KR20050097962A

KR20050097962A - 의약 조성물

Info

Publication number: KR20050097962A
Application number: KR1020057014032A
Authority: KR
Inventors: 카즈오 우메자와; 쿠니키 가토; 요시카즈 스즈키; 유타카 호리구치; 쥰 나카시마; 히로유키 하타; 히로유키 남바; 이즈미 다케이; 료이치 호리에
Original assignee: 각고호우징 게이오기주크
Priority date: 2003-02-14
Filing date: 2004-02-16
Publication date: 2005-10-10
Also published as: WO2004072056A1; EP1600445A4; AU2004210789A1; EP1600445A1; US20060167086A1; JPWO2004072056A1; CA2515658A1

Abstract

항종양제나 항염증제로서 유용한 (-)-DHM2EQ는, 예를 들면, 아밀로오스트리스(3, 5-디메틸 페닐카르바메이트)을 유효성분으로 하는 분리제가 충전되어 있는 광확활성 칼럼을 이용함으로서, (±)-DHM2EQ로부터 직접, 광학분할 할 수 있다. 상기 광학활성 칼럼을 이용한 광학 분할에 의해 얻어진 (-)-DHM2EQ 또는 그 약리학적으로 허용되는 염은 다양한 증상을 개선하기 위한 의약 조성물로서 유용하다.

Description

의약 조성물{MEDICINAL COMPOSITION}

[관련 문헌과의 상호 참조]

본원은，2003년 2월 14일자로 출원한 일본국 특원 2003－37167호, 2003년 2월 18일자로 출원한 일본국 특원 2003－39098호 및 2003년 8월 6일자로 출원한 일본국 특원 2003－288281호에 기초한 우선권을 주장한다. 이들 문헌을 본 명세서에 원용(援用)한다．

본 발명은, 의약 조성물, 종양 세포 증식 저해제, 세포 접착 저해제, 아포토시스(apoptosis) 유도제, 비만 예방·방지제, 혈당치 저하제, 분화 유도의 저해를 분해하는 약제, 및 이들 의약 조성물·약제에 유효성분으로서 함유하는 광학활성을 갖는 화합물, 즉, 5-디히드록시메틸에폭시키노마이신C의 광학 활성체의 직접 분할 방법, 및 치료 방법에 관한 것이다.

암이나 백혈병, 및 류머티즘, 췌장염, 간염, 소화기계 염증 등의 염증성 질환에는 효과적인 치료약이 없고, 새로운 기구로 일하는 신규 화학요법이 기대되고 있다. 또한, 그 외에, 면역 질환, 알레르기성 질환, 종양 전이, 악역질, 동맥 경화, 혈관 신생성 질환 등에 있어서도 새로운 기구로 일하는 신규 화학요법이 기대되고 있다. 최근 NF-κB는 종양이나 염증 부위에서 활성화되는 것이 명확해져 왔다. 그리고 최근 발견된 NF-κB저해제 5- 디히드록시 메틸 에폭시 키노마이신C(통상 dehydroxymethylepoxyquinomicin(DHMEQ))는 세포 레벨에서 강하고 NF-κB를 저해하고(A. Ariga et al., J. Biol. Chem. 277, 24625-24630, 2002), 동물의 개체 레벨에서도 전위선암(Cancer Res. 2003, Jan 1;63(1):107-10)이나 유방암(2002년도 일본 암학회 총회 기사, p157)의 증대를 강하게 제어하고, 류머티즘의 모델 마우스에 있어서 증상도 억제한다(N. Matsumoto et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 10, 865-869, 2000). DHM2EQ는, 그들 종양 세포 등에 특이성이 높고, 독성이 낮다. 그래서 DHM2EQ는 신규 항종양제, 항염증제로서의 역할이 기대되고 있다.

DHMEQ의 광학 활성체의 종래의 제조법을 도 1에 나타낸다. 우선, 라세미체의 DHM2EQ(식 (2))의 페놀성 수산기를 일단 시릴기로 보호한 화합물(식 (16))을 키랄 칼럼에 의해 분할해서 광학 활성체의 화합물(식(17) 및 식(18)을 얻고, 이어서 각각을 탈보호함으로서 목적으로 한 광학 활성인(-)-DHM2EQ(식(2)과(＋)-DHM2EQ(식(4))를 얻고 있다. 그러나 본 방법에서는 공정의 길이에 따른 수율 손실의 문제가 지적되고 있다(N. Matsumoto et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 10, 865-869, 2000)

그래서, 본 발명은, 의약 조성물에 유효성분으로서 함유시키기 위한, 우수한 약리 작용을 갖고, 또한 특이성이 높은 화합물을, 신속하고 또한 높은 수율을 얻을 수 있는 방법을 제공하는 것을 주된 목적으로 한다. 또한, 본 발명은, 상기 화합물을 유효성분으로 하는 의약 조성물을 제공하는 것도 목적으로 한다.

도 1은, DHM2EQ의 광학 활성체의 종래의 제조법의 반응 스킴을 나타내는 도이다.

도 2는, 본 발명의 광학 활성인 DHM2EQ(식(2), 식(4))의 제조 방법의 반응 스킴을 나타내는 도이다.

도 3은, (-)-DHM2EQ 및 (＋)-DHM2EQ의 HPLC 프로필을 나타내는 도이다.

도 4는, (-)-DHM2EQ가 HUVEC와 HL-60 세포의 접착에 미치는 억제 효과를 나타내는 도이다.

도 5는, (-)-DHM2EQ가 골수종 모델 마우스에게 미치는 항종양 효과를 나타내는 도이다.

도 6은, (-)-DHM2EQ가 갑상선암 모델 마우스에게 미치는 항종양 효과를 나타내는 도이다.

도 7은, (-)-DHM2EQ의 비대화 지방세포에 대한 아포토시스 유도작용의 해석결과를 나타내는 도이다.

도 8은, (-)-DHM2EQ가 비만형 당뇨병 모델 마우스에게 미치는 체중 증가 억제 작용을 나타내는 도이다.

도 9은, (-)-DHM2EQ가 근아세포로부터 근세포로의 분화유도의 저해를 해제하는 효과를 나타내는 도이다.

본 발명자들은, 상기 문제점을 극복하기 위해서 예의 검토한 결과, 식(5)으로 나타나는 기(基)로 치환된 다당의 방향족 카르바메이트 유도체를 유효성분으로 하는 분리제를 충전한 광학활성인 칼럼을 이용하고, 고속액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해, 식(3)으로 나타나는 화합물의 라세미체를 광학활성인 화합물(식(2), 식(4))에 직접, 광학분할 할 수 있는 것을 발견했다(도 2).

또한, 본 발명자들은, 식(3)으로 나타나는 화합물의 라세미체가 갖는 혈관내피세포의 접착저해 작용보다 우수한 작용을 광학활성인 화합물(식(2), 식(4))이 있는지 없는지를 조사하기 위해, 식(2), 식(3), 식(4)으로 나타나는 화합물을 각각 이용해서, 인간 탯줄 정맥내피세포(HUVEC)와 인간 급성 골수성 백혈병 세포 HL-60과의 접착을 조사했다. 그 결과, 식(2)으로 나타나는 화합물이, 식(3) 및 식(4)으로 나타나는 화합물보다 우수한 혈관내피세포의 접착 저해 작용을 나타내는 것을 발견했다.

나아가, 본 발명자들은, 식(2)으로 나타나는 화합물이, 다발성 골수종, 갑상선암 등의 종양세포의 증식을 억제하는 것을 발견했다.

또한, 본 발명자들은, 비대화 지방세포를 식(2)로 나타나는 화합물에서 처리하는 것에 의해, 비대화 지방 세포에 대해서 아포토시스를 유도하는 것을 발견했다.

또한, 본 발명자들은, 비만·2형 당뇨병 모델 동물에 있어서, 식(2)로 나타나는 화합물이, 고지방식 부하에 의한 체중 증가를 억제하는 것을 발견했다.

또한, 본 발명자들은, 배양세포에 있어서 근아(筋芽)세포로부터 근세포로의 분화유도의 저해를 식(2)으로 나타나는 화합물이 해제하는 것을 발견했다. 이와 같이 해서, 본 발명자들은 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명에 관계된 의약 조성물은, 하기의 일반식(1)으로 나타나는 광학활성인 화합물 또는 그 약리학적으로 허용되는 염을 유효성분으로서 함유하고, NF-κB의 활성화를 수반하는 증상을 개선하는 것을 특징으로 한다.

식 중, R¹은 수소원자 또는 C 2~4의 알카노일기이고, 알카노일기로서는, 아세틸기, 프로피오닐기, 및 부타노일기, 및 이들의 이성체기를 들 수 있고, 특히 아세틸기가 바람직하다.

또한, 상기 화합물이 다음 식(2)인 것이 바람직하다.

본 발명에 관계되는 의약 조성물은, 종양세포에 아포토시스를 일으키는 것에 의해서, 적어도 하나의 증상을 개선하는 것을 특징으로 하고, 종양세포의 아포토시스가 기여하지 않고, 종양세포에 기인하는 적어도 하나의 증상을 개선하는 것을 특징으로 한다.

상기 NF-κB의 활성화를 수반하는 증상은, 예를 들면, 종양세포에 기인하는 것이어도 좋다. 상기 종양세포의 증식을 저해하는 것에 의해, 상기 증상을 개선하는 것을 특징으로 한다.

또한, 종양세포와 혈관 내피 세포의 접착을 저해하는 것에 의해, 상기 증상을 개선하는 것을 특징으로 한다.

즉, 상기 증상은, 예를 들면, 면역질환, 알레르기성 질환, 염증성 질환, 종양 전이, 악역질, 동맥 경화, 혈관 신생성 질환(종양내의 혈관 신생성 질환), 백혈병으로 이루어진 군에서 선택되는 증상이다.

상기 종양으로서는, 예를 들면, 골수종, 갑상선암, 유방암, 췌장암, 악성 종양, 전위선암 등이다.

또한, 본 발명에 관계된 의약 조성물은, NF-κB의 활성화시키는 치료에 의한 NF-κB의 상기 활성화를 저해하는 것에 의해, 상기 치료의 효과를 증대시킬 수 있는 하기의 일반식(1)으로 나타나는 광학활성인 화합물 또는 그 약리학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 해서 함유하는 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 화합물이 다음 식(2)인 것이 바람직하다.

상기 NF-κB를 활성화시키는 치료는, 항종양제를 이용한 치료이어도 좋고, 종양세포에 대한 방사선 조사에 의한 치료이어도 좋다. 즉, 상기 의약 조성물과 상기 항종양제를 유효성분으로서 함유하는 것으로서도 좋다. 상기 항종양제란, 예를 들면, 캄프토테신(camptothecine) 또는 다우노르비신(Daunorubicin) 등이다.

또한, 본 발명에 관계된 의약 조성물은, 하기의 일반식(1)으로 나타나는 광학활성인 화합물 또는 그 약리학적으로 허용되는 염을 유효성분으로서 함유하고, TNF-α에 의해서 야기되는 질환을 개선하는 것을 특징으로 한다.

식 중, R¹은 수소원자 또는 C 2~4의 알카노일기이고, 알카노일기로서는, 아세틸기, 프로피오닐기, 및 부타노일기, 및 이들의 이성체기를 들 수 있고, 특히 아세틸기가 바람직하다. 즉, 상기 화합물은 다음 식(2)인 것이 바람직하다.

상기 TNF-α에 의해서 야기되는 질환은, 예를 들면, 인슐린 저항성을 수반하는 질환, 당뇨병에 기인하는 질환, 근(筋)디스트로피 등이어도 좋다.

즉, 상술한 의약 조성물은, 우수한 약리작용을 갖는(-)-체의 화합물을 유효성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하고 있지만, 실질적으로(＋)-체의 화합물을 함유하지 않은 것이 특히 바람직하다.

본 발명에 관계된, 종양세포의 증식을 저해하기 위한 종양세포 증식 저해제는, 하기의 일반식(1)으로 나타나는 광학활성인 화합물 또는 그 약리학적으로 허용되는 염을 유효성분으로서 함유하는 것을 특징으로 한다.

