UA125991C2 - Спосіб забезпечення рослини азотфіксувальними бактеріями gluconacetobacter diazotrophicus - Google Patents

Abstract

Винахід стосується способу забезпечення рослини азотфіксувальними бактеріями, де спосіб включає поранення рослини, що росте, над рівнем землі на попередньому етапі, який не передбачає введення в рослину азотфіксувальних бактерій, і після попереднього етапу введення азотфіксувальних бактерій у рану рослини, утворену в результаті поранення, де азотфіксувальні бактерії містять Gluconacetobacter diazotrophicus. Також, винахід стосується композиції та набору для забезпечення рослини азотфіксувальними бактеріями, де композиція містить Gluconacetobacter diazotrophicus.

Description

(54) СПОСІБ ЗАБЕЗПЕЧЕННЯ РОСЛИНИ АЗОТФІКСУВАЛЬНИМИ БАКТЕРІЯМИ

СГ ПСОМАСЕТОВАСТЕВ ОПІАХОТВОРНІСИ5 (57) Реферат:

Винахід стосується способу забезпечення рослини азотфіксувальними бактеріями, де спосіб включає поранення рослини, що росте, над рівнем землі на попередньому етапі, який не передбачає введення в рослину азотфіксувальних бактерій, і після попереднього етапу введення азотфіксувальних бактерій у рану рослини, утворену в результаті поранення, де азотфіксувальні бактерії містять С/исопасеїобасієї діагоїгорНісив. Також, винахід стосується композиції та набору для забезпечення рослини азотфіксувальними бактеріями, де композиція містить Списопасеїобасіеєег аіагоїгорнісив.

Галузь винаходу

Даний винахід стосується способу інокуляції рослин азотфіксувальними бактеріями, а також композицій та наборів, придатних для застосування в такому способі.

Рівень техніки

Азотфіксувальну бактерію Сіисопасефобасіег аіагоїгорпіси5, раніше відому як Асейюбасіег діаготорнісив (Сів, М. еї аї. Ійї. У. Бузі. Васіевтіої!. 39:361-364; 1989), вперше виділили з коренів і стебел цукрової тростини (Самаїсапіє, М. А., еї аІ. (1988) Ріапі 5оїЇ Мої. 108, р. 23-31). Шляхом введення "Ма було показано, що (с. діагоїгорпіси5 фіксує азот всередині рослин цукрової тростини (ЗеміЙа, М. єї аї. Мої. Ріапі Містобе Іпіегасі. 14:358-366; 2001; Водавєу, В. М. єї а. Ріапі

Зої! 252:139-149; 2003), і що вона здатна екскретувати майже половину фіксованого азоту в формі, яка є потенційно доступною для рослин (Соіпо, Е. Н еї аІ). Рей. Еиг. Місторіо!Ї. бос.

МісторіоІ. Ген. 106:341-346; 1993). Дана бактерія проникає між клітин меристеми коренів цукрової тростини і в точках росту бічних коренів колонізує міжклітинний простір, а також ксилему, без утворення бульбочок (Чате5, Е. К. еї аЇ. У. Ехр. Вої. 52:747-760; 2001). Були продемонстровані умови, в яких може відбуватись внутрішньоклітинна колонізація бактерією са, що забезпечує можливість фіксації азоту небульбочковими ендосимбіонтами (ЕР-В-1422997 і СосКіпо, Е.С., еї аІ. (2006) Іп Міо СеїІшаг апа ОемеІортепіа! Віоіоду-Ріапі Мої. 42, Мо. 1, р 74- 82). Зокрема, бактерії вводять у середовище для росту рослини, доки рослина проростає, або в межах 7 днів після цього періоду.

У УМО2011/144741 припускається, що такі бактерії, як й, можна вводити у стебла цукрової тростини для поліпшення фіксації азоту. Зрозуміло, що така методика є не єдиною, яку можна використовувати в будь-якій великомасштабній сільськогосподарській технології.

Заявники встановили, що рослини, які ростуть, можна успішно інокулювати азотфіксувальними бактеріями.

Короткий опис винаходу

Відповідно до даного винаходу запропоновано спосіб інокуляції рослини азотфіксувальними бактеріями, при цьому вказаний спосіб включає введення азотфіксувальних бактерій в рану рослини, яка росте.

Було встановлено, що в разі нанесення на рану, зокрема, на поверхню рани в тканині

Зо рослини, подальший ріст рослини поліпшувався. Наприклад, може поліпшуватись показник біомаси або врожайність та/або може збільшуватись кількість квітів. Це може бути зумовлено колонізацією тканини рослини азотфіксувальними бактеріями подібно до того, що описано, наприклад, у ЕР-В-1422997, хоча той факт, що це може відбуватись у разі нанесення таким чином, є несподіванкою. Азотфіксувальні бактерії, які колонізували тканину рослини, можуть бути джерелом внутрішньоклітинного азоту, який поліпшує ріст рослини. Таким чином, спосіб за даним винаходом являє собою корисний засіб уведення препарату, що поліпшує ріст рослини, в рослини, які ростуть.

Азотфіксувальні бактерії переважно мають бути такими бактеріями, які можуть локалізуватися внутрішньоклітинно в рослинній клітині. У конкретному варіанті здійснення ними є симбіотичні азотфіксувальні бактерії Сіисопасефобасієег діаоїгорпіси5 (54), що колонізують внутрішньоклітинно, наприклад, Сіисопасеїобасіег аіаоїгорпіси5, штам ІМІ 504998 (раніше ІМІ 501986) або ІМІ 504958 (раніше ІМІ 504853), кожен з яких депонували в САВІ (Велика Британія) 21 вересня 2012 року та 222 травня 2015 року відповідно. Такі штами є новими та складають додатковий аспект даного винаходу. Альтернативно, азотфіксувальними бактеріями можуть бути бактерії виду НегразрігйЙшт. Інші азотфіксувальні бактерії включають А?7оїобрасіег,

ВеїегіпсКіа, Сіовігідішт, Кпі2обішт, Кіерзіеа та ЗрігПчт Іротегит.

