CN115463137B - 一种新型pd-1/pd-l1小分子抑制剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种新型PD‑1/PD‑L1小分子抑制剂及其应用，具体应用在制备治疗免疫调节相关疾病药物、抗肿瘤药物、抗感染药物中，本发明所述化合物化合物对PD‑1/PD‑L1具有显著的抑制活性，且本发明优选化合物对PD‑1/PD‑L1的抑制率达70％以上；解决了现有PD‑1/PD‑L1单克隆抗体半衰期长、口服生物利用度低、价格昂贵等缺点，具有良好的临床应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种新型PD-1/PD-L1小分子抑制剂及其应用。
背景技术
免疫系统在抵御重大疾病过程中往往发挥着重要作用，例如癌症。然而，癌细胞往往会通过多种机制逃避机体的免疫抑制，相比于传统的肿瘤疗法，免疫疗法因具有避免副作用等优势从而提供更持久的疗效，并已由最初的非特异性免疫治疗逐渐向特异性的免疫靶向治疗方向转化。其中一个机理是改变协同刺激和协同抑制的分子在免疫细胞上的表达，阻断抑制性免疫检查点(如PD-1)的信号通路已被证明是一种有效的治疗方式。
程序性死亡受体-1(programmed death-1，PD-1)是一种50-55KD的I型跨膜蛋白，属于CD28超家族成员，主要分布在T细胞、B细胞和NK细胞等免疫相关细胞中，研究发现，以PD-1为靶点的免疫调节对抗自身免疫性疾病、抗肿瘤、抗感染及器官移植存活或变态反应等均具有重要的意义。其配体PD-L1也可作为靶点，相应的抑制剂也可以起到相同的作用。
在正常情况下，PD-1/PD-L1信号通路可以诱导和维持外周组织的免疫耐受，对防止组织的过度炎症反应以及自身免疫性疾病的发生具有积极作用；而异常的情况下，此信号通路在抗病毒或者抗肿瘤时也发挥着重要的调节作用。如，当T细胞表面的PD-1与肿瘤细胞或肿瘤相关巨噬细胞表面的PD-L1相互作用时，这种相互作用会引起一系列信号传导应答，从而导致T淋巴细胞增殖和相关细胞因子的分泌受到抑制，肿瘤抗原特异性T细胞的凋亡和/或无法免疫，最终抑制免疫应答并促进肿瘤细胞的逃逸。PD-1或PD-L1的抑制剂药物可通过阻断PD-1/PD-L1的相互作用来破坏肿瘤的免疫耐受性，恢复肿瘤特异性T细胞对肿瘤细胞的杀伤功能，并实现肿瘤清除。
现有PD-1/PD-L1抑制剂药物表现出半衰期长、口服生物利用度低、价格昂贵等缺点。此外，PD1/PD-L1抗体在实体瘤患者客观缓解率(ORR)较低，且存在免疫原性强、副作用大等问题。因此，寻找非单克隆抗体，发展新型的PD-1/PD-L1抑制剂，包括小分子、环肽、肽和大环化合物是很有必要的。
相对于抗体药物，小分子抑制剂具有可控的药动学行为，并且费用相对较低，更好地弥补大分子药物在临床上的缺陷。
申请号为CN202210336542.0的中国专利中公开了一种小分子抑制剂ML385在抑制肿瘤细胞PD-L1方面的应用。所述ML385抑制剂抑制肿瘤细胞中PD-L1的功能，激活T细胞的抗肿瘤免疫功能。所述ML385抑制剂通过抑制NRF2和MAF的结合，破坏NRF2识别PD-L1 L2-SE的核心位点，从而抑制PD-L1和PD-L2的表达。通过实验验证了在乳腺癌细胞SUM159和MDA-MB-231中，小分子抑制剂ML385明显抑制了PD-L1的表达。但其应用范围较窄。
申请号为CN202011128388.5的中国专利中公开了一种靶向PD-1/PD-L1相互作用的抗肿瘤小分子抑制剂及其应用。所述的小分子抑制剂，N-[2-(aminocarbonyl)phenyl][1,1'-biphenyl]-4-carboxamide，可以通过抑制PD-1/PD-L1相互作用，重新激活T细胞的免疫应答，进而高效靶向杀伤肿瘤细胞。该小分子抑制剂可以作为新的抗肿瘤药物。但其对INF-γ的表达恢复作用较弱。
因此，发展新型的PD-1/PD-L1小分子抑制剂具有广阔的应用前景和实际意义。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种新型PD-1/PD-L1小分子抑制剂及其衍生物，可以用于制备治疗与PD-1/PD-L1相关疾病的药物。