즉, 본 발명에 관계된, 종양세포의 증식을 저해하기 위한 종양세포 증식 저해제는, 우수한 약리작용을 갖는(-)-체의 화합물을 유효성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하고 있지만, 실질적으로(＋)-체의 화합물을 함유하지 않은 것이 특히 바람직하다.

또한, 상기 화합물이 다음 식(2)인 것을 특징으로 해도 좋다.

본 발명에 관계된, 혈관 내피 세포의 접착 분자의 발현을 억제하기 위한 접착 분자 발현 억제제는, 하기의 일반식(1)으로 나타나는 광학활성인 화합물 또는 그 약리학적으로 허용되는 염을 유효성분으로서 함유하는 것을 특징으로 한다.

즉, 본 발명에 관계된, 혈관 내피 세포의 접착 분자의 발현을 억제하기 위한 접착 분자 발현 억제제는, 우수한 약리작용을 갖는(-)-체의 화합물을 유효성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하고 있지만, 실질적으로(＋)-체의 화합물을 함유하지 않은 것이 특히 바람직하다.

또한, 상기 화합물이 다음 식(2)인 것을 특징으로 해도 좋다.

본 발명에 관계된, 종양세포의 아포토시스를 유도하기 위한 아포토시스 유도제는, 하기의 일반식(1)으로 나타나는 광학활성인 화합물 또는 그 약리학적으로 허용되는 염을 유효성분으로서 함유하는 것을 특징으로 한다.

즉, 본 발명에 관계된, 종양세포의 아포토시스를 유도하기 위한 아포토시스 유도제는, 우수한 약리작용을 갖는(-)-체의 화합물을 유효성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하고 있지만, 실질적으로(＋)-체의 화합물을 함유하지 않은 것이 특히 바람직하다.

또한, 상기 화합물이 다음 식(2)인 것을 특징으로 해도 좋다.

본 발명에 관계된, 비대화 지방세포의 아포토시스를 유도하기 위한 유도제는, 하기의 일반식(1)으로 나타나는 광학활성인 화합물 또는 그 약리학적으로 허용되는 염을 유효성분으로서 함유하는 것을 특징으로 한다.

식 중, R¹은 수소원자 또는 C 2~4의 알카노일기이고, 알카노일기로서는, 아세틸기, 프로피오닐기, 및 부타노일기, 및 이들의 이성체기를 들 수 있고, 특히 아세틸기가 바람직하다. 또한, 상기 화합물은 다음 식(2)인 것이 바람직하다.

즉, 본 발명에 관계된, 비대화 지방 세포의 아포토시스를 유도하기 위한 유도제는, 우수한 약리작용을 갖는(-)-체의 화합물을 유효성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하고 있지만, 실질적으로(＋)-체의 화합물을 함유하지 않은 것이 특히 바람직하다. 즉, 본 발명에 관계된, 비대화 지방 세포의 아포토시스를 유도하기 위한 유도제는, 나아가, TNF-α를 유효성분으로서 함유하는 것으로 해도 좋다.

본 발명에 관계된, 비만예방·방지제는, 하기의 일반식(1)으로 나타나는 광학활성인 화합물 또는 그 약리학적으로 허용되는 염을 유효성분으로서 함유하는 것을 특징으로 한다.

즉, 본 발명에 관계된, 비만예방·방지제는, 우수한 약리작용을 갖는(-)-체의 화합물을 유효성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하고 있지만, 실질적으로(＋)-체의 화합물을 함유하지 않은 것이 특히 바람직하다.

본 발명에 관계된, 혈당치 저하제는, 하기의 일반식(1)으로 나타나는 광학활성인 화합물 또는 그 약리학적으로 허용되는 염을 유효성분으로서 함유하는 것을 특징으로 한다.

즉, 본 발명에 관계된, 혈당치 저하제, 우수한 약리작용을 갖는(-)-체의 화합물을 유효성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하고 있지만, 실질적으로(＋)-체의 화합물을 함유하지 않은 것이 특히 바람직하다.

본 발명에 관계된, 세포분화 유도의 저해를 해제하는 약제는, 하기의 일반식(1)으로 나타나는 광학활성인 화합물 또는 그 약리학적으로 허용되는 염을 유효성분으로서 함유하는 것을 특징으로 한다.

즉, 상기 세포분화 유도의 저해는, 예를 들면, TNF-α에 의한 근세포 분화의 억제이어도 좋다. 또한, 본 발명에 관계된, 세포분화 유도의 저해를 해제하는 약제는, 우수한 약리작용을 갖는(-)-체의 화합물을 유효성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하고 있지만, 실질적으로(＋)-체의 화합물을 함유하지 않은 것이 특히 바람직하다.

또한, 본 발명은, 식(3):

으로 나타나는 화합물의 라세미체를 직접 광학 분할함으로서, 식(2):

또는 식(4):

으로 나타나는 광학 활성인 화합물을 제조하는 방법을 제공할 수 있다. 상기 광학 분할은, 광학 활성 칼럼을 이용하는 것으로 해도 좋다.

상기 광학 활성 칼럼은, 하기의 식(5)으로 나타나는 기로 치환된 다당의 방향족 카르바메이트 유도체를 유효성분으로 하는 분리제가 충전되어 있는 것이라면 좋다.

식중, R³~R⁷는, 수소원자, 또는 탄소수 1~8의 알킬기이어도 좋고, 탄소수 1~8의 알콕시기, 탄소수 6~14의 방향족기, 또는 할로겐 원자 등이어도 좋다.

상기 다당의 방향족 카르바메이트 유도체는, 아밀로오스트리스(3, 5-디메틸 페닐카르바메이트)인 것으로 해도 좋고, 셀룰로오스트린(3, 5-디메틸 페닐카르바메이트)인 것으로 해도 좋다. 특히, 아밀로오스트리스(3, 5-디메틸 페닐카르바메이트)을 유효성분으로 하는 분리제가 충전된 DAICEL CHIRALPAK AD(다이셀 화학공업(주))가 바람직하다.

본 발명의 방법에 의해, 효율 좋고, 대량으로, 광학 활성인 DHMEQ를 제조할 수 있다.

본 발명의 방법에 의해, 식(2) 또는 식(4)으로 나타나는 광학활성인 DHMEQ를 제조할 수 있지만, 이들 광학 활성체 중, 식(2)으로 나타나는 화합물쪽이 식(4)으로 나타나는 화합물보다 생물학적 활성(약리활성)이 높은 것이 후술하는 실시예에서 나타나 있다.

또한, 본 발명에 관계된 직접 분할 방법은, 식(3)

으로 나타나는 화합물의 라세미체를, 하기의 식(5)으로 나타나는 기로 치환된 다당의 방향족 카르바메이트 유도체를 유효성분으로 하는 분리제에 의해서, 직접, 광학 분할하는 것을 특징으로 해도 좋다.

상기 다당의 방향족 카르바메이트 유도체는, 아밀로오스트리스(3, 5-디메틸 페닐카르바메이트)인 것으로 해도 좋고, 셀룰로오스트리스(3, 5-디메틸 페닐카르바메이트)인 것으로 해도 좋다.

본 발명에 관계된 치료 방법에는, NF-κB의의 활성화를 수반하는 증상을 개선하기 위한 하기의 일반식(1)으로 나타나는 광학 활성인 화합물 또는 약리학적으로 허용되는 염을 이용하는 것으로 한다.

또한, 상기 화합물은 다음 식(2)인 것이 바람직하다.

본 발명에 관계된 치료 방법은, 종양세포에 아포토시스를 일으키는 것에 의해서, 적어도 하나의 증상을 개선하는 것으로 해도 좋고, 종양세포의 아포토시스가 기여하지 않고, 종양세포에 기인하는 적어도 하나의 증상을 개선하는 것으로 해도 좋다.

상기 NF-κB의 활성화를 수반하는 증상은, 예를 들면, 종양세포에 기인하는 것이어도 좋다.

상기 종양세포의 증식을 저해하는 것에 의해, 상기 증상을 개선하는 것으로 해도 좋고, 종양세포와 혈관 내피 세포와의 접착을 저해하는 것에 의해, 상기 증상을 개선하는 것으로 해도 좋다.

또한, 본 발명에 관계된 치료 방법에는, NF-κB의 활성화시키는 치료에 의한 NF-κB의 상기 활성화를 저해하는 것에 의해, 상기 치료의 효과를 증대시킬 수 있는 하기의 일반식(1)으로 나타나는 광학활성인 화합물 또는 그 약리학적으로 허용되는 염을 유효성분으로서 함유하는 의약 조성물을 사용하는 것으로 한다.

또한, 상기 화합물은 다음 식(2)인 것이 바람직하다.

상기 NF-κB를 활성화시키는 치료는, 항종양제를 이용한 치료이어도 좋고, 종양세포에 대한 방사선 조사에 의한 치료이어도 좋다. 즉, 상기 의약 조성물과 상기 항종양제를 유효성분으로서 함유하는 것으로 해도 좋다. 상기 항종양제란, 예를 들면, 캄프토테신(camptothecine) 또는 다우노르비신(Daunorubicin) 등이다.

또한, 본 발명에 관계된 치료 방법에는, TNF-α에 의해서 야기되는 질환을 개선하기 위한 하기의 일반식(1)으로 나타나는 광학활성인 화합물 또는 그 약리학적으로 허용되는 염을 이용하는 것으로 한다.

상기 TNF-α에 의해서 야기되는 질환은, 예를 들면, 인슐린 저항성을 수반하는 질환, 당뇨병에 기인하는 질환, 근(筋)디스트로피(dystrophy) 등이어도 좋다.

즉, 상술한 치료 방법에는, 우수한 약리작용을 갖는(-)-체의 화합물을 유효성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하고 있지만, 실질적으로(＋)-체의 화합물을 함유하지 않은 것이 특히 바람직하다.

이하, 상기 지견에 근거해서 완성한 본 발명의 실시 형태를, 실시예를 들면서 상세히 설명한다. 실시 형태 및 실시예에 특별히 설명이 없는 경우에는, J. Sambrook, E. F. Fritsch ＆ T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual(3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York(2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J. G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl(Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley ＆ Sons Ltd. 등의 표준적인 프로토콜집에 기재의 방법, 또는 그것을 수식하거나, 개정 변경한 방법을 이용한다. 또한, 시판중인 시약 킷이나 측정 장치를 이용하고 있는 경우에는, 특별히 설명이 없는 경우, 그것에 첨부한 프로토콜을 이용한다.

즉, 본 발명의 목적, 특징, 이점, 및 그 아이디어는, 본 명세서의 기재에 의해, 당업자에게는 분명하고, 본 명세서의 기재로부터, 당업자라면, 용이하게 본 발명을 재현할 수 있다. 이하에 기재된 발명의 실시 형태 및 구체적인 실시예 등은, 본 발명의 바람직한 실시 양태를 나타내는 것이고, 예시 또는 설명을 위해서 나타내고 있는 것이며, 본 발명을 그것들에 한정하는 것은 아니다. 본 명세서에서 개시되어 있는 본 발명의 의도 및 범위 내에서, 본 명세서의 기재에 근거해, 다양한 개정 변경 및 수식할 수 있는 것은, 당업자에게 있어서 분명하다.

NF-κB는, 생체 방어 반응에 관여하는 중심적인 전사 인자이고, NF-κB에 의해 유도되는 유전자는 면역 글로블린 이외에 시토킨 (IL(interleukin)-1, IL-2, IL-6, IL-8, TNF(tumor necrosis- factor)-α등), 세포접착인자(E-셀렉틴, ICAM(intercellular adhesion molecule)-1, VCAM(vascular cell adhesion molecule)-1 등), 일산화 질소(NO) 합성효소, Fas 리간드 등의 면역 응답이나 염증반응에 깊이 관련되어 있는 것이 많은 것이 알려져 있다(Cell, 87, 13-20, 1996). 또한, 방광암, 유방암, 멜라노마 등으로 보고되고 있는 NF-κB의 항상적 활성화는, 아포토시스의 억제, 세포 증식의 촉진, 세포 분화의 억제 등을 비롯한 종양형성의 다양한 면에 관여하고, 종양 형성을 촉진한다고 생각되고 있다(J. Clin. Invest. 107, 241-246, 2001). 한편, NF-κB의 활성화 저해 단백질 IκB의 유전자 도입에 의해 특이적으로 세포사(細胞死)가 유도되는 것이 보고되어 있으므로, NF-κB의 활성화 저해 작용을 갖는 화합물은, 항염증 작용이나 항종양 활성을 갖는 의약품이나 약제로서 기대되고 있다.

