성장 자극 물질, 내생의 부착 인자 및 특정 내생 영양소의 방출을 포함한다.
따라서, 본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명에 따른 새로운 배양 배지를 동물, 바람직하게는 인간 부착 의존성 세포와 결합시켜 조정된 배양 배지를 생성시키는 것을 포함하여 조정된 배양 배지를 생성하는 방법이 제공된다.
달리 상술하지 않는 경우, 새로운 배지, 조정된 배지 및 두 배지의 혼합물은 "배양 배지"로 언급될 것이다.
표 2는 새로운 배지에 첨가되는 성장 인자(들) 및 단백질 가수분해물의 농도 범위 및 바람직한 농도를 나타낸다. 따라서, 존재하는 경우에 본 발명에 따른 적절한 세포 배양 배지 내의 성장 인자의 농도는 표 2에 규정된 바와 같다.
표 2
본 발명에 따른 새로운 배양 배지는 배양되는 세포형 및 달성하고자 하는 성능에 따라 임의적으로 배양 배지에서 통상적으로 발견되고 비동물 기원인 성분으로 추가로 보충될 수 있다는 것이 이해될 것이다. 예를들어, 적절한 성분은 모두 비동물 기원인 아미노산(비필수 아미노산 포함), 비타민, 뉴클레오티드/뉴클레오시드, 지방산, 항생제 및 산화 안정제이다.
적절한 새로운 배지는 비동물성 표준 배지, 예컨대 DMEM-기초(고-글루코오스 둘베코 변형 이글 배지(high-glucose Dulbecco's Modified Eagle's Media)), MEM(최소 필수영양 배지 이글), 배지 199, RPM-1 1640은 모두 시판되며, 특히 라이프-테크놀로지스-집코-BRL(Life-technologies-Gibco-BRL), 바이오위트테이커(BioWittaker), 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)에서 시판되고, 이는 상기에 교시한 바와 같이 성장 인자(들) 및 임의로는 비동물 기원의 단백질 가수분해물로 추가로 적절하게 보충된다. 당업자는 출발 배지가 배양되는 세포형에 따라 선택되는 것이 필요하다는 것을 이해할 것이다. 바람직한 시판되는 새로운 배지는 바이오위트테이커사에서 시판하는 울트라-MEM(카탈로그 번호 12-745F)이다. 대안적으로, 배양되기 위한 세포형에 따라, 새로운 배지는 각각의 개별적 성분으로부터 제조되고, 탄수화물원, 무기염 성분, 미량의 원소, 아미노산(비필수 아미노산 포함), 비타민, 뉴클레오티드/뉴클레오시드, 지방산, 항생제, 산화 안정제 및 물을 포함(비한정적 열거)하고, 상기에 교시한 바와 같이 비동물 기원 외생 성장 인자(들) 및 임의적으로, 그러나 바람직하게는 비동물 기원 단백질 가수분해물로 적절하게 보충된 비동물성 배지이다. 이러한 배지의 기본 조성의 예는 실시예 1 및 표 3에 주어진다.
상기 배지는 동물, 예컨대 포유동물, 바람직하게는 인간 세포, 특히 부착 의존성 동물, 예컨대 포유동물, 바람직하게는 인간 세포, 바람직하게는 부착 의존성 이배체 세포의 배양에 적합하고, 이는 본 발명의 또 다른 양태이다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 본 발명에 따른 배양 배지 내에서 하기의 단계를 포함하는 방법으로 동물, 바람직하게는 인간 부착 의존성 세포, 바람직하게는 이배체 세포를 생산하기 위한 방법이 또한 제공된다:
a) 상기 배양 배지에 세포를 시딩하고, 세포가 기질에 부착되도록 하는 단계;
b) 단계 a)로부터 생성된 조정된(conditioned) 배지를 수거하고, 비동물 기원의 프로테아제로 기질로부터 세포층을 떼어내고 세포를 해리시켜 세포 현탁액을 형성시키는 단계;
c) 세포 부착을 가능하게 하는 부착 지지물을 포함하는 배양 장치내에서, 단계 b)의 세포의 현탁액을 상기 배양 배지에 접종시키는 단계;
d) 동일한 배양 배지내에서 세포를 성장시키는 단계;
e) 임의적으로 단계 b) 내지 단계 d)를 반복하는 단계.
임의로, 상기 방법은 세포 은행을 생성하기 위해 단계 b)에서 수거한 세포를 동결하는 단계를 포함한다.
임의로, 단계 b)에서 사용된 프로테아제는 처리 후에 비활성화된다.
세포형 및 달성하려는 세포 배양 방법의 성능에 따라, 당업자는 특히 단계 b) 및 c)에 사용되는 배양 배지가 새로운 배지, 또는 이전의 배양으로부터 유래된 조정된 배지 또는 새로운 배지와 조정된 배지의 혼합물일 수 있음을 이해할 것이다. 혼합물 내에서, 새로운 배양 배지 및 조정된 배양 배지 사이의 비는 1:0(100% 새로운 배지) 내지 0:1(100% 조정된 배지)이다. 바람직하게는, 조정된 배지는 배지 전체 부피의 0 내지 약 75%이다. 새로운 배양 배지 및 조정된 배양 배지 사이의 바람직한 비는 1:1(50% 새로운 배지/50% 조정된 배지)이고, 더욱 바람직한 비는 약 7:1(87.5% 새로운 배지/12.5% 조정된 배지) 내지 1:7이고, 가장 바람직한 비는 약 3:1(75% 새로운 배지/25% 조정된 배지) 내지 1:3이고, 가장 바람직한 비는 3:1(75% 새로운 배지/25% 조정된 배지)이다. 바람직한 비는 바람직하게는 배지의 매 교환시에 배양 과정에 걸쳐 유지된다.
프로테아제는 비동물 기원으로, 이는 프로테아제가 동물 공급원으로부터 정제되지 않음을 말하는 것이다. 프로테아제는 재조합 기원일 수 있으나, 바람직하게는 세균, 효모 또는 식물 기원이고, 적절하게는 이차적 비동물 기원이다. 재조합 기원의 프로테아제는 이의 생산을 위해 미생물, 예컨대 세균, 바이러스, 효모, 식물 등의 사용을 포함하는 재조합 DNA 기술로 생산되는 임의의 프로테아제를 의미한다. 바람직한 프로테아제는 시스테인 엔도펩티다아제, 중성 진균 프로테아제(황국균(A. oryzae)에서 유래됨), 중성 세균 프로테아제(고초균(Bacillus subtilis)에서 유래됨)(Brocklehurst, K. et al., Cysteine proteinases. In New Comprehensive Biochemistry Vol. 16, Hydrolytic Enzymes; Neuberger, A. & Brocklehurst, K., eds, pp. 39-158 (1987) Elsevier, Amsterdam), 세린 프로테아제, 예컨대 트립신 유사 프로테아제(예컨대, 인비트로젠사(Invitrogen, 3175 Staley Road, Grand Island, NY 14072)의 제품 카탈로그 번호 02-106의 알프로테아제(rProtease)) 또는 재조합 트립신(예컨대, 프로디젠사(Prodigen, 101 Gateway Blvd, Suite 100 College Station, Texas 77845)의 옥수수 내에서 생산된 재조합 트립신인 제조 코드가 TRY인 트립진(Trypzean))이다. 트립신 유사 프로테아제족의 프로테아제는 일반적으로 원핵생물, 동물 및 바이러스에서 발견되나, 놀랍게도 지금까지는 식물에서 발견되지 않았다. 이들 효소는 다양한 생리적 과정에 관여하고, 이들중 가장 알려진 것은 소화, 수정, 혈액 응고 캐스케이드 및 발생 과정이다. 이들은 공통의 조상 단백질로부터 분기된 것으로 간주된다. 이들 효소는 문헌에 광범위하게 기재되어 있고(A.J. Greer, "Comparative modelling methods - application to the family of mammalian serine proteases" Proteins, Vol. 7, p 317-334, 1990), 이들의 구조를 기초로 하여 다양한 족으로 나누어질 수 있다(A. Sali & T. Blundell, "definition of general topological equivalence in protein structures" J. Mol. Biol., 212, p 403-428, 1990). 적절한 프로테아제는 세린 프로테아제, 예컨대 재조합 트립신 또는 트립신 유사 프로테아제이다. 바람직한 프로테아제는 중성 진균 프로테아제 또는 중성 세균 프로테아제이다. 본 발명에 따른 더욱 바람직한 프로테아제는 시스테인 엔도펩티다아제이다. 특히 바람직한 시스테인 프로테아제는 식물 기원이다. 식물 기원의 바람직한 시스테인 엔도펩티다아제는 피신(무화과인 피쿠스 글라브라타(Ficus glabrata)의 유액의 주요 단백질 분해 성분)(Liener, I.E. & Friedenson, B. Methods Enzymol, 1970, 19, 261-273), 줄기 브로멜라인(stem bromelain)(파인애플 식물인 아나나스 코모서스(Ananas comosus)의 줄기로부터 추출), 액티니딘(키위 과일 또는 차이니즈 구즈베리인 참다래(Actinidia chinensis)에서 유래) 및 파파인(파파야(Carica papaya) 과일의 유액에서 유래)으로 구성되는 군으로부터 선택된다. 시스테인 프로테아제로는 피신이 특히 바람직하다.
