JP2005058236A - 熱安定性Taqポリメラーゼフラグメント - Google Patents
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Abstract
【解決手段】アミノ酸配列が特定の配列からなるアミノ酸配列であることを特徴とするDNAポリメラーゼ活性を有するポリペプチドからなる。
【選択図】なし
Description
〔1〕アミノ酸配列が配列番号:2のアミノ酸配列であることを特徴とするDNAポリメラーゼ活性を有するポリペプチド、
〔2〕アミノ酸配列がさらにN-末端メチオニン残基を有することを特徴とする前記〔1〕記載のポリペプチド、
〔3〕前記〔1〕または〔2〕記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
〔4〕配列番号:1または配列番号:3のヌクレオチド配列であることを特徴とする前記〔3〕記載のポリヌクレオチド、
〔5〕前記〔3〕または〔4〕記載のポリヌクレオチドを含有する組換えDNAベクター、
〔6〕ポリペプチドが、
(i)末端ヒスチジンタグ、
(ii)該ヒスチジンタグに隣接する第X因子プロテアーゼ切断部位を提供するアミノ酸配列、および
(iii)前記〔1〕記載のポリペプチド
からなる融合ポリペプチドをコードすることを特徴とする前記〔5〕記載の組換えDNAベクター、
〔7〕ポリヌクレオチドが配列番号:5のアミノ酸配列を有する融合ポリペプチドをコードすることを特徴とする前記〔6〕記載の組換えDNAベクター、
〔8〕(a)前記〔5〕記載の組換えDNAベクターを用いて宿主細胞を形質転換する工程、
(b)該宿主細胞を培養し、該宿主細胞においてDNAポリメラーゼ活性を有するポリペプチドを発現させる工程、
(c)工程(b)で発現させたDNAポリメラーゼ活性を有するポリペプチドを精製する工程
を含む、DNAポリメラーゼ活性を有するポリペプチドを生成するための方法、
〔9〕(a)前記〔6〕または〔7〕記載の組換えDNAベクターを用いて宿主細胞を形質転換する工程、
(b)該宿主細胞を培養し、
(i)末端ヒスチジンタグ、
(ii)該ヒスチジンタグに隣接する第X因子プロテアーゼ切断部位を提供するアミノ酸配列、および
(iii)前記〔1〕記載のポリペプチド
からなる融合ポリペプチドを該宿主細胞において発現させる工程、
(c)工程(b)で発現させた融合ポリペプチドを精製する工程、
(d)第X因子タンパク質分解活性を有するプロテアーゼの存在下で該融合ポリペプチドをインキュベートして融合タンパク質を切断し、それにより第X因子プロテアーゼ切断部位およびヒスチジンタグからDNAポリメラーゼ活性を有するポリペプチドを分離する工程、ならびに
(e)工程(d)のDNAポリメラーゼ活性を有するポリペプチドを精製する工程
を含む、DNAポリメラーゼ活性を有するポリペプチドを生成するための方法、
〔10〕工程(c)において、融合ポリペプチドが、ヒスチジンタグを結合し得る粒状アフィニティーマトリクスを使用して精製されることを特徴とする前記〔9〕記載の方法、
〔11〕工程(d)において、融合ポリペプチドのヒスチジンタグが粒状アフィニティーマトリクスに結合されることを特徴とする前記〔9〕または〔10〕記載の方法、
〔12〕粒状アフィニティーマトリクスが金属キレート樹脂でコーティングされたクロマトグラフィー材料であり、金属イオンが該コーティングされたクロマトグラフィー材料に固定されることを特徴とする前記〔10〕または〔11〕記載の方法、
〔13〕クロマトグラフィー材料がニッケル−ニトリロ三酢酸(Ni-NTA)でコーティングされることを特徴とする前記〔12〕記載の方法、
〔14〕前記〔5〕〜〔7〕いずれか記載の組換えDNAベクターで形質転換された組換え宿主細胞、
〔15〕1つ以上の非イオン性ポリマー界面活性剤を含有する緩衝液中に前記〔1〕または〔2〕記載のポリペプチドを含有する安定化された調製物、
〔16〕ポリペプチドに共有結合する場合に該ポリペプチドのDNAポリメラーゼ活性を可逆的にブロックし得る化合物に該ポリペプチドが共有結合されていることを特徴とする前記〔15〕記載の安定化された調製物、
〔17〕化合物が
(a)無水シトラコン酸、
(b)無水cis-アコニット酸、
(c)無水2,3-ジメチルマレイン酸、
(d)無水エキソ-cis-3,6-エンドオキソ-Δ4-テトラヒドロフタル酸、および
(e)無水3,4,5,6-テトラヒドロフタル酸
