CN113186115A - 植物接种方法 - Google Patents

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Abstract

一种用固氮细菌如重氮营养葡糖醋杆菌接种植物的方法，所述方法包括将该固氮细菌施用至生长植物的伤口，例如施用至最近切割过的草。以这种方式的接种导致增强的生长特性，包括增加的草绿色度。还描述和要求保护适合在该方法中使用的新颖组合物以及用于生产这些组合物的试剂盒。

Description

植物接种方法
本申请是申请日为2015年7月28日，申请号为201580041250.2，发明名称为“植物接种方法”的分案申请。
技术领域
本发明涉及一种用固氮细菌接种植物的方法并且涉及适合用于该方法中的组合物和试剂盒。
背景技术
该固氮细菌重氮营养葡糖醋杆菌(Gluconacetobacter diazotrophicus)，以前称为重氮营养醋杆菌(吉利斯，M.(Gillis,M.)等人，国际系统细菌学杂志(Int.J.Syst.Bacteriol.)，39:361-364；1989)，最初分离自甘蔗根和茎(卡瓦尔坎蒂，V.A.(Cavalcante，V.A.)等人，(1988)植物土壤(Plant Soil)，第108卷，第23-31页)。已经通过15N2掺入证明了重氮营养葡糖醋杆菌将氮固定在甘蔗植物中(塞维利亚，M.(Sevilla,M.)等人，分子植物微生物相互作用(Mol.Plant Microbe Interact.)，14:358-366；2001；博迪，R.M.(Boddey，R.M.)等人，植物土壤(Plant Soil)，252:139-149；2003)，并且其具有以潜在地可用于植物的形式排出几乎一半的固定氮的能力(克霍，E.H(Cojho,E.H)等人，欧洲微生物学会联合会微生物通讯(Fed.Eur.Microbiol.Soc.Microbiol.Lett.)，106:341-346；1993)。该细菌侵入甘蔗根分生组织的细胞之间和细胞间定殖的侧根的出现点处，并且还侵入木质部，而不形成结瘤(詹姆斯，E.K.(James，E.K.)等人，实验植物学杂志(J.Exp.Bot.)，52:747-760；2001)。已经证明了可以引发Gd的细胞内定殖从而使得能够进行非结节性内共生固氮的条件(EP-B-1422997和科金(Cocking)E.C.等人，(2006)体外细胞与发育生物学-植物(In Vitro Cellular and Developmental Biology-Plant)，第42卷，第1期，第74-82页)。特别地，当植物生长至萌发时或在萌发7天内时，将该细菌施用至该植物的生长培养基中。
WO 2011/144741表明可以将诸如Gd的细菌注入甘蔗的茎中以增强固氮。显然，这种技术并不是一种可以应用于任何大规模农业操作中的技术。
诸位申请人已经发现，可以用固氮细菌成功地接种生长植物。
发明内容
根据本发明，提供了一种用固氮细菌接种植物的方法，所述方法包括将该固氮细菌施用至生长植物的伤口。
已经发现，当施用至伤口时，特别是施用至植物组织的伤口表面时，随后的植物生长得到增强。例如，可以增强生物量或产量和/或可以增加花的数量。这可能是由于通过固氮细菌以类似于例如在EP-B-1422997中所述的方式的植物组织定殖，但是当以这种方式施用时可能引发这种结果的事实是令人惊讶的。在植物组织内定殖的固氮细菌可以提供增强植物生长的细胞内氮源。因此，本发明的方法提供了一种向生长植物施用植物生长增强处理的有用手段。
