PT1539803E - Derivados de fluoro- alquil-ciclopéptidos com actividade anti-integrina - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "DERIVADOS DE FLUORO-ALQUIL-CICLOPÉPTIDOS COM ACTIVIDADE ΑΝΤΙ-INTEGRINA" A presente invenção tem por objecto derivados de fluoro--alquil-ciclopéptidos dotado de actividade anti-integrina, particularmente compostos de péptidos cíclicos contendo grupos fluoro-alquilo no átomo de azoto da ligação de péptido e/ou na posição C-α, tal como indicado na fórmula geral (I) aqui a seguir. A presente invenção, aqui descrita, também tem por objecto processos para a preparação dos referidos compostos, a sua utilização como medicamentos, particularmente como inibidores de receptores de integrina, úteis como agentes antiangiogénicos e anti-metastãsicos e composições farmacêuticas que os contêm.

Antecedentes da invenção

As integrinas são uma classe de receptores envolvida no fenómeno de adesão das células. São glicoproteínas que consistem em duas unidades α e β, combinadas para dar famílias diferentes. Para maiores detalhes, ver Kessler, H., et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 1997, 36, 1374-89.

Todas as integrinas têm um "sítio universal de reconhecimento de células" capaz de reconhecer a sequência de péptidos comum Arg-Gli-Asp, também conhecida como RGD, dos símbolos de uma letra que identificam os três aminoácidos, embora cada integrina reconheça preferencial-mente uma conformação diferente deste tripéptido (Kessler, H., et al., J. Am. Chem. Soc., 1996, 118, 7461-72). A família das integrinas βι desempenham um papel importante na organização dos tecidos e as integrinas β2 são importantes para o sistema imunitário, enquanto as integrinas β3 regulam o processo de coagulação e a angiogénese.

Um dos objectivos da química farmacêutica é tornar disponível para os médicos compostos capazes de interagir com a família das integrinas, mas selectivamente em vários sub-tipos, tendo em vista a diversidade dos papéis que cada um deles desempenha ao nível fisiopatológico. A presente invenção, aqui descrita, tem por objecto as integrinas envolvidas nos mecanismos da angiogénese. A acção dos diferentes factores de crescimento estimula a expressão da integrina αγβ3 (receptor de vitronectina) nas células endoteliais. Durante a migração consequente das células endoteliais na direcção da estimulação da angiogénese, a membrana com o receptor da integrina αΥβ3 liga-se à sequência do tripéptido RGD presente em várias formas na matriz extracelular. Esta ligação leva a uma acumulação de proteínas - do tipo de talina, paxilina, a-actinina, tensina e vinculina - do cito-esqueleto. Isto favorece o processo de migração, actuando como um sinal de sobrevivência das células endoteliais, com a formação de novos vasos sanguíneos. A administração dos análogos de RGD solúveis impede a formação das proteínas nos receptores e leva à morte programada das células (apoptose), contrariando a migração das células endoteliais e prevenindo a neovascularização (Giannis, Aet al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 1997, 36, 588-90).

Entre as muitas moléculas envolvidas selectivamente na angiogénese, as integrinas constituem um alvo promissor na terapia do cancro e era todas as doenças responsáveis pela neovascularização descontrolada.

Ura estudo científico inicial deste assunto (Saiki, I., et al., Jpn. J. Câncer Res.f 1990, 81; 668-675) refere a acção dos péptidos que contêm uma sequência de RGD que reconhece a integrina, inibindo assim a angiogénese em tumores. 0 tripéptido RGD está presente nos ligandos naturais destes receptores, tal como vitronectina, fibronectina e fibrinogénio.

Estudos mais recentes mostraram que as integrinas do tipo αγβ3 e αγβ5 aumentam na angiogénese dos tumores de células endoteliais e que essa inibição das integrinas aY, por meio de anticorpos, péptidos cíclicos RGD e agentes peptido-miméticos de RGD, podem bloquear a neovascularização (Arap, W. , et al., Current Opinion in Oncology, 1998, 10 : 560--565) . As integrinas βι (αχ βχ e oí2 βι) , podem também desempenhar um papel na angiogénese, embora o seu papel tenha ainda de ser estudado cuidadosamente. A administração sistémica de um anticorpo anti- αΥβ3, por exemplo, o anticorpo LM609 (Vitaxin), bloqueia a angiogénese do tumour e reduz o crescimento e as propriedades invasivas do carcinoma da mama em seres humanos (Brooks, P. C., et al., J. Clln. Invest., 1995, 96: 1815-22).

Muitas integrinas podem ser inibidas por péptidos pequenos que incorporam a sequência de RGD. A incorporação desta sequência em ciclos de penta- ou de hexa-péptidos contendo D-aminoácidos, leva normalmente às moléculas que são inibidores potentes e selectivos de integrinas (Haubnev, R., et al., J. Am. Chem. Soc. , 1996, 118: 7881-91). A vitronectina é uma proteína da matriz vascular e um antagonista selectivo dos receptores de 0ίγβ3, enquanto o fibrinogénio, outra proteína, apresenta uma ligação selectiva aos receptores de αιη>β3.

Até à data, a pesquisa sobre análogos de RGD tem sido dirigida principalmente para os antagonistas dos receptores de οίι^β3 que são potentes e selectivos e podem ser administrados oralmente. Alguns destes análogos de RGD que não são péptidos, utilizados como anticoagulantes, estão hoje em dia a ser investigados em ensaios clínicos.

Como agentes antiangiogénicos, por outro lado, são necessários análogos de RGD capazes de inibirem selecti-vamente os receptores de αγβ3 e αγβ5 sem afectarem os receptores de αι^β3 ·

Para analisar exemplos de compostos que inibem os receptores de αγβ3 e as suas aplicações, ver a patente de invenção europeia EP1 077 218, registada em nome do requerente, a que se faz uma referência específica, também para uma discussão alargada sobre o estado da técnica.

