KR20050026543A

KR20050026543A - 항-인테그린 활성을 갖는 플루오로알킬사이클로펩티드유도체

Info

Publication number: KR20050026543A
Application number: KR1020057001696A
Authority: KR
Inventors: 달포초알마; 잔니니주세페; 피사노클라우디오
Original assignee: 씨그마-토 인더스트리에 파마슈티체 리유니테 에스. 피. 에이.
Priority date: 2002-07-29
Filing date: 2003-07-18
Publication date: 2005-03-15
Also published as: HK1079218A1; DK1539803T3; US20060205637A1; EP1539803A2; ITRM20020402A1; WO2004011487A2; ES2282690T3; JP2006515563A; MXPA05001065A; ITRM20020402A0; WO2004011487A3; SI1539803T1; PL374607A1; DE60312178D1; WO2004011487A8; PT1539803E; DE60312178T2; CA2486795A1; BR0311667A; EP1539803B1

Abstract

하기의 화학식 1 의 화합물은

[화학식 1]

사이클로[NX₁-R₁-CO-NX₂-R₂-CO-NX₃-R₃-CO-NX ₄-R₄-CO-NX₅-R₅-CO],

(여기에서 하나 이상의 x-플루오로알킬화 아미노산이 존재함)

인테그린, 특히 α_vβ₃ 및 α_vβ₅패밀리에 속하는 것들의 저해제이고, 따라서 특히 망막병증, 급성 신부전, 골다공증 및 암전이와 같은 비정상적 혈관생성과 관련된 질병의 치료를 위한 의약으로서 유용하다. 본원에 기재된 화합물은 또한 적절히 표지되면, 진단시약으로써, 특히 작은 종양 덩어리 및 동맥폐쇄 현상의 감지 및 위치 확인에 유용하다.

Description

항-인테그린 활성을 갖는 플루오로알킬사이클로펩티드 유도체{FLUORO-ALKYL-CYCLOPEPTIDE DERIVATIVES HAVING ANTI-INTEGRIN ACTIVITY}

본원에 기재된 본 발명은 항-인테그린 활성을 갖는 플루오로알킬사이클로펩티드 유도체에 관한 것으로, 특히 하기의 화학식 1 에서 나타내는 바와 같이 펩티드결합 상에 존재하는 질소원자 및/또는 α-탄소원자 위치에 플루오로알킬기를 갖고 있는 사이클릭 펩티드 화합물에 관한 것이다. 하기의 본 발명은, 또한 상기 화합물의 제조방법, 특히 인테그린 수용체의 저해제로서, 항-혈관생성 및 항-암전이제로서 유용한 의약으로서의 그의 용도 및 이들을 함유하고 있는 약학 조성물에 관한 것이다.

인테그린은 세포부착현상 (cell adhesion phenomenon) 에 관여하는 수용체의 한 클래스이다. 이들은 α, β 두 서브유니트로 이루어진 당단백질로서, 이들 서브유니트가 조합하여 서로 다른 패밀리를 형성한다. 보다 자세한 사항은 [Kessler, H., et al., Angrew. Chem. Int. Ed. Engl., 1997, 36, 1374-89.]을 참조한다.

비록 각각의 인테그린은 상이한 트리펩티드 구조 (conformation) 를 우선적으로 인식하지만, 모든 인테그린은 3-문자 기호로는 Arg-Gly-Asp, 1-문자 기호로는 RGD 로 알려진 일반적인 펩티드 서열을 인식할 수 있는 "보편적인 세포 인식 부위(universal cell recognition site)" 를 갖고 있다 (Kessler, H., et al., J. Am. Chem. Soc., 1996, 118, 7461-72).

β₁ 인테그린 패밀리는 조직 편제에 중요한 역할을 하며, β₂ 인테그린은 면역체계에서 중요한 반면, β₃ 인테그린은 혈액응고 과정 및 혈관생성을 조절한다.

약품제조 화학의 한 목적은 인테그린 패밀리와 상호작용할 수 있으나, 그들 각각이 생리병리학적 수준에서 수행하는 역할의 다양성이라는 관점에서는 여러 서브타입에 대해 선택적으로 작용하는 화합물을, 의사들로 하여금 상용가능케 하는 것이다.

본원에 기재된 본 발명은 혈관생성기작에 관여하는 인테그린을 표적으로 삼고 있다.

상이한 성장인자들의 작용이 내피세포에서의 인테그린 α_vβ₃(비트로넥틴 수용체) 발현을 자극한다. 혈관생성 자극을 받아 결과적으로 내피세포가 이동하는 동안, α_vβ₃인테그린 수용체를 갖는 막은 세포외기질 (extracellular matrix) 에 다양한 형태로 존재하는 RGD 트리펩티드 서열에 결합한다. 이러한 결합이 세포골격 (cytoskeleton) 의 - 탈린, 팍실린, α-액티닌, 텐신, 및 빈큘린 타입의 - 단백질 축적을 야기한다. 이것이 내피세포 생존 신호로 작용하여 새 혈관의 형성과 아울러 이동을 돕는다. 가용성 RGD 유사체를 투여하면 수용체상의 단백질 축적이 막히게 되고, 내피세포의 이동 및 신혈관생성을 방해받게 되어 궁극적으로는 프로그램된 세포의 죽음인 세포사멸 (apoptosis) 이 야기된다 (Giannis, A., et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 1997, 36, 588-90).

혈관생성에 선택적으로 관여하는 많은 분자들 중 인테그린은 암 치료 및 무절제한 신혈관생성의 원인이 되는 모든 질병에 대한 유망한 표적이 된다.

상기 대상에 대한 최초의 과학적 연구는 RGD 서열을 포함하는 펩티드가 인테그린을 인식하여, 종양에서의 혈관생성을 저해하는 활성을 갖는다고 보고하였다 (Saiki, I., et al., Jpn. J. Cancer Res., 1990, 81:668-675).

RGD 트리펩티드는 비트로넥틴, 피브로넥틴, 피브리노겐 등과 같은 이들 수용체에 대한 천연 리간드 안에 존재한다.

