KR20050025266A - 열안정성 ｔａｑ 폴리머라제 절편 - Google Patents

Abstract

288 N-말단 아미노산이 없는 천연 테르무스 아쿠아티쿠스 (Thermus aquaticus) DNA 폴리머라제 (TaqWT) 의 절편 (TaqΔ288) 은 TaqWT, TaqΔ279 및 TaqΔ289 을 능가하는 증가된 열안정성을 보유하는 것을 발견했다. 따라서, 본 발명은 TaqΔ288, 상기 또는 그의 유도체를 코딩하는 재조합 발현 벡터 및 TaqΔ288 에 대한 정제 프로토콜을 제공한다. 본 발명은 또한 TaqΔ288 을 포함하는 키트 및 TaqΔ288 및 TaqΔ288 를 포함하는 키트의 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 핵산 템플레이트의 서열 분석 방법 및 표적 핵산의 증폭 방법에 관한 것이다.

Description

열안정성 ＴＡＱ 폴리머라제 절편{THERMOSTABLE TAQ POLYMERASE FRAGMENT}

본 발명은 분자생물한 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 DNA 폴리머라제 활성이 있는 폴리펩티드에 관한 것이다. 본 발명은 열안정성 DNA 폴리머라제 활성이 있어, 열안정성이 증강된 폴리펩티드를 제공한다. 본 발명은 또한 상기 폴리펩티드의 제조 방법을 제공한다.

에셰리키아 콜라이 (E.coli) 와 같은 중온성 미생물 유래의 DNA 폴리머라제가 당업계에 공지되어 있다. 참고 문헌으로서, 예를 들어, [Bessman 등, J. Biol. Chem. 223 (1957) 171-177] 및 [Buttin, G. 및 Kornberg, A., J. Biol. Chem. 241 (1966) 5419-5427]. 또한, 당분야에 공지된 것으로는 테르무스 아쿠아티쿠스 (Thermus aquaticus) 종과 같은 호열성 미생물 (thermophile) 유래의 DNA 폴리머라제가 있다. 초기에 존재하는 양에 비해 더 많은 양으로 기존 핵산 서열을 증폭시키기 위한 열안정성 효소의 용도는 US 4,683,195, US 4,683,202 및 US 4,965,188 에 기재되어 있으며, 상기 문헌에서는 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 방법이 기재되어 있다. Roche Diagnostics GmbH (Mannheim, Germany) 와 같은 상업적인 판매자들은 PCR 시약을 판매하며 PCR 프로토콜을 출간한다. 프라이며, 템플레이트, 뉴클레오시드 트리포스페이트, 적당한 완충액 및 반응 조건, 및 폴리머라제가 PCR 과정에 이용되며, 이는 표적 DNA 의 변성, 프라이머의 하이브리디제이션, 및 폴리머라제에 의한 상보 가닥의 합성이 수반된다. 각각의 프라이머의 신장 산물은 원하는 핵산 서열의 제작을 위한 템플레이트가 된다. 상기 특허들은 사용된 폴리머라제가 열안정성 효소인 경우, 폴리머라제가 매 변성 단계 후 추가되지 않아도 된다는 것을 개시하는데, 이는 열이 폴리머라제 활성을 악화시키지 않기 때문이다. 그러나, 순환적인 PCR 과정에서의 경우에서와 같이 반복적인 가열은, 그의 열안정성에 따라 폴리머라제의 효소 활성에 영향을 주게 된다. 주어진 횟수의 PCR 순환 후에는, 더 높은 열안정성이 있는 폴리머라제가 더 낮은 열안정성이 있는 폴리머라제보다 더 많은 효소 활성을 보유하게 된다. 따라서, 열안정성은 폴리머라제에 대해 요망되는 특징이다.

US 4,889,818 및 US 5,079,352 는 테르무스 아쿠아티쿠스 (Thermus aquaticus)유래의 분자량이 약 94 kDa 인 열안정성 DNA 폴리머라제 (Taq DNA 폴리머라제, 또한 TaqWT 로도 명명됨) 의 분리 및 재조합적 발현 및 PCR 에서의 상기 폴리머라제의 용도를 기재한다.

테르무스 아쿠아티쿠스 (T. aquaticus) DNA 폴리머라제는, 예를 들어, 그의 높은 합성 속도 (매 초 약 75 개의 뉴클레오티드를 합성할 수 있다) 로 인해 PCR 및 다른 재조합 DNA 기술에서의 용도에 특히 바람직하다. 그럼에도 불구하고, 대안적인 열안정성 폴리머라제에 대한 수요가 여전히 있다. 특히, DNA 폴리머라제의 증강된 열안정성은, 연장된 초기 열 인큐베이션이 PCR 에 우선하는 경우 유리하다. 상기 경우에 대한 예는, 효소 활성을 가역적으로 블로킹하기 위해 화학적으로 개질된 DNA 폴리머라제의 DNA 폴리머라제 활성의 활성화이다.

특히, Taq DNA 폴리머라제의 열안정성은 다른 폴리머라제의 것을 능가한다. 95℃ 에서의 정제된 TaqWT 의 반감기는 안정화된 제제에서는 약 40 분이고, Light Cycler PCR 에 대해 사용되는 전형적인 반응 혼합물에서는 약 20 분이지만, 기타 DNA 폴리머라제, 예컨대 Pwo DNA 폴리머라제 (피로코코스 우에세이 (Pyrococcus woesei) 유래; Roche Catalogue No. 1664947) 에서는 증가한다. Pwo DNA 폴리머라제는 100℃ 에서의 반감기에 있어서, 상기 온도에서의 반감기가 5 분 미만인 Taq DNA 폴리머라제에 비해 2 시간을 더 초과하는 증가된 열적 안정성을 나타낸다.

WO 91/02090 는 테르무스 아쿠아티쿠스 (Thermus aquaticus) 로부터 정제된 열안정성 DNA 폴리머라제를 기재한다. 상기 폴리머라제는, 온전한 폴리머라제 (몰 중량 94 kDa) 의 80 또는 85 kDa 인 분해 생산물이며, 실질적으로 5'-3' 엑소뉴클리아제 활성이 없다. 상기 폴리머라제에 대한 서열 데이터는 제공되지 않는다.

Lawyer, F.C., 등은 문헌 [J. Biol. Chem. 264 (1989) 6427-6437] 에서 E. coli 에서의 테르무스 아쿠아티쿠스 유래 DNA 폴리머라제 유전자의 분리, 특징화 및 발현을 기재했다. 천연 효소의 N-말단이 없는 Taq DNA 폴리머라제 절편을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 발현 벡터의 클로닝이 또한 개시되어 있다.

Kaledin 등은 문헌 [Chemical Abstract 93, No. 40169 p (1989)] 에서 분자량이 약 60 - 62 kDa 인, 테르무스 아쿠아티쿠스 유래의 열안정성 DNA 폴리머라제 효소의 정제에 관해 보고했다. 상기 폴리머라제에 대해서는 서열 데이터가 제공되지 않았다.

Chien 등은 문헌 [Chemical Abstract 85, No. 155559 t (1976)] 에서 테르무스 아쿠아티쿠스 유래의 열안정성 DNA 폴리머라제 효소의 정제에 대해 보고했다. 상기 효소의 분자량은 수크로스 구배 원심분리로 측정하여 68 kDa 이고, 겔 여과로 측정하여 63 kDa 임을 보고한다. 상기 폴리머라제에 대해서는 서열 데이터가 제공되지 않았다.

US 5,616,494 는 N-말단 235 아미노산 잔기가 배제된 Taq DNA 폴리머라제의 효소적으로 활성인 절단된 절편을 교시한다. 정제된 효소는 완전히 활성인 것으로 기재되어 있으나, 감소된 진행성 (processivity) 을 가지며, 5' 엑소뉴클레아제 활성이 결여되어 있다. 천연 Taq DNA 폴리머라제와 비교해 보면, PCR 증폭 반응을 완성하기 위해서는 결손 (delting) 절편에 더 많은 단위의 DNA 폴리머라제가 필요하다. 추가적인 N-말단 메티오닌이 있는 절단 형태를 E. coli 에서 발현시켰다.

US 5,885,813 는 그의 dNMP 결합 부위에서 천연 Taq DNA 폴리머라제 잔기 667 에 상응하는 위치에 타이로신 잔기가 있는 271 및 272 아미노산의 N-말단 결여가 있는 Taq DNA 폴리머라제의 효소적으로 활성인 절단된 형태를 개시한다. 두 절단된 형태는, 각각 리딩 프레임에 융합된 추가적인 메티오닌-코딩 개시 코돈을 사용해 E. coli 에서 발현시켰다.

US 5,079,352 는 분자량이 약 61 kDa 인 Taq DNA 폴리머라제의 절단된 형태를 교시한다 (실시예 IX). 정제 동안, 상기 형태 (Stoffel 절편으로도 공지되어 있음) 는 원래 단백질분해 인공물로서 인식되었다. N-말단 서열분석은 상기 절단된 형태가 Glu289 및 Ser290 사이의 단백질분해 절단의 결과로서 수득된다는 것을 증명한다. 천연 Taq DNA 폴리머라제의 N-말단 유래의 289 아미노산의 결실은 완전히 활성인 DNA 폴리머라제를 제공한다. 상기 문헌은 절단된 형태, 즉 Stoffel 절편을 코딩하는 DNA 및 추가적인 메티오닌-코딩 개시 코돈을 포함하는 벡터의 구축을 추가로 기재한다. 상기 벡터를 이용하여, 분자량이 약 61 kDa 인 천연 Taq DNA 폴리머라제의 절단된 형태를 E. coli 에서 발현시켰다. 본 발명의 문헌에서, US 5,079,352 에서 기재된 바와 같은 천연 Taq DNA 폴리머라제의 Stoffel 절편 (Applied Biosystems 에서 상표명 AmpliTaq DNA 폴리머라제로서 시판되어 입수가능) 은 추가로 TaqΔ289 로 명명된다.

US 5,436,149 는 효소적으로 활성인 절단된 테르무스 아쿠아티쿠스 DNA 폴리머라제를 교시하는데, 여기서 N-말단 279 아미노산 잔기는 배제되었다. 절편을, 천연 Taq DNA 폴리머라제 잔기 280 에 상응하는 아미노산을 코딩하는 리딩 프레임에 융합된, 메티오닌 (개시 코돈) 및 글리신 잔기를 코딩하는 2 개의 추가적인 코돈을 사용해 E. coli 에서 발현시켰다. 상기 본문에서, US 5,436,149 (AB Peptides, Inc 에서 시판되어 입수가능한 Klentaq1 및 Clontech, Inc 에서 시판되어 입수가능한 AdvanTaq DNA Polymerase 로도 공지되어 있음) 에 기재된 바와 같은 천연 Taq DNA 폴리머라제의 절편은 추가로 TaqΔ279 로 명명된다. 절단된 형태의 효소 활성은 99℃ 의 온도에 대한 노출이 반복되어도 생존함을 나타낸다.

당분야의 견해에서는, 상기 기재된 PCR 과정을 개선하고, 기타 재조합 기술, 예컨대 DNA 서열분석, 및 DNA 폴리머라제 활성에 의한 DNA 프라이머의 온도 의존성 신장에서 열안정성 DNA 폴리머라제를 사용하는 경우 수득되는 결과를 개선하기 위해 사용될 수 있는 정제된, 열안정성 DNA 폴리머라제가 요망된다.

본 발명자들은 놀랍게도 288 N-말단 아미노산이 결여된 천연 테르무스 아쿠아티쿠스 DNA 폴리머라제 (TaqWT) 의 절편 (TaqΔ288) 이 TaqWT, TaqΔ279 및 TaqΔ289 를 초월하는 증가된 열안정성을 보유한다는 것을 발견했다. 따라서, 본 발명은 TaqΔ288, 상기 또는 그의 유도체를 코딩하는 재조합 발현 벡터 및 TaqΔ288 에 대한 정제 프로토콜을 제공함으로써 상기 기재된 필요성을 충족하도록 보조한다. 본 발명은 또한 TaqΔ288 을 포함하는 키트, 및 TaqΔ288 및 TaqΔ288 을 포함하는 키트의 용도를 제공한다. 또한, 본 발명은 핵산 템플레이트의 서열분석 방법 및 표적 핵산의 증폭 방법을 제공한다.

본 발명의 이해를 돕기 위해서, 몇가지 용어를 하기에 정의한다.

아미노산 식별자는 아미노산의 3-문자 약자 및 단문자 알파벳을 이용한다: 즉, Asp D 아스파르트산, Ile I 이소류신, Thr T 트레오닌, Leu L 류신, Ser S 세린, Tyr Y 타이로신, Glu E 글루탐산, Phe F 페닐알라닌, Pro P 프롤린, His H 히스티딘, Gly G 글리신, Lys K 라이신, Ala A 알라닌, Arg R 아르기닌, Cys C 시스테인, Trp W 트립토판, Val V 발린, Gln Q 글루타민, Met M 메티오닌, Asn N 아스파라긴. 아미노산 서열 내 특정 위치에서의 아미노산은 그의 3-문자 약자 및 숫자로 주어진다. 예로서, 서열 번호 2 의 천연 Taq DNA 폴리머라제의 아미노산 서열을 참조하면, "Glu7" 은 아미노산 위치 7 에서의 글루탐산 잔기를 의미한다.

용어 "세포", "세포주", 및 "세포 배양물" 은 호환하여 사용할 수 있으며, 상기 모든 정의에는 자손들이 포함된다. 따라서, 용어 "형질전환체" 또는 "형질전환 세포" 에는 1 차 형질전환 세포 및 계대의 횟수에 상관없이 상기 세포로부터 유도된 배양이 포함된다. 모든 자손들이 DNA 함량에 있어서 의도하거나 또는 의도하지 않은 돌연변이에 의해 정확하게 일치하지 않을 수 있다. 원래 형질전환된 세포에서 스크리닝된 것과 동일한 기능을 가진 돌연변이 자손도 형질전환체의 정의에 포함된다.

용어 "조절 서열 (control sequence)" 은 특별한 숙주 세포에서 작동적으로 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 DNA 서열을 의미한다. 원핵생물에 적합한 조절 서열에는, 예를 들어 프로모터, 임의로는 작동자 서열, 리보솜 결합 부위 및 가능한 기타 서열이 포함된다. 진핵 세포는 프로모터, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서를 이용하는 것으로 공지되어 있다.

용어 "발현 시스템" 은, 작동가능한 결합으로 원하는 코딩 서열 및 조절 서열을 포함하여, 상기 서열로 형질전환된 숙주가 코딩되는 단백질을 생산할 수 있도록 하는 DNA 서열을 의미한다. 형질전환을 유효화하기 위해서는, 발현 시스템은 벡터 상에 포함되어야 하나, 관련 DNA 는 또한 숙주 염색체에 통합될 수도 있다.

용어 "유전자" 는 회수가능한 생활성 폴리펩티드 또는 전구체의 제조에 필요한 조절 및 코딩 서열을 포함하는 DNA 서열을 의미한다. 폴리펩티드는 전장 코딩 서열 또는 효소 활성이 유지되는 한 코딩 서열의 임의의 부분에 의해 코딩될 수 있다.

용어 "작동적으로 연결된 위치에" 및 "작동적으로 연결된" 은 코딩 서열에 의해 코딩되는 단백질의 발현을 구동하기 위해 조절 서열이 기능하도록 하는 코딩 서열의 배치를 의미한다. 따라서, 조절 서열에 "작동적으로 연결된" 코딩 서열은 코딩 서열이 조절 서열의 지령 하에 발현될 수 있는 배치를 의미한다.

용어 "비이온성 중합체 계면활성제" 는 이온 전하가 없으며, 본 발명의 목적 상 TaqΔ288 를 pH 범위 약 3.5 내지 약 9.5, 바람직하게는 4 내지 8.5 에서 안정화시키는 능력을 특징으로 하는 계면활성제를 의미한다.

본원에 사용된 용어 "올리고뉴클레오티드" 는 2 개 이상, 바람직하게는 3 개 이상, 일반적으로 10 개 이상의 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드를 포함하는 분자로서 정의된다. 정확한 크기는 다수의 인자에 따라 가변적이며, 이는 올리고뉴클레오티드의 궁극적인 기능 또는 용도에 따라 가변적이다. 올리고뉴클레오티드는 합성되거나 또는 클로닝으로 유도될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "프라이머" 는 프라이머 신장이 개시되는 조건 하에 위치하는 경우 합성 개시 시점으로서 작용할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 올리고펩티드 "프라이머" 는 정제된 제한 절단 (restriction digest) 에서와 같이 자연적으로 발생하거나 또는 합성하여 제조될 수 있다. 핵산 가닥에 상보적인 프라이머 신장 생성물의 합성은, 적합한 온도의 적절한 완충액 내에서 4 가지의 상이한 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 열안정성 폴리머라제 효소의 존재 하에 개시된다. "완충액" 에는 보조인자 (예컨대, 2 가 금속 이온) 및 염 (적절한 이온력을 제공하기 위함) 이 포함되며, 원하는 pH 로 조정된다.

