KR20040099395A - 부정맥 치료용 약제의 제조를 위한 라놀라진의 용도 - Google Patents

부정맥 치료용 약제의 제조를 위한 라놀라진의 용도 Download PDF

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KR20040099395A
KR20040099395A KR10-2004-7015749A KR20047015749A KR20040099395A KR 20040099395 A KR20040099395 A KR 20040099395A KR 20047015749 A KR20047015749 A KR 20047015749A KR 20040099395 A KR20040099395 A KR 20040099395A
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벨라디넬리루이즈
안첼레비치찰스
블랙번브렌트
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씨브이 쎄러퓨틱스, 인코포레이티드
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Abstract

빈맥, 예컨대 특발성 심실 빈맥, 심실 세동, 및 토르사드 데 포인트 (TdP) 를 포함하는 부정맥을 바람직하지 않은 부작용을 최소화하는 방식으로 치료하는 방법이 제공된다.

Description

부정맥 치료용 약제의 제조를 위한 라놀라진의 용도 {USE OF RANOLAZINE FOR THE PREPARATION OF A MEDICAMENT FOR THE TREATMENT OF ARRHYTHMIAS}
본원에 그 전문이 참고문헌으로 도입되는, 2002. 4. 4. 자로 출원한 U.S. 가특허 출원 제 60/370,150 호, 2002. 9. 5. 자로 출원한 U.S. 가특허 출원 제 60/408,292 호 및 2002. 10. 30. 자로 출원한 U.S. 가특허 출원 제 60/422,589 호를 우선권으로 청구한다.
심장은 본질적으로, 신체를 통한 혈액 순환을 책임지는 펌프이다. 정상 기능 심장에서, 상기 순환은, 예를 들어 순환계의 요구에 따른 수축력 및/또는 심박을 증가 또는 감소시키는 전기 충격의 발생으로 일어난다.
심장의 전기 충격은 전기적으로 감지되어 디스플레이될 수 있으며 (심전도, EKG), EKG 의 전기 파형은 "PQRST" 복합체로 허용되는 집합을 특징으로 한다. PQRST 복합체에는 심방 탈분극파에 해당하는 P-파; 심실 탈분극파에 해당하는 QRS복합체; 및 심장 세포의 재분극을 나타내는 T-파가 포함된다. 따라서, P 파는 심장의 상부 챔버 내 활성과 연관되며, QRS 복합체 및 T 파는 모두 하부 챔버 내 활성을 반영한다.
어떤 방식으로 전기 신호가 교란되면, 심장의 효율적인 펌핑 작용이 악화되거나 심지어 모두 중단될 수 있다. 심장의 규칙적이고 주기적인 맥박의 교란은 심장 질환에서 나타나는 가장 일반적인 장애의 하나이다. 불규칙한 리듬 (부정맥) 은 약간 성가실 수도 있고, 또는 심각한 문제를 나타낼 수도 있다. 예를 들어, 부정맥은 심장 근육, 판막 또는 동맥에 내재된 기형을 나타낼 수 있으며, 심장이 너무 느리게 뛰거나 (서맥), 또한 심장이 너무 빠르게 뛰는 (빈맥) 상황이 포함된다.
빈맥은 두 가지 일반적 종류로 나타난다: 심실위 빈맥 및 심실성 빈맥.
심실위 빈맥에는 발작성 심실위 빈맥 (PSVT), 심방 세동, 심방 조동, AV 결절 회귀, 및 볼프-파킨슨 화이트 증후군 (Wolff-Parkinson White 증후군, WPW) 이 포함된다. 심실위 빈맥 (SVT) 은 심장 하부 챔버 위의 어느 부위에서의 심장 문제로 인해 심장을 통해 전달되는 전기 충격이 비정상인 상태이다. SVT 에는 분 당 140 내지 250 박동의 심박이 관여될 수 있다 (정상은 분 당 약 70 내지 80 박동이다).
심실성 빈맥에는 심실성 빈맥 자체 뿐만 아니라, 심실 세동 및 토르사드 데 포인트 (Torsade de Pointe, TdP) 가 포함된다. 심실성 빈맥 (VT) 은 심실 내에서 기원하는 빠른 심장 리듬이다. VT 는 심실 근육의 규칙적 수축을 혼란시켜서, 혈액을 분출하는 심실의 능력이 종종 상당히 감소되는 경향이 있다. 이는 과도한 심박과 조합되어, VT 도중 심장에 의해 실제로 펌핑되는 혈액량을 위험한 수준으로 감소시킬 수 있다. 결과적으로, VT 를 앓는 환자는 때때로 비교적 괜찮게 느낄 수 있지만, 이들은 - 언제나의 심계항진에 부가하여 - 종종 심각한 어지러움, 의식 소실 또는 심지어 돌연사를 겪는다. 일반적으로, VT 는 내재 심장 질환이 없는 환자에서는 일어나지 않는다. 내재 심장 질환을 갖는 사람들에 있어서는, 좌심실의 기능이 악화될 수록, 생명을 위협하는 심실성 빈맥의 발생 위험성이 높아진다는 것이 일반적인 사실이다.
심실성 빈맥은 심근 허혈 상황, 예컨대 불안정성 협심증, 만성 협심증, 변이형 협심증, 심근 경색, 급성 관상동맥 증후군, 및 부가적으로 급성 및 만성 심부전 둘 다에서 일어날 수 있다.
EKG 로 측정되는 Q 파 및 T 파 간 평균보다 긴 간격으로 반영되는, 재분극의 비정상적 연장 또는 긴 QT 증후군 (long QT syndrome, LQTS) 으로 알려진 상태가 있다. QT 간격의 연장은 환자를 토르사드 데 포인트로 알려진 매우 빠른 비정상적 심장 리듬 ("부정맥") 에 취약하게 만든다. 부정맥이 발생하면, 혈액이 심장으로부터 펌핑되지 않고, 뇌에서 혈액이 신속히 박탈되어, 갑작스런 의식 소실 (실신) 을 일으키며, 돌연사가 야기될 수 있다.
LQTS 는 심장 이온 채널의 기능장애 또는 약물에 의해 야기된다. 상기 채널은 칼륨 이온, 나트륨 이온, 및 칼슘 이온의 흐름을 조절하며, 세포 안팎으로의 그 흐름은 심장의 전기 활성을 발생시킨다. LQTS 를 앓는 환자는 보통 식별가능하게 내재된 구조적 심장 질환을 갖지 않는다. LQTS 는 특정 상황, 예를 들어 운동, 특정 약리 제제의 투여 하에 또는 수면 중에서도 특정한 변이형 심실성 빈맥을 발생시키는 경향을 가지며, 유전될 수 있다. 이와는 달리, 환자는 예를 들어 특정 처방 의약으로의 노출에 의해 LQTS 를 획득할 수 있다.
획득형 LQTS 는 약리 제제로 유도될 수 있다. 예를 들어, 퀴니딘으로 치료받은 환자에서 토르사드 데 포인트 (TdP) 의 발생률은 2.0 내지 8.8% 범위로 추산된다. DL-소탈롤은 1.8 내지 4.8% 범위의 발생률에 연관되었다. 새로운 클래스 III 의 항-부정맥제, 예컨대 도페틸리드 및 이부틸리드에 대해 유사한 발생률이 기술되었다. 실제로, 더욱 증가하는 수의 비심혈관 제제도 TdP 를 악화 및/또는 촉진시키는 것으로 나타나 있다. 50 개를 초과하는 시판 약물이 TdP 를 유도하는 것으로 보고되어 있다. 상기 문제점은 신약에 대해 더욱 빈번히 일어나고 있으며, 최근 수년간 여러 신약이 시장에서 철수되었다 (예컨대 프레닐아민, 테로딜린 및 일부 국가에서 테르페나딘, 아스테미졸 및 시사프라이드). 약물 유도 TdP 는 심실 심근의 내재 전기 이질성의 증대에 이차적인 재분극 분산의 증가 결과 대부분 발생하는 것으로 나타났다.
연장된 재분극 및 획득 LQTS 를 일으킬 수 있는 대부분의 약리 제제는 하기 4 개의 상이한 기전 중 하나를 통해 주로 작용하는 것으로 구분될 수 있다: (1) K 전류 IKs및 IKr중 하나 또는 둘의 지연. 예로는 퀴니딘, N-아세틸프로카인아미드, 세슘, 소탈롤, 브레틸륨, 클로필륨 및 기타 신규 클래스 III 항부정맥제가 있다 (상기 작용은 K 채널을 활성화시키는 약물, 예컨대 피나시딜 및 크로마칼린에 의해 특이적으로 길항될 수 있을 것이다); (2) 현저한 Ito를 갖는 것으로 보고된 개과 (canine) 하부심장외 M 세포에서 우선적으로 EAD 를 유도하고 재분극을 연장시키는 것으로 나타난 4-아미노피리딘의 경우에서와 같은 Ito의 억제; (3) Bay K 8644 의 경우에서와 같은 ICa의 증가 (상기 작용은 Ca 채널 차단제에 의해 역전될 수 있다); (4) 아코니틴, 베라트리딘, 베트라코톡신, DPI, 및 말미잘 독소 (ATX) 안토플레우린-A (AP-A) 및 ATX-II 의 경우에서와 같은 INa불활성화의 지연 (상기 작용은 INa를 차단하고/하거나 Na 전류를 서서히 불활성화시키는 약물, 예컨대 리도카인 및 멕실레틴에 의해 길항될 수 있다). 상기 약물 (예컨대 리도카인 및 멕실레틴) 이 연장된 재분극을 단축시킬 수 있으므로, 이들은 또한 앞의 2 개 기전에 의해 유도되는 EAD 를 억제할 수 있다.
LQTS 및 TdP 를 일으키는 약물 목록은 계속 증가하고 있다. 사실상, QT 를 연장시킬 수 있는 임의 약리 제제는 LQTS 를 유도할 수 있다. TdP 의 발생률은 상기 부정맥을 촉진시키는 것으로 공지된 약물의 혈장 농도와는 관련되지 않았다. 그러나, 일부 상기 약물의 과도한 용량 또는 감소된 대사로 야기되는 높은 혈장 농도는 TdP 촉진 위험성을 증가시킬 수 있다. 이러한 감소된 대사는 시토크롬 P450효소를 방해하는 다른 약물의 동시 사용으로 야기될 수 있다. TdP 와 연관된 일부 약물의 대사를 방해하는 것으로 보고된 약제에는 전신성 케토코나졸 및 구조적으로 유사한 약물 (플루코나졸, 이트라코나졸, 메트로니다졸); 세로토닌 재흡수 저해제 (플루옥세틴, 플루복사민, 세르트랄린), 및 기타 항우울제 (네파조돈), 인간 면역결핍 바이러스 (HIV) 프로테아제 저해제 (인디나비르, 리토나비르, 사퀴나비르); 디히드로피리딘 칼슘 채널 차단제 (펠로디핀, 니카르디핀, 니페디핀) 및 에리트로마이신, 및 기타 마크롤라이드 항생제가 포함된다. 자몽 및 자몽 쥬스도 또한 시토크롬 P450효소를 방해하여 일부 약물과 상호작용할 수 있다. 일부 약물은 이들이 QT 간격을 연장시키기 때문이 아니라 주로 P4503A4 의 저해제여서 다른 QT 연장제의 혈장 농도를 증가시키기 때문에 TdP 에 연관되었다. 최적예는 상기 효소의 강력한 저해제여서, 테르페나딘, 아스테미졸, 또는 시사프라이드 요법 도중 TdP 의 원인이 되는 케토코나졸 및 이트라코나졸이다. 한편, 약물의 TdP 연관 발생률은 하기 일부 약물의 경우 매우 낮았다: 디피히드라민, 플루코나졸, 퀴닌, 리튬, 인다파미드, 및 바소프레신. 또한 TdP 는 의학 상태, 예컨대 간 기능장애 또는 선천성 LQTS 를 갖는 환자에서 또는 전해질 교란 (특히 저칼륨증 및 저마그네슘증) 을 갖는 환자에서 QT 를 연장시키는 약물의 사용으로 야기될 수 있음을 주지해야 한다.