NF-κB의 활성화 저해 작용을 갖는 화합물로서는, 종래, 살리실산 아미드 유도체(WO 01/12588 A1), 파네폭시돈(panepoxydone ; Biochem. Biophys. Res. Commun. 226, 214-221, 1996), 시클로에폭시돈(cycloepoxydon ; J. Antibiot. 51, 455-463, 1998), SN-50(J. Biol. Chem. 270, 14255-14258, 1995)등이 알려져 있다.

상술한 살리실산 아미드 유도체는, 독성이 없는 항생물질 에폭시퀴노마이신(epoxyquinomicin)의 구조를 근거로 새롭게 디자인된 것이지만, 최근, 본 발명자들은, 상기 화합물의 라세미체가 항염증 작용, 면역억제 작용, 항종양 활성, 항동맥 경화작용, 종양전이 억제작용, 항악역질 작용, 항알레르기 작용 및 혈관신생 억제 작용 등을 갖는 것을 명확히 하고 있다.

라세미체에는 두 개의 에난티오머(enantiomer)((＋)-체 및 (-)-체)가 혼재해서, 일반적으로 그들 에난티오머는, 비등점, 융점 등의 물리적인 성질이 대부분 동일하다. 그러나, (＋)-체 및 (-)-체의 화합물은, 통상 생체에 대한 작용을 달리 하는 경우가 있다. 예를 들면, 「탈리도마이드의 비극」과 같이, 한쪽의 에난티오머는 수면 작용이나 진정 작용을 갖는 것에 대해서, 다른 한쪽의 에난티오머는 최기(催奇) 작용(태아기형 유발 작용)을 갖는 것이 알려져 있다. 또한, 의약품이나 농약 등에 있어서는, 라세미체보다, 한쪽 에난티오머를 유효성분으로서 함유시킨 약제를 이용함으로서, 보다 우수한 효과를 얻을 수 있고, 부작용이 적은 것이 알려져 있다. 따라서, 의약품 등에 대해서는, 광학적으로 순수한 화합물을 조제하는 것이 매우 중요한 과제로 되어 있다.

본 발명자들은, 이미 상기 살리실산 아미드 유도체의 라세미체를 (＋)-체 및 (-)-체의 화합물로 분할하는 것을 시도하고 있다(Bioorg. Med. Chem. Lett. 10, 865-869, 2000). 그러나, 상기 화합물의 분할 방법은, 상기 화합물의 라세미체의 페놀성 수산기를 일단 시릴기로 보호한 화합물을 제작해야 했었다. 그래서, 본 발명자들은, 다양한 유도체를 유효성분으로 하는 분리제를 담지하는 광학활성 칼럼을 이용해서 상기 화합물의 라세미체를 (-)-체 및 (＋)-체의 화합물에 직접 분할할 수 있는지의 여부를 조사했다. 그 결과, 식(6)

으로 나타나는 기로 치환된 다당의 방향족 카르바메이트 유도체를 유효 성분으로 하는 분리제를 이용함으로서, 상기 화합물의 라세미체를 (-)-체 및 (＋)-체의 화합물에 직접, 광학 분할 할 수 있는 것을 발견했다.

즉, 치환기가 분자 형으로 변화를 주거나, 치환기 자체가 갖는 물리적 화학적 특성 및 치환기가 방향족 고리의 π전자계에 부여하는 전자적 영향 등이 복잡하게 조합되어 있거나 하는 것으로부터, 분리나 흡착의 특성이 현저한 변화와 치환과의 관계를 고려하면, 하기의 일반식(5)

으로 나타나는 치환기(-R³, -R⁴, -R⁵, -R⁶및 -R⁷)을 수소원자, 또는 탄소수 1~8의 알킬기로서도, 탄소수 1~8의 알콕시기, 탄소수 6~14의 방향족기, 또는 할로겐원자 등으로 해도 좋다.

다당의 방향족 카르바메이트 유도체의 원료로 되는 다당은, 합성 다당, 천연 다당 및 천연 변성 다당의 어느 것이든 상관 없지만, 광학활성을 갖는 다당이 바람직하고, 고순도의 다당을 용이하게 얻을 수 있는 아밀로오스나 셀룰로오스 등이 보다 바람직하다. 그 외에, 고순도의 다당을 용이하게 얻을 수 있는 것으로서, β-1, 4-키토산, 키친, β-1, 4-만난, β-1, 4-키실란, 이눌린, 카들란 등을 원료로 하는 것으로 해도 좋다. 또한, 본 실시예에 있어서는, 다당의 방향족 카르바메이트 유도체로서, 아밀로오스트리스(3, 5-디메틸페닐 카르바메이트)를 이용해서, 본 발명의 직접 분할 방법을 행하고 있지만, 셀룰로오스트리스(3, 5-디메틸페닐 카르바메이트)를 적용하는 것으로 해도 좋다.

여기서는, 분리제에 유효성분으로서 함유되는 다당의 카르바메이트 유도체에 대해서 설명했지만, 그 외에, 에스테르 유도체나 에테르 유도체, 방향족 카르바메이트 이외의 카르바메이트 유도체 등의 다당 유도체를 이용하는 것으로 해도 좋다.

이들 분리제를 담지하는 담체로서는, 유기 담체 또는 무기 담체가 일반적으로 이용되지만, 무기 담체가 보다 바람직하다. 이와 같은 무기 담체로서는, 예를 들면, 실리카겔, 알루미나, 마그네시아, 산화티탄, 유리, 규산염, 카올린 등이 있다. 담체의 입경은 사용하는 칼럼의 사이즈에 따라 다르지만, 일반적으로 0.5μm~10μm이고, 바람직하게는 1μm~300μm이고, 보다 바람직하게는 5μm~20μm이다. 또한, 그 성상은 다공질인 것이 바람직하고, 그 경우 구멍의 평균 세공경(細孔徑)은 10Å~100μm인 것이 바람직하고, 50Å~50000Å이라면 보다 바람직하다. 상기 다당의 방향족 카르바메이트 유도체를 담체에 담지하는 방법으로서는, 예를 들면, 다당의 방향족 카르바메이트 유도체를 용제에 용해해서 도프로 하고, 이것을 교반하면서 천천히 담체에 적하해서, 담체에 균일하게 코팅시키는 방법, 등의 일반적인 방법을 이용할 수 있다.

또한, 상기 직접 분할 방법을 적용하는 것에 의해, 식(3)으로 나타나는 화합물의 라미세체로부터 간편하게 광학 활성인 화합물(식(2) 및 식(4))을 제조하는 것도 가능하다. 이하, 그 제조 방법에 대해서 상술한다.

=== 식(2) 및 식(4)으로 나타나는 화합물의 제조 방법 ===

일반식(12)으로 나타나는 화합물은, wipf들의 합성법(Synthesis, 12호, 1549-1556 1페이지, 1995년)에 준하여 제조할 수 있다.

일반식(12)으로 나타나는 화합물의 제조 방법의 일예를 하기의 반응 공정식에 근거해서 설명한다.

하기의 반응 공정에 있어서, R¹은 수소원자 또는 C 2~4의 알카노일기이고, 알카노일기로서는, 아세틸기, 프로피오닐기, 및 부타노일기, 및 이들의 이성체기를 들 수 있고, 특히 아세틸기가 바람직하다. R²는 C 1~4의 알킬기이고, 알킬기로서는, 메틸기, 에틸기, 프로필기, 부틸기 및 이들의 이성체기를 들 수 있고, 메틸기, 에틸기가 바람직하고, 메틸기가 특히 바람직하다. 또한, X는 할로겐 원자이고, 할로겐 원자로서는, 불소, 염소, 브롬 및 요소 원자를 들 수 있고, 염소 원자, 브롬 원자가 바람직하고, 염소 원자가 특히 바람직하다.

공정(a) : N-(2-알카노일벤조일)-2, 5-디메톡시아닐린의 조제

2, 5-디메톡시아닐린을 용매(예를 들면, 피리딘 등)에 용해시키고, -78~50℃, 바람직하게는 빙냉하에서, 식(7)의 O-알카노일 살리시로일 하라이드의초산에틸 용액을 첨가해서, 교반하면서 반응시킨다. 물을 첨가해서 반응을 정지시킨 후, 초산 에틸을 첨가하고, 염산, 물, 중조수, 물로 차례로 세정하고, 건조 후, 감압 농축, 및 진공 건조함으로서 식(8)으로 나타나는 N-(2-알카노일 벤조일)-2, 5-디메톡시 아닐린 화합물을 얻을 수 있다. 이 화합물은 정제하지 않고, 다음 공정으로 사용할 수 있다.

공정(b) : 3-(O-알카노일 살리시로일 아미드)-4, 4-디알콕시-2, 5-시클로헥사디에논 화합물의 조제

상기에서 얻어진 식(8)의 화합물을 용매(예를 들면, 메탄올, 에탄올 등)로 용해시키고, -20~50℃, 바람직하게는 빙냉하에서, 디아세톡시요오드벤젠을 첨가하고, 실온에서 교반하면서 반응시킨다. 감압 농축 후, 초산 에틸을 첨가하고, 중조수, 식염수로 차례로 세정하고, 용매층을 감압 농축해서 얻어진 찌꺼기를 크로마토그래피로 정제함으로서, 식(9)으로 나타나는 3-(O-알카노일 살리시로일 아미드)-4, 4-디알콕시-2, 5-시클로헥사디에논 화합물을 얻을 수 있다.

공정(c) : 5, 6-에폭시-4, 4-디알콕시-3-알카노일 살리시로일 아미드-2-시클로헥세논 화합물의 조제

식(9)의 화합물을 용제(예를 들면, 테트라히드로프랜, 메탄올 등)로 용해시키고, -20~50℃, 바람직하게는 빙냉하에서, 과산화 수소수 및 수산화나트륨을 첨가하고, 교반하면서 반응시킨다. 반응액에 초산에틸을 첨가하고, 염산용액, 티오황산나트륨수용액, 식염수로 차례로 세정하고, 대기중에서 건조한 후, 진공 건조한다. 잔존하는 원료 화합물을 제거하기 위해서, 찌꺼기를 아세톤에 용해시키고, p-톨루엔술폰산을 첨가하고, 실온에서 교반해서 원료 화합물을 분해한다. 메탄올을 감압 류거(留去)해서 얻은 찌꺼기에 초산에틸을 첨가하고, 물로 세정한다. 초산에틸층을 건조해서 얻은 잔류물을 칼럼 크포마토그래피로 정제해서, 식(10)으로 나타나는 5, 6-에폭시-4, 4-디알콕시-3-알카노일 살리시로일 아미드-2-시클로헥세논 화합물을 얻을 수 있다.

공정(d): 5, 6-에폭시-2-알카노일 살리시로일 아미드-2-시클로헥센-1, 4-디온의 조제

식(10)의 화합물을 용제(예를 들면, 염화 메틸렌 등)로 용해시키고, 빙냉하에서 무기산 또는 유기산(예를 들면, 삼불화 붕소 디에틸에테르 착체 등)을 첨가하고, 교반하면서 반응시킨다. 반응액에 용제(예를 들면, 초산 에틸 등)을 첨가하고, 물로 세정하고, 용제층을 농축한 후, 얻어진 찌꺼기를 메탄올로 세정해서 식(11)으로 나타나는 5, 6-에폭시-2-알카노일 살리시로일 아미드-2-시클로헥센-1, 4-디온 화합물을 얻을 수 있다.