У конкретному варіанті здійснення азотфіксувальні бактерії вводять разом або в комбінації зі штамом Теїтірасійй5, як описано заявниками в міжнародній заявці на патент, що одночасно перебуває на розгляді, яка заявляє пріоритет згідно із заявкою на патент Великої Британії Мо 1400840.3. Заявники встановили, що такий штам може поліпшувати активність азотфіксувальних бактерій. Придатні штами Теггтібасійй5 включають Тегїтгірасійи5 засспагорпіц5,

Тетірасіїйн5 Ппаіорпіїив5, Тетірасійи5 догіепзі5 або Тегтгірасійи5 аідіпдепві5, але, зокрема, являють собою штам ТеїгтірасіШиє засспагорпйи5. Тегпірасійшй5 вводять окремо або в суміші з азотфіксувальними бактеріями. Теггірасійй5 може перебувати у вигляді однорідної суміші з азотфіксувальними бактеріями (і більше того, ІМІ 501986 (нині ІМІ 504998) був класифікований як консорція са та Теїтірасійи5), або її можна вводити у формі спільної культури або змішаної культури.

Рана може бути результатом випадкового або природного пошкодження, при цьому доступність додаткового азоту може сприяти репаративному росту. Однак у конкретному 60 варіанті здійснення рана є результатом пошкодження, спричиненого такими діями, як скошування (газонна трава), зрізання (силосні та сінокосні культури), нарізка живців (банан, ананас, цукрова тростина, сорго, рис, голубиний горох, бавовник, абака, рамі), обрізка (плодові дерева, виткі рослини), поїдання сільськогосподарськими тваринами або збирання врожаю. Інші процеси, такі як боронування, під час якого рослини можуть ненавмисно або не повністю пошкоджуватись, можуть бути непридатними в деяких випадках. Зокрема, рани можуть бути виявлені в "наземній" частині рослини, такій як листя або стебла.

Отже, спосіб за даним винаходом може додатково включати попередню стадію нанесення "пошкодження" рослині, зокрема, шляхом скошування, зрізання, нарізки живців, обрізки або збирання врожаю. Азотфіксувальні бактерії відповідним чином наносять у межах порівняно короткого періоду часу після здійснення таких дій, наприклад, у межах 48 годин, наприклад, у межах 24 годин, як, наприклад, у межах 10 годин, і переважно у межах 1-2 годин з моменту нанесення пошкодження рослині.

Доставку бактерій здійснюють шляхом нанесення придатного складу на ранову ділянку, зокрема, на поверхню рани, в формі композиції. Дана композиція може бути в формі рідини, гелю, пасти, які можна наносити безпосередньо або в розведеній формі, або вона може бути в формі твердої композиції, такої як порошкова або гранульована композиція, яку перед використанням розчиняють у рідині, такій як вода. У твердих композиціях будуть використовуватися бактерії як правило, у висушеній формі, наприклад, у висушеній заморожуванням формі, які можуть бути відновлені шляхом додавання води. У разі необхідності бактерії можна піддати мікроінкапсуляції з використанням відомих з рівня техніки способів для підтримки високої життєздатності та стійкості бактерій.

У конкретному варіанті здійснення дана композиція перебуває в формі, що придатна для нанесення розпиленням на рослини, і, таким чином, буде являти собою концентрат для розведення, який може бути в формі рідини або твердої речовини, зокрема, в формі рідини, або вона може являти собою розведену водну композицію, яку можна безпосередньо наносити розпиленням. Альтернативно, композиція може бути такою композицією, в яку можна занурювати поверхню рани рослини, наприклад, шляхом умочування.

Кількість азотфіксувальних бактерій, які вводять, у будь-якому конкретному випадку буде варіюватись залежно від таких чинників, як тип оброблюваного насіння, конкретний штам

Зо використовуваних азотфіксувальних бактерій, потрібний рівень поліпшення проростання та спосіб уведення, а також потрібний ефект. Однак, як правило, в рани рослини вводять розчин, що містить від 1 до 1 х 107 бактерій на мілілітр композиції, яку наносять, наприклад, від 10 до 103 бактерій на мілілітр композиції, наприклад, від 50 до 200 бактерій на мілілітр композиції та, зокрема, 100 бактерій на мілілітр композиції. Такий розчин можна одержати шляхом культивування бактерій до рівня, який можна легко виявити, наприклад, шляхом вимірювання оптичної щільності з наступним відповідним розведенням розчину.

Заявники встановили, наприклад, що у випадку певних бактерій на ефекти щодо такої властивості, як показник біомаси, впливає кількість бактерій, які наносять дозозалежним чином.

Це означає, що можна вводити різні дози залежно від мети обробки. Наприклад, у випадку трав може знадобитись максимальне збільшення біомаси для пасовищної трави, тоді як у випадку газонної трави або рулонного трав'яного газону переважним може бути повільний ріст. У таких випадках кількість бактерій, які вводять, будуть обирати таким чином, щоб забезпечити оптимальне одержання біомаси цільових видів трав, що проілюстровано на прикладі нижче.

У конкретному варіанті здійснення композиція додатково містить поживну речовину для азотфіксувальних бактерій, наприклад, дана композиція може містити З 95 вага/об'єм сахарози, як описано в документі ЕР-В-1422997.

Азотфіксувальні бактерії можуть бути єдиним активним компонентом в даній композиції, або їх можуть об'єднувати з додатковими агрохімічно активними компонентами, такими як інсектициди, фунгіциди або регулятори росту рослин, якщо це необхідно.