프로테아제는 적당한 분리 시간 내에서 효과적인 세포 해리(개별화된 세포)를 보장하기 위해 적절한 농도로 사용될 수 있다.
이배체 부착 의존성 세포 생성 방법은 실시예 Ⅱ에 예시된 단계를 참조하여 더욱 잘 이해된다. 요컨대, 세포층은 본 발명에 따른 배양 배지내에서 세포 배양을 위해 해동되고 시딩된 세포에서 유래되거나 이전의 계대배양으로부터 유래된다. 이후, 첫번째 단계에서, 세포 분리를 위해 부착 의존성 세포 배양의 배지를 분리하고 접종 단계를 위한 조정된 배지로 사용하기 위해 유지한다. 세포층(바람직하게는 세척됨)은 프로테아제 용액을 사용하고 플라스크를 진탕시킴으로써 분리되고 개별화된 세포로 해리된다. 세포가 분리되고 개별화되는 경우, 세포 현탁액이 수거되고 세포 접종 또는 세포 은행 생성에 사용될 수 있다. 임의적으로, 프로테아제의 활성이 세포주의 배양에 대해 유독한 경우, 이는 적절한 프로테아제 억제제로 억제될 수 있다. 두번째 단계에서, 세포 접종을 위해 세포는 생성된 세포주에 적용되는 보통의 세포 밀도로 새로운 플라스크 내로 시딩된다. 이후, 배양 배지, 바람직하게는 새로운 배양 배지 및 조정된 배지의 혼합물이 새로운 플라스크로 첨가된다. 세번째 단계에서, 세포 성장을 위해 새로운 세포 배양물은 세포주 생성에 사용되는 보통의 방법에서 적용되는 바와 같은 동일한 온도 및 동일한 분위기에서 인큐베이션된다. 임의적인 네번째 단계는 단계 1(세포 분리) 후에 단계 2(세포 접종) 및 단계 3(세포 성장) 대신에 세포 은행 생성을 위해 적용될 수 있다. 이는 세포주 동결을 위해 사용되는 보통의 비동물 기원의 동결보호제(보통 DMSO 및 메티셀룰로오스)로 보충된 동물 기원 성분이 결여된 배지내에서 세포를 동결시킴으로써 수행된다.
보통, 세포는 외생의 동물 기원의 성분이 전혀 없는 배지내에서 배양하기 전에 감소된 농도의 상기 성분을 이용한 수 회의 배양을 포함하는 소정의 계획에 따라 외생의 동물 유래 성분이 결여된 배지내에서의 성장에 적합되어야 한다(Chandler JP., Am Biotechnol Lab 1990, 8, 18-28). 이러한 적합 단계는 보통의 세포 성장 및 통상적 세포 형태를 보장하기 위해 필요하다.
본 발명에 따라 세포를 생산하는 방법은 외생의 동물 기원의 성분이 없는 배지내에서 세포를 배양하기 전에 임의의 적합 단계를 필요로 하지 않고, 이러한 적합 단계의 부재에 의해 세포의 노쇠가 영향받지 않는다는 것이 밝혀졌다. 이는 본 발명의 또 다른 이점이다. 실제로, 보통의 세포 성장 및 통상의 세포 형태는 세포의 노쇠가 관찰되는 개체군 배증 수준(PDL)의 2/3에 상당하는 PDL에 도달하기 위해 필요한 다수의 세대(개체군 배증) 동안 유지된다. 바람직하게는, 보통의 세포 성장 및 통상의 세포 형태는 세포의 노쇠가 관찰되는 개체군 배증 수준에 도달하기 위해 필요한 다수의 세대(개체군 배증) 동안 유지된다. 세포의 노쇠는 동물 기원 성분을 함유하는 보통의 방법에서 관찰되는 PDL과 동등한 PDL에서 관찰된다. 예를들어, 마스터 세포 은행(Master Cell Bank)(PDL 13)으로부터 유래하고 본 발명에 따른 배지에서 배양한 MRC-5 세포의 경우, 보통의 세포 성장 및 통상의 세포 형태는 세포의 노쇠가 관찰된 후에 50 세대(개체군 배증) 이상 동안 유지된다.
따라서, 본 발명은 또한 본 발명에 따른 배양 배지에서의 성장에 적합된 세포주, 바람직하게는 동물, 예컨대 포유동물, 더욱 바람직하게는 인간 이배체 부착 의존성 세포주를 제공한다. "적합"은 통상의 세포 성장 및 세포 형태가 동물 유래 성분을 함유하는 종래의 배지로 관찰된 세대수와 유사한 세대수 동안 유지되거나, 노쇠가 종래의 배지로 관찰되는 것보다 현저히 이르게 관찰되지 않음을 의미한다. 더욱이, 본 발명은 또한 본 발명에 따른 배양 배지에서 생물학적으로 활성인 생성물, 바람직하게는 바이러스의 생성에 적합된 세포주, 바람직하게는 동물, 예컨대 포유동물, 더욱 바람직하게는 인간 이배체 부착 의존성 세포주를 제공한다.
따라서, 또 다른 구체예에서, 본 발명은 또한 본 발명에 따른 배양 배지에서 동물, 예컨대 포유동물, 바람직하게는 인간 이배체 부착 의존성 세포 배양하여 재조합 단백질 또는 바이러스를 생성하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 상기에 정의된 프로테아제를 사용하여 세포 배양물을 계대하는 것을 포함한다. 특히, 통상적으로 이배체 세포인 부착 의존성 세포는 동물 기원의 외생 성분이 실질적으로 없는 영양 배지에 저밀도로 시딩되고, 증식하여 컨플루언트 또는 다중층을 형성한 후, 분리되어 현탁액을 형성하고 다시 저밀도로 시딩된다. 바람직하게는, 세포를 분리하고 계대하기 위해 사용되는 비동물 기원 또는 재조합 기원의 프로테아제는 시스테인 엔도펩티다아제, 중성 진균 프로테아제, 중성 세균 프로테아제 또는 트립신 유사 프로테아제로 구성되는 군으로부터 선택된다. 적절한 프로테아제는 트립신 유사 프로테아제, 예컨대 트립진 또는 재조합 트립신, 예컨대 알프로테아제 또는 시스테인 엔도펩티다아제, 더욱 바람직하게는 피신, 줄기 브로멜라인 및 액티니딘이다. 시스테인 프로테아제로는 피신이 특히 바람직하다.