프라이머는 증폭시 최대 효율을 위해서는 단일 가닥이 되나, 그와 달리 이중가닥일 수 있다. 이중 가닥인 경우, 프라이머는 신장 생성물 제조에 사용되기 전에 먼저 그의 가닥들을 분리하도록 처리된다. 프라이머는 일반적으로 올리고디옥시리보뉴클레오티드이다. 프라이머는 폴리머라제 효소의 존재 하에 신장 생성물 합성을 도모하기에 충분히 길어야만 한다. 프라이머의 정확한 길이는 다수의 인자들, 예컨대 프라이머의 공급원 및 원하는 결과에 따라 가변적이며, 템플레이트에 대한 프라이머의 적절한 어닐링을 보장하기 위해서는 반응 온도는 프라이머 길이 및 뉴클레오티드 서열에 따라 조정되어야 한다. 표적 서열의 복잡성에 따라서는, 올리고뉴클레오티드 프라이머는 전형적으로는 15 내지 35 개의 뉴클레오티드를 포함한다. 짧은 프라이머 분자는 일반적으로 템플레이트와 충분히 안정한 복합체를 형성하기 위해서는 더 낮은 온도를 필요로 한다.

프라이머는 템플레이트의 특정 서열의 가닥에 대해 "실질적으로" 상보적이 되도록 선택된다. 프라이머는 발생할 프라이머 신장에 대한 템플레이트 가닥과 하이브리다이즈하기에 충분히 상보적이어야 한다. 프라이머 서열이 템플레이트의 정확한 서열을 반영할 필요는 없다. 예를 들어, 비상보성 뉴클레오티드 절편은, 가닥에 실질적으로 상보적인 프라이머 서열의 잔부와 함께 프라이머의 5' 말단에 결합될 수 있다. 비상보성 염기 또는 더 긴 서열도 프라이머에 분포될 수 있으나, 단 프라이머 서열은 하이브리다이즈할 템플레이트의 서열에 충분히 상보적임으로써, 프라이머의 신장 생성물 합성을 위한 템플레이트 프라이머 복합체를 형성한다.

용어 "제한 엔도뉴클레아제" 및 "제한 효소" 는 특이적인 뉴클레오티드 서열또는 그 부근의 이중 가닥 DNA 를 절단하는 박테리아 효소를 의미한다.

용어 DNA 폴리머라제 활성이 있는 "열안정성" 폴리펩티드는 열에 대해 안정하며, 내열성이고 템플레이트 핵산 가닥에 상보적인 프라이머 신장 생성물 형성에 적절한 방식으로 뉴클레오티드의 조합을 촉매 (촉진) 하는 효소를 의미한다. 일반적으로, 프라이머 신장 생성물의 합성은 프라이머의 3' 말단에서 시작하며, 합성이 종결될 때까지 템플레이트 가닥을 따라 5' 방향으로 진행한다. 열안정성 DNA 폴리머라제의 한 예는 Taq DNA 폴리머라제 (TaqWT) 또는 그의 결실 절편, 예컨대 TaqΔ279, TaqΔ289, 및 본 발명의 효소, 즉 TaqΔ288 이다.

DNA 폴리머라제 활성에 대한 검정에서는, 말단 서열이 G+C 풍부이며, 서로 하이브리다이즈할 수 있는 DNA 올리고뉴클레오티드를 이용한다. 올리고뉴클레오티드는 말단 서열이 하이브리다이즈하는 경우 루프를 형성한다. 하이브리디제이션은 5' 단일 가닥 돌출로 마감되는 이중 가닥 DNA 의 짧은 스트렛치를 유도한다. 동시에, 반대편 가닥에서는 말단 3' OH 관능기가 제공되어, DNA 폴리머라제에 대한 기질을 나타낸다. DNA 폴리머라제 활성을 지지하는 조건 하에서 반응 혼합물 내 dNTP 및 2 가 이온의 존재 하에서, DNA 폴리머라제는 템플레이트 가닥에 상보적인 뉴클레오티드와 함께 말단 3' OH 관능기가 있는 가닥, 즉 5' 돌출이 있는 가닥의 신장을 촉매한다. 5' 돌출이 블런트 말단으로 더 이상 전환되지 않을 때까지 반응이 진행한다.

검정은 DNA 폴리머라제 활성으로 촉발되는 형광 공명 에너지 이동 (FRET) 의 원리을 근거로 한다. 일반적으로, 첫번째 및 두번째 표지 형광발색단으로서는, 상호작용하여 FRET 을 생성할 수 있는 것이 바람직하다. 상기 기재된 특별한 올리고뉴클레오티드를 셋팅하는 검정에 대해서는, 5' 단일-가닥 돌출을 초기에 제공하는 뉴클레오티드에 근접한 위치에서 이중-가닥 부분 내에서, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체가 제 1 형광발색단에 결합하여 위치하는 것이 사용된다. 바람직하게는, 제 1 형광발색단이 플루오레신 (fluorescein) 이다. 5' 단일-가닥 돌출 내에 및 형광발색단-표지된 제 1 위치로부터 약 10 뉴클레오티드인 위치에 아데닌이 있다. dTTP 대신에, 반응 혼합물은 표지된 dUTP 또는 표지 및 비표지 dUTP 의 혼합물을 포함할 수 있으며; dUTP 는 반대편 가닥에 혼입되어 상기 아데닌과 짝지어질 수 있다. 바람직하게는, dUTP 에 결합된 표지는 제 2 형광발색단으로서의 LightCycler-Red 640 이다. 일단 표지된 dUTP 가 DNA 폴리머라제 효소 활성에 의해 혼입되면, 제 1 및 제 2 표지는 FRET 를 지지하는 부근에 있게 된다. 표지된 dUTP 가 혼입된 올리고뉴클레오티드 분자는, LightCycler-Red 640 이외의 플루오레신에 대해 특이적인 여기 파장으로 정해진 빛을 이용해 FRET 을 정량하고, 형광측정기를 이용해 LightCycler-Red 640 의 발광 파장에서 발광을 측정함으로써 측정될 수 있다. 당업자는 FRET 을 정량하기 위한 상기 원리, 방법 및 기구를 알 것이다.

FRET 검정을 이용하여, 본 발명자들은 TaqWT, TaqΔ289, TaqΔ279 및 TaqΔ288 을 비교함으로써, 각각의 폴리머라제가 E. coli 에서 재조합적으로 발현되었다. 각각의 발현 배양의 분해물 (lysate) 에서, 각각의 DNA 폴리머라제는 DNA 폴리머라제 활성의 열안정성에 대해 시험했다. 활성은 97℃ 에서 35 분 동안의 인큐베이션 전후로 분해물 샘플에서 측정했다. 놀랍게도, 열처리에 의해 TaqWT, TaqΔ289 및 TaqΔ279 의 DNA 폴리머라제 활성은 50% 미만으로 감소했으며, TaqΔ279 에서는 약 30% 내지 약 50% 미만의 활성이 보유되었고, TaqΔ289 에서는 약 15% 내지 약 30% 의 활성이 보유되었고, TaqWT 에서는 0% 내지 약 5% 의 활성이 보유되었다. 대조적으로, TaqΔ288 은 약 50% 초과 내지 약 80% 의 말단 메티오닐 보유 활성을 가진 채 발현했다.

동일한 FRET 활성 검정을 이용하여, TaqWT 및 TaqΔ288 을 PCR 반응 혼합물에서의 정제된 효소로서 비교했다. 98℃ 에서 30 분 동안의 열 인큐베이션 후, TaqWT 는 활성을 약 10% 내지 약 15% 보유했다. 대조적으로, TaqΔ288 는 활성을 약 30% 내지 약 35% 보유했다.

동일한 FRET 활성 검정법을 이용하여, TaqWT, TaqΔ279 및 TaqΔ288 을 안정화된 제제, 즉 50% 글리세롤을 함유하는 저장 완충액에서 정제된 효소로서 비교했다. TaqWT, TaqΔ279 및 TaqΔ288 을 동일한 저장 완충액에서 유지했다. 98℃ 에서 30 분간의 열 인큐베이션 후, TaqWT 은 활성을 약 40% 내지 약 50% 로 보유했다. TaqΔ279 는 활성을 약 80% 내지 약 100% 보유했다. TaqΔ288 는 활성을 약 90% 내지 약 100% 보유했다.

N-말단 메티오닌의 유무시 TaqΔ288 의 열안정성은 구분할 수 없었다.

본 발명의 제 1 구현예는 DNA 폴리머라제 활성이 있는 폴리펩티드로서, 폴리펩티드의 아미노산 서열이 Taq DNA 폴리머라제의 N-말단 288 아미노산이 결실된 테르무스 아쿠아티쿠스 (Taq) DNA 폴리머라제의 아미노산 서열인 것을 특징으로 한다. 본문에서, 상기 폴리펩티드는 또한 TaqΔ288 로도 명명된다. 바람직하게는, 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열은 서열 번호 2 의 아미노산 서열이다.

본 발명에 따른 폴리펩티드는 한 가지 이상의 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드는 폴리펩티드를 재조합적으로 발현하는 형질전환된 숙주 세포로부터 수득될 수 있다. 그러나, 폴리펩티드의 아미노산 서열은 폴리펩티드를 코딩하는 오픈 리딩 프레임의 코돈에 의해 조정된다. 기능성 오픈 리딩 프레임은 N-말단 메티오닌 잔기를 코딩하는 개시 코돈을 필요로 한다. 따라서, 본 발명의 다른 구현예에서 폴리펩티드의 아미노산 서열은 추가적으로 N-말단 메티오닌 잔기를 갖는다. 바람직하게는, 폴리펩티드의 아미노산 서열은 서열 번호 4 의 아미노산 서열이다. 본문에서, 서열 번호 2 및 서열 번호 4 의 폴리펩티드는 모두 TaqΔ288 로서 명명된다.

바람직하게는, 폴리펩티드의 열안정성은 천연 효소, 즉 서열 번호 7 에 따른 원래의 아미노산 서열을 가진 Taq DNA 폴리머라제 (TaqWT) 와 비교하면 증강된다. 또한, 열안정성은 결실 절편 TaqΔ289 및 TaqΔ279 와 비교하면 증강된다. 본 발명자들은 재조합적으로 발현시 E. coli TaqΔ288 (N-말단 메티오닌이 있음), TaqΔ289, TaqΔ279 및 TaqWT 에서와 동일한 조건 하에서, TaqΔ288 는 다른 것들과 비교하면 최고의 열안정성을 갖는 것으로 관찰되었다.

본 발명의 또다른 구현예는 본 발명에 따른 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이다. 당업자는 본 발명에 따른 DNA 폴리머라제 활성 및 증가된 열안정성이 있는 폴리펩티드가 재조합 DNA 기술에 의해 가장 용이하게 구축된다는 사실을 인지할 것이다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 1 또는 서열 번호 3 의 뉴클레오티드 서열이다.

또한, 당업자는 폴리펩티드의 최초의 10 내지 20 개 아미노 말단 아미노산 잔기를 코딩하는 뉴클레오티드 서열로 도입될 수 있고 폴리펩티드의 서열에 영향을 미치지 않는 사일런트 코돈 변화 (즉, 코딩되는 아미노산은 변경되지 않는다) 를 인지한다. 상기 변화들은 최적화된 뉴클레오티드 서열을 유도할 수 있으며, E. coli 와 같은 세포 또는 형질전환된 숙주 세포 내에서의 본 발명에 따른 폴리펩티드의 증산과 같은 무세포 발현 시스템에서 있을 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 기타 최적화된 뉴클레오티드 서열은 완전한 코딩 서열 내에 사일런트 코돈 변화들을 도입함으로써 수득될 수 있다. 상기는 원핵 숙주 세포, 예를 들어, 바실러스 (Bacillus) 종에서 또는 진핵 숙주 세포, 예컨대 효모 세포에서, 바람직하게는 메틸영양성 (methylotrophic) 효모 세포에서 발현되는 경우 특히 유용하다.

발현 벡터 구축을 위해서, 본 발명에 따른 DNA 폴리머라제 활성을 가진 폴리펩티드, 또는 활성을 악화시키지 않는 추가적인 서열 또는 활성 단백질을 제공하기 위한 제어된 조건 (예컨대 펩티다아제의 처리) 하에 절단가능한 추가적인 서열에 대한 폴리펩티드의 융합체를 코딩하는 DNA 가 수득된다. 이어서, 코딩 서열은 발현 벡터 내 적합한 조절 서열과 작동적으로 연결되어 위치한다. 따라서, 본 발명의 또다른 구현예는 본 발명에 따른 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 벡터이다.

벡터는 적합한 숙주 세포를 형질전환하기 위해 사용되며, 형질전환된 숙주 세포는 DNA 폴리머라제 활성이 있는 재조합 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건 하에 배양된다. 벡터는 숙주 세포에서 자가복제되거나 또는 숙주 세포의 염색체 DNA 에 통합되도록 고안될 수 있다.

각각의 후속적인 단계들은 다양한 방식으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 원하는 코딩 서열은 게놈 절편에서 수득되어 적절한 숙주에 직접 이용될 수 있다. 각종 숙주에서 작동가능한 발현 벡터의 구축은 하기와 같이 일반적으로 제시되는 적당한 레플리콘 (replicon) 및 조절 서열을 이용하여 수행된다. 원하는 코딩 및 조절 서열을 포함하는 적합한 벡터의 구축은 당업계에 공지된 표준 라이게이션 및 제한효소 기술 (restriction technique) 을 이용한다. 분리된 플라스미드, DNA 서열, 또는 합성된 올리고뉴클레오티드는 원하는 형태로 절단, 개질 및 다시 라이게이션된다. 적합한 제한효소 부위는, 정상적으로 이용가능한 경우가 아니라면, 하기에 예시된 바와 같이 코딩 서열의 말단에 추가되어 발현 벡터의 구축을 촉진할 수 있다.

서열 개질이 필요한 벡터 또는 코딩 서열의 부분에 대해서는, 각종 부위 특이적 프라이머 지령 돌연변이 방법 (site-specific primer-directed mutagenesis method) 이 이용가능하다. 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 이 부위 특이적 돌연변이화에 이용될 수 있다. 당분야의 근래 표준적인 또다른 기술에서는, 원하는 돌연변이를 코딩하는 합성 올리고뉴클레오티드가, 돌연변이화 프라이머의 신장 생성물의 구축을 위한 템플레이트로서 제공되는 단일 가닥 벡터, 예컨대 pBS13+ 의 상보적인 핵산 서열의 직접합성을 위한 프라이머로서 사용된다. 돌연변이화된 DNA 는 숙주 박테리아로 형질전환되고, 형질전환된 박테리아의 배양물은 평판배양되어 동정된다. 개질된 벡터의 동정은, 선택된 형질전환체의 DNA 의 니트로셀룰로오스 필터 또는 기타 멤브레인으로의 이동 및 개질된 서열에 대한 정확한 대응의 하이브리디제이션을 허용하나 원래 가닥과의 하이브리디제이션은 방지하는 온도에서 키나아제로 처리된 합성 프라이머로 하이브리다이즈되는 "리프트 (lift)" 가 수반된다. 프로브와 하이브리다이즈하는 DNA 를 포함하는 형질전환체는 이어서 배양되어 개질 DNA 의 수용자로서 제공된다.

당업자는 또한 소위 "히스티딘 택 (histidine tag)" 을 포함하는 융합 폴리펩티드의 재조합 수단에 의한 구축을 허용하는 발현 벡터를 인지한다. (폴리)히스티딘 택은 바람직하게는 6 개의 연속적인 히스티딘을 포함하는 아미노산 서열이다. 히스티딘 택은 일반적으로 원하는 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 융합된다. 상기 융합 폴리펩티드의 정제는 폴리히스티딘 택 융합 폴리펩티드가 금속-킬레이팅 수지 상에 고정된 금속 이온에 의해 흡착되는 고정 금속 친화 크로마토그래피에 의해 촉진된다. 그의 한 예는 Qiagen 사로부터의 QIAexpress purification system 이다. 동일한 회사에서 폴리히스티딘-택 융합 폴리펩티드 제조에 사용될 수 있는 발현 벡터 (pQE) 를 제공한다.