からなる群より選択されることを特徴とする前記〔16〕記載の安定化された調製物、
〔18〕ポリペプチドを結合する場合に該ポリペプチドのDNAポリメラーゼ活性を可逆的にブロックし得る抗体によりペプチドが結合されていることを特徴とする前記〔15〕記載の安定化された調製物、
〔19〕プライマー伸長生成物を生成するための、前記〔1〕または〔2〕記載のポリペプチド、ポリペプチドに共有結合する場合に該ポリペプチドのDNAポリメラーゼ活性を可逆的にブロックし得る化合物に共有結合されている前記〔1〕または〔2〕記載のポリペプチド、ポリペプチドを結合する場合に該ポリペプチドのDNAポリメラーゼ活性を可逆的にブロックし得る抗体により結合されている前記〔1〕または〔2〕記載のポリペプチド、あるいは前記〔15〕〜〔18〕いずれか記載の安定化された調製物の使用、
〔20〕核酸鋳型を配列決定するための前記〔19〕記載の使用、
〔21〕標的核酸を増幅するための前記〔19〕記載の使用、
〔22〕前記〔15〕〜〔18〕いずれか記載の安定化された調製物を含有する、プライマー伸長生成物を生成するためのキット、
〔23〕(a)標的核酸に実質的に相補的なプライマーおよび
(i)前記〔1〕または〔2〕記載のポリペプチド、
(ii)ポリペプチドのDNAポリメラーゼ活性を可逆的にブロックし得る化合物に共有結合されている前記〔1〕または〔2〕記載のポリペプチド、および
(iii)ポリペプチドのDNAポリメラーゼ活性を可逆的にブロックし得る抗体により結合されている前記〔1〕または〔2〕記載のポリペプチド
からなる群より選択されるポリペプチドを含有する増幅反応混合物と試料を接触させる工程、
(b)熱処理によりブロックされたDNAポリメラーゼ活性を任意に開放する工程、
(c)工程(a)で得られた混合物中で該プライマーを該標的核酸にアニーリングする工程、
(d)工程(b)の後、該混合物をインキュベートすることにより標的核酸を増幅して、プライマー伸長生成物の形成を可能にする工程
を含む、試料中で標的核酸を増幅するための方法、ならびに
〔24〕少なくとも1つの連鎖終結試薬および1つ以上のヌクレオチド三リン酸の存在下で前記〔1〕または〔2〕記載のポリペプチドを用いて配列決定すべき核酸鋳型から連鎖終結断片を生成し、該断片のサイズから該核酸の配列を決定する工程を含む、核酸を配列決定する方法
に関する。
欠失変異体TaqΔ288の構築および生成
配列番号:6のTaqWTをコードするDNA配列で出発して、配列MRGS−6×His−IEGRをコードするDNA配列を含むオリゴヌクレオチドプライマー、および配列番号:5のアミノ酸配列をコードするDNAであるTaqWTのC末端をコードするDNA配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーを、PCRを使用して作製する。構築物を、pQE80L発現ベクター中に挿入する。
細菌溶解物中でのWT TaqポリメラーゼおよびTaqポリメラーゼのN末端欠失変異体の活性
発現ベクターpQE80L(Qiagenのカタログ番号32923)を使用して、TaqWT、TaqΔ279、TaqΔ288、およびTaqΔ289のリーディングフレームを、標準的な手順(Sambrook, Fritsch & Maniatis、Molecular Cloning, A Laboratory Manual、第3版、CSHL Press、2001年;Qiagen仕様説明書「QIAexpressionist(登録商標)」、第5版、2003年6月)に従ってE.coli XL-1 Blue株中にクローン化する。形質転換コロニーを使用して、dYT培地(H2O 1L当たり、16gのBacto Trypton、10gのBacto East Extract、5gのNaCl;25μMのアンピシリン)に播種し、そして一晩培養したものを、連続振とう(振とうインキュベーター、1分間に150回転)下で37℃で、マイクロウエルプレート(Falcon、番号353227号)で増殖させる。100μlの一晩培養物を、100μlの新しい培地と混合し、そして1時間インキュベートする。IPTGを添加して500μMの最終濃度とし、そして培養物をさらに4時間インキュベートする。続いて、培養物を10%B-PER(登録商標)溶液(例えば、B-PER Protein Extraction Reagents、Pierce)と混合し、そして60℃で20分間混合物をインキュベートすることによって、細菌を溶解させる。マイクロウエルプレートを、1分間に3,300回転(rpm)で遠心分離して、溶解物を澄明にする。各溶解物の内、最初の40μlのアリコートを、ピペットでEppendorf PCRプレート(各々0.2ml容量の96腔)に入れる。プレートを、Eppendorf「Mastercycler gradient」サーモサイクラーで97℃で35分間インキュベートする。各溶解物の内、第2の40μlのアリコートを、ポジティブコントロールとして室温で維持する。