一方面，本发明提供了一种化合物在制备PD-1/PD-L1小分子抑制剂中的应用。
结果如如式(I)。
其中：
R1、R1a各自独立地选自-H、-OH、或R1及R1a一起形成＝O；
R2、R2a各自独立地选自-H、-OH、-CH3，或R2及R2a一起形成＝O；
R3、R3a各自独立地选自-H、-OH、 或R3及R3a一起形成＝O；
R4为-H、-OH、
R5为C2-C6羧基、5-6元饱和内酯环或5-6元不饱和内酯环。
在本发明所述的一个优选的实施方案中，所述C3-C7羧基优选
在本发明所述的一个优选的实施方案中，所述5-6元内酯环优选
在本发明中，式(I)所述的新型PD-1/PD-L1小分子抑制剂优选自具有下列任一种取代基组合的化合物：
优选地，所述的化合物选自序号为7、10、12、15、16、21、24、28、46的化合物。
另一方面，本发明提供了一种前述化合物在制备治疗免疫调节相关疾病药物、抗肿瘤药物、抗感染药物中的应用。
进一步地，所述免疫相关疾病是器官特异性自身免疫疾病或系统性自身免疫疾病。
所述器官特异性自身免疫疾病为慢性淋巴细胞性甲状腺炎、甲状腺功能亢进、胰岛素依赖型糖尿病、重症肌无力、溃疡性结肠炎、恶性贫血伴慢性萎缩性胃炎、肺出血肾炎综合征、寻常天疱疮、类天疱疮、原发性胆汁性肝硬化、多发性脑脊髓硬化症、急性特发性多神经炎；
所述系统性自身免疫疾病包括系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、系统性血管炎、硬皮病、天疱疮、皮肌炎、混合性结缔组织病、自身免疫性溶血性贫血、甲状腺自身免疫疾病、溃疡性结肠炎。
进一步地，所述肿瘤包括PD-1阳性或PD-L1阳性肿瘤，包括但不限于黑色素瘤、结肠癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、食管癌、宫颈癌、神经胶质瘤或肝癌等肿瘤。
进一步地，所述感染是慢性或持续性感染，包括但不限于病毒、细菌、真菌或原生动物感染。
进一步地，所述病毒感染是由以下病毒引起的：腺病毒、腺相关病毒、BK病毒、布尼亚病毒、基孔肯雅病毒、柯萨奇病毒、冠状病毒、巨细胞病毒、东方马脑炎病毒、埃博拉病毒、肠病毒、EB病毒、汉坦病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、疱疹病毒、人泡沫病毒、人免疫缺陷病毒、人乳头瘤病毒、人嗜β-淋巴细胞病毒、I型人T细胞白血病病毒、II型人T细胞白血病病毒、流感病毒、JC病毒、JEV、拉沙热病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、马尔堡病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、尼帕病毒、诺如病毒、正呼肠孤病毒、副流感病毒、细小病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒、呼肠孤病毒、呼吸道合胞病毒、鼻病毒、裂谷热病毒、轮状病毒、风疹病毒、天花病毒、圣路易斯脑炎病毒、西尼罗病毒、西方马脑炎病毒或黄热病病毒。
进一步地，所述细菌感染由以下引起：大肠杆菌(Escherichia coli)、艰难梭菌(Clostridium difficile)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella thyphimurium)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、淋病奈瑟氏球菌(Neisseriagonorrhoeae)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、流感嗜血杆菌(Hemophilusinfluenzae)、痢疾志贺菌(Shigella dysenteriae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、肺炎链球菌(Streptococcuspneumonia)或沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)。