БО Композиція може додатково містити добавки або допоміжні засоби, такі як загусники, диспергувальні засоби, розчинники, зволожувальні засоби, тверді носії тощо, відомі з рівня техніки.

У конкретному варіанті здійснення дана композиція додатково містить полісахарид або прийнятну з погляду сільського господарства поверхнево-активну речовину або їх комбінацію.

У конкретному варіанті здійснення дана композиція додатково містить прийнятну з погляду сільського господарства поверхнево-активну речовину. Наявність поверхнево-активної речовини надає композиції здатність до порівняно вільного плину по всій поверхні ран для полегшення проникнення азотфіксувальних бактерій.

Придатні поверхнево-активні речовини або детергенти включають неіоногенні детергенти, 60 як, наприклад, такі, що реалізуються під торговельною маркою "ТмеепФт, наприклад, Тмееп 80.

Тмееп 80 являє собою неіоногенний детергент; який на 70 95 складається з жирної кислоти - олеїнової кислоти, а решта являє собою комбінацію лінолевої, пальмітинової та стеаринової кислот. Показник рН 195 розчину перебуває в діапазоні від 5,5 до 7,2. Його широко використовують для емульгування і диспергування речовин у медичних і харчових продуктах.

Його активність як антибактеріального засобу несуттєва або відсутня (Оам/узоп еї аї. (1986) Оаїа

Ттог Віоспетіса! Везеєагсп, Зга ед., Охгога Опімегейу Ргез5 (Мем МоїКк, МУ: 1986), р. 289).

Кількість поверхнево-активної речовини, яку вводять в рану рослини, в комбінації з азотфіксувальними бактеріями (а також необов'язково з полісахаридом, як додатково описано нижче) має бути достатньою для отримання ефекту поліпшеного росту рослини. Вона буде варіюватись залежно від різних чинників, таких як конкретна поверхнево-активна речовина, тип рослини, яку обробляють, походження рани, конкретний штам задіяної азотфіксувальної бактерії та спосіб уведення. Однак, як правило, композиція містить від 0,0005 до 10 95 об'єм/об'єм, як, наприклад, від 0,0005 до 0,595 об'єм/об'єм, наприклад, від 0,0005 до 1 95 об'єм/об'єм, в тому числі від 0,0005 до 0,2 95 об'єм/об'єм, наприклад, від 0,0005 до 0,15 95 об'єм/об'єм і, зокрема, приблизно 0,1 95 об'єм/об'єм.

У додатковому варіанті здійснення дана композиція містить полісахарид. Придатні для використання в даній композиції полісахариди включають гідроколоїдні полісахариди, отримані з джерел рослинного, тваринного або мікробного походження.

Зокрема, вони включають полісахариди, що виділяються у вигляді камеді, такі як аравійська камедь, камедь гхаті, камедь карайї та трагакантова камедь, похідні целюлози, такі як карбоксиметилцелюлоза, метилцелюлоза, гідроксипропілцелюлоза, гідроксипропілметилцелюлоза або мікрокристалічна целюлоза, види крохмалю та їх похідні, що включають, наприклад, кукурудзяний крохмаль, маніоковий крохмаль, картопляний крохмаль, рисовий крохмаль, пшеничний крохмаль та їх модифіковані варіанти, такі як прежелатинізований крохмаль, окиснений крохмаль, етилований крохмаль, декстрини або мальтодекстрин з крохмалю, пектин, полісахариди, одержані з морських водоростей, такі як агар, альгінати, карагінан і фурцеларан, камеді з насіння, такі як гуарова камедь і камедь бобів ріжкового дерева, полісахариди, одержані шляхом мікробіологічної ферментації, такі як ксантанова камедь і геланова камедь, а також азотовмісні полісахариди, такі як хітозан; або їх

Зо суміш.

У конкретному варіанті здійснення полісахарид являє собою полісахарид, що виділяється у вигляді камеді, такий як аравійська камедь, камедь гхаті, камедь карайї або трагакантова камедь. Конкретним прикладом полісахариду є аравійська камедь.

Аравійська камедь являє собою природну камедь, яку збирають у вигляді продуктів виділення різних видів акацієвих дерев (Рапд еї а). 2010 (2010) ВіотоїІесшіев: 11, 1398-1405); вона являє собою складний полісахарид, який інтенсивно використовували в широкому діапазоні галузей промисловості, в тому числі в лакофарбовій, клейовій, фармацевтичній, текстильній та харчовій галузях. Вважають, що аравійська камедь з дерева акації являє собою розгалужений полімер галактози, рамнози, арабінози та глюкуронової кислоти у вигляді кальцієвої, магнієвої та калієвої солей з молекулярною масою приблизно 250000. Було продемонстровано (Вадаг, К.М. еї аї. (2011) Кесепі Кезеагсі іп бсіепсе апа Тесппоїоду З (5) 6-7), що замочування насіння певних рослин у 1 95 розчині аравійської камеді протягом 24 годин до пророщування чинить ефект щодо проростання насіння. Крім того, в документі У/О02/058466 повідомляється, що певні композиції, які містять комбінації полісахаридів і пептидів, здатні збільшувати врожайність культур.

Кількість полісахариду, який уводять в рану рослини, має бути достатньою для отримання ефекту поліпшеної фіксації азоту, якщо це здійснюють у комбінації з азотфіксувальними бактеріями, а також необов'язково з поверхнево-активною речовиною. Вона буде варіюватись залежно від різних чинників, таких як конкретний полісахарид, що використовується, тип рослини, яку обробляють, походження рани, конкретний штам задіяної азотфіксувальної бактерії та спосіб уведення. Однак, як правило, використовують композицію, що містить від 0,1 до 1 95 вага/вага, наприклад, від 0,1 до 0,5 95 вага/вага і, зокрема, приблизно 0,3 95 вага/вага полісахариду.