该固氮细菌应当适当地是可以在植物细胞内进行细胞内定位的细菌。在一个具体实施例中，这是细胞内定殖的共生固氮细菌重氮营养葡糖醋杆菌(Gd)，例如重氮营养葡糖醋杆菌菌株IMI 504998(旧称IMI 501986)或IMI 504958(旧称IMI 504853)，两者分别于2015年7月28日和2015年6月17日保藏于CABI(英国)。这些菌株是新颖的并形成本发明的另一方面。可替代地，该固氮细菌可以是草螺菌属(Herbaspirillum)的物种。其他固氮细菌包括固氮菌属、拜叶林克氏菌属、梭菌属、根瘤菌属、克雷白氏杆菌属以及含脂螺菌。
在一个具体实施例中，将该固氮细菌与土地芽孢杆菌属(Terribacillus)菌株一起施用或与其组合施用，如诸位申请人在共同未决的国际专利申请中所述，该申请要求英国专利申请号1400840.3的优先权。诸位申请人已经发现，这种菌株可以增强固氮细菌的活性。合适的土地芽孢杆菌属(Terribacillus)菌株包括嗜糖土地芽孢杆菌(Terribacillussaccharophilus)、嗜盐土地芽孢杆菌(Terribacillus halophilus)、Terribacillusgoriensis或Terribacillus aidingensis，但特别是嗜糖土地芽孢杆菌菌株。单独或与固氮细菌混合的土地芽孢杆菌属(Terribacillus)。土地芽孢杆菌属(Terribacillus)可以与固氮细菌紧密混合(并且实际上，IMI 501986(现在为IMI 504998)已被分类为Gd和土地芽孢杆菌属(Terribacillus)的聚生体)，或者可以将其以共培养或混合培养的形式施用。
该伤口可能是意外或自然损害的结果，因此额外的氮可用性可以促进修复生长。然而，在一个具体实施例中，该伤口是由以下行为造成的损害的结果，这些行为如：割草(景观草)、扦插(青贮和干草作物)、截根培植(香蕉、菠萝、甘蔗、高粱、水稻、木豆、棉花、麻蕉、苎麻)、剪枝(果树、藤本植物)、经过牲畜或经过收割的消耗。在一些情况下，植物可能被无意地或不完全地损害的其他过程(如耙地)可能不合适。具体地，该伤口将在植物的‘地上’部分中发现，如叶或茎。
因此，本发明的方法可以进一步包括对植物造成‘损害’的预备步骤，该预备步骤具体地通过割草、扦插、截根培植、剪枝或通过收割进行。在进行这类行为的相对短的时间内适当地施用该固氮细菌，例如在对植物造成损害的48小时内，例如在24小时内，如在10小时内，以及适当地在1-2小时内。
该细菌的递送是通过将合适的配制品以组合物的形式施用到伤口区域，特别是施用到伤口表面来实现的。该组合物可以呈可以直接施用的液体、凝胶、糊剂形式或呈稀释形式，或者其可以呈固体组合物的形式，如粉末或颗粒组合物，该组合物将在使用前溶解在液体(如水)中。在固体组合物中，该细菌通常以干燥形式使用，例如以冻干形式使用，其在添加水时可复原。如果需要，可以使用本领域已知的方法将该细菌微囊化，以便保持细菌的高存活率和稳定性。
在一个具体实施例中，该组合物呈适于喷雾在植物上的形式并且因此将包括用于稀释的浓缩物，该浓缩物可以呈液体或固体形式，特别是呈液体形式，或者该组合物可以包括可以直接喷雾的稀释水性组合物。可替代地，该组合物可以是可以通过例如浸渍而浸没植物的伤口表面的组合物。
在任何具体情况下，所施用的固氮细菌的量将根据以下因素而变化，如所处理的种子的类型、所用固氮细菌的具体菌株、所需的萌发增强的水平和施用方法、以及所需的效果。然而，典型地，向植物的伤口施用包含从1至1x 107个细菌/毫升所施用的组合物(例如10-103个细菌/毫升组合物，例如50-200个细菌/毫升组合物，如100个细菌/毫升组合物)的溶液。这样的溶液可以通过将该细菌培养至容易检测的水平，例如通过检查光密度并且然后相应地稀释该溶液来获得。