보다 최근의 연구는 내피세포 종양에서 혈관생성시 α_vβ₃ 및 α_vβ₅ 타입 인테그린이 증가됨을 보여준 바 있으며, 항체, RGD 사이클릭 펩티드 및 RGD 펩티드 유사 제제를 이용해 α_v 인테그린을 저해하여 신혈관생성을 막을 수 있음을 보여주고 있다 (Arap, W., et al., Current Opinion in Oncology, 1998, 10:560-565). β₁ 인테그린 (α₁β₁ 및 α₂β₁) 또한 아직 그 역할이 완전히 연구되지는 않았지만 혈관생성에 있어 어떤 역할을 수행할 것으로 추측된다.

예컨대 LM609 항체(Vitaxin)와 같은 항-α_vβ₃ 항체를 전신 투여하게 되면 종양 혈관생성이 차단되고, 인간 유방암의 성장 및 전이적 특성이 감소된다 (Brooks, P.C., et al., J. Clin. Invest., 1995, 96:1815-22).

많은 인테그린이 RGD 서열과 결합하는 작은 펩티드에 의해 저해될 수 있다. D-아미노산들을 함유하는 펜타- 또는 헥사- 펩티드 사이클 내 상기 서열의 포함은 통상 강력하고 선택적인 인테그린 저해제인 분자를 유도하게 된다 (Haubnev, R., et al., J. Am. Chem. Soc., 1996, 118:7881-91).

비트로넥틴은 혈관 기질의 단백질로서 α_vβ₃ 수용체의 선택적인 길항제(antagonist) 인 반면, 또다른 단백질인 피브로넥틴은 α_Ⅱbβ₃ 수용체에 선택적 결합을 제시한다.

지금까지, RGD 유사체에 대한 탐구는 주로 강력하고 선택적이며, 구강을 통해 투여가 가능한, α_Ⅱbβ₃ 수용체에 대한 길항제를 향해 있었다. 항-혈액응고제로 사용되던 이들 비펩티드성 RGD 유사체 중 일부는, 현재 임상시험을 통해 조사 중에 있다.

반면, 항-혈관생성 약품으로서는 α_Ⅱbβ₃수용체에 영향을 미치지 않고 α_vβ₃ 및/또는 α_vβ₅ 수용체를 선택적으로 저해할 수 있는 RGD 유사체가 요구된다.

α_vβ₃ 수용체를 저해하는 화합물의 예 및 이들의 적용에 대해서는, 또한 기술의 상태에 관한 추가적 고찰을 위하여는 본 출원인의 이름으로 출원된 EP 1 077 218 (특정 참고문헌 기재됨)을 참고할 것이다.

Arg-Gly-Asp (RGD) 서열을 포함하는 사이클릭 펩티드 구조물의 예는 EP 0 596 350, Merck Patent; Wermuth, J., et al., J. Am. Chem. Soc., 1997, 119(6), 1328-1335; US 5.705.481, Merck Patent; WO 99/58162, Du Pont Pharmaceuticals; Liu, S., et al., Bioconjugate Chemistry (2001), 12(4), 559-568; WO 01/097860 에 기재되어 있다.

본원에 기재된 본 발명의 목표 중 하나는 장기간 치료에 유용한 특성인 구강 투여가 가능하고, α_vβ₃ 수용체에 대하여 선택적으로 작용하는 작용제 (agonist) 를 제조하는 것이다.

불소 원자를 포함하고 있는 천연 화합물의 예는 드물다. 상기 원소는, 그의 물리화학적 성질 (용적, 전기음성도 등) 로 인해, 생물학적으로 활성적인 유기 화합물에 독특한 특성을 부여해 줄 것이다.

최근 몇년 동안, 보다 취급이 용이한 플루오로화 시약이 보편화됨으로써 목적하는 특성을 갖는 유기성 유도체들이 제조되어 왔다. 예컨대, 피리독살 의존성 효소 (트랜스아미나제, 디카르복실라제) 의 아미노산 기질은 플루오로화되면 특이적인 불활성화제로 작용하며; 플루오로화된 피리미딘은 항암적 활성을 나타내며; 캡토프릴의 트리플루오로메틸화된 유사체는 nM 미만의 활성을 가지며; 천연 안트라사이클린의 플루오로화된 유사체는 항암제로서 보다 더 활발한 활성을 가지며 (Giannini, G., Current Medicinal Chem., 2002, 9:1867-93); 트리플루오로메틸화 엔케팔린 유사체는 10000배 이상 더 큰 효능을 갖는다. RGD의 플루오로화된 선형 유사체에 관하여는 [A. Dal Pozzo, et al., J. Chem. Res. (S) 468-469 (1999)]에 기술되어 있다. 또한 [Ojima, I., Organofluorine Compounds in Medicinal Chemistry and Biomedical Applications; R. Filler (ed), 1993 - Elsevier Science Publisher; Ojima, I. et al., Biomedical Frontiers of Fluorine Chemistry - ACS Symposium Series 639 (1996); Sewald, N. et al., Amino Acids (1995) 8:187-194]를 참고할 것이다.

아미노산의 알킬화반응은 약품제조 화학의 매우 중요한 태양 중 하나이다. 또한 인테그린 저해제 분야에 있어서도 아미노산의 N-알킬화반응의 예가 있으며 (Kesseler, H., et al., J. Med. Chem., 1999, 42, 3033-40), Merck사에서 이 반응을 이용하여 EMD 121874 (Cilengitide) 라 불리는 제품을 개발하여 현재 Ⅱ상 임상시험 진행 중에 있다.

α-알킬화반응은 비록 여전히 잠재적으로는 유망하나, 보다 적은 빈도로 접근되고 있다. 사실, 펩티드의 핵심-위치에 C^α-이중치환된 아미노산의 결합이 펩티드의 이차구조를 변경하여 안정화시키는 것으로 알려져 있다 (Marshall, G.R., Int. J. Pept. Protein Res., 1998, 32, 544-5). 더욱이, 수소를 불소로 치환하면 이를 포함하고 있는 펩티드의 단백질-가수분해 안정성 및 용해도에 영향을 줄 것이라 추측된다 (Koksch, B., J. Pept. Sci., 1997, 3, 157-67).

