KR20050036955A - 친환경 농업용 보충제 - Google Patents

Abstract

식물 생장 조정제를 포함하는 실질적으로 무병원균성인 조성물을 적절한 조건하에 고탄수화물 배지에서 생산한다. 배양 여액을 살균하고 제제화하여 식물 생장을 증진시키는데 사용한다.

Description

친환경 농업용 보충제{ENVIRONMENTALLY SAFE AGRICULTURAL SUPPLEMENT}

관련 출원 상호 참조

이 출원은 35 U.S.A 19(e)에 의해 2002년 7월 16일자로 출원된 미국 임시 출원 제60/396,833호의 이익을 주장하며, 그 기재 내용을 본 명세서에 참조로 포함한다.

본 발명은 식용 및 관상용 작물의 생장과 품질을 증진시키는 제제(formulation)에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 고당도 배지, 좋게는 농업 폐기물의 퇴비화에서 유도된 살균 여액(sterilized filtrate)에 관한 것이다.

영양 보충제로 비료를 사용하고, 감염의 부정적 효과를 없애기 위하여 살충제를 사용하며, 옥신류 및 지베렐린산류 등의 생장 호르몬을 보충하는 등 많은 방책들이 식용작물의 생산성을 높이기 위하여 사용되어져 왔다. 이러한 각 접근법은 특히 합성 물질을 사용하여 행하는 때에는 허용할 수 없는 환경의 변질과 이에 부수하는 생태계의 불균형에 관련되는 문제들을 발생시킨다.

식물 생장 조정제(plant growth regulators)는 일부 진균류에 의해 생성된다고 알려져있다. 예컨데, 브리주엘라(Brizuela, M. A.) 등이 문헌[Revista Ibero Americana de Mycologgia(1998) 15: 69-74]에 보고한 바와 같이, 지베렐린류, 인돌-아세트산(indole-acetic acid), 시토키닌류(cytokinins) 및 기타 식물 생장을 조정하는데 유용한 화합물들이 담자균류(Basidiomycetes)에서 발견되었다. 식물 생장 조정제인 디하이드로암풀리신(dihydroampullicin)은 진균류인 암풀리페리나(Ampulliferina)에서 생산되며[Kimura, Y., et al., BioscienceBiotech. & Biochenz. (1993) 57: 687-688], 뉴로스포라(Neurospora)와 다양한 식무병원성 진균(phytopathogenic fungi)이 식물 생장 조정제를 생산한다는 사실은 널리 알려져 있다. 또한 백색부후 차가버섯(white rot polypore)인 폴리포러스 버시칼라(Polyporus versicolor)가 식물 생장 조정제를 생산한다는 것이 널리 알려져 있다. 그러나 식물 생장 인자의 생산을 증진시키는 배양 조건은 매우 다양하다.

담자균류는 지베렐린류, 옥신류, 인돌아세트산, 앱시스산(abscisic acid), 시토키닌류 및 에틸렌은 물론 기타 식물 자극 대사체들을 생산하는 것으로 알려져 왔다. 그러나 이러한 인자들의 생산은 식물 그 자체와 관련한 생산 또는 소규모 실험실에 기초한 상황에서 알려져 왔다.

본 발명은 진균류, 특히 담자균류로부터 식물 생장 인자를 상업적 규모로 제공하는 방법을 제공한다. 이러한 일은 일반적으로 가능하지 않은 것으로 여겨져 왔다. 예를 들어, 문헌["Handbook of Applied Mycology," Vol. 4, Fungal Biotechnology (1992) 588쪽]에는

「타프리나(Taphrina) 및 엑소바시디움(Exobasidium)종(種)이 숙주 식물의 기생 조직의 표면층 내에 효모 유사 세포와 포자를 만들었다는 것을 알게 된 것은 흥미로운 일이다. 합성 배지에서 액침발효법(submerged fermentation process: SMF)으로 생장할 때, 이 진균류에 의한 시토기닌(CK) 생산은 너무 적어서 효모 유사 세포의 형태로 SMF 배지에서 생장함에도 불구하고 숙주 식물에서는 자연적으로 일어나는 광범위한 형태 변화를 일으킬 수 없었다. 그렇기 때문에, 숙주 조직에서 생장한 타프리나의 병원성 균사(pathogenic hyphal) 세포에 의한 CK의 생산은 확실히 양적으로 상이함이 강조되었다. 고상 발효 기술(solid state fermentation technique)에 따른 진균류의 생장이 숙주 조직에서의 상기 유형의 진균류 생장과 매우 닮았다는 것은 잘 알려져 있다.」라고 기재되어 있다.

또한 이 문헌에는,

「절대 기생균류(obligate parasitic fungi), 균근균류(mycorrhizal fungi), 자낭균류(ascomycetous fungi) 및 담자균류(basidiomyceteous fungi)는 배양에서의 문제점들과 느린 생장 속도로 인하여 CK(시토키닌)를 배양 생산할 잠재력이 없다는 것이 분명하다.

분리 정제 공정(downstream processing)이 매우 소량의 GA3(지베렐린산 3)을 분리하기 위해 대규모의 액체를 취급하는 공정 포함하기 때문에 시트르산이나 글루콘산과 같은 다른 발효 산물에 비하여 비용 집약적이다.

여과법 또는 원심분리법으로 균사세포(mycelial cells)를 분리한 후, GA3를 적당한 수지/흡착제에 흡수시키거나 적당한 용매로 추출한다. 추가적인 정제는 반복되는 액체-액체 분획, 진공 하에서의 농축 및 GA3의 무정형의 분말 또는 결정을 얻기 위한 최종 공정과 같은 일련의 작업을 수반한다.」라는 내용이 기재되어 있다.

따라서 비록 어떤 식물 기생진균류가 식물 생장 조정제를 생산할 수 있을 지라도, 그 진균류는 배양, 추출 및 농축 공정이 행해지지 않으면 발효 시스템에서 실질적으로 이용할 수 있는 정도의 양으로 식물 생장 조정제를 생산할 수 없을 것이다.