进一步地，所述真菌感染由以下引起：假丝酵母属(Candida)、曲霉属(Aspergillus)、隐球菌属(Cryptococcus)、球孢子菌属(Coccidioides)、组织胞浆菌属(Histoplasma)、肺孢子菌属(Pneumocystis)或葡萄穗霉属(Stachybotrys)。
进一步地，所述原生动物感染由以下引起：变形虫界(Amoebozoa)、古虫界(Excavata)、囊泡藻界(Chromalveolata)、内阿米巴属(Entamoeba)、疟原虫属(Plasmodium)、贾第虫属(Giardia)、锥虫属(Trypanosoma)、球虫目(Coccidia)、贝诺孢子虫属(Besnoitia)、双腔吸虫属(Dicrocoelium)或利什曼虫属(Leishmania)。
在本发明中，所述PD-1/PD-L1小分子抑制剂药物可通过现有常规方法合成制得或提取纯化。
所述的药物的剂型可为冻干粉针剂、胶囊、固体分散剂和片剂或它们任意形式的组合。
再一方面，本发明提供了一种PD-1/PD-L1小分子抑制剂组合物，该组合物包括式(I)化合物，或其药学上可接受的盐、对映异构体、非对映异构体、消旋体、溶剂化合物、水合物、多晶型、前药或同位素变体，以及他们的混合物和药学上可接受的赋形剂。
在本发明中，所述PD-1/PD-L1小分子抑制剂药物或其组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、肌肉注射、皮下注射、直肠等。
在本发明中，所述的“PD-1/PD-L1抑制剂”是指可以阻断PD-1与PD-L1的结合，阻断负向调控信号，使T细胞恢复活性，从而增强免疫应答的物质。
在本发明中，所述“药学上可接受的盐”是指本发明化合物的盐，由本发明发现的具有特定取代基的化合物与相对无毒的酸或碱制备。
在本发明中，所述“溶剂化合物”是指一个或多个溶剂分子与本发明化合物的缔合物或复合物。
在本发明中，所述“水合物”是指其中溶剂分子为水的溶剂合物。
在本发明中，所述“多晶型”是指同一化合物在不同物理条件下结晶成两种或多种不同结构的晶体。
在本发明中，所述的化合物结构可具有一个或多个不对称中心，因此，该化合物可作为光学纯的旋光异构体，也可作为它们的混合物(所述的混合物中，各旋光异构体的占比可相同或不同)。例如，当化合物仅具有一个不对称中心时，该化合物可作为光学纯的R或S旋光异构体生产，也可作为它们的混合物(例如外消旋体)生产；如无特别说明，在说明书和权利要求书中对具体化合物的描述或命名意在同时包括光学纯的旋光异构体以及它们的混合物；互为实体和镜像又不能重合的旋光异构体分子互称为对映体；不成镜像关系的旋光异构体互称为非对映体。
在本发明所示的结构中，在未表明任何特定的手性原子的立体化学时，则任意的旋光异构体以及它们的混合物都可作为本发明的化合物；在由实心楔形或虚线表示特定构型来说明所有的手性原子的立体化学时，则仅指向该旋光异构体。
在本发明中，任意两原子间的化学键是指两原子中不对称碳原子的构型任意，可为R构型碳原子、S构型碳原子或它们的混合碳原子(若该混合碳原子中，R构型碳原子和S构型碳原子各占50％，则该混合碳原子表观无手性)。
在本发明中，所述的化合物还存在前药形式或同位素变体形式。
本发明所述的“前药”指前体药物，本领域也称作前体药物、药物前体、前驱药物等，是指药物经过化学结构修饰后得到的在体外无活性或活性较小、在体内经酶或非酶的转化释放出活性药物而发挥药效的化合物。
本发明中，所述的同位素变体是指部分原子由同位素替代后的结构。
本发明的有益效果：
(1)本发明所述化合物对PD-1/PD-L1具有显著的抑制活性，且本发明优选化合物对PD-1/PD-L1的抑制率达70％以上；
(2)本发明提供了一种新型PD-1/PD-L1小分子抑制剂，解决了现有PD-1/PD-L1单克隆抗体半衰期长、口服生物利用度低、价格昂贵等缺点。
附图说明
图1为本发明实施例1中化合物1至9结构。
图2为本发明实施例1中化合物10至17结构。