바람직한 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 세포 배양 배지내에서 하기의 단계를 포함하여, 동물, 예컨대 포유동물, 바람직하게는 인간 부착 의존성 세포, 바람직하게는 이배체 세포에서 바이러스를 생성하는 방법에 관한 것이다:
a) 세포를 바이러스로 감염시키는 단계,
b) 바이러스를 증식시키는 단계, 및
c) 바이러스를 수거하는 단계.
임의적으로, 수거된 바이러스는 1회 이상의 정제 단계에 적용된다. 본 발명의 추가의 양태는 본원에 기재된 바와 같이 생성되고 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 및/또는 애쥬번트와 혼합되어 백신과 같은 면역원성 조성물로서 제형화되는 바이러스를 제공하는 것이다.
세포형 및 달성하려는 세포 배양 방법의 성능에 따라, 당업자는 단계 a)에서 세포를 시딩하기 위해 사용된 배양 배지가 새로운 배지 또는 이전의 배양으로부터 유래되는 조정된 배지 또는 새로운 배지 및 조정된 배지의 혼합물일 수 있음을 이해할 것이다. 바람직하게는, 최적의 바이러스 생성을 위해, 새로운 배양 배지 및 조정된 배양 배지 사이의 비는 1:0(100% 새로운 배지) 내지 0:1(100% 조정된 배지)이다. 바람직하게는, 조정된 배지는 배지의 전체 부피의 0 내지 약 75%이다. 새로운 배양 배지 및 조정된 배양 배지의 바람직한 비는 1:1(50% 새로운 배지/50% 조정된 배지)이고, 더욱 바람직하게는 약 7:1(87.5% 새로운 배지/12.5% 조정된 배지)이고, 가장 바람직하게는 약 3:1(75% 새로운 배지/25% 조정된 배지)이다. 1:0(100% 새로운 배지)의 새로운 배양 배지 및 조정된 배양 배지 사이의 비가 특히 바람직하다. 세포를 감염시키고 바이러스를 증식시키기 위해 사용되는 배지는 성장 배양 배지와 동일할 수 있고, 더욱 바람직하게는 25% w/v의 EGF, 25% w/v의 bFGF 및 25% w/v의 T3를 포함하며, 임의로 20% w/v의 단백질 가수분해물, 바람직하게는 밀 펩톤 E1(Organotechnie SA, France)으로 추가로 보충된다. 가장 바람직하게는, 배지는 임의의 단백질 가수 분해물을 함유하지 않는다.
바이러스 생성의 방법은 실시예 Ⅲ에 예시된 단계와 관련하여 더욱 잘 이해된다.
요컨대, 첫번째 단계에서 바이러스 감염을 위해 본 발명에 따른 배지에서 본 발명의 방법에 따라 배양된 부착 의존성 세포는 바이러스 생성을 위해 사용되는 보통의 방법에서 적용되는 감염다중도(MOI)와 동일한 감염다중도로 적절한 바이러스로 감염된다. 두번째 단계에서, 바이러스 증식을 위해 감염된 세포는 바이러스 생성을 위해 적용되는 보통의 방법에서 통상적으로 적용되는 것과 동일한 온도 및 동일한 분위기에서 배양된다. 세번째 단계에서, 바이러스는 바이러스 생성을 위해 사용되는 보통의 방법에서 적용되는 것과 동일한 증식 시간 후에 수거된다. 바이러스 수거 방법은 바이러스 수거를 위한 방법에서 통상적으로 적용되는 방법에 따른다. 바이러스 생성을 위해 적용되는 일반적인 배양 조건에 대해, A형 간염 바이러스(Hepatitis A virus) 배양 방법(WO 95/24468), A형 간염 바이러스 백신(WO 94/06446; A. Hagen J., 2000, Bioprocess Engineering 23, 439-449)을 참조하라.
본 발명에 따른 배지 및 방법을 사용하여 생성될 수 있는 바이러스 및 인간 바이러스 백신의 예는 살아있거나 약독되고 비활성화된 재조합 변형된 생바이러스를 포함한다. 특히, 부착 의존성 세포에서 증식될 수 있는 백신 용도를 위한 약독된 바이러스는 아데노바이러스과(즉, 아데노바이러스 1-49), 헤르페스바이러스과(즉, 헤르페스바이러스 HSV, 사이토메갈로바이러스 CMV, 수두대상포진 바이러스 VZV, 엡스타인-바 바이러스 EBV), 플라비바이러스과(즉, 뎅기바이러스, C형 간염 바이러스 HEV, 일본 뇌염 바이러스, 황열바이러스), 폭스바이러스과(즉, 우두, 원숭이 폭스바이러스, 백시니아바이러스, 마마바이러스), 피코르나바이러스과(즉, 에코바이러스, 콕삭키바이러스, A형 간염 바이러스, 폴리오바이러스, 리노바이러스), 리오바이러스과(즉, 로타바이러스, 콜로라도진드기열 바이러스), 토가바이러스과(즉, 동부말뇌염(Eastern equine encephalytis) 바이러스, 풍진바이러스), 헤파드나 바이러스과(즉, B형 간염 바이러스), 레트로바이러스과(즉, 면역결핍 바이러스 HIV/SIV), 파라믹소바이러스과(즉, 홍역 바이러스, 이하선염바이러스, 파라인플루엔자바이러스, 호흡기합포체바이러스 RSV), 랍도바이러스과(즉, 광견병바이러스, 수포성 구내염 바이러스), 오르토믹소바이러스과(즉, 인플루엔자 바이러스), 미분류 바이러스(즉, E형 간염 바이러스, D형 간염 바이러스), 아스트로바이러스과(즉, 아스트로바이러스), 코로나바이러스과(즉, 코로나바이러스), 아레나바이러스과(즉, 주닌 바이러스), 분야바이러스과(즉, 리프트 밸리 피버(lift valley fever) 바이러스)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 또 다른 구체예에서, 본 발명에 따른 방법을 사용한 바이러스 백신의 생성은 부착성 세포내에서 발현된 재조합 단백질의 생성을 포함한다. 바람직한 부착 의존성 세포는 예컨대 AGMK, VERO, MDCK(개 상피 신장 세포), CEF(닭, 태아 섬유아세포) 및 CHO(중국 햄스터 난소 세포)를 포함하고, 더욱 특히 바람직한 세포는 부착 의존성 이배체 세포, 예컨대 MRC-5, WI-38, TIG-1, TIG-7, FRhL-2, MRC-9, IMR-90 및 IMR-91이다. MRC-5가 특히 바람직한 세포주이다. 본 발명에 따른 방법은 A형 간염 바이러스, 이하선염 바이러스 및 VZV의 생성에 성공적임이 증명되었다.
본 발명의 바람직한 양태에 따르면, 간염, 특히 HAV, 폴리오 바이러스, HSV, 특히 HSV-1 및 HSV-2, CMV, EBV, 풍진 바이러스, 파라믹소바이러스과(예컨대, 홍역 바이러스, 이하선염 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 호흡기합포체바이러스 RSV), VZV중 어느 하나로 감염된 세포가 바람직하다.
평균적으로, 마스터 세포 은행을 개시하기 위해 15 세대가 필요하고 작용성 세포 은행을 생성하기 위해 10 세대가 필요하다. 400 Ｌ 규모의 평균 배치 배양을 수행하기 위해 약 15 세대 이상이 필요하다. 부착 의존성 세포주를 출발 물질로 하여 본 발명에 따른 배지를 사용하면, 약 15 세대를 지닌 마스터 세포 은행(MCB) 및 약 10 세대를 지닌 작용성 세포 은행을 제조하기 위해 동일한 계획을 수행하는 것이 가능하며, 이로써 동물 기원의 외생 성분이 없는 배지와 관련하여 개발된 조건하에서 약 15 세대를 지닌 배양물을 제조할 수 있다.