이제는 진균성 균사괴(fungal spawn)의 존재 하에 농업 페기물을 퇴비화시키고 그 배양 여액을 살균시켜 생성된 액상 퇴비 인자 (liquid compost factor: LCF)를 물로 1:500 내지 1:10,000까지 희석시킨 후 직접 밭작물에 사용함으로써 친환경적인 생장 자극제를 공급할 수 있다는 것을 알게 되었다. 여기서는 사용가능한 용액을 얻기 위해 추출이나 화학적 분리 공정을 실시해야할 필요가 없다. 단지 가열 및 여과 공정만이 요구된다. 추출이나 농축을 위한 용매나 수지 베드가 필요치 않다. 게다가 가열된 액체 배양액의 여과 공정에서 고체와 필터 물질 자체를 건조하여 식물 생장 자극제의 공급원으로 사용할 수 있다. 건조된 물질은 첨가제로서 퇴비에 첨가될 수 있다.

본 발명은 빠른 뿌리 생장과 식물 체적 생장을 자극하고, 밭작물, 나무 및 기타 식물의 생산성을 증진시키는 조성물에 관한 것으로, 상기 조성물은 고유효(high available) 탄수화물 농도를 갖는 배지, 좋게는 농업 폐기물에서 생장한 진균성 균사괴의 저온 살균 배양 여액을 포함한다. 생성된 액상 퇴비 인자(LCF)는 많은 작물의 생장속도와 수확량을 증가시키는데 다양한 방식으로 사용될 수 있다.

따라서 한 측면에서, 본 발명은 식물 보충제를 제조하는 방법에 관한 것으로 상기 방법은 광(光)의 존재 하에서 균개(mycelial mat)를 교란하지 않는 조건에서 통기(aeration)하면서 최소 10% 유효 탄수화물 농도를 갖는 배지에서 진균성 균사괴를 배양하고, 배양균을 수확하고, 단백질을 변성시키고, 고체를 제거하고, 여액을 저온 살균 또는 다른 방식으로 살균시켜 상기 조성물을 얻는 단계를 포함한다. 다른 측면에서, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조되는 조성물에 관한 것이다. 따라서 본 발명의 조성물은, 좋게는 농업 폐기물을 포함하는, 탄수화물 고함량 배지에서 생장한 진균성 균사 배양물의 살균 배양 여액을 포함한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 이 조성물을 단독으로 사용하거나 또는 다른 생장 촉진제와 함께 사용하여 식물의 생장 및 생산성을 증진시키는 방법에 관한 것이다. 따라서 본 발명은 본 발명의 조성물을 단독으로 사용하거나, 예컨대 제초제(herbicides), 살충제(insecticides), 살선충제(nematicides) 또는 기타 생장 자극제나 영양소와 함께 사용하여 식물을 배양하는 방법에 관한 것이다.

발명의 실시 형태

본 발명은 "액상 퇴비 인자(Liquid Compost Factor: LCF)"라고 일컬어지는 친환경적 식물 생장 자극 조성물에 관한 것이다. LCF는 고농도 탄수화물 배지에서 특정한 조건하에 생장한 진균성 균사괴 배양물의 살균 배양 여액이다. 본 발명의 조성물은 진균성 균사괴로부터의 살균 여액은 물론 그의 건조 형태 및 여과로 부터 회수된 고체의 건조 형태를 함유한다. 일반적으로, 이 조성물들은 어느 것이나 수용액으로 희석된다. 상기 생성된 희석 LCF는, 옥수수, 타로토란, 양상추, 콩, 오이, 토마토, 파인애플 및 기타 식용작물 등의 밭작물에 사용될 때, 뿌리 생장을 자극하고 과실 생산성을 증진시키며 작물 수확량을 향상시킬 수 있다.

LCF는 기존 작물에 선충 감염 증상을 경감시킨다고 알려져 왔으며 균성 잎점무늬병(fungal leaf spots), 잎썩음병(leaf rot) 및 세균성 구근부패병(bacterial bulb rot)의 감소와 같이 질환 감소에 도움을 준다.

LCF는 또한 관상식물에 사용될 수 있고 개화를 증진시킬 수 있다. LCF는 잔디의 녹화를 증진시키는데 효과적이다. LCF는 또한 절화(cut flowers)와 잎 장식(foliage)의 수명을 연장시키는데 사용될 수 있다. LCF는 또한 나무 생장을 증진시키기 때문에, 예컨대 재식림 달성을 보조하는데 유용하다.

본 발명의 LCF는 식물 방어 기작의 유도인자(elicitor)는 물론 균성 배양균의 2차 대사체인 식물 생장 조정제를 함유한다. 이 식물 생장 조정제의 생산은 적당한 배양 조건, 적당한 배지 조성 및 적당한 배양후 처리에 의해 영향을 받는다. 배지는, 식물 생장 조정제의 대사 생산을 위한 적합한 전구체를 사용하여 식물 성장 조정제를 생산하기 위해, 충분한 유효 탄수화물과 충분한 칼륨이온을 함유해야 한다. 비록 바나나, 감자, 프룬(prunes), 오렌지, 토마토, 아티초크(artichokes), 호박(squash), 포도, 해바라기, 시금치, 시드 또는 아몬드 등의 다른 재료가 또한 사용될 수 있지만, 당밀(Molasses)은 약 2% - 6%의 칼륨이온을 함유하고 있어서, 선호되는 환경적으로 만족스러운 재료이다. K⁺의 최종 농도는 .005% - 0.1% wt/vol, 바람직하게는 0.01% - 0.1% wt/vol 여야 한다.