알킬화반응 다음 단계는 아미노산의 플루오로알킬화반응이다. 이 경우, 역시, 선형 올리고펩티드의 플루오로알킬화반응의 예가 있다 (Dal Pozzo, A., et al. Tetrahedron, 1998, 54: 6019-28; Koksch, B. et al. Biomedical Frontiers of Fluorine Chemistry; ACS Symposium Series 639, Chapter 3, 1996, 42-58). 플루오로알킬화된 펩티드는 다음과 같은 장점을 보인다.; 생리학적 펩티다제의 보호 (알킬기와 유사); 소수성 성질의 상당한 증가 (대부분의 알킬기보다 우세), 이는 생체이용율 (흡수 및 분포) 을 증가시키며; 부피로 인한 구조의 경화 (단순 메틸기의 경우보다 용액 중 부피가 보다 증가), 수소결합을 형성할 수 있는 특성으로, 이는 다른 것들 중 특히, 카르바마이드 결합 주위의 회전의 제한을 초래할 것이다.

본 발명의 다른 목적은 그 핵심 위치에 C-α 및/또는 N- 위치에 플루오로알킬화된 아미노산을 갖는 펩티드를 합성하는 제조방법을 제공하고, 새로이 형성된 구조로 인한 입체적 부피와 전자적 효과에 불구하고, α_vβ₃ 및/또는 α_vβ ₅ 인테그린 수용체의 강력하고 선택적인 저해제로서 이들 화합물의 생물학적 특성을 발견하였음을 제공하는데 있다.

발명의 개요

하기의 화학식 1 의 화합물:

사이클로[NX₁-R₁-CO-NX₂-R₂-CO-NX₃-R₃-CO-NX ₄-R₄-CO-NX₅-R₅-CO]

(여기에서,

R₁은 CH(CH₂)₃NHC(NH)NH₂; C[CH_nF_m](CH ₂)₃NHC(NH)NH₂로부터 선택되고;

R₂는 CH₂; CH₂-CH₂;

기이고;

R₃는 CHCH₂COOH; C[CH_nF_m]CH₂-COOH 로부터 선택되고;

R₄는CH-CH₂-Ph; C[CH_nF_m]CH₂-Ph; CH-CH ₂-(4-OH)Ph; CH-CH₂-(4-OMe)Ph; CH-CH₂-(4-F)Ph; CH-CH(OH)-Ph; C(CH₃)₂; CH-C(CH₃)₃; CH-CH₂-COOH;

로부터 선택되고;

R₅는 CH-CH₂-Ph; C[CH_nF_m]CH₂-Ph; CH-CH(CH₃)₂; C[CH_nF_m]CH(CH₃)₂; CH-C(CH₃) ₃로부터 선택되거나;

NX₄-R₄-CO-NX₅-R₅-CO 기는 3-아미노메틸-벤조일이고;

n+m=3 이고;

X₁-X₅는 동일하거나 또는 상이하고, H 또는 (CH₂)_n-CH₃이며; (CH₂)_n-

-NX₄-R₄- =

CH₂F; (CH₂)_n-CF₃ 이며, 여기서 n=0-3 이고;

단, 상기 화학식 1 의 화합물에는 하나 이상의 α-플루오로알킬화 아미노산이 존재함을 조건으로 하며;

여기서 각각의 NX-R-CO 아미노산은 절대적인 R 형태 또는 S 형태 배열을 가질수 있음);

이들의 개별 거울상 이성질체, 부분입체 이성질체, 관련 혼합물, 약학적으로 허용가능한 염이 α_vβ₃ 및/또는 α_vβ₅ 인테그린 수용체의 선택적인 저해제라는 것이 현재 발견되어 있다.

따라서, 본 발명의 목적은 상기에서 기술한 화학식 1 의 화합물, 그 제조방법, 의약으로서 그의 용도 및 이들을 함유하는 약학 조성물이다.

본 발명의 상기 목적 및 다른 목적은 실시예를 이용하여 구체적으로 설명되고 있다.

발명의 상세한 설명

본 발명에 따르면, 약학적으로 허용가능한 염이란 당업자가 상기 염을 의약으로 사용시 원치 않는 효과를 일으키는 산 또는 염기를 사용하지 않고 제조할 수 있는 모든 염을 말한다.

본 발명과 관련하여는 다음의 화합물들이 바람직하다:

c(Arg-Gly-Asp-D-Phe-(R 또는 S)-Tfm-Phe) (ST1930/ST1931);

c(Arg-Gly-Asp-D-Phe-(R,S)-Dfm-Phe) (ST1932);

c(Arg-Gly-(R 또는 S)-Tfm-Asp-D-Phe-Val) (ST2189/2190);

c(Arg-Gly-Asp-(R 또는 S)-Tfm-Phe-Val) (ST2191/2192);

c(Arg-Gly-Asp-D-Phe-(R 또는 S)-Tfm-Val) (ST2409/ST2410);

c(Arg-Gly-Asp-D-Phe-(R 또는 S)-N-Me-Tfm-Phe.

더 광범위한 국면에서, 본 발명은 α_vβ₃ 및 α_vβ₅ 인테그린에 의한 중개로 세포가 RGD 서열을 포함하는 리간드에 부착되는 것을 선택적으로 저해하는 방법을 제공하고 있다. 그의 또다른 국면에서, 본 발명의 목적은 비정상적인 혈관형성에 영향받는 대상을 치료하는데 유용한 의약 제조를 위한 화학식 1 의 화합물의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 의한 의약의 용도의 예를 들면 암전이의 억제, 망막병증, 급성 신부전 및 골다공증의 치료 등이 있다.