诸位申请人已经发现例如在某些细菌的情况下，对性质(如生物量)的效果受到以剂量依赖性方式施用的细菌量的影响。这意味着可以根据处理目的施用不同的剂量。例如，在草的情况下，对于牧草而言可能需要的是生物量最大化，而对于景观草或草皮草而言，缓慢生长可能是优选的。在这种情况下，将选择所施用的细菌量来为目标草物种提供最佳的生物量生产，如下所示。
在一个具体实施例中，该组合物进一步包括针对该固氮细菌的营养素，例如该组合物可包括如EP-B-1422997中所述的3％w/v蔗糖。
该固氮细菌可以是该组合物的唯一活性组分，或者可以根据需要与另外的农业化学活性组分如杀虫剂、杀真菌剂或植物生长调节剂组合。
该组合物可进一步包括如本领域已知的添加剂或赋形剂(例如增稠剂、分散剂、稀释剂、湿润剂、固体载体等)。
在一个具体实施例中，该组合物进一步包括多糖或农业上可接受的表面活性剂或这些的组合。
在一个具体实施例中，该组合物进一步包括农业上可接受的表面活性剂。表面活性剂的存在确保该组合物能够在伤口的整个表面上相对自由地流动，以便促进固氮细菌的进入。
合适的表面活性剂或洗涤剂包括非离子型洗涤剂，例如以商品名
Figure BDA0002931149970000041
出售的那些，例如Tween 80。
Tween 80是非离子型洗涤剂；70％由脂肪酸油酸组成，并且其余为亚油酸、棕榈酸和硬脂酸的组合。1％溶液的pH在5.5-7.2的范围内。它广泛用于乳化和分散医药和食物产品中的物质。它作为抗细菌剂具有很小活性或没有活性(道森(Dawson)等人(1986)生化研究数据(Data for Biochemical Research)，第3版，牛津大学出版社(纽约，NY：1986)，第289页)。
当与固氮细菌(以及任选地如下文进一步描述的多糖)组合时，向植物伤口施用的表面活性剂量应当足以产生增强的植物生长效果。这将随如下各种因素而变化：例如特定的表面活性剂、所处理的植物的类型、伤口的性质、所采用的固氮细菌的特定菌株以及施用方法。然而，通常，包括从0.0005％v/v至10％v/v，例如从0.0005％v/v至0.5％v/v，例如从0.0005％v/v至1％v/v，包括从0.0005％v/v至0.2％v/v，例如从0.0005％v/v至0.15％v/v，例如约0.1％v/v的组合物。
在另一个实施例中，该组合物包括多糖。用于在该组合物中使用的合适的多糖包括源自植物、动物或微生物来源的水胶体多糖。
具体地，这些包括渗出物胶质多糖(exudate gum polysaccharide)(例如阿拉伯胶、阔叶榆绿木胶、刺梧桐胶和黄蓍胶)、纤维素衍生物(如羧甲基纤维素、甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素或微晶纤维素)、淀粉及衍生物(包括例如玉米淀粉、木薯淀粉、马铃薯淀粉、大米淀粉、小麦淀粉及其改性形式(例如预胶化淀粉、氧化淀粉、乙基化淀粉、淀粉糊精或麦芽糖糊精))、果胶、来源于海藻的多糖(例如琼脂、藻酸盐、角叉菜胶和红藻胶)、种子胶(例如瓜尔胶和刺槐豆胶)、衍生自微生物发酵的多糖(例如黄原胶和吉兰糖胶)、和含氮多糖(如壳聚糖)；或这些的混合物。
在一个具体实施例中，该多糖是渗出物胶质多糖，例如阿拉伯胶、阔叶榆绿木胶、刺梧桐胶或黄蓍胶。该多糖的具体实例是阿拉伯胶。
阿拉伯胶是作为来自不同种类的阿拉伯胶树的渗出物(方(Fang)等人2010(2010)生物分子(Biomolecules)：11,1398-1405)而收集的天然树胶；作为一种复合多糖，它广泛应用于包括涂料、胶水、药品、纺织品和食品在内的各种工业领域。来自阿拉伯胶树的阿拉伯胶被认为是半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖和葡萄糖醛酸的支化聚合物，其中钙、镁和钾盐的分子量约为250,000。已经显示(巴德(Badar)，K.V.等人，(2011)近期科技研究(RecentResearch in Science and Technology)3(5)6-7)，当在萌发前将某些植物的种子浸泡在1％的阿拉伯胶溶液中持续24小时后，会对种子萌发产生影响。此外，WO 02/058466报道了，包括多糖和肽的组合的某些组合物可以增加作物产量。