그러나, 히스티딘 택은 DNA 활성이 있는 정제된 폴리펩티드의 일부로서 반드시 요망되는 것은 아니다. 상기 말단에, 프로테아제 절단 부위를 제공하는 추가적인 서열이 히스티딘 택과 원하는 폴리펩티드 사이에 삽입될 수 있다. 공지된 한 예는 인자 X 프로테아제에 대한 절단 부위를 제공하는 서열이다. 따라서, 본 발명의 또다른 구현예는 본 발명의 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 벡터이다. 바람직하게는, DNA 서열은 (i) 말단 히스티딘 택, (ii) 히스티딘 택 부근에 인자 X 프로테아제 절단 부위를 제공하는 아미노산 서열, 및 (iii) 본 발명에 따른 폴리펩티드로 이루어진 융합 폴리펩티드를 코딩한다. 융합 폴리펩티드 내의 인자 X 프로테아제 절단 부위는 인자 X 프로테아제 활성이 있는 단백질에 의해 인식 및 절단될 수 있다는 사실이 이해될 것이다. 더욱 바람직하게는, DNA 서열은 서열 번호 5 의 아미노산 서열을 가진 융합 폴리펩티드를 코딩한다.

본 발명에 따른 DNA 폴리머라제 활성을 가진 폴리펩티드 또는 그의 유도체, 예컨대 융합 폴리펩티드를 제조하는 것을 원하는 경우, 폴리펩티드의 재조합 형태의 제조는 전형적으로는 발현 벡터, 즉 재조합 DNA 벡터의 구축, 벡터를 가진 숙주 세포의 형질전환체의 구축 및 발현이 발생할 수 있는 조건 하에서의 형질전환된 숙주 세포의 배양이 수반된다. 따라서, 본 발명의 또다른 구현예는 본 발명에 따른 재조합 DNA 벡터로 형질전환된 재조합 숙주 세포이다.

조절 서열, 재조합 DNA 벡터, 및 형질전환법은 유전자 발현에 사용되는 숙주 세포의 유형에 좌우된다. 일반적으로, 원핵 생물, 효모, 곤충 또는 포유류 세포가 숙주로서 사용된다. 원핵 생물 숙주는 일반적으로 재조합 단백질 제조에 가장 유효하며 간편하고, 따라서 본 발명의 폴리펩티드 또는 융합 단백질의 발현에 바람직하다.

재조합 단백질 발현에 가장 빈번히 사용되는 원핵 생물은 E. coli 이다. 당업자는 본 발명의 수행에 사용될 수 있는 다수의 E. coli 균주 및 발현 시스템을 알 것이다. 그러나, 본 발명의 열안정성 DNA 폴리머라제의 재조합 발현을 위해서는 E. coli 이외의 미생물 균주, 예컨대 바실리 (bacilli), 예를 들어 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 각종 슈도모나스 (Pseudomonas), 및 기타 박테리아 균주가 사용될 수 있다. 상기 원핵 생물 시스템에서는, 숙주 또는 숙주와 상용성인 종들 유래의 조절 서열 및 복제 부위를 포함하는 플라스미드 벡터가 전형적으로 사용된다.

박테리아에 추가하여, 진핵성 미생물, 예컨대 효모도 재조합 숙주 세포로서 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 폴리펩티드 또는 융합 폴리펩티드는, 진핵성 미생물 숙주 유기체로서 바람직하게는 메틸영양성 효모를 사용하여 제조될 수 있다. 메틸영양성 효모는 메탄올 이용에 필요한 생화학적 경로를 갖고 있으며, 세포 형태 및 성장 특징을 근거로 4 개의 속으로 분류된다: 한세눌라 (Hansenula), 피키아 (Pichia), 캔디다 (Candida), 및 토룰롭시스 (Torulopsis). 가장 고등으로 발생된 메틸영양성 숙주 시스템은 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris) (코마가타엘라 파스토리스 (Komagataella pastoris)) 및 한세눌라 폴리모르파 (Hansenula polymorpha) (피키아 안구스타 (Pichia angusta)) 를 이용한다. 효모에서의 이종성 단백질의 발현은 US 5,618,676, US 5,854,018, US 5,856,123 및 US 5,919,651 에 기재되어 있다.

종결자 서열은 또한 코딩 서열의 3' 말단에 위치하는 경우 발현을 증강시킬 수 있다. 상기 종결자는 효모-유도 유전자에서 코딩 서열 이후 3' 비번역 영역에서 발견된다. 효모-상용성 프로모터, 복제의 기원 (origin), 및 기타 조절 서열을 포함하는 임의의 벡터는 본 발명의 열안정성 DNA 폴리머라제에 대한 효모 발현 벡터 구축에서의 용도에 적합하다.

더욱이, 본 발명에 따른 DNA 폴리머라제 활성을 가진 폴리펩티드 또는 이를 포함하는 융합 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 또한 다세포 유기체로부터 유래된 진핵성 숙주 세포 배양물에서 발현될 수 있다.

사용되는 숙주 세포에 따라, 형질전환은 상기 세포에 적합한 표준 기술을 이용하여 수행된다. 문헌 [Cohen, S.N., 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69 (1972) 2110-2114] 에 기재된 바와 같은 염화칼슘을 이용하는 칼슘 처리법은 실질적인 세포벽 배리어를 포함하는 원핵 생물 또는 기타 세포에 대해 이용된다. 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens) 가 있는 곤충은 특정 식물 세포용으로 이용된다 (Shaw, C.H., 등, Gene 23 (1983) 315-330). 포유류 세포에 대해서는, 문헌 [Graham and van der Eb, Virology 52 (1978) 546] 의 칼슘 포스페이트 침전법이 바람직하다. 효모로의 형질전환은 문헌 [van Solingen, P. 및 Plaat, J. B., J. Bact. 130 (1977) 946-947 및 Hsiao, C.L. 및 Carbon, J., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 (1979) 3829-3833] 의 방법에 따라 수행된다.

본 발명의 또다른 구현예는, 하기 단계를 포함하는 DNA 폴리머라제 활성을 가진 폴리펩티드의 제조 방법이다: (a) 본 발명에 따른 재조합 DNA 벡터로 숙주 세포를 형질전환하는 단계; (b) 숙주 세포를 배양하고, DNA 폴리머라제 활성을 가진 폴리펩티드를 상기 숙주 세포에서 발현하는 단계; (c) 단계 (b) 에서 발현된 DNA 폴리머라제 활성을 가진 폴리펩티드를 정제하는 단계. 재조합적으로 발현된 폴리펩티드의 정제는 재조합적으로 발현된 TaqWT (US 5,079,352) 또는 그의 결실 절편(US 5,616,494; US 5,436,149) 과 유사하게 수행될 수 있으나, 단 TaqΔ288 이 수득된다. 하기의 단계를 포함하는 DNA 폴리머라제 활성을 가진 폴리펩티드의 제조 방법이 더욱 바람직하다: (a) 본 발명에 따른 재조합 DNA 벡터로 숙주 세포를 형질전환하는 단계; (b) 숙주 세포를 배양하고, (i) 말단 히스티딘 택 (histidine-tag), (ii) 히스티딘 택에 인접하게 인자 X 프로테아제 절단 부위를 제공하는 아미노산 서열, 및 (iii) 본 발명에 따른 폴리펩티드로 이루어진 융합 단백질을 상기 숙주 세포에서 발현하는 단계; (c) 단계 (b) 에서 발현된 융합 폴리펩티드를 정제하는 단계; (d) 인자 X 단백질 분해 활성이 있는 프로테아제의 존재 하에 상기 융합 폴리펩티드를 인큐베이션하여 융합 폴리펩티드를 절단함으로써, 인자 X 프로테아제 절단 부위 및 히스티딘 택으로부터 DNA 폴리머라제 활성을 가진 폴리펩티드를 분리하는 단계; (e) 단계 (d) 의 DNA 폴리머라제 활성을 가진 폴리펩티드를 정제하는 단계. 단계 (c) 에서 융합 폴리펩티드를 히스티딘 택에 결합할 수 있는 특정 친화성 매트릭스를 이용하여 정제하는 것이 더욱더 바람직하다. 단계 (d) 에서 융합 폴리펩티드의 히스티딘 택을 특정 친화성 매트릭스에 결합시키는 것이 더더욱 바람직하다. 특정 친화성 매트릭스는 금속-킬레이팅 수지로 피복된 크로마토그래피 재료이며, 금속 이온은 피복된 크로마토그래피 재료 상에 고정되는 것이 더욱더 바람직하다. 크로마토그래피 재료는 니켈-니트릴로트리아세트산 (Ni-NTA) 으로 피복되는 것이 더욱 바람직하다. 이에 관하여, 당업자라면 EP 1 069 131 을 알 수 있을 것이다. 따라서, 형질전환된 E. coli 세포의 배양에서 재조합적으로 발현된 본 발명에 따른 히스티딘-택 융합 폴리펩티드를 분리하는 바람직한 방법은 세포의 분해물을 제조하는 것이다. 분해물을 제조하는 한 가지 방법은 세포를 분해 완충액 내에 현탁시키고 세포를 초음파로 처리하는 것이다. 분해물 내에 존재하는 DNA 는 DNase, 바람직하게는 DNase I 로 절단한다. E. coli 단백질은 열 변성 (30 분, 72℃ 가 바람직하다) 에 의해 실질적으로 분해되며, 원심분리에 의해 분해물로부터 분리될 수 있다. 원심분리 후에는, 맑은 상층액을 Ni-NTA Superflow column (Qiagen Catalogue No. 30410, 30430 또는 30450) 을 이용하여 크로마토그래피함으로써, 히스티딘-택 융합 폴리펩티드가 컬럼의 고정된 금속 친화성 매트릭스에 결합하게 된다. 세척용 완충액으로 2 회 세척한 후, 세척용 완충액 및 용리 완충액의 구배를 적용함으로써, 상기 구배에서 용리 완충액을 세척용 완충액으로 서서히 교체한다. 이에 따라, 히스티딘-택 융합 폴리펩티드는 칼럼으로부터 용출될 수 있다. 추가로, 용출된 융합 폴리펩티드는 인자 X 프로테아제의 특이적인 단백질분해 활성을 지지하는 조건 하에 인자 X 프로테아제의 존재 하에 인큐베이션한다. 열변성 (30 분, 72℃ 가 바람직하다) 후, 히스티딘-택을 제거하고, 비절단 융합 폴리펩티드를 생성물, 즉 TaqΔ288 로부터 Ni-NTA Superflow 컬럼을 이용한 또다른 크로마토그래피에 의해 분리한다. 생성물을 포함하는 유출물을 수집한다. 추가적인 가공 단계는, 농축 및, 바람직하게는 본 발명에 따른 폴리펩티드의 안정화된 제조를 제공하는 TaqΔ288 의 안정화를 지지하는 완충액에 대한 투석이다.

대안적으로는, 융합 폴리펩티드는 컬럼의 고정된 금속 친화성 매트릭스에 결합되는 경우 인자 X 프로테아제로 절단될 수 있다. 상기의 경우, 융합 단백질이 결합하는 컬럼 재료는 인자 X 프로테아제의 특이적인 단백질분해 활성을 지지하는 조건 하에 인자 X 프로테아제의 존재 하에 인큐베이션된다. 용리 완충액이 아닌 완충액, 즉 히스티딘 택이 Ni-NTA-피복 크로마토그래피 재료에 결합하는 것을 지지하는 완충액을 사용한 후속적인 세척은 유출시 TaqΔ288 폴리펩티드가 인자 X 프로테아제와 함께하도록 한다. 후속적으로, 인자 X 프로테아제는 불활성화되고, TaqΔ288 폴리펩티드가 정제된다.

장기간 안정성을 위해서, 본 발명의 열안정성 DNA 폴리머라제 효소는 하나 이상의 비이온성 중합체 계면활성제를 함유하는 완충액 중에 보관될 수 있다. 상기 계면활성제는 일반적으로 약 100 내지 250,000 달톤, 바람직하게는 약 4,000 내지 200,000 달톤 범위의 분자량을 가지며, 약 3.5 내지 약 9.5, 바람직하게는 약 4 내지 8.5 의 pH 에서 효소를 안정화시키는 것이다. 상기 계면활성제의 예에는, 문헌 [McCutcheon's Emulsifiers & Detergents, North American edition (1983), McCutcheon Division of MC Publishing Co., 175 Rock Road, Glen Rock, NJ (USA) 에서 출판] 의 제 295-298 페이지에 기재된 것들이 포함된다.

바람직하게는, 계면활성제가 에톡실화 지방 알콜 에테르 및 라우릴 에테르, 에톡실화 알킬 페놀, 옥틸페녹시 폴리에톡시 에탄올 화합물, 개질된 옥시에틸화 및/또는 옥시프로필화 직쇄 알콜, 폴리에틸렌 글리콜 모노올레이트 화합물, 폴리소르베이트 화합물, 및 페놀계 지방 알콜 에테르를 포함하는 군에서 선택된다. 더욱 바람직한 것은, ICI Americas Inc. Wilmington, DE 로부터의 Tween 20, 폴리옥시에틸화 (20) 소르비탄 모노라우레이트, 및 BASF Wyandotte Corp., Parsippany, NJ 로부터의 Iconol NP-40, 에톡실화 알킬 페놀 (노닐) 이다.

본 발명의 또다른 구현예는 하나 이상의 비이온성 중합체 계면활성제를 함유하는 완충액 중에 본 발명에 따른 폴리펩티드를 함유하는 안정화된 제제이다. 바람직하게는, 안정화된 제제의 완충액은 글리세롤, KCl, 트리스/HCl (트리스(히드록시메틸)-아미노메탄 히드로클로라이드), EDTA (에틸렌 디아민-테트라아세트산 디소듐 염), Tween 20 및 디티오-트레이톨 (DTT) 로 이루어진 군으로부터 선택되는 성분을 함유한다. 63% (질량 대 부피) 글리세롤, 100 mM KCl, 20 mM 트리스/HCl pH 8.5, 0.1 mM EDTA, 0.5% (부피 대 부피) Tween 20, 1 mM DTT 로 이루어진 안정화된 제제가 더욱 바람직하다.

PCR 증폭의 각 싸이클에서, 이중 가닥 표적 서열은 변성되고, 프라이머는 변성된 표적의 각각의 가닥에 어닐링되며, 프라이머는 DNA 폴리머라제의 작용에 의해 연신된다. 증폭의 특이성은 프라이머 하이브리디제이션의 특이성에 좌우된다. 프라이머는 표적 핵산 서열의 각각의 가닥의 3' 말단에서 발생하는 서열에 상보적이거나 또는 실질적으로 상보적이 되도록 선택된다. 전형적인 PCR 에서 이용되는 상승된 온도 하에, 프라이머는 의도하는 표적 서열에만 하이브리다이즈한다. 그러나, 증폭 반응 혼합물은 전형적으로는 프라이머 하이브리디제이션 특이성을 보장하기 위해 필요한 온도보다 한참 낮은 실온에서 집합된다. 상기의 덜 엄격한 조건 하에서는, 프라이머는 기타의 부분적으로만 상보적인 핵산 서열 (또는 다른 프라이머) 에 비특이적으로 결합할 수 있으며, 원하지 않는 신장 산물 합성을 개시하여, 표적 서열을 따라 증폭될 수 있다. 비특이적인 프라이머 신장 생성물의 증폭은 원하는 표적 서열의 증폭과 경쟁할 수 있으며, 원하는 서열의 증폭 효율을 현저히 감소시킬 수 있다. 비특이적인 증폭에 의해 야기되는 문제점은 문헌 [Chou, Q., 등, Nucleic Acids Res. 20 (1992) 1717-1723] 에서 추가로 논의된다.

비특이적인 증폭은 반응 개시 전 비표적 서열에 결합된 프라이머로부터의 신장 생성물의 감소에 의해 감소될 수 있다. "핫-스타트" 프로토콜로 명명된 한 방법에서는, 필요한 하이브리디제이션 특이성 제공에 충분하게 승온시킬 때까지 하나 이상의 중요한 시약을 반응 혼합물에서 배제시킨다. 상기 방법에서, 반응 조건이 특이적인 프라이머 하이브리디제이션을 보장하는 시간 동안에는 반응 혼합물이 프라이머 신장을 지지하지 못한다.