그의 또다른 국면에서, 본 발명의 목적은 상기 언급된 화합물의 진단 시약으로서의 용도에도 있다. 특히, 본 발명에 따른 화합물은, 적절히 표지하면, 작은 종양 덩어리를 감지하고 위치를 정하는 데 있어 유용하다. 이와 유사하게, 상기 표지된 화합물은 또한 뇌졸중 또는 심근경색증과 같은 동맥폐쇄 현상의 분석에도 유용하게 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명의 추가적인 목적은 전술한 바와 같이, 특히 종양, 바람직하게는 작은 종양 덩어리, 또는 뇌졸중, 심근경색증과 같은 동맥폐쇄 현상의 감지 및 위치 확인용 진단시약을 제조하기 위한 화학식 1 의 화합물의 용도이다. 또한 화학식 1 의 화합물을 하나 이상 함유하는 진단 시약도 본 발명에 포함된다. 본 발명에 따른 화합물의 표지에 있어서, 상기는 당업자가 그의 특정한 지식에 기초하여 적절한 표지 시약을 선택하고, 본 발명에 의한 화합물을 유도해낼 수 있는 당업계의 일반적 기술지식의 일부이다. 본 발명에 따른 화합물에 관한 적용의 예는 WO 99/11590 및 다음의 참고문헌에서 찾을 수 있다 : Su, Z.F., et al., Bioconjug. Chem. 2002 May-Jun; 13(3):561-70; Haubner, R., et al., Cancer Res. 2001 Mar 1;61(5):1781-5; Haubner R, et al., J. Nucl. Med. 2001 Feb; 42(2):326-36; van Hagen, P.M, et al., Int. J. Cancer 2000 Aug 20; 90(4):186-98; Sivolapenko, G.B., et al., Eur. J. Nucl. Med. 1998 Oct; 25(10):1383-9; Pearson, D.A., et al., J. Med. Chem. 1996 Mar 29; 39(7):1372-82.

화학적 관점에서 볼 때, 본 발명은 이미 그 합성에 관하여 공지되고, 충분히 연구되어 있는 많은 수의 비-자연적 아미노산 (플루오로알킬 아미노산) 을 함유하는 펩티드 구조물의 폐환된 유도체를 수득하는 것이다.

사이클로펩티드는 카르복실릭 에스테르의 형태로 플루오로메틸화된 아미노산으로부터 시작하여 합성되며; 이것을 상응하는 N-보호된 아미노산의 브로마이드로 아실화한다. 이렇게 수득한 디펩티드 에스테르를 가수분해한 후, 말단의 카르복실기를 H-Orn(Cbz)-Gly-OtBu 와 축합반응시킨다.

이렇게 수득한 테트라펩티드로부터 질소 말단의 보호를 제거한 후, 이것을 Fmoc-Allgly-OH (아스파르트산의 전구체)로 아실화반응을 일으켜, 전체적으로 보호된 선형 펜타-펩티드를 만든다. 두개의 보호 말단기를 제거한 후, TBTU를 거친 폐환반응을 계속 수행하고, 뒤이어 과망간산염으로 알릴 잔기를 산화시킨다. 마지막 단계로 오르니틴 측쇄의 Cbz 를 유리시키고, 뒤이어 아민 관능기의 구아니딜화반응을 일으켜 최종 사이클로펩티드를 수득하고, 상기 사이클로펩티드는 RP-HPLC 로 정제하고, 두 부분입체 이성질체를 분리한다.

플루오르화된 아미노산 (빌딩 블록) 의 제조방법에 관한 몇가지 예를 이하에서 기술한다.

제조방법 1

H-( R,S )-α-Tfm-Phe-OEt

(Burger, K., Gaa, K., Chemiker Zeitung, 1990, 114, 101-104)

생성물은 위에서 인용한 참고문헌에 기재된 대로 제조하였다.

¹H-NMR (CDCl₃) δ 7,33-7,18 (m, 5H, arom.), 4.26 (q, CH₂-CH₃), 3.45-2.95 (dd, CH₂-C₆H₅), 1.32 (t, CH₃).

제조방법 2

H-( R,S )-α-Dfm-Phe-OEt

(Bey, P., Vevert, J.P., Van Dorsselaer, V. and Kolb, M., J. Org. Chem. 1979, 44, 2732-42)

¹H-NMR (CDCl₃) δ 7.28-7.13 (m, 5H, arom.), 6.14-5.77 (t, CHF₂), 4.16 (q, CH ₂ -CH₃), 3.20-2.87 (2 dd, CH₂-C₆H₅), 1.21 (t, CH₃).

제조방법 3

N-CH ₃ -( R,S )-α-Tfm-Phe-OCH ₃

(Buvger, K. and Hollweer, W., Synlett. 1994, 751-3)

¹H -NMR (CDCl₃) d 7.28-7.15 (m, 5H, arom.), 3.73 (s, OCH₃), 3.27, 3.22, 3.16, 3.12 (q, CH ₂ -C₆H₅), 2.47 (s, N-CH,₃).

이 합성 블록 (빌딩 블록) 은 당업계에서 통상의 경험을 가진 당업자가 통상의 기술을 사용하여 본 발명에 따른 사이클로펩티드를 합성하는데 사용된다.

하기의 실시예는 본 발명에 대해 보다 구체적으로 설명하고 있다

약어 : TEA: 트리에틸아민; THF: 테트라하이드로푸란; LDA: 리티오이소프로필아미드; DMF: 디메틸포름아미드; 브로모엔아민: 1-브로모-N,N-2-트리메틸-1-프로페닐아민; HATU: O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N¹,N¹,N¹-테트라메틸유로니움 헥사플루오로포스페이트; DIEA: 디이소프로필아민; DCM: 디클로로메탄; DCC: 디사이클로헥실카르보다이이미드; HOAT: 아자벤조트리아졸; allgly: 2-알릴글라이신; Tfm: 트리플루오로메틸; Dfm: 디플루오로메틸; TBTU: O-(벤조-트리아조-1-일)N,N,N¹,N^l-테트라메틸유로니움 테트라플루오로보레이트

실시예 1

C(Arg-Gly-Asp-D-Phe-( R 또는 S )-Tfm-Phe) (ST1930/ST1931)

Pht-D-Phe-Br의 제법 (Dal Pozzo, A., Bergonzi, R. and Ni, M. H., Tetrahedron Lett., 2001, 42, 3925-7).

Pht-D-Phe-OH 1.4 g (4.75 mmol)을 DCM 중 0.5 M 브로모엔아민용액 19 ㎖ 에 아르곤 조건 하에서 용해시켰다. 10 분 후면, 용액은 사용할 수 있는 상태가 된다.