DNAポリメラーゼ活性を有するポリペプチドの発現および精製
2Lのフラスコ中に800mlアリコートに分割した全容量4LのdYT培地で、TaqΔ288、TaqΔ279(Kentaq)、Stoffel断片(TaqΔ290)、およびTaqWTをコードするリーディングフレームを挿入したpQE80L発現ベクター(Qiagenのカタログ番号32923)で形質転換したE.coli XL-1 Blue株を接種する。細胞を振とう培養で37℃で増殖させる(振とうインキュベーター、1分間に250回転)。約0.8(600nmで測定した)の光学濃度の時点で、IPTG(イソプロピルチオガラクトシド)を添加して、最終濃度を500μMとする。細胞を、光学濃度が2と3の間に達するまで、さらに増殖させる。その後、遠心分離によって細胞を沈殿させ、そしてペレットを、室温で、B50緩衝液(25mM TrisHCl、pH8.5、0.1mM EDTA、5%グリセロール、1mM DTT(ジチオスレイトール)、50mM NaCl)中に再懸濁させる。
細胞を、1,000バールで2回、French Pressを使用して溶解させる。NaClを1.5Mまで添加して、DNA由来のポリメラーゼを溶解させる。続いて、混合物を、水浴上で75℃で15分間加熱した。続いて、混合物をさらに15分間、加熱せずに水浴中に放置する。沈殿を、遠心分離によって上清から分離する。上清を、B100緩衝液(25mM Tris-HCl、pH8.5、0.1mM EDTA、5%グリセロール、1mM DTT、100mM NaCl)に対して透析する。続いて、クロマトグラフィー段階を行う。第一段階では、ヘパリンセファロースカラムならびにB100およびB600(25mM Tris-HCl、pH8.5、0.1mM EDTA、5%グリセロール、1mM DTT、600mM NaCl)での勾配溶出の手段による、TaqΔ288ポリペプチドの溶出を使用する。B50に対するTaqΔ288含有画分の透析に続いて、酵素を、Qセファロースカラムならびに溶出には、B50およびB250(25mM Tris-HCl、pH8.5、0.1mM EDTA、5%グリセロール、1mM DTT、250mM NaCl)の勾配を使用してさらに精製する。最後に、溶出されたTaqΔ288を含む画分を、保存緩衝液(50%[v/v]グリセロール、100mM KCl、20mM Tris-HCl、pH8.5、0.1mM EDTA、1mM DTT、0.25% Thesit)に対して透析する。
精製にHis−タグを使用すると、精製が容易である。5gの沈降細胞を、25mlの溶解緩衝液(50mM NaH2PO4、300mM NaCl、10mMイミダゾール、0.1mM PMSF(フッ化フェニルメチルスルホニル)、1mM DTT、pH8.0)中に再懸濁させ、そして超音波を使用して溶解させる。DNase I(Roch Diagnostics GmbH, Mannheim)を20mg/mlの最終濃度となるように、そしてMgCl2を4mMの最終濃度となるように添加する。混合物を、25℃で30分間インキュベートする。72℃で30分間の加熱インキュベーションに続いて、沈殿物を、遠心分離(22,000×g)によって沈殿させる。澄明な上清を、10mlのNi-NTA Superflow column(Qiagen)に装填する。カラムを、2倍容量の緩衝液A(50mM NaH2PO4、300mM NaCl、10mMイミダゾール、pH8.0)で洗浄する。緩衝液Aで出発して緩衝液B(50mM NaH2PO4、300mM NaCl、250mMイミダゾール、pH8.0)で終わる直線的な勾配の100ml容量で、カラムを溶出する。Qセファロースを用いた陰イオン交換クロマトグラフィーによって、His-タグ付きTaqΔ288ポリペプチドをさらに精製する。最後に、精製したHisタグ付きTaqΔ288ポリペプチドを含む画分を、保存緩衝液に対して透析する。