"핫-스타트" 프로토콜에서의 특징은, DNA 폴리머라제의 가역적 불활성화, 즉, 가역적으로 차단되는 DNA 폴리머라제에 의해 PCR 반응 혼합물로부터 DNA 폴리머라제 활성이 배제된다는 것이다. 한 가지 방법에는 상승된 온도에서 특정 기간 동안 DNA 폴리머라제의 인큐베이션 후에만 활성화되는 화학적으로 개질된 DNA 폴리머라제를 이용함으로써, PCR 반응 혼합물의 셋업동안 원하지 않는 DNA 합성 생성물의 형성을 방지한다. US 6,183,998 에서는 포름알데히드와 같은 알데히드를 이용하여 열안정성 DNA 의 가역적 불활성화를 기재한다. 50℃ 초과의 온도에서의 효소 활성의 회복과 함께 상온에서의 효소의 본질적으로 완전한 불활성화가 달성된다. 특허 EP 0 771 870 및 US 6,479,264 에서는 디카르복실산 무수물을 이용한 열안정성 DNA 폴리머라제의 가역적 불활성화를 기재한다. US 5,773,258 및 US 5,677,152 에서는 열안정성 효소의 효소 활성의 가역적인 불활성화를 기재한다. 공유결합 개질을 위한 바람직한 시약에는 말레산 무수물; 치환된 말레산 무수물, 예컨대 시트라콘산 무수물, 시스-아코니트산 무수물 및 2,3-디메틸말레산 무수물; 엑소-시스-3,6-엔독소-델타4-테트라히드로프탈산 무수물; 및 3,4,5,6-테트라히드로프탈산 무수물이 포함된다. 따라서, 시트라콘산 무수물 및 시스-아코니트산 무수물이 PCR 증폭용의 가역적으로 블로킹되는 DNA 폴리머라제의 제조를 위해서는 바람직하다. 가역적으로 불활성화되는 효소는 효소를 불활성화시키는 단백질의 화학적 개질의 결과이다. 불활성화된 효소의 활성은 증폭 반응 이전 또는 그의 일부로서 상승된 온도에서 반응 혼합물의 인큐베이션에 의해 회복된다. 따라서, 본 발명의 또다른 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 상기 폴리펩티드에 공유결합으로 커플링되는 경우 폴리펩티드의 DNA 폴리머라제 활성을 가역적으로 블로킹할 수 있는 화합물에 공유결합으로 커플링된다. 화합물이 (a) 시트라콘산 무수물, (b) 시스-아코니트산 무수물, (c) 2,3-디메틸말레산 무수물, (d) 엑소-시스-3,6-엔독소-델타 4-테트라히드로프탈산 무수물, 및 (e) 3,4,5,6-테트라히드로프탈산 무수물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 더욱 바람직하다.

본 발명의 또다른 바람직한 구현예는 DNA 폴리머라제 활성을 가진 폴리펩티드를 함유하는 안정화된 제제로서, 상기 폴리펩티드에 공유결합으로 커플링되는 경우 폴리펩티드의 DNA 폴리머라제 활성을 가역적으로 블로킹할 수 있는 화합물에 상기 폴리펩티드가 공유결합으로 커플링된다. 화합물이 (a) 시트라콘산 무수물, (b) 시스-아코니트산 무수물, (c) 2,3-디메틸말레산 무수물, (d) 엑소-시스-3,6-엔독소-델타 4-테트라히드로프탈산 무수물, 및 (e) 3,4,5,6-테트라히드로프탈산 무수물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 더욱 바람직하다.

한편, 본 발명의 또다른 바람직한 구현예는 DNA 폴리머라제 활성을 가진 폴리펩티드를 함유하는 안정화된 제제로서, 상기 폴리펩티드와 결합하는 경우 폴리펩티드의 DNA 폴리머라제 활성을 가역적으로 블로킹할 수 있는 항체에 상기 폴리펩티드가 결합된다. US 5,338,671 에서는 DNA 폴리머라제 활성을 저해하기 위한 DNA 폴리머라제 효소에 특이적인 항체의 용도를 개시한다. DNA 폴리머라제 및 DNA 폴리머라제-특이적 항체의 예비 혼합은 항체-폴리머라제 복합물의 형성을 초래한다. 상기의 조건 하에서, 올리고뉴클레오티드 신장 활성은 실질적으로 전무하게 검출될 수 있다. 상승된 온도에서는, 항체가 복합물로부터 유리되므로, 유리된 DNA 폴리머라제는 PCR 동안 DNA 합성에서 기능할 수 있다. 바람직하게는, 항체는 Taq DNA 폴리머라제에 대한 모노클로날 항체이다. Taq DNA 폴리머라제에 대한 모노클로날 항체는 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 US 5,338,671 에 기재되어 있다. 바람직하게는, Taq DNA 폴리머라제에 대한 모노클로날 항체는 TP4-9.2 및 TP1-12.2 이며, 이들은 각각 ATCC 접근 번호 HB11807 및 HB11127 으로 지정된, American Type Culture Collection (ATCC) 에 기탁된 하이브리도마로부터 수득가능하다. 바람직한 항체는, 약 1 ×10⁷ M^-1 이상의 폴리머라제에 대한 회합 상수를 갖는다. 본 발명에 따르면, DNA 폴리머라제에 특이적인 것으로 정의된 항체는 약 20-40℃ 의 온도에서 DNA 폴리머라제의 효소 활성을 저해할 수 있는 항체들이다. 본 발명의 항체는 PCR 열 순환동안 이용되는 상승된 온도에 의해 또는 열 순환 전 상승된 온도에서의 PCR 혼합물의 예비 인큐베이션에 의해 불활성화된다. 폴리머라제의 효소 활성을 저해하는 항체의 성능은, 예를 들어, 문헌 [Sharkey, D.J., 등, BioTechnology 12 (1994) 506-509] 에 기재된 바와 같이 당업자에게 공지된 검정법에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, DNA 폴리머라제의 효소 활성에 대한 표준 검정법은 DNA 내에서의 단일 가닥 갭에서의 3H-dNTP 에 혼화하는 폴리머라제의 성능을 근거로 할 수 있다. 폴리머라제 활성을 저해하는 항체의 성능은 항체와 폴리머라제를 미리 인큐베이션시킨 후, 표준 폴리머라제 검정법을 수행함으로써 결정된다. 상기 검정법에서 폴리머라제 활성을 현저하게 감소시킬 수 있는 항체가 본 발명에서 유용하다. 유사한 검정법이 열에 의해 원하는 항체가 불활성화되는 것을 측정하기 위해 사용될 수 있다. 간략하게, 폴리머라제를 저해하는 항체의 성능에 대한 검정법은, 원하는 온도로 상승시킨 후, 냉각시키고 폴리머라제 활성에 대해 검정함으로써 변형될 수 있다. 원하는 항체는 85-95℃의 온도에서 불활성화되어, 활성 폴리머라제를 유리시킨다.

본 발명의 또다른 구현예는 본 발명에 따른 폴리펩티드의 용도이며, 본 발명에 따른 폴리펩티드는, 상기 폴리펩티드에 공유결합으로 결합되는 경우 폴리펩티드의 DNA 폴리머라제 활성을 가역적으로 블로킹할 수 있는 화합물에 공유결합으로 커플링되며, 프라이머 신장 생성물을 제조하기 위해 본 발명에 따른 폴리펩티드가 상기 폴리펩티드에 결합되는 경우, 폴리펩티드의 DNA 폴리머라제 활성을 가역적으로 블로킹할 수 있는 항체 또는 본 발명에 따른 안정화된 제제에 결합된다. 프라이머 신장 생성물은, 예를 들어 PCR 을 수행하거나 또는 생거 방법을 이용하는 서열분석 반응을 수행하는 경우 생성된다. 따라서, 핵산 템플레이트의 서열분석을 위한 본 발명의 용도가 바람직하다. 또한, 표적 핵산을 증폭하기 위한 본 발명의 용도가 바람직하다. 프라이머 신장에 대한 또다른 예시는 닉 트랜슬레이션 (nick translation) 이다. 당업자는 용어 "프라이머 신장 생성물의 제조" 를 설명하는 다수의 기타 예시들을 알 것이다. 본 발명은 본 발명에 따른 DNA 폴리머라제 활성이 있는 폴리펩티드를 이용한 프라이머 신장 생성물 또는 상기를 함유하는 제제의 제조에 관한 것이다.

본 발명의 또다른 구현예는 본 발명에 따른 안정화된 제제를 함유하는 프라이머 신장 생성물 제조를 위한 키트이다. 핵산 템플레이트의 서열분석용 키트가 바람직하다. 표적 핵산 증폭을 위한 키트도 바람직하다. 매우 바람직한 것은, LightCycler 를 이용한 표적 핵산 증폭용 키트이다. 따라서, 한 예시는 LightCycler DNA Master SYBR Green I kit (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim; Catalogue No. 2015099) 이다. 따라서, 상기 키트는 3 개의 바이알을 포함할 수 있는데, 그 중 하나 (1) 은 TaqΔ288 또는 가역적으로 블로킹되는 DNA 폴리머라제 활성이 있는 TaqΔ288 의 안정화된 제제, 및 추가적으로 dNTP 믹스, 임의로는 dTTP 대신에 dUTP, SYBR green I 염료 및 10 mM MgCl₂ 를 함유하는 10 × 농축 반응 혼합물을 포함한다. 키트의 또다른 바이알 (2) 는 예를 들어, 25 mM 의 농도로 MgCl₂ 의 원액 용액을 포함한다. 키트의 또다른 바이알 (3) 은 최종 반응 부피를 조정하기 위한 멸균된 PCR 급 정제수를 포함한다.

본 발명의 또다른 구현예는 하기 단계들을 포함하는 표적 핵산 증폭 방법이다: (a) (i) 본 발명에 따른 폴리펩티드, (ii) 상기 폴리펩티드에 공유결합으로 커플링되는 경우 폴리펩티드의 DNA 폴리머라제 활성을 가역적으로 블로킹할 수 있는 화합물에 공유결합으로 커플링된 본 발명의 폴리펩티드, 및 (iii) 상기 폴리펩티드에 결합되는 경우 폴리펩티드의 DNA 폴리머라제 활성을 가역적으로 블로킹할 수 있는 항체에 의해 결합되는 본 발명의 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드 및 상기 표적 핵산에 상보적인 프라이머를 함유하는 증폭 반응 혼합물과 상기 샘플을 접촉시키는 단계, (b) 임의로는 블로킹된 DNA 폴리머라제 활성을 열처리로 해제시키는 단계, (c) 단계 (a) 에서 수득한 혼합물 내에서 상기 프라이머를 상기 표적 핵산에 어닐링시키는 단계, (d) 단계 (b) 이후 혼합물을 인큐베이션함으로써 표적 핵산을 증폭해 프라이머 신장 생성물이 생성되도록 하는 단계.

논의의 용이성을 위해, 하기에 제시되는 프로토콜은 증폭될 특이적인 서열이 이중 가닥 핵산 중에 포함되어있다는 것을 가정한다. 그러나, 상기 과정은, 바람직한 구현예에서 궁극적인 생성물이 여전히 이중 가닥 DNA 이더라도, mRNA 와 같은 단일 가닥 핵산의 증폭에서 동등하게 유용하다. 단일 가닥 핵산의 증폭에서, 제 1 단계는 상보적인 가닥 (두 증폭 프라이머 중 하나가 본 목적을 위해 사용될 수 있다) 의 합성이 수반되며, 후속적인 단계에서는 하기에 기재된 이중-가닥 증폭 과정과 같이 진행한다.

따라서, 예시적인 증폭 과정은 하기의 단계를 포함한다: (a) 증폭될 특이적인 서열에 대해 각각 4 개의 상이한 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 2 개의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 각각의 핵산 가닥과 접촉시키는 단계로서, 각각의 프라이머는 그의 상보물로부터 분리시 한 프라이머로부터 합성되는 신장 생성물이 나머지 프라이머의 신장 생성물 합성을 위한 템플레이트로서 제공될 수 있도록 특이적인 서열의 상이한 가닥에 실질적으로 상보적이 되도록 선택되며, 상기 접촉이 상보적인 핵산 가닥에 대한 각 프라이머의 하이브리디제이션을 허용하는 단계; (b) 단계 (a) 와 동시에 또는 이후에, 특이적인 핵산 서열의 각각의 가닥에 상보적인 프라이머 신장 생성물을 형성하기 위한 뉴클레오시드 트리포스페이트의 조합을 가능하게 하는 본 발명에 따른 DNA 폴리머라제 활성이 있는 폴리펩티드와 각각의 핵산 가닥을 접촉시키는 단계; (c) DNA 폴리머라제 활성이 있는 폴리펩티드의 활성을 촉진하고, 증폭될 각각의 상이한 서열에 대해 각각의 핵산 가닥 템플레이트에 상보적인 각각의 프라이머의 신장 생성물 합성에 유효하나, 상보적인 가닥 템플레이트로부터 각각의 신장 생성물이 분리될 정도는 아닌 유효한 시간 동안 유효한 온도에서 단계 (b) 로부터의 혼합물을 유지하는 단계; (d) 단일 가닥 분자 생성을 위해 합성되는 템플레이트로부터의 프라이머 신장 생성물을 분리하기 위해서는 유효하나 효소를 비가역적으로 변성시킬 정도는 아닌 유효한 시간 동안 유효한 온도에서 단계 (c) 로부터의 혼합물을 가열하는 단계; (e) 단계 (d) 에서 생성된 각각의 단일 가닥 분자에 대한 프라이머의 하이브리디제이션을 촉진하기에 유효한 시간 동안 유효한 온도에서 단계 (d) 로부터의 혼합물을 냉각하는 단계; 및 (f) DNA 폴리머라제 활성이 있는 폴리펩티드의 활성을 촉진하고, 증폭될 각각의 상이한 서열에 대해 단계 (d) 에서 제조된 각각의 핵산 템플레이트에 상보적인 각각의 프라이머의 신장생성물을 합성하기에 유효하나, 상보적인 가닥 템플레이트로부터 각각의 신장 생성물을 분리할 정도는 아닌 유효한 온도에서 유효한 시간 동안 단계 (e) 로부터의 혼합물을 유지하는 단계. 단계 (e) 및 (f) 에서는 유효 시간 및 온도가 일치할 수 있으므로, 단계 (e) 및 (f) 는 동시에 수행될 수 있다. 단계 (d)-(f) 는 원하는 수준의 증폭이 수득될 때까지 반복된다.

증폭 방법은 공지된 서열의 특이적인 핵산 서열의 대량 생산에 대해서 뿐 아니라 존재하는 것으로 공지되어 있으나 완전히 규명되지 않은 핵산 서열 제조를 위해서도 유용하다. 템플레이트 (상보물) 로부터 분리되는 경우, 한 프라이머로부터 합성된 신장 생성물이 정해진 길이의 핵산 서열로의 다른 프라이머의 신장을 위한 템플레이트로서 제공될 수 있도록, 서열을 따라서 상대적인 위치에서 원하는 서열의 상이한 가닥을 하이브리다이즈하는 2 개의 올리고뉴클레오티드 프라이머 제조에 충분한 양 말단에서의 염기의 갯수를 알기만 하면 된다. 서열의 양 말단에서의 염기에 대한 지식이 많을수록, 표적 핵산에 대한 프라이머의 특이성 및 과정의 효율성 및 반응의 특이성이 더 커질 수 있다.

임의의 경우에 있어서도, 증폭될 서열의 초기 카피는, 서열이 순수하거나 또는 연속적인 분자일 필요가 없는 경우에도 이용가능해야 한다. 일반적으로, 증폭 과정은, 수반되는 반응 단계의 갯수에 비해 지수적인 양으로 하기의 조건이 주어진 하나 이상의 특이적인 핵산 서열을 생산하기 위한 연쇄 반응이 수반된다: (a) 필요한 서열의 말단은, 이들에 하이브리다이즈할 올리고펩티드가 합성될 수 있도록 충분히 상세히 공지되어 있으며, (b) 소량의 서열이 연쇄 반응 개시에 이용가능하다. 사용되는 특이적인 프라이머의 5' 말단에 상응하는 말단을 가진 불연속적인 핵산 이중구조물이다.