그러나, QT 간격을 연장시키지만 TdP 를 유도하지 않는 것으로 공지된 항-부정맥 약물도 존재한다. 상기 약물에 공통적인 특성은 다른 이온 전류, 예컨대 INa채널, 및/또는 ICa채널을 동시에 저해하는 능력에 있음이 발견되었다.
유전형 LQTS 는 전기 재분극을 조절하는 이온 채널 중 하나를 생산하거나 "코딩하는" 여러 유전자 중 하나에 돌연변이가 발생하는 경우 일어난다. LQT1, LQT2, LQT3, LQT4, 및 LQT5 로 구분되는 5 개 이상의 상이한 유전형 LQTS 가 있다. 이들은 본래 EKG 자취의 상이한 모양으로 구분되었으며, 후에 특정 유전자 돌연변이에 연관되었다. KCNQ1 (KVLQT1) 또는 KCNE1 (MinK) 유전자 돌연변이로부터의 LQT1 형이 가장 빈번하며, 유전자분석된 환자의 대략 55-60% 에 해당한다. HERG 또는 KCNE2 (MiRP1) 돌연변이로부터의 LQT2 형이 다음으로 약 35-40% 이며, SCN5A 돌연변이로부터의 LQT3 은 약 3-5% 에 해당한다. 2 가지 돌연변이를 갖는 환자는 모든 환자의 1% 미만에 해당하는 것으로 생각되지만, 이는 새로운 유전학 기법으로 더 많은 환자가 연구되는 경우 변할 수 있다.
돌연변이체 유전자는 비정상적인 채널을 형성시키며, 상기 채널이 적절히 기능하지 못하므로, 심장의 전기 회복이 더 오래 걸리고, 이는 스스로 연장된 QT 간격으로 나타난다. 예를 들어, SCN5A 에 의해 코딩되는 심장 Na+ 채널의 아미노산 잔기 1505-1507 (KPQ) 의 유전된 결실은 치명적인 심실 부정맥에 연관되는 심각한 상염색체 우성 LQT3 증후군을 일으킨다. 치명적인 부정맥은 LQT3 환자의 39% 에서 수면 또는 휴식 도중에 일어나며, 이는 아마도 과도한 후기 Na+ 전류가 특히 낮은 심박에서 재분극을 비정상적으로 연장시켜 초기 후탈분극 (early afterdepolarization, EAD) 및 이소성 박동 발생을 촉진하기 때문일 것이다. 중간-심근에서의 우선적인 재분극의 속도감소는 재분극의 전층 (transmural) 분산을 더욱 증강시켜 단일방향의 차단 및 부정맥의 재진입을 유도할 수 있다. 또다른 32% 의 LQT3 환자에 있어서, 치명적인 심장 사고는 운동 또는 감정에 의해 유도된다.
최근에는 심장 나트륨 채널 유전자 SCN5A 의 변이형이 아프리카계 미국인에서 부정맥과 연관됨이 보고되었다. 단일쇄 배좌 다형성 (SCCP) 및 DNA 서열 분석에서는 SCN5A 의 코돈 1102 중 C 에서 A 로의 이형접합 변위가 세린 (S1102) 을 티로신 (Y1102) 으로 치환하는 것으로 드러났다. S1102 는 채널의 도메인 II 및 III 을 연결하는 세포내 서열에 위치하는 보존된 잔기이다. 상기 연구자들은 Y1102 대립유전자가 부정맥 감수성을 증가시킴을 발견하였다. QTc(교정된 QT) 는 아미오다론으로 현저히 연장되어, 토르사드 데 포인트 심실성 빈맥을 일으키는 것으로 나타났다.
부정맥 및 TdP 의 위험성을 감소시키는 방식으로 유전 또는 획득된 LQTS 를 치료하거나 예방하는 제제가 필요하다. 라놀라진은 예전에 심박 또는 혈압에 영향이 없거나 최소한의 영향을 갖는, 협심증 치료를 위해 효과적인 제제인 것으로 나타났다. 이제 놀랍게도, 라놀라진 및 관련 화합물이 유전 또는 획득된 부정맥의 예방 및/또는 치료를 위해 효과적인 제제임을 발견하였다.
놀랍게도, IKr, IKs, 및 후기 INa이온 채널을 저해하는 화합물이 상기 바람직한 활성 스펙트럼을 나타냄을 발견하였다. 상기 화합물들은 심실 작용 전위기를 연장시키고, 심실 유효 불응기를 증가시키고, TDR 을 감소시키고, APD 를 증가시키고, EAD 를 일으키지 않는다. 예를 들어, 협심증 및 울혈성 심부전에 유용한 것으로 공지된 라놀라진은 칼슘 채널을 차단하지 않는 용량 수준에서 IKr, IKs,및 후기 INa이온 채널을 저해하는 그 능력으로 인해 심실성 빈맥의 치료에 유용한 것으로 나타났다. 이는 특히, 본원에 그 전문이 참고문헌으로 도입된 U.S. 특허 제 4,567,264 호에서, 라놀라진이 칼슘 이온 채널을 저해하는 심장선택적 약물이라고 개시되었고, 칼슘 채널을 차단하는 그 효과의 결과로 부정맥을 포함하는 여러 질환 상태의 치료에 유용할 수 있음이 제시되었다는 점에서 놀랍다. 그러나, 본 발명자들은 라놀라진이 칼슘 채널에 영향이 없거나 거의 없는 수준에서 효과적인 항-부정맥제로 작용함을 발견하였다. 치료적 용량 수준에서 칼슘 채널 활성에 대한 무영향 또는 최소한의 영향은, 환자에서 부정맥을 치료하는 경우 바람직하지 않은 칼슘 이온 채널 저해제의 널리 공지된 효과 (예컨대 혈압 변화) 를 방지한다는 점에서 유익하다. 발명자들은 또한 라놀라진이 EAD, 및 약물, 예컨대 퀴니딘 및 소탈롤 투여의 부작용인 유도 활성의 억제에 효과적임을 발견하였다.
따라서, 사인형 리듬을 복구시키면서 바람직하지 않은 부작용, 예컨대 평균 동맥압, 혈압, 심박의 변화, 또는 기타 역효과가 실질적으로 없는 신규하고 효과적인 VT 치료 방법이 제공된다.
본 발명은 바람직하지 않은 부작용을 최소화하면서 특정 심장 이온 채널의 활성을 조절하는 화합물의 투여를 포함하는, 심장 부정맥의 치료 방법에 관한 것이다.
본 발명의 개요
본 발명의 목적은 포유류에서 부정맥을 치료하는 효과적인 방법을 제공하는 것이다. 따라서, 제 1 측면에 있어서, 본 발명은 하기 화학식 I 의 화합물 또는 이들의 이성질체, 또는 화학식 I 의 화합물의 약학적으로 허용가능한 염 또는에스테르 또는 그 이성질체의 치료량을 투여하는 것을 포함하는, 포유류에서의 부정맥 치료 방법에 관한 것이다:
(식 중,
R1, R2, R3, R4및 R5는 각각 독립적으로 수소, 저급 알킬, 저급 알콕시, 시아노, 트리플루오로메틸, 할로, 저급 알킬티오, 저급 알킬 술피닐, 저급 알킬 술포닐, 또는 N-임의 치환 알킬아미도이며, 단 R1이 메틸인 경우, R4는 메틸이 아니거나; 또는
R2및 R3이 함께 -OCH20- 를 형성하며;
R6, R7, R8, R9및 R10은 각각 독립적으로 수소, 저급 아실, 아미노카르보닐메틸, 시아노, 저급 알킬, 저급 알콕시, 트리플루오로메틸, 할로, 저급 알킬티오, 저급 알킬 술피닐, 저급 알킬 술포닐, 또는 디-저급 알킬 아미노이거나; 또는
R6및 R7이 함께 -CH=CH-CH=CH- 를 형성하거나; 또는
R7및 R8이 함께 -O-CH20- 를 형성하고;
R11및 R12는 각각 독립적으로 수소 또는 저급 알킬이고;
W 는 산소 또는 황이다).
바람직한 화합물은 N-(2,6-디메틸페닐)-4-[2-히드록시-3-(2-메톡시페녹시)프로필]-1-피페라진아세트아미드 {또한 1-[3-(2-메톡시페녹시)-2-히드록시프로필]-4-[(2,6-디메틸페닐)-아미노카르보닐메틸]-피페라진으로 공지됨} 로 명명되는 라놀라진 라세믹 혼합물, 또는 이들의 이성질체 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염이다. 이는 바람직하게는 IKr, IKs및 후기 INa이온 채널은 저해하지만 칼슘 채널 또는 다른 이온 채널은 저해하지 않는 용량 수준으로 투여된다. 라세믹 혼합물 또는 이성질체로서의 라놀라진은 자유 염기 또는 약학적으로 허용가능한 염으로 제형화될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 염으로 제형화되는 경우, 디히드로클로라이드 염이 바람직하다.
제 2 측면에 있어서, 본 발명은 라놀라진, 또는 이들의 이성질체, 또는 상기 화합물의 약학적으로 허용가능한 염 또는 그의 이성질체의 유효량을 이들 필요로 하는 포유류에 투여하는 것을 포함하는, 부정맥의 치료 방법에 관한 것이다.
제 3 측면에 있어서, 본 발명은 라놀라진, 또는 이들의 이성질체, 또는 상기 화합물의 약학적으로 허용가능한 염 또는 그의 이성질체를 후기 INa이온 채널을 저해하는 용량 수준으로 투여하는 것을 포함하는, 포유류에서 부정맥의 치료 방법에 관한 것이다. IKr, IKs, 및 후기 INa이온 채널을 저해하는 치료량이 바람직하다.IKr, IKs, 및 후기 INa이온 채널을 저해하지만 칼슘 채널은 저해하지 않는 치료량이 보다 바람직하다.
하나의 바람직한 구현예에 있어서, 본 발명의 화합물은 12 시간 이상 동안 350 ±30 ng/㎖ 이상인 화학식 I 의 화합물의 혈장 수준을 제공하는 방식으로 투여된다.
두번째 바람직한 구현예에 있어서, 본 발명의 화합물은 12 시간 이상 동안 최대 4000 ng/㎖ 미만, 바람직하게는 약 350 내지 약 4000 ng 기재/㎖ 인 화학식 I 의 화합물의 혈장 농도를 유지하는 서방성 제형으로 투여된다.
세번째 바람직한 구현예에 있어서, 본 발명의 화합물은 약 10 mg 내지 700 mg 의 화학식 I 의 화합물을 포함하는 제형으로 투여된다. 바람직한 화학식 I 의 화합물은 라놀라진, 또는 이들의 이성질체, 또는 상기 화합물의 약학적으로 허용가능한 염 또는 이들의 이성질체이다.