(상기에서 준비한) 브로마이드 용액 12.5 ㎖ 를 0 ℃까지 냉각시킨 후, 여기에 H-α-Tfm-Phe-OEt 248 ㎎ (0.950 mmol) 및 콜리딘 (1 당량)을 첨가하고; 상기 혼합물을 실온 (a.t.) 에서 교반하고, 10 분 후 또다른 브로마이드 용액 6.5 ㎖ 및 1 당량의 콜리딘을 첨가한다. 2 시간 후, 상기 혼합물을 건조시키고, 5% NaHCO₃15 ㎖ 및 EtOAc 15 ㎖ 를 이용하여 추출하고, 이를 30분 동안 교반한다. 상기 용매를 물, 1N HCl, 물로 세척하고, 뒤이어 이를 증류시키고, 용매로써 헥산-EtOAc (8:2) 를 사용한 플래시 크로마토그래피 컬럼 상에서 잔류물을 정제한다.

무수 DCM 21 ㎖ 중 디펩티드 Pht-D-Phe-α-Tfm-Phe-OEt 460 mg 의 용액에 DCM 중 1M BBr₃ 용액 4.3 ㎖ 를 첨가하고; 상기 혼합물을 2 시간 동안 가열되는 역류축합반응시키고, 이어서 물 21 ㎖ 로 세척하고, 건조시킨다.

산 펩티드 (b) 390 ㎎ 을 HATU (1.4당량) 406.7 ㎎ 및 2.8 당량의 DIEA 을 함유한 무수 CH₃CN 6㎖ 에 용해시키고, 15 분 동안 교반한 후, HCl-H-Orn(Cbz)-OtBu (2 당량) 548 ㎎ 및 2 당량의 또다른 DIEA를 첨가한다. 2 시간 후 반응물을 DCM 15 ㎖ 로 희석하고 식염수 20 ml 로 추출한다. 상기 유기상을 다시 2 N HCl, NaHCO₃ 및 물로 세척한다. 잔류물은 용매로서 헥산-EtOAc (6:4) 를 사용한 플래시 크로마토그래피 컬럼 상에서 정제한다.

상기에서 수득한 트리펩티드 424 ㎎ 을 TFA:DCM (=1:1) 2.2 ㎖ 에 용해시키고 30 분 후 이를 건조시킨다.

이렇게 수득한 화합물 283.8 ㎎ 을 DCM 5.7 ㎖ 에 용해시키고 여기에 HCl·H-Gly-OtBu (1 당량), DIEA (2 당량), HOAT (3 당량) 및 DCC (3 당량) 을 첨가한다. 20 분 후 상기 혼합물을 여과하고, 상기 여과물을 물, 0.1 N HCl, 5% NaHCO₃ 및 물로 세척한 후 건조시킨다.

상기에서 수득한 테트라펩티드 349 ㎎ 을 EtOH 5 ㎖ 에 용해시키고, EtOH (1.5 당량) 중 1 M NH₂-NH₂·H₂0 용액 600 ㎕ 를 첨가하고, 상기 반응물을 2.5 시간 동안 가열되는 역류축합반응시킨다. EtOH 을 제거하고, DCM 10 ㎖ 및 Na₂CO₃ (1.5 당량) 63.6 ㎎ 을 함유하는 수용액 10 ㎖ 를 이용하여 추출한다. 10 분간 교반한 후, 상기 유기상을 건조시키고, 잔기는 CHCl₃-MeOH (98:2) 를 사용한 플래시 크로마토그래피를 이용하여 정제한다.

탈보호된 테트라펩티드 134 ㎎ 을 DCM 2.7 ㎖ 에 용해시킨다. Fmoc-AllGly-OH (1 당량), DIEA (1 당량), HOAT (1.2 당량) 및 DCC (1.2 당량)를 첨가하고, 반응은 상기에서 기술한 바와 같이 진행시킨다.

상기에서 기재된 바와 같이 수득된 펜타펩티드 151.6 ㎎ 을 DCM 5 ㎖ 에 용해시키고, 피페리딘 140 ㎕ 을 첨가한다. 두시간 후 상기 반응 혼합물을 물, pH 5.5인 버퍼, 물, 5% NaHCO₃, 및 물로 세척하고, 이어서 이를 건조시킨다. 잔류물은 먼저 CHCl₃로 세척하고 다음으로 CHCl₃-MeOH (95:5) 로 세척하여 실리카 겔로 여과하여 정제한다.

상기에서 기재한 바와 같이 펜타펩티드는 카르복실 말단을 탈보호한다.

탈보호된 선형 펜타펩티드 116 ㎎ 을 DMF 86 ㎖ 에 용해시킨 후, TBTU (3 당량), HOBT (3 당량) 및 DIEA (860 ㎕) 을 첨가한다. 5 분 후 상기 혼합물을 건조시키고, 잔류물을 DCM 10 ㎖ 로 추출하고, 상기 용액을 식염수, 2 N HCl, 물, 5% NaHCO₃및 물로 세척한다.

상기에서 기재한대로 수득한 사이클릭 펜타펩티드 80.9 ㎎ 을 아세톤 6.9 ㎖ 에 용해시키고, 상기 용액을 냉각시킨 후, KMnO₄ 수용액(620 ㎕ 내 100.5 mg) 을 적가한다. 0℃ 에서 1 시간 동안 반응시킨 후, 본 반응 혼합물을 실온에서 밤새 방치한다. 끝으로 완전히 색이 없어질때까지 3 N H₂SO₄ 770 ㎕ 및 40% NaHS0₃용액을 첨가한다. 아세톤을 제거한 후, 상기 반응물을 물로 희석하고 그 생성물을 EtOAc 로 추출한다.

사이클릭 펜타펩티드 66.8 ㎎을 DMF/AcOH (=6:4) 혼합물 1 ㎖ 에 용해시킨 후, 포름산 암모늄 (5 당량) 23.8 ㎎ 을 첨가하고, 10% Pd/C 33.4 ㎎ 을 첨가한다. 15 분 후 반응 혼합물을 MeOH 로 희석하고, Celite에서 여과한 후, 여과물을 건조시킨다.

완전히 탈보호된 사이클릭 펜타펩티드 60.5 ㎎ 을 MeOH 540 ㎕ 에 용해시킨후, DIEA (5 당량) 73 ㎕ 및 피라졸카르복스아미딘 모노클로로하이드레이트 (4 당량) 49.8 ㎎ 을 첨가한다. 1 시간 후 반응을 TFA로 중화시키고 건조시킨다. 정제 및 두 부분입체 이성질체의 분리는 하기 조건 하에서 예비 RP-HPLC에 의해 동시에 수행된다.