Exemplos de estruturas de péptidos cíclicos contendo a sequência Arg-Gli-Asp (RGD) estão descritas na patente de invenção europeia EP 0 596 350, patente da Merck; Wermute, J. et al., J. Am. Chem. Soc., 1997, 119 (6), 1328-1335; patente de invenção norte-americana US 5.705.481, patente da Merck; patente da WO 99/58162, Du Pont Pharmaceuticals; Liu, S., et al., Bioconjugate Chemistry (2001), 12 (4), 559-568 ; patente de invenção WO 01/097860. 4 A patente de invenção alemã DE 197 25 368 descreve péptidos cíclicos contendo a sequência de RGD. Estes péptidos podem conter um Fen, eventualmente fluorado no anel de fenilo. Não se atribui nenhum significado técnico especial ao átomo de flúor e os compostos interagem com os receptores de integrina sem nenhuma selectividade em particular.

Um dos objectivos da presente invenção aqui descrito consiste em providenciar agonistas selectivos para os receptores de αγβ3 que podem ser administrados oralmente, que é uma característica útil para as terapias de longo prazo.

Exemplos de compostos naturais que contêm um átomo de flúor são ratos. Este elemento, graças às suas propriedades físico-químicas (dimensões, electronegatividade, etc.) pode dotar os compostos orgânicos, activos sob o ponto de vista biológico, com características particulares.

Nos últimos anos, com a disponibilidade de mais reagentes fluorados manipuláveis, prepararam-se derivados orgânicos com características promissoras, por exemplo, substratos de aminoácidos de enzimas dependentes de piridoxal (transaminases e descarboxilases) actuam como inactivadores específicos quando são fluorados; as pirimidinas fluoradas exercem actividade anti-cancro; análogos trifluorometilados de captorilo têm actividade inferior a nM; os análogos fluorados de antraciclinas naturais são agentes anti-cancro muito mais activos (Giannini, G., Current Medicinal Chem., 2002, 9: 1867-93); os análogos de encefalina trifluoro-metilados aumentaram a sua potência mais do que 10.000 vezes. Os análogos lineares fluorados de RGD estão descritos em A. Dal Pozzo, et al., J. Chem. Res. (S) 468-469 (1999). Ver também Ojima, J., Organofluorine Compounds in Medicinal Chemistry and Biomedical Applications; R. Filler (ed), 1993-

Elsevier Science Publisher; Qjima, I. et al., Biomedical Frontiers of Fluorine Chemistry - ACS Symposium Series 639 (1996) ; Sewald, N. et al., Amino Acids (1995) 8: 187-194. A alquilação de um aminoácido é um aspecto muito importante da química farmacêutica. Também no domínio dos inibidores de integrina, há exemplos de N-alquilação de aminoácidos (Kessler, H., et al., J. Med. Chem., 1999, 42, 3033-40), que conduzem ao produto designado por EMD 121874 (Cilengitide), desenvolvido pela Merck e que estão neste momento na fase II dos ensaios clínicos.

Muito menos frequente é a abordagem da a-alquilação, embora ela seja ainda potencialmente promissora. É sabido, de facto, que a incorporação dos aminoácidos di-substituídos com C° em posições chave dos péptidos pode modificar e estabilizar a estrutura secundária (Marshall, G. R., Int. J. Pept. Protein Res., 1998, 32, 544-5). Além disso, a substituição do flúor por hidrogénio pode afectar a estabilidade proteolítica e a solubilidade do péptido que o contém (Koksch, B., J. Pept.Sei., 1997, 3, 157-67). 0 estádio subsequente à alquilação é a fluoro-alquilação de aminoácidos. Neste caso, também, há exemplos de fluoro-alquilação de oligopéptidos lineares (Dal Pozzo, A., et al. Tetrahedron, 1998, 54: 6019-28; Koksch, B. et al. Biomedical Frontiers of Fluorine Chemistry; ACS Symposium Serie 639, Capítulo 3, 1996, 42-58) . Os péptidos fluoroalquilados apresentam as seguintes vantagens: protecção de peptidases fisiológicas, semelhantes a alqui-lo; um aumento substancial no carácter hidrofóbico (superior à maior parte dos grupos alquilo), que aumenta a biodisponibilidade (absorção e distribuição); endurecimento da conformação devido ao aumento de volume (que, em solução, é maior do que a distribuição de um simples grupo metilo) , a capacidade única de dar ligações de hidrogénio, o que, entre outras coisas, pode causar uma rotação restrita à volta da ligação de carbamida.

Um outro objecto da presente invenção é providenciar um processo de síntese de péptidos contendo, numa posição chave, aminoácidos fluoroalquilados na posição C-α e/ou N e, a despeito do volume estérico e dos efeitos electrónicos dos novos produtos, a descoberta das propriedades biológicas destes compostos, tal como inibidores selectivos potentes de inibidores de integrina αγβ3 e/ou αΥβ5.

Sumário da invenção

Verificou-se agora que os compostos de fórmula geral (I) ciclo [NXi-Ri-CO-NX2-R2-CO-NX3-R3-CO-NX4-R4-CO-NX5-R5-CO] na qual:

Ri se selecciona entre CH (CH2)3NHC (NH) NH2; C[CHnFj (CH2)3NHC (NH) NH2

CHICHJsNH—(' J; CH(CHj)2-CO-K r

H r2 representa o grupo CH2; CH2-CH2; R3 selecciona-se entre grupos CHCH2COOH; C[CHnFm]CH2_ -COOH; R4 selecciona-se entre grupos CH-CH2-Ph ; C[CHnFm] CH2-Ph; CH-CH2- (4-OH) Ph;CH-CH2- (4-OMe) Ph; CH-CH2- (4-F) Ph; 7 um simples grupo metilo), a capacidade única de dar ligações de hidrogénio, o que, entre outras coisas, pode causar uma rotação restrita à volta da ligação de carbamida.