본 발명은 또한 세포, 바람직하게는 이배체 부착 의존성 세포, 더욱 바람직하게는 진핵 세포, 가장 바람직하게는 동물, 예컨대 포유동물, 바람직하게는 인간 세포의 배양을 위해 본원의 상기에 기재된 배양 배지를 사용하는 것을 고려한다. 또한, 본 발명에 따른 배양 배지 및 세포, 바람직하게는 이배체 부착 의존성 세포, 더욱 바람직하게는 진핵 세포, 가장 바람직하게는 동물, 예컨대 포유동물, 바람직하게는 인간 세포를 포함하는 세포 배양물을 제공하는 것이 본 발명의 목적이다.
본 발명은 추가로 본원에 기재된 방법으로 수득가능한 바이러스 개체군에 관한 것이다. 이는 추가로 바이러스 개체군을 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 애쥬번트와 혼합하는 것을 포함하여 바이러스 백신을 생성하는 방법에 관한 것이다.
실시예 Ⅰ.1. 개별적 성분으로부터의 새로운 배지의 제조
예시적인 유리한 새로운 배양 배지는 표 3에 나열된 일반적 성분의 전부 또는 대부분을 포함한다. 본 발명에 따르면, 이 배지는 표 2에 나열된 성장 인자 및 단백질 가수분해물로 적절하게 보충될 수 있다.
표 3 - 동물 기원의 성분이 없는 배지
실시예 Ⅰ.2. 적절하게 보충된 시판되는 배지로부터의 새로운 배지의 제조
시판되는 배지 : 바이오위트테이커사(BioWittaker)에서 구입가능한 울트라-MEM(카탈로그 번호 12-745F)(혈청이 감소된 배지, 단백질 비함유 기본 배지, L-글루타민이 없음)
기본 배지 포뮬레이션은 동물 기원의 성분이 없으나 통상적으로 제조자의 지시에 따라 소량의 혈청(예컨대, 10% 미만) 및 기타 첨가물(ITES = 인슐린(동물 기원) + 트랜스페린(동물 기원) + 에탄올아민 + 셀레늄)이 보충되도록 설계되어 있다. 이 배지를 동물 기원의 권장 보충물(혈청 및 ITES)의 부재하에서 사용했다.
이 배지에 하기 성분들을 보충했는데, 이들 모든 성분은 일차적 및 이차적 동물 기원의 성분이 없었다:
1. IGF-1 : 0.1 ㎎/Ｌ
2. EGF : 0.005 ㎎/Ｌ
3. bFGF : 0.003 ㎎/Ｌ
4. 트리요오도-L-티로닌(T3) : 0.066 ㎎/Ｌ
5. 밀 펩톤 E1 : 2.5 g/Ｌ 및, 추가로,
6. 페릭 프룩토오스 : 0.1667 ㎖/Ｌ
7. 피루브산 나트륨 : 0.055 g/Ｌ.
하기의 성분을 또한 동물 기원 성분의 부재하에서 수행되는 배양 방법을 최적화시키기 위해 첨가했다:
- 글루타민 : 0.2922 g/Ｌ
- 글루코오스 : 0.33 g/Ｌ
- 셀레늄(Na2SeO3) : 0.01 ㎎/Ｌ
- 에탄올아민 : 0.0006 ㎕/Ｌ.
비동물성 세포 은행으로부터 MRC-5 세포(PDL 21)를 해동시키고, 상기에 기재된 배지와 하기의 계대배양 계획을 이용하여, 실시예 Ⅱ 및 Ⅳ에 기재된 방법에 따라 배양했다:
· D7 : 12.5%의 조정된 배지로 구성된 100 ㎖의 성장 배지중 1/8의 비로 세포 접종
· D12 : 25%의 조정된 배지로 구성된 100 ㎖의 성장 배지중 1/4의 비로 세포 접종
· D16 : 12.5%의 조정된 배지로 구성된 100 ㎖의 성장 배지중 1/8의 비로 세포 접종
· D21 : D7에서 출발하여 계획을 반복.
±3 개월(예컨대, 80일) 동안 노쇠(± PDL 65)에 이르기까지 175 ㎠의 T-플라스크에서 세포를 배양했다. 이 과정에서, 세포 접종물을 목표 세포 밀도로 고정시키지 않았다. 대조군에 대해 수행된 세포수 계산은 노쇠가 관찰되기 전에 세포 접종물 밀도가 9000 세포/㎠ 및 40000 세포/㎠ 사이에 포함되는 것으로 나타났다. MRC-5 세포는 노쇠가 관찰된 후에 0.57 PDL/일의 세포 성장률로 배양 81일 후에 PDL66에 도달했다. 도 4, 5 및 6에 예시된 이 결과는 81일 후에 약 PDL65에서의 노쇠 및 약 0.56 PDL의 세포 성장률을 일으키는 섹션 Ⅰ.2에 예시된 개별적 성분으로부터 제조된 배지에서 관찰되는 것과 동등했다.
동시에, EGF, bFGF 및 T3 농도가 세포 성장 배지에 존재하는 농도의 25%로 감소되고, 밀 펩톤 농도가 0.5 g/Ｌ로 감소되는 것을 제외하고 본원의 상기에 기재된 동일한 배지를 사용하여 실시예Ⅲ에 기재된 방법에 따라 HAV를 생성하기 위해 상기의 배양으로부터 유래되는 세포를 사용했다. 바이러스의 수거는 배양 시작 2개월 후에 수행했다.
실시예 Ⅱ
동물 기원의 임의의 성분이 실질적으로 없는 배양 배지에서 동물 또는 인간 부착 의존성 세포를 생성하는 방법.
단계 1 : 세포 분리
세포 배양 플라스크에서 성장한 부착 의존성 세포 배양의 배양 배지를 분리하고 멸균 용기에 보관했다. 이렇게 회수한 배지는 조정된 배지로 간주하고 세포 접종에 사용한다. 세포층을 EDTA가 보충된 인산염 완충 염수(PBS)로 2회 세척했다. PBS 리터 당 약 0.04 g 내지 약 1 g의 EDTA, 바람직하게는 약 0.2 g/Ｌ의 목표치가 바람직하다.
세포층을 세척한 후, 전체 세포층이 덮이도록 충분한 양의 프로테아제 용액을 첨가했다. 약 0.01 ㎖/㎠ 내지 약 2 ㎖/㎠, 바람직하게는 0.0333 ㎖/㎠의 목표 부피가 바람직하다. 이 프로테아제 용액은 EDTA로 보충된 PBS 내에서 효소를 용해시켜 제조했다. PBS 리터 당 약 0.02 g 내지 약 0.5 g의 EDTA, 바람직하게는 약 0.1 g/Ｌ의 목표치가 바람직하다. PBS/EDTA에 첨가되는 프로테아제의 양은 효과적인 세포 분리를 달성하기에 충분한 단백질 분해 활성을 지니는 용액을 생성시키는데 필요한 양이다. 세포 분리는 대부분의 세포가 플라스크에서 분리되고 세포 집합물이 약 5 분 내지 약 30 분, 바람직하게는 약 12 분의 바람직한 목표 시간 후에 개별적인 세포로 해리되는 경우에 유효한 것으로 간주했다. 부착 의존성 세포에 대해 사용될 수 있는 몇몇 프로테아제의 효소적 활성은 예를들어 하기의 목록에 주어지나 이에 제한되지 않는다:
- 피신에 대해 약 5.5 μUPABA/㎖ 내지 약 550 μUPABA/㎖, 바람직하게는 약 55 μUPABA/㎖의 목표 효소 활성이 바람직하다(PABA의 1 유닛(unit)은 37℃에서 분당 1 μmole의 Na- 벤조일- DL-아르기닌-p-니트로아닐린을 가수분해하는 효소의 활성이다(참조: Methods in Enzymology Vol ⅩⅠⅩ Proteolytic enzymes p261-284)).