정제되거나 또는 정제되지 않은 형태의 임의의 핵산 서열은 출발 핵산 (들) 로서 이용가능하나, 단, 증폭하고자 하는 특정 핵산을 함유하거나 또는 함유하는 것으로 추정되는 것이어야 한다. 증폭될 핵산은 임의의 공급원, 예를 들어 pBR322 와 같은 플라스미드로부터, 클로닝된 DNA 또는 RNA 로부터, 또는 박테리아, 효모, 바이러스, 세포소기관 및 동식물과 같은 고등 유기체를 포함하는 임의의 공급원으로부터의 천연 DNA 또는 RNA 로부터 수득될 수 있다. DNA 또는 RNA 는 혈액, 조직 재료, 예컨대 융모막 융모, 또는 각종 기술에 의한 양막 세포로부터 추출될 수 있다. 참고 문헌은, 예를 들어 [Maniatis 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1982, pp. 280-281]. 따라서, 상기 과정은, 예를 들어 메신저 RNA 를 포함하는 DNA 또는 RNA 를 이용할 수 있고, 여기서 DNA 또는 RNA 는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 또한, 각각의 한 가닥을 포함하는 DNA-RNA 하이브리드도 이용가능하다. 임의의 상기 핵산의 혼합물은 또한 이전의 증폭 반응으로부터 제조된 핵산과 마찬가지로 이용할 수 있다 (상동이거나 또는 상이한 프라이머를 이용). 증폭될 특이적인 핵산 서열은 큰 분자의 단지 한 분획일 수 있거나, 또는 초기에 불연속적인 분자로서 존재하여 특이적인 서열은 완전 핵산으로 이루어지도록 할 수 있다.

증폭될 서열이 초기에 순수한 형태로 존재할 필요는 없으며; 서열은 전장 인간 DNA 에 포함된 -글로빈 유전자의 일부 (문헌 [Saiki, R.K., 등, Science 230 (1985) 1350-1354] 에서 예시됨) 또는 특정 미생물 기원의 핵산 서열로서, 상기 유기체가 단지 특별한 생물학적 샘플의 매우 미미한 분획으로만 이루어질 수 있다. 세포는, 세포 분해 및 세포 성분의 현탁이 일어날 때까지 (일반적으로 1 내지 15 분) 저장성 완충액 내에서 약 90℃-100℃ 에서의 열처리 후 증폭 과정에 직접 사용될 수 있다. 가열 단계 후, 증폭 시약은 분해된 세포에 직접 첨가될 수 있다. 출발 핵산 서열은 하나 이상의 원하는 특이적 핵산 서열을 포함할 수 있다. 증폭 과정은 대량의 한 가지 핵산 서열의 제조에서 뿐만 아니라, 상동이거나 또는 상이한 핵산 분자 상에 위치한 한 가지 이상의 상이한 특이적인 핵산 서열의 동시적인 증폭에도 유용하다.

프라이머는 PCR 과정에서 중요한 역할을 담당한다. 증폭 과정 언급에서 사용된 용어 "프라이머" 는, 특히 증폭될 절편의 말단 서열에 관한 정보에서 일부 불명확한 점이 있는 경우 또는 WO 91/05753 에 기재된 축퇴 프라이머 과정 (degenerate primer process) 을 이용하는 경우 하나 이상의 프라이머를 의미할 수 있다. 예를 들어, 핵산 서열이 단백질 서열 정보로부터 인용되는 경우, 유전자 코드의 축퇴성을 근거로 한 모든 가능한 코돈 변형을 나타내는 서열을 포함하는 프라이머의 집합이 각각의 가닥에 대해 이용될 수 있다. 상기 집합 유래의 한 프라이머는, 증폭에 유용한 원하는 서열의 일부와 충분히 상동적이다.

또한, 적절한 갯수의 상이한 올리고뉴클레오티드 프라이머가 사용되는 한, 하나 이상의 특이적인 핵산 서열은, 제 1 핵산 또는 핵산들의 혼합물로부터 증폭가능하다. 예를 들어, 2 개의 상이한 특이적인 핵산 서열이 생성되는 경우, 4 개의 프라이머가 이용된다. 프라이머들 중 2 가지는 특이적인 핵산 서열 중 하나에 특이적이며, 나머지 2 개의 프라이머는 제 2 의 특이적인 핵산 서열에 특이적이다. 상기 방법으로, 두 개의 상이한 특이적인 서열은 각각 본 발명의 방법에 의해 지수적으로 생산될 수 있다.

주어진 서열 내에서의 서열은 주어진 횟수의 증폭 싸이클 후, 반응 중 더 큰 특이성을 수득하기 위해, 1 회 이상의 증폭 싸이클 후, 증폭될 서열의 내부 서열 (즉, 말단에 있지 않는 서열) 에 상보적인 한 셋트의 프라이머를 첨가함으로써 증폭될 수 있다. 상기 프라이머들은 임의의 단계에서 첨가될 수 있으며, 더 작은 증폭 절편을 제공한다. 대안적으로는, 비상보적 말단을 가지나 증폭에서 이전에 이용된 프라이머와 일부 중복되는 프라이머를 이용하여 더 긴 절편이 제조될 수 있다.

프라이머는 또한, 증폭 과정이 시험관 내 돌연변이 생성을 위해 이용되는 경우 중요한 역할을 담당한다. 이용된 프라이머가 원래 템플레이트에 정확하게 상보적인 것이 아닌 증폭 반응의 생성물은 템플레이트 이외의 프라이머의 서열을 포함하여, 시험관내 돌연변이를 도입한다. 추가적인 싸이클에서, 상기 돌연변이는, 추가적인 잘못짝지어진 프라이밍 (priming) 이 필요하지 않으므로 감소된 효율로 증폭된다. 상기 기재된 바와 같이 변경된 DNA 서열의 제조 방법은 추가적인 서열 변화를 유도하기 위해 상이한 프라이머를 이용하여 변경된 DNA 상에서 반복될 수 있다. 상기의 방법으로, 일련의 돌연변이화된 서열이 점진적으로 생성될 수 있는데, 여기서 상기 일련에 대한 각각의 신규한 첨가는 이전의 최종 것과는 소폭 상이하나, 원래 DNA 공급원 서열과는 점차 대폭 상이하게 된다.

프라이머가 그의 서열의 일부로서 비상보성 서열을 포함하지만, 단, 충분한 양의 프라이머가 증폭될 가닥에 상보적인 서열을 포함하므로 다수의 기타 장점이 실현될 수 있다. 예를 들어, 템플레이트 서열에 상보적이 아닌 뉴클레오티드 서열 (예컨대, 예를 들어 프로모터, 링커, 코딩 서열 등) 은 프라이머 중 하나 또는 두 가지 모두의 5' 말단에 결합되어 증폭 과정의 생성물에 추가될 수 있다. 신장 프라이머가 추가된 후, 충분한 싸이클을 실행해 비상보성 뉴클레오티드 삽입물을 함유하는 원하는 양의 신규한 템플레이트를 수득하게 된다. 이는 단순한 기술을 이용하여 비교적 단기간에 (예를 들어, 2 시간 이하) 대량의 조합된 절편 생산을 가능하게 한다.

올리고뉴클레오티드 프라이머는 임의의 적합한 방법, 예를 들어 상기 기재된 포스포트리에스테르 및 포스포디에스테르 방법 또는 그의 자동화된 구현예와 같이 임의의 적합한 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 상기의 자동화된 구현예에서, 디에틸포스포르아미다이트가 출발 물질로 사용되며, 문헌 [Beaucage 등, Tetrahedron Letters 22 (1981) 1859-1862] 에 기재된 바와 같이 합성될 수 있다. 개질된 고체 지지체 상에서 올리고뉴클레오티드를 합성하는 한 가지 방법은 U.S. 특허 제 4,458,066 호에 기재되어 있다. 생물학적 공급원 (예컨대, 제한 엔도뉴클레아제 절단) 에 의해 분리된 프라이머를 이용할 수도 있다.

그러나, 어느 프라이머를 사용하든 간에, 반응 혼합물은 발생할 PCR 에 대한 템플레이트를 포함해야만 하는데, 이는 특이적인 핵산 서열은 템플레이트로서의 상기 서열을 포함하는 핵산을 이용함으로써 제조되기 때문이다. 제 1 단계는 4 개의 상이한 뉴클레오시트 트리포스페이트가 있는 각각의 핵산 가닥과 증폭 또는 추적될 각각의 특이적인 핵산 서열에 대한 2 개의 올리고뉴클레오티드 프라이머의 접촉을 수반한다. 증폭 또는 추적되는 핵산이 DNA 인 경우, 각종 뉴클레오티드 유도체가 상기 공정에서 사용될 수 있지만 뉴클레오시드 트리포스페이트는 일반적으로 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP 이다. 예를 들어, 비공지 서열의 샘플 중 공지된 서열의 검출을 위해 PCR 을 이용하는 경우, WO 91/05210 에 교시된 바와 같이 샘플간 오염을 감소시키기 위해 dTTP 가 종종 dUTP 에 의해 대체된다.

뉴클레오시드 트리포스페이트의 농도는 광범위하게 변화할 수 있다. 전형적으로는, 증폭용 완충액 중 각각의 dNTP 의 농도는 50 내지 500 μM 이며, MgCl₂ 는 완충액 중에 1 내지 3 mM 의 양으로 존재하여 폴리머라제를 활성화하고, 반응의 특이성을 증가시킨다. 그러나, DNA 서열분석 또는 고특이성 활성에서의 방사성표지 프로브 생성과 같은 일부 적용에서는 dNTP 농도는 1 내지 20 pM 인 것이 바람직하다.

표적 핵산의 핵산 가닥은 추가적인 핵산 가닥의 합성을 위한 템플레이트로서 제공되며, 여기서 이들은 프라이머의 신장 생성물이다. 상기 합성은 임의의 적합한 방법을 이용하여 수행될 수 있으나, 일반적으로는 완충 수용액, 바람직하게는 pH 7 내지 9, 가장 바람직하게는 약 8 에서 수행한다. 합성을 촉진하기 위해서는, 두 올리고뉴클레오티드 프라이머의 과몰량이 템플레이트 가닥을 함유하는 완충액에 첨가된다. 실제적인 문제점으로서, 첨가되는 프라이머의 양은 일반적으로, 증폭될 서열이 복잡한 장쇄 핵산 가닥의 혼합물에 함유되는 경우, 상보적인 가닥 (템플레이트) 의 양을 초과하는 과몰량이다. 큰 과몰량이 공정의 효율 개선을 위해 바람직하다. 따라서, 클로닝된 DNA 템플레이트에 대해서는 프라이머:템플레이트 비율이 1000:1 이상인 것이 일반적이며, 복잡한 게놈 샘플 유래의 증폭을 위해서는 프라이머:샘플 비율이 약 100:1 이상인 것이 일반적이다.

이어서, 템플레이트, 프라이머 및 뉴클레오시드 트리포스페이트의 혼합물을, 핵산을 증폭하려는지 또는 검출하려는지 여부에 따라 이중- 또는 단일가닥으로 처리한다. 핵산이 단일-가닥인 경우, 제 1 신장 싸이클 전에 변성 단계를 채용할 필요가 없으며, 반응 혼합물은 그의 상보적인 표적 (템플레이트) 서열에 대한 프라이머의 하이브리디제이션을 촉진하는 온도에서 유지한다. 상기 온도는 일반적으로 약 35℃ 내지 65℃ 이상, 바람직하게는 약 37℃ 내지 60℃ 로서, 유효한 시간, 일반적으로 수 초 내지 5 분, 바람직하게는 30 초 내지 1 분 동안 유지된다. 35℃ 내지 70℃ 의 하이브리디제이션 온도가 이용될 수 있다. 길이가 15 뉴클레오티드 이상인 프라이머가 프라이머 하이브리디제이션의 특이성을 증가시키기 위해 사용된다. 더 짧은 프라이머는 더 낮은 하이브리디제이션 온도를 필요로 한다.

원래 단일-가닥인 핵산에 대한 상보물은 적당한 완충액, dNTP 및 하나 이상의 올리고뉴클레오티드의 존재 하에 본 발명에 따른 DNA 폴리머라제 활성이 있는 폴리펩티드를 첨가함으로써 합성될 수 있다. 적당한 단일 프라이머가 첨가되는 경우, 프라이머 신장 생성물은 단일-가닥 핵산에 상보적으로 되며, 동일하거나 또는 동일하지 않은 길이 (템플레이트에 하이브리다이즈하는 프라이머의 위치에 따라 좌우됨) 의 이중 가닥 중에 핵산 가닥으로 하이브리다이즈되는데, 여기서 이는 2 개의 단독적인, 분리된 상보적인 가닥을 생성하기 위해 상기 기재된 바와 같이 단일 가닥들로 분리될 수 있다. 이어서, 제 2 프라이머가 첨가되면 프라이머 신장의 후속적인 싸이클이 원래 단일 가닥인 핵산 및 템플레이트로서의 제 1 프라이머의 신장 생성물 두 가지를 모두 이용해 발생한다. 대안적으로는, 2 개 이상의 적당한 프라이머 (이들 중 하나는 템플레이트인 나머지 프라이머의 신장 생성물을 이용하여 합성을 프라이밍하여 반응을 수행한다) 가 단일 가닥 핵산에 첨가될 수 있으며 반응이 수행된다.

이중-가닥 표적의 증폭 또는 단일-가닥 표적의 제 2 싸이클 증폭의 경우에서와 같이 핵산이 2 개의 가닥을 포함하는 경우, 핵산의 가닥은 프라이머가 하이브리다이즈하기 전 분리되어야만 한다. 상기 가닥 분리는 물리적, 화학적 또는 효소적 수단을 포함하는 임의의 적합한 변성 방법으로 수행될 수 있다. 핵산 가닥 분리의 한 가지 바람직한 물리적 방법에는 완전한 (>99%) 변성이 발생할 때까지 핵산을 가열하는 것이 수반된다. 전형적인 열 변성은, 핵산의 조성 및 크기에 따라 약 수 초 내지 수 분의 일반적인 범위의 시간 동안 약 80℃ 내지 105℃ 범위의 온도에서 수행된다. 바람직하게는, 수 초 내지 1 분 동안의 유효 변성 온도는 90℃-100℃ 이다. 가닥 분리는 또한 헬리케이즈 (helicase) 로 공지된 효소의 클래스 또는 헬리케이즈 활성이 있으며 ATP 의 존재 하에서는 DNA 를 변성시키는 효소 RecA 유래의 효소에 의해 유도될 수 있다. 헬리케이즈를 사용한 핵산의 가닥 분리에 적합한 반응 조건은 문헌 [Kuhn Hoffmann-Berling, CSH-Quantitative Biology 43 (1978) 63] 에 기재되어 있으며, RecA 를 이용하는 기술은 문헌 [Radding, C.M., Ann. Rev. Genetics16 (1982) 405-437] 에 개관되어 있다. 변성은 동등하거나 또는 동등하지 않은 길이의 2 개의 분리된 상보적인 가닥을 양산한다.

이중 가닥 핵산이 열에 의해 변성되는 경우, 반응 혼합물은 각각의 프라이머가 상보적인 표적 (템플레이트) 서열에 하이브리디제이션되는 것을 촉진하는 온도로 냉각되도록 한다. 상기 온도는 일반적으로 시약에 따라서 약 35℃ 내지 65℃, 바람직하게는 37℃ 내지 60℃ 이다. 하이브리디제이션 온도는, 일반적으로 수 초 내지 수 분, 바람직하게는 10 초 내지 1 분인 유효 시간 동안 유지된다. 실제에서는, 온도가 약 95℃ 에서 37℃ 만큼 낮은 온도로 단순히 하강되며, 하이브리디제이션은 상기 범위 내의 온도에서 발생한다.

핵산이 단일- 또는 이중-가닥인지 여부에 상관없이, 본 발명에 따른 DNA 폴리머라제 활성이 있는 폴리펩티드가 변성 단계 이전 또는 그 동안 또는 강온되는 경우 또는 하이브리디제이션을 촉진하기 위한 범위 내에 있을 때 첨가될 수 있다. 본 발명의 폴리머라제의 열안정성이 임의의 시기에 반응 혼합물에 상기 폴리머라제를 첨가하는 것을 허용하더라도, 혼합물이 엄격한 하이브리디제이션 온도 미만으로 냉각되지 않는 시점에 반응 혼합물에 폴리머라제를 첨가함으로써 비특이적인 증폭을 실질적으로 저해할 수 있다. 하이브리디제이션 후, 이어서 반응 혼합물을 DNA 폴리머라제 활성이 있는 폴리펩티드의 활성이 촉진되거나 또는 최적화되는 온도, 즉 하이브리다이즈된 프라이머 및 템플레이트 유래의 프라이머 신장 생성물의 합성 촉진시 DNA 폴리머라제 활성이 있는 폴리펩티드의 활성 증가에 충분한 온도로 가열되거나 또는 유지된다. 온도는 각각의 핵산 템플레이트에 상보적인 각각의 프라이머의 신장 생성물 합성에 실제적으로 충분해야 하나, 그의 상보적인 템플레이트 유래의 각각의 신장 생성물을 변성시킬 정도로 높아서는 안된다 (즉, 온도는 일반적으로 약 80℃ 내지 90℃ 미만이다).