Um outro objecto da presente invenção é providenciar um processo de síntese de péptidos contendo, numa posição chave, aminoácidos fluoroalquilados na posição C-α e/ou N e, a despeito do volume estérico e dos efeitos electrónicos dos novos produtos, a descoberta das propriedades biológicas destes compostos, tal como inibidores selectivos potentes de inibidores de integrina αγβ3 e/ou αΥβ5.

Sumário da invenção

Verificou-se agora que os compostos de fórmula geral (I) ciclo [NXi-R1-CO-NX2-R2-CO-NX3-R3-CO-NX4-R4-CO-NX5-R5-CO] na qual:

Ri se selecciona entre CH (CH2)3NHC (NH) NH2; C[CHnFj (CH2)3NHC (NH) NH2 R2 representa o grupo CH2; CH2-CH2; ; CH(CHa)2-CO-

H

CHICHjJjNH Ν' /

H R3 selecciona-se entre grupos CHCH2COOH; C[CHnFm]CH2_ -COOH; R4 selecciona-se entre grupos CH-CH2-Ph ; CtCHnFj CH2-Ph; CH-CH2- (4-OH) Ph;CH-CH2- (4-OMe) Ph; CH-CH2- (4-F) Ph; 7 CH-CH (OH) -Ph ; C (CH3)2; CH- C(CH3)3 ;CH-CH2-COOH;

CH-CHJ

H

Rs selecciona-se entre grupos CH-CH2-Ph; C [CHnFra] CH2-Ph; CH-CH (CH3) 2; C[CHnFj CH(CH3)2 ; CH-C(CH3)3 ; ou, o grupo NX4-R4-CO-NX5-R5-CO representa um grupo 3-aminometil-benzoílo, n+m=3 X1-X5, que podem ser iguais ou diferentes, representam átomos de H, grupos de fórmula geral (CH2) n-CH3; (CH2)n~ grupos de fórmula geral

CHF2 ; (CH2) n-CH2F, (CH2)n-CF3 em que n= 0-3; com a condição de que pelo menos um aminoácido a-fluoro-alquilado esteja presente no composto de fórmula geral (I), em que cada aminoácido NX-R_CO uma configuração absoluta do tipo R ou do tipo S; os seus enantiómeros individuais, diastereómeros, as misturas relacionadas, os sais aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico são inibidores selectivos dos receptores de integrina αγβ3 e/ou αγβ5.

Por isso, são objectos da presente invenção os compostos de fórmula geral (I), tal como se descreveu antes, um processo para a sua preparação, a sua utilização como medicamentos e as composições farmacêuticas que os contêm.

Descrição detalhada da invenção

De acordo com a presente invenção, os sais aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico que um especialista na matéria é capaz de preparar sem que o ácido ou a base utilizados deem efeitos colaterais indesejados, quando a os referidos sais são utilizados como medicamentos.

No contexto da presente invenção, preferem-se os seguintes compostos: c(Arg-Gli-Asp-D-Fen-(R ou S)-Tfm-Fen) (ST1930/ST1931); c(Arg-Gli-Asp-D-Fen-(R, S) -Dfm-Fen) (ST1932); c(Arg-Gli-(R ou S)-Tfm-Asp-D-Fen-Val) (ST2189/2190) ; c(Arg-Gli-Asp-(R ou S)-Tfm-Fen-Val) (ST2191/2192); c(Arg-Gli-Asp-D-Fen-(R ou S)-Tfm-Val) (ST2409/ST2410); c(Arg-Gli-Asp-D-Fen-(R ou S)-N-Me-Tfm-Fen.

No seu aspecto mais amplo, a presente invenção tem por objecto um processo para inibir de forma selectiva a adesão celular mediada pelas integrinas αγβ3 e/ou αγβ5 a um ligando contendo a sequência de RGD. Num outro dos seus aspectos, o objecto da presente invenção é a utilização de um composto de fórmula geral (I) para a preparação de um medicamento útil para o tratamento de indivíduos afectados por angiogénese anormal. Exemplos de utilização do medicamento, de acordo com a presente invenção, são a redução de metástases e o tratamento de retinopatia, insuficiência aguda do rim e osteoporose.

Num outro dos seus aspectos, a presente invenção tem por objecto a utilização dos compostos mencionados antes como agentes de diagnóstico. Em particular, os compostos de acordo com a presente invenção, quando marcados de forma apropriada, são úteis para a detecção e a localização de pequenas massas tumorais. Do mesmo modo, os referidos compostos marcados são também úteis para a análise de acontecimentos de oclusão arterial tal como ataques e enfartes do miocárdio.

Por isso, um outro objecto da presente invenção é a utilização de compostos de fórmula geral (I) , tal como se descreveu antes, para a preparação de agentes de diagnóstico, particularmente para a detecção e localização de tumores e, preferencialmente, pequenas massas tumorais ou eventos de oclusão arterial tal como ataques e enfartes do miocárdio. Também estão cobertos pela presente invenção agentes de diagnóstico contendo pelo menos um composto de fórmula geral (I) . No que se refere à marcação dos compostos de acordo com a presente invenção, isto faz parte da perícia de um técnico médio neste domínio, o qual, com base no seu conhecimento específico, é capaz de escolher o agente de marcação apropriado e fazer a derivação do composto de acordo com a presente invenção, pode ser visto na patente de invenção WO 99/11590 e nas referências que se seguem: Su, Z. F., et al., Bioconjug. Chem. Maio-Jucn 2002; 13 (3): 561-70; Haubner, R., et al., Câncer Res. Mar 2001, 1; 61 (5) : 1781-5 ; Haubner R, et al,, J. Nucl, Med, Fev 2001 ; 42 (2) : 326-36 ; van Hagen, P. M, et al., Int. J. Canner 20 Ago 2000; 90 (4): 186-98; Sivolapenko, G. B. , et al., Eur. J. Nucl. Med. Ou t 1998; 25(10): 1383-9; Pearson, D. A., et al. , J. Med. Chem. Mar 29 1996; 39 (7) : 1372-82.