일반적으로, 유효 탄수화물 함량이 높으면 높을 수록, 식물 생장 조정제의 생산은 보다 효과적이다. 그러나 탄수화물의 농도가 당의 형태로 너무 높으면, 삼투압이 너무 증가하여 진균의 생장이 지연되거나 저해된다. 최종 산물에서 식물 생장 조정제의 생산을 증진시키는 다른 인자들로는 균개가 교란되지 않게 남겨지는 상태의 통기 조건 및 가시 스펙트럼의 장파장 영역이 우세한 광의 존재 하에서의 생장을 들 수 있다. 배양에 적당한 조명 조건들로는 미국 특허 제5,123,203호에 기재된 것들이 바람직하며 그 내용은 본 명세서에 참조로 포함되었다. 자실기질(fruiting substrates)에 카로테노이드 색소를 첨가하고 Ca⁺²를 감소시킴에 의하여 적색광원이 바람직한 것으로 나타났다. 그러므로 노란색을 생산하기에 충분한 배지에 카로틴을 첨가함으로써 또한 식물 생장 조정제(PRG) 생산이 증진된다. 파인애플 과즙이 탄수화물 공급원으로 사용되면, 충분한 카로틴이 본질적으로 존재한다.

배양 배지는 5-10% 당밀의 함량에 해당하는 유효 당도를 함유할 것이다. 농업 폐기물이 배지를 구성하는데 사용될 수 있지만, 적당한 탄수화물의 모든 공급원 및 카로틴을 함유하는 기타 필요 영양소가 사용될 수 있다. 일부 영양소는 곡물(grains)과 다른 영양소의 존재하에 진균류를 배양함으로써 제조되는 진균성 균사괴 자체에 의해 공급될 수 있다. 그러므로 배지의 필요 당도는 다양한 과일, 옥수수 시럽, 사탕수수 시럽, 사탕무우 시럽, 당밀 등의 어떠한 공급원으로부터 제조된 시럽에 의해서도 공급될 수 있다. 또한 파인애플, 오렌지, 플럼(plum), 포도, 파파야 등의 다른 과일로부터 제조된 시럽이 사용될 수 있다. 배지에서 영양소의 공급원으로서 식물 추출물을 사용하는 것이 좋다.

배지는 진균류 배양에 일반적인 유효 탄수화물 함량 보다 높은 유효 탄수화물 함량을 가져야 한다.“유효 탄수화물”이란 진균 배양에 의해 대사시킬 수 있는 탄수화물 에너지 공급원을 의미한다. 이러한 유효 탄수화물의 일반적인 조성은 수크로스, 글루코스, 기타 단당류와 이당류를 포함한다. 일반적으로, 배지는 최소 10% wt/vol, 좋게는 12% wt/vol, 더욱 좋게는 13% wt/vol, 훨씬 더 좋게는 15% wt/vol의 유효 탄수화물을 함유한다. 대안으로, 배지에서 최종 농도는 최소 10, 더 좋게는 최소 12, 가장 좋게는 최소 15의 BRIC 계수가 된다. 유효 탄수화물의 고농도는 매우 바람직하며, 상술한 것처럼, 단지 허용될 수 없는 삼투압 상태를 일으키는 것을 피하기 위한 필요성으로 인해 제한된다. 진균류는 셀룰로오스를 소화시킬 수 있기 때문에, 셀룰로오스 형태로 탄수화물 수준을 증진시키거나 삼투압을 높이지 않는 다른 탄수화물을 사용하는 것은 바람직하다.

배양 배지에 최적 BRIC 값은 12-15의 범위인 것으로 여겨진다. 통상적인 배양에서, BRIC 값이 19보다 높을 때, 예컨대 24나 30에서는 매우 느리게 생장하거나 전혀 생장하지 않았다. BRIC 19에서 균사는 단지 얇은 층으로 배지의 표면을 덮었으며, BRIC 11과 8에서는 매우 우수한 생장이 일어났다. 그러나, BRIC 11 아래에서는 PGR 함량이 더 적은 것 같았다.

탄소 공급원으로서 유효 탄수화물에 더하여, 배지는 또한 다른 영양소, 특히 질소 공급원 및 다양한 보조 인자를 함유해야 한다. 일반적으로, 접종원으로 사용되는 진균성 균사괴에 대부분의 이들 영양소의 충분한 공급원이 있다. 그러나 배지가 눈에 보일 정도의 노란색을 제공하기에 충분한 카로틴 농도를 포함하는 것이 중요한 것으로 여겨진다.

당밀이 적어도 일부 유효 탄수화물 공급원으로 사용된다면, 당밀 그 자체가 많은 비타민과 진균류에 필요한 기타 영양소를 공급한다. 사탕수수로부터 제조된 시럽은 더 좋은 영양소 공급원을 제공하기 때문에 사탕무우로부터 제조된 시럽보다 바람직하다. 요구되는 영양소의 다른 공급원으로는 칼륨이온의 공급을 위한 바나나의 사용을 들 수 있으며 파파야는 또한 배지에 유용한 첨가제이다. 파파야는 카로티노이드, 당 및 황 화합물을 함유하고 있다. 그것은 특히 과당을 많이 함유하고 있다.

우선 배지를 오염 유기물을 제거하기에 충분한 시간동안 되도록이면 충분한 온도까지 가열하여 살균시킨다. 그 다음 정화된 배지에 진균류 배양물 즉, 진균성 균사괴를 접종한다.

본 명세서 내에 기술된 배양 기술에 적합하다면 어떤 진균류라도 본 발명에 사용할 수 있다. 다수의 진균류가 식물 생장 조정제를 생산할 수 있는 것으로 기술되어져 왔지만, 통상적으로 이는 식물 생장 조정제의 상업적 또는 실용적 생산 수단으로서의 실례는 아니었다.

본 발명의 LCF 조성물을 얻는데 사용가능한 진균류의 배양은 시판되는 장치를 사용하여 효과적인 방식으로 수행될 수 있다. 스테인리스 스틸 드럼이 유용하지만, 이는 비싸고 특히 스테인리스 스틸이 부식을 견디도록 고안되지 않는다면 발효 시에 부식이 일어날 수 있다. 그렇기 때문에 유리나 플라스틱 용기가 바람직하다. 진균류를 마개에 꼭 맞는 면전(cotton plug)을 갖는 55 갤런 반투명 플라스틱 드럼에서 배양하는 것이 특히 편리하다고 알려져 있다. 상기 드럼이나 다른 용기의 내부는 우선 사용 전에 예컨대 묽은 요오드 용액으로 오염을 제거한다.