TaqΔ288の活性
最初に65℃でM13mp9ssDNAにM13プライマーをハイブリダイズさせ、その後、放射標識されたα32dCTPを取込ませる標準的な手順を使用して、DNAポリメラーゼ活性を測定する。液体シンチレーションカウンティングによって、取込みを測定する。活性を、参照としたTaqWT調製物のマスターロットと比較した。表2に、結果をまとめる。
TaqΔ288の分子特徴付け
Hisタグを有さないTaqΔ288ポリペプチドを調製している。N末端の配列決定によって、アミノ酸配列ESPKALEEAPWPPPEが明らかになっている。TaqΔ288ポリペプチドの分子量を、MALDI TOFにより62.5kDaと決定している。
TaqΔ288のシトラコニル化
3mlの反応緩衝液(50mM HEPES、300mM KCl、1mM EDTA、pH8.5)中の3mgの精製したHisタグ付きTaqΔ288ポリペプチドを、室温で1時間、2μlの無水シトラコン酸と反応させる。続いて混合物を、保存緩衝液(63%[w/v]グリセロール、100mM KCl、20mM Tris-HCl、pH8.5、0.1mM EDTA、0.5% Tween 20、1mM DTT)に対して透析する。
シトラコニル化Taq-Δ-288-Dの評価
「LightCycler h-G6PDHハウスキーピング遺伝子セット」または「LightCycler-Parvovirus B19定量化キット」由来の検出混合物および「LightCycler-FastStart DNAマスターハイブリダイゼーションプローブ」由来の反応混合物を用いて、LightCyclerTM装置を使用した形式で、種々のTaq誘導体の評価を実施した。全てのキットはRoche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germanyから入手可能である。
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US 4,683,195
US 4,683,202
US 4,889,818
US 4,965,188
US 5,079,352
US 5,338,671
US 5,436,149
US 5,616,494
US 5,618,676
US 5,677,152
US 5,773,258
US 5,854,018
US 5,856,123
US 5,885,813
US 5,919,651
US 6,183,998
US 6,479,264
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Claims (24)
- アミノ酸配列が配列番号:2のアミノ酸配列であることを特徴とするDNAポリメラーゼ活性を有するポリペプチド。
- アミノ酸配列がさらにN-末端メチオニン残基を有することを特徴とする請求項1記載のポリペプチド。
- 請求項1または2記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
- 配列番号:1または配列番号:3のヌクレオチド配列であることを特徴とする請求項3記載のポリヌクレオチド。
- 請求項3または4記載のポリヌクレオチドを含有する組換えDNAベクター。
- ポリペプチドが、
(i)末端ヒスチジンタグ、
(ii)該ヒスチジンタグに隣接する第X因子プロテアーゼ切断部位を提供するアミノ酸配列、および
(iii)請求項1記載のポリペプチド
からなる融合ポリペプチドをコードすることを特徴とする請求項5記載の組換えDNAベクター。 - ポリヌクレオチドが配列番号:5のアミノ酸配列を有する融合ポリペプチドをコードすることを特徴とする請求項6記載の組換えDNAベクター。
- (a)請求項5記載の組換えDNAベクターを用いて宿主細胞を形質転換する工程、
(b)該宿主細胞を培養し、該宿主細胞においてDNAポリメラーゼ活性を有するポリペプチドを発現させる工程、
(c)工程(b)で発現させたDNAポリメラーゼ活性を有するポリペプチドを精製する工程
を含む、DNAポリメラーゼ活性を有するポリペプチドを生成するための方法。 - (a)請求項6または7記載の組換えDNAベクターを用いて宿主細胞を形質転換する工程、
(b)該宿主細胞を培養し、
(i)末端ヒスチジンタグ、
(ii)該ヒスチジンタグに隣接する第X因子プロテアーゼ切断部位を提供するアミノ酸配列、および
(iii)請求項1記載のポリペプチド