이용된 핵산(들)에 따라서는, 상기 합성 반응에 유효한 전형적인 온도는 일반적으로 약 40℃ 내지 80℃, 바람직하게는 50℃ 내지 75℃ 의 범위이다. 본 발명의 DNA 폴리머라제 활성을 가진 폴리펩티드에 대해서 온도는 더욱 바람직하게는 약 65℃ 내지 75℃ 이다. 상기 합성에 필요한 시간은, 주로 온도, 핵산의 길이, 효소 및 핵산 혼합물의 복잡성에 따라서 약 10 초 내지 수 분 이상의 범위일 수 있다. 신장 시간은 일반적으로 약 30 초 내지 수 분이다. 핵산이 더 긴 경우, 상보적인 가닥 합성에 대해서는 일반적으로 더 긴 시간이 필요하다.

신규하게 합성된 가닥 및 상보적인 핵산 가닥은 증폭 과정의 후속적인 단계에서 사용되는 이중-가닥 분자를 형성한다. 이후 단계에서, 이중-가닥 분자의 가닥은 분자 변성에 유효한 시간 및 온도에서 열변성에 의해 분리되나, 상기 온도 및 시간은 DNA 폴리머라제 활성이 있는 폴리펩티드가 완전히 비가역적으로 변성되거나 또는 불활성화될 정도의 긴 시간 및 온도가 아니다. 상기 템플레이트의 변성 후, 온도는 상기 기재된 바와 같이 이전 단계에서 생산된 상보적인 단일-가닥 분자 (템플레이트) 에 대한 프라이머의 하이브리디제이션을 촉진하는 수준까지 감소된다.

상기 하이브리디제이션 단계 후, 또는 하이브리디제이션 단계와 동시에, 온도는 신규하게 합성된 가닥 및 원래 가닥 모두를 템플레이트로서 사용하여 프라이머 신장 생성물의 합성을 할 수 있도록, DNA 폴리머라제 활성이 있는 폴리펩티드의 활성을 촉진에 유효한 온도로 조정된다. 또한, 온도는 상기 기재된 바와 같의 그의 템플레이트로부터의 신장 생성물을 분리 (변성) 할 정도로 높지 않아야 한다. 하이브리디제이션은 상기 단계 동안 발생하여, 변성 후 냉각의 선행 단계가 필요하지 않게 할 수 있다. 상기의 경우, 동시적인 단계를 이용하면, 바람직한 온도 범위는 50℃ 내지 70℃ 이다.

가닥 분리, 하이브리디제이션 및 신장 생성물 합성의 한 싸이클 내에 수반되는 가열 및 냉각 단계는 원하는 양의 특이적인 핵산 서열 생산에 필요한 대로 수회 반복될 수 있다. 유일한 제한점은, 프라이머, DNA 폴리머라제 활성이 있는 폴리펩티드, 및 존재하는 뉴클레오시드 트리포스페이트의 양이다. 일반적으로, 15 내지 30 싸이클이 완수된다. 증폭된 DNA 의 진단적 검출을 위해서는, 싸이클의 횟수는 샘플의 특성, 샘플 내 초기 표적 농도 및 증폭 후 이용되는 검출 과정의 감도에 좌우된다. 주어진 검출의 감도에 대해서는, 증폭될 샘플이 순수하고 초기 표적 농도가 높은 경우 더 적은 횟수의 싸이클이 필요하다. 샘플이 핵산의 복잡한 혼합물이고 초기 표적 농도가 낮은 경우, 검출을 위해 시그널을 충분히 증폭하기 위해서는 더 많은 횟수의 싸이클이 필요하다. 일반적인 증폭 및 검출에 대해서는, 과정이 약 15 회 반복된다. 표지된 서열 특이적 프로브로 검출되는 서열을 생성하기 위해 증폭이 이용되는 경우 및 인간 게놈 DNA 가 증폭의 표적인 경우, 명확하게 검출가능한 시그널을 생성하기 위해, 즉 배경 노이즈가 검출을 방해하지 않도록 하기 위해 과정은 15 내지 30 회 반복된다.

초기 첨가 후, 추가적인 뉴클레오티드, 프라이머, 또는 DNA 폴리머라제 활성이 있는 폴리펩티드는 첨가할 필요가 없으나, 단, 중요한 시약이 고갈되어선 안되며, DNA 폴리머라제 활성이 있는 폴리펩티드가 변성되거나 또는 비가역적으로 불활성화되어선 안되고, 그러한 경우에는 반응이 계속되기 위해서는 추가적인 폴리머라제 또는 기타 시약이 첨가된다. 원하는 양의 특이적인 핵산 서열을 생산하기 위해서 적당한 횟수의 싸이클이 완수된 후에는, 반응을 통상적인 방법, 예를 들어 DNA 폴리머라제 활성을 가진 폴리펩티드를 EDTA, 페놀, SDS 또는 CHCl₃ 의 첨가에 의해 불활성화시키거나 또는 반응 성분을 분리함으로써 반응을 정지시킬 수 있다.

증폭 과정은 연속하여 수행될 수 있다. 자동화된 과정의 한 구현예에서, 반응 혼합물은 특정 수준에서 특정 시간 동안 온도가 제어될 수 있도록 프로그램되어 온도가 순환할 수 있다. 상기 목적을 위한 한 가지 상기 설비는 Perkin-Elmer Cetus Instruments 사에 의해 개발 및 시판되는 증폭 반응 취급용 자동화 기계가 있다. 상기 기구를 이용해 PCR 을 수행하기 위한 상세한 지시사항은 기구 판매사로부터 입수가능하다. 상기 기구에 대한 또다른 실시예는, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany 로부터 입수가능한 LightCycler 이다.

본 발명의 DNA 폴리머라제 활성이 있는 폴리펩티드는 PCR 에 의한 핵산 서열의 증폭이 유용한 각종 공정에서 매우 유용하다. 증폭 방법은 US 4,800,159 에 기재된 바와 같이 특정 핵산 서열을 적합한 발현 벡터에 삽입하기 위한 클로닝에 이용될 수 있다. 벡터는 적절한 숙주 세포가 재조합 DNA 기술의 표준 방법에 의한 서열의 유전자 생성물을 제조하도록 형질전환하기 위해 이용될 수 있다. 상기 클로닝은 블런트-말단 라이게이션 또는 프라이머 내에 포함된 부위에서 절단하기 위한 제한 효소를 이용한 벡터로의 직접 라이게이션을 수반한다. 본 발명의 열안정성 DNA 폴리머라제에 적합한 기타 과정들에는 US 4,683,195 및 US 4,683,202 및 EP 0 229 701; EP 0 237 362; 및 EP 0 258 017 에 기재된 것들이 포함된다. 또한, 본 발명의 효소는 하기에서 유용하다: 비대칭 PCR (참고 문헌: Gyllensten, U.B. 및 Erlich, H.A., Proc.Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988) 7652-7656); 역방향 PCR (Ochman, H., 등, Genetics 120 (1988) 621-623); 및 DNA 서열분석 (참고 문헌: Innis, M.A., 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988) 9436-9440 및 McConlogue, L., 등, Nucleic Acids Res. 16 (1988) 9869), cDNA 말단의 랜덤 증폭(RACE), 일련의 DNA 절편을 증폭하기 위해 사용되는 랜덤 프라이밍 PCR 및 문헌 [Loh, E., in METHODS: A Companion to Methods in Enzymology (1991) 2, pp. 11-19] 에 기재되어 있는 라이게이션 중재 앵커 (anchor) PCR 및 앵커 PCR 과 같은 단측면 특이성을 이용하는 PCR 공정에 유용하다.

특히, 본 발명에 따른 DNA 폴리머라제 활성을 가진 폴리펩티드는 LightCycler 를 이용한 표적 핵산 증폭에 유용하다. LightCycler 기구 및 PCR 수행을 위한 프로토콜은 Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany 에서 입수가능한 매뉴얼 "LightCycler Operator's Manual Version 3.5"(October 2000) 에 기재되어 있다. 그에 따라, 제 4.3.1 장에 주어진 권장사항을 TaqΔ288 에 적용한다.

본 발명의 또다른 구현예는, 하나 이상의 사슬 종결제 및 하나 이상의 뉴클레오티드 트리포스페이트의 존재 하에 본 발명에 따른 폴리펩티드로 서열분석될 핵산 템플레이트로부터 사슬 종결 절편을 생성하고 상기 절편의 크기로부터 상기 핵산의 서열을 결정하는 단계를 포함하는 핵산의 서열분석법이다.

생거 다이디옥시뉴클레오티드법 (Sanger dideoxynucleotide method) 에 의한 DNA 서열분석 (Sanger, F., 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977) 5463-5467) 은, 신규한 벡터 (Yanisch-Perron, C., 등, Gene 33 (1985) 103-119), 염기 유사체 (Mills, D.R., 및 Kramer, F.R., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 (1979) 2232-2235, 및 Barr 등, BioTechniques 4 (1986) 428-432), 효소 (Tabor, S., 및 Richardson, C.C., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987) 4767-4771, 및 Innis, M.A., 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988) 9436-9440), 및 DNA 서열분석의 부분적 자동화를 위한 기구 (Smith, L.M., 등, Nature 321 (1986) 674-679; Prober, J.M., 등, Science 238 (1987) 336-341; 및 Ansorge, W., 등, Nuc. Acids Res. 15 (1987) 4593-4602) 의 개발을 포함하여, 근년에 현저하게 개량되었다. 기본적인 다이디옥시 서열분석 과정은 하기 단계를 수반한다: (i) 적합한 단일 또는 변성된 이중 가닥의 DNA 템플레이트에 대한 올리고뉴클레오티드 프라이머의 어닐링; (ii) 각각 하나의 α-표지 dNTP 또는 ddNTP (대안적으로는, 표지된 프라이머가 사용될 수 있다), 비표지 dNTP 의 혼합물, 및 하나의 사슬종결 다이디옥시뉴클레오티드-5'-트리포스페이트 (ddNTP) 를 포함하는 4 개의 분리된 반응에서 DNA 폴리머라제를 사용한 프라이머의 신장; (iii) 고해상도 폴리아크릴아미드-우레아 겔 상에서의 상기 4 셋트 반응 생성물의 전개; 및 (iv) DNA 서열을 추측하기 위해 시험될 수 있는 겔의 자기방사 영상 (autoradiographic image) 의 생성. 대안적으로는, 형광으로 표지된 프라이머 또는 뉴클레오티드가 사용되어 반응 생성물을 동정할 수 있다. 공지된 다이디옥시 서열분석법은 E.coli DNA 폴리머라제 I 의 Klenow 절편, 역전사효소, Taq DNA 폴리머라제, 또는 개질된 T7 DNA 폴리머라제와 같은 DNA 폴리머라제를 이용한다.

기본적인 다이디옥시 서열분석법의 대안으로서, 싸이클 다이디옥시 서열분석법 (cycle dideoxy sequencing) 은 다이디옥시 사슬 종결제의 존재 하에 표적 서열의 선형 비대칭성 증폭이다. 단회 싸이클은 모든 가능한 길이의 신장 생성물의 패밀리를 생성한다. 후속적인 DNA 템플레이트 유래의 신장 반응 생성물의 변성, 프라이머 어닐링 및 프라이머 신장의 다중 싸이클이 다이디옥시 종결제의 존재 하에 발생한다. 상기 공정은, 오직 1 개의 프라이머가 사용되며 각각의 싸이클에서의 서열분석 반응 생성물의 산물이 선형이며, 증폭 생성물이 길이로 볼 때 이종성이며 이후 반응에 대한 템플레이트로서 제공되지 않는다는 점에서 PCR 과 상이하다. 싸이클 다이디옥시 서열분석법은 자동화된 DNA 서열분석 기기를 이용하는 연구실에 유리하며 다른 한편으로는 대용량 서열분석 연구실에서 유리하다. 기술의 특이성 및 생성된 시그널의 증량으로 인해 클로닝없이 직접 게놈 DNA 를 서열분석하는 것이 가능하다. 싸이클 서열분석 프로토콜 (cycle sequencing protocol) 은 게놈성, 클론성 및 PCR-증폭성 템플레이트를 포함하는 단일 및 이중 가닥 템플레이트에 융통된다.

증강된 열안정성을 가진 DNA 폴리머라제, 특히 TaqΔ288 는 싸이클 서열분석(cycle sequencing) 에서 각종 장점을 갖는다: 이들은 게놈 표적에 대한 프라이머의 특이적인 하이브리디제이션에 필요한 엄격한 어닐링 온도를 견딜 뿐 아니라 각 싸이클에서 발생하는 고온 변성의 다중 싸이클을 견딘다. 고온, 즉 70-75℃ 에서의 신장 반응 수행은 2 차 구조의 탈안정화 때문에 2 차 구조를 포함하는 DNA 를 사용한 서열분석 결과에서 현저한 개선을 초래한다. 그러나, 상기 온도는 모든 2 차 구조를 제거하지는 않는다.

하기의 실시예, 참고 문헌, 서열 목록, 표 및 도면은 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공되며, 그의 진정한 범위는 첨부된 특허청구범위에 기재되어 있다. 본 발명의 진의를 벗어나지 않고도 과정 상에 변형이 있을 수 있다는 것이 이해되어야 한다.

참고 문헌 목록

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실시예 1

결실 돌연변이 TaqΔ288 의 구축 및 제조

서열 번호 6 의 TaqWT 를 코딩하는 DNA 서열, 서열 MRGS-6xHis-IEGR 를 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 TaqWT 의 C-말단을 코딩하는 DNA 서열에 하이브리다이즈하는 올리고뉴클레오티드 프라이머로 출발한다. 서열 번호 5 의 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 는 PCR 을 이용하여 제조했다. 구축물은 pQE80L 발현 벡터에 삽입했다.

실시예 2

박테리아 분해물 중 Taq 폴리머라제의 N-말단 결실 변이체 및 WT Taq 폴리머라제의 활성

표준 절차에 따라, 발현 벡터 pQE80L (Qiagen 카탈로그 번호 32923) 를 이용하여, TaqWT, TaqΔ279, TaqΔ288 및 TaqΔ289 의 리딩 프레임을 E. coli 균주 XL-1 Blue 에 클로닝했다 (Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd edition, CSHL Press, 2001; Qiagen manual "The QIAexpressionist^TM", 5^th edition, June 2003). 형질전환된 콜로니는 dYT 배지 (H₂O 의 l 당 16 g 의 박토 트립톤 (Bacto Trypton), 10 g 의 박토 효모 추출물 (Bacto Yeast Extract), 5 g 의 NaCl; 25 μM 의 앰피실린 (Ampicillin)) 접종에 사용하고, 밤새 지속적인 진탕 (진탕 배양기 (shaker incubator), 분 당 150 회전) 하에 37℃에서 마이크로웰 플레이트 (Falcon No. 353227) 에서 배양물을 키웠다. 100 ㎕ 의 밤새 배양물을 100 ㎕ 의 신선한 배지와 혼합하고 1 시간 동안 인큐베이션했다. IPTG 를 첨가하여 최종 농도가 500 μM 이 되도록 하여 4 시간 더 인큐베이션했다. 후속적으로, 배양액을 10% B-PER 용액 (예를 들어, B-PER Protein Extraction Reagents, Pierce) 와 혼합하여 박테리아를 분해하고, 혼합물을 60℃ 에서 20 분 동안 인큐베이션했다. 마이크로웰 플레이트를 분 당 3,300 회전 (rpm) 으로 원심분리하여 분해물 (lysate) 분리했다. 각각의 분해물 중 첫번째 40 ㎕ 의 분취물을 Eppendorf PCR plate (각각 부피가 0.2 ml 인 96 공) 에 피펫팅했다. 플레이트를 Eppendorf "Mastercycler gradient" 열순환기 (thermocycler) 에서 97℃ 로 35 분 동안 인큐베이션했다. 각각의 분해물 중 제 2 의 40 ㎕ 분취물을 양성 대조군으로서 실온에서 유지했다.

후속적으로, 30-40 ㎕ 의 각각의 분해물 (가열된 분해물 및 대조군) 을 또다른 마이크로웰 플레이트 (Costar No. 3903, 96 공) 에 옮기고, PCR 주 혼합물 (master mix) 과 혼합하여 최종 부피 100 ㎕ 를 만들었다. PCR 주 혼합물은 10 ㎕ 10 ×Taq 완충액, dATP, dCTP 및 dGTP 이 각각 0.15 mM, LightCycler Red 640-N-히드록시숙신이미드 에스테르-표지 dUTP (동몰량) 를 추가적으로 함유하는 0.2 mM dNTP, 0.5 mM MgCl₂ (10 ×Taq 완충액에 함유된 MgCl₂ 에 추가되는 양), 및 서열 번호 8 의 50 pM 의 형광표지 템플레이트 (즉, 템플레이트를 1.6  ㎍/㎕ 로 함유하는 0.5 ㎕ 의 용액) 를 함유한다. 마이크로웰 플레이트는 템플레이트 신장을 위해 72℃ 에서 60 분 동안 인큐베이션된다.