네번째 바람직한 구현예에 있어서, 본 발명의 화합물은 제형 1 리터 당 약 1 내지 약 30 마이크로몰의 용량 수준을 제공하는 제형으로 투여된다. 제형 1 리터 당 약 1 내지 약 10 마이크로몰의 용량 수준을 제공하는 제형의 투여가 바람직하다.
제 4 측면에 있어서, 본 발명은 라놀라진, 또는 이들의 이성질체, 또는 상기 화합물의 약학적으로 허용가능한 염 또는 이들의 이성질체의 유효량을 이를 필요로 하는 포유류에게 투여하는 것을 포함하는, 포유류에서의 부정맥의 예방 방법에 관한 것이다.
제 5 측면에 있어서, 본 발명은 라놀라진, 또는 이들의 이성질체, 또는 상기 화합물의 약학적으로 허용가능한 염 또는 이들의 이성질체의 유효량을 이를 필요로 하는 포유류에게 투여하는 것을 포함하는, 포유류에서의 부정맥의 치료 방법에 관한 것이다.
제 6 측면에 있어서, 본 발명은 라놀라진, 또는 이들의 이성질체, 또는 상기 화합물의 약학적으로 허용가능한 염 또는 이들의 이성질체의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 포유류에게 투여하는 것을 포함하는, 획득 부정맥 (처방 약제 또는 다른 화학물질에 의해 야기되는 부정맥) 의 치료 방법에 관한 것이다. 퀴니딘에 대한 감수성에 의해 획득된 부정맥을 갖는 포유류로의 제형물 투여가 바람직하다.
제 7 측면에 있어서, 본 발명은 라놀라진, 또는 이들의 이성질체, 또는 상기 화합물의 약학적으로 허용가능한 염 또는 이들의 이성질체의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 포유류에게 투여하는 것을 포함하는, 획득 부정맥 (처방 약제 또는 다른 화학물질에 의해 야기되는 부정맥) 의 예방 방법에 관한 것이다.
제 8 측면에 있어서, 본 발명은 라놀라진, 또는 이들의 이성질체, 또는 상기 화합물의 약학적으로 허용가능한 염 또는 이들의 이성질체의 유효량을 이를 필요로 하는 포유류에게 투여하는 것을 포함하는, 유전 부정맥 (유전자 돌연변이로 야기된 부정맥) 의 치료 방법에 관한 것이다.
제 9 측면에 있어서, 본 발명은 라놀라진, 또는 이들의 이성질체, 또는 상기 화합물의 약학적으로 허용가능한 염 또는 이들의 이성질체의 유효량을 이를 필요로하는 포유류에게 투여하는 것을 포함하는, 유전 부정맥 (유전자 돌연변이로 야기된 부정맥) 의 예방 방법에 관한 것이다.
제 10 측면에 있어서, 본 발명은 라놀라진, 또는 이들의 이성질체, 또는 상기 화합물의 약학적으로 허용가능한 염 또는 이들의 이성질체의 유효량을 이를 필요로 하는 포유류에게 투여하는 것을 포함하는, 유전적으로 결정된 선천성 LQTS 를 갖는 포유류에서의 부정맥의 예방 방법에 관한 것이다.
제 11 측면에 있어서, 본 발명은 라놀라진, 또는 이들의 이성질체, 또는 상기 화합물의 약학적으로 허용가능한 염 또는 이들의 이성질체의 유효량을 이를 필요로 하는 포유류에게 투여하는 것을 포함하는, 유전적으로 결정된 선천성 LQTS 를 갖는 포유류에서의 부정맥의 치료 방법에 관한 것이다.
제 12 측면에 있어서, 본 발명은 라놀라진, 또는 이들의 이성질체, 또는 상기 화합물의 약학적으로 허용가능한 염 또는 이들의 이성질체의 유효량을 이를 필요로 하는 포유류에게 투여하는 것을 포함하는, 토르사드 데 포인트의 예방 방법에 관한 것이다.
제 13 측면에 있어서, 본 발명은 라놀라진, 또는 이들의 이성질체, 또는 상기 화합물의 약학적으로 허용가능한 염 또는 이들의 이성질체의 유효량을 이를 필요로 하는 포유류에게 투여하는 것을 포함하는, LQT3 을 앓는 포유류에서의 부정맥의 예방 방법에 관한 것이다.
제 14 측면에 있어서, 본 발명은 라놀라진, 또는 이들의 이성질체, 또는 상기 화합물의 약학적으로 허용가능한 염 또는 이들의 이성질체의 유효량을 이를 필요로 하는 포유류에게 투여하는 것을 포함하는, LQT3 을 앓는 포유류에서의 부정맥의 치료 방법에 관한 것이다.
제 15 측면에 있어서, 본 발명은 라놀라진, 또는 이들의 이성질체, 또는 상기 화합물의 약학적으로 허용가능한 염 또는 이들의 이성질체의 유효량을 이를 필요로 하는 포유류에게 투여하는 것을 포함하는, LQT1, LQT2, 및 LQT3 을 앓는 포유류에서의 부정맥의 예방 방법에 관한 것이다.
제 16 측면에 있어서, 본 발명은 라놀라진, 또는 이들의 이성질체, 또는 상기 화합물의 약학적으로 허용가능한 염 또는 이들의 이성질체의 유효량을 이를 필요로 하는 포유류에게 투여하는 것을 포함하는, LQT1, LQT2, 및 LQT3 을 앓는 포유류에서의 부정맥의 치료 방법에 관한 것이다.
제 17 측면에 있어서, 라놀라진, 또는 이들의 이성질체, 또는 상기 화합물의 약학적으로 허용가능한 염 또는 이들의 이성질체의 유효량을 이를 필요로 하는 포유류에게 투여하는 것을 포함하는, LQT3 을 앓는 포유류에서의 부정맥의 감소 방법에 관한 것이다.
제 18 측면에 있어서, 본 발명은 라놀라진, 또는 이들의 이성질체, 또는 상기 화합물의 약학적으로 허용가능한 염 또는 이들의 이성질체의 유효량을 이를 필요로 하는 포유류에게 투여하는 것을 포함하는, LQT1, LQT2, 및 LQT3 을 앓는 포유류에서의 부정맥의 감소 방법에 관한 것이다.
제 19 측면에 있어서, 본 발명은 적절한 집단을 SCN5A 유전자 돌연변이에 대해 스크리닝하고, 라놀라진, 또는 이들의 이성질체, 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염의 유효량을 상기 유전자 돌연변이를 갖는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 부정맥의 예방 방법에 관한 것이다. SCN5A 유전자 돌연변이에 대해 바람직한 적절한 집단은 정상 기능의 나트륨 채널을 갖지 않는 집단의 일부이다.
제 20 측면에 있어서, 본 발명은 바람직하지 않은 부작용을 최소화하면서 포유류에서 심실성 빈맥을 치료하는 방법에 관한 것이다.
제 21 측면에 있어서, 본 발명은 투여 부작용으로 TdP 를 일으키는 약물 이전에, 이후에, 또는 동시에 IKr, IKs, 및 후기 INa이온 채널을 저해하는 화합물의 치료량을 투여하는 것을 포함하는, 약물 치료 결과 일어나는 포유류에서의 심실성 빈맥의 치료 방법에 관한 것이다. 퀴니딘 또는 소탈롤에 대한 감수성으로 획득된 부정맥을 갖는 포유류로의 제형물 투여가 바람직하다.
제 22 측면에 있어서, 본 발명은 IKr, IKs, 및 후기 INa이온 채널을 저해하지만 칼슘 채널은 저해하지 않는 용량 수준으로 화학식 I 의 화합물의 치료량을 투여하는 것을 포함하는, 심장 약화 포유류에서의 심실성 빈맥의 치료 방법에 관한 것이다.
제 23 측면에 있어서, 본 발명은 12 시간 이상 동안 350 ±30 ng/㎖ 이상인 화학식 I 의 화합물의 혈장 수준을 제공하는 방식으로, 볼루스로서의 화학식 I 의 화합물의 투여에 의한 부정맥 또는 심실성 빈맥의 치료 방법에 관한 것이다.
제 24 측면에 있어서, 본 발명은 12 시간 이상 동안 최대 4000 ng/㎖ 미만, 바람직하게는 약 350 내지 약 4000 ng 베이스/㎖ 인 화학식 I 의 화합물의 혈장 수준을 유지하는 방식으로, 서방성 제형으로서의 화학식 I 의 화합물의 투여에 의한 부정맥 또는 심실성 빈맥의 치료 방법에 관한 것이다.
제 25 측면에 있어서, 본 발명은 화학식 I 의 화합물 또는 이들의 이성질체, 또는 상기 화합물의 약학적으로 허용가능한 염 또는 에스테르 또는 그의 이성질체를 볼루스 또는 서방성 조성물로 투여하는, 부정맥의 치료 방법에 관한 것이다.
제 26 측면에 있어서, 본 발명은 화학식 I 의 화합물 또는 이들의 이성질체, 또는 상기 화합물의 약학적으로 허용가능한 염 또는 에스테르 또는 그의 이성질체를 정맥내 투여하는, 부정맥의 치료 방법에 관한 것이다.
제 27 측면에 있어서, 본 발명은 화학식 I 의 화합물 또는 이들의 이성질체, 또는 상기 화합물의 약학적으로 허용가능한 염 또는 에스테르 또는 그의 이성질체의, 포유류에서의 부정맥 치료를 위한 용도에 관한 것이다.
제 28 측면에 있어서, 본 발명은 심근 허혈 상황, 예컨대 불안정성 협심증, 만성 협심증, 변이형 협심증, 심근 경색, 급성 관상동맥 증후군, 및 부가적으로 급성 및 만성인 심부전에서 야기되는 심실성 빈맥의 치료 방법에 관한 것이다.
약어:
APD: 작용 전위기
BCL: 기본 주기 길이
EAD : 초기 후탈분극
ECG 및 EKG: 심전도
IKr: 급속 칼륨 채널 정류 전류
IKs: 완속 칼륨 채널 정류 전류
INa, L: 후기 나트륨 채널 전류
epi 세포: 심장외 세포
endo 세포: 심장내 세포
LQTS: 장기 QT 증후군
M 세포: 심장의 중간심근 영역에서 유래되는 세포
RMP: 휴지막 전위
TdP: 토르사드 데 포인트
TDR: 재분극의 전층 분산
VT: 심실성 빈맥
도면 설명
도 1. 전도계의 가상 작용 전위 및 이를 일으키는 전류의 시간 경과 간 상관관계.
도 2. 일반 충격 전달.
도 3. 개과 좌심실 근육세포에서 지연된 정류 전류 (IKr) 의 급속 활성화 성분에 대한 라놀라진의 효과. A: 라놀라진 (50 μM) 이전 및 이후에 유지 전위 -40 mV 에서 30 mV 로의 250 msec 펄스 및 - 40 mV 로의 재분극 동안 기록되는 대표적 전류 자취. 세포를 5 μM 니페디핀을 함유하는 Tyrode 용액에 담갔다.B: IKr로의 라놀라진의 저해 효과에 대한 농도-반응 곡선. IKr은 30 mV 로의 250 msec 탈분극 펄스 후 -40 mV 로의 재분극에 대한 꼬리 전류 (tail current) 로 측정하였다 (n = 5-8).