컬럼 : Alltima (Alltech Italia) C18, 10 ㎛, 250 x 22 mm;

이동상 : 아세토니트릴의 34% 수용액 + 0.1% TFA.

유속 : 12 ㎖/분.

부분입체이성질체 Ⅰ(Rt 21.30) ST1930

부분입체이성질체 Ⅱ (Rt 26.76) ST1931

전체 수율은 최종 3단계에 기초하여 계산되었다 : 33%.

부분입체이성질체 I (ST1930)

¹H-NMR (CD₃OD): δ 7.30-7.19 (m, arom.), 4.70, 4.28 및 4.08 (m, α-CH) 3.80-3.15 (CH₂-Gly), 3.32 (m, CH₂-N), 3.15-2.80 (m CH₂-Asp + CH₂-Phe + CH₂-Tfm-Phe), 1.63-1.35 (m, CH₂-CH₂-Arg).

¹⁹F-NMR (CD₃OD): δ 5.18

MS (M+H⁺): 691.13

부분입체이성질체 II (ST1931)

¹H-NMR (CD₃OD): δ 7.23-7.20 (m, arom.), 4.85-4.05 (m, α-CH), 4.30-3.75 (2 dd CH₂-Gly), 3.18 (m, CH₂-N), 3.50-2.50 (m CH₂-Asp + CH₂-Phe + CH₂-Tfm-Phe), 2.10-1.55 (m, CH₂-CH₂-Arg).

¹⁹F-NMR (CD₃OD): δ 4.17.

MS (M+H⁺): 691.13

실시예 2

c(Arg-Gly-Asp-D-Phe-( R,S )-Dfm-Phe) (ST1932)

H-(R,S)-Dfm-Phe-OEt 에서 시작하여, 공정은 실시예 1 에서 기술된 바와 같이 수행된다. 두 부분입체이성질체의 혼합물은 미분리 상태로 얻어진다.

¹H-NMR (CD₃OD): δ 8.00-7.05 (d, NH), 7.35-7.15 (m, arom.), 6.42-5.6 (t, CHF₂), 4.74-4.32 (m, α-CH), 4.32-3.96 (2 dd, CH₂-Gly), 3.68-2.50 (m), 1.75-1.45 (m, CH₂-CH₂-Arg).

¹⁹F-NMR (CD₃OD): δ from - 54.4 to - 55.5

MS (M+H⁺): 673,14.

실시예 3

c(Arg-Gly-( R 또는 S )-Tfm-Asp-D-Phe-Val) (ST2189/2190)

H-(R,S)-Tfm-Allgly-Oet 을 Pth-Gly-Br 과 축합반응을 시킨 후, 실시예 1 에 기재된 바와 같이 공정을 수행하였다. 두 부분입체 이성질체의 혼합물을 CH₃CN 22% 수용액 + 0.1% TFA 를 사용한 예비 HPLC 를 이용하여 분리 및 정제하였다.

부분입체이성질체 I (Rt 20.76)

¹H-NMR (DMSOD₆+D₂O): δ 7.30-7.12, 4.70, 4.26, 4.10 3.86, 3.60-2.70, 1.72, 1.52-1.12, 0.65

MS (M+H⁺): 643.2

부분입체이성질체 II (Rt 25.44)

¹H-NMR (DMSOD₆+D₂O): δ 7.30-6.96, 4.50, 4.15, 4.10-2.75, 1.90, 1.62, 1.43-1.20, 0.82

MS (M+H⁺): 643.2

실시예 4

c(Arg-Gly-Asp-( R 또는 S )-Tfm-Phe-Val) (ST2191/2192)

HCl. H-(R,S)-Tfm-Phe-OEt 를 Pth-AllGly-Br 과 축합반응시킨 후, 실시예 1 에 기재된 바와 같이 진행한다. 두 부분입체 이성질체의 혼합물은 CH₃CN 30% 수용액 + 0.1% TFA 를 사용한 예비 HPLC 를 이용하여 분리 및 정제하였다.

부분입체 이성질체 I (Rt 17.19)

¹H-NMR (D₂O): δ 7.50-7.30, 4.90, 4.30-4.16, 4.05 3.76-3.60, 3.32-2.82, 2.03-170, 1.57, 0.86, 0.73.

MS (M+H⁺): 643.2

부분입체 이성질체 II (Rt 22.17)

¹H-NMR (D₂O): δ 7.48-7.12, 4.75, 4.25, 4.07, 3.74-3.10, 2.95, 2.10, 1.85, 1.63-1.00, 0.77.

MS (M+H⁺): 643.2

실시예 5

c(Arg-Gly-Asp-D-Phe-( R 또는 S )-Tfm-Val) (ST2409/2410)

HCl·H-(R,S)-Tfm-Val-OEt 을 Pth-D-Phe-Br (하이드로클로라이드로, 총 3 당량의 콜리딘이 사용됨) 과 축합반응을 시켰다. 그 다음, 실시예 1 에 기술된 공정을 수행하여 테트라펩티드 Pht-D-Phe-(R,S)-Tfm-Val-Orn(Cbz)-Gly-OtBu 를 수득했다. 두 중간체인 부분입체이성질체의 혼합물을 플래시 크로마토그래피 [헥산-AcOEt = 4:6] 를 이용하여 분리하였다.

부분입체이성질체 I (신속한 이동, Rf 0.23)

부분입체이성질체 II (서서히 이동, Rf 0.36).

두가지 순수 키랄 중간 생성물은 실시예 1 에서 기술된 것과 유사한 단계로 두 병렬 합성을 이용하여 분리되어 처리되었다.

부분입체 이성질체 I (ST2409)

¹H-NMR (D₂O) δ 7.37-7.25; 4.83, 4.73, 4.46, 4.13, 3.47, 3.21, 3.08-2.69, 2.33, 1.92-1.50, 1.08.