De um ponto de vista químico, a presente invenção consiste na obtenção de derivados ciclizados de uma estrutura peptídica contendo um certo número de aminoácidos não naturais (aminoácidos de fluoroalquilo), cuja síntese já é conhecida e tem sido estudada apropriadamente.

Sintetizaram-se os ciclopéptidos a partir de um aminoácido fluorometilado sob a forma de um éster carboxílico; este é acilado com o brometo do aminoácido correspondente, protegido por N. Depois da hidrólise do éster de dipéptido assim obtido, o carboxilo terminal é condensado com H-Orn (Cbz)-Gli-OtBu.

Depois da eliminação da protecção do azoto terminal do tetrapéptido assim obtido, este é acilado com Fmoc-Allgli-OH (um precursor do ácido aspártico) para se obter o pentapéptido linear totalmente protegido. Depois da desprotecção dos dois grupos terminais protectores, o processo continuba com ciclização por via de TBTU, seguido de oxidação do resíduo de alilo com permanganato. As últimas etapas envolvem a libertação de Cbz na cadeia lateral de ornitina, seguida de guadinilação da função amina, para se obter o ciclopéptido final, que é purificado por CLER-PR, com separação dos dois diastereoisómeros.

Aqui a seguir descrevem-se alguns exemplos de preparações para as sínteses de aminoácidos fluorados (blocos de construção):

Preparação 1 H-(R,S)-a-Tfm-Phe-OEt (Burger, K., Gaa, K., Chemiker Zeitung, 1990, 114, 101- -104)

Preparou-se o produto conforme descrito na referência citada antes. RMN do XH (CDCla) δ 7,33-7, 18 (m, 5H, arom.), 4,26 (q, CH2. -CH3), 3,45-2,95 (dd, CH2-C6H5) , 1,32 (t, CH3) .

Preparação 2 H-(R, S)-a-Dfm-Fen-OEt (Sey, P., Vevert, J. P., Van Dorsselaer, V. e Kolb, M., J. Org. Chem. 1979, 44, 2732-42)

Preparou-se o produto conforme descrito na referência citada antes. RMN do (CDC13) δ 7,28-7,13 (m, 5H, arom.), 6,14-5,77 (t, CHF2), 4,16 (q, CH2-CH3) , 3,20-2,87 (2 dd, CH2-C6H5) , 1,21 (t, CH3) .

Preparação 3 N-CH3- {R, S)-a-Tfm-Fen-OCH3 [Buvger, K. e Hollweer, W., Synlett. 1994, 751-3)

Preparou-se o produto conforme descrito na referência citada antes. RMN do λΕ (CDC13) δ 7,28-7, 15 (m, 5H, arom.), 3,73 (s, OCH3) , 3,27, 3,22, 3,16, 3,12 (q, CH2-C6H5) , 2,47 (s, N-CH3) .

Estes blocos sintéticos (blocos de construção) são utilizados para a síntese de ciclopéptidos de acordo com a presente invenção, utilizando técnicas que serão familiares para um técnico com experiência normal na matéria.

Os exemplos que se seguem ilustram melhor a presente invenção.

Abreviaturas: TEA: tetraetilamina; THF: tetra-hidrofu-rano; LDA: litioisopropilamida; DMF: dimetilformamida; bromoenamina: l-bromo-N,N-2-trimetil-l-propenilamina; HATU: hexaflurofosfato de 0-(7-azabenzotriazol-l-il)- N,N,N1,N1,N1· -tetrametilurónio; DIEA: di-iso-propilamina; DCM: dicloro-metano; DCC: diciclo-hexilcarbodi-imida; HOAT: azabenzo-triazolo; algli: 2-alilglicina; Tfm: trifluorome-tilo; Dfm : difluorometilo; TBTU: tetrafluoroborato de 0-(benzo-triazol--l-il)N,N, N1,!*1-tetra- metilurónio.

Exemplo 1 C(Arg-Gli-Asp-D-Fen-(R ou S)-Tfm-Fen) (ST1930/ST1931)

Preparação de Pht-D-Fen-Br (Dal Pozzo, A., Bergonzi, R. e Ni, M. H.f Tetrahedron Lett., 2001, 42, 3925-7).

Dissolve-se 1,4 g (4, 75 mmole) de Pht-D-Fen-OH em atmosfera de árgon no seio de 19 mL de uma solução 0,5 M de bromoenamina no seio de DCM. Passados 10 minutos, a solução está pronta para ser utilizada. A 12,5 mL da solução de brometo (preparada como se descreveu antes), arrefecida para 0 °C, adicionou-se 248 mg (0,950 mmole) de Η-α-Tfm-Fen-OEt e colilidine (1 eq.); a mistura agita-se à temperatura ambiente (t.a.) e, passados 10 minutos, adiciona-se mais 6,5 mL da solução de brometo e 1 eq. De colidina. Passadas 2 horas, leva-se a mistura à secagem e extraiu-se no seio de 15 mL de NaHC03 a 5 % e 15 mL de EtOAc, deixando-se em agitação durante 30 minutos. Lava-se o dissolvente com água, HC1 IN e água, seguido de evaporação e purificação numa cromatografia à pressão em coluna com hexano-EtOAc 8 : 2 como o dissolvente. A uma solução de 460 mg do dipéptido Pht-D-Fen-a-Tfm-Fen-OEt no seio de 21 mL de DCM anidro, adicionou-se 4,3 mL de uma solução 1M de BBr3 no seio de DCM; faz-se a condensação da mistura em contra-corrente aquecendo-se durante 2 horas e depois lavou-se com 21 mL de água e levou-se à secagem.