도 4. 라놀라진은 연장된 정류 전류 (IKs) 의 완속 활성화 성분을 저해한다. A: 100 μM 라놀라진의 존재 및 부재 하에 개과 좌심실 심장외 근육세포에서 전형적 실험으로 기록되는 대표적 IKs전류 자취. 전류는 유지 전위 -50 mV 으로부터 3 초 동안 30 mV 로의 탈분극 단계, 이어서 0 mV 로의 재분극 단계 (4.5 초) 에 의해 유도되었다. IKs를 재분극 단계 후에 기록된 꼬리 전류로서 측정하였다. 라놀라진 (100 μM) 은 IKs를 거의 완전히 차단하였고, 저해 효과는 세척에 의해 완전히 역전되었다. B: 5 μM 의 E-4031 및 5 μM 의 니페디핀의 존재 하 IKs(30 mV 로의 3 초 탈분극 단계 후 0 mV 로의 재분극 단계에 의해 유도되는 꼬리 전류로서 측정됨) 로의 라놀라진의 저해 효과에 대한 농도-반응 곡선 (n = 5-14). 라놀라진은 13.4 μM 의 IC50로 IKs를 저해하였다.
도 5. 라놀라진은 개과 심실 근육세포에서 IKl에 영향을 미치지 않는다. A: 유지 전위 -40 mV 로부터 900 msec 동안 -100 내지 0 mV 범위의 시험 전위로의 전압 단계 동안 라놀라진 (100 μM) 으로의 노출 이전 및 이후에 기록되는 대표적 전류 자취를 나타낸다. B: 시험 전압의 함수로서 900 msec 펄스 말기에 측정된 전류 수준을 도시하여 얻어진 일정 상태 (steady state) I-V 상관관계. 100 μM 이하 농도의 라놀라진은 IKl를 변화시키지 않았다. 데이타는 평균 ±S.E.M. 으로 나타낸다 (n = 6).
도 6. 2000 msec 의 기본 주기 길이 (BCL) 에서 심장외 및 M 세포 작용 전위에 대한 라놀라진의 효과 ([K+]0= 4 mM). A: 기저선 조건 하에, 이어서 점진적으로 더 높은 농도의 라놀라진 (1-100 μM) 첨가에 따라 기록되는 겹쳐진 막통과 작용 전위를 나타낸다. B 및 C: 그래프는 작용 전위기 (APD50및 APD90) 에 대한 라놀라진의 농도-의존적 효과를 도시한다. 데이타는 평균 ±SD 로 나타낸다. *- p < 0.05 vs. 대조군.
도 7. 기본 주기 길이 500 msec 에서 심장외 및 M 세포 작용 전위기 (APD50및 APD90) 에 대한 라놀라진의 효과 ([K+]0= 4mM). 그래프는 작용 전위기 (APD50및 APD90) 에 대한 라놀라진의 농도-의존적 효과를 도시한다. 데이타는 평균 ±SD 로 나타낸다. *- p < 0.05 vs. 대조군.
도 8. 작용 전위의 업스트로크 (upstroke) 의 상승 속도 (Vmax) 에 대한 라놀라진의 효과. 기저선 조건 하에, 및 10 및 100 μM 라놀라진의 존재 하에 기록된 겹쳐진 작용 전위 (B) 및 대응하는 미분 업스트로크 (dV/dt, A) 를 나타낸다 (BCL = 500 msec). C: Vmax를 감소시키기 위한 라놀라진 효과의 농도-반응 상관관계.
도 9. 기본 주기 길이 2000 msec 및 [K+]0= 2 mM 에서 기록된 심장외 및 M 세포 작용 전위에 대한 라놀라진의 효과. A: 라놀라진 (1-100 μM) 의 존재 및 부재 하에 기록된 겹쳐진 막통과 작용 전위를 나타낸다. B 및 C: 그래프는 작용 전위기 (APD50및 APD90) 에 대한 라놀라진의 농도-의존적 효과를 도시한다. 데이타는 평균 ±SD 로 나타낸다. *- p < 0.05 vs. 대조군.
도 10. 기본 주기 길이 500 msec 에서 심장외 및 M 세포 작용 전위기 (APD50및 APD90) 에 대한 라놀라진의 효과 ([K+]0= 2mM). 그래프는 작용 전위기 (APD50및 APD90) 에 대한 라놀라진의 농도-의존적 효과를 도시한다. 데이타는 평균 ±SD 로 나타낸다. *- p < 0.05 vs. 대조군.
도 11. 위에서 아래로의 각각의 패널은, 기본 주기 길이 (BCL) 2000 msec 에서 동맥 관류 개과 좌심실 쐐기 (wedge) 제조물의 중간심근 (M 영역) 및 심장외막 (Epi) 으로부터 기록된 ECG 자취 및 막통과 작용 전위를 나타낸다. 겹쳐진 신호는 기저선 조건 (대조군) 및 1-100 μM 범위의 농도에 걸친 라놀라진의 효과를 나타낸다. A: 쐐기물을 관류시키기 위해 4 mM KCl 을 함유하는 Tyrode 용액을 이용하여 수행하였음. B: 2 mM KCl 을 함유하는 Tyrode 용액을 이용하여 수행하였음.
도 12. 복합 데이타는 라놀라진 (1-100 μM) 으로의 노출 전후 APD90(Epi및 M 의 값) 및 QT 간격값 (A, C) 및 APD50값 (B, D) 을 도식적으로 나타낸다. A, B: 4 mM KCl. C, D: 2 mM KCl. BCL = 2000 msec.
도 13. M 세포 제조물에서 d-소탈롤-유도 초기 후탈분극 (EAD) 을 억제하는 라놀라진의 효과. A 및 B: IKr차단물 (100 μM d-소탈롤) 의 존재 하 대조군 조건 하에, 이어서 계속되는 d-소탈롤의 존재 하에 단계적으로 증가하는 농도의 라놀라진 (5, 10, 및 20 μM) 첨가 후 2 개의 M 세포 제조물로부터 기록되는 겹쳐진 막통과 작용 전위. 기본 주기 길이 = 2000 msec.
도 14. 천공 패치 전압 클램프 기법을 이용하여 기록된, 라놀라진에 의한 후기 INa의 차단. A: TTX-감수성 전류는 대조군 용액 중에 (흑색 자취) 및 20 μM 라놀라진 후에 (적색 자취) 나타낸다. B: 2 - 8 개 세포에 대한 농도-반응 곡선의 요약도.
도 15. Ito에 대한 라놀라진의 효과. 전류는 100 ms 단계 동안 -10 (작은 외향 전류), 0, 및 10 mV 로 기록되었다. Ito는 대조군 용액 중에 (좌측, 흑색 자취), 및 50 μM 라놀라진 첨가 4 분 후에 (우측, 적색 자취) 기록되었다.
도 16. 10 μM (9 개 세포), 20 μM (9 개 세포), 50 μM (6 개 세포), 및 100 μM (7 개 세포) 농도에 대한 3 개의 시험 전위에서 Ito로의 라놀라진의 효과에 대한 요약 데이타.
도 17. 정상화 (Normalized) Ito및 라놀라진의 효과. 상기 데이타는 도4 에 나타낸 것과 동일하다.
도 18. 상부 패널은 100 μM 라놀라진 첨가 4 분 후, 및 대조군 용액으로의 복귀 후 (적색 자취) 대조군 용액 중 INa-Ca의 겹쳐진 자취를 나타낸다. 도의 하부 패널은 농도-반응 곡선을 나타낸다.
도 19. 단일도 중 IKr, IKs, ICa, INa,후기, 및 INaCa에 대한 농도-반응 곡선. IKr, IKs, 및 후기 INa는 라놀라진에 대해 유사한 감수성을 나타낸 반면, INaCa및 ICa는 상당히 덜 감수성이었다.
도 20. 푸르키니에 (Purkinje) 섬유 작용 전위에 대한 라놀라진의 효과. A 및 B: 그래프는 BCL 500 (A) 및 2000 (B) msec 에서 작용 전위기 (APD50및 APD90) 에 대한 라놀라진 (1-100 μM) 의 농도-의존적 효과를 도시한다. C 및 D: 기저선 조건 하에, 및 BCL 500 (C) 및 2000 (D) msec 에서 점진적으로 더 높은 농도의 라놀라진 첨가 후 기록된 겹쳐진 막통과 작용 전위 ([K+]0= 4 mM). 데이타는 평균 ±SD 로 나타낸다.*- p < 0.05 vs. 대조군.
도 21. 작용 전위의 업스트로크 상승 속도 (Vmax) 에 대한 라놀라진의 농도-의존적 효과. 라놀라진 (1-100 μM) 의 부재 및 존재 하에 기록된 겹쳐진 작용 전위 (B) 및 대응하는 미분 업스트로크 (dV/dt, A) 를 나타낸다 (BCL = 500 msec). C: Vmax를 감소시키는 라놀라진 효과의 농도-반응 상관관계.
도 22. 낮은 [K+]0의 존재 하에 푸르키니에 섬유 작용 전위에 대한 라놀라진의 효과. A 및 B: 그래프는 BCL 500 (A) 및 2000 (B) msec 에서 작용 전위기 (APD50및 APD90) 에 대한 라놀라진 (1-100 μM) 의 농도-의존적 효과를 도시한다 ([K+]0= 3 mM). 데이타는 평균 ±SD 로 나타낸다.*- p < 0.05 vs. 대조군.
도 23. 푸르키니에 섬유 제조물에서 d-소탈롤-유도 초기 후탈분극 (EAD) 을 억제하는 라놀라진의 효과. IKr차단물 (100 μM d-소탈롤) 의 존재 하에, 이어서 계속되는 d-소탈롤의 존재 하에 단계적으로 증가하는 농도의 라놀라진 (5 및 10 μM) 첨가 후 푸르키니에 섬유 제조물로부터 기록된 겹쳐진 막통과 작용 전위를 나타낸다. 기본 주기 길이 = 8000 msec.
도 24A 및 B. 소탈롤에 대한 전체적 전기물리학적 데이타. 우심실 및 좌심실 ERP (ms) 에 대한 소탈롤의 효과를 나타낸다.
도 25A 및 B. 소탈롤에 대한 전체적 전기물리학적 데이타. QT 및 QRS 간격 (ms) 에 대한 소탈롤의 효과를 나타낸다.
도 26. 라놀라진에 대한 전체적 전기물리학적 데이타. 우심실 및 좌심실 ERP (ms) 에 대한 라놀라진의 효과를 나타낸다.
도 27. 라놀라진에 대한 전체적 전기물리학적 데이타. 평균 ERP-LV 에 대한 라놀라진의 효과를 나타낸다.
도 28. 라놀라진에 대한 전체적 전기물리학적 데이타. QT 간격 (ms) 에 대한 라놀라진의 효과를 나타낸다.
도 29. 라놀라진에 대한 전체적 전기물리학적 데이타. QRS 간격에 대한 라놀라진의 효과를 나타낸다.
도 30. 작용 전위 전압 클램프 기법을 이용하여 기록된, 라놀라진에 의한 후기 INa의 차단. A: TTX-감수성 전류는 대조군 용액 중에 및 20 μM 라놀라진 후에 나타낸다. 20 mV 및 -28 mV 전압에 대응하는 전압인 2 개의 커서에서 측정하였다. 저해는 20 mV 에서 최대였지만, 일부 TTX-감수성 전류는 라놀라진의 존재 하에 -28 mV 에 남아 있었다. TTX-감수성 전류는 또한 라놀라진의 존재 하에 초기 작용 전위에도 남아 있었다.