からなる融合ポリペプチドを該宿主細胞において発現させる工程、
(c)工程(b)で発現させた融合ポリペプチドを精製する工程、
(d)第X因子タンパク質分解活性を有するプロテアーゼの存在下で該融合ポリペプチドをインキュベートして融合タンパク質を切断し、それにより第X因子プロテアーゼ切断部位およびヒスチジンタグからDNAポリメラーゼ活性を有するポリペプチドを分離する工程、ならびに
(e)工程(d)のDNAポリメラーゼ活性を有するポリペプチドを精製する工程
を含む、DNAポリメラーゼ活性を有するポリペプチドを生成するための方法。 - 工程(c)において、融合ポリペプチドが、ヒスチジンタグを結合し得る粒状アフィニティーマトリクスを使用して精製されることを特徴とする請求項9記載の方法。
- 工程(d)において、融合ポリペプチドのヒスチジンタグが粒状アフィニティーマトリクスに結合されることを特徴とする請求項9または10記載の方法。
- 粒状アフィニティーマトリクスが金属キレート樹脂でコーティングされたクロマトグラフィー材料であり、金属イオンが該コーティングされたクロマトグラフィー材料に固定されることを特徴とする請求項10または11記載の方法。
- クロマトグラフィー材料がニッケル−ニトリロ三酢酸(Ni-NTA)でコーティングされることを特徴とする請求項12記載の方法。
- 請求項5〜7いずれか記載の組換えDNAベクターで形質転換された組換え宿主細胞。
- 1つ以上の非イオン性ポリマー界面活性剤を含有する緩衝液中に請求項1または2記載のポリペプチドを含有する安定化された調製物。
- ポリペプチドに共有結合する場合に該ポリペプチドのDNAポリメラーゼ活性を可逆的にブロックし得る化合物に該ポリペプチドが共有結合されていることを特徴とする請求項15記載の安定化された調製物。
- 化合物が
(a)無水シトラコン酸、
(b)無水cis-アコニット酸、
(c)無水2,3-ジメチルマレイン酸、
(d)無水エキソ-cis-3,6-エンドオキソ-Δ4-テトラヒドロフタル酸、および
(e)無水3,4,5,6-テトラヒドロフタル酸
からなる群より選択されることを特徴とする請求項16記載の安定化された調製物。 - ポリペプチドを結合する場合に該ポリペプチドのDNAポリメラーゼ活性を可逆的にブロックし得る抗体によりペプチドが結合されていることを特徴とする請求項15記載の安定化された調製物。
- プライマー伸長生成物を生成するための、請求項1または2記載のポリペプチド、ポリペプチドに共有結合する場合に該ポリペプチドのDNAポリメラーゼ活性を可逆的にブロックし得る化合物に共有結合されている請求項1または2記載のポリペプチド、ポリペプチドを結合する場合に該ポリペプチドのDNAポリメラーゼ活性を可逆的にブロックし得る抗体により結合されている請求項1または2記載のポリペプチド、あるいは請求項15〜18いずれか記載の安定化された調製物の使用。
- 核酸鋳型を配列決定するための請求項19記載の使用。
- 標的核酸を増幅するための請求項19記載の使用。
- 請求項15〜18いずれか記載の安定化された調製物を含有する、プライマー伸長生成物を生成するためのキット。
- (a)標的核酸に実質的に相補的なプライマーおよび
(i)請求項1または2記載のポリペプチド、
(ii)ポリペプチドのDNAポリメラーゼ活性を可逆的にブロックし得る化合物に共有結合されている請求項1または2記載のポリペプチド、および
(iii)ポリペプチドのDNAポリメラーゼ活性を可逆的にブロックし得る抗体により結合されている請求項1または2記載のポリペプチド
からなる群より選択されるポリペプチドを含有する増幅反応混合物と試料を接触させる工程、
(b)熱処理によりブロックされたDNAポリメラーゼ活性を任意に開放する工程、
(c)工程(a)で得られた混合物中で該プライマーを該標的核酸にアニーリングする工程、
(d)工程(b)の後、該混合物をインキュベートすることにより標的核酸を増幅して、プライマー伸長生成物の形成を可能にする工程
を含む、試料中で標的核酸を増幅するための方法。 - 少なくとも1つの連鎖終結試薬および1つ以上のヌクレオチド三リン酸の存在下で請求項1または2記載のポリペプチドを用いて配列決定すべき核酸鋳型から連鎖終結断片を生成し、該断片のサイズから該核酸の配列を決定する工程を含む、核酸を配列決定する方法。
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