Dissolveu-se 390 mg do péptido ácido (b) no seio de 6 mL de CH3CN anidro com 406,7 mg (1,4 eq) de HATU e 2,8 eq de DIEA deixando-se em agitação durante 15 minutos, depois do que se adicionou 548 mg (2 eq) de HCl H-Orn (Cbz)-OtBu e outros 2 eq de DIEA. Passadas 2 horas, diluiu-se a mistura reaccional com 15 mL de DCM e extraiu-se no seio de 20 mL de salmoura. Lava-se a fase orgânica novamente com HCl 2N, NaHC03 e água. Purifica-se o resíduo numa coluna de cromatografia à pressão com hexano-EtOAc 6 : 4 como o dissolvente.

Dissolveu-se 482 g do péptido obtido antes no seio de 2,2 mL de TFA/DCM (1 : 1) e levou-se à secagem passados 30 minutos.

Dissolveu-se 283,8 mg do composto obtido no seio de 5,7 mL de DCM, e adicionou-se HCl-H-Gli-OtBu (1 eq), DIEA (2 eq) , HOAT (3 eq) e DCC (3 eq) . Passados 20 minutos, filtra-se a mistura, lava-se o filtrado com água, HCl 0,1N, NaHC03 a 5 % e água e depois levou-se à secagem.

Dissolveu-se 349 g do tetrapéptido obtido antes no seio de 5 mL de EtOH, adicionou-se 600 pL de uma solução 1M de NH2-NH2 · H20 no seio de EtOH (1,5 eq) e faz-se a condensação da mistura em contra-corrente aquecendo-se durante 2,5 horas.

Elimina-se o EtOH e faz-se a extracção com 10 mL de DCM e 10 mL de uma solução aquosa contendo 63,6 mg de Na2C03 (1,5 eq) . Passados 10 minutos de agitação, levou-se à secagem a fase orgânica e purifica-se o resíduo por cromatografia à pressão com CHCl3-MeOH 98 : 2.

Dissolveu-se 134 mg do tetrapéptido desprotegido no seio de 2,7 mL de DCM. Adiciona-se Fmoc-AlGli-OH (1 eq) , DIEA (1 eq), HOAT (1,2 eq) e DCC (1,2 eq) e a reacção prosseguiu como se descreveu antes.

Dissolveu-se 151,6 mg do tetrapéptido obtido como descrito antes no seio de 5 mL de DCM e adiciona-se 140 pL de piperidina. Passadas 2 horas lava-se a miustura reaccional com água, tampão de pH 5,5, água, NaHC03 a 5 % e água e depois levou-se à secagem. Purifica-se o resíduo por filtração em gel de sílica, lava-se primeiro com CHC13 e depois com CHCl3-MeOH, 95 : 5.

Desprotege-se o pentapéptido no terminal carboxilo conforme se descreveu antes.

Dissolveu-se 116 mg do tetrapéptido linear desprotegido no seio de 66 mL de DMF, e adiciona-se TBTU (3 eq) , HOBT (3 eq) ed DIEA (860 pL). Passados 5 minutos, leva-se a mistura à secagem, extrai-se o resíduo com 10 mL de DCM e lava-se a solução com salmoura, HCl 2N, água, NaHC03 a 5 % e água.

Dissolveu-se 80,9 mg do pentapéptido cíclico obtido como descrito antes no seio de 6,9 mL de acetona, arrefece-se a solução e adiciona-se, gota a gota uma solução aquosa de KMn04 (100,5 mg no seio de 620 pL). Passada uma hora a 0 °C, deixa-se a mistura reaccional durante a noite à temperatura ambiente. Finalmente, adicionou-se 770 pL de H2S04 3N e adicionou-se uma solução de NaHS03 a 40 % até se conseguir uma descoloração completa. Depois de se eliminar a acetona, diluiu-se a mistura reaccional e extrai-se o produto no seio de EtOAc.

Dissolveu-se 66,8 mg do pentapéptido cíclico obtido em 1 mL de uma mistura de DMF/AcOH a 6 : 4; adiciona-se 23,8 mg de formato de amónio (5 eq.) e depois 33,4 mg de Pd/C a 10 %. Passados 15 minutos, dilui-se a mistura reaccional com MeOH e filtra-se em Celite e leva-se o filtrado à secagem.

Dissolveu-se 60,5 mg do tetrapéptido cíclico, totalmente desprotegido no seio de 540 pL de MeOH, e adiciona-se 73 pL de DIEA (5 eq) e 49,8 mg de monocloridrato de pirazole-carboxamida (4 eq.). Passada 1 hora, neutralizou-se a reacção com TFA e levou-se à seca-gem. A purificação e a separação simultânea dos 2 diastereoisómeros foram feitas por CLER-RP nas seguintes condições:

Coluna: Alltima (Alltech Italia)C18, 10 pm, 250 x 22 mm;

Fase móvel: acetonitrilo a 34 % no seio de H2O+TFA a 0,1 %.

Velocidade de fluxo : 12 mL/min.

Diastereoisómero I (Rt 21,30) ST1930

Diastereoisómero II (Rt 26,76) ST1931

Rendimento global calculado com base nas 3 últimas etapas: 33 %.

Diastereoisómero I (ST1930) RMN do (CD3OD) : δ 7,30-7,19 (m, arom.), 4,70, 4,28 e 4,08 (m, α-CH), 3,80-3,15 (CH2-Gli), 3,32 (m, CH2-N) , 16 3,15-2,0 (m CH2-Asp + CH2-Fen + CH2-Tfm-Fen) , 1,63-1,35 (m, CH2-CH2-Arg) , RMN do 19F (CD3OD) : δ 5,18. EM (M+H+) : 691,13.

Diastereoisómero II (ST1931) RMN do ΧΗ (CD3OD) : δ 7,23-7, 20 (m, arom.), 4,85-4,05 (ra, α-CH), 4,30- 3,75 (2 dd CH2-Gli), 3,18 (m, CH2-N) , 3,50- 2,50 (m CH2-Asp + CH2-Fen + CH2-Tfm-Fen) , 2,10-1,55 (m, CH2-CH2-Arg) . RMN do 19F (CD3OD) : δ 4,17. EM (M+H+) : 691,13.