공정(e): 5, 6-에폭시-4-히드록시-3-알카노일 살리시로일 아미드-2-시클로헥세논의 조제

식(11)의 화합물을, 용매(예를 들면, 메탄올, 에탄올, THF 등)로 현탁(懸濁)하고, -78~50℃, 바람직하게는 빙냉하에서, 환원제(예를 들면, 수소화 붕소 나트륨 등)을 첨가해서 반응시킨다. 반응액에 용제(예를 들면, 초산 에틸, 염산 에틸 등)을 첨가하고, 염산, 물로 차례로 세정하고, 용제층을 건조 후, 감압 농축해서, 메탄올로 현탁, 교반, 세정하고, 식(12)로 나타나는 5, 6-에폭시-4-히드록시-3-알카노일 살리시로일 아미드-2-시클로헥세논을 얻을 수 있다.

즉, 식(7)의 O-알카노일 살리시로일 하라이드로서, O-아세틸 살리시로일 클로리드을 이용하고, 공정(b)에 있어서 식(8)의 화합물을 용해시키는 용매로서, 메탄올을 이용함으로서, 식(3)으로 나타나는 화합물((±)-DHM2EQ;즉, 「DHM2EQ」를 「DHMEQ」로 칭하는 경우가 있다.)을 제조할 수 있다.

식(3)의 화합물의 광학 분할은, 광학 활성 칼럼을 이용한 고속 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의해 행한다. 이것에 의해, 식(2) 및 식(4)의 화합물을 얻을 수 있다. 광학 활성 칼럼으로서, 일반식(5)으로 나타나는 기로 치환된 다당의 방향족 카르바메이트 유도체를 유효 성분으로 하는 분할제, 예를 들면, DAICEL CHIRALPAK AD(10mm i.d. x250mm)을 이용할 수 있다. DAICEL CHIRALPAK AD를 이용하는 경우, 0.1~0.9v/v% 초산 첨가 메탄올을 이동 상(相)(예를 들면, 속도:0.5~2.5ml/min)으로 해서, 식(3)의 화합물의 메탄올을 용액(예를 들면, 농도 5~20mg/ml)을 조제하고, 이것을 50~200μl 씩, 5~20회에 걸쳐 주입하고, 식(2) 및 식(4)의 화합물을 분리해서 취하면 좋다.

식(2) 및 식(4)의 화합물의 시광도(施光度)를 JASCO DIP-360의 시광계로 측정함으로서, 광학순도를 산출 할 수 있다. 즉, 식(2)에 나타난 화합물의 시광성은 좌시성이므로, 이것을 (-)-체라고 기재한다. 또한, 식(4)에 나타나는 화합물의 시광성은 우시성이므로, 이것을 (＋)-체라고 기재한다.

=== 식(2)으로 나타나는 화합물의 약리 작용에 대해서 ===

(-)-DHM2EQ는, NF-κB의 활성화를 수반하는 증상, 구체적으로는, 유방암, 췌장암, 림프계 악성 종양, 전위선암, 갑상선암, 골수종 등의 종양세포에 기인하는 증상이나, 면역 질환, 알레르기성 질환, 염증성 질환, 종양전이, 악역질, 동맥경화, 혈관신생성질환(특히, 종양내의 혈관신생성 질환), 백혈병(특히, 성인 T세포 백혈병(Adult T cell leukemia) )등의 증상, 인슐린 저항성을 수반하는 증상, 당뇨병에 기인하는 질환, 및 근(筋)디스트로피 등을 개선(예방이나 진행 억제를 포함)할 수 있고, (±)-DHM2EQ 보다 우수한 효과를 갖는다.

따라서, (-)-DHM2EQ는, 종양 세포 증식 저해제, 접착 분자의 발현 억제제, 아포토시스 유도제, 비만 예방·방지제, 혈당치 저하제, 분화 유도의 저해를 해제하는 약제 등에 이용될 때, (±)-DHM2EQ 보다 유용하다.

또한, 종양 세포에 기인하는 증상의 개선에는, 종양 세포의 아포토시스가 기여해도 기여하지 않아도 좋다. 아포토시스가 기여하지 않은 경우란, 예를 들면, 세포접착 저해에 따른 종양 전이 저해, 아포토시스를 수반하지 않은 종양 증식 저해, 암 악역질 개선, 혈관신생 저해에 따른 종양 세포 괴사(壞死) 등을 들 수 있지만, 이것에 한정되는 것은 아니다. 즉, 종양 세포의 아포토시스가 기여하지 않음이란, (-)-DHM2EQ를 환부에 투여해도, 그 결과가, 그 환부에 있어서 종양 세포의 아포토시스에 의존하지 않은 것을 의미하지만, 아포토시스가 의존하지 않은 효과와는 별도로, 종양 세포의 아포토시스가 생기고 있어도 상관없다.

이하, (-)-DHM2EQ의 각 작용 효과에 따라, 상세히 설명한다.

<세포 접착 저해 작용>

염증성 자극이나 물리적 자극 등이 혈관 내피 세포에 가해지면, 혈관 내피 세포막 상의 세포접착 분자의 발현이 증강하고, 백혈구가 혈관 내피 세포 표면상에 접착하고, 혈관 밖으로 이동한다. 이것은, 혈관 내피 세포내에서, 전이 인자인 NF-κB이 활성화됨에 따라, ICAM-1, VCAM-1, E-셀렉틴 등의 접착 분자의 발현을 높이기 때문이다. 백혈구의 혈관벽으로의 접착은 지방질의 축적 등을 개입시켜 동맥 경화를 유도하기 때문에, 종래, 백혈구와 혈관 내피 세포와의 접착을 저해할 수 있으면, 동맥 경화 예방/억제로 연결된다고 생각되어 왔다.

또한, 종양 세포의 접착은 혈관으로부터의 침출, 전이를 일으키는 것이 알려져 있다. 예를 들면, 전이능이 높은 대장암에서는 E-셀렉틴의 리간드인 시아릴루이스-X가 고(高)발현하고 있는 것이 보고되어 있고, 혈관 내피 세포에서 NF-κB가 활성화되면, 혈관 내피 세포막 상에서의 E-셀렉틴의 발현이 증강하고, 대장암 세포가 혈관 내피 세포 표면 상에 접착해서 혈관 밖으로 침출하기 쉽게 되고, 전이가 촉진된다고 생각되고 있다.

만일, 혈관 내피 세포의 세포 접착 활성을 저해할 수 있으면, 동맥 경화나 종양 전이의 예방이나 억제로 연결될 가능성이 있고, 그와 같은 NF-κB 저해제는 동맥 경화나 종양세포의 전이 예방이나 억제에 유용할 수 있다고 생각된다.

그래서, 본 발명자들은, 상기 제조 방법에 의해 얻은, 식(2)의 화합물(이하, 「(-)-DHM2EQ」라고 칭한다.) 및 식(4)의 화합물(이하, 「(＋)-DHM2EQ」라고 칭한다.), 및 식(3)의 화합물(이하, 「(±)-DHM2EQ」라고 칭한다.) 를 이용해서, 그들 화합물이 인간 탯줄 정맥내피세포(HUVEC)의 세포 접착 활성에 주는 영향을 조사했다. TNF-α에 의해 자극한 혈관 내피 세포와 종양 세포와의 접착에 주는 각 화합물의 영향을 조사한 결과, (-)-DHM2EQ는 (＋)-DHM2EQ 보다 약 10배 강하고, 또한, (±)-DHM2EQ에 비해서 약 3배 강하고, 혈관 내피 세포와 종양세포와의 접착을 저해했다. 이렇게 해서, (-)-DHM2EQ는 (±)-DHM2EQ 보다 우수한 혈관 내피 세포 접착 저해 작용을 갖는 것이 명확해 졌다. 따라서, (-)-DHM2EQ는 (±)-DHM2EQ 보다 혈관 내피 세포 접착 저해제로서 보다 유용하고, 항동맥 경화제나 종양 전이 억제제로서도 보다 유용하다.

<항염증 작용 및 면역 질환 억제 작용>

본 발명자들은, 타입 II 콜라겐에 의해 관절염을 유발시킨 만성 관절 류머티즘 모델 마우스에게 (±)-DHM2EQ를 투여하고, 증상을 관찰한 경과, (±)-DHM2EQ가 관절염 증상의 억제에 유효하다는 것을 명확히 하고 있다. 이것은, 아마 (±)-DHM2EQ가 NF-κB의 활성 저해를 통해서 효과를 나타내고 있다고 생각되지만, (±)-DHM2EQ 보다 수배~수십배 이상 강한 활성 저해 효과를 갖는 (-)-DHM2EQ는, 관절염 증상에 대해서 항염증제로서 또한 예방/억제에 유효하다고 생각된다.

이상의 점으로부터, (-)-DHM2EQ는, 면역질환, 염증성 질환(알레르기성 염증 질환도 포함) 등의 증상에 대해서 유용한 면역 질환 억제제 및 항염증제이라고 기대할 수 있다.

<종양 세포 증식 저해 작용 및 항종양 작용>

최근, 본 발명자들은, (±)-DHM2EQ가, NF-κB가 활성화하고 있는 호지킨 림프종세포의 증식은 저해하지만, NF-κB가 활성화하고 있지 않은 골수구계(骨髓球系) 백혈병 세포의 증식은 저해하지 않은 것을 명확히 하고 있다. 이 점으로부터, (±)-DHM2EQ는 NF-κB의 활성화하고 있는 종양 세포의 증식 저해제로서 유용하고, NF-κB의 억제를 통해서 작용한다고 생각된다.

또한, 본 발명자들은, (±)-DHM2EQ가 in vitro 및 in vivo에서 아포토시스 비의존적으로 사람 유방암 세포의 증식을 억제하는 것을 명확히 하고 있다. 이 점으로부터, (±)-DHM2EQ는, 유방암의 예방·치료제로서 유용하다고 생각된다.

또한, 본 발명자들은, (-)-DHM2EQ가, 골수종 모델 마우스에 대해서 종양의 증식을 억제하는 것을 명확히 하고 있다(실시예 3 참조). 다발성 골수종은, 뼈 파괴에 따른 아픔을 수반하고, 고통이 심하고, 현재에 있어서는 근본적인 치료법이 없다. 따라서, (-)-DHM2EQ는, 다발성 골수종 등의 골수종에 대한 항종양제로서 기대할 수 있다.

나아가, 본 발명자들은, (-)-DHM2EQ가, 갑상선암 모델 마우스에 대해서 종양의 증식을 저해하는 것을 명확히 하고 있다(실시예 4 참조). 갑상선암은 난치성 암의 하나로, 현재로서는 효과적인 치료 방법은 전혀 없다. 따라서, (-)-DHM2EQ는, 갑상선암에 대한 항종양제로서 기대할 수 있다.

이상의 점으로부터, (±)-DHM2EQ 보다 NF-κB의 활성화 저해 효과가 강한 (-)-DHM2EQ는, 보다 우수한 종양 세포 증식 저해제로서 기대할 수 있다. 즉, 본 발명에 적용되는 종양 세포로서는, 예를 들면, 갑상선암 세포, 전위선암 세포, 유방암 세포, 악성 종양 세포, 췌장암 세포 등을 들 수 있지만, 특히 이들에 한정되는 것은 아니고, NF-κB가 활성화하고 있는 종양 세포라면 무엇이든지 좋다. 즉, 상기 악성 종양 세포로서는 림프계 악성 종양 세포가 치료대상으로서 바람직하고, 그 중에서도 호지킨 림프종세포, 골수종 세포가 특히 바람직하다. 또한, 호르몬 요법을 대상으로 하지 않는 호르몬 비감수성 종양도 치료의 대상으로 될 수 있기 때문에, 이 점은 호르몬 요법에 비해 큰 이점이 된다.