当与固氮细菌以及还有任选地表面活性剂组合时，向植物伤口施用的多糖量应当足以产生增强的固氮效应。这将随如下各种因素而变化：例如所采用的特定的多糖、所处理的植物的类型、伤口的性质、所采用的固氮细菌的特定菌株以及施用方法。然而，通常使用包括从0.1％w/w至1％w/w，例如从0.1％w/w至0.5％w/w，例如约0.3％w/w多糖的组合物。
在一个实施例中，该组合物包括多糖和农业上可接受的表面活性剂二者。已经发现，在一些情况下，这些组分增强固氮细菌的作用，并且似乎一起协同作用以产生更显著的增强。用包括这些组分的组合物处理的植物可以显示增加的生长，如通过经处理的植物的干重增加所证明的。
包括上述组分的新颖组合物形成本发明的另一方面。因此，在另一方面，本发明提供了一种农业上可接受的组合物，该组合物包括固氮细菌，特别是重氮营养葡糖醋杆菌，以及多糖、表面活性剂或其组合。
该固氮细菌如上所述，并且特别地重氮营养葡糖醋杆菌(Gluconacetobacterdiazotrophicus)适当地以上述量存在。类似地，该多糖是如上所述的多糖，例如渗出物胶质多糖，例如阿拉伯胶，并且该多糖以如上所述的量包括在该组合物中，例如浓度为从0.1％w/w至1％w/w多糖。此外，该表面活性剂适当地是如上所述的表面活性剂，例如非离子型洗涤剂，例如70％由脂肪酸油酸组成，其余为亚油酸、棕榈酸和硬脂酸的组合的表面活性剂。在一个具体实施例中，该组合物将包括从0.0005％v/v至10％v/v表面活性剂，例如从0.0005％v/v至0.2％v/v表面活性剂。
在又另一方面，本发明提供了一种用于制备包括固氮细菌的农业上可接受的组合物的试剂盒。在这类试剂盒中，该固氮细菌，并且特别是重氮营养葡糖醋杆菌可以与组合物的其他组分分开保持，例如在分开的容器中，或在有两部分的包装或容器中。该固氮细菌可以是冷冻干燥的。其他组分可以呈浓缩物的形式，以便于储存或运输，在使用时易于用例如水稀释。这种性质的浓缩物将包含与以上所列组合物相同的组分，但通常具有更高的水平。因此，例如，浓缩物可以包含从1％w/w至10％w/w，例如从1％w/w至5％w/w，例如约3％w/w的多糖，并且十倍稀释将产生适合用于例如本发明的方法中的组合物。类似地，该表面活性剂可以按从0.005％v/v至2％v/v的量存在于该浓缩物中。其他组分，例如针对固氮细菌的营养素适当地以所需浓度包括在该浓缩物中。
这种类型的试剂盒可以被用于生产本发明的组合物，该试剂盒可以直接使用。特别地，将任何浓缩物用水稀释至合适的体积，此时将该固氮细菌添加到其中。
本发明使得细胞内固氮细菌能够被施用和递送到大范围的作物中。特别地，这些植物可以是多年生植物、两年生植物或持续性一年生植物，包括但不限于果树和灌木(例如蓝莓、树莓和茶树)、藤本植物、饲料作物(苜蓿和青草，用于青贮、干草或家畜的直接消耗)、景观草和树篱、林业植物、园艺植物和草本植物(例如细香葱、芦笋、茄子)。
先前已经报道，Gd可以改进富含蔗糖的作物如甜菜或甘蔗的产量(WO 2010/022517)。然而，诸位申请人已经发现，使用本发明的处理，在不富含蔗糖的作物中观察到改进，并且这些形成本发明的一个具体实施例。