Exemplo 2 c(Arg-Gli-Asp-D-Fen-(R S)-Dfm-Fen) (ST1932)

Partindo de H-(R,S)-Dfm-Fen-OEt, o processo é tal como se descreveu no Exemplo 1. Obtém-se uma mistura dos dois diastereoisómeros, que não se separaram. RMN do (CD30D) : δ 8,00-7,05 (d, NH), 7,35-7,15 (m, arom.), 6,42-5, 6 (t, CHF2), 4,74-4,32 (m, α-CH), 4,32-3,96 (2 dd, CH2-GIÍ) , 3,68-2, 50 (m) , 1,75-1,45 (m, CH2-CH2-Arg) . RMN do 19F (CD3OD): δ de 54,4 a 55,5. EM (M+H+): 673,14.

Exemplo 3 c(Arg-Gli-(R ou S)-Tfm-Asp-D-Fen-Val) (ST2189/2190)

Condensou-se H-(R,S)-Tfm-Algly-Oet com Pth-Gli-Br, depois procedeu-se conforme descrito no Exemplo 1. Separou-se a mistura dos dois diastereoisómeros e purificou-se por meio de CLER preparativa com CH3CN em água a 22 % + TFA a 0,1 %. 17

Diastereoisómero I (Rt 20.76) RMN do (DMSOD6+D20) : δ 7,30-7,12, 4,70, 4,26, 4,10 3,86, 3,60-2-70, 1,72, 1,52-1,12, 0,65. EM (M+H+) : 643,2.

Diastereoisómero II (Rt 25.44) RMN do ΧΗ (DMS0D6+D20) : δ 7,30-6, 96, 4,50, 4,15, 4,10- 2,75, 1,90, 1,62, 1,43-1, 20, 0,82, EM (M+H+) : 643,2.

Exemplo 4 C(Arg-Gli-Asp-(R ou S)-Tfm-Fen-Val) (ST2191/2192)

Condensou-se HCl. H-(R,S)-Tfm-Fen-OEt com Pth-AlGli-Br, depois procedeu-se conforme descrito no Exemplo 1. Separou-se a mistura dos dois diastereoisómeros e purificou-se por meio de CLER preparativa com CH3CN em água a 30 % + TFA a 0-1 %.

Diastereoisómero I (Rt 17.19) RMN do XH (D20) : δ 7,50-7,30, 4,90, 4,30-4,16, 4,05 3, 76- 3,60, 3,32-2,82, 2,03-170, 1,57, 0,86, 0,73, EM (M+H+) : 643,2.

Diastereoisómero II (Rt 22.17) RMN do Hí (D20) : δ 7,48-7,12, 4,5, 4,25, 4,07, 3,75-3, 10, 2,95, 2,10, 1,85, 1,63-1,00, 0,77. EM (M+H+) : 643,2. 18

Exemplo 5 c(Arg-Gly-Asp-D-Fen- (R ou S)-Tfm-Val) (ST2409/241Q)

Condensou-se HC1. H-(R,S)-Tfm-Val-OEt com Pth-D-Fen-Br (sendo um cloridrato utilizou-se um total de 3 eq. de colidina), depois procedeu-se conforme descrito no Exemplo 1, obtendo-se o tetrapéptido Pht-D-Fen- (R, S)-Tfm-Val-Orn (Cbz)-Gli-OtBu. Separou-se a mistura dos dois diastereo-isómeros intermédios por meio de cromatografia à pressão [hexano - AcOEt = 4:6] .

Diastereoisómero I (movimento rápido, Rf 0,23)

Diastereoisómero II (movimento lento, Rf 0,36)

Trataram-se separadamente os dois produtos intermédios, puros sob o ponto de vista quirálico, com duas sínteses paralelas, com etapas semelhantes às descritas no exemplo 1:

Diastereoisómero I (ST2409) RMN do 4! (D20) : δ 7,37-7, 25; 4,83, 4,73, 4,46, 4,13, 3,47, 3,21, 3,08-2, 69, 2,33, 1,92-1,50, 1,08. RMN do 19F (D20) δ 10,50, 0,97 EM (M+H+) : 643,16

Diastereoisómero II (ST2410) RMN do 1H (D20) : δ 7,37-7,29; 4, 87, 4,73, 4,56, 4,46, 3,53, 3,18, 3,00-2, 55, 1,87, 1,60, 1,18, 0,85, RMN do 19F (D20) δ 9,29, 0,97 EM (M+H+) : 643,16 19

Exemplo 6 c(Ar-Gli-Asp-D-Fen-(R ou S)-N-Me-Tfm-Fen) [ST2552/2553]

NH-Me-a-Tfm-Fen-OMe i) N3-D-Fen-OH, Bromoenamina N3-D-Fen-N-Mea-Tfm-Fen- ii) Colidina, 80,6%

Depois da hidrólise do éster no carboxi terminal, fez-se o acoplamento com HOm(Cbz)-Gli-OtBu; o grupo azida foi então reduzido com [Et3NH] [Sn (SPh)3] e o pentapéptido linear ficou completo com a condensação de Fmoc-Algli no terminal N. Tal como para o produto intermédio, a síntese do ciclopen-tapéptido continua conforme descrito no exemplo 1.

Ligação aos receptores de integrina ανβ3 ◄

Submeteram-se as placas de 96 microtubos, durante a noite, a um revestimento com 0,5 pL de integrina αγβ3 (Chemicon, cat. CC1020). No dia seguinte, lavaram-se os microtubos e fez-se a incubação com (125I) Echistatin (Amersham, cat. IM304) 0,05 nM na ausência ou na presença de compostos de acordo com a presente invenção. Passadas 3 horas de incubação e uma série de lavagens, solubilizou-se a integrina de cada microtubo, ligada à substância radioactiva, com NaOH 2N e mediu-se então a radioactividade utilizando um contador gama. Determinou-se a ligação não específica, a ser subtraída de todas as amostras, na presença de Echistatin μΜ.