В одному варіанті здійснення композиція містить як полісахарид, так і прийнятну з погляду сільського господарства поверхнево-активну речовину. Було встановлено, що в деяких випадках ці компоненти поліпшують ефект азотфіксувальних бактерій, і, очевидно, діють синергічно з отриманням більш значного поліпшення. Рослини, які обробляли композицією, що містить ці компоненти, можуть демонструвати збільшення темпів росту, що підтверджується збільшенням сухої ваги оброблених рослин. 60 Нові композиції, які містять вказані вище компоненти, складають додатковий аспект даного винаходу. Таким чином, у додатковому аспекті даного винаходу запропоновано прийнятну з погляду сільського господарства композицію, яка містить азотфіксувальні бактерії, зокрема,

СіІисопасеїйобасіег діа7оїгорпісив, і полісахарид, поверхнево-активну речовину або їх комбінацію.

Азотфіксувальні бактерії, описані вище, та, зокрема, СіІисопасеїобрасіег аїіаоїгорпіси5 відповідним чином присутні в описаних вище кількостях. Аналогічно, полісахарид являє собою описаний вище полісахарид, такий як полісахарид, що виділяється у вигляді камеді, наприклад, аравійську камедь, і вона включена в композицію в описаній вище кількості, наприклад, у концентрації від 0,1 до 1 95 вага/вага полісахариду. Крім того, поверхнево-активна речовина являє собою переважно поверхнево-активну речовину, описану вище, таку як неіоногенний детергент, наприклад, поверхнево-активну речовину, яка на 70 95 складається з жирної кислоти - олеїнової кислоти, а решта являє собою комбінацію лінолевої, пальмітинової та стеаринової кислот. У конкретному варіанті здійснення дана композиція буде містити від 0,0005 до 10 95 об'єм/об'єм поверхнево-активної речовини, наприклад, від 0,0005 до 0,295 об'єм/об'єм поверхнево-активної речовини.

У ще одному додатковому аспекті в даному винаході запропоновано набір для одержання прийнятної з погляду сільського господарства композиції, яка містить азотфіксувальні бактерії.

В таких наборах азотфіксувальні бактерії, та, зокрема, Сіисопасефобасіег діаоїгорпіси5, можна зберігати окремо від інших компонентів композиції, наприклад, в окремих контейнерах або в упаковці або контейнері, що складається з двох частин. Азотфіксувальні бактерії можна висушувати заморожуванням. Інші компоненти можуть бути в формі концентрату, для зручності зберігання або транспортування, готового до розведення, наприклад, водою перед використанням. Концентрати такої природи будуть містити ті ж самі компоненти, що в перелічених вище композиціях, але зазвичай на вищих рівнях. Таким чином, наприклад, концентрат може містити від 1 до 10 95 вага/вага, наприклад, від 1 до 5 95 вага/вага та, зокрема, приблизно З 95 вага/вага полісахариду, при цьому десятиразове розведення дасть в результаті композицію, придатну для використання, наприклад, у способі за даним винаходом. Аналогічно, поверхнево-активна речовина може міститися в концентраті в кількості від 0,005 до 2 95 об'єм/об'єм. Інші компоненти, такі як, наприклад, поживна речовина для азотфіксувальних бактерій, переважно включені в концентрат у потрібній концентрації.

Зо Набори такого типу можна використовувати для одержання композиції за даним винаходом, яку можна відразу ж використовувати. Зокрема, будь-який концентрат розводять водою до відповідного об'єму, після чого до нього відразу додають азотфіксувальні бактерії.

Даний винахід забезпечує можливість нанесення на широкий діапазон культур і доставку в нього внутрішньоклітинних бактерій, що здійснюють фіксацію азоту. Зокрема, цими культурами можуть бути багаторічні, дворічні або відновлювані однорічні культури, що включають без обмеження плодові дерева та чагарники (наприклад, рослини чорниці, малини і чайного куща), виткі рослини, фуражні культури (люцерну та траву для силосування, сінокосу або безпосереднього поїдання сільськогосподарськими тваринами), газонну траву та рослини, що утворюють живі огорожі, лісові культури, садові культури та трав'янисті рослини (наприклад, цибулю-скороду, аспарагус, баклажан).

Раніше було повідомлено, що са може поліпшувати врожай багатих на сахарозу культур, таких як цукровий буряк або цукрова тростина (ММО2010/022517). Однак заявники встановили, що у випадку використання препарату за даним винаходом поліпшення спостерігали для культур, не багатих на сахарозу, що складає конкретний варіант здійснення даного винаходу.

У конкретному варіанті здійснення спосіб і композицію за даним винаходом застосовують щодо трави, такої як газонна трава, рулонний трав'яний газон або пасовищна трава, відразу або незабаром після скошування. Використання цього препарату приводить до поліпшення росту трави, що підтверджується збільшенням сухої ваги інокульованої трави порівняно з неінокульованою. Очевидно, що азотфіксувальні бактерії здатні проникати в траву крізь рани, які є результатом процедури скошування, та колонізують трави внутрішньоклітинно, що приводить до поліпшення характеристик росту.

Крім того, було встановлено, що колонізація з використанням а може підвищувати рівні хлорофілу в рослинах та, зокрема, у видах трави, таких як пасовищна, газонна трава або рулонний трав'яний газон. Підвищення рівня хлорофілу пов'язане не тільки з вмістом азоту, але також і з рівнем зеленості рослин, при цьому дана властивість є особливо бажаною в таких застосуваннях, як щодо газонної трави, у якої високі рівні зеленості є корисними.