在一个具体实施例中，将本发明的方法和组合物在割草后立即或之后不久施用至草，如景观草、草皮草或牧草。这种处理导致草的生长增强，如通过与未接种的草相比接种的草的干重增加所证明的。似乎该固氮细菌能够通过由割草过程产生的伤口进入草中，并定殖在草类植物的细胞内，从而导致增强的生长特性。
此外，已经发现通过Gd的定殖可以增加植物，并且特别是草物种，如牧场草、景观草或草皮草中的叶绿素水平。由于叶绿素的增加不仅与氮含量相关，而且还与植物的绿色度水平相关，在高水平的绿色度是有利的应用(如景观草)中，这种性质是高度理想的。
附图说明
现在将参照附图通过实例的方式具体描述本发明，其中：
图1是显示未接种和接种的切割过的草的平均干重(g)的图；
图2是显示用Gd和蔗糖、Tween和/或阿拉伯胶或其组合处理的接种的切割过的草的地上部分干重的图；
图3示出了茶营养繁殖的制备实例，其中(A)示出了插穗的移除，并且(B)是用于DNA分离的每个插穗的子部分的图解表示；
图4显示了从已经接种Gd的茶植物的样品获得的PCR产物的凝胶的图像；对照植物中的所有条带都已进行测序并被确认为非特异性结合。来自接种的植物的测序条带被确认为重氮营养葡糖醋杆菌；
图5是显示各种处理对切割过的草的生物量的影响的图；
图6显示了测定Gd对草的头状花序数量的影响的测试结果；并且
图7是显示对切割过的草的生物量用不同组合物处理的结果的图。
然而，对于本领域技术人员显而易见的是，为了实施本发明不需要具体细节。出于说明和描述的目的，呈现本发明的具体实施例的以下描述。这些实施例不旨在将本发明穷举或限制为所公开的精确形式。显然，鉴于上述教导，许多修改和变化都是可能的。示出和描述这些实施例是为了最好地解释本发明的原理及其实际应用，从而使得本领域的其他技术人员能够最佳地利用本发明以及具有适于预期的特定用途的各种修改的各种实施例。
实例1
施用至切割过的草
方法学
重氮营养葡糖醋杆菌的培养：
根据需要，在ATGUS培养基[0.8％(w/v)琼脂，酵母提取物(2.7g l-1)，葡萄糖(2.7gl-1)，甘露醇(1.8g l-1)，MES缓冲液(4.4g l-1)，K2HPO4(4.8g l-1)和KH2PO4(0.65g l-1)，pH6.5]上培养具有表达GUS的pRGS561质粒的重氮营养葡糖醋杆菌菌株IMI 501986(现为IMI50998)。通过在包含50mg l-1的X-Gluc(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡萄糖醛酸环己基铵盐)的ATGUS培养基上铺板来测试b-葡萄糖醛酸酶(gusA)基因的表达；深蓝色菌落的形成表明gusA基因表达。
接种程序：
制备重氮营养葡糖醋杆菌的含水悬浮液，以给出在600nm下的光密度为1.1，c.109个菌落形成单位(CFU)/毫升。通过连续稀释，在ARGUS培养基(在适当情况下具有抗生素)上铺板并在皮氏培养皿(28℃，黑暗)中孵育4天后计数细菌菌落来测定CFU的数量。将该悬浮液稀释至10-4以产生包含约100个细菌/ml的溶液，准备用于如下所述的喷雾。
将0.5g标准重量的草黑麦草品种仙后(Cassiopeia)种子播种在John Innes1号堆肥的幼苗托盘中并轻轻地用堆肥覆盖。
将各个托盘放置在较大的托盘中，并在生长室中在21℃/15℃白天/晚上16/8小时循环提供足够的水持续20天。之后，使用剪刀在高于土壤水平2cm高度处切割草(除去剪下物)，并使用家用手持雾化喷雾器施用以下处理：
实验1.处理
水+3％蔗糖的对照
Gd+水+3％蔗糖
实验2处理
Gd+水
Gd+水+3％蔗糖
Gd+水+0.1％Tween
Gd+水+0.3％阿拉伯胶
Gd+水+3％蔗糖+0.1％Tween
Gd+水+3％蔗糖+0.3％阿拉伯胶
Gd+水+3％蔗糖+0.1％Tween+0.3％阿拉伯胶
萌发的幼苗的干重