도 31. 라놀라진에 의한 INa,후기의 차단. 2000 ms BCL. 농도-반응 곡선의 요약도. 오차 막대는 ±s.e.m. 이며, 세포수는 3-11 개 세포이다.
도 32. 라놀라진에 의한 INa,후기의 차단. 300 ms BCL. 농도-반응 곡선의 요약도. 오차 막대는 ±s.e.m. 이며, 세포수는 6-10 개 세포이다.
도 33. 완속 및 급속 자극에서 INa,후기에 대한 라놀라진 효과의 요약 데이타. 오차 막대는 ±s.e.m. 이며, 세포수는 6-12 개 세포이다.
도 34. 근육세포의 작용 전위기에 대한 3, 10, 및 30 μmol/ℓ 라놀라진의 효과.
도 35. 먼저 2 Hz 에서, 이어서 0.5 Hz 에서 박동된 근육세포에 대한 30 μmol/ℓ 라놀라진의 효과.
도 36. 0.5, 1 and 2 Hz 의 박동 빈도에서 3, 10, 및 30 μmol/ℓ 라놀라진의 부재 및 존재 하에 측정된 APD50및 APD90의 비교.
도 37. 다양한 박동 빈도에서 APD50및 APD90을 단축시키는 라놀라진의 효과. 대조군의 백분율로 정상화됨.
도 38. 0.25 Hz 에서 박동된 근육 세포의 작용 전위기에 대한 5 μmol/ℓ 퀴니딘의 효과. 10 μmol/ℓ 라놀라진은 퀴니딘의 효과를 약화시켰다.
도 39. EAD 에 대한 퀴니딘 및/또는 라놀라진의 효과. 10 μmol/ℓ 라놀라진은 퀴니딘에 의해 유도되는 EAD 의 억제에 효과적인 것으로 나타났다.
도 40. 유발 활성에 대한 퀴니딘 및/또는 라놀라진의 효과. 10 μmol/ℓ 라놀라진은 퀴니딘에 의해 유도되는 유발 활성의 억제에 효과적인 것으로 나타났다.
도 41. 기니아픽 심실 근육세포에서 작용 전위기에 대한 1, 3, 10, 및 30 μmol/ℓ 라놀라진 및/또는 ATXII 의 효과.
도 42. 기니아픽 심실 근육세포에서 작용 전위기에 대한 1, 3, 10, 및 30 μmol/ℓ 라놀라진 및/또는 ATXII 의 효과. 1 μmol/ℓ 만큼 낮은 농도의 라놀라진은 ATXII-유도 EAD 및 유발 활성을 효과적으로 제거하였다.
도 43. 기니아픽 심실 근육세포에서 작용 전위기에 대한 1, 3, 10, 및 30 μmol/ℓ 라놀라진 및/또는 ATXII 의 효과. 1 μmol/ℓ 만큼 낮은 농도의 라놀라진은 ATXII-유도 EAD 및 유발 활성을 효과적으로 제거하였다.
도 44. 기니아픽 심실 근육세포에서 작용 전위기에 대한 1, 3, 10, 및 30 μmol/ℓ 라놀라진 및/또는 ATXII 의 효과. 1 μmol/ℓ 만큼 낮은 농도의 라놀라진은 ATXII-유도 EAD 및 유발 활성을 효과적으로 제거하였다.
도 45. 기니아픽 심실 근육세포에서 작용 전위기에 대한 1, 3, 10, 및 30 μmol/ℓ 라놀라진 및/또는 ATXII 의 효과. 1 μmol/ℓ 만큼 낮은 농도의 라놀라진은 ATXII-유도 EAD 및 유발 활성을 효과적으로 제거하였다.
도 46. 기니아픽 심실 근육세포에서 작용 전위기에 대한 1, 3, 10, 및 30 μmol/ℓ 라놀라진 및/또는 ATXII 의 효과. 1 μmol/ℓ 만큼 낮은 농도의 라놀라진은 ATXII-유도 EAD 및 유발 활성을 효과적으로 제거하였다.
도 47. K-H 완충액 관류 기니아픽 단리 심장 모델에서 유도된 EAD 및 MAP 연장에 대한 10 μM 라놀라진 및/또는 ATXII 의 효과. 10 μM 만큼 낮은 농도의 라놀라진은 ATXII-유도 EAD 및 MAP 연장을 감소시키거나 효과적으로 제거하였다.
도 48. VT 에 대한 ATXII 의 효과. ATXII (20 nM) 유도 VT (자발적 VT 및 박동 유도 VT 모두).
도 49. 유도 VT 에 대한 ATXII (20 nM) 및 라놀라진의 효과. 30 μM 농도에서의 라놀라진은 ATXII-유도 VT 를 감소시키거나 효과적으로 제거하였다.
도 50. 유도된 EAD 및 ΔMAP 에 대한 ATXII (20 nM) 및 라놀라진의 효과.
발명의 상세한 설명
본 발명은 부정맥 발생의 치료, 감소 또는 예방 수단을 제공한다.
정상 심장 리듬 (사인형 리듬) 은 여러 심장 세포 상 이온 채널의 고도로 통합된 전기물리학적 행동에 의해 발생하는 작용 전위 (AP) 에 의해 일어난다. 나트륨, 칼슘 및 칼륨 채널은 심장 작용 전위의 모양 및 기간을 결정하는 가장 중요한 채널이다. 간단하게, 나트륨 및 칼슘 채널의 활성화는 개별 심장 세포 내로 양으로 하전된 이온의 유입을 일으켜서 막의 탈분극을 유도한다. 역으로, 칼륨 채널의 개방은 세포 밖으로의 양 전하 흐름을 허용하여, 크게는 작용 전위를 종결시키고 세포를 재분극시킨다 (도 1).
AP 는 박동조율기 (pacemaker) 에서 그들의 시작점에서부터 굴 (sino) 심방 결절을 통해, 심방 근육을 통해, 이어서 심방심실 결절 (AV) 을 통해, 푸르키니에 전도계를 통해, 마지막으로 심실로 전달된다.
심장에서 충격 개시 및 전달의 정상 순서에서의 손상인 부정맥은 원발성 심혈관 질환, 폐 장애, 자율신경 장애, 전신 장애, 약물-관련 부작용, 유전 효과 (유전자의 돌연변이), 또는 전해질 불균형에서 야기될 수 있다.
정상 사인형 리듬 및 부정맥은 심전도 (ECG) 상에서 가시화된다. ECG 는 심장 근육의 흥분에 의해 유도되는 전기 전위 변화의 도식적 추적이며, 신체 표면에서 감지된다. 심전도로부터, 심박, PR 간격 기간, AV 결절의 전도 시간 반영, QRS 기간, 심실에서 전도 시간의 반영, 및 심실 작용 전위기의 측정치인 QT 간격이 측정될 수 있다. 사인형 리듬 중에 생성되는 ECG 의 대표도를 도 2 에 나타낸다.
심실성 빈맥은 증강된 자발성, 후탈분극 및 유발 자발성 및 회귀에 의해 야기된다. 증강된 자발성은 정상적으로 자발적인 이완기 탈분극을 나타내는 세포에서 일어난다. B-아드레날린성 자극, 저칼륨증, 및 심장 근육 세포의 기계적 신장은 4 상 기울기를 증가시켜서 박동조율기 속도를 가속화시키는 반면, 아세틸콜린은 4 상 기울기의 감소 및 과다분극 모두에 의해 박동조율기 속도를 감소시킨다. 충격이 심장의 나머지를 흥분시키는 증강된 정상 또는 비정상 자발성 영역으로부터 전달되는 경우, 부정맥이 일어난다.
후탈분극 및 유발 자발성은 정상 심장 작용 전위가 손상되거나 비정상 탈분극이 뒤따르는 일부 병태생리학적 상태에서 일어난다. 상기 비정상 탈분극이 역치에 도달하는 경우, 이는 다시 이차 업스트로크를 일으켜서, 비정상 리듬을 일으키고 전달시킬 수 있다. 상기 비정상 이차 업스트로크는 초기 정상 또는 "유발" 업스트로크 후에만 일어나므로, 유발 리듬으로 불린다. 유발 리듬의 2 가지 주요한 형태가 인지된다: (1) 세포내 칼슘 과부하 조건 (심근 허혈, 아드레날린성 스트레스 등) 하에 일어날 수 있는 연장된 후분극 (DAD). 상기 후탈분극이 역치에 도달하면, 이차 유발 박동 또는 박동들이 일어날 수 있다; 및 (2) 초기 후탈분극 (EAD) 은 종종 심장 작용 전위가 현저히 연장되는 경우 일어난다. 이것이 일어나는 경우, 3 상 재분극이 EAD 에 의해 방해될 수 있다. 시험관 내의 EAD-매개 유발 및 임상적 부정맥은 내재 심박이 완속이고, 세포외 K+ 이 낮으며, 작용 전위기를 연장시키는 특정 약물이 존재하는 경우 가장 일반적이다. EAD 는 작용 전위의 재분극상 도중 전체 내향 전류의 증가로 얻어진다.
TdP 는 여러 상이한 유형의 약물 치료의 일반적이고 심각한 부작용이며; EAD및 생성 유발에 의해 유도될 수 있다. 그러나, 저칼륨증, 저마그네슘증, 저칼슘증, 고등급 AV 차단, 선천성 장애 및 중증 서맥을 포함하는 TdP 위험성을 측정하는 다른 상태들이 존재한다.
긴 QT 증후군 (LQTS) 은 심장 세포에서 이온 채널로 불리는 단백질 구조의 기능장애로 유도된다. 상기 채널은 칼륨, 나트륨 및 칼슘 분자와 같은 이온의 흐름을 조절한다. 세포 안팎으로의 상기 이온의 흐름은 심장의 전기 활성을 일으킨다. 상기 채널의 비정상성은 획득되거나 유전될 수 있다. 획득된 형태는 보통 처방 약제로 유도된다.
유전된 형태는 전기 재분극을 조절하는 이온 채널 중 하나를 만들거나 "코딩하는" 여러 유전자 중 하나에서 돌연변이가 발생하는 경우 일어난다. 돌연변이체 유전자는 비정상 채널이 형성되게 하며, 상기 비정상 채널이 정상 채널만큼 효율적이지 못하므로, 심장의 전기 회복이 더 오래걸린다. 이는 연장된 QT 간격으로 심전도 (ECG, EKG) 상에 나타낸다. QT 연장은 심장이 다형성 VT 에 취약하게 만들며, 그 중 한 종류는 "토르사드 데 포인트" 로 공지된 빠른 비정상 심장 리듬이다.
선천성 LQTS 는 6 개 유전자 중 하나 이상의 돌연변이로 유도된다:
*신규 돌연변이 KVLQT1 의 동종접합 보인자는 Jervell, Lange-Nielsen 증후군을 갖는다. KVLQT1 및 MinK 는 함께 어셈블리하여 IKs채널을 형성한다.
상기 표에 기재된 LQT 질환 및 이온 채널은 이들이 유전된 LQTS 에 대한 것에서와 같이 획득된 LQTS 에 대해서도 동일하다.
LQTS 의 유전 또는 획득된 형태가 포유류에 존재하고, VT 증상이 나타나는 경우, 화학식 I 의 화합물, 특히 라놀라진의 투여로 VT 의 발생 및/또는 빈도가 감소됨이 주지되어야 한다. LQTS 의 유전 또는 획득된 형태가 존재하지만 VT 증상이 없는 경우, 화학식 I 의 화합물, 특히 라놀라진의 투여로 VT 의 발생이 예방된다.