Детальний опис винаходу

Далі даний винахід буде більш детально описаний за допомогою прикладів з посиланням на діаграми, що додаються, на яких: бо фігура 1 являє собою графік, на якому продемонстровані середні значення сухої ваги (г)

неінокульованої та інокульованої зрізаної трави; фігура 2 являє собою графік, на якому продемонстровані показники сухої ваги наземної частини інокульованої зрізаної трави, яку обробляли (30 та сахарозою, Тмжмееп та/або аравійською камеддю або їх комбінаціями; на фігурі З проілюстровано приклад підготовки до вегетативного розмноження чайного куща, де на (А) зображено видалений живець, а на (В) у вигляді діаграми представлені відрізки кожного живця, який відібрали для виділення ДНК; на фігурі 4 продемонстроване зображення гелю з продуктами ПЛР, одержаними зі зразків чайного куща, які інокулювали с; всі продукти зі смуг, що відповідали контрольним рослинам, піддавали секвенуванню та підтверджували у вигляді неспецифічного зв'язування. Секвеновані продукти зі смуг, що відповідають інокульованим рослинам, підтверджували як ті, що належать до Сіисопасейобасіег аіа7оїгорпісив; фігура 5 являє собою графік, на якому продемонстровані ефекти різних препаратів щодо показників біомаси зрізаної трави; на фігурі 6 продемонстровані результати тесту для визначення ефекту Сй щодо кількості квіткових голівок у трави; і фігура 7 являє собою графік, на якому продемонстровані результати обробок різними композиціями стосовно показників біомаси зрізаної трави.

Однак спеціалісту в даній галузі буде очевидно, що точні подробиці не потрібні для практичної реалізації даного винаходу. Наступний опис конкретних варіантів здійснення даного винаходу представлений для цілей ілюстрації та опису. Вони не призначені для того, щоб бути вичерпними або обмежувати даний винахід точними розкритими формами. Очевидно, що можливими є багато модифікацій і варіацій у світлі описаних вище ідей. Варіанти здійснення продемонстровані та описані для того, щоб найкращим чином пояснити принципи даного винаходу та його практичного застосування, щоб тим самим надати можливість іншим спеціалістам у даній галузі найкращим чином використати даний винахід і різні варіанти здійснення з різними модифікаціями, які підходять для конкретного наміченого використання.

Приклад 1

Нанесення на зрізану траву

Методика

Культивування 0. аіагоїгорпісив5 о. аіаоїгорпіси5, штам ІМІ 501986 (нині ІМІ 50998), з плазмідою рКО5561, що експресує вИи5, культивували на середовищі АТОИЗ (0,8 95 (вага/об'єм) агар, дріжджовий екстракт (2,7 г "л7), глюкоза (2,7 гл"), маніт (1,8 гл"), буфер МЕЗ (4.4 гл"), К"НРОХ (4,8 гл") та КНгРО» (0,65 гл), рН 6,5) відповідно до вимог. Експресію гена Б-глюкуронідази (ди5А) тестували шляхом посіву на середовище АТОИ5, що містить Х-С1ІШс (5-бром-4-хлор-3-індоліл-бета-О-глюкуронової кислоти циклогексиламонійну сіль) при 50 мг:л'"!; утворення темно-синіх колоній вказувало на експресію гена дизА.

Процедури інокуляції

Водну суспензію 0. аіа2оїгорпіси5 готували з отриманням оптичної щільності при 600 нм в 11, що відповідає приблизно 109 колонієутворювальних одиниць (СЕ) на мілілітр. Число СЕУ визначали шляхом серійного розведення, посіву на середовище АТОИЗ (з додаванням у разі необхідності антибіотиків) та підрахунку колоній бактерій після 4 днів інкубування в чашках

Петрі (28 "С, у темряві). Суспензію розводили до 107 з одержанням розчину, що містить приблизно 100 бактерій на мл, готового для нанесення розпиленням, як описано нижче.

Стандартну наважку з 0,5 г насіння трави І оЇїшт регеппе сорту Саззіореєїа висівали в касети для розсади з компостом ЧЩопп Іппев Ме 1 і трохи вкривали компостом.

Окремі касети розміщували в касети більшого розміру та забезпечували відповідною кількістю води в кімнаті для вирощування з циклом день/ніч 21 "С/15 "С, 16/8 год. протягом 20 днів. Після цього траву зрізали на висоті 2 см над рівнем грунту з використанням ножиць (обрізки видаляли), і наносили наступні препарати за допомогою побутового ручного дрібнокраплинного розпилювача.

Експеримент 1. Препарати

Контроль з водою « З 95 сахарози са я вода ях З 95 сахарози

Експеримент 2. Препарати са з вода са я вода ях З 95 сахарози са я вода я 0,1 95 Тмееп 60 са я вода ях 0,3 95 аравійської камеді са я вода «ж З 95 сахарози я 0,1 95 Гуееп са я вода ях З 95 сахарози я 0,3 95 аравійської камеді са я вода ях З 95 сахарози я 0,1 95 Гуееп--0,3 95 аравійської камеді

Суха вага паростків

Паростки діставали з агару пінцетом, і відмивали весь агар, що залишився на коренях.

Кожний паросток поміщали в паперовий мішок та поміщали в піч при 80 "С на 48 годин, а потім зважували.

Результати експерименту 1 та експерименту 2 продемонстровані відповідно на фігурах 1 та 2.

Результати на фігурі 1 демонструють суттєве збільшення середнього значення сухої ваги трави (на графіку: 0,09676 г для неінокульованої і 0,1276 г для інокульованої). Ці показники сухої ваги значущо відрізнялись при Р « 0,01. Таким чином, інокуляція в такий спосіб очевидно приводить до значного поліпшення росту.