¹⁹F-NMR (D₂O) δ 10.50, 0.97

MS (M+H⁺): 643.16

부분입체 이성질체 II (ST2410)

¹H-NMR (D₂O) δ 7.37-7.29; 4.87, 4.73, 4.56, 4.46, 3.53, 3.18, 3.00-2.55, 1.87, 1.60, 1.18 0.85

¹⁹F-NMR (D₂O) δ 9.29, 0.97

MS (M+H⁺): 643.16

실시예 6

c(Arg-Gly-Asp-D-Phe-( R 또는 S )-N-Me-Tfm-Phe) (ST2552/2553)

말단 카르복실기에 있는 에스테르를 가수분해한 후, H-Orn(Cbz)-Gly-OtBu 와 커플링반응을 수행하고; 이어서, 상기 아자이드기를 [Et₃NH][Sn(SPh)₃] 으로 환원시키고, 선형 펜타펩티드의 N-말단에서 Fmoc-Allgly 와의 축합반응을 완결시켰다. 상기 중간 생성물로부터, 사이클로펜타펩티드의 합성은 실시예 1 에서 기술한 것과 같이 계속한다.

인테그린 α _v β ₃ 수용체에의 결합

96-웰 플레이트에 0.5 ㎍/㎖ 의 인테그린 α_vβ₃ (Chemicon, cat. CC1022) 을 도포하고 밤새 방치하였다. 다음날, 웰을 세척하고 본 발명에 따른 화합물의 부재 또는 존재하에 0.05 nM (¹²⁵I)Echistatin (Amersham, cat. IM304) 과 인큐베이션하였다. 3 시간 동안 인큐베이션하고 일련의 세척을 한 후, 각각의 웰로부터 방사성 물질로 표지된 인테그린을 2N NaOH 로 용해시킨 후, 감마 카운터를 이용하여 방사활성을 측정하였다. 비특이적 결합을 모든 시료로부터 제하기 위해 1 μM Echistatin 으로 결정하였다.

인테그린α _v β ₅ 수용체에의 결합

96-웰 플레이트에 1 ㎍/㎖의 인테그린 α_vβ₅ (Chemicon, cat. CC1020) 을 도포하고 밤새 배양하였다. 다음날, 웰을 세척하고 본 발명에 따른 화합물의 부재 또는 존재하에 0.05 nM (¹²⁵I)Echistatin (Amersham, cat. IM304) 과 인큐베이션하였다. 그 다음, 공정은 상기의 경우에 기재한 것과 같이 진행하였다.

IC ₅₀ 파라미터의 평가

본 발명에 따른 화합물의 비트로넥틴 수용체에 대한 친화력은 "ALLFIT" 소프트웨어를 이용해 설명되는 파라미터인 IC₅₀±SD 값 (nM) 으로써 표현된다.

하기의 표 1 은 수득한 실험결과를 보여준다. 특히, ST2552 는 비트로넥틴 수용체 α_vβ₃및 α_vβ₅, 양자 모두에 대해 높은 결합 친화력을 나타냈다.

세포 배양

갓 희생된 소의 부신에서 미세혈관 내피세포 (소 미세혈관 내피세포-BMEC) 를 분리하여 실험실에 도착하기까지 얼음에서 보관하였다. 무균 상태에서, 부신을 베타딘 용액으로 5분간 세척하고, 그다음 무균 PBS 2ℓ 중에서 세척하였다. 그 다음, 부신을 무균의 일회용 란셋으로 약 2 ㎜ 조각으로 자르고, 이를 PBS (부신 당 30 ㎖) 가 담겨있는 폴리스티렌 팰콘튜브에 옮겼다. +4℃ 로 냉각시킨 원심분리기에서 600 rpm 으로 원심분리한 후 상청액은 제거하였다. 펠렛을 0.12 % 콜라게나제 A 용액 (Boehringer Mannheim) 으로 1:2 로 재현탁시킨 후, 37℃ 에서 2 시간 동안 교반하며 배양하였다. 뒤이어 먼저 200 메쉬의 필터 (Sigma) 로 여과하고, 다음으로 100 메쉬의 필터 (Sigma) 로 여과한 후, 상청액을 15% FBS를 함유한 DMEM 용액에 넣어 콜라게나제 A 의 활성을 억제하였다. 상기 용액을 실온에서 1000 rpm 으로 원심분리하고 그 침전물을 20% FBS, 50 ㎍/㎖ 의 소의 뇌추출물 (BBE), 50 ㎍/㎖ 의 헤파린(Sigma), 0.5% v/v 젠타마이신(Sigma) 및 1% v/v L-글루타민을 함유하고 있는 DMEM 배지에 재현탁시켰다. 상기 세포를 1% 젤라틴 (Sigma porcine gelatin) 으로 젤라틴화된 페트리디쉬에 접종하였다. 집중지역에서, 세포는 팩터 Ⅷ 로서의 내피세포 마커를 특징으로 한다.

ATCC (American Type Culture Collection) 로부터 수득한 인간 멜라닌종 MeWo 세포를, 10% FCS, 2mM L-글루타민 및 50 ㎍/㎖ 젠타마이신을 함유하고 있는 완전한 EMEM (Eagle Minimal Essential Medium) 에서 배양을 지속했다.

SK-LMS-1 인간 평활근육종 세포 (ATCC) 를 10% FCS, 2 mM L-글루타민 및 50 ㎍/㎖ 젠타마이신을 보충한 EMEM 에서 키웠다.

모든 세포를 5% CO₂를 함유하는 습한 공기 중에서 37℃ 로 유지시켰다.

세포 부착 검정법

96-웰 플레이트에 5 ㎍/㎖ 인간 비트로넥틴 (Cal-biochem) 을 +4℃ 에서 12 시간 동안 사전처리했다. BEMC 또는 MeWo 세포를 트립신-EDTA 로 분리하고, 계수한 후, 비트로넥틴 기질상에 도포하였다. 상기 분자를 0.1 내지 100 μM 의 범위의 스칼라 농도에서 측정하고, 부착된 채 남아있는 세포와 함께 배양시켰다. 배양 후, 세포를 Ca²⁺ 및 Mg²⁺이 들어있는 PBS 로 1 회 세척하여 기질에 부착되지 않은 세포들을 제거하였다. 부착된 세포를 실온에서 10 분 동안 4% 파라포름알데히드 용액으로 고정하였다. 이어서, 세포를 1% 톨루이딘 블루 용액으로 실온에서 10분간 염색하였다. 염색 후 세포를 이차증류수로 세척하고, 건조시킨 후 1% SDS 용액으로 용해시켰다. 이어서, 세포를 Victor multilable plate counter (Wal-lac)로 600 nm 에서의 흡광도를 측정함으로써 정량하였다.