나트륨 펜토바르비톨은 QT 간격을 연장시키지만, 또한 재분극의 전층 분산을 감소시키는 것으로 공지되어 있다. 이는 IKr, IKs및 가장 현저하게는 INa를 저해하여 상기를 수행한다. 전층 분산 감소는 M 세포에서보다 epi 및 endo 세포에서 더 큰 APD 연장으로 나타난다. 나트륨 펜토바르비톨은 또한 M 세포에서 d-소탈롤-유도 EAD 활성을 억제한다. 따라서, QT 를 연장시키는 그 작용에도 불구하고, 펜토바르비톨은 TdP 를 유도하지 않는다.
아미오다론은 QT 를 연장시키며, 낮은 빈도로 TdP 를 유도하는 것으로 공지되어 있다. 아미오다론은 M 세포에서보다 epi 및 endo 세포에서 더 큰 APD 연장을 나타내어 재분극의 전층 분산을 감소시키는 것으로 나타났다. 아미오다론은 심장에서 나트륨, 칼륨 및 칼슘 채널을 차단한다. 만성적으로 (30-45 일 동안 30-40 mg/kg/1 일, 경구적으로) 투여되는 경우, 또한 IKr차단제인 d-소탈롤이 재분극 또는 EAD 활성의 현저한 분산을 유도하는 능력을 억제한다.
개과 좌심실로부터의 동맥-관류 쐐기 제조물에 있어서, 라놀라진은 우선적으로 심장외 (epc) 세포의 APD90을 연장시키는 것으로 나타났다. 라놀라진이 또한 M 세포의 APD90을 단축시키면서 epi 세포의 APD90은 연장시키기 때문에, 전층 분산의 감소는 더 높은 농도에서 더욱 현저한 것으로 나타났다.
라놀라진이 EAD 를 유도하는지, 및 후기 나트륨 전류 및 칼슘 전류에 대한 라놀라진의 작용이 푸르키니에 섬유에서 d-소탈롤에 의한 EAD 유도를 길항할 수 있는지 여부를 결정하기 위해, 개과 좌심실로부터 단리된 근육세포에 시험을 수행하였다. 라놀라진의 존재 하에서는 EAD 가 관찰되지 않았다. 5 μ몰/ℓ만큼 낮은 농도에서 라놀라진은 d-소탈롤에 의해 유도된 EAD 를 억제할 수 있는 것으로 나타났다.
또한, 라놀라진은 약물의 치료적 농도 (~2 내지 8 μM) 보다 매우 더 높은 농도 (296 μ몰/ℓ) 에서 칼슘 채널을 차단하는 것으로 나타났다.
따라서, 라놀라진은 연장된 QT 간격을 나타내지만, EAD 또는 TdP 를 유도하지 않는다.
라놀라진이 연장된 QT 간격을 유도할 수 있으므로, 라놀라진은 심실 근육세포의 APD 기간을 증가시킬 수 있다. 표면 EKG 의 QT 간격은 심실 재분극 기간을 반영한다.
라놀라진은 기니아픽 근육세포의 APD 를 감소시키는 것으로 나타났다 (세척 시 가역적임). 또한 라놀라진은 퀴니딘의 존재 하에 APD 를 감소시키는 것으로 나타났다. 퀴니딘은 EAD 및 TdP 를 유발하는 것으로 공지되어 있다. 라놀라진은 퀴니딘에 의해 유도된 EAD 및 다른 유발 활성을 억제하는 것으로 나타났다.
ATXII (말미잘 독소) 는 나트륨 채널의 개방 상태의 불활성화를 느리게하며, EAD 를 유발하고, QT 간격을 연장시키며, M 세포에서 더 긴 APD 의 연장 결과 재분극의 전층 분산에 있어서 가파른 상승을 유발한다. 데이타는 라놀라진이 ATXII 의 존재 하에 APD 의 감소를 유도함을 나타낸다. 따라서, 라놀라진은 ATXII 에 의해 유도되는 EAD 를 억제한다. ATXII 는 LTQ3 증후군 (TdP 를 일으킴) 을 모방하는 나트륨 이온 활성화제이다. 따라서, 라놀라진은 TdP 를 일으키지 않고, 대신 ATX 에 의해 유도되는 TdP 를 억제한다.
정의
본 명세서에서 사용되는 하기 단어 및 어구는 일반적으로 이들이 사용되는 문맥의 범위에 대해 달리 명시되지 않는 한, 하기에 나타내는 의미를 갖는 것으로 이해된다.
"아미노카르보닐메틸" 은 하기 구조를 갖는 기를 나타낸다:
(식 중, A 는 부착점을 나타낸다).
"할로" 또는 "할로겐" 은 플루오로, 클로로, 브로모 또는 요오도를 나타낸다.
"저급 아실" 은 하기 구조를 갖는 기를 나타낸다:
(식 중, R 은 본원에 정의된 바와 같은 저급 알킬이며, A 는 부착점을 나타내고, 아세틸, 프로파노일, n-부타노일 등과 같은 기가 포함된다).
"저급 알킬" 은 1-4 탄소수의 비분지형 포화 탄화수소쇄, 예컨대 메틸, 에틸, n-프로필, 및 n-부틸을 나타낸다.
"저급 알콕시" 는 --OR 기를 나타낸다 (식 중, R 은 본원에 정의된 바와 같은 저급 알킬이다).
"저급 알킬티오" 는 --SR 기를 나타낸다 (식 중, R 은 본원에 정의된 바와 같은 저급 알킬이다).
"저급 알킬술피닐" 은 하기 화학식의 기를 나타낸다:
(식 중, R 은 본원에 정의된 바와 같은 저급 알킬이며, A 는 부착점을 나타낸다).
"저급 알킬 술포닐" 은 하기 화학식의 기를 나타낸다:
(식 중, R 은 본원에 정의된 바와 같은 저급 알킬이며, A 는 부착점을 나타낸다).
"N-임의 치환 알킬아미도" 는 하기 구조를 갖는 기를 나타낸다:
(식 중, R 은 독립적으로 수소 또는 저급 알킬이며, R' 은 본원에 정의된 바와 같은 저급 알킬이고, A 는 부착점을 나타낸다).
용어 "약물" 또는 "약물들" 은 처방 약제 뿐만 아니라 일반판매 (over-the-counter) 약제 및 모든 약리 제제를 나타낸다.
"이성질체" 는 동일한 원자량 및 원자수를 갖지만 하나 이상의 물리적 또는 화학적 특성이 상이한 화합물을 나타낸다. 화학식 I 의 화합물의 모든 이성질체는 본 발명의 범위 내에 속한다.
"임의의" 또는 "임의로" 는 이어서 기술되는 사건 또는 상황이 일어날 수도 일어나지 않을 수도 있음을 의미하며, 상기 표현에는 상기 사건 또는 상황이 일어나는 경우 및 그렇지 않은 경우가 포함된다.
용어 "치료적 유효량" 은 치료를 필요로 하는 포유류에 투여되는 경우, 하기에 정의된 바와 같이 치료에 효과를 나타내기 충분한 화학식 I 의 화합물의 양을 나타낸다. 치료적 유효량은 치료받는 대상체 및 질환 상태, 대상체의 체중 및 연령, 질환 상태의 중증도, 투여 방식 등에 따라 변할 것이며, 이는 당업자가 쉽게 결정할 수 있다.
용어 "치료" 또는 "치료함" 은 하기를 포함하는, 포유류에서 질환의 임의 치료를 의미한다:
(i) 질환의 예방, 즉, 질환의 임상 증상이 발생하지 않게 함;
(ii) 질환의 억제, 즉, 임상 증상의 발생을 정지시킴; 및/또는
(iii) 질환의 완화, 즉, 임상 증상의 퇴화를 유도함.
부정맥은 임의의 비정상 심박을 나타낸다. 서맥은 비정상적으로 느린 심박을 나타내는 반면, 빈맥은 비정상적으로 빠른 심박을 나타낸다. 본원에서 사용되는 부정맥의 치료에는 상부 심실성 빈맥, 예컨대 심방 세동, 심방 조동, AV 결절의 재진입 빈맥, 심방 빈맥, 및 특발성 심실성 빈맥을 포함하는 심실성 빈맥 (VT), 심실 세동, 전흥분 증후군, 및 토르사드 데 포인트 (TdP) 가 포함되는 것이다,
사인형 리듬은 정상 심박을 나타낸다.
용어 "심장 약화 포유류" 는 심장병태학적 질환 상태, 예를 들어 협심증, 울혈성 심부전, 허혈 등을 갖는 포유류를 의미한다.
여러 경우에 있어서, 본 발명의 화합물은 아미노 및/또는 카르복실기 또는이와 유사한 기의 존재로 인해 산 및/또는 염기 염을 형성할 수 있다. 용어 "약학적으로 허용가능한 염" 은 화학식 I 의 화합물의 생물학적 유효성 및 특성을 보유하며 생리학적으로 또는 달리 바람직한 염을 나타낸다. 약학적으로 허용가능한 염기 부가 염은 무기 및 유기 염기로부터 제조될 수 있다. 무기 염기로부터 유래되는 염에는 예로서, 나트륨, 칼륨, 리튬, 암모늄, 칼슘 및 마그네슘 염이 포함된다. 유기 염기로부터 유래되는 염에는 일차, 이차 및 삼차 아민의 염, 예컨대 알킬 아민, 디알킬 아민, 트리알킬 아민, 치환 알킬 아민, 디(치환 알킬) 아민, 트리(치환 알킬) 아민, 알케닐 아민, 디알케닐 아민, 트리알케닐 아민, 치환 알케닐 아민, 디(치환 알케닐) 아민, 트리(치환 알케닐) 아민, 시클로알킬 아민, 디(시클로알킬) 아민, 트리(시클로알킬) 아민, 치환 시클로알킬 아민, 디치환 시클로알킬 아민, 트리치환 시클로알킬 아민, 시클로알케닐 아민, 디(시클로알케닐) 아민, 트리(시클로알케닐) 아민, 치환 시클로알케닐 아민, 디치환 시클로알케닐 아민, 트리치환 시클로알케닐 아민, 아릴 아민, 디아릴 아민, 트리아릴 아민, 헤테로아릴 아민, 디헤테로아릴 아민, 트리헤테로아릴 아민, 헤테로시클릭 아민, 디헤테로시클릭 아민, 트리헤테로시클릭 아민, 혼합 디- 및 트리-아민 (여기서, 아민 상 치환기의 2 개 이상은 상이하며, 알킬, 치환 알킬, 알케닐, 치환 알케닐, 시클로알킬, 치환 시클로알킬, 시클로알케닐, 치환 시클로알케닐, 아릴, 헤테로아릴, 헤테로시클릭으로 이루어진 군으로부터 선택된다) 등이 포함되지만 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 2 개 또는 3 개의 치환기가 아미노 질소와 함께 헤테로시클릭 또는 헤테로아릴기를 형성하는 아민이 포함된다.
적합한 아민의 구체예에는 예로서, 이소프로필아민, 트리메틸 아민, 디에틸 아민, 트리(이소-프로필) 아민, 트리(n-프로필) 아민, 에탄올아민, 2-디메틸아미노에탄올, 트로메타민, 라이신, 아르기닌, 히스티딘, 카페인, 프로카인, 히드라바민, 콜린, 베타인, 에틸렌디아민, 글루코사민, N-알킬글루카민, 테오브로민, 퓨린, 피페라진, 피페리딘, 모르폴린, N-에틸피페리딘 등이 포함된다.