본 발명에 유용한 바람직한 진균류는 자연에서 식물과 공존하고 식물에 의존하여 생장하는 진균류의 강(綱)인 담자균류이다. 담자균류는 다공성이거나 주름성일 수 있으며 본 발명의 방법으로 배양되는 바람직한 균사괴 공급원은 다공성 진균류 특히 구멍장이버섯과(Polyporaceae)의 진균류이다. 구멍장이버섯과는 일반적으로 갈색 부후균(brown rot fungi)속(屬) 또는 백색 부후균(white rot fungi)속을 구성하는 것으로 분류될 수 있다. 갈색 부후균은 그들이 생장하는 나무에서 백색 셀룰로오스를 퇴화시켜서 뒤에 갈색 리그닌(lignine)을 남긴다. 백색 부후균은 반대 작용을 한다. 즉 그들은 리그닌을 퇴화시키고 뒤에 백색 셀룰로오스를 남긴다. 따라서 본 발명의 방법에서 사용하기에 바람직한 진균류는 갈색 부후 차아버섯(brown rot Polyporus) 진균류이며 특히 흰살버섯속(Bridgeoporus), 세리포리아(Ceriporia), 미로버섯속(Daedalea), 덕다리버섯속(Laetiporus), 손등버섯속(Oligoporus) 및 피에노포렐러스속(Pyenoporellus)에 속하는 것들이다.

따라서 본 발명에서는 요구되는 특정한 배양 조건에서 다양한 담자균류 구성원을 사용할 수 있으나, 구멍장이 버섯과에 속하는 것이 바람직하며 갈색 부후형이 특히 바람직하다.

본 발명에서 사용하기에 특히 바람직한 진균류는 덕다리버섯, 특히 붉은덕다리버섯(Laetiporus sulphureus)이다. “설퍼 셀프(Sulphur shelf)” 또는 “치킨 오브 더 우즈(Chicken of the Woods)”로 불려지는 붉은 덕다리버섯은 활렵수의 상처 기생균이다. 그것은 보통 하와이에 유칼립투스 로브스터(Eucalyptus robusta) 에서 발견된다. 이러한 진균류는 나무의 심재에서 살기 때문에 나무의 바깥쪽에서는 눈에 띄지 않는다. 자실체(fruiting body)나 버섯은 몇 해마다 나타나는 유황 또는 오렌지 색 말굽버섯(bracket mushroom)처럼 나타난다. 상기 진균류는 심재를 주로 먹고 살며 셀룰로오스와 헤미셀룰로오스가 효소작용에 의해 분해된 후 리그닌이 남겨지기 때문에 내부적으로 입방갈색썩음병(cubical brown rot)을 일으킨다. 감염 개시 후 많은 해가 지난 후 나무가 괴사한다. 공개된 문헌에서는 숙주 나무의 생장을 조절하는 이 진균류의 능력을 다룬 바가 없으며 또한 어떤 식물 자극 물질을 이 균류와 관련시킨 바도 없다. 본 발명의 제어된 진균 액상 배양 생장(controlled fungal liquid culture growth)에서, 이 식물 생장 조정제들은 대량으로 생산되며 보통의 숙주 범위를 넘는 식물에서 식물 생장에 영향을 미치는 것으로 증명되었다. 본 명세서에서 기술된 바와 같이, 식물 자극 물질을 이용하기 위해서는, 액을 가열하여 조직 분해 효소를 제거한다. 자극 물질은 100℃에서 열적으로 안정하다.

붉은 덕다리버섯(L. sulphureus)의 진균 액상 배양은 옥수수, 콩, 레터스, 곡물 및 그래스(grasses)의 종자 발아(seed germination)를 촉진하는 것으로 나타났다. 엽면살포(foliar spray)는 파인애플, 커피, 토마토, 타로, 사탕수수 및 기타 작물에 영향을 미치는 것으로 나타났다. 보통 이 진균은 바이오메스(biomass) 수톤 무게인 100피트 크기의 유칼립투스 나무의 생장에 영향을 미친다. 적절히 희석하면 식물 자극 효과는 더 작은 식물에서도 효과적이다. 액상 배양액은 예컨대 물로 1:3,000으로 희석될 수 있으며 이때도 여전히 효력이 유지된다. 실제 덕다리버섯속 진균류는 큰 둘레와 근계를 갖는 숙주나무를 자극하기 위하여 다양한 식물 생장 조정제 생산 균형을 유지한다. 이 균형은 더 작은 식물과 나무에도 효과적으로 적용된다.

따라서 진균성 균사괴는 좋게는 담자균류, 보다 좋게는 갈색 부후 담자균류 그리고 보다 더 좋게는 덕다리버섯속 진균류를 포함하며, 특별히 선택된 진균 생물에 적합한 조건 하에 생장한다. 진균용 영양 배지는 구체적으로는 사용된 진균에 따라 적당한 성분을 함유하지만, 탄소 공급원, 질소 공급원 및 관련 비타민과 보조 인자들을 늘 함유해야 한다. 본 발명의 배양 배지에서 균개가 형성되도록 하기 위해서 충분한 진균 접종원을 제공하기에 족한 적정 기간 동안 배양하여 균사괴를 생산한다. 초기 접종으로부터 균사괴를 형성하는데 통상적으로 걸리는 시간은 5일 내지 100일의 범위이다.

본 발명에 유용한 시판되는 액상 진균성 균사괴는 마우이에 소재하며 이전에 마우이 시타케 무역 회사(Maui Shiitake Trading Company)였던 쿠쿠이 스폰 주식회사(Kukui Spawn Co.)로부터 구입할 수 있다.

그 다음, 액상 균사괴를 사용하여 LCF의 제조를 위한 배양 배지를 접종한다. 접종된 배양 배지를 가시 스펙트럼의 장파장 영역이 우세한 광의 존재하에 15-37℃의 온도, 바람직하게는 약 20℃의 온도에서 필요한 수준의 PGR을 생산하기에 충분한 시간 동안 교반 없이 배양한다.

일반적으로 PGR은 30일, 바람직하게는 45일, 보다 바람직하게는 60일의 배양 후에 유용한 양으로 생산된다.