- 브로멜라인에 대해 약 0.001 젤라틴 분해 단위(GDU)/㎖ 내지 약 0.1 GDU/㎖, 바람직하게는 약 0.01 GDU/㎖의 목표 효소 활성이 바람직하다(GDU 활성의 1 유닛은 검정 조건에서 확정된 젤라틴 기질로부터의 아미노산 1 ㎎을 유리시키는 효소의 활성이다(상기 참조와 동일)).
- 황국균(A. oryzae)으로부터의 중성 진균 프로테아제에 대해 약 12.5 ㎍/㎖(1.25 ㎍/㎖ 내지 약 125 ㎍/㎖, 바람직하게는 약 12.5 ㎍/㎖)의 단백질 양에 상응하는 목표 효소 활성이 요망된다(제조자인 리벤 자크 노르만디얼(Lyven Zac Normandial, 11 avenue du Pays de Caen 14460 Colombelles, France)에 의거함).
- 고초균(B. subtilis)으로부터의 중성 세균 프로테아제에 대해 약 150 ㎍/㎖(15 ㎍/㎖ 내지 약 1.5 ㎎/㎖, 바람직하게는 약 150 ㎍/㎖)의 단백질 양에 상응하는 목표 효소 활성이 요망된다(제조자인 리벤 자크 노르만디얼(Lyven Zac Normandial, 11 avenue du Pays de Caen 14460 Colombelles, France)에 의거함).
- 트립진에 대해 약 100 USP/㎖ 내지 0.1 USP/㎖, 바람직하게는 1 USP/㎖의 목표 효소 활성이 요망된다(제조자인 프로디젠(Prodigen, 101 Gateway Blvd, Suite 100 College Station, Texas 77845. Manufacturer code : TRY)에 의거함).
- 알프로테아제에 대해 약 3 배 내지 300 배, 바람직하게는 30 배의 원액(stock solution)의 목표 희석이 요망된다(공급자인 인비트로젠(Invitrogen, 3175 Staley Road, Grand Island, NY 14072. Supplier catalogue number 02-106)에 의거함).
세포 분리가 관찰되는 경우, 플라스크를 천천히 진탕시키고 세포 현탁액을 멸균 용기내로 수거했다. 세포를 최대한으로 수거하기 위해, 플라스크를 새로운 배양 배지로 헹구어 동일한 멸균 용기로 수거했다. 이후 세포 현탁액을 세포 접종 단계 또는 세포 은행 생성 단계를 위해 준비했다.
단계 2 : 세포 접종
단계 1에 기재된 세포 분리 후에 수득한 부착 의존성 세포는 하기의 지시에 따라 새로운 플라스크에 접종시킬 수 있다:
- 세포를 동물 기원 성분으로 부착 의존성 세포를 배양하기 위한 보통의 방법에 적용되는 것과 동일한 세포 밀도로 접종시켰다. 예를들어, MRC-5 세포는 약 5000 세포/㎠ 내지 약 40000 세포/㎠, 바람직하게는 7500 세포/㎠ 내지 약 25000 세포/㎠의 목표 세포 밀도로 접종시켰다.
- 세포 접종 후에 플라스크내로 첨가되는 성장 배지의 부피는 동물 기원 성분으로 부착 의존성 세포를 배양하기 위한 보통의 방법에 첨가되는 부피와 동일하다. 성장 배지는 새로운 배지 및 조정된 배지의 혼합물로 구성된다. 조정된 배지는 세포 분리 단계(단계 1 참조)의 초기에서 수거한 세포 배양 배지이다. 새로운 배지로 첨가되는 조정된 배지의 양은 접종되는 세포주를 기초로 했다. 조정된 배지의 0% 내지 약 75%의 일반적 목표치가 요망된다. 예를들어, MRC-5 세포 배양에 대해서는 바람직하게는 약 10% 내지 약 35%의 조정된 배지의 목표치가 요망되고, 바람직하게는 약 0.025 ㎖/㎠ 내지 약 3 ㎖/㎠의 조정된 배양 배지의 목표가 플라스크 내로 첨가되는 것이 요망된다.
단계 3 : 세포 성장
세포 배양 플라스크 내에 접종된 부착 의존성 세포를 동물 기원 성분으로 부착 의존성 세포를 배양하기 위한 보통의 방법에서 적용되는 것과 동일한 온도에서 배양했다. 예를들어, 약 30 ℃ 내지 약 40 ℃, 바람직하게는 37 ℃의 목표 온도가 MRC-5 세포 인큐베이션에 요망된다.
세포 배양 플라스크 내에 접종된 부착 의존성 세포를 동물 기원 성분으로 부착 의존성 세포를 배양하기 위한 보통의 방법에서 적용되는 것과 동일한 분위기에서 인큐베이션했다. 예를들어, MRC-5 세포는 CO2 조절의 유무, 및 상대 습도 조절의 유무하에서 배양할 수 있다.
단계 4 : 세포 은행 생성
단계 1에 기재된 세포 분리 후에 수득한 부착 의존성 세포를 하기를 제외하고는 동물 기원 성분으로 부착 의존성 세포를 배양하기 위한 보통의 방법에서 적용되는 것과 동일한 과정 후에 세포 은행 생성을 위해 동결시킬 수 있다:
세포는 동물 기원 성분으로 부착 의존성 세포를 동결시키기 위한 보통의 방법에서 사용되는 바와 동일한 비동물 기원의 동결보호제 첨가물로 보충된 동물 기원 성분이 없는 배지내에서 동결되어야 한다. 예를들어, MRC-5 세포는 약 2.5 % 내지 약 12.5%의 DMSO의 요망되는 목표치 및 약 0.01% 내지 약 1%의 메틸셀룰로오스의 요망되는 목표치로 보충된 동물 기원 성분이 없는 배지 내에서 동결된다.
실시예 Ⅲ
배양 배지내의 동물 또는 인간 부착 의존성 세포에서 바이러스를 생성하는 방법.
단계 5 : 바이러스 감염
부착 의존성 세포를 동물 기원 성분으로 부착 의존성 세포를 배양하기 위한 보통의 방법에서 적용되는 것과 동일한 감염다중도(MOI)로 감염시켰다. 예를들어, 약 0.005 내지 약 1의 MOI 목표치가 A형 감염 바이러스(HAV)에 의한 MRC-5 세포 감염에 요망된다. 세포를 본원에 기재되고 표 2에 따른 성분으로 보충된 동물 기원 성분이 없는 배지에서 감염시켰다. 바이러스 생성에 있어서 단백질 가수분해물은 임의적이다.
단계 6 : 바이러스 증식
감염된 부착 의존성 세포를 동물 기원 성분을 사용한 부착 의존성 세포 배양에서의 바이러스 증식에 대한 보통의 방법에서 적용되는 것과 동일한 온도에서 인큐베이션했다. 예를들어, 약 31℃ 내지 약 33℃, 바람직하게는 32℃의 목표 온도가 MRC-5 세포에서의 HAV 증식에 요망된다. 감염된 부착 의존성 세포를 동물 기원 성분을 사용한 부착 의존성 세포 배양에서의 바이러스 증식에 대한 보통의 방법에서 적용되는 것과 동일한 분위기에서 인큐베이션했다. 예를들어, HAV로 감염된 MRC-5 세포는 CO2 조절의 유무 및 상대 습도 조절의 유무하에서 인큐베이션할 수 있다.