Ligação aos receptores de inteqrina αγβ5

Submeteram-se as placas de 96 microtubos, durante a noite, a um revestimento com 1 pL de integrina αγβ5 (Chemicon, cat. CC1022). No dia seguinte, lavaram-se os microtubos e fez-se a incubação com (125I) Echistatin (Amersham, cat. IM304) 0,05 nM na ausência ou na presença de compostos de acordo com a presente invenção. O processo prosseguiu conforme descrito no caso anterior.

Avaliação dos parâmetros de CI50 A afinidade dos compostos, de acordo com a presente invenção, para os receptores de vitronectina foi expressa como o valor de CI50 ± DP (nM) que é um parâmetro elaborado utilizando o software "ALLFIT". O quadro 1 a seguir mostra os resultados obtidos. Em particular, ST2552 demonstrou uma elevada afinidade de ligação para ambos os receptores de vitronectina (αγβ3 e αγβ5)

Composto Quadro 1 °ίγβ3 αγβ5 CI50 ± DP (nM) ST1930 345 ± 86 6,7 ± 0,8 ST1931 7238 ± 1283 93 ± 9 ST1932 332 + 101 5,5 ± 0,8 ST2189 > 10.000 > 10.000 ST2190 > 10.000 > 10.000 ST2191 237 ± 64 10 ± 1,9 ST2192 1018 ± 348 72,7 ± 3,8 ST2409 36,3 ± 0,84 3,4 ± 0,07 ST2410 285,3 ± 8,1 42,8 ± 0,5 ST2552 O +1 00 rH 7,7 ± 0,1 ST2553 704,4 ± 9,2 93,3 ± 1,9

Culturas de células

Isolaram-se células endoteliais microvasculares de glândulas supra-renais de bovino (células endoteliais microvasculares de bovino - CEMB) de animais que tinham acabado de ser sacrificados e armazenaram-se em gelo até à sua chegada ao laboratório. Em condições esterilizadas, lavaram-se as glândulas numa solução de betadine durante 5 minutos e depois em 2 litros de SBF esterilizado. Cortaram-se então as glândulas, com uma lanceta esterilizada, descartável, em fragmentos de aproximadamente 2 mm e transferiram-se para tubos Falcon de poliestireno contendo SBF (30 mL por glândula) . Depois da centrifugação a 600 rpm numa centrifugadora arrefecida para +4 °C, decantou-se o sobrenadante. Fez-se uma nova suspensão da massa 1:2 com uma solução a 0,12 % de colagenase A (Boehringer Mannheim) e incubou-se a 37 °C durante 2 horas com agitação. Depois da filtração subsequente em cargas (Sigma), primeiro de 200 e depois de 100 mesh, adicionou-se o sobrenadante a uma solução de DMEM contendo SBF a 15 % para inibir a acção da colagenase A. Centrifugou-se a solução a 1000 rpm à temperatura ambiente e voltou a suspender-se o precipitado em meio DMEM contendo SBF a 20 %, 50 pg/mL de extracto de cérebro de bovino (ECB), 50 pg/mL de heparina (Sigma), gentamicina a 0,5 % v/v (Sigma) e L-glutamina a 1 % v/v. Semaram-se as células em pratos de Petri e gelatinizaram-se com gelatina a 1 % (gelatina porcina da Sigma). Na confluência, caracterizaram-se as células com marcadores endoteliais como factor VIII.

Mantiveram-se em cultura células MeWo de melanoma humano da American Type Culture Collection (ATCC), em Meio Essencial Mínimo de Eagle (MEME) completo contendo FCS a 10 %, L-glutamina 2 mM e 50 pg/mL de gentamicina.

Mantiveram-se todas as células a 37 “C numa atmosfera humidificada contendo 5 % de C02 Ensaio de adesão de células

Pré-trataram-se placas de 96 microtubos com 5 pg/mL de vibronectina humana (Cal- biochem) durante 12 horas a +4 °C. Separaram-se células CEMB ou MeWo com tripsina-EDTA, contaram-se e colocaram-se em placas num substrato de vitronectina. Fez-se a análise das moléculas em concentrações crescentes variando de 0,1 a 100 μΜ e fez-se uma incubação conjunta com as células que estavam aderentes. Depois da incubação das células lavaram-se uma vez com SBF e Mg 2+ de modo a eliminar as que não estavam aderentes ao substrato. Fixaram-se as células aderentes com uma solução a 4 % de para-formaldeído, durante 10 minutos, à temperatura ambiente. Coraram-se então as células com uma solução de azul de toluidina a 1 %, durante 10 minutos, à temperatura ambiente. Depois da coloração, lavaram-se as células em água duplamente destilada, secaram-se e solubilizaram-se com uma solução de SDS a 1 %. Quantificaram-se então as células por meio de uma leitura da absorvência num contador de placa de marcadores múltiplos da Victor (Wal-lac) a 600 nm. 0 parâmetro de avaliação para a actividade das moléculas foi o valor de CI50 ± DP (μΜ) O quadro 2, que se mostra aqui a seguir, indica os resultados obtidos com as moléculas previamente encontradas em que se verificou que tinham uma maior afinidade de ligação para os receptores de vitronectina. Em particular, a molécula ST2552 mostrou que inibia a adesão das células de melanoma humano MeWo à vitronectina com um valor de CI50 de 0,33 μΜ.