用镊子从琼脂中除去幼苗，并从根上洗涤所有剩余的琼脂。将每个幼苗放入纸袋中，并置于80℃的烘箱中48小时，并且然后称重。
实验1和实验2的结果分别示于图1和图2中。
图1中的结果显示草的平均干重显著增加(未接种的图为0.09676g，接种的图为0.1276g)。这些干重在P<0.01时显著不同。因此，以这种方式的接种显然导致生长的显著增强。
图2中显示的这些结果显示在Gd/S/T/GA和下一最高干重(Gd/T)和Gd/S/T之间的显著差异(P<0.001)，证明了三种组分的组合的协同效应。Gd和Gd/S在P＝0.05时没有显著差异。
实例2
通过重氮营养葡糖醋杆菌(Azoticus)定殖茶(野茶树)
从茎插穗的营养生殖
茶叶克隆的营养繁殖的标准手段是单叶扦插。从包括大约四至六个节和嫩枝条尖的较大茎，基于组织的健康(即，没有昆虫和疾病)选择茎和叶的部分。选择用于扦插的部分在由山崎(Yamasaki)等人，土壤和作物管理(Soiland Crop Management)，(2008)SCM-23所推荐的红色和绿色木材之间。最近成熟的包含与成熟叶相邻的略微变红的树皮的嫩枝条被发现导致最佳的生根成功，这些成熟叶具有主动发芽腋芽。
从优选的部分中，选择包括茎和一片健康叶的3-5cm部分的样品。使用在叶(2)上方约0.5cm的对角切割(1)和在叶之下围绕节间(3)的另一个对角切割，切除每个茎部分，避免伤口部位的夹紧或擦伤(参见图3A)。
将每个茶茎插穗的底部浸入1％吲哚-丁酸溶液中，并置于单独的花盆中；种植插穗，其中茎直略倾斜，这样使得叶片不接触土壤。每个花盆以4:1比例包含砂和John Innes1号扦插混合物，这些混合物用水饱和。向每个插穗的切割上表面施用20μl水或20μl的2.5x105cfu/ml的水中的Gd，并且通过用塑料片覆盖每个花盆并用水轻轻喷雾来保持每个样品的湿度。
在3个月生长后，并且为了证实用Gd成功定殖茎插穗，从花盆中取出未接种和接种的茎插穗。将每个插穗被细分为如下部分，这些部分为(a)嫩枝条的顶部，该嫩枝条的顶部包括(图3B)中的接种位点(4)，(b)图3B中的节部分(5)，和(C)下茎部分，该下茎部分包括图3B中的任何根组织(6)。然后将这些部分在液氮中快速冷冻。
根据制造商的方案使用TRIzol试剂从插穗的每个部分(即，图3B中的4、5和6)进行DNA分离，并且进行PCR。进行的PCR反应是由田(Tian)等人，(2009)描述的两步反应；第一步使用GDI-25F(5’-TAGTGGCGGACGGGTGAGTAACG-3’)和GDI-923R(5’-CCTTGCGGGAAACAGCCATCTC-3’)，其扩增包含引物GDI139F(5’TGAGTAACGCGTAGGGATCTG-3’)和GDI916R(5’-GGAAACAGCCATCTCTGACTG-3’)的扩增子的899bp产物，后一步的设计基于在GenBank数据库中可用16S rDNA序列信息。在95℃下初始变性步骤持续3分钟后，执行以下温度曲线32次；在95℃下变性20秒，在55℃下退火45秒，并且在72℃下延伸20秒，其中在72℃下最后延伸步骤为5分钟。然后取一微升这种PCR产物，并将其用作用于使用GDI39F和GDI916R的PCR的第二步骤的模板。在第二轮中对参数的修改包括将退火温度增加到62℃持续15秒，并且将循环数增加到39。在用溴化乙锭染色的1％琼脂糖凝胶上分析PCR扩增产物以及测序以确认产物的一致性(图4)。
有趣的是，在茶插穗的部分4中没有检测到AzGd，表明AzGd在接种后从伤口部位向基部移动，分别在部分5和6中检测到。