图3为本发明实施例1中化合物18至26结构。
图4为本发明实施例1中化合物27至30结构。
图5为本发明实施例1中化合物31至34结构。
图6为本发明实施例1中化合物35至39结构。
图7为本发明实施例1中化合物40至42结构。
图8为本发明实施例1中化合物43至44结构。
图9为本发明实施例1中化合物45至47结构。
图10为各化合物体外阻断PD-L1抑制T细胞分泌IFN-γ表达水平。
图11为各化合物能够抑制病毒感染。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
采用HTRF(Homogenegous time resolved fluorescence)法对表1中的31个化合物进行体外抑制PD-1/PD-L1结合活性试验，本发明所述化合物对PD-1/PD-L1结合表现出了显著的抑制活性，部分化合物的抑制率大于80％，可以作为PD-1/PD-L1小分子抑制剂，可用于制备新型PD-1/PD-L1小分子抑制剂药物，以治疗PD-1/PD-L1介导的相关疾病，包括肿瘤、炎症性疾病、自身免疫疾病、细菌感染、病毒感染、真菌感染。
表1实施例所用化合物基本信息
实施例1
1.1仪器和试剂
PD-1/PD-L1 binding assay kits(法国Cisbio公司)；96孔浅口板(法国Cisbio公司)；酶标仪(Molecular Devices:M5)；阳性对照药BMS-1(HY-19991)购自于MedChemExpress公司；化合物均购自成都普思生物科技股份有限公司，详细信息如表1，化合物结构如图1-9。
1.2实验方法
待测样品溶液配制：分别准确称量2mg表1中化合物于2mL EP管中，加入1mL DMSO，充分溶解。
体外活性试验：取96孔浅口板，每孔加入2μL含待测样品溶液(每个待测样品设置两个复孔)、4μL Tag1-PD-L1蛋白和4μL Tag2-PD-1蛋白，室温孵育15min后，再加入5μLanti-Tag1-Eu3+与5μL anti-TAG2-XL665，室温孵育12h，用Molecular Devices M5多功能型酶标仪检测荧光信号，(665nm/620nm)*104为原始数据；阳性对照品为蛋白PD-1/PD-L1；阴性对照品为PD-L1。
抑制率计算公式：
抑制率％＝[(阳性对照孔-药物孔)/(阳性对照孔-阴性对照孔)]×100％。
1.3实验结果
通过HTRF法测定各待测样品(浓度为50μM)体外抑制PD-1/PD-L1结合活性，各待测样品表现出不同程度的抑制活性(见表2)，结果表明，化合物7、10、12、15、16、21、24、28及46对PD-1/PD-L1结合具有显著的抑制活性，故为制备PD-1/PD-L1小分子抑制剂提供了重要的参考价值。
表2各化合物抑制PD-1/PD-L1结合活性
实施例2
2.1仪器和试剂
PD-1/PD-L1 binding assay kits(法国Cisbio公司)；96孔浅口板(法国Cisbio公司)；酶标仪(Molecular Devices:M5)；阳性对照药BMS-1(HY-19991)购自于购自于MedChemExpress公司；化合物均购自成都普思生物科技股份有限公司，详细信息如表1，化合物结构如图1-9。
2.2实验方法
待测样品溶液配制：分别准确称量2mg表1中化合物7、10、12、15、16、21、24、28和46于2mL EP管中，加入1mL DMSO，充分溶解。
体外活性试验：取96孔浅口板，每孔加入2μL不同浓度待测样品溶液，浓度分别设为12.5、25、50、100及200μg/mL(每个待测样品设置两个复孔)、4μL Tag1-PD-L1蛋白和4μLTag2-PD-1蛋白，室温孵育15min后，再加入5μLanti-Tag1-Eu3+与5μL anti-TAG2-XL665，室温孵育12h，用Molecular Devices M5多功能型酶标仪检测荧光信号，(665nm/620nm)*104为原始数据；阳性对照品为蛋白PD-1/PD-L1；阴性对照品为PD-L1。
抑制率计算公式：
抑制率％＝[(阳性对照孔-药物孔)/(阳性对照孔-阴性对照孔)]×100％。