단계 7 : 바이러스 수거
부착 의존성 세포의 감염 및 바이러스 수거 사이에서의 바이러스 증식 시간은 동물 기원 성분을 사용한 부착 의존성 세포 배양에서의 바이러스 증식에 대한 보통의 방법에서 적용되는 것과 동일하다. 예를들어, MRC-5 세포에서의 HAV 증식은 바이러스 감염후 약 21 내지 29일째에 달성된다.
바이러스 수거의 방법은 동물 기원 성분을 사용한 부착 의존성 세포 배양에서의 바이러스 수거를 위한 보통의 방법에서 적용되는 것과 동일하다. 예를들어, MRC-5 세포에서 생성된 HAV의 수거는 세포층을 PBS를 사용한 세포층의 2회 세척으로 시작하여, 0.1 내지 1 g/Ｌ의 EDTA로 보충된 PBS를 사용한 세포 분리 및 이후 동결에 의한 세포 용해에 의해 바이러스가 수거된다.
실시예 Ⅳ
세포 분리를 위한 피신 프로테아제를 사용한 노쇠까지의 MRC-5 세포 배양(도 1, 2 및 3 참조)
MRC-5 세포 노쇠 테스트를 위한 소규모 방법은 노쇠가 관찰될 때까지 단계 1 내지 3에 기재된 동물 기원 성분이 없는 방법을 사용하여 세포를 생산하는 방법을 반복하는 것을 필요로 한다. 동물 기원 성분이 없는 세포 은행 PDL 21으로부터 유래한 MRC-5 세포를 해동시키고, 표 2에 기재된 성분으로 적절하게 보충된 새로운 배지 100 ㎖를 지닌 Nunc T175 ㎠ 플라스크에 접종시키고, 37℃에서 인큐베이션했다. 7일 후에, 세포 분리를 위해 45 μUPABA/㎖의 효소적 활성을 지닌 4.2 ㎖의 피신 용액을 사용하여, 37℃에서 Nunc T-175 ㎠ 플라스크에서 계대배양(단계 1 내지 3 참조)을 수행했다. 계대배양을 하기의 계획에 따라 수행했다:
· D7 : 12.5%의 조정된 배지로 구성된 100 ㎖의 성장 배지중 1/8의 비로 세포 접종
· D12 : 12.5%의 조정된 배지로 구성된 100 ㎖의 성장 배지중 1/8의 비로 세포 접종
· D17 : 25%의 조정된 배지로 구성된 100 ㎖의 성장 배지중 1/4의 비로 세포 접종
· D21 : D7에서 출발하여 계획을 반복.
이 방법에서, 세포 접종물을 목표 세포 밀도로 고정시키지 않았다. 대조군에 대해 수행되는 개체군 계산은 세포 접종물 밀도가 8000 세포/㎠ 및 33000 세포/㎠ 사이에 포함됨을 나타냈다. MRC-5 세포는 노쇠가 관찰된 후에 0.56 PDL/일의 세포 성장률로 배양 90일 후에 개체군 배증 수준 71에 도달했다. 도 1, 2 및 3에 예시된 이 결과는 세포 분리를 위한 돼지 트립신 및 우 혈청을 사용하는 방법에서 관찰되는 것과 동등했다(83일 후에 약 PDL65에서의 노쇠 및 약 0.55 PDL/일의 세포성장률(Wistrom C, Villeponteau. B. Exp. Gerontol, 1990; 25(2) : 97-105)).
실시예Ⅴ
세포 분리를 위한 브로멜라인 프로테아제를 사용한 노쇠까지의 MRC-5 세포 배양(도 1,2 및 3 참조)
이 방법은 하기 사항을 제외하고 실시예Ⅲ에 기재된 바와 유사하다:
- 세포 분리를 위해 피신 용액 대신 0.01105의 젤라틴 분해 유닛(GDU)/㎖의 효소적 활성을 지닌 브로멜라인 용액을 사용했다.
- 하기의 계획에 따라 계대배양을 수행했다:
· D7 : 12.5%의 조정된 배지로 구성된 100 ㎖의 성장 배지중 1/8의 비로 세포 접종
· D12 : 12.5%의 조정된 배지로 구성된 100 ㎖의 성장 배지중 1/8의 비로 세포 접종
· D17 : 12.5%의 조정된 배지로 구성된 100 ㎖의 성장 배지중 1/4의 비로 세포 접종
· D21 : D7에서 출발하여 계획을 반복.
대조군에 대해 수행되는 세포수 계산은 세포 접종물 밀도가 8000 세포/㎠ 및 33000 세포/㎠ 사이에 포함됨을 나타냈다. MRC-5 세포는 노쇠가 관찰된 후에 0.56 PDL/일의 세포 성장률로 배양 82일 후에 개체군 배증 수준 67에 도달했다. 도 1, 2 및 3에 예시된 이 결과는 세포 분리를 위한 돼지 트립신 및 우 혈청을 사용하는 방법에서 관찰되는 것과 동등했다(83일 후에 약 PDL65에서의 노쇠 및 세포 성장률 = 0.55 PDL/일(Wistrom C, Villeponteau. B. Exp. Gerontol, 1990; 25(2) : 97-105)).
실시예Ⅵ
세포 분리를 위한 피신 프로테아제를 사용하여 증식된 MRC-5 세포에서의 HAV의 생성(도 7 참조)
세포 분리를 위해 피신 프로테아제를 사용하여 배양한 MRC-5 세포를 지닌 Nunc 세포 공장(CF)에서의 HAV의 생성은 실시예Ⅱ의 단계 5 내지 7에 기재된 방법의 이행을 필요로 한다. 동물 기원 성분이 없는 세포 은행에서 유래(PDL21에서)된 MRC-5 세포를 실시예Ⅰ의 단계 1 내지 3에 기재된 방법을 사용하여 개체군 배증 수준이 36에 도달할 때 까지 Nunc T175 ㎠ 플라스크에서, 이후 CF에서 증식시켰다. MRC-5 세포를 0.01의 목표 MOI로 표 2에 기재된 배지에서 제조한 HAV 스톡 시드(seed)로 감염시켰다. 감염 후, 7, 14 및 21일 후에 3회의 배지 갱신이 이루어지는 27일 동안 32℃에서 세포를 인큐베이션했다. PBS로 세포층을 2회 세척하는 것으로 출발한 후, 약 0.2 g/Ｌ의 EDTA로 보충된 PBS로 세포를 분리하고, 최종적으로 세포를 동결시킴으로써 감염 27일 후에 HAV 수거를 수행했다. 이 방법을 사용하여 수득한 HAV 벌크(bulk)의 항원 역가는 250 내지 350 E.L.I.S.A 유닛(ELU)/0.1 ㎖이었다. 이 결과는 세포 분리를 위한 돼지 트립신 및 우 혈청을 사용하는 방법에서 관찰되는 것과 동등했다(HAV 벌크 항원 역가 약 250 ELU/0.1 ㎖).
실시예Ⅶ
세포 분리를 위한 브로멜라인 프로테아제를 사용하여 증식된 MRC-5 세포에서의 HAV 생성(도 7 참조)
이 방법은 세포 분리를 위해 피신 용액 대신 0.01105의 젤라틴 분해 유닛(GDU)/㎖의 효소적 활성을 지닌 브로멜라인 용액을 사용하는 것을 제외하고는 실시예Ⅴ에 기재된 방법과 유사하다.
이 방법으로 수득한 HAV 벌크의 항원 역가는 250 및 350 E.L.I.S.A 유닛/0.1 ㎖이었다. 이 결과는 세포 분리를 위한 돼지 트립신 및 우 혈청을 사용하는 방법에서 관찰되는 것과 동등했다(HAV 벌크 역가 약 250 ELU/0.1 ㎖).