<아포토시스 유도 작용 및 항비만 작용 및 항인슐린 저항성 작용>

최근, 본 발명자들은, (±)-DHM2EQ가, NF-κB가 활성화 하고 있는 백혈병 세포인 아포토시스를 유도하는 것을 명확히 하고 있다. 이 점으로부터, NF-κB의 활성화 저해 효과가 강한 (-)-DHM2EQ는 (±)-DHM2EQ에 비해, 보다 우수한 아포토시스 유도 작용을 갖는 것을 기대 할 수 있다.

종래의 화학 요법은 세포에 보편적인 증식 기구를 널리 표적으로 하고 있기 때문에, 종양 세포 뿐만아니라 정상 세포에 대한 영향도 크고, 반드시 유효한 치료수단으로 되어 있지 않았다. 그러나, 본 발명자들은, (±)-DHM2EQ가 백혈병 세포의 아포토시스를 유도하는 것과 동일한 농도에서 일간 정상 백혈구의 아포토시스를 전혀 유도하지 않는다고 하는 실험 결과를 얻고, 종양 세포에 대한 특이성이 높은 것을 명확히 했다. 따라서, 나아가 비활성이 높은 (-)-DHM2EQ는, 백혈병 세포등 림프계 악성 종양 세포에 대한 특이성이 또한 높고, 정상세포에 대한 부작용은 또한 적다고 생각된다. 이와 같이, 본 발명에 관계된 아포토시스 유도제는, 악성 림프 종세포, 백혈병 세포 또는 골종양세포의 아포토시스 유도에 매우 적합하게 사용할 수 있고, 악성 림프종, 백혈병 또는 골수종에 대해서 특이성이 높기 때문에, 우수한 치료 효과를 기대할 수 있다.

즉, 치료대상으로 되는 림프계 악성 종양으로서는, 악성 림프종, 백혈병 또는 골수종 등을 들 수 있다. 상기 악성 림프종에는 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종 등이 포함되고, 골수종에는, 다발성 골수종 등의 형질세포성 종양 등이 포함되고, 백혈병에는, 급성 림프성 백혈병, 성인T 세포 백혈병 림프종, 만성 림프성 백혈병 등이 포함된다.

또한, (-)-DHM2EQ로 비대화 지방 세포를 처리하면, 아포토시스를 유도할 수 있다. 따라서, (-)-DHM2EQ는, 비대화 지방 세포의 아포토시스를 유도하기 위한 아포토시스 유도제로서 이용할 수 있다.

한편, 상세한 메카니즘은 아직 명확하지 않지만, 비만 등에 의해 비대(대형)화한 지방 세포로부터 혈액중에 염증성 사이트 카인인 TNF-α가 분비되고, 상기 TNF-α가 인슐린 수용체를 통과한 시그널 전달계를 저해함에 따라, 인슐린 저항성(인슐린 감수성 저하) 이 생기는 것이 알려져 있다. 인슐린 수용체를 통과한 시그널 전달계는, 보통은 골격 근세포내에 존재하고 있는 당수송담체(糖輸送擔體)(GLUT)를 급속히 세포막 상으로 이동시키고, 골격근세포내로의 당(글루코오스 등)의 도입을 촉진하는 기능도 갖기 때문에, 인슐린 저항성을 생성시키는 하나의 원인으로서, TNF-α가, 당수송담체의 세포막 상으로의 이동을 저해함으로서, 당의 세포내 도입을 저해하는 것이 고려되고 있다.

따라서, (-)-DHM2EQ가 비대화 지방 세포의 아포토시스를 유도하면, 지방 세포로부터 혈액중에 분비되는 TNF-α의 양이 감소하고, 당의 세포내 도입 작용의 저해를 방지하는 것 등에 의해, 비만예방·방지제, 혈당치 저하로서 유효할 뿐만 아니라, 인슐린 저항성을 수반하는 질환, 혹은 당뇨병에 기인하는 질환 등의 증상 개선이 초래된다. 인슐린 저항성을 수반하는 질환에는, 예를 들면, 2형 당뇨병, 고인슐린 혈증, 비질대사이상(肥質代謝異常), 비만, 고혈압, 동맥경화성 질환 등이 있고, 또한 당뇨병에 기인하는 질환으로서는, 예를 들면, 당뇨병성 신부전증, 당뇨병성 망막증, 당뇨병성 신경장해 등이 있지만, (-)-DHM2EQ에는, 이들 증상에 대해서 우수한 치료 효과를 기대할 수 있다.

<항 ATL 작용>

본 발명자들은, (±)-DHM2EQ을 이용해서, 성인 T세포 백혈병 림프종(ATL) 세포의 NF-κB의 활성화에 주는 영향을 조사한 결과, (±)-DHM2EQ는, ATL 세포의 NF-κB의 활성화를 저해하는 것을 명확히 했다. 또한, (±)-DHM2EQ를 이용해서, ATL 세포의 증식에 주는 영향을 조사한 결과, (±)-DHM2EQ는, 정상 세포의 증식을 저해하는 일은 없고, ATL 세포의 증식을 특이적으로 저해할 수 있는 것을 명확히 했다. 나아가, ATL 세포의 아포토시스의 유도에 주는 영향을 조사한 결과, (±)-DHM2EQ는 정상 세포의 아포토시스는 유도하지 않고 ATL 세포의 아포토시스를 유도할 수 있는 것을 명확히 하고 있다. 이들 점으로부터 (±)-DHM2EQ는 항 ATL 활성(작용)을 갖는 것으로 생각된다.

이상의 점으로부터, (±)-DHM2EQ보다 NF-κB의 활성화 저해 효과가 강한 (-)-DHM2EQ는 항 ATL제로서 보다 유용하다고 생각된다.

<항 악역질 작용>

악역질(cachexia ; 악액질이라고도 표기된다.)는, 악성 종양, 결핵, 당뇨병, 혈액 질환, 내분비·대사질환 등의 만성병에 있어서, 식용 부진, 진행하는 체중감소, 빈혈, 피부건조, 부종 등을 주요 증상으로 하는 전신 불량을 나타내는 질환이다. 특히, 악성 종양 말기 환자 등에게, 자주 볼 수 있는 증상이고, 체중 감소·빈혈 등을 중심으로 한 전신 기능의 저하를 나타낸다. 암환자가 악역질을 발증하면, 합병증의 위험이 높아지고, 화학 요법에 대한 반응이 악화된다. 나아가, 전신 쇠약 때문에, 암에 대한 화학 요법이나 방사선 치료의 부작용도 커지고, 악역질 때문에 사망에 이르는 경우도 있다.

지금까지, 악역질이 발증하는 상세한 메커니즘은, 완전하게는 설명되고 있지 않지만, 최근에 이르러, 인더루킨 6(IL-6)이나 종양 괴사 인자α(TNF-α) 등, 몇 개의 사이트 카인의 관여를 포함해, 겨우 그 메커니즘에 관한 단서를 얻을 수 있게 되었다(최신 의학 1999년 54권 10호 2502-2507페이지). 예를 들면, 암악역질에 있어서 다양한 증상의 발현 기서(機序)로서는, 악역질에 의해서 발현이 유도되어 과잉 발현한 사이트 카인이, 중추신경계에 작용하고, 섭식 감소, 발열, 저혈압, 무기력 상태 등의 증상을 일으키고, 또한, 당질, 단백질, 지질의 이화 항진상태를 초래하게 된다.

이와 같은 악역질에 있어서 증상을 억제하는데 스테로이드 투여가 유효하다. 악역질 환자에게 스테로이드를 투여하면, 스테로이드의 면역 반응 억제 작용이나 그것에 의한 항염증 작용, 또한 악역질 유도 사이트 카인의 생산 억제 작용에 의해, 악역질 대사이상이 시정되고, 체중감소, 식용부진, 무기력, 미각이상, 빈혈 등의 악역질 증상이 경감, 개선된다. 그러나, 스테로이드의 장기복용은, 그 중독(重篤)인 부작용이 큰 문제로 된다. 스테로이드는, 본래 자기가 가진 호르몬이기 때문에, 섭취한 스테로이드는 과잉한 호르몬과 마찬가지로 작용 효과를 나타내고, 예를 들면, 신장에 있어서 염(鹽) 재흡수에 관여함에 따라, 부작용으로서 부종이나 고혈압이 나타나는 경우가 있다.

한편, 오메가 3불포화 지방산이, IL-6 등의 염증성 사이트 카인의 생산을 억제하거나, 급성기반응단백의 합성에 영향을 주는 것을 이용해서, EPA(eicosapentaenoic acid)의 투여가 악역질의 개선에 일정한 효과를 올리고 있다. 그러나, 이와 같은 영양제제는, 작용이 간접적이기 때문에, 현저하고 확실한 효과는 기대하기 어렵다.

따라서, 스테로이드와 같은 광범위한 작용을 갖는 약제와는 달리, 악역질에 특이적이고, 효과의 현저한 약제의 개발이 요구되게 되었다. 이와 같은 요청아래, 본 발명자들은, 악역질의 증상을 유발한 모델 마우스에게 (±)-DHM2EQ를 투여하고, 증상을 관찰한 결과, (±)-DHM2EQ가 악역질의 증상의 예방/개선에 유효하다는 것을 명확히 하고 있다. 따라서, (±)-DHM2EQ보다 NF-κB의 활성화 저해 효과가 강한 (-)-DHM2EQ은, 악역질 증상에 대해서 예방/개선에, 보다 유효하다고 생각된다.

<혈관 신생 억제 작용>

(±)-DHM2EQ는, NF-κB의 활성화를 저해할 수 있기 때문에, NF-κB의 활성화에 의해 일어나는 시클로 옥시게나아제-2(COX-2)의 유전자 발현을 저해할 수 있을 것으로 생각된다. 또한, 시클로 옥시게나아제-2의 유전자 발현을 저해하는 것으로부터, COX-2의 하류에 있는 프로스타글란딘의 합성도 저해할 수 있을 것으로 생각된다. 종양내에 있어서, NF-κB의 활성화는 프로스타글란딘의 합성 촉진을 통해 혈관 신생을 왕성하게 일으키고 있지만, (±)-DHM2EQ는 NF-κB의 활성화 저해를 통해, 프로스타글란딘에 의해 촉진되는 종양혈관의 신생을 저해할 수 있을 것으로 생각된다. 따라서, (±)-DHM2EQ는, 종양 내에 있어서 혈관 신생을 저해하고, 종양으로의 산소나 영양분의 공급을 저해하는 것에 의해 항종양 작용을 나타내는 암 치료약으로서도 유용하다고 생각된다.

이상의 점으로부터, (±)-DHM2EQ보다 NF-κB의 활성화 저해 작용이 강한(-)-DHM2EQ는, 종양 내에 있어서 혈관신생 저해제로서 보다 유용하다고 생각된다.

<항 근디스트로피 작용>

본 발명자들은, (-)-DHM2EQ를 이용함으로서, 근아 세포로부터 근세포로의 분화 유도의 저해를 해제할 수 있는 것을 명확히 했다. 따라서, (-)-DHM2EQ는, 근아 세포로부터 근세포로의 분화 유도의 저해를 해제하는 약제로서 이용할 수 있다. 또한, (-)-DHM2EQ는, 근아 세포로부터 근세로포의 분화 유도의 저해에 의해 발증하는 근 디스트로피 개선에 대해서 유용하고, 우수한 치료 효과를 기대할 수 있다.

<본 발명에 관계된 의약 조성물과 NF-κB를 활성화시키는 치료와의 병용 효과>

종래, 종양 치료 방법으로서 화학 요법이나 방사선 요법 등이 알려져 있다. 그러나, 화학 요법이나 방사선 요법을 이용하면, 종양 세포에 있어서 NF-κB가 활성화되고, 암치료의 효과가 감소하는(J. Clin. Invest. 107, 241-246, 2001). 예를 들면 방사선 치료는, 종양 세포를 죽이기 위해 행해지지만, 방사선 조사에 의한 산화 스트레스에 의해서 NF-κB가 활성화되고, 종양 세포는 아포토시스를 일으키기 어려워져 방사선 요법에 저항하도록 된다. 이와 같이, 종양 세포에 방사선을 조사하고 있으면, 점차 방사선의 효과가 있기 어려워지는 일이 있다. 따라서, 이와 같은 암치료에 대한 저항성을 해제하는 방법의 개발이 요구되고 있다.