Результати, продемонстровані на фігурі 2, показують значущі відмінності (Р « 0,001) між са/5/1/5А і наступними найвищими показниками сухої ваги (с5а/1) ї са/5/ї, демонструючи синергічний ефект комбінації з трьох компонентів. са ї («а/5 значущо не відрізнялись при

Р-0,05.

Приклад 2

Колонізація чайного куща (СатейЦа в5іпеп5із) з використанням СіІисопасейфобасіег діагоморпісив (Агоїїсив)

Вегетативне розмноження зі стеблового живця

Стандартним способом вегетативного розмноження клонів чайного куща є використання живця з одним листком. З більших стебел, що мають приблизно від чотирьох до шести вузлів і апікальні клітини, відбирали частини стебла та листя, виходячи зі стану тканин (тобто відсутності комах і захворювань). Ділянки, відібрані для відрізання, розташовувались між ділянками червоної та зеленої деревини, як рекомендовано в Уатавакі еї аїЇ. ої апа Стор

Мападетенпі, (2008) 5СМ-23. Було встановлено, що нещодавно дозрілі пагони, які містять трохи забарвлену в червоний колір кору, прилеглу до зрілого листя з пазушними бруньками, що активно розвиваються, є найкращими з погляду вкорінення.

З бажаних частин відбирали зразки, що містять частину стебла завдовжки 3-5 см і один здоровий листок. Кожну частину стебла вирізали шляхом здійснення діагонального надрізу (1) приблизно на 0,5 см вище листка (2) та другого діагонального надрізу нижче листка поблизу міжвузля (3), уникаючи здавлювання або сплющування ранової ділянки (див. фігуру ЗА).

Нижню частину кожного стеблового живця чайного куща занурювали в 195 розчин індолілмасляної кислоти та висаджували в окремі горщики; при цьому живці висаджували таким чином, щоб стебло приймало пряме або трохи нахилене положення, не торкаючись листом грунту. Кожний горщик містив суміш для живців із піску та компосту Щдопп Іппе5 номер 1 у співвідношенні 4:1, просочену водою. На відрізані верхівки кожного живця наносили 20 мкл води або 20 мкл са при 2,5 х 105 СЕШО/мл у воді, при цьому вологість для кожного зразка підтримували шляхом накривання кожного горщика пластиковим листом і окроплення невеликою кількістю води.

Після З місяців вирощування, з метою підтвердження успішної колонізації стеблових живців з використанням са, неінокульовані та інокульовані стеблові живці діставали з горщиків.

Кожний живець розділяли на частини, які являли собою (а) верхівку пагона, що містить ділянку інокуляції (4), на (фігурі ЗВ), (Б) вузлову частину (5) на фігурі ЗВ та (С) нижню частину пагона, що містить будь-яку тканину кореня (6), на фігурі ЗВ. Ці частини потім піддавали швидкому заморожуванню в рідкому азоті.

Виділення ДНК з кожної частини живця (тобто 4, 5 і б на фігурі ЗВ) здійснювали з використанням реагенту ТКІ20! відповідно до протоколу виробника, та проводили ПЛР. Реакцію

ПЛР проводили у вигляді двостадійної реакції, описаної в публікації Тіап еї. аї., (2009); на першій стадії використовували 50І-25Е (5-ТАатасСа,асАСасатаАатТААС(а-3" і 0І-9238 (5-ссттаспапАААСАасССАТСТО-3"), які під час ампліфікації давали продукт розміром 899 п.о., що містив амплікон для праймерів З0І139Е (5-ТтаАдаТтААСасатТАаасАТСТа-3") і

ОрІіЯ16К (5-4сАААСАасССАТСТСТОИаАСТа-3, при цьому останні конструювали на основі інформації про послідовність 165 рДНК, доступної в базі даних СепВапк. Після початкової стадії денатурації при 95"С протягом З хвилин наступний температурний профіль повторювали 32 рази; денатурація протягом 20 секунд при 95"С, відпал протягом 45 секунд при 5570 та подовження протягом 20 секунд при 72"С з кінцевою стадією подовження протягом 5 хвилин при 72"С. Один мікролітр цього продукту ПЛР відбирали та використовували як матрицю для другої бо стадії ПЛР з використанням С0ІЗОЕ та С0І916К. Модифікації параметрів на другому раунді включали підвищення температури відпалу до 62"С протягом 15 секунд і збільшення числа циклів до 39. Продукти ампліфікації ПЛР аналізували в 1 95 агарозному гелі, забарвленому бромідом етидію, а також секвенували для підтвердження ідентичності продукту (фігура 4).

Цікаво, що А?;бСа не виявляли в частині 4 живця чайного куща, що вказує на те, що А?;са переміщалася базипетально від ранової ділянки після інокуляції, але при цьому виявляли відповідно в частинах 5 і 6.

Секвенування та наступні результати, отримані за допомогою ВІАЗТ, підтвердили, що смуги, видимі для частини 1 контрольних рослин, були результатом неспецифічного зв'язування наборів використовуваних праймерів, при цьому 4 смуги, які спостерігали для частин 2 та З інокульованої тканини, були ідентифіковані як ті, що належать до СІисопасеїобасієег діа7оїгорпіси5 Раб (за ідентифікації 10095, покриття 8695 та Е-величини 7е-04). Дані результати свідчать про те, що А?;54, навіть за низького числа копій в інокульованій тканині, успішно колонізувала Сатеїіа 5іпеп5і5 після інокуляції в ранову ділянку. Ймовірно, це являє собою перший приклад колонізації багаторічної рослини з використанням са.

Приклад З

Дослідження ефекту препарату щодо показників біомаси трави

Траву вирощували в камері для вирощування рослин (БйоїгопФ) (23 "С/15 С за вологості 65 95) в касетах для розсади з використанням компосту Уопп Іппе5 Мо 1 протягом 2 тижнів. Траву потім зрізали на висоті 8 см, і на неї відразу ж наносили розпиленням 10 мл препарату, склад якого викладено нижче, з використанням побутового розпилювача.