후속적으로, 플레이트는 4℃ 에서 10 분 동안 냉각된다. FRET (형광 공명 에너지 이동) 은 형광측정기 (fluorimeter; Tecan) 를 이용하여 정량적으로 측정된다. 여기 파장은 485 nm 이다. 발광의 측정은 635 nm 의 파장에서 취했다. 백그라운드 시그널을 차감한 후에는, 발광 값은 잔류한 DNA 폴리머라제 활성의 함수이다. 각각의 실험에 대하여 상대적인 활성값은, 가열된 샘플의 측정값을 가열되지 않은 대조군 샘플의 측정값으로 나누고 그 결과에 100 을 곱해 계산한다. 표 1 은 4 개의 실험에서 측정된 상대적인 활성값을 요약한다.

97℃ 에서 35 분 후 DNA 폴리머라제 활성을 가진 폴리펩티드의 상대적 활성

실험 번호	TaqΔ288	TaqΔ279	TaqΔ289	TaqWT
1	67	31	18	-3
2	90	36	32	-1
3	62	46	24	-3
4	78	38	28	1

실시예 3

DNA 폴리머라제 활성을 가진 폴리펩티드의 발현 및 정제

전체 부피가 4 l 인 dYT 배지를, 2 l 플라스크에 800 ml 분취물로 나눈 것에, TaqΔ288, TaqΔ279 (Klentaq), Stoffel 절편 (TaqΔ290) 및 TaqWT 를 코딩하는 리딩 프레임이 삽입된 pQE80L 발현 벡터 (Qiagen 카탈로그 번호 32923) 로 형질전환된 E. coli 균주 XL-1 Blue 에 접종했다. 세포를 37℃ 에서 진탕 배양 중에 키웠다 (진탕 배양기, 분 당 250 회전). 약 0.8 (600 nm 에서 측정) 의 광학 밀도에서, IPTG (이소프로필티오갈락토시드) 를 최종 농도 500μM 이 되도록 하여 첨가했다. 광학 밀도가 2 내지 3 에 다다를 때까지 세포를 추가로 배양했다. 이어서, 원심분리로 세포를 침전시키고, 펠렛을 B50 완충액 (25 mM TrisHCl pH 8.5, 0.1 mM EDTA, 5% 글리세롤, 1 mM DTT (디티오트레이톨), 50 mM NaCl) 중에서 실온에서 재현탁했다.

정제 프로토콜 1

프렌치 프레스 (French Press) 를 이용하여 세포를 1,000 바아에서 2 회 분해했다. NaCl 를 1.5 M 로 첨가하여 DNA 로부터 폴리머라제를 용해했다. 후속적으로, 혼합물을 75℃ 에서 15 분 동안 수조 상에서 가열했다. 후속적으로, 혼합물을 추가의 가열없이 수조에 15 분 동안 더 두었다. 원심분리로 침전을 분해물로부터 분리했다. 분해물을 B100 완충액 (25 mM TrisHCl pH 8.5, 0.1 mM EDTA, 5% 글리세롤, 1 mM DTT, 100 mM NaCl) 에 대해 투석했다. 후속적으로, 크로마토그래피 단계를 수행했다. 제 1 단계에서는 헤파린 세파로스 칼럼 및 B100 및 B600 (25 mM TrisHCl pH 8.5, 0.1 mM EDTA, 5% 글리세롤, 1 mM DTT, 600 mM NaCl) 로 구배용출을 수단으로 하는 TaqΔ288 폴리펩티드의 용출을 이용했다. 후속한 B50 에 대한 TaqΔ288-함유 분획의 투석에서, 효소는 Q 세파로스 칼럼을 이용하고 B50 및 B250 (25 mM TrisHCl pH 8.5, 0.1 mM EDTA, 5% 글리세롤, 1 mM DTT, 250 mM NaCl) 로 구배용출하여 추가로 정제했다. 최종적으로, 용출된 TaqΔ288 이 있는 분획은 저장용 완충액 (50% [v/v] 글리세롤, 100 mM KCl, 20 mM TrisHCl pH 8.5, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.25% Thesit) 에 대해 투석했다.

정제 프로토콜 2

정제 동안 His-tag 이 사용되는 경우 정제는 촉진된다. 5 g 의 침전된 세포를 25 ml 용해 완충액 (50 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl, 10 mM 이미다졸, 0.1 mM PMSF (페닐메틸술포닐 플루오라이드), 1 mM DTT, pH 8.0) 에 재현탁하고, 초음파를 이용해 분해했다. DNase I (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim) 를 최종 농도 20 mg/ml 이 되도록 첨가하고 MgCl₂ 를 최종 농도 4 mM 이 되도록 첨가했다. 혼합물을 25℃ 에서 30 분 동안 인큐베이션했다. 후속하는 30 분 동안의 72℃ 에서의 인큐베이션후, 침전을 원심분리 (22,000 ×g) 로 침전시켰다. 분해물을 10 ml Ni-NTA superflow column (Qiagen) 에 로오딩했다. 칼럼을 2 배 부피의 완충액 A (50 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl, 10 mM 이미다졸, pH 8.0) 로 세척했다. 칼럼을 완충액 A 로 출발하여 완충액 B (50 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl, 250 mM 이미다졸, pH 8.0) 로 용출하는 100 ml 부피의 선형구배로 용출했다. His-tag 이 태깅된 TaqΔ288 폴리펩티드는 추가로 Q 세파로스를 사용한 음이온 교환 크로마토그래피로 정제했다. 최종적으로, 정제된 His-tag 태깅된 TaqΔ288 폴리펩티드를 함유하는 분획을 저장용 완충액에 대해 투석했다.

His-tag 을 제거하기 위해, Ni-NTA 정제된 His-tag 태깅된 TaqΔ288 폴리펩티드는 Xa 반응 완충액 (20 mM TrisHCl pH 6.5, 50 mM NaCl, 1 mM CaCl₂) 에 대해 투석했다. 인자 Xa 프로테아제 (TaqΔ288 폴리펩티드 mg 당 1 U) 를 10 ×농축 반응 완충액의 전체 반응 부피의 1/10 으로 첨가했다. 혼합물을 4℃ 에서 3 내지 6 시간 동안 인큐베이션했다. 후속적으로, 1 M TrisHCl pH 8.5 (약 1/100 부피) 를 첨가하여 pH 를 8.0 로 상승시켰다. 추가로, 평형화된 Ni-NTA 초유량 재료 (superflow material) 를 첨가하고, 혼합물을 30 분 동안 지속적인 진탕 (회전) 하에 실온에서 인큐베이션했다. 분해물을 His-tag 태깅된 TaqΔ288 폴리펩티드를 제거하지 않고 72℃ 에서 30 분 동안 열-불활성화하여 Ni-NTA 초유량 재료 (superflow material) 로부터 분리했다. 후속 단계들은 Q 세파로스를 사용한 음이온 교환 크로마토그래피에 이은 저장용 완충액에 대한 투석이었다.

실시예 4

TaqΔ288 의 활성

DNA 폴리머라제 활성은, 65℃ 에서 M13 프라이머를 M13mp9ss DNA 에 먼저 하이브리다이즈한 후, 방사활성으로 표지된 α³²dCTP 에 혼입시키는 표준 과정을 이용하여 결정했다. 혼입은 액체 신틸레이션 카운팅으로 측정했다. 활성을, 기준으로서 제공되는 TaqWT 제제의 마스터 랏 (master lot) 과 비교했다. 표 2 는 결과를 요약한다.

DNA 폴리머라제 활성이 있는 폴리펩티드의 특이적 활성

TaqWT	~100 kU/mg
TaqΔ288	~77  kU/mg
TaqΔ279	~370  kU/mg
TaqD290	~111  kU/mg

TaqΔ288 폴리펩티드 중 His-tag 의 존재성 및 부재성에 대해서는, DNA 폴리머라제 활성에 대해 상이성이 없음을 검출했다.

실시예 5

TaqΔ288 의 분자 특성

His-tag 이 없는 TaqΔ288 를 제조했다. N-말단 서열분석은 아미노산 서열 ESPKALEEAPWPPPE 를 밝혀냈다. TaqΔ288 폴리펩티드의 분자량은 MALDI TOF 에 의해 62.5 kDa 로 측정되었다.

실시예 6

TaqΔ288 의 시트라코닐화 (citraconylation)

3 ml 의 반응 완충액 (50 mM HEPES, 300 mM KCl, 1 mM EDTA, pH8.5) 중 3 mg 의 정제된 His-tag 태깅된 TaqΔ288 폴리펩티드를 2 ㎕ 의 시트라콘산 무수물과 1 시간 동안 실온에서 반응시켰다. 후속적으로, 혼합물을 저장용 완충액 (63% [w/v] 글리세롤, 100 mM KCl, 20 mM TrisHCl pH 8.5, 0.1 mM EDTA, 0.5% Tween 20, 1 mM DTT) 에 대해 투석했다.

본 발명의 288 N-말단 아미노산이 결여된 천연 테르무스 아쿠아티쿠스 DNA 폴리머라제 (TaqWT) 의 절편 (TaqΔ288) 은 TaqWT, TaqΔ279 및 TaqΔ289 를 초월하는 증가된 열안정성을 보유하며, 따라서 본 발명은 TaqΔ288, 상기를 코딩하는 재조합 발현 벡터 및 TaqΔ288 에 대한 정제 프로토콜을 제공함으로써, 통상적인 PCR 과정을 개선하고, 기타 재조합 기술, 예컨대 DNA 서열분석, 및 DNA 폴리머라제 활성에 의한 DNA 프라이머의 온도 의존성 신장의 다른 과정들에서 열안정성 DNA 폴리머라제를 사용하는 경우 수득되는 결과를 개선할 수 있도록 보조한다.

도 1 은 TaqΔ288 (1), TaqΔ279 (2), TaqΔ289 (3) 및 TaqWT (4) 의 상대적인 활성을 측정하기 위한 4 개의 실험군의 비교를 나타낸다. 동일한 실험에 대응하는 막대는 동일하게 칠해진 패턴으로 나타냈다. 막대는 표 1 에 제시된 수치를 나타낸다.