测序和随后的BLAST结果证实了对照植物的部分1中看到的条带是所使用的引物组的非特异性结合的结果，在接种组织的部分2和3中观察到的4个条带被鉴定为重氮营养葡糖醋杆菌Pal5(以100％鉴定，86％查询覆盖和7e-04的E值)。结果表明尽管在接种的组织中低拷贝数的AzGd在接种伤口部位后成功地定殖野茶树。这可能是通过Gd定殖多年生植物的第一个实例。
实例3
研究处理对草生物量的影响
使用John Innes 1号堆肥在种子托盘中在植物生长室
Figure BDA0002931149970000121
(23℃/15℃，65％湿度)中使草生长2周。然后将其切割成8cm的高度，并立即使用家用喷雾器喷雾10ml下面所述的处理。
处理
1.水
2.3％蔗糖+0.1％Tween+0.3％阿拉伯胶
3.水+Gd(2.5x 105cfu/ml)
4.水+3％蔗糖+0.1％Tween+0.3％阿拉伯胶+Gd(2.5x 103cfu/ml)
5.水+3％蔗糖+0.1％Tween+0.3％阿拉伯胶+Gd(2.5x 104cfu/ml)
6.水+3％蔗糖+0.1％Tween+0.3％阿拉伯胶+Gd(2.5x 105cfu/ml)
7.水+3％蔗糖+0.1％Tween+0.3％阿拉伯胶+Gd(2.5x 106cfu/ml)
8.水+3％蔗糖+0.1％Tween+0.3％阿拉伯胶+Gd(2.5x 107cfu/ml)
在类似的生长条件下，将草放回Fitotron持续另外2周。在土壤水平下，切割5个随机选择的植物以形成一个样品并称重。将该过程再重复五次，每次处理给出总共六个样品。
将这些样品在烘箱中干燥48小时并称重。
结果示于表5中。这些结果表明，如果存在一些蔗糖以支持Gd的生长，则根据配制品，草的生物量随着Gd的添加而增加。此外，该增加是剂量依赖性的，在2.5x 106cfu/ml下观察到最佳生长。因此，如果处理的草是牧草，其中使生物量最大化是有益的，则这样的剂量可能是有益的。然而，如果处理的草是景观草或草皮草，具有增强的绿色度的较低生物量可以是有益的，因为它可以改进外观而不增加对进一步扦插或割草的需要。在这种情况下，可以使用小于或大于2.5x 106cfu/ml的剂量。
实例4
田间试验
相对于仅用水处理的1m2未接种的切割过的草区(对照)，将包括水+3％蔗糖+0.1％Tween+0.3％阿拉伯胶+Gd(2.5x 105cfu/ml)的配制品施加到单个1m2的切割过的草区上(已建立的黑麦草草皮)。
在草被新鲜切割下的30分钟内，使用家用雾化喷雾器来施用该配制品和水以流出。通过塑料筛保护对照区不受处理区的影响。在下午晚些时候在静止的空气中进行该施用。
使用20cm方形线象限通过计数完全延伸和完全形成的头状花序的数目对1m2区进行二次采样。
将来自每个区中的每个20cm方形的结果取平均值，并且结果示于图6。很明显，以这种方式施用的Gd处理基本上影响花的生长。
实例5
组合物组分的比较
使用包括在该实验中使用的组合物的各个组分的各种组合物重复实例3所述的方法。具体地，用于本实验的组合物如下：
处理
1.水
2.水+Gd(2.5x 105cfu/ml)
3.水+3％蔗糖+0.1％Tween+0.3％阿拉伯胶+Gd(2.5x 105cfu/ml)
4. 0.3％阿拉伯胶+Gd(2.5x 105cfu/ml)
5. 3％蔗糖+Gd(2.5x 105cfu/ml)
6. 0.1％Tween+Gd(2.5x 105cfu/ml)
使AberGlyn草在植物生长室
Figure BDA0002931149970000131
中在23℃/15℃，80％湿度下在JohnInnes 1号土壤中生长2周。用剪刀将草切割成8cm的高度，除去插穗，并立即使用家用喷雾器用10ml处理对该草喷雾。将该草放回植物生长室持续另外两周。
从托盘中随机选择5个植物并合并在一起以制备一个样品并称重。将该过程再重复五次，因此每次处理总共取六个样品。将草在80℃下干燥48小时，并且然后称重。