접종된 배양 배지의 교반은 균개의 교란을 방지하기 위해 피해야 하지만, 배지의 에어레이션은 바람직할 수 있다. 이것은 예컨대 배지를 통해 산소를 버블링 하거나 균사막이 교란되지 않고 유지되는 다른 수단에 의해 제공될 수 있다. 심지어 배지를 통한 공기의 버블링 없이 단지 균사 표면(mycelial surface)과의 상호작용을 통해 에어레이션이 일어나도록 하는 것만으로도 충분한 산소가 이용될 수 있는 것으로 나타났다.

“가시 스펙트럼의 장파장 영역”은 약 500-800nm, 좋게는 600-750nm의 파장을 갖는 광을 의미한다. 다른 파장이 포함될 수 있지만, 우세한 파장은 상기 범위에 있어야 한다. 따라서 전체광자의 퍼센트로서, 장파장 영역은 상기 광자의 50%이상을 나타내야 한다.

PGR 수준은 표준 생물검정법(standard bioassay methods)을 사용하여 평가할 수 있다. 상토(potting soil)에 토양 드렌치(soil drench)로 사용되는 LCF의 기지(旣知) 농도에서 콩 묘목(seedling) 생장을 비교하여 생장 표준으로 사용한다. LCF 용액의 색상은 시간에 따른 콩 묘목에 대한 효과에 상호관련이 있다. 비료 비율은 처리와 제어를 위해 고정되며, 묘목은 사용 14일 후 평가된다. 전체 무게, 뿌리 무게, 뿌리 길이, 잎 무게 및 높이의 차이로 인한 효과를 표준 LCF 용액으로 인한 효과와 비교하기 위해 측정한다. 대안으로, 노란색에서 짙은 붉은 포도주색으로의 변화는 PGR의 생산과 상호관련이 있다는 것으로 나타나 있으므로, 배양액의 색상이 지표(index)로 사용될 수 있다.

LCF 용액의 농도(strength)는 콩 묘목에 대해 1:500의 적합한 희석 세기를 갖는 기지의 LCF 용액, 즉 “표준”의 색상에 맞추어 조절한다. 보통 60일간 배양된 배양물을 물로 1:2로 희석하면 표준의 색도에 필적하는 색도에 도달될 것이다. 배양 시간이 더 길면 배양액을 더욱 희석하여야 표준 LCF 수준에 도달된다.

배양조직이 성숙함에 따라, 균사막이 생장하고, 충분한 PGR 생산이 일어났을 때 배양조직의 액체 부분을 쉽게 무균적으로 제거할 수 있다. 고형물을 수확된 배양 배지로부터 좋게는 여과법 또는 대안으로 원심분리법이나 고체를 분리 제거하기 위해 알려진 기타 수단들에 의해 제거한다. 그 후 액체 부분은 100℃로 가열하고 10분간 유지한다. 이 공정은 셀룰라아제, 리파제 및 헤미셀룰라아제 등의 효소를 변성시킨다. 화학적/온도 단백질 추출법 또는 막 여과법을 또한 사용할 수 있다. 그 다음으로, 변성 단백질을 종이 여과시키거나, 또는 원심분리법에 의해 제거할 수 있다. 그 후, 액체 부분을 저온살균(pasteurization) 및 한외(限外)여과(ultrafiltration) 등의 적당한 살균법으로 처리하는데, 좋게는 저온살균 처리한다. 그 뒤, 생성된 저온살균 “LCF"를 살균 용기에 담는다. 그리고 균사막이 있는 배양 플라스크를 원한다면, 추가적으로 LCF를 제조하기 위해 살균된 차가운 영양소 용액으로 다시 채운다. 첫 번째 LCF 생산에는 60일이 걸리지만, 균사막이 첫 번째 작업에서 만들어졌기 때문에 두 번째 생산은 단지 약 30일이면 된다. 세 번째와 그 다음의 생산 작업에는 30일이 걸리며 배양 용기가 오염될 때까지 계속될 수 있다.

“배양 여액”이란 상술한 배양물의 액체 부분을 의미한다. “배양 여액”은 이 여액의 회수가 반드시 실질적인 여과법에 의해 수행되지 않을 수 있음에도 불구하고, 일반적으로 사용되는 용어이다. 실제 본 발명의 많은 배양물에서는, 배양 여액을 가만히 따라 내거나 또는 사이펀으로 흡입하여 제거할 수 있도록 균사막이 형성된다. 따라서 “배양 여액”은 간단히 배양물의 액체부분을 말한다.

본 발명의 LCF의 “살균”은 다양한 수단에 의해 달성될 수 있다. 저온살균법이 가장 실용적이기 때문에, 그 조성물은 LCF라고 일컬어진다. 그러나 한외여과 또는 아이도포어(Idophor) 등의 살균제나 항생물질의 함유와 같은 다른 방식의 살균법이 또한 효과적일 수 있다.

살균 배양 여액에 더하여, 본 발명의 LCF 조성물은 또한 배양물의 여과 후에 남겨진 건조 가능한 물질을 포함할 수 있다. 이 물질이 또한 PGR을 함유하고 있고 살균 여액과 유사한 방식으로 사용될 수 있다.

균개는 LCF 수확을 위해 배지를 제거한 후 재사용될 수 있다. 일반적으로 배지는 균개 아래로부터 관을 통해서 제거할 수 있으며 새로운 살균 배지로 교체할 수도 있다. 일반적으로는 균개가 이전의 배지를 제거하는 동안 찢어지기 때문에, 신규 살균 배지를 간단히 용기 내에 다시 부으면 막 부분은 다시 모여 계속 생장한다.