실시예Ⅷ
세포 분리를 위해 피신 프로테아제를 사용하여 증식된 MRC-5 세포의 세포 은행 생성(도 8, 9 및 10 참조)
피신을 사용하여 증식된 MRC-5 세포를 위한 세포 은행 생성은 선택한 PDL(PDL21)에 도달할 때까지 실시예Ⅰ의 단계 1 내지 3에 기재된 동물 기원 성분이 없는 방법으로 세포 성장 방법을 반복하는 것을 필요로 한다. 이 PDL에서 세포를 실시예Ⅰ의 단계 4에 기재된 방법에 따라 동결시켰다. 혈청을 함유하는 세포 은행(PDL 14에서)에서 유래된 MRC-5 세포를 해동시키고, 표 2에 기재된 100 ㎖의 배지를 지닌 Nunc T175 ㎠ 플라스크에 접종시키고 37℃에서 인큐베이션했다. 7일 후에, 세포 분리를 위한 45 μUPABA/㎖의 효소적 활성을 지닌 4.2 ㎖의 피신 용액을 사용하여 37℃에서 Nunc T-175 ㎠ 플라스크에서 계대배양(단계 1 내지 3 참조)을 수행했다. 하기의 계획에 따라 계대배양을 수행했다:
· D7 : 12.5%의 조정된 배지로 구성된 100 ㎖의 성장 배지중 1/8의 비로 세포 접종
· D12 : 25%의 조정된 배지로 구성된 100 ㎖의 성장 배지중 1/4의 비로 세포 접종
· D17 : 1/4의 비를 사용하여 세포 은행 생성.
이 방법에서, 세포 접종물을 목표 세포 밀도로 고정시키지 않았다. 세포수 계산치를 도 8, 9 및 10에 나타냈다. MRC-5 세포는 16일 후에 PDL 21에 도달했다. 이 PDL에서 MRC-5 세포를 7.5% DMSO 및 0.1%의 메틸셀룰로오스로 보충된 동물 기원 성분이 없는 배지내에서 동결시켰다. 해동 후에, 이 MRC-5 세포는 생존력 및 세포 성장률이 동결 전에 관찰된 것과 동등함을 나타냈다(약 90 내지 95%의 생존력 및 0.55 PDL/일 초과의 세포 성장률)(도 1, 2 및 3 참조). 이 결과는 세포 분리를 위한 돼지 트립신 및 우 혈청을 사용하는 방법에서 관찰되는 것과 동등했다(약 90 내지 95%의 생존력 및 세포 성장률 = 0.55 PDL/일)(Wistrom C, Villeponteau. B. Exp. Gerontol, 1990; 25(2) : 97-105).
실시예Ⅸ
세포 분리를 위한 브로멜라인 프로테아제를 사용하여 증식된 MRC-5의 세포 은행 생성(도 8, 9 및 10 참조)
이 방법은 하기 사항을 제외하고 실시예Ⅶ에 기재된 방법과 유사하다:
- 세포 분리를 위해 피신 용액 대신 0.01105의 젤라틴 분해 유닛(GDU)/㎖의 효소적 활성을 지닌 브로멜라인 용액을 사용했다.
- 하기의 계획에 따라 계대배양을 수행했다:
· D7 : 25%의 조정된 배지로 구성된 100 ㎖의 성장 배지중 1/4의 비로 세포 접종
· D11 : 12.5%의 조정된 배지로 구성된 100 ㎖의 성장 배지중 1/8의 비로 세포 접종
· D16 : 1/4의 비를 사용하여 세포 은행 생성.
세포수 계산 결과를 도 8, 9 및 10에 나타냈다. MRC-5 세포는 16일 후에 개체군 배증 수준 21에 도달했다. 해동 후에, 이 MRC-5 세포는 생존력 및 세포 성장률이 동결 전에 관찰된 것과 동등함을 나타냈다(약 90 내지 95%의 생존력 및 0.55 PDL/일 초과의 세포 성장률)(도 1, 2 및 3 참조). 이 결과는 세포 분리를 위한 돼지 트립신 및 우 혈청을 사용하는 방법에서 관찰되는 것과 동등했다(약 90 내지 95%의 생존력 및 세포 성장률 = 0.55 PDL/일(Wistrom C, Villeponteau. B. Exp. Gerontol, 1990; 25(2) : 97-105)).
실시예Ⅹ
세포 분리를 위한 트립진(Prodigen) 또는 알프로테아제(Invitrogen)를 사용하여 노쇠 때까지 MRC-5 세포 배양
MRC-5 세포 노쇠 테스트를 위한 소규모 방법은 노쇠가 관찰될 때까지 실시예Ⅱ의 단계 1 내지 3에 기재된 동물 기원 성분이 없는 방법을 사용하여 세포를 생산하는 방법을 반복하는 것을 필요로 한다. 동물 기원 성분이 없는 PDL 21정도의 세포 배양으로부터 유래한 MRC-5 세포를 1 USP/㎖의 활성을 지닌 트립진 용액 또는 알프로테아제(Invitrogen)용액(세포 분리를 위해 사용되는 EDTA로 보충된 PBS로 30 배로 희석된 원액, 실시예Ⅱ의 단계 1 참조)을 사용하여 하기의 계획에 따라 Nunc T175 ㎠에서 증식시켰다:
· D0 : 12.5%의 조정된 배지로 구성된 100 ㎖의 성장 배지중 1/8의 비로 세포 접종
· D5 : 25%의 조정된 배지로 구성된 100 ㎖의 성장 배지중 1/4의 비로 세포 접종
· D9 : 12.5%의 조정된 배지로 구성된 100 ㎖의 성장 배지중 1/8의 비로 세포 접종
· D14 : D0에서 출발하여 계획을 반복.
이 방법에서, 세포 접종물을 목표 세포 밀도로 고정시키지 않았다. 대조 샘플에 대해 수행되는 세포수 계산은 세포 접종물 밀도가 8000 세포/㎠ 및 30000 세포/㎠ 사이임을 나타냈다. MRC-5 세포는 노쇠가 관찰된 후에 0.56 PDL/일의 세포 성장률로 배양 61일 후에 60 이상의 PDL에 도달했다. 도 11, 12 및 13에 예시된 이 결과는 세포 분리를 위한 돼지 트립신 및 우 혈청을 사용하는 방법에서 관찰되는 것과 동등했다(83일 후에 약 PDL65에서의 노쇠 및 약 0.55 PDL/일의 세포 성장률(Wistrom C, Villeponteau. B. Exp. Gerontol, 1990; 25(2) : 97-105)).

Claims (36)

  1. ⅰ) EGF, FGF, 트리-요오도-L 티로닌 및 히드로코르티손으로 구성되는 목록으로부터 선택된 하나 이상의 이차적 비동물 기원의 외생 성장 인자, 및
    ⅱ) 이차적 비동물 기원의 IGF-1 및/또는 인슐린중 하나 이상을 포함하는, 일차적 동물 기원의 외생 성분이 결여된 세포 배양 배지.
  2. 제 1 항에 있어서, 배지가 EGF, FGF, 트리-요오도-L 티로닌 및 히드로코르티손으로 구성되는 목록으로부터 선택된 둘 이상의 이차적 비동물 기원의 외생 성장 인자 및 이차적 비동물 기원의 IGF-1 및/또는 인슐린중 하나 이상의 배합물을 포함함을 특징으로 하는 세포 배양 배지.
  3. 제 2 항에 있어서, 배지가 이차적 비동물 기원의 EGF, FGF, 트리-요오도-L 티로닌 및 히드로코르티손, 및 이차적 비동물 기원의 IGF-1 및/또는 인슐린중 하나 이상의 배합물을 포함함을 특징으로 하는 세포 배양 배지.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항중 어느 한 항에 있어서, 모든 성분이 일차적 및 이차적 비동물 기원임을 특징으로 하는 세포 배양 배지.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항중 어느 한 항에 있어서, 비동물 기원의 단백질 가수분해물을 추가적으로 포함함을 특징으로 하는 세포 배양 배지.