<110> Roche Diagnostics GmbH F. Hoffmann-La Roche AG <120> Thermostable Taq polymerase fragment <130> 21822 <150> EP03 017 636.6 <151> 2003-08-12 <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1638 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TaqD288_D-2, Faktor Xa-geschnitten <220> <221> CDS <222> (1)..(1632) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1638) <223> TaqDelta 288 without N-terminal methionine <400> 1 gaa agc ccc aag gcc ctg gag gag gcc ccc tgg ccc ccg ccg gaa ggg 48 Glu Ser Pro Lys Ala Leu Glu Glu Ala Pro Trp Pro Pro Pro Glu Gly 1 5 10 15 gcc ttc gtg ggc ttt gtg ctt tcc cgc aag gag ccc atg tgg gcc gat 96 Ala Phe Val Gly Phe Val Leu Ser Arg Lys Glu Pro Met Trp Ala Asp 20 25 30 ctt ctg gcc ctg gcc gcc gcc agg ggg ggc cgg gtc cac cgg gcc ccc 144 Leu Leu Ala Leu Ala Ala Ala Arg Gly Gly Arg Val His Arg Ala Pro 35 40 45 gag cct tat aaa gcc ctc agg gac ctg aag gag gcg cgg ggg ctt ctc 192 Glu Pro Tyr Lys Ala Leu Arg Asp Leu Lys Glu Ala Arg Gly Leu Leu 50 55 60 gcc aaa gac ctg agc gtt ctg gcc ctg agg gaa ggc ctt ggc 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ctg gcc ggc cac 576 Glu Glu Ile Ala Arg Leu Glu Ala Glu Val Phe Arg Leu Ala Gly His 180 185 190 ccc ttc aac ctc aac tcc cgg gac cag ctg gaa agg gtc ctc ttt gac 624 Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gln Leu Glu Arg Val Leu Phe Asp 195 200 205 gag cta ggg ctt ccc gcc atc ggc aag acg gag aag acc ggc aag cgc 672 Glu Leu Gly Leu Pro Ala Ile Gly Lys Thr Glu Lys Thr Gly Lys Arg 210 215 220 tcc acc agc gcc gcc gtc ctg gag gcc ctc cgc gag gcc cac ccc atc 720 Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala His Pro Ile 225 230 235 240 gtg gag aag atc ctg cag tac cgg gag ctc acc aag ctg aag agc acc 768 Val Glu Lys Ile Leu Gln Tyr Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys Ser Thr 245 250 255 tac att gac ccc ttg ccg gac ctc atc cac ccc agg acg ggc cgc ctc 816 Tyr Ile Asp Pro Leu Pro Asp Leu Ile His Pro Arg Thr Gly Arg Leu 260 265 270 cac acc cgc ttc aac cag acg gcc acg gcc acg ggc agg cta agt agc 864 His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser 275 280 285 tcc gat ccc aac ctc cag aac atc ccc gtc cgc acc ccg ctt ggg cag 912 Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Val Arg Thr Pro Leu Gly Gln 290 295 300 agg atc cgc cgg gcc ttc atc gcc gag gag ggg tgg cta ttg gtg gcc 960 Arg Ile Arg Arg Ala Phe Ile Ala Glu Glu Gly Trp Leu Leu Val Ala 305 310 315 320 ctg gac tat agc cag ata gag ctc agg gtg ctg gcc cac ctc tcc ggc 1008 Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Leu Ser Gly 325 330 335 gac gag aac ctg atc cgg gtc ttc cag gag ggg cgg gac atc cac acg 1056 Asp Glu Asn Leu Ile Arg Val Phe Gln Glu Gly Arg Asp Ile His Thr 340 345 350 gag acc gcc agc tgg atg ttc ggc gtc ccc cgg gag gcc gtg gac ccc 1104 Glu Thr Ala Ser Trp Met Phe Gly Val Pro Arg Glu Ala Val Asp Pro 355 360 365 ctg atg cgc cgg gcg gcc aag acc atc aac ttc ggg gtc ctc tac ggc 1152 Leu Met Arg Arg Ala Ala Lys Thr Ile Asn Phe Gly Val Leu Tyr Gly 370 375 380 atg tcg gcc cac cgc ctc tcc cag gag cta gcc atc cct tac gag gag 1200 Met Ser Ala His Arg Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr Glu Glu 385 390 395 400 gcc cag gcc ttc att gag cgc tac ttt cag agc ttc ccc aag gtg cgg 1248 Ala Gln Ala Phe Ile Glu Arg Tyr Phe Gln Ser Phe Pro Lys Val Arg 405 410 415 gcc tgg att gag aag acc ctg gag gag ggc agg agg cgg ggg tac gtg 1296 Ala Trp Ile Glu Lys Thr Leu Glu Glu Gly Arg Arg Arg Gly Tyr Val 420 425 430 gag acc ctc ttc ggc cgc cgc cgc tac gtg cca gac cta gag gcc cgg 1344 Glu Thr Leu Phe Gly Arg Arg Arg Tyr Val Pro Asp Leu Glu Ala Arg 435 440 445 gtg aag agc gtg cgg gag gcg gcc gag cgc atg gcc ttc aac atg ccc 1392 Val Lys Ser Val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn Met Pro 450 455 460 gtc cag ggc acc gcc gcc gac ctc atg aag ctg gct atg gtg aag ctc 1440 Val Gln Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met Lys Leu Ala Met Val Lys Leu 465 470 475 480 ttc ccc agg ctg gag gaa atg ggg gcc agg atg ctc ctt cag gtc cac 1488 Phe Pro Arg Leu Glu Glu Met Gly Ala Arg Met Leu Leu Gln Val His 485 490 495 gac gag ctg gtc ctc gag gcc cca aaa gag agg gcg gag gcc gtg gcc 1536 Asp Glu Leu Val Leu Glu Ala Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ala Val Ala 500 505 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120 125 Trp Gly Arg Leu Glu Gly Glu Glu Arg Leu Leu Trp Leu Tyr Arg Glu 130 135 140 Val Glu Arg Pro Leu Ser Ala Val Leu Ala His Met Glu Ala Thr Gly 145 150 155 160 Val Arg Leu Asp Val Ala Tyr Leu Arg Ala Leu Ser Leu Glu Val Ala 165 170 175 Glu Glu Ile Ala Arg Leu Glu Ala Glu Val Phe Arg Leu Ala Gly His 180 185 190 Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gln Leu Glu Arg Val Leu Phe Asp 195 200 205 Glu Leu Gly Leu Pro Ala Ile Gly Lys Thr Glu Lys Thr Gly Lys Arg 210 215 220 Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala His Pro Ile 225 230 235 240 Val Glu Lys Ile Leu Gln Tyr Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys Ser Thr 245 250 255 Tyr Ile Asp Pro Leu Pro Asp Leu Ile His Pro Arg Thr Gly Arg Leu 260 265 270 His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser 275 280 285 Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Val Arg Thr Pro Leu Gly Gln 290 295 300 Arg Ile Arg Arg Ala Phe Ile Ala Glu Glu Gly Trp Leu Leu Val Ala 305 310 315 320 Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Leu Ser Gly 325 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2352 Phe Pro Arg Leu Glu Glu Met Gly Ala Arg Met Leu Leu Gln Val His 770 775 780 gac gag ctg gtc ctc gag gcc cca aaa gag agg gcg gag gcc gtg gcc 2400 Asp Glu Leu Val Leu Glu Ala Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ala Val Ala 785 790 795 800 cgg ctg gcc aag gag gtc atg gag ggg gtg tat ccc ctg gcc gtg ccc 2448 Arg Leu Ala Lys Glu Val Met Glu Gly Val Tyr Pro Leu Ala Val Pro 805 810 815 ctg gag gtg gag gtg ggg ata ggg gag gac tgg ctc tcc gcc aag gag 2496 Leu Glu Val Glu Val Gly Ile Gly Glu Asp Trp Leu Ser Ala Lys Glu 820 825 830 tga 2499 <210> 7 <211> 832 <212> PRT <213> Thermus aquaticus <400> 7 Met Arg Gly Met Leu Pro Leu Phe Glu Pro Lys Gly Arg Val Leu Leu 1 5 10 15 Val Asp Gly His His Leu Ala Tyr Arg Thr Phe His Ala Leu Lys Gly 20 25 30 Leu Thr Thr Ser Arg Gly Glu Pro Val Gln Ala Val Tyr Gly Phe Ala 35 40 45 Lys Ser Leu Leu Lys Ala Leu Lys Glu Asp Gly Asp Ala Val Ile Val 50 55 60 Val Phe Asp Ala Lys Ala Pro Ser Phe Arg His Glu Ala Tyr Gly Gly 65 70 75 80 Tyr Lys Ala Gly Arg Ala Pro Thr Pro Glu Asp Phe Pro Arg Gln Leu 85 90 95 Ala Leu Ile Lys Glu Leu Val Asp Leu Leu Gly Leu Ala Arg Leu Glu 100 105 110 Val Pro Gly Tyr Glu Ala Asp Asp Val Leu Ala Ser Leu Ala Lys Lys 115 120 125 Ala Glu Lys Glu Gly Tyr Glu Val Arg Ile Leu Thr Ala Asp Lys Asp 130 135 140 Leu Tyr Gln Leu Leu Ser Asp Arg Ile His Val Leu His Pro Glu Gly 145 150 155 160 Tyr Leu Ile Thr Pro Ala Trp Leu Trp Glu Lys Tyr Gly Leu Arg Pro 165 170 175 Asp Gln Trp Ala Asp Tyr Arg Ala Leu Thr Gly Asp Glu Ser Asp Asn 180 185 190 Leu Pro Gly Val Lys Gly Ile Gly Glu Lys Thr Ala Arg Lys Leu Leu 195 200 205 Glu Glu Trp Gly Ser Leu Glu Ala Leu Leu Lys Asn Leu Asp Arg Leu 210 215 220 Lys Pro Ala Ile Arg Glu Lys Ile Leu Ala His Met Asp Asp Leu Lys 225 230 235 240 Leu Ser Trp Asp Leu Ala Lys Val Arg Thr Asp Leu Pro Leu Glu Val 245 250 255 Asp Phe Ala Lys Arg Arg Glu Pro Asp Arg Glu Arg Leu Arg Ala Phe 260 265 270 Leu Glu Arg Leu Glu Phe Gly Ser Leu Leu His Glu Phe Gly Leu Leu 275 280 285 Glu Ser Pro Lys Ala Leu Glu Glu Ala Pro Trp Pro Pro Pro Glu Gly 290 295 300 Ala Phe Val Gly Phe Val Leu Ser Arg Lys Glu Pro Met Trp Ala Asp 305 310 315 320 Leu Leu Ala Leu Ala Ala Ala Arg Gly Gly Arg Val His Arg Ala Pro 325 330 335 Glu Pro Tyr Lys Ala Leu Arg Asp Leu Lys Glu Ala Arg Gly Leu Leu 340 345 350 Ala Lys Asp Leu Ser Val Leu Ala Leu Arg Glu Gly Leu Gly Leu Pro 355 360 365 Pro Gly Asp Asp Pro Met Leu Leu Ala Tyr Leu Leu Asp Pro Ser Asn 370 375 380 Thr Thr Pro Glu Gly Val Ala Arg Arg Tyr Gly Gly Glu Trp Thr Glu 385 390 395 400 Glu Ala Gly Glu Arg Ala Ala Leu Ser Glu Arg Leu Phe Ala Asn Leu 405 410 415 Trp Gly Arg Leu Glu Gly Glu Glu Arg Leu Leu Trp Leu Tyr Arg Glu 420 425 430 Val Glu Arg Pro Leu Ser Ala Val Leu Ala His Met Glu Ala Thr Gly 435 440 445 Val Arg Leu Asp Val Ala Tyr Leu Arg Ala Leu Ser Leu Glu Val Ala 450 455 460 Glu Glu Ile Ala Arg Leu Glu Ala Glu Val Phe Arg Leu Ala Gly His 465 470 475 480 Pro Phe Asn Leu Asn Ser Arg Asp Gln Leu Glu Arg Val Leu Phe Asp 485 490 495 Glu Leu Gly Leu Pro Ala Ile Gly Lys Thr Glu Lys Thr Gly Lys Arg 500 505 510 Ser Thr Ser Ala Ala Val Leu Glu Ala Leu Arg Glu Ala His Pro Ile 515 520 525 Val Glu Lys Ile Leu Gln Tyr Arg Glu Leu Thr Lys Leu Lys Ser Thr 530 535 540 Tyr Ile Asp Pro Leu Pro Asp Leu Ile His Pro Arg Thr Gly Arg Leu 545 550 555 560 His Thr Arg Phe Asn Gln Thr Ala Thr Ala Thr Gly Arg Leu Ser Ser 565 570 575 Ser Asp Pro Asn Leu Gln Asn Ile Pro Val Arg Thr Pro Leu Gly Gln 580 585 590 Arg Ile Arg Arg Ala Phe Ile Ala Glu Glu Gly Trp Leu Leu Val Ala 595 600 605 Leu Asp Tyr Ser Gln Ile Glu Leu Arg Val Leu Ala His Leu Ser Gly 610 615 620 Asp Glu Asn Leu Ile Arg Val Phe Gln Glu Gly Arg Asp Ile His Thr 625 630 635 640 Glu Thr Ala Ser Trp Met Phe Gly Val Pro Arg Glu Ala Val Asp Pro 645 650 655 Leu Met Arg Arg Ala Ala Lys Thr Ile Asn Phe Gly Val Leu Tyr Gly 660 665 670 Met Ser Ala His Arg Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ile Pro Tyr Glu Glu 675 680 685 Ala Gln Ala Phe Ile Glu Arg Tyr Phe Gln Ser Phe Pro Lys Val Arg 690 695 700 Ala Trp Ile Glu Lys Thr Leu Glu Glu Gly Arg Arg Arg Gly Tyr Val 705 710 715 720 Glu Thr Leu Phe Gly Arg Arg Arg Tyr Val Pro Asp Leu Glu Ala Arg 725 730 735 Val Lys Ser Val Arg Glu Ala Ala Glu Arg Met Ala Phe Asn Met Pro 740 745 750 Val Gln Gly Thr Ala Ala Asp Leu Met Lys Leu Ala Met Val Lys Leu 755 760 765 Phe Pro Arg Leu Glu Glu Met Gly Ala Arg Met Leu Leu Gln Val His 770 775 780 Asp Glu Leu Val Leu Glu Ala Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ala Val Ala 785 790 795 800 Arg Leu Ala Lys Glu Val Met Glu Gly Val Tyr Pro Leu Ala Val Pro 805 810 815 Leu Glu Val Glu Val Gly Ile Gly Glu Asp Trp Leu Ser Ala Lys Glu 820 825 830 <210> 8 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Flu T-14 oligonucleotide; DNA template for screening of heat-stable DNA polymerase mutants; the T on position 14 is labeled with fluoresceine. <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> labeled with fluoresceine <400> 8 tcgattcggt acgtccgcgc gatcggcgca tatagcgccg atcgcggacg tac 53

Claims (24)

1. DNA 폴리머라제 활성이 있는 폴리펩티드로서, 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열이 서열 번호 2 의 아미노산 서열인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
2. 제 1 항에 있어서, 폴리펩티드의 아미노산 서열이 N-말단 메티오닌 잔기를 추가적으로 갖는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
3. 제 1 항 또는 제 2 항의 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열.
4. 제 3 항에 있어서, 뉴클레오티드 서열이 서열 번호 1 또는 서열 번호 3 의 뉴클레오티드 서열인 것을 특징으로 하는 뉴클레오티드 서열.
5. 제 3 항의 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 벡터.
6. 제 5 항에 있어서, DNA 서열이 하기로 이루어지는 융합 폴리펩티드를 코딩하는 것을 특징으로 하는 재조합 DNA 벡터:

   (i) 히스티딘 택 (histidine tag),

   (ii) 히스티딘 택 부근에 인자 X 프로테아제 절단 부위를 제공하는 아미노산 서열, 및

   (iii) 제 1 항의 폴리펩티드.
7. 제 6 항에 있어서, DNA 서열이 서열 번호 5 의 아미노산 서열을 갖는 융합 폴리펩티드를 코딩하는 것을 특징으로 하는 재조합 DNA 벡터.
8. 하기 단계들을 포함하는, DNA 폴리머라제 활성을 가진 폴리펩티드의 제조 방법:

   (a) 제 5 항에 따른 재조합 DNA 로 숙주 세포를 형질전환하는 단계,

   (b) 상기 숙주 세포를 배양하고, 상기 숙주 세포에서 DNA 폴리머라제 활성을 가진 폴리펩티드를 발현시키는 단계,

   (c) 단계 (b) 에서 발현된 DNA 폴리머라제 활성을 가진 폴리펩티드를 정제하는 단계.
9. 하기 단계를 포함하는, DNA 폴리머라제 활성을 가진 폴리펩티드의 제조 방법:

   (a) 제 6 항 또는 제 7 항의 재조합 DNA 벡터로 숙주 세포를 형질전환하는 단계,

   (b) 상기 숙주 세포를 배양하고, 하기로 이루어지는 융합 단백질을 상기 숙주 세포에서 발현시키는 단계:

   (i) 말단 히스티딘 택,

   (ii) 히스티딘 택 부근에 인자 X 프로테아제 절단 부위를 제공하는 아미노산 서열, 및

   (iii) 제 1 항의 폴리펩티드,

   (c) 단계 (b) 에서 발현된 융합 폴리펩티드를 정제하는 단계,

   (d) 인자 X 단백질 분해 활성을 가진 프로테아제의 존재 하에 상기 융합 폴리펩티드를 인큐베이션하여 상기 융합 폴리펩티드를 절단함으로써, DNA 폴리머라제 활성을 가진 폴리펩티드를 인자 X 프로테아제 절단 부위 및 히스티딘 택으로부터 분리하는 단계,

   (e) 단계 (d) 의 DNA 폴리머라제 활성을 가진 폴리펩티드를 정제하는 단계.
10. 제 9 항에 있어서, 단계 (c) 에서 융합 폴리펩티드가 히스티딘 택에 결합할 수 있는 특별한 친화성 매트릭스를 이용하여 정제되는 것을 특징으로 하는 방법.
11. 제 9 항에 있어서, 단계 (d) 에서 융합 폴리펩티드의 히스티딘 택이 특별한 친화성 매트릭스에 결합되는 것을 특징으로 하는 방법.
12. 제 10 항 또는 제 11 항에 있어서, 특별한 친화성 매트릭스가 금속-킬레이팅 수지로 피복된 크로마토그래피 재료이며, 피복된 크로마토그래피 재료 상에 금속 이온이 고정된 것을 특징으로 하는 방법.
13. 제 12 항에 있어서, 크로마토그래피 재료가 니켈-니트릴로트리아세트산 (Ni-NTA) 으로 피복되는 것을 특징으로 하는 방법.
14. 제 5 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 재조합 DNA 벡터로 형질전환된 재조합 숙주 세포.
15. 하나 이상의 비이온성 고분자 계면활성제를 함유하는 완충액 중에 제 1 항 또는 제 2 항의 폴리펩티드를 함유하는 안정화된 제제.
16. 제 15 항에 있어서, 상기 폴리펩티드에 공유결합으로 커플링되는 경우 상기 폴리펩티드의 DNA 폴리머라제 활성을 가역적으로 블로킹할 수 있는 화합물에 상기 폴리펩티드가 공유결합으로 커플링되는 것을 특징으로 하는 안정화된 제제.
17. 제 16 항에 있어서, 화합물이 하기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 안정화된 제제:

    (a) 시트라콘산 무수물,

    (b) 시스-아코니트산 무수물,

    (c) 2,3-디메틸말레산 무수물,

    (d) 엑소-시스-3,6-엔독소-델타 4-테트라히드로프탈산 무수물, 및

    (e) 3,4,5,6-테트라히드로프탈산 무수물.
18. 제 15 항에 있어서, 상기 폴리펩티드에 결합하는 경우, 상기 폴리펩티드의 DNA 폴리머라제 활성을 가역적으로 블로킹할 수 있는 항체에 의해 폴리펩티드가 결합되는 것을 특징으로 하는 안정화된 제제.
19. 프라이머 신장 생성물 제조를 위해, 제 1 항 또는 제 2 항의 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드에 공유결합으로 커플링되는 경우 상기 폴리펩티드의 DNA 폴리머라제 활성을 가역적으로 블로킹할 수 있는 화합물에 공유결합으로 커플링된 제 1 항 또는 제 2 항의 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드에 결합하는 경우 상기 폴리펩티드의 DNA 폴리머라제 활성을 가역적으로 블로킹할 수 있는 항체에 의해 결합된 1 항 또는 제 2 항의 폴리펩티드, 또는 제 15 항의 안정화된 제제를 사용하는 방법.
20. 제 19 항에 있어서, 핵산 템플레이트의 서열분석을 위해 사용되는 방법.
21. 제 19 항에 있어서, 표적 핵산 증폭을 위해 사용되는 방법.
22. 제 15 항의 안정화된 제제를 함유하는 프라이머 신장 생성물 제조용 키트.
23. 하기 단계를 포함하는, 샘플 내에서의 표적 핵산의 증폭 방법:

    (a) 상기 샘플을, 상기 표적 핵산과 본질적으로 상보적인 프라이머 및 하기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 폴리펩티드를 함유하는 증폭 반응 혼합물과 접촉시키는 단계:

    (i) 제 1 항 또는 제 2 항의 폴리펩티드,

    (ii) 상기 폴리펩티드의 DNA 폴리머라제 활성을 가역적으로 블로킹할 수 있는 화합물에 공유결합으로 커플링된 제 1 항 또는 제 2 항의 폴리펩티드, 및

    (iii) 상기 폴리펩티드의 DNA 폴리머라제 활성을 가역적으로 블로킹할 수 있는 항체에 의해 결합된 제 1 항 또는 제 2 항의 폴리펩티드,

    (b) 블로킹된 DNA 폴리머라제 활성을 열처리로 해제시키는 단계,

    (c) 단계 (a) 에서 수득되는 혼합물 중에서의 상기 표적 핵산에 대한 상기 프라이머의 어닐링 단계,

    (d) 단계 (b) 이후 혼합물이 프라이머 신장 생성물을 형성하도록 인큐베이션함으로써 표적 핵산을 증폭하는 단계.
24. 하기 단계를 포함하는, 핵산의 서열분석 방법: 하나 이상의 사슬 종결제 및 하나 이상의 뉴클레오티드 트리포스페이트의 존재 하에 제 1 항 또는 제 2 항의 폴리펩티드가 있는 서열분석될 핵산 템플레이트로부터 사슬 종결 절편을 생성하고 상기 절편의 크기로부터 상기 핵산의 서열을 결정하는 단계.