본 발명의 방법에 따른 식물 생장 조정제의 생산에 더하여, 배지는 또한 병원균에 대한 식물의 방어를 일으키는 물질의 유도인자를 포함하는 것으로 나타났다. 이 방어 기작들은 피토알렉신(phytoalexins)이라고 알려져 있으며 기생균 또는 병원균에 감염된 식물에서 일어난다. 이 기작들의 일반적인 논의는 웹 사이트[www.uidaho.edu/ag/plantdisease, 아이다호 식물과학 대학 (U. of Idaho Plant Science)의 코스 405/504 강의 8]에서 찾을 수 있는 "How Plants Defend Themselves Against Pathogens "이라는 제목의 강의 보고서에서 발견할 수 있다. 약술한 바와 같이 일반적으로 구조적 방어는 예컨대 식물 대사의 붕괴에 대한 장벽을 구성하는 왁스, 코르크 층, 이층(離層, abscission layer) 등의 형성을 포함한다. 대사 방어는 이미 존재하는 방어 뿐 아니라 병원체의 감염에 의하여 유도된 방어를 포함한다. 이러한 대사 방어들은 피토알렉신으로 지칭되는 독성 물질의 생성을 포함한다. 본 발명의 LCF는 이런 종류의 반응을 이끌어낼 수 있다.

따라서 본 발명의 한 측면은 LCF의 식물 생장 조절 효과를 피토알렉신의 생산을 유도하는 것과 결부시킨다. 이러한 측면은 에덴 바이오사이언스(Eden Bioscience)에 의해 제조되었으며 하핀(Harpin) 단백질을 함유하고 있는 메신저(Messenger)라 불리는 제품과 같은 기지의 피토알렉신 억제제를 첨가함으로써 강화될 수 있다.

LCF는 작물이나 나무에 사용하기에 적합한 농도로 희석된다. PGR의 농도와 요구되는 효과에 따라 1:100 - 1:2,000 또는 1:5,000의 희석이 사용될 수 있다. 물론 희석의 수준은 PGR의 초기 농도, 물질이 사용될 방식 및 통상의 기술 내에서 충분히 결정되는 다른 많은 인자에 의해 결정된다. 1;6,000만큼 높은 희석이나 1:10,000정도의 훨씬 더 큰 희석이 많은 경우에 효과적인 것으로 나타났다. LCF는 또한 사용을 위하여 활석(滑石: talc)이나 규조토(硅藻土 : diatomaceous earth) 등의 비활성 지지체에서 건조되거나 비료의 성능을 끌어올리기 위해 과립상의 비료 상에서 건조될 수 있다. 일반적으로, 희석된 LCF는 식목침액(planting dip) 또는 엽면살포제(foliar spray)에 포함키거나, 점적관수 시스템(drip irrigation system)을 통해 첨가하거나 상토와 혼합하거나 묘목(seedling) 주변토양(surrounding soil)에 이용하는 등의 통상적인 방식으로 이용될 수 있다.

하나의 구체예에서, 살포제나 토양 보충제로 사용되는 때에 사용 비율은 에이커 당 물 30갤런 당 LCF 6-8 온스이다. 한편 액체를 대량으로 사용하는 것이 바람직하다. 좋게는, 1 에이커에 사용되는 전체 액체는 100 - 200갤런의 물에 희석되어 1 파인트(pint) - 1.5쿼트(quart)에 가까운 희석 상태를 갖는 100 - 500갤런일 것이다. 따라서 일반적으로 살포제로 사용되는 에이커 당 물 125-200갤런에 살균 배지로서 1쿼트의 LCF를 사용하거나 에이커 당 물 325갤런에 희석된 2쿼트의 살균 배양 여액 LCF를 사용한다.

한편 상술한 것처럼, 배양 여액 LCF는 또한 과립 물질로 건조되어 건조 물질로서 사용될 수 있다.

LCF 및 그 희석물 또는 기타 제제들은 또한 조합된 적용을 위하여 살충제 등의 다른 산성물질, 다른 영양소 및/또는 비료와 혼합될 수 있다. 기초 비료 또는 용액과 혼합하는 것은 피해야한다. 특히 좋은 혼합물은 본 명세서에 참조로 포함된 국제공개공보 제96/38590호에 기술된 계면활성제 혼합 작물 보조제들(surfactant blend crop adjuvants)과의 혼합물이다. 대안으로, 소듐라우릴설페이트, 당밀, 잇꽃(safflower), 기름 및 치즈의 혼합물과 같이 완전히 면제성분들(exempt ingredients)로 이루어진 살선충제 혼합물이 또한 사용될 수 있다. 이에 대해서는 2002년 6월 21일에 출원되었으며 본 명세서에 참조로 포함된 함께 출원 중인 특허출원 제60/390,289호에 기술되어 있다. 상술한 것처럼 상기 제제에는 피토알렉신 방어 단백질의 엘리시터와 대사체들이 또한 포함될 수 있다.

예시로서, LCF는 잔디용 또는 채소 및 나무용으로 고안된 비료 펠렛(pellet) 상을 1%(wt/wt) 코팅하여 공급될 수 있다. 규조토 상에 2%(wt/wt) 코팅된 것은 레터스, 토마토, 양배추 및 가지등이 소립종자용으로 적당한 종자 처리 가루(seed treatment flour)이다. 규조토에 코팅된 LCF의 퍼센트가 높으면 더 큰 종자에 유용하다. 예를 들어, 6.5% 코팅은 옥수수, 강낭콩, 콩, 완두 및 오이용으로 적합하다.나근묘목(bare root seedling), 구경(球莖), 파인애플 근두(根頭: crowns) 및 기타 식물성 작물에 이 가루를 뿌려 생장을 증진시킬 수 있다.

편리한 사용 방식은 플라스틱 가방에 있는 1온스의 종자에 상기 가루를 약 1/2 티스푼 첨가하는 것이다. 가방을 닫은 후 가방을 흔들어 그 가루들이 종자에 코팅되도록 한다. 과량의 가루는 회수하고 얻어진 종자는 상기 가루의 훌륭한 코팅막을 갖는다.

일반적으로, LCF는 실온에서 직사광선이 닿지 않는 건조 조건 하에서 보관해야 한다. 본 발명의 LCF는 친환경적이지만, 먹거나 장시간 동안 피부에 접촉해서는 안 된다.

하기의 실시예들은 예시를 위한 것으로 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.