2.3实验结果
通过HTRF法测定不同浓度各待测样品体外抑制PD-1/PD-L1结合活性及IC50，各待测样品表现出不同程度的抑制活性(见表3)，结果表明，化合物7、10、12、15、16、21、24、28和46对PD-1/PD-L1结合具有显著的抑制活性，为制备PD-1/PD-L1小分子抑制剂提供了重要的参考价值。
表3各化合物抑制PD-1/PD-L1结合活性
实施例3各药物阻断PD-L1抑制T细胞分泌IFN-γ表达作用的实验
3.1仪器和试剂
IFN-r Elisa assay kits(法国Cisbio公司)；96孔板(NEST公司)；酶标仪(Molecular Devices:M5)；阳性对照药BMS-1(HY-19991)购自于购自于MedChemExpress公司；化合物均购自成都普思生物科技股份有限公司，详细信息如表1，化合物结构如图1-9。
3.2实验方法
待测样品溶液配制：分别准确称量2mg表1中化合物7、10、12、15、16、21、24、28及46于2mL EP管中，加入1mL DMSO，充分溶解。
实验过程：最近的科学研究表明，通过阻断PD-1/PD-L1相互作用可促进T细胞增殖和干扰素IFN-γ分泌。因此，我们建立一种肿瘤细胞/T细胞共培养模型评估化合物对IFN-γ分泌的影响。用EDTA抗凝管盛放全血，密度梯度离心法分离PBMC。并从PBMC中进一步分离得到CD3+T细胞，用RPMI-1640完全培养基重悬细胞调整浓度5×105/mL，通过从人外周血单个核细胞(PBMCs)中分离提取CD3+T细胞与稳定表达OS-8(抗CD3单链可变因子)以及人PD-L1的Hep3B细胞共培养，然后分别添加化合物7、10、12、15、16、21、24、28和46。在药物刺激72h后通过ELISA检测IFN-γ水平。
3.3实验结果
通过ELISA法测定不同浓度各待测样品体外阻断PD-L1抑制T细胞分泌IFN-γ表达水平(见图10)，结果表明，各化合物以剂量依赖的方式显著提高IFN-γ的产生。
实施例4各药物抑制病毒感染实验
4.1仪器和试剂
水炮口炎病毒购自ATCC；96孔板(NEST公司)；化合物均购自成都普思生物科技股份有限公司，详细信息如表1，化合物结构如图1-9。
4.2实验方法
待测样品溶液配制：分别准确称量2mg表1中化合物7、10、12、15、16、21、24、28于2mL EP管中，加入1mL DMSO，充分溶解。
实验过程：小鼠原代腹腔巨噬细胞分离之后培养于含10％胎牛血清高糖DMEM培养基中。然后分别添加化合物7、10、12、15、16、21、24、28和46及水泡口炎病毒刺激，病毒感染8h后，提取RNA并进行逆转录，采用实时荧光定量PCR法测定水泡口炎病毒复制本的水平。
4.3实验结果
通过采用不同化合物对野生型小鼠原代腹腔巨噬细胞进行药理学处理发现(见图11)，各化合物均能显著抑制病毒感染。
实施例5药物冻干粉针剂的制备
取药物固体粉末10g，加入50g甘露醇和40g L-精氨酸作为赋形剂，用2000g注射用水溶解，加入4g活性炭除热源，0.45微米过滤，滤液分装共制800份，-50℃预冷10小时，抽真空，最后升温至室温干燥，保持5小时，即得药物冻干粉针剂。
实施例6药物固体分散剂的制备
取药物固体粉末5g，泊洛沙姆30g，乳糖50g，于粉碎机中粉碎后置于蒸发皿中水浴80℃熔融，转移至冰水浴冷冻固化，粉碎过80目筛，干燥后即得药物固体分散剂。
实施例7药物胶囊的制备
取药物固体粉末100g，采用胶囊机将其灌装进硬胶囊中，封口，打光即得。
实施例8药物片剂的制备
取药物固体粉末20g，研细，过80目筛，与淀粉等量递加混合均匀，向混合细粉中加入适量淀粉浆制软材(少量分次加入，软材以“握之成团，清压即散”为宜)，将软材挤压过16目尼龙筛制湿颗粒，40-60℃干燥约半小时，过16目筛整粒，最后加入滑石粉，混匀压片即得。
Claims (1)
1.一种化合物在制备抗肝癌或抗水泡口炎病毒感染的药物中的应用，其特征在于，所述化合物结构选自：
。
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