结果示于表7中。此实验显示所使用的组分确实对草的生长具有影响。在这个实例中，该表面活性剂的干重增加最大。阿拉伯胶显示出仅比对照略有改进，可能是由于如下事实：需要表面活性剂来帮助Gd在植物上扩散并帮助液体进入草的伤口(尽管在这种情况下，该组合没有显示预期的改进)。再次，水+Gd处理类似于对照，因此表明Gd需要添加这些组分中的至少一些以定殖这些伤口。

Claims (29)

1.一种重氮营养葡糖醋杆菌的固氮菌株，其获自英国CABI持有的保藏编号为IMI504958的保藏物或英国CABI持有的保藏编号为IMI 504998的保藏物。
2.一种组合物或试剂盒，其包括如权利要求1所述的菌株。
3.权利要求2所述的组合物或试剂盒，其包括表面活性剂和/或多糖。
4.权利要求2所述的组合物或试剂盒，其包括多糖和表面活性剂。
5.权利要求3或4所述的组合物或试剂盒；其中所述多糖是水胶体多糖。
6.权利要求3至5中任一项所述的组合物或试剂盒；其中所述多糖是阿拉伯胶。
7.权利要求3至6中任一项所述的组合物或试剂盒；其中所述表面活性剂是非离子型洗涤剂。
8.权利要求3至7中任一项所述的组合物或试剂盒；其中所述表面活性剂是Tween表面活性剂。
9.权利要求3至8中任一项所述的组合物或试剂盒；其中所述表面活性剂的70％由脂肪酸油酸组成，并且剩余部分是亚油酸、棕榈酸和硬脂酸的组合。
10.权利要求9所述的组合物或试剂盒；其中所述表面活性剂是Tween 80。
11.权利要求2至10中任一项所述的组合物或试剂盒，其以适合于递送至植物的形式提供。
12.权利要求2至10中任一项所述的组合物或试剂盒；其中所述重氮营养葡糖醋杆菌以干燥或冻干的形式提供。
13.权利要求2至10中任一项所述的组合物或试剂盒，其是适合于在递送至植物之前稀释的浓缩形式。
14.一种植物，其含有权利要求1所述的菌株或者含有权利要求2至13中任一项所述的组合物或试剂盒。
15.权利要求2至13中任一项所述的试剂盒；其中所述重氮营养葡糖醋杆菌与表面活性剂和/或多糖分开提供。
16.权利要求15所述的试剂盒，其具有在分开的容器中的组分。
17.包括将权利要求1所述的菌株递送至植物或者将权利要求2至10中任一项所述组合物递送至植物的方法。
18.权利要求17所述的方法，其用于增加植物的叶绿素水平和/或增加产量。
19.一种组合物或试剂盒；其中所述组合物或试剂盒包括重氮营养葡糖醋杆菌、非离子型洗涤剂和水胶体多糖。
20.权利要求19所述的组合物或试剂盒；其中所述多糖是阿拉伯胶。
21.权利要求19或20所述的组合物或试剂盒；其中所述多糖是阿拉伯胶。
22.权利要求19至21中任一项所述的组合物或试剂盒；其中所述表面活性剂是Tween表面活性剂。
23.权利要求19至22中任一项所述的组合物或试剂盒；其中所述表面活性剂的70％由脂肪酸油酸组成，并且剩余部分是亚油酸、棕榈酸和硬脂酸的组合。
24.权利要求19至23中任一项所述的组合物或试剂盒；其中所述表面活性剂是Tween80。
25.权利要求19至24中任一项所述的组合物或试剂盒，其以适合于递送至植物的形式提供。
26.权利要求19至23中任一项所述的组合物或试剂盒；其中所述重氮营养葡糖醋杆菌以干燥或冻干的形式提供。
27.权利要求19至26中任一项所述的组合物或试剂盒，其是适合于在递送至植物之前稀释的浓缩形式。
28.权利要求19至27中任一项所述的试剂盒；其中所述重氮营养葡糖醋杆菌与表面活性剂和/或多糖分开提供。
29.权利要求19至28中任一项所述的试剂盒，其具有在分开的容器中的组分。
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