실시예 1: 저온 살균 LCF의 제조

배지는 한외여과로부터 얻은 고섬유성 파인애플 쥬스 농축액(retentate) 20갤런, 파인애플 시럽 1갤런, 당밀수 20갤런(당밀 5갤런과 물 40갤런을 혼합함.) 및 껍질, 종자 및 펄프를 임의로 포함하는 말랑하게 잘익은 순수한 파파야 퓨레 5갤런으로 제조하였다.

그 뒤, 추가적인 농축액 및/또는 당밀수를 첨가하여 전체 부피를 50갤런으로 조절하였다. 성분들을 개방형 플라스틱 드럼에서 혼합하고 스테인리스 스틸 단지로 옮겨 끓이고 100℃에서 최소 30분간 유지시켰다. 뜨거운 슬러리를 소독된 반투명 55갤런 바이오프로세싱 드럼으로 옮기고 실온으로 냉각시켰다. 냉각에는 수일이 걸린다.

냉각된 배지를 층류 후드(laminar flow-hood) 하에서 진균 개시 배양물(아래 참조)로 접종시키고 하나 또는 두개의 살균 면전(cotton plug)을 55갤런 드럼에 설치하였다. 그 다음, 드럼을 냉방된 채광실에서 60일 동안 방해 없이 배양하였다. 조명은 아르고라이트(Agrolights) 또는 디럭스 웜 화이트 라이트(deluxe warm white light)로 공급하였다. 쿨 화이트 라이트(cool white light)는 만족스럽지 않다.

60일 후, 배양물의 액체 부위를 제거하고 여과하여 고체를 제거하였다. 여과된 액체를 10분간 100℃로 가열하여 가용성 단백질을 변성시켰다. 그 다음, 가열된 배지를 여과하고 30분 동안 100℃로 재가열하여 저온 살균하였다. 저온 살균된 산물을 위생 처리된 병에 넣어서 실온에서 저장하였다. 본 실시예에서 제조된 LCF의 pH는 2.5이다.

본 실시예에 사용된 진균 개시 배양물은 이전에는 마우이 시타케 무역 회사였던 하와이의 쿠쿠이 스펀 주식회사로부터 구입하였다. 총 1리터의 액상 균사괴 용기를 냉각된 영양소 용액의 바이오프로세싱 드럼에 무균적으로 첨가한다. 보통 바이오프로세싱 드럼 50갤런 당 균사괴 액상 배양균 2병이 첨가된다.

실시예 2: 식물에 사용

실시예 1에서 제조된 LCF 1온스를 물 5갤런으로 희석시켰다. 이 혼합물을 커피 나무 주위 토양에 사용하였다.

LCF 1온스를 물 5갤런으로 희석시키고 옥수수 식물(corn plants)을 처리하는데 사용하였는데, 그 결과 대조군(control) 식물보다 체적이 60% 더 크게 생장하였다. LCF 1온스를 물 10갤런으로 희석시킨 경우에도 향상된 결과가 나타났다.

1온스의 LCF를 물 5갤런에 유사하게 희석하여 마노아(Manoa) 레터스에 살포하는데 사용하였으며 대조군보다 잎 무게가 50% 더 증가하였다.

오이 종자를 뿌리기 전에 6.5% LCF 가루로 처리하였고 식물은 대조군보다 39% 더 무겁게 생장하였다.

1온스의 LCF를 물 5갤런에 희석하여 파인애플 근두에 사용한 결과 파인애플이 더 빠르게 생장하였다. 또한 더 나이든 식물의 잎에 이 희석제를 살포하거나 3년 된 파인애플 묘목을 이 희석제에 잠깐 담갔을 때에도 이러한 향상된 생장 결과가 관찰되었다.

LCF 1온스를 물 1갤런에 희석하여 마른땅 타로토란(dry land taro)용, 고구마용 및 얌(yam)용 구경(corm)/식목침액으로 사용하였다.

타로토란 묘목이 결과적으로 6주 동안에 대조군 식물보다 160% 더 무겁게 생장하였다.

사탕수수에 사용하는 경우에, 필요한 희석은 식물의 품종에 따라 변경하였다. 어떤 경우에는 LCF 1온스와 물 2 1/2갤런이 줄기 직경을 50% 증가시키는데 성공적이었다.

잔디가 물 5갤런으로 희석된 1온스의 LCF의 살포에 의해 더 빠른 속도로 생장하게 되었다.

또한, 더글라스(Douglas) 전나무를 처리하는데 LCF를 묘목 포트(pot) 당 1:500으로 희석한 29mls의 토양 드렌치(soil drench)로서 사용하였으며 그 결과 4주 내에 10% - 20% 생장하였다.

LCF는 곡물, 야채 및 기타 작물의 건조 종자 코팅 처리를 위해 고분자와 혼합될 수 있다. LCF의 퍼센트는 작물에 따라 변할 것이다.

LCF는 선충 감염 현상을 경감시키는데 사용될 수 있다. 감염된 커피 나무 당 5갤런의 1:500 희석제. 5개월에 3회 사용으로 뿌리와 잎가지가 늘어나고, 과실 균일성이 증가하며, 생산성이 증가할 것이다.

LCF는 균성 잎점무늬병 및 세균성 썩음병과 같은 식물 질병 발병률을 줄이는데 사용될 수 있다. 1:1600의 LCF 희석제를 3주마다 잎에 도포하면 양파 구근 썩음병(Onion Bulb Rot)이 감소될 수 있다.

LCF의 희용액(weak solution)인 0.1% 용액을 사용하여 절화, 잎 장식 및 크리스마스 트리의 수명을 연장시킬 수 있다.

LCF를 1:500 폴리아(foliar) 또는 소일드렌치 용(用)으로 사용하여 혹한, 곤충 및 화학물질로 인한 식물 손상을 감소시킬 수 있다.