약학적으로 허용가능한 산 부가 염은 무기 및 유기 산으로부터 제조될 수 있다. 무기 산으로부터 유래되는 염에는 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산 등이 포함된다. 유기 산으로부터 유래되는 염에는 아세트산, 프로피온산, 글리콜산, 피루브산, 옥살산, 말산, 말론산, 숙신산, 말레산, 푸마르산, 타르타르산, 시트르산, 벤조산, 신남산, 만델산, 메탄술폰산, 에탄술폰산, p-톨루엔-술폰산, 살리실산 등이 포함된다.
본원에서 사용되는 "약학적으로 허용가능한 담체" 에는 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항균제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제 등이 포함된다. 약학 활성 물질을 위한 상기 매질 및 제제의 사용은 당분야에 널리 공지되어 있다. 현재까지 활성 성분과 비상용성인 임의 종래 매질 또는 제제를 제외하고, 치료 조성물에서의 그 사용이 포함된다. 보조 활성 성분이 또한 조성물 내에 도입될 수 있다.
약학 조성물 및 투여
본 발명의 화합물은 통상 약학 조성물의 형태로 투여된다. 따라서 본 발명은 활성 성분으로서 하나 이상의 본 발명의 화합물, 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염 또는 에스테르, 및 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제; 불활성 고체 희석제 및 충전제를 포함하는 담체; 멸균 수용액 및 다양한 유기 용매를 포함하는 희석제; 투과 증강제; 가용화제; 및 아쥬번트를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 본 발명의 화합물은 단독으로 또는 다른 치료제와 조합되어 투여될 수 있다. 상기 조성물은 약학 분야에 널리 공지된 방식으로 제조된다 (예컨대, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mace Publishing Co., Philadelphia, PA 17판 (1985), 및 "Modern Pharmaceutics", Marcel Dekker, Inc. 3 판 (G.S. Banker & C.T. Rhodes 편저) 참고).
본 발명의 화합물은, 예를 들어 참고문헌으로 도입되는 특허 및 특허 출원에 기재된 바와 같이 직장, 구강, 비강내 및 경피 경로, 동맥내 주사, 정맥내, 복강내, 비경구, 근육내, 피하, 구강, 국소에 의해, 흡입제로서, 또는 예를 들어 스텐트 또는 동맥 삽입 관형 중합체와 같은 코팅 또는 함침 장치를 통하는 것을 포함하는, 유사한 용도를 갖는 제제 투여의 임의의 허용된 방식에 의해 단일 또는 다중 용량으로 투여될 수 있다.
하나의 바람직한 투여 방식은 비경구, 특히 주사에 의한 것이다. 본 발명의 신규 조성물이 주사제로 투여하기 위해 도입될 수 있는 형태에는 수성 또는 오일 현탁액, 또는 참기름, 옥수수유, 면실유, 또는 땅콩 오일과의 에멀젼 뿐만 아니라 엘릭서, 만니톨, 덱스트로오스, 또는 멸균 수용액, 및 유사한 약학 비히클이 포함된다. 염수 수용액도 또한 주사제를 위해 통상 사용되지만, 본 발명의 범위에서는 덜 바람직하다. 에탄올, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜 등 (및 적합한 이들의 혼합물), 시클로덱스트린 유도체, 및 식물성 오일도 또한 사용될 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어 레시틴과 같은 코팅의 사용, 분산액의 경우 목적 입자 크기의 유지, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 예방은 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등에 의해 얻어질 수 있다.
멸균 주사 용액은 목적량의 본 발명의 화합물을 적절한 용매 중에, 필요하다면 상술된 다양한 다른 성분과 함께 도입한 후 여과 멸균화하여 제조된다. 일반적으로, 분산액은 기본 분산액 매질 및 상술된 것으로부터 필요한 다른 성분을 포함하는 멸균 비히클 내로 다양한 멸균 활성 성분을 도입하여 제조된다. 멸균 주사 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 미리 멸균 여과된 이들의 용액으로부터 임의의 부가적 목적 성분과 함께 활성 성분의 분말을 얻게하는 진공-건조 및 동결-건조 기법이다.
경구 투여는 화학식 I 의 화합물의 또다른 투여 경로이다. 투여는 캡슐 또는 장용성 코팅정 등에 의할 수 있다. 하나 이상의 화학식 I 의 화합물을 포함하는 약학 조성물의 제조에 있어서, 활성 성분은 통상 부형제에 의해 희석되고/되거나 캡슐, 봉지 (sachet), 종이 또는 다른 용기의 형태일 수 있는 상기 담체 내에 봉입된다. 부형제가 희석제로 작용하는 경우, 이는 비히클, 담체 또는 활성 성분용 매질로서 작용하는 고체, 반고체, 또는 액체 물질 (상기와 같음) 일 수 있다. 따라서, 조성물은 정제, 알약, 분말, 마름모꼴 정제, 봉지, 교갑, 엘릭서, 현탁액, 에멀젼, 용액, 시럽, 에어로졸 (고체로서 또는 액체 매질 중에), 예를 들어 10 중량% 이하의 활성 화합물을 포함하는 연고, 연질 및 경질 젤라틴 캡슐, 멸균 주사 용액, 및 멸균 포장 분말의 형태일 수 있다.
적합한 부형제의 일부 예에는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 트래거캔쓰, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 멸균수, 시럽, 및 메틸 셀룰로오스가 포함된다. 제형물에는 부가적으로 하기가 포함될 수 있다: 윤활제, 예컨대 활석, 스테아르산마그네슘, 및 미네랄 오일; 습윤제; 유화 및 현탁제; 방부제, 예컨대 메틸- 및 프로필히드록시-벤조에이트; 감미제; 및 조미제.
본 발명의 조성물은 당분야에 공지된 절차를 이용하여 환자에게 투여 후 활성 성분의 신속, 서방, 지연 방출 또는 상기 방출 수단의 임의 조합을 제공하기 위해 제형화될 수 있다. 경구 투여용 조절 방출 약물 전달계에는 삼투 펌프 시스템 및 중합체-코팅 저장소 또는 약물-중합체 매트릭스 제형을 포함하는 분산/용해 시스템이 포함된다. 조절 방출 시스템의 예는 그 전문이 본원에 참고문헌으로 도입되는 U.S. 특허 3,845,770; 4,326,525; 4,902,514; 및 5,616,345 및 WO 0013687 에 주어진다. 본 발명의 방법에 사용하기 위한 또다른 제형에는 경피 전달 장치 ("패치") 가 이용된다. 상기 경피 패치는 조절되는 양의 본 발명의 화합물의 연속 또는 불연속 주입을 제공하기 위해 이용될 수 있다. 약학 제제의 전달을 위한 경피 패치의 구축 및 이용은 당분야에 널리 공지되어 있다. 예컨대 그 전문이 본원에 참고문헌으로 도입된 U.S. 특허 5,023,252, 4,992,445 및 5,001,139 을 참조한다. 상기 패치는 약학 제제의 연속적, 간헐적 또는 요구시 전달을 위해 구축될 수 있다.
조성물은 바람직하게는 단위 투여형으로 제형화된다. 용어 "단위 투여형" 은 인간 대상체 및 다른 포유류를 위한 단위 투여로서 적합한 물리적 개별 단위를 나타내며, 각각의 단위는 적합한 약학 부형제 (예컨대 정제, 캡슐, 앰플) 와 연합하여 목적하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 소정량의 활성 물질을 포함한다. 화학식 I 의 화합물은 넓은 투여 범위에 걸쳐 유효하며, 일반적으로 약학적 유효량으로 투여된다. 바람직하게는, 경구 투여를 위해서는, 각각의 투여 단위는 10 mg 내지 2 g, 보다 바람직하게는 10 내지 700 mg 의 화학식 I 의 화합물을 포함하며, 비경구 투여를 위해서는, 바람직하게는 10 내지 700 mg, 보다 바람직하게는 약 50 내지 약 200 mg 의 화학식 I 의 화합물을 포함한다. 그러나, 실제로 투여되는 화학식 I 의 화합물의 양은 치료될 상태, 선택된 투여 경로, 투여되는 실제 화합물 및 그 상대 활성, 개별 환자의 연령, 체중 및 반응, 환자 증상의 중증도 등을 포함하는 대응 상황의 견지에서 의사에 의해 결정될 것임이 이해될 것이다.
고체 조성물, 예컨대 정제의 제조를 위해, 주요 활성 성분이 약학 부형제와 혼합되어 본 발명의 화합물의 균일한 혼합물을 포함하는 고체 예비제형 조성물을 형성한다. 상기 예비제형 조성물을 균일한 것으로 칭하는 경우, 이는 활성 성분이 조성물에 걸쳐 균일하게 분산되어 조성물이 동일하게 유효한 단위 투여형, 예컨대 정제, 알약 및 캡슐로 쉽게 분할될 수 있음을 의미한다.
본 발명의 정제 또는 알약은 코팅되거나 다르게는 배합되어, 연장된 작용의장점을 나타내는 투여형을 제공하거나 위의 산 조건으로부터 보호될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 알약은 내부 투여 및 외부 투여 성분을 포함할 수 있으며, 후자는 전자에 걸친 외피의 형태이다. 2 개 성분은 위에서의 붕해에 저항하며 내부 성분이 손상되지 않고 십이지장으로 통과되게 하거나 방출을 연장시키는 장용층에 의해 분리될 수 있다. 여러 중합체성 산, 및 중합체성 산과 셀락, 세틸 알콜 및 셀룰로오스 아세테이트와 같은 물질의 혼합물을 포함하는 다양한 물질이 상기 장용층 또는 코팅을 위해 사용될 수 있다.
하나의 구현예에 있어서, 본 발명의 바람직한 조성물은 환자에게 투여 후 활성 성분의 신속, 서방 또는 지연 방출을 제공하기 위해, 특히 서방성 제형으로 제형화된다. 본 발명의 가장 바람직한 화합물은 그 이름이 (±)-N-(2,6-디메틸-페닐)-4-[2-히드록시-3-(2-메톡시페녹시)프로필]-1-피페라진-아세트아미드인 라놀라진이다. 달리 언급되지 않는다면, 명세서 및 실시예에서 사용되는 라놀라진 혈장 농도는 라놀라진 자유 염기를 나타낸다.
흡입 또는 취입용 조성물에는 약학적으로 허용가능한 수성 또는 유기 용매 중의 용액 및 현탁액 또는 이들의 혼합물, 및 분말이 포함된다. 액체 또는 고체 조성물은 상술된 바와 같이 적합한 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함할 수 있다. 바람직하게는 조성물은 국소 또는 전신 효과를 위해 경구 또는 비강 호흡 경로로 투여된다. 바람직하게는 약학적으로 허용가능한 용매 중의 조성물은 불활성 기체를 사용하여 분무될 수 있다. 분무 용액은 분무화 장치로부터 직접 흡입될 수 있고, 또는 분무화 장치가 얼굴 마스크 텐트 또는 간헐적 포지티브압 호흡기에 부착될 수 있다. 용액, 현탁액, 또는 분말 조성물은 적절한 방식으로 제형물을 전달하는 장치로부터 바람직하게는 구강 또는 비강으로 투여될 수 있다.