최근, 본 발명자들은, 화학 요법이나 방사선 요법 등의 NF-κB을 활성화 시키는 종양 치료에 (±)-DHM2EQ를 이용함으로서, 상기 종양 치료의 효과가 증대하는 것을 명확히 하고 있다. 따라서, (±)-DHM2EQ보다 NF-κB의 활성화 저해 효과가 강한 (-)-DHM2EQ는, 화학 요법이나 방사선 요법 등의 NF-κB를 활성화시키는 치료와 병용시킴으로서, 상기 치료의 효과를 더욱 증강시키는 것에 유용하다고 생각된다.

상기 화학요법에 이용되는 항종양제로서는, 적어도 NF-κB를 활성화시키는 것이라면 어느 것이라도 좋고, 예를 들면, 캄프테신(CPT)이나 다우노마이신(성분명:다우노르비신;DNR 또는 DM)등의 항종양제가 있다.

즉, (-)-DHM2EQ와 병용하는 약제는 항암제에 한정되지 않고, 투여에 의해NF-κB가 활성화 되고, 그 때문에 치료에 대한 저항성을 생성시키는 약제라면 어느 것이라도 좋다. 예를 들면, (-)-DHM2EQ는, 감염증질환, 알레르기 질환, 면역질환, 염증성질환, 종양전이, 악역질, 동맥경화, 혈관 신생성 질환(특히, 종양내의 혈관 신생질환), 백혈병(특히, 성인T 세포 백혈병(Audult T cell leukemia))등의 질환에 대해서 이용되는 치료와 병용함으로서, 치료의 효과를 증대시키는 것도 기대할 수 있다. 투여의 시기에 관해서는, (-)-DHM2EQ는, NF-κB를 활성화시키는 치료와 동시에 투여해도 좋지만, NF-κB를 활성화시키는 치료 후에 NF-κB의 활성화를 저해하기 위해서 이용하는 것으로 해도 좋다. 또한, NF-κB의 활성화를 저해하기 위해서, 미리 투여해도 좋다. 치료대상으로서는, 상기 질환을 수반하는 인간 및 인간 이외의 포유류 동물이 고려된다.

===== 식(13)으로 나타나는 화합물의 라세미체의 제조 방법=====

상술한 것에 있어서는, 식(3)으로 나타나는 화합물의 라세미체를 직접 분할하는 것에 의해, 광학활성인 (-)체 및 (＋)체 화합물을 제조하는 방법에 대해서 설명했지만, 식(13)

으로 나타나는 화합물의 라세미체((±)-DHM3EQ)도 마찬가지로 직접 분할해서, 식(14)

으로 나타나는 (-)-체 화합물((-)-DHM3EQ)이나 식(15)

으로 나타나는 (＋)-체 화합물((±)-DHM3EQ)을 제조하는 것도 가능하다. 이하에, 식(13)으로 나타나는 화합물 라세미체의 제조 방법에 대해서, 하기의 반응식을 이용해서 설명한다. 즉, 하기의 반응식에 있어서, R²는 C1~C4 알킬기이고, 알킬기로서는, 메틸기, 에틸기, 프로필기, 부틸기 및 이들의 이성체기를 들 수 있고, 메틸기, 에틸기가 바람직하고, 메틸기가 특히 바람직하다.

공정(f):3, 3-디알콕시-4, 5-에폭시-6-히드록시-2-살리시로일 아미드시클로헥세논의 제조

식(16)으로 나타나는 5, 6-에폭시-4, 4-디알콕시-3-살리실로일 아미드-2-시클로 헥세논 화합물을 메탄올 등의 용제와 중조수 혼합용매로 용해하고, -78~50℃, 바람직하게는 빙냉하에서, 환원제(수소화 붕소 나트륨 등)을 첨가하고, 교반하면서 반응시킨다. 상기 반응액에 용제(초산 에틸 등)을 첨가하고, 염산, 물로 차례로 세정하고, 용제층을 건조 후, 감압 농축, 진공 건조하고, 칼럼 크로마토그래피 등으로 정제해서, 식(17)로 나타나는 3, 3-디알콕시-4, 5-엑폭시-6-히드록시-2-살리시로일 아미드 시클로 헥센 화합물을 얻는다.

공정(g):5, 6-에폭시-4-히드록시-2-살리시로일 아미드-2-시클로헥세논(식(13), DHM3EQ)의 제조

식(17)의 화합물을 용제(아세톤 등)로 용해시키고, p-톨루엔 술폰산을 첨가하고, 실온에서 교반하면서 반응시킨다. 반응액에 용제(초산 에틸 등)을 첨가하고 물로 세정하고, 용제층을 건조하고, 감압 농축하고 정제해서, 식(13)의 5, 6-엑폭시-4-히드록시-2-살리시로일 아미드-2-시클로 헥세논(DHM3EQ)을 얻을 수 있다.

이와 같이 해서 제조된 (±)-DHM3EQ도, 식(5)로 나타나는 기로 치환된 다당의 방향족 카르바메이트 유도체를 유효성분으로 하는 분리제가 충전된 광학 활성 칼럼을 이용하거나, 바치식으로 상기 분리제를 이용하거나 함으로서, (＋)-DHM3EQ와 (-)-DHM3EQ에 직접, 광학 분할하는 것이 가능하다. 광학 활성 칼럼으로서는, (±)-DHM3EQ를 (＋)-DHM3EQ와 (-)-DHM3EQ에 직접, 광학 분할할 수 있는 칼럼을 이용하는 것이 바람직하고, 분리제로서는, (±)-DHM3EQ를 (＋)-DHM3EQ와 (-)-DHM3EQ에 직접, 광학 분할할 수 있는 분리제를 이용하는 것이 바람직하다.

즉, 이와 같이 해서 정제된, (-)-DHM3EQ(식(14)) 또는 (＋)-DHM3EQ(식(15))는, (-)-DHM3EQ와 마찬가지로 라세미체의 화합물보다 우수한 약리작용을 갖고, NF-κB의 활성화를 수반하는 증상을 개선하는데 보다 유용한 것으로 생각된다.

=== 기타 실시예 ===

상술한 것에 있어서는, 일반식(1)로 나타나는 화합물 R¹이 아세틸기인 화합물의 약리작용에 대해서 설명했지만, 일반식(1)로 나타나는 화합물 R¹이 수소원자, 프로피오닐기, 또는 부타노일기, 또는 이들 이성체기인 화합물도 동일한 약리작용을 갖는 것으로 생각된다.

즉, 본 발명의 화합물은, 약리학적으로 허용되는 염, 예를 들면, 제 4급 암모늄염 등의 유기염, 혹은 알카리 금속 등의 금속염, 과 같은 형태로 해도 좋다. 이와 같은 화합물 염은, 공지의 방법으로 제조 할 수 있다.

<실시예 1>

상술한 방법에 의해, (±)-5-데히드록시 메틸에폭시 퀴노마이신 C(dehydroxymethyl derivatives of epoxyquinomicin C ; DHM2EQ)을 합성했다. 얻어진 (±)-DHM2EQ의 광학 분할은, 0.5v/v% 초산 첨가 메탄올을 이동상(유속:1.0ml/min)으로 해서, DAICEL CHIRALPAK AD(10mm i.d×250mm)을 이용한 고속 액체 크로마토그래피(HPLC)(검출파장:315nmUV, 칼럼 온도:40℃)에 의해 행했다. (±)-DHM2EQ 20mg을 2ml의 메탄올에 용해하고, 이것을 100μl씩 20회에 걸쳐 주입하고, 3.8분과 5.7분 피크 부분을 분리해서 얻은 결과, 85%의 회수율로 (-)-DHM2EQ 및 (±)-DHM2EQ을 얻었다. 분리 모양을 도 3에 나타낸다.

이와 같이 해서 얻어진 양물질의 시광도((-)-DHM2EQ:[α]²⁰ _p-241° (c0.1MeOH), (＋)-DHM2EQ:[α]²⁰ _p＋239°(c0.1MeOH))는, 문헌(Bioorg. Med. Chem. Lett. 10, 865-869, 2000)에 기재한 것과 일치하고, 광학 순도(ee)는 99% 이상이었다.

<실시예 2>

본 실시예에 있어서는, TNF-α에 의해 자극한 혈관 내피 세포와 종양세포와의 접착에 대한 (-)- 및 (＋)-DHM2EQ의 효과를 조사했다.

(1) 세포 배양

정상 인간 탯줄 정맥내피세포(HUVEC;Cell systems, Lake Kirland, WA)는, I형 콜라겐(주식회사 고연(高硏), Tokyo, Japan)으로 코팅한 플라스틱 플라스크(Costar, New York, USA)를 사용하고, 비동화한 10% 송아지 태아혈청(FBS:JRH BIOSCIENCES, Lenexa, KS), 10μg/ml bFGF (Pepro Tech EC LTD, London, UK)을 포함하는 MCDB- 131 배지(Sigma, St. Louis, MO)을 이용해서, 37℃, 5% CO₂의 인큐베이터 속에서 배양했다. 인간 급성전골수구성 백혈병 세포주 HL-60 세포(Japanese Collection of Research Bioresources)는, 비동화한 10% FBS를 포함하는 RPMI1640 배지(일본제약 주식회사, Tokyo, Japan)을 이용해서, 37℃, 5% CO₂의 인큐베이터 속에서 배양했다.

(2) 세포 접착 실험

HUVEC를 48 웰 플레이트(Costar)에 4.0×10⁴세포/웰(500μl/웰)로 뿌리고 하룻밤 배양했다. 다음날, 배양한 HUVEC를, 각종 농도로 희석한 (-)-DHM2EQ, (±)-DHM2EQ, 또는 (＋)-DHM2EQ로 처리하고, 37℃, 5% CO₂에서 2시간 인큐베이터 했다. 그 후, 또한 10ng/ml TNF-α(Genzyme-Techne, Cambridge, MA)를 첨가하고, 37℃, 5% CO₂에서 2시간 인큐베이터 했다(컨트롤로서는, TNF-α 무처리로 했다.). 6시간 후, 37℃로 따뜻한 PBS(phosphate buffered saline;인산완충생리식염수)로 각 웰을 2회 세정하고, 새로운 배지를 각 웰에 첨가했다(200μl/웰). 계속해서, 각 웰에 HL-60 세포를 6.0×10⁴세포/웰(200μl/웰)의 농도로 뿌리고, 37℃, 5% CO₂에서 1시간 인큐베이터 했다. 다음으로, 37℃로 따뜻한 PBS에서 각 웰을 3회 세정하고, 미접착 HL-60 세포를 제거하고, 새로운 배지(200μl/웰)을 첨가했다. 그 후, HUVEC에 접착한 HL-60세포를 현미경으로 확인하고, 현미경 시야내의 접착 세포수를 측정함으로서 세포 접착능을 평가했다. 그 결과를 도 4에 나타낸다. 즉, 도 중에 각각의 DHM2EQ를 이용했을 때의 IC₅₀를 나타낸다. 도 4에 나타낸 것과 같이, (-)-DHM2EQ는, (＋)-DHM2EQ 및 (±)-DHM2EQ보다 세포 접착 저해 활성이 각각 10배 및 3배 강한 것이 명확해 졌다.

<실시예 3>

다음으로, 다발성 골수종에 대한 (-)-DHM2EQ에 의한 항종양 효과를 조사했다. 4×10⁷개의 다발성 골수종 세포주 KMS-12-PE(Ohtsuki T. et al., Br. J. Hematol. 73, 199-204, 1999)를 0.2ml의 PBS로 용해하고, 이것을 CB17/1cr-SCID 마우스의 왼쪽 등부에 피하 주사하고 종양 혹을 형성시키고, 그 종양 조각 5mm 입방을 10마리의 마우스에게 이식했다. 종양을 이식한 후, 16일 동안 관찰하고, 종양 조각의 생착(生着), 증식 경향을 확인 후, 5마리의 마우에게 (-)-DHM2EQ 용액(RPMI 1640배지)을 8mg/kg-체중으로 복강내에 투여했다((-)-DHM2EQ). 투여는 14일 동안 매일 행했다. 대조군인 마우스 5마리에게는 동일량의 용매를 투여했다(컨트롤). 종양 지름의 계측은, 주 2회 행했다(종양 용량=(단 지름)²×(장 지름)×0.52). 그 결과, 도 5에 나타낸 것과 같이, (-)-DHM2EQ는, 컨트롤에 비해서 유의미하게 종양의 증식을 억제하는 것이 명확해 졌다.