  6. 제 5 항에 있어서, 단백질 가수분해물이 밀에서 유래함을 특징으로 하는 세포 배양 배지.
  7. 제 1 항 내지 제 5 항중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 동물, 바람직하게는 인간 이배체 부착 의존성 세포의 배양을 위해 적합됨을 특징으로 하는 세포 배양 배지.
  8. 제 1 항 내지 제 6 항중 어느 한 항에 있어서, EGF는 존재하는 경우에 약 0.00001 내지 0.3 ㎎/ℓ의 농도로 존재하고, FGF는 존재하는 경우에 약 0.00001 내지 0.1 ㎎/ℓ의 농도로 bFGF의 형태로 존재하고, 트리-요오도-L 티로닌은 존재하는 경우에 약 0 내지 1 ㎎/ℓ의 농도로 존재하고, 히드로코르티손은 존재하는 경우에 약 0 내지 10 ㎎/ℓ의 농도로 존재하고, IGF-1은 존재하는 경우에 약 0.00001 내지 5 ㎎/ℓ의 농도로 존재하고, 인슐린은 존재하는 경우에 약 0.1 내지 1000 ㎎/ℓ의 농도로 존재함을 특징으로 하는 세포 배양 배지.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항중 어느 한 항에 있어서, 배지가 새로운 배지 및 조정된(conditioned) 배지의 혼합물임을 특징으로 하는 세포 배양 배지.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항중 어느 한 항에 따른 배지 내에서의 성장을 위해 적합된 동물, 바람직하게는 인간 이배체 부착 의존성 세포주.
  11. 제 1 항 내지 제 9 항중 어느 한 항에 따른 배양 배지 내에서의 생물학적 생성물의 생성을 위해 적합된 동물, 바람직하게는 인간 이배체 부착 의존성 세포주.
  12. 제 11 항에 있어서, 생물학적 생성물이 바이러스임을 특징으로 하는 세포주.
  13. 제 10 항 내지 제 12 항중 어느 한 항에 있어서, MRC-5, WI-38, TIG-1, TIG-7, FRhL-2, MRC-9, IMR-90 및 IMR 91로 구성되는 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 세포주.
  14. 조정된 배양 배지를 생성하기 위해 제 1 항 내지 제 8 항중 어느 한 항의 새로운 배양 배지를 동물, 바람직하게는 인간 이배체 부착 의존성 세포와 배합하는 것을 포함하여, 조정된 배양 배지를 생성하기 위한 방법.
  15. a) 제 1 항 내지 제 9 항중 어느 한 항에 정의된 세포 배양 배지에 세포를 시딩(seeding)하고, 세포가 기질에 부착되도록 하는 단계,
    b) 단계 a)로부터 생성된 조정된 배지를 수거하고, 비동물 기원의 프로테아제로 기질로부터 세포층을 떼어내고 세포를 해리시켜 세포 현탁액을 형성시키는 단계,
    c) 세포 부착을 가능하게 하는 부착 지지물을 포함하는 배양 장치내에서, 단계 b)의 세포의 현탁액을 배양 배지에 접종시키는 단계, 및
    d) 동일한 배양 배지내에서 세포를 성장시키는 단계를 포함하여, 동물, 바람직하게는 인간 이배체 부착 의존성 세포를 생성하는 방법.
  16. 제 15 항에 있어서, 세포 은행(cell bank)을 생성하기 위해 단계 b)에서 수거한 세포를 동결시키는 것을 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 15 항 또는 제 16 항에 있어서, 단계 a) 및 단계 c)의 어느 하나에서 사용된 세포 배양 배지가 ⅰ) 조정된 배지 또는 ⅱ) 새로운 배지 또는 ⅲ) 조정된 배지 및 새로운 배지의 혼합물임을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 17 항에 있어서, 조정된 배지가 새로운 배지에 의해 1:0 내지 0:1의 비(새로운 배지:조정된 배지)로 희석됨을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 17 항에 있어서, 조정된 배지가 새로운 배지에 의해 7:1 내지 1:7의 비(새로운 배지:조정된 배지)로 희석됨을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 17 항에 있어서, 조정된 배지가 새로운 배지에 의해 3:1 내지 1:3의 비(새로운 배지:조정된 배지)로 희석됨을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 17 항에 있어서, 조정된 배지가 새로운 배지에 의해 3:1의 비(새로운 배지:조정된 배지)로 희석됨을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 15 항 내지 제 21 항중 어느 한 항에 있어서, 단계 b)에서 사용된 비동물 기원의 프로테아제가 시스테인 엔도펩티다아제, 중성 진균 프로테아제, 중성 세균 프로테아제 또는 세린 프로테아제로 구성되는 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 22 항에 있어서, 세린 프로테아제가 재조합 트립신 또는 트립신 유사 트로테아제임을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 22 항에 있어서, 시스테인 엔도펩티다아제가 피신, 줄기 브로멜라인(stem bromelain) 및 액티니딘으로 구성되는 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 1 항 내지 제 9 항중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 배양 배지에서 동물, 바람직하게는 인간 부착 의존성 세포 배양물을 생성하기 위한 방법으로서, 비동물 기원의 프로테아제를 사용하여 세포 배양물을 계대하는 단계를 포함하는 방법.
  26. 제 25 항에 있어서, 비동물 기원의 프로테아제가 시스테인 엔도펩티다아제, 중성 진균 프로테아제, 중성 세균 프로테아제 또는 트립신 유사 프로테아제로 구성되는 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 26 항에 있어서, 시스테인 엔도펩티다아제가 피신, 줄기 브로멜라인 및 액티니딘으로 구성되는 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 14 항 내지 제 27 항중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양물이 MRC-5, WI-38, TIG-1, TIG-7, FRhL-2, MRC-9, IMR-90 및 IMR 91 세포의 배양물임을 특징으로 하는 방법.
  29. 제 1 항 내지 제 9 항중 어느 한 항에 따른 세포 배양 배지중의 동물, 바람직하게는 인간 이배체 부착 의존성 세포 배양물에서 바이러스를 생성하는 방법으로서,
    a) 세포를 바이러스로 감염시키는 단계,
    b) 바이러스를 증식시키는 단계, 및
    c) 바이러스를 수거하는 단계를 포함하는 방법.
  30. 제 29 항에 있어서, 세포 배양 배지가 제 17 항 내지 제 21 항중 어느 한 항에 추가로 정의된 바와 같음을 특징으로 하는 방법.
  31. 제 29 항 또는 제 30 항에 있어서, 수거한 바이러스를 하나 이상의 정제 단계에 적용시키는 것을 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
  32. 제 29 항 내지 제 31 항중 어느 한 항에 있어서, 바이러스가 MRC-5, WI-38, TIG-1, TIG-7, FRhL-2, MRC-9, IMR-90 및 IMR 91 세포로부터 생성됨을 특징으로 하는 방법.
  33. 제 29 항 내지 제 32 항중 어느 한 항에 있어서, 바이러스가 HAV, 폴리오 바이러스, HSV, CMV, EBV, 풍진 바이러스, 파라믹소 바이러스과, 예컨대 유행성 이하선염 바이러스, VZV의 군으로 구성되는 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  34. 제 29 항 내지 제 33 항중 어느 한 항의 바이러스를 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 애쥬번트와 혼합하는 것을 포함하여 백신을 생산하는 방법.
  35. 제 29 항 내지 제 33 항중 어느 한 항에 따른 방법으로 수득가능한 바이러스 집단.
  36. 제 34 항의 바이러스 집단을 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 애쥬번트와 혼합하는 것을 포함하여 바이러스 백신을 생산하는 방법.
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