Препарати 1. Вода 2. З У сахарози яз 0,1 95 Гуееп--0,3 95 аравійської камеді 3. Вода ж са (2,5 х 105 СЕШ/мл) 4. Вода -- 3 95 сахарози «ж 0,1 95 Пуееп--0,3 95 аравійської камеді я (за (2,5 х 103 СЕО/мл) 5. Вода ях З 95 сахарози - 0,1 95 Пувеп--0,З 95 аравійської камеді - са (2,5 х 105 СЕШ/мл) 6. Вода -- З 95 сахарози я 0,1 95 Тм'єєп--0,3 95 аравійської камеді ж са (2,5 х 105 СЕО/мл) 7. Вода я З 95 сахарози ж 0,1 95 Пувеп--0,З 95 аравійської камеді - са (2,5 х 106 СЕШ/мл) 8. Вода я З 95 сахарози - 0,1 95 Пувеп--0,З 95 аравійської камеді - са (2,5 х 107 СЕШ/мл)

Зо Траву повертали в Рійоїгоп на наступні 2 тижні з аналогічними умовами для росту. 5 рослин, що відбирали випадковим чином, зрізали на рівні грунту з формуванням одного зразка та зважували. Це повторювали ще п'ять разів з одержанням в цілому шести зразків, що відповідають кожному препарату.

Ці зразки висушували в печі протягом 48 годин і зважували.

Результати продемонстровані на фігурі 5. Дані результати демонструють те, що за умов наявності деякої кількості сахарози, яка забезпечує підтримання росту й, біомаса трави збільшувалась із додаванням (34 залежно від складу. Більше того, збільшення було дозозалежним, при цьому оптимальний ріст спостерігали при 2,5 х 106 СЕШ/мл. Таким чином, така доза може бути корисною, якщо трава, що підлягає обробці, являє собою пасовищну траву, для якої максимальне збільшення біомаси є корисним. Однак, якщо трава, що підлягає обробці, являє собою газонну траву або рулонний трав'яний газон, нижчий показник біомаси з поліпшеною зеленістю може бути корисним в плані поліпшення зовнішнього вигляду без зростання потреби в додатковому зрізанні або скошуванні В даному випадку можна використовувати дозування, що становить менше або більше 2,5 х 105 СЕО/мл.

Приклад 4

Польове випробування

Склад, що містить воду ж З 95 сахарози ж 0,1 95 Гуееп--0,3 95 аравійської камеді - са (2,5 х 105 СЕШ/мл), наносили на окрему ділянку зрізаної трави площею 1 м: (стандартний газон на основі І оїїшт регеппе), порівнюючи з ділянкою неінокульованої зрізаної трави площею 1 м, яку обробляли тільки водою (контроль).

Склад і воду наносили в межах 30 хвилин після скошування трави з використанням для роботи побутового дрібнокраплинного розпилювача. Контрольну ділянку відгороджували від оброблюваної ділянки за допомогою пластикової перегородки. Нанесення здійснювали ближче до вечора в безвітряну погоду.

На ділянках площею 1 м? формували підвибірки з використанням дротяної сітки з квадратами площею 20 см шляхом підрахунку кількості повністю розгорнутих і повністю сформованих квіткових голівок.

Результати для кожного квадрата площею 20 см на кожній ділянці усереднювали, і дані результати продемонстровані на фігурі 6. Очевидно, що препарат на основі са, який наносять бо таким чином, значною мірою впливає на ріст квіток.

Приклад 5

Порівняння компонентів композиції

Спосіб із прикладу З повторювали з використанням різних композицій, що містили окремі компоненти композиції, яку використовували в тому експерименті. Більш конкретно, в даному експерименті використовували наступні композиції.

Препарати 1. Вода 2. Вода ж са (2,5 х 105 СЕШ/мл) 3. Вода «З 95 сахарози я 0,1 95 Гм/єеп--0,3 95 аравійської камеді - са (2,5 х 105 СЕШ/мл) 4. 0,3 95 аравійської камеді ж- а (2,5 х 105 СЕШ/мл) 5. З 965 сахарози ж са (2,5 х 105 СЕИО/мл) 6. 01 95 Тмеепьса (2,5 х 105 СЕО/мл)

Траву АбегОїуп вирощували в грунті з компостом ЧУопп Іппе5 Мо 1 протягом 2 тижнів у камері для вирощування рослин (ЕйоїгопФ)) при 23/15 "С, вологості 80 95. Траву зрізали на висоті 8 см з використанням ножиць, видаляли обрізки, та на траву відразу ж наносили розпиленням 10 мл препарату з використанням побутового розпилювача. Траву повертали в камеру для вирощування рослин і залишали на наступні два тижні.

Випадковим чином відбирали п'ять рослин з касети, їх об'єднували для одержання одного зразка та зважували. Це повторювали ще п'ять разів з тим, щоб в цілому одержати шість зразків, що відповідають кожному препарату. Траву сушили протягом 48 годин при 80 "С, а потім зважували.

Результати продемонстровані на фігурі 7. Цей експеримент продемонстрував, що використовуваний компонент чинив ефект щодо росту трави. В цьому прикладі поверхнево- активна речовина забезпечувала найбільший приріст сухої ваги. Аравійська камедь продемонструвала лише незначне поліпшення порівняно з контролем, імовірно внаслідок того факту, що поверхнево-активна речовина може бути необхідною для сприяння поширенню са в рослині та допомагає рідині проникати в рани трави (хоча в цьому випадку комбінація не демонструвала очікуваного поліпшення). Ефективність препарату вода жї Са знову-таки була подібною до контролю, що вказує на те, що для колонізації ран ба потребує додавання щонайменше деяких із даних компонентів.