<실시예 4>

인간 갑상선암에 대한 (-)-DHM2EQ에 의한 항종양 효과를 조사했다. 미분화인 인간 갑상선암 세포 부유액 FRO(5×10⁶ 세포;200μl의 RPMI-1640)을 8주된 수컷 BALB/cnu/nu 마우스(Charles River Japan 사제)의 옆구리에 피하 주사했다. 그 후, 캘리퍼를 이용해서 종양 사이즈를 하루걸러 측정하고, 종양 용량=(a;종양의단 지름)²×(b;a에 대한 수직 지름)×0.4에 의해 종양 용량을 산출했다. 종양 용량이 100mm³에 달한, 피하 주사로부터 14일 후를 0일로 해서, 9마리의 마우스군에게 (-)-DHM2EQ의 용액(Cremophore (BASF사):PBS:DMOS(2:1:1))을 10mg/kg-체중에서 복강 내에 10일 동안 매일 투여했다(○:(-)-DHM2EQ). 대조군 마우스 9마리에게는 동일 량의 용매를 투여했다(■:컨트롤). 그 결과 도 6에 나타낸 것과 같이, (-)-DHM2EQ는, 컨트롤에 비해서 유의하게 종양의 증식을 저해하는 것이 명확해졌다.

<실시예 5>

인슐린 저항성을 수반하는 질환은, 상술한 것과 같이, 비대화 지방 세포로부터 분비되는 TNF-α에 기인한다고 생각되고 있다. 그래서, (-)-DHM2EQ가 비대한 지방 세포의 아포토시스를 유도할 수 있는지를 확인하기 위해, 전구(前驅)지방세포를 장기 배양해서 분화 유도시켜서 얻어지는 비대화 지방 세포에 대한 (-)-DHM2EQ의 영향을 조사했다.

전구지방세포주 3T3-L1(7.5×10⁴ 세포;1ml의 10% FBS를 포함한 DMEM)을 12웰 플레이트중의 커버 글라스 상에 뿌리고, 컨플엔트(confluent)에 달하고 나서 2, 3일 후에, 500μM IBMX(3-이소부틸일-1-메틸키산틴), 1μM Dex(덱사메타존), 및 1μg/ml 인슐린을 포함한 배지로 교환했다. 3일 동안 배양후, 1μg/ml 인슐린을 포함한 배지로 교환하고, 또한 3일 동안 배양해서 통상의 배지(10% FBS를 포함한 DMEM)로 교환했다. 이후 3일 간격으로 50일까지, 배지 교환을 계속했다.

분화 유도 50일째에 배지를 교환하고, 24시간 후에 비대화 지방 세포를 (-)-DHM2EQ(10μg/ml)에서 30분 전처리하고, 계속해서 TNF-α(10ng/ml)을 또한 첨가해서 자극했다(컨트롤로서, (-)-DHM2EQ 무첨가, TNF-α 무첨가, 및 양쪽 모두 무첨가의 각 조건으로 실험을 행했다.). 나아가 24시간 후, 배지를 제외하고, 비대 지방 세포를 형광항체용 PBS(8g/1NaCl, 0.45g/1 NaH₂PO₄·2H₂O, 1.28g/1Na₂HPO₄)50μl로 3회 세정하고, 4% 파라포름알데히드 500μl로 4℃에서 15분간 고정했다. 그 후, 형광항체용 PBS 50μl로 3회 세정하고, 0.2% BSA, 및 0.5% Tween-20을 포함한 형광항체용 PBS로 15분 동안 처리했다.

그 후, 500μl 증류수로 3회 세정하고, 차광한 150mm² 샬레 중의 파라핀 시트 상에 커버 글라스를 세포면을 위로 해 두었다. 또한, 그 위로부터 TUNEL 용액(TdT buffer II / FITC-dUTP / TdT =45μl / 2.5μl / 2.5μl)을 45μl씩 적하하고, 37℃에서 1시간 인큐베이터 했다. 마지막으로 커버 글라스를 차광한 12웰 플레이트로 되돌아가, 1ml의 형광항체용 PBS로 3회 세정한 후, 커버 글라스를 취출해서 슬라이드 글라스에 50% 글리세롤로 고정하고, 형광 현미경으로 관찰했다.

그 결과, 도 7에 나타낸 것과 같이, 미리 10mg/ml (-)-DHM2EQ로 처리된 비대화 지방 세포는, 10mg/ml TNF-α의 자극에 의해, 아포토시스를 유도하는 것이 명확해 졌다. 즉, 10mg/ml TNF-α 또는 10mg/ml (-)-DHM2EQ의 한쪽으로만 처리된 비대화 지방세포는 아포토시스를 유도하지 않았다.

이상의 점으로부터, (-)-DHM2EQ는 TNF-α를 분비하는 비대화 지방세포에 기인하는 인슐린 저항성 증후군(예를 들면, 2형 당뇨병, 고 인슐린 혈증, 지질대사이상, 비만, 고혈압, 동맥경화성 질환 등)의 개선(예방, 치료를 포함)에 유용하다고 생각된다. 또한, (-)-DHM2EQ는, 비만 예방제, 다이어트제, 혈당치 저하제로서도 유용하다고 생각된다. 나아가서는, (-)-DHM2EQ는, 당뇨병에 기인하는 질환(예를 들면, 당뇨병성 신부전증, 당뇨병성 망막증, 당뇨병성 신경 장해 등)의 개선(예방, 치료를 포함)에도 유용하다고 생각된다.

<실시예 6>

다음으로, 비만·2형 당뇨병 모델 동물 KKA^y 마우스를 이용해서, 당뇨병에 대한 (-)-DHM2EQ의 효과를 조사했다.

4주된 암컷 KKA^y 마우스를 2군((-)-DHM2EQ 투여군 5마리, 컨트롤군 4마리)으로 나누고, 고지방식(CRF-1, 오리엔탈 효모(주)를 기본 사료로서, 무첨가군(○:(-)-DHM2EQ 없이), (-)-DHM2EQ 투여군(●:(-)-DHM2EQ 첨가)를 자유 섭취하게 해서 4주 동안 주고, 매주 체중을 측정했다. 즉, 마우스에게 투여하는 (-)-DHM2EQ는 막자사발로 잘게 부수고, 0.5% CMC 용액을 첨가해서 현탁 또는 용해하고, 이것을 고지방식으로 첨가했다. 그 결과, 도 8에 나타낸 것과 같이, 무첨가군은, 고지방식 부하에 의해서 현저한 체중증가를 나타내고 있었지만, (-)-DHM2EQ군은 고지방식하에서도 체중 증가가 억제되고 있었다. 이상의 점으로부터, (-)-DHM2EQ는 항비만제(항비만 예방·방지제)(다이어트제를 포함), 항당뇨병제로서 유용하다고 생각된다.

<실시예 7>

듀시엔누형을 비롯한 근(筋)디스트로피 환자에게 있어서 근디스트로피 질환의 진전은, 근아세포로부터 근세포로의 분화 유도의 저해에 의한 근세포의 재생 불량이 하나의 발증 기구라고 생각되고 있다(의학의 변천, 199:1045-1048, 2001). 듀시엔누형 근(筋)디스트로피 모델 동물인 mdx 마우스는, 인간 듀시엔누형 근(筋)디스트로피 환자와 마찬가지로 디스트로피의 발현을 결손하고 있음에도 불구하고, 근(筋)재생이 활발하게 행해지고 있기 때문에 거의 근력 저하를 볼 수 없다. 그 이유로서, 인간 환자에게 있어서는, 일단 파손된 근세포의 재생 과정에서, TNF-α 등의 염증성 인자가 근분화를 저해하고 있기 때문이라고 생각되고 있다.

그래서, 본 발명자들은, 근아 세포주 C2C12의 분화유도계를 이용해서, (-)-DHM2EQ의 첨가가 TNF-α에 의한 근분화 저해반응을 해제할 수 있는지의 여부를 조사했다.

10% FBS를 포함한 DMEM(배양용 배지)를 이용해서, 마우스 골격근 유래의 근아 세포주 C2C12(이화학 연구소 세포 뱅크로부터 구입)를 7.5×10⁴ cells/ml로 조정하고, 커버 글라스(마츠나미 글라스 공업주식회사, Osaka, Japan)를 부설한 플라스틱제 12웰 플레이트의 각 웰에 각각 1ml씩 파종했다. 그 후, 각 웰에 있어서 세포가 컨플루언트(confluent)하게 될 때까지 증식했을 때, 배지를, 2% heat-inactivated horse serum을 포함한 DMEM(분화용 배지)로 교환했다. TNF-α(1ng/ml) 및 / 또는 (-)-DHM2EQ(3μm/ml)을 작용시키는데 대해서는, 이 시점에서 각 약제를 첨가했다. 6일 후, 다핵의 근세포의 출현이라고 하는, 근세포가 분화한 지표를 확인해서, 배지를 제거했다. 즉, 컨트롤로서, 6일째에 정확히 컨플엔트 되도록, 배양용 배지에서 배양한 세포를 준비했다.

이들 세포를 PBS(Ca^2＋, Mg^2＋ free-PBS ; 8.0g/1 NaCl, 0.2g/1 KCl, 2.3g/1 NaHPO₄·12H₂O, 0.2g/1 KH₂PO₄) 로 2회 세정한 후에 커버 글라스를 웰로부터 취출하고, 냉풍 드라이어를 이용해서 세포를 건조시켰다. 그 후, 커버 글라스를 다시 12웰 플레이트의 웰에 넣고, 거기에 May-Gr㎻nwald 액(Merck사, Darmstadt, Germany)을 약 300μl씩 넣고 글라스 상의 세포를 침적하고, 2~3분 그대로 정지해서 고정·염색했다. 2~3분 경과후, 재빨리 pH를 6.7로 조정한 PBS를 각 웰에 동일량 첨가하고, 각 웰의 용액에 공기를 불어 넣으면서, 세포를 또한 2~3분 고정·염색했다. 그리고, 커버 글라스를 웰로부터 취출한 후, 세정하고, 드라이어의 냉풍으로 글라스를 건조시켰다.

커버 글라스를 다시 12웰 플레이트의 웰에 넣고, 김자(Giemsa) 염색액(1ml의 PBS(pH;6.7)에 45μl의 Giemsa액(Merck)을 첨가한 용액)을 넣고 커버 글라스를 침적했다. 그 후, 각 웰 용액에 재차 공기를 불어 넣어면서, 10~15분 동안 핵을 염색했다. 그 후, 상기와 마찬가지로 커버 글라스를 웰로부터 취출하고, 세정하고, 드라이어의 냉풍으로 건조시켰다.

이상과 같이해서 제작한 샘플을 슬라이드 글라스에 얹고, 형광 현미경(Nikon UFX-DX;위상차용 40배의 대상 렌즈, Ph2로 세트했다.)을 이용해서 400배의 배율로 사진을 촬영했다. 그 결과, 도 9에 나타낸 것과 같이, 1ng/ml의 TNF-α는 근아세포로부터 근세포로의 분화 유도를 억제했지만, 1~3μg/ml의 (-)-DHM2EQ는 상기 분화 유도의 저해를 해제하는 것이 명확해 졌다. 즉, 분화 유도하지 않았던 C2C12 세포의 분화율은 0% 이었다.