분자의 활동도 평가 파라미터로는 IC₅₀±SD (μM) 값을 사용하였다.

비트로넥틴 수용체에 대한 주된 결합 친화력을 갖는 것으로 이전에 발견된 분자를 이용해 수득한 결과가 하기의 표 2 에 나와있다. 특히, ST2552 분자가 MeWo 인간 멜라닌종 세포의 비트로넥틴에의 결합을 저해함이 0.33 μM 의 IC₅₀값을 통해 보여졌다.

본 발명의 또다른 목적에 있어서, 약학 조성물은 활성 성분으로서 하나 이상의 화학식 1 의 화합물을 현저한 치료 효과를 제공할 만큼의 양으로 함유하고 있어야 한다. 본 발명에 의해 포괄되는 조성물은 전적으로 통상적인 것이며, 예를 들면 [Remington's Pharmaceutical Science Handbook, Mack Pub. N.Y. - latest edition] 에서 기술되고 있는 바와 같이 약품제조 산업에서 통상 실시되는 방법에 의해 수득된다. 선택된 투여 경로에 따라, 상기 조성물은 경구, 비경구, 또는 정맥내투여에 적합하게, 고체 또는 액체 형태로 될 것이다. 본 발명에 따른 상기 조성물은 활성 성분과 더불어, 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 비히클 또는 부형제를 함유한다. 이들은, 예를 들면 용해제, 분산제, 현탁화제 및 에멀젼화제와 같은 특히 유용한 제형물 상호보조제가 될 수 있다.

Claims

하기의 화학식 1 의 화합물, 이의 개별 거울상 이성질체, 부분입체 이성질체, 관련 혼합물, 또는 약학적으로 허용가능한 염:

[화학식 1]

사이클로[NX₁-R₁-CO-NX₂-R₂-CO-NX₃-R₃-CO-NX ₄-R₄-CO- NX₅-R₅-CO]

(여기에서,

R₁은 CH(CH₂)₃NHC(NH)NH₂; C[CH_nF_m](CH ₂)₃NHC(NH)NH₂로부터 선택되고;

R₂는CH₂; CH₂-CH₂; 또는

기이고;

R₃는CHCH₂COOH; C[CH_nF_m]CH₂-COOH 로부터 선택되고;

R₄는CH-CH₂-Ph; C[CH_nF_m]CH₂-Ph; CH-CH ₂-(4-OH)Ph; CH-CH₂-(4-OMe)Ph; CH-CH₂-(4-F)Ph; CH-CH(OH)-Ph; C(CH₃)₂; CH-C(CH₃)₃; CH-CH₂-COOH; 또는

로부터 선택되며;

R₅는 CH-CH₂-Ph; C[CH_nF_m]CH₂-Ph; CH-CH(CH₃)₂; C[CH_nF_m]CH(CH₃)₂; CH-C(CH₃) ₃로부터 선택되거나;

또는 NX₄-R₄-CO-NX₅-R₅-CO 기는 3-아미노메틸-벤조일이며;

n+m=3 이고;

X₁-X₅ 는 동일하거나 상이하며, H 또는 (CH₂)_n-CH₃ 이며;

-NX₄-R₄- =

(CH₂)_n-CHF₂; (CH₂)_n-CH₂F; (CH₂)_n-CF₃이며, 여기서 n=0-3 이고;

단, 상기 화학식 1 의 화합물에는 하나 이상의 α-플루오로알킬화 아미노산이 존재함을 조건으로 하며;

여기서 각각의 NX-R-CO 아미노산은 절대적인 R 타입 또는 S 타입 배열을 가질 수 있음).
제 1 항에 있어서,

c(Arg-Gly-Asp-D-Phe-(R 또는 S)-Tfm-Phe) ;

c(Arg-Gly-Asp-D-Phe-(R,S)-Dfm-Phe) ;

c(Arg-Gly-Asp-(R 또는 S)-Tfm-Phe-Asp-D-Phe-Val) ;

c(Arg-Gly-Asp-(R 또는 S)-Tfm-Phe-Val) ;

c(Arg-Gly-Asp-D-Phe-(R 또는 S)-Tfm-Val) ;

c(Arg-Gly-Asp-D-Phe-(R 또는 S)-N-Me-Tfm-Phe

로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물.
제 1 항 또는 제 2 항에 따른 화합물의 의약으로서의 용도.
제 1 항 또는 제 2 항에 따른 화합물의 α_vβ₃ 및 α_vβ₅ 계에 속하는 인테그린 패밀리에 속하는 수용체를 저해하는 의약 제조를 위한 용도.
제 4 항에 있어서, 상기 의약이 항-혈관생성 활성을 갖는 용도.
제 5 항에 있어서, 상기 의약이 항-암전이적 활성을 갖는 용도.
제 5 항에 있어서, 상기 의약이 망막병증, 급성 신부전 및 골다공증으로 이루어진 군으로부터 선택된 질병의 치료에 유용한 용도.
약학적으로 허용가능한 부형제 및/또는 비히클과의 혼합물 내에 활성 성분으로서 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 하나 이상의 화합물을 함유하는 약학 조성물.
제 1 항 또는 제 2 항에 따른 상기 화합물의 진단 시약의 제조를 위한 용도.
제 9 항에 있어서, 상기 화합물이 표지된 용도.
제 9 또는 제 10 항에 있어서, 상기 진단시약이 종양 덩어리의 감지 및 위치 확인에 사용되는 용도.
제 11 항에 있어서 상기 종양 덩어리가 작은 경우의 용도.
제 9 항 또는 제 10 항에 있어서 상기 진단시약이 동맥폐쇄현상의 감지 및 위치 확인에 사용되는 용도.
제 13 항에 있어서, 상기 현상이 뇌졸중 또는 심근경색인 경우의 용도.
제 1 항 또는 제 2 항에 따른 화합물을 하나 이상 함유하는 진단시약.