Claims (26)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Спосіб забезпечення рослини азотфіксувальними бактеріями, де спосіб включає поранення рослини, що росте, над рівнем землі на попередньому етапі, який не передбачає введення в рослину азотфіксувальних бактерій, і після попереднього етапу введення азотфіксувальних бактерій у рану рослини, утворену в результаті поранення, де азотфіксувальні бактерії містять сіисопасегобасіег аіагоїгорнісив.

2. Спосіб за п. 1, де поранення рослини включає поранення стебла або листка рослини.

3. Спосіб за п. 1 або п. 2, де попередній етап включає поранення рослини, що росте, шляхом косіння, зрізання, обрізання, споживання худобою або збирання врожаю.

4. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, де азотфіксувальні бактерії вводять протягом 48 годин від зазначеного попереднього етапу.

5. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, де азотфіксувальні бактерії вводять у вигляді сільськогосподарсько прийнятної композиції або набору.

6. Спосіб за п. 5, де композиція або набір додатково крім азотфіксувальних бактерій містить полісахарид та/або поверхнево-активну речовину.

7. Спосіб за п. 6, де поверхнево-активна речовина є неіонним детергентом.

8. Спосіб за п. 7, де поверхнево-активна речовина на 70 95 складається з жирної олеїнової кислоти, а решта є комбінацією лінолевої, пальмітинової та стеаринової кислот.

9. Спосіб за будь-яким з пп. 6-8, де полісахарид є гідроколоїдним полісахаридом.

10. Спосіб за п. 9, де полісахарид є полісахаридом, що виділяється у вигляді камеді.

11. Спосіб за п. 10, де полісахаридом, що виділяється у вигляді камеді, є аравійська камедь.

12. Спосіб за будь-яким з пп. 6-11, де композиція або набір містить як полісахарид, так і поверхнево-активну речовину.

13. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, де рослина є багаторічною, дворічною або відновлюваною однорічною рослиною.

14. Спосіб за п. 13, де рослина є плодовим деревом, кущем, виноградною лозою, кормовою культурою, травою, живоплотом, лісовою рослиною, садовою рослиною або трав'янистою (516) рослиною.

15. Сільськогосподарсько прийнятна композиція для забезпечення рослини азотфіксувальними бактеріями, де композиція містить С/исопасеїобасієї аіагогорнісив, неіїонний детергент та полісахарид.

16. Композиція за п. 15, де полісахарид є гідроколоїдним полісахаридом.

17. Композиція за п. 15, де полісахарид є полісахаридом, що виділяється у вигляді камеді.

18. Композиція за п. 17, де полісахарид, що виділяється у вигляді камеді, є аравійською камеддю.

19. Композиція за будь-яким з пп. 15-18, де поверхнево-активна речовина на 70 95 складається з жирної олеїнової кислоти, а решта є комбінацією лінолевої, пальмітинової та стеаринової ее

20. Композиція за будь-яким з пп. 15-19, яка додатково містить поживну речовину для зазначених азотфіксувальних бактерій.

21. Набір для забезпечення рослини азотфіксувальними бактеріями, де набір містить списопасеїобасіеєег діагоїгорнісив, неіонний детергент та полісахарид.

22. Набір за п. 20, де неіонний детергент та полісахарид є такими, як вказано у будь-якому з пп. 16-20.

23. Набір за пп. 20-21, де азотфіксувальні бактерії знаходяться в ліофілізованій формі.

24. Набір за будь-яким з пп. 21-23, що містить один або більше компонентів у концентрованій формі для розведення перед використанням.

25. Штам Суийисопасеїобасієг аіа7огорнісив, внесений згідно з Будапештським договором у САВІ у Великобританії, з депозитарним номером ІМІ 504958, для підсилення росту рослин.

26. Штам СсСуисопасеїобасієг аіа7огорнісив, внесений згідно з Будапештським договором у САВІ у Великобританії, з депозитарним номером ІМІ 504998, для підсилення росту рослин. і урза 3 Показники сухої ваги маговеної частими зрізаної тевем, вну збройляли 5 : « пля 1 : х : ж : Її пах х В пВ ; о. ! КО : й У ! ' о. | . З і ДЕ о. о : дрон МНН ол НН ння Неїнокульсвані інвкжльсяав: :

Фкура показни суКОї аг мазимної «аотини інакульвииної ПЕ зрізаної трави Ф дл ПІЦ ПИТ хв Б ЕВАНС Ж КЕ БО У і оОлик п Б. КЗ ї. Ж перо : Х Я що : : ми не ни: нн нн Я я їУ -ї М 5 х їх Її й С У Кі З ШИК: її КЯ - Фігура З ше ши . Зх ши и КК КК м Фк МКК са ї Б й хм сх М а СВ. ї Що роюхюх З Ж одндккннкцялікінтякх Я - ке УКВ о яко У й до КК КН В Кк 5 Ко ОК тро ї хо с ш хх ї че х хх Фігура й є її ОО в ОО я МУ ОХ І о - м ЕМО а с КК о. о. СК с ОМ ях ох х х хх хх х Зх ОХ ОО БО с

В о. я о» с ОО В с нура З Гераодних знаемик суки! я ПАК х І . ше ше ще шк ке що що ! І й піневр і Й І і ФнУва й о. Кількість нвітнових голівок інонульонаної зрізаної трави ІЕЕ ОООБ о о. : х Ковтволь інвиуинеовині Фігура У пає й Й ій ї 5оовак о Бода Бадуой ся кр З МИ Ки превувах 000 Компютернаверстка!, Скворцова.дГ (00000000 ДП "Український інститут інтелектуальної власності", вул. Глазунова, 1, м. Київ - 42, 01601