이들의 점으로부터, 듀시엔누형을 비롯한 근(筋)디스트로피 환자에게 (-)-DHM2EQ를 투여함으로서, TNF-α에 의한 근분화 저해를 해제해서 근재생을 유도하고, 근디스트로피 질환을 개선하는 것이 기대된다.

본 발명에 의하면, 면역질환, 알레르기성 질환, 염증성 질환, 종양 전이, 악역질, 동맥경화 등의 증상에 유용한 의약 조성물, 및 의약 조성물에 유효 성분으로서 함유시키는 광학활성인 화합물의 제조 방법이나 직접 분할 방법을 제공할 수 있다.

Claims

하기의 일반식(1)으로 나타나는 광학활성인 화합물 또는 그 약리학적으로 허용되는 염을 유효성분으로서 함유하고, NF-κB의 활성화를 수반하는 증상을 개선하는 것을 특징으로 하는 의약 조성물.

(식 중, R¹은 수소원자 또는 C 2~4의 알카노일기이다.)
제 1 항에 있어서,

상기 화합물이 다음 식(2)인 것을 특징으로 하는 의약 조성물.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,

상기 증상이, 종양세포에 기인하는 것을 특징으로 하는 의약 조성물.
제 3 항에 있어서,

상기 종양세포의 증식을 저해하는 것에 의해, 상기 증상을 개선하는 것을 특징으로 하는 의약 조성물.
제 1 항에 있어서,

혈관 내피 세포의 세포접착활성을 저해하는 것에 의해, 상기 증상을 개선하는 것을 특징으로 하는 의약 조성물.
제 1 항에 있어서,

상기 증상이, 면역질환, 알레르기성 질환, 염증성 질환, 종양 전이, 악역질, 동맥 경화, 백혈병으로 이루어진 군에서 선택되는 증상인 것을 특징으로 하는 의약 조성물.
NF-κB를 활성화시키는 치료에 의한 NF-κB의 상기 활성화를 저해하는 것에 의해, 상기 치료의 효과를 증대시킬 수 있는, 하기의 일반식(1)으로 나타나는 광학활성인 화합물 또는 그 약리학적으로 허용되는 염을 유효성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 의약 조성물.

(식 중, R¹은 수소원자 또는 C 2~4의 알카노일기이다.)
제 7 항에 있어서,

상기 화합물이 다음 식(2)인 것을 특징으로 하는 의약 조성물.
제 7 항 또는 제 8 항에 있어서,

상기 NF-κB를 활성화시키는 치료가, 항종양제를 이용한 치료인 것을 특징으로 하는 의약 조성물.
제 7 항 또는 제 8 항에 있어서,

상기 NF-κB를 활성화시키는 치료가, 종양세포에 대한 방사선 조사에 의한 치료인 것을 특징으로 하는 의약 조성물.
제 9 항에 있어서,

상기 항종양제가, 유효 성분으로서 함유되어 있는 것을 특징으로 하는 의약 조성물.
제 9 항에 있어서,

상기 항종양제는, 캄프토테신(camptothecine) 또는 다우노르비신(Daunorubicin) 인 것을 특징으로 하는 의약 조성물.
하기의 일반식(1)으로 나타나는 광학활성인 화합물 또는 그 약리학적으로 허용되는 염을 유효성분으로서 함유하고, TNF-α에 의해서 야기되는 질환을 개선하는 것을 특징으로 하는 의약 조성물.

(식 중, R¹은 수소원자 또는 C 2~4의 알카노일기이이다)
제 13 항에 있어서,

상기 화합물은 다음 식(2)인 것을 특징으로 하는 의약 조성물.
제 13 항 또는 제 14 항에 있어서,

상기 TNF-α에 의해서 야기되는 질환이, 인슐린 저항성을 수반하는 질환인 것을 특징으로 하는 의약 조성물.
제 13 항 또는 제 14 항에 있어서,

상기 TNF-α에 의해서 야기되는 질환이, 당뇨병에 기인하는 질환인 것을 특징으로 하는 의약 조성물.
제 13 항 또는 제 14 항에 있어서,

상기 TNF-α에 의해서 야기되는 질환이, 근디스트로피인 것을 특징으로 하는 의약 조성물.
하기의 일반식(1)으로 나타나는 광학활성인 화합물 또는 그 약리학적으로 허용되는 염을 유효성분으로서 함유하는 종양 세포의 증식을 저해하기 위한 종양세포 증식저해제.

(식 중, R¹은 수소원자 또는 C 2~4의 알카노일기이다.)
제 18 항에 있어서,

상기 화합물이 다음 식(2)인 것을 특징으로 하는 종양세포 증식저해제.
하기의 일반식(1)으로 나타나는 광학활성인 화합물 또는 그 약리학적으로 허용되는 염을 유효성분으로서 함유하는 혈관 내피 세포의 세포 접착을 저해하기 위한 세포접착 저해제.

(식 중, R¹은 수소원자 또는 C 2~4의 알카노일기이다.)
제 20 항에 있어서,

상기 화합물이 다음 식(2)인 것을 특징으로 하는 세포 접착 저해제.
하기의 일반식(1)으로 나타나는 광학활성인 화합물 또는 그 약리학적으로 허용되는 염을 유효성분으로서 함유하는, 종양세포의 아포토시스를 유도하기 위한 아포토시스 유도제.

(식 중, R¹은 수소원자 또는 C 2~4의 알카노일기이다.)
제 22 항에 있어서,

상기 화합물이 다음 식(2)인 것을 특징으로 하는 아포토시스 유도제.
하기의 일반식(1)으로 나타나는 광학활성인 화합물 또는 그 약리학적으로 허용되는 염을 유효 성분으로서 함유하는, 비대화 지방세포의 아포토시스를 유도하기 위한 아포토시스 유도제.

(식 중, R¹은 수소원자 또는 C 2~4의 알카노일기이다)
제 24 항에 있어서,

상기 화합물이 다음 식(2)인 것을 특징으로 하는 아포토시스 유도제.
제 24 항 또는 제 25 항에 있어서,

나아가, TNF-α를 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 아포토시스 유도제.
하기의 일반식(1)으로 나타나는 광학활성인 화합물 또는 그 약리학적으로 허용되는 염을 유효성분으로서 함유하는 비만예방·방지제.

(식 중, R¹은 수소원자 또는 C 2~4의 알카노일기이다.)
제 27 항에 있어서,

상기 화합물이 다음 식(2)인 것을 특징으로 하는 비만예방·방지제.
하기의 일반식(1)으로 나타나는 광학활성인 화합물 또는 그 약리학적으로 허용되는 염을 유효성분으로서 함유하는 혈당치 저하제.

(식 중, R¹은 수소원자 또는 C 2~4의 알카노일기이다.)
제 29 항에 있어서,

상기 화합물이 다음 식(2)인 것을 특징으로 하는 혈당치 저하제.
하기의 일반식(1)으로 나타나는 광학활성인 화합물 또는 그 약리학적으로 허용되는 염을 유효성분으로서 함유하는, 세포분화 유도의 저해를 해제하는 약제.

(식 중, R¹은 수소원자 또는 C 2~4의 알카노일기이다.)
제 31 항에 있어서,

상기 화합물이 다음 식(2)인 것을 특징으로 하는 세포분화 유도의 저해를 해제하는 약제.
제 31 항 또는 제 32 항에 있어서,

상기 세포 분화 유도의 저해가, TNF-α에 의한 근세포 분화의 억제인 것을 특징으로 하는 세포분화 유도의 저해를 해제하는 약제.
식(3):

으로 나타나는 화합물의 라세미체를 직접 광학 분할하는 것을 특징으로 하는, 식(2):

또는 식(4):

으로 나타나는 광학 활성인 화합물을 제조하는 방법.
제 34 항에 있어서,

상기 광학 분할이 광학 활성 칼럼을 이용해서 행해지는 광학 활성인 화합물을 제조하는 방법.
제 35 항에 있어서,

상기 광학 활성 칼럼은, 하기의 식(5)으로 나타나는 기로 치환된 다당의 방향족 카르바메이트 유도체를 유효성분으로 하는 분리제가 충전되어 있는 것을 특징으로 하는 광학 활성인 화합물을 제조하는 방법.

(식중, R³~R⁷는, 수소원자, 탄소수 1~8의 알킬기이다.)
제 36 항에 있어서,

상기 다당의 방향족 카르바메이트 유도체가, 아밀로오스트리스(3, 5-디메틸페닐 카르바메이트)인 것을 특징으로 하는 광학 활성인 화합물을 제조하는 방법.
식(3)

으로 나타나는 화합물의 라세미체를, 하기의 식(5)으로 나타나는 기로 치환된 다당의 방향족 카르바메이트 유도체를 유효성분으로 하는 분리제에 의해, 직접, 광학 분할하는 것을 특징으로 하는 직접 분할 방법.

(식중, R³~R⁷는, 수소원자, 탄소수 1~8의 알킬기이다.)
제 38 항에 있어서,

다당의 방향족 카르바메이트 유도체가, 아밀로오스트리스(3, 5-디메틸페닐 카르바메이트)인 것을 특징으로 하는 직접 분할 방법.
NF-κB의 활성화를 수반하는 질환을 개선하기 위해서 하기의 일반식(1)으로 나타나는 광학 활성인 화합물 또는 약리학적으로 허용되는 염을 이용하는 것을 특징으로 하는 치료 방법.

(식 중, R¹은 수소원자 또는 C 2~4의 알카노일기이다.)
제 40 항에 있어서,

상기 화합물이 다음 식(2)인 것을 특징으로 하는 치료 방법.
제 40 항 또는 제 41 항에 있어서,

상기 증상이, 종양 세포에 기인하는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
제 42 항에 있어서,

상기 종양 세포의 증식을 저해하는 것에 의해, 상기 질환을 개선하는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
제 40 항에 있어서,

혈관 내피 세포의 세포 접착 활성을 저해하는 것에 의해, 상기 질환을 개선하는 것을 특징으로 하는 치료 방법.
제 40 항에 있어서,

상기 질환이, 면역질환, 알레르기성 질환, 염증성 질환, 종양 전이, 악역질, 동맥 경화, 백혈병으로 이루어진 군에서 선택되는 증상인 것을 특징으로 하는 치료 방법.
NF-κB를 활성화시키는 치료를 행하는 스텝과, 하기의 일반식(1)으로 나타나는 광학활성인 화합물 또는 그 약리학적으로 허용되는 염을 유효성분으로서 함유하는 의약 조성물을 투여하는 스텝을 포함하는 것을 특징으로 하는 치료 방법.

(식 중, R¹은 수소원자 또는 C 2~4의 알카노일기이다.)
제 46 항에 있어서,

상기 화합물이 다음 식(2)인 것을 특징으로 하는 치료 방법.
제 46 항 또는 제 47 항에 있어서,

상기 NF-κB를 활성화시키는 치료가, 항종양제의 투여인 것을 특징으로 하는 치료 방법.
제 46 항 또는 제 47 항에 있어서,

상기 NF-κB를 활성화시키는 치료가, 종양 세포에 대한 방사선 조사에 의한 치료인 것을 특징으로 하는 치료 방법.
TNF-α에 의해서 야기되는 질환을 개선하기 위해서 하기의 일반식(1)으로 나타나는 광학활성인 화합물 또는 그 약리학적으로 허용되는 염을 이용하는 것을 특징으로 하는 치료 방법.

(식 중, R¹은 수소원자 또는 C 2~4의 알카노일기다.)
제 50 항에 있어서,

상기 화합물이 다음 식(2)인 것을 특징으로 하는 치료 방법.
제 50 항 또는 제 51 항에 있어서,

상기 TNF-α에 의해서 야기되는 질환이, 인슐린 저항성을 수반하는 질환인 것을 특징으로 하는 치료 방법.
제 50 항 또는 제 51 항에 있어서,

상기 TNF-α에 의해서 야기되는 질환이, 당뇨병에 기인하는 질환인 것을 특징으로 하는 치료 방법.
제 50 항 또는 제 51 항에 있어서,

상기 TNF-α에 의해서 야기되는 질환이, 근디스트로피인 것을 특징으로 하는 치료 방법.