입상 비료와 상토에 심기에 앞서서 10분간 100만 당 800, 1000 또는 2000부의 LCF 살균 배양 여액을 함유하는 용액에 줄기를 잠깐 담금가서 파인애플 줄기들을 테스트하였다. 또한 그 줄기들을 동시에 미세유액 계면활성제 혼합 살선충제에 잠시 담가주었다. 대조군은 6.9그램의 평균 뿌리 무게와 29.4인치의 평균 뿌리 길이를 가지고 있었지만, 100만 당 800부 LCF로 처리된 것들은 8.2그램의 뿌리 무게와 33.5인치의 뿌리 길이를 가지고 있었고 100만 당 1000부 LCF로 처리된 식물은 7.4그램의 뿌리 무게와 대조군에 비해 41%가 증가한 41.4인치의 뿌리 길이를 가지고 있었다. 그러나 100만 당 2000부에서는 독성 효과가 나타나서 뿌리 무게와 뿌리 길이가 대조군 보다 작았다.

가반조(Garbanzo) 콩을 1/2갤런 또는 1갤런의 물에 1온스의 살균 배양 여액 LCF가 희석된 희석제에 담갔다. 그 콩을 콩 100그램 당 상기 희석물질 1ml의 비율로 처리하였다. 그 뒤 콩을 건조하고 심었으며 그 결과 미처리(未處理) 대조군에 비해 수확된 콩의 양이 22% 증가하였다.

기타 응용으로, 본 발명의 LCF 조성물 처리를 꽃 자극제, 제초제 및 잔디 생장 억제제와 결합시켰다.

LCF를 토마토에 사용하였을 때 56%의 과실 무게 증가가 얻어졌다.

Claims (25)

1. 성분이 최소 10%의 유효 탄화수소와 추가적으로 칼륨이온 및 카로틴을 함유한 배지에서 장파장 광의 존재 하에 실질적인 교반없이 배양된 진균성 균사괴의 배양물로부터 얻어지는 살균 배양 여액인 것을 특징으로 하는 식물 생장 조절 물질을 함유하는 조성물.
2. 성분이 최소 10%의 유효 탄화수소와 추가적으로 칼륨이온 및 카로틴을 함유한 배지에서 장파장 광의 존재 하에 실질적인 교반없이 배양된 진균성 균사괴의 배양물로부터 얻어지는 임의로 건조된 살균 배양 여액인 식물 생장 조절 물질을 함유하는 조성물의 유효량을 포함하는 것을 특징으로 하는 식물 생장 및/또는 발육 증진용 제제.
3. 제2항에 있어서, 상기 배지의 BRIC 값은 12-15인 제제.
4. 제2항에 있어서, 상기 배지는 당밀 및/또는 파인애플 또는 파파야 시럽이나 즙을 포함하는 것인 제제.
5. 제2항에 있어서, 상기 배지는 노란색을 부여하기에 충분한 카로틴과 0.01% - 0.1% wt/vol의 K⁺을 함유하는 것인 제제.
6. 제2항에 있어서, 상기 진균성 균사괴는 담자균(Basidiomycete)의 균사괴인 것인 제제.
7. 제6항에 있어서, 상기 담자균은 차아버섯(Polyporus) 진균인 것인 제제.
8. 제7항에 있어서, 상기 차아버섯은 갈색부후 차아버섯인 제제.
9. 제8항에 있어서, 상기 갈색부후 차아버섯은 덕다리버섯(Laetiporus)인 제제.
10. 장파장 광의 존재 하에 실질적인 교반없이 최소 10%의 유효 탄화수소와 추가적으로 칼륨이온 및 카로틴을 함유하는 배지에서 생장한 진균성 균사괴 배양물의 여액을 살균하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 식물 생장 조정제를 함유하는 조성물의 제조 방법.
11. 장파장 광의 존재 하에 실질적인 교반없이 최소 10%의 유효 탄화수소와 추가적으로 칼륨이온 및 카로틴을 함유하는 배지에서 진균성 균사괴를 배양하는 공정, 배양 여액을 회수하는 공정, 여액에서 가용 단백질을 변성시키고 변성된 단백질을 제거하는 공정 및 배양 여액을 살균하여 상기 조성물을 얻는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 식물 생장 조정제를 포함하는 조성물의 제조 방법.
12. 제11항에 있어서, 상기 배지는 노란색을 부여하기에 충분한 카로틴과 0.01% - 0.1% wt/vol의 K⁺을 함유하는 것인 제조 방법.
13. 제11항에 있어서, 상기 배양 여액은 상기 배양물의 여과하여 회수되는 것인 제조 방법.
14. 제11항에 있어서, 상기 변성 단백질은 여과에 의해 제거되는 것인 제조 방법.
15. 제10항에 있어서, 상기 살균 공정은 저온살균에 의하여 행해지는 것인 제조 방법.
16. 제11항에 있어서, 상기 살균 공정은 저온살균에 의하여 행해지는 것인 제조 방법.
17. 제10항에 있어서, 상기 진균성 균사괴는 담자균(Basidiomycete)의 균사괴인 것인 제조 방법.
18. 제17항에 있어서, 상기 담자균은 차아버섯(Polyporus) 균인 것인 제조방법
19. 제18항에 있어서, 상기 차아버섯은 갈색부후 차아버섯인 제조 방법.
20. 제19항에 있어서, 상기 갈색부후 차아버섯은 덕다리버섯(Laetiporus)인 제조 방법.
21. 종자 또는 적어도 식물 일부와 제2항의 제제를 접촉시키는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 식물 생장, 발육 및 체적을 증진시키는 방법
22. 제21항에 있어서, 상기 제제는 적어도 하나의 살충제 및/또는 적어도 하나의 영양소 및/또는 적어도 하나의 제초제를 추가적으로 함유하는 것인 방법.
23. 제21항에 있어서, 상기 제제는 적어도 하나의 피토알렉신을 생산하는 유도인자를 추가적으로 함유하는 것인 방법.
24. 제2항에 있어서, 상기 조성물로 코팅된 규조토 또는 비료입자를 포함하는 것인 제제.
25. 제21항에 있어서, 종자 또는 적어도 식물 일부를 적어도 하나의 살충제 및/또는 적어도 하나의 영양소 및/또는 적어도 하나의 제초제와 접촉시키는 공정을 추가적으로 포함하는 것인 방법.