Quadro 2

Composto CEMB MeWo SK-LMS1 CI50 ± DP (μΜ) ST1930 8,9±0,4 6,9±1,3 / ST1932 14,2±1,0 13,9±4,3 / ST2191 18,8±4,4 21,9±2,5 / ST2192 >100 / / ST2409 12,5±1,5 / 15,9±1,6 ST2410 77,6±7,2 / >100 ST2552 >100 0,33±0,05 / consonância com um outro objecto da invenção, as composições farmacêuticas contêm pelo menos um composto de fórmula geral (I) como o ingrediente activo, numa quantidade tal que produza um efeito terapêutico significativo. As composições incluídas na presente invenção são inteiramente convencionais e obtêm-se por processos que são de prática comum na indústria farmacêutica, tal como, por exemplo, os ilustrados no Remington's Pharmaceutical Science Handbook, Mack Pub. N. Y. - na sua última edição Consoante a via de administração escolhida, as composições estarão sob a forma sólida ou líquida, apropriada para administração oral, parentérica ou intravenosa. As composições de acordo com a presente invenção contêm, em conjunto com o ingrediente activo, pelo menos um veículo ou excipiente aceitável sob o ponto de vista farmacêutico. Estes podem ser coadjuvantes particularmente úteis da formulação, por exemplo, agentes de solubilização, agentes dispersantes, agentes de suspensão e agentes emulsionantes.

Lisboa, 10 de Maio de 2007

Claims (14)

1. REIVINDICAÇÕES Compostos de fórmula geral (I) ciclo [NXi-R1-CO-NX2-R2-CO-NX3-R3-CO-NX4-R4-CO-NX5-R5-CO] caracterizados pelo facto de: Ri se seleccionar entre CH (CH2) 3NHC (NH) NH2; C[CHnFm] (CH2) 3NHC (NH) NH2 R2 representar um grupo CH2; CH2-CH2;

   N- CH{CH2)3NH—V ]; CH(CH2|2-C0-N Ν' I I Η H R3 seleccionar-se entre grupos CHCH2COOH; grupos de fórmula geral C [CHnFm] CH2-COOH ; R4 seleccionar-se entre grupos CH-CH2-Ph; C[CHnFm] CH2-Ph; CH-CH2-(4-OH)Ph; CH-CH2-(4-OMe)Ph; CH-CH2-(4-F)Ph; CH-CH (OH) -Ph; C(CH3)2; CH-C(CH3)3; CH-CH2-COOH;

   R5 seleccionar-se entre grupos CH-CH2-Ph; C[CHnFm] CH2-Ph; CH - CH (CH3)
2. 2; C[CHnFra] CH(CH3)2; CH-C(CH3)3; ou, o grupo de fórmula geral NX4-R4-CO-NX5-R5-CO representar um grupo 3-aminometil-benzoílo,em que n+m=3 Xi-X5, que podem ser iguais ou diferentes, representarem átomos de H, grupos de fórmula geral (CH2)n-CH3,·

   (CH2)n-CHF2; (CH2) n-CH2F, (CH2)n-CF3 em que n= 0-3; com a condição de que pelo menos um aminoácido a-fluoro-alquilado esteja presente no composto de fórmula geral (I) , em que cada aminoácido de fórmula geral NX-R-CO pode ter uma configuração absoluta do tipo R ou do tipo S; os seus enantiómeros individuais, diastereómeros, as misturas relacionadas, os sais aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se seleccionar no grupo que consiste em: c(Arg-Gli-Asp-D-Fen-(R ou S)-Tfm-Fen); c(Arg-Gli-Asp-D-Fen- (R, S) -Dfm-Fen); c(Arg-Gli- (R ou S)-Tfm-Asp-D-Fen-Val); c(Arg-Gli-Asp-(R ou S)-Tfm-Fen-Val); c(Arg-Gli-Asp-D-Fen-(R ou S)-Tfm-Val); c(Arg-Gli-Asp-D-Fen-(R ou S)-N-Me-Tfm-Fen.
3. Compostos de acordo com as reivindicações l ou 2 caracterizados pelo facto de se utilizarem como medicamentos .
4. 4. Utilização dos compostos de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizados pelo facto de se destinarem à preparação de medicamentos que inibem os receptores que pertencem à família das integrinas que pertencem ao sistema de αγβ3 e αΥβ5.
5. 5. Utilização de acordo com a reivindicação 4, caracteri- zada pelo facto de os referidos medicamentos terem acti-vidade antiangiogénica.
6. 6. Utilização de acordo com a reivindicação 5, caracteri- zada pelo facto de os referidos medicamentos terem acti-vidade antimetastásica.
7. 7. Utilização, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo facto de os referidos medicamentos serem úteis para o tratamento de uma doença seleccionada no grupo que consiste em retinopatia, insuficiência aguda do rim e osteoporose.
8. 8. Composições farmacêuticas caracterizadas pelo facto de conterem pelo menos um composto de acordo com as reivindicações 1 ou 2 como ingrediente activo, misturado com veículos e/ou excipientes aceitáveis sob 0 ponto de vista farmacêutico.
9. 9. Utilização de compostos de acordo com as reivindicações 1 - 2, caracterizada pelo facto de se destinar à preparação de agentes de diagnóstico para a detecção e a localização de pequenas massas tumorais ou para a análise de eventos de oclusão arterial tal como acidentes vasculares ou enfartes do miocárdio, em que os referidos compostos estão marcados. 3
10. 10. Utilização de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo facto de o referido agente de diagnós-tico ser utilizado para a detecção e localização de massas tumorais.
11. 11. Utilização de acordo com a reivindicação 10, caracte- rizada pelo facto de as massas tumorais serem pequenas.
12. 12. Utilização de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo facto de o referido agente de diagnós-tico ser utilizado para a detecção e localização de eventos de oclusão arterial.
13. 13. Utilização de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo facto de o referido evento ser um acidente vascular ou um enfarte do miocárdio.
14. 14. Agente de diagnóstico caracterizado pelo facto de conter pelo menos um composto de acordo com as reivindicações 1 ou 2. Lisboa, 10 de Maio de 2007 4