라놀라진의 정맥내 제형은 하기와 같은 무균 충전 공정을 통해 제조된다. 적합한 용기 내에, 필요량의 덱스트로오스 1 수화물을 대략 최종 배치 중량의 78% 로 주사용수 (WFI) 중에 용해시킨다. 연속 교반하면서, 필요량의 라놀라진 자유 염기를 덱스트로오스 용액에 첨가한다. 라놀라진의 용해를 촉진하기 위해, 용액 pH 를 0.1N 또는 1N 염산 용액으로 표적 3.88-3.92 로 조정한다. 부가적으로, 0.1N HCl 또는 1.0N NaOH 를 사용하여 표적 pH 3.88-3.92 로 최종 조정할 수 있다. 라놀라진이 용해된 후, 배치를 WFI 로 최종 중량으로 조정한다. 공정 중 조건이 충족됨이 확인되면, 라놀라진 벌크 용액을 2 개의 0.2 ㎛ 멸균 필터를 통한 멸균 여과로 멸균화시킨다. 이어서, 멸균 라놀라진 벌크 용액을 멸균 유리 바이알 내로 무균적으로 충전하고, 멸균 마개로 무균적으로 마개를 덮는다. 이어서 마개가 덮인 바이알을 깨끗한 플립-탑 알루미늄 밀봉으로 봉한다.
본 발명의 화합물은 본 개시의 견지에서 당업자에게 공지된 절차를 이용하여, 예를 들어 분산에 의해 스텐트 내로 함침되거나, 예를 들어 스텐트 상에, 예컨대 겔 형태로 코팅될 수 있다.
라놀라진의 정맥내 제형은 하기와 같은 무균 충전 공정을 통해 제조된다. 적합한 용기 내에, 필요량의 덱스트로오스 1 수화물을 대략 최종 배치 중량의 78% 로 주사용수 (WFI) 중에 용해시킨다. 연속 교반하면서, 필요량의 라놀라진 자유 염기를 덱스트로오스 용액에 첨가한다. 라놀라진의 용해를 촉진하기 위해,용액 pH 를 0.1N 또는 1N 염산 용액으로 표적 3.88-3.92 로 조정한다. 부가적으로, 0.1N HCl 또는 1.0N NaOH 를 사용하여 표적 pH 3.88-3.92 로 최종 조정할 수 있다. 라놀라진이 용해된 후, 배치를 WFI 로 최종 중량으로 조정한다. 공정 중 조건이 충족됨이 확인되면, 라놀라진 벌크 용액을 2 개의 0.2 ㎛ 멸균 필터를 통한 멸균 여과로 멸균화시킨다. 이어서, 멸균 라놀라진 벌크 용액을 멸균 유리 바이알 내로 무균적으로 충전하고, 멸균 마개로 무균적으로 마개를 덮는다. 이어서 마개가 덮인 바이알을 깨끗한 플립-탑 알루미늄 밀봉으로 봉한다.
본 발명의 바람직한 서방성 제형은 바람직하게는 위 내 (전형적으로 대략 2) 및 장 내 (전형적으로 대략 5.5) 의 pH 범위에 걸쳐 수성 매질 중에서 용해 속도를 조절하는 부분 중성화 pH-의존성 결합제 및 화합물의 밀접한 혼합물을 포함하는 압축 정제의 형태이다.
화합물의 서방성을 제공하기 위해, 제형물이 위 및 위장관을 통해 통과함에 따라 제형물이 약물을 천천히 및 연속적으로 방출하도록 화합물의 용해 프로필을 조절하기 위해 하나 이상의 pH-의존성 결합제가 선택될 수 있다. pH-의존성 결합제(들)의 용해 조절능은 서방성 제형물에 있어서 특히 중요한데, 이는 1 일 2 회 투여를 위해 충분한 화합물을 포함하는 서방성 제형은 화합물이 너무 급속히 방출되는 경우 ("용량-덤핑 (dumping)") 원치않는 부작용을 유도할 수 있기 때문이다.
따라서, 본 발명에 사용하기 적합한 pH-의존성 결합제는 그 위 내 체류 동안 (여기서, pH 는 약 4.5 미만이다) 정제로부터 약물의 급속 방출을 저해하고, 하부 위장관에서 (여기서, pH 는 일반적으로 약 4.5 초과이다) 투여형으로부터 치료량의화합물 방출을 촉진하는 것들이다. "장용성" 결합체 및 코팅제로 약학 분야에 공지된 여러 물질이 목적하는 pH 용해 특성을 갖는다. 이들에는 프탈산 유도체, 예컨대 비닐 중합체 및 공중합체의 프탈산 유도체, 히드록시알킬셀룰로오스, 알킬셀룰로오스, 셀룰로오스 아세테이트, 히드록시알킬셀룰로오스 아세테이트, 셀룰로오스 에테르, 알킬셀룰로오스 아세테이트, 및 이들의 부분 에스테르, 및 저급 알킬 아크릴산 및 저급 알킬 아크릴레이트의 중합체 및 공중합체, 및 이들의 부분 에스테르가 포함된다.
서방성 제형을 제조하기 위해 본 발명의 화합물과 함께 사용될 수 있는 바람직한 pH-의존성 결합제 물질은 메타크릴산 공중합체이다. 메타크릴산 공중합체는 중성 아크릴레이트 또는 메타크릴레이트 에스테르, 예컨대 에틸 아크릴레이트 또는 메틸 메타크릴레이트와 메타크릴산의 공중합체이다. 가장 바람직한 공중합체는 메타크릴산 공중합체, C 형, USP 이다 (이는 46.0% 내지 50.6% 메타크릴산 단위를 갖는 에틸 아크릴레이트 및 메타크릴산의 공중합체이다). 상기 공중합체는 EudragitL 100-55 (분말) 또는 L30D-55 (수중 30% 분산액) 로 Roehm Pharma 에서 시판된다. 서방성 제형 투여형에서 단독으로 또는 조합되어 사용될 수 있는 다른 pH-의존성 결합제 물질에는 히드록시프로필 셀룰로오스 프탈레이트, 히드록시프로필 메틸셀룰로오스 프탈레이트, 셀룰로오스 아세테이트 프탈레이트, 폴리비닐아세테이트 프탈레이트, 폴리비닐피롤리돈 프탈레이트 등이 포함된다. 하나 이상의 pH-의존성 결합제는 본 발명의 투여형 중에 약 1 내지 약 20 wt%, 보다 바람직하게는 약 5 내지 약 12 wt% 범위, 가장 바람직하게는 약 10 wt% 의 양으로 존재한다.
하나 이상의 pH-비의존성 결합제가 경구 투여형인 서방성 제형 중에 사용될 수 있다. pH-의존성 결합제 및 점도 증강제, 예컨대 히드록시프로필 메틸셀룰로오스, 히드록시프로필 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 중성 폴리(메트)아크릴레이트 에스테르 등은 이들 자체가 확인된 pH-의존성 결합제에 의해 제공되는 필요한 용해 조절을 제공하지 않음이 주지된다. pH-비의존성 결합제는 본 발명의 제형 중에 약 1 내지 약 10 wt% 범위의 양으로, 바람직하게는 약 1 내지 약 3 wt% 범위의 양으로, 가장 바람직하게는 약 2.0 wt% 로 존재한다.
표 1 에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 바람직한 화합물은 약 6.5 를 초과하는 pH 를 갖는 수용액 중에서는 비교적 불용성이지만, 약 pH 6 미만에서는 용해도가 현저히 증가하기 시작한다. 하기 실시예에 있어서, pH 6 을 초과하는 용액 또는 수중 라놀라진의 용액은 라놀라진 디히드로클로라이드로 제조된다. 하기 실시예의 논의 부분에서, 실험 결과로 나타나는 라놀라진의 농도는 라놀라진 자유 염기로 계산된다.
제형 중 pH-의존성 결합제 함량의 증가는 위에서 발견되는 전형적인 pH 4.5 미만의 pH 에서 제형으로부터 서방형 화합물의 방출 속도를 감소시킨다. 결합제에 의해 형성되는 장용성 코팅은 덜 가용성이며, 화합물의 용해도가 더 낮은 pH 4.5 초과에서 상대적 방출 속도를 증가시킨다. pH-의존성 결합제의 적절한 선택으로 pH 4.5 초과에서 제형으로부터 화합물의 더 빠른 방출 속도가 얻어지는 반면, 낮은 pH 에서는 방출 속도에 크게 영향을 미친다. 결합제의 부분적 중성화는 결합제의 개별 과립 주위에 형성되는 라텍스 유사 필름으로의 전환을 촉진한다. 따라서, pH-의존성 결합제의 유형 및 양과 부분 중성화 조성물의 양은 제형으로부터 화합물의 용해 속도를 면밀히 조절하기 위해 선택된다.
본 발명의 투여형은 서방성 제형물로부터 화합물의 방출 속도가 낮은 pH (약4.5 미만) 에서는 용해 속도가 상당히 느려지도록 조절되기 충분한 양의 pH-의존성 결합제를 가져야 한다. 메타크릴산 공중합체, C 형, USP (EudragitL 100-55) 의 경우, pH-의존성 결합제의 적합한 양은 5% 내지 15% 이다. pH 의존성 결합제는 전형적으로 약 1 내지 약 20% 의 중화된 결합제 메타크릴산 카르복실기를 가질 것이다. 그러나, 중합 정도가 약 3 내지 6% 범위인 것이 바람직하다. 서방성 제형은 또한 화합물 및 pH-의존성 결합제와 밀접하게 혼합된 약학 부형제를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 부형제에는, 예를 들어 pH-비의존성 결합제 또는 필름 형성제, 예컨대 히드록시프로필 메틸셀룰로오스, 히드록시프로필 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 중성 폴리(메트)아크릴레이트 에스테르 (예컨대 Roehm Pharma 에서 상표명 EudragitNE 로 시판되는 메틸 메타크릴레이트/에틸 아크릴레이트 공중합체), 전분, 젤라틴, 당 카르복시메틸 셀룰로오스 등이 포함될 수 있다. 다른 유용한 약학 부형제에는 희석제, 예컨대 락토오스, 만니톨, 건조 전분, 미세결정성 셀룰로오스 등; 표면 활성제, 예컨대 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르, 소르비탄 에스테르 등; 및 착색제 및 조미제가 포함된다. 윤활제 (예컨대 활석 및 스테아르산마그네슘) 및 기타 정제화 보조제가 또한 임의로 존재한다.
본 발명의 서방성 제형은 바람직하게는 약 50 중량% 내지 약 95 중량% 이상, 보다 바람직하게는 약 70% 내지 약 90 중량%, 가장 바람직하게는 약 70 내지 약 80 중량% 함량의 화합물; 5% 내지 40%, 바람직하게는 5% 내지 25%, 보다 바람직하게는 5% 내지 15% 함량의 pH-의존성 결합제; 나머지로 pH-비의존성 결합제, 충전제, 및다른 임의 부형제를 포함하는 투여형을 갖는다. 본 발명의 일부 바람직한 서방성 제형을 하기 표 2 에 나타낸다.
성분 중량 범위 (%) 바람직한 중량 범위 (%) 가장 바람직한 중량 범위 (%)
활성 성분 0-95 70-90 75
미세결정성 셀룰로오스 (충전제) 1-35 5-15 10.6
메타크릴산 공중합체 1-35 5-12.5 10.0
수산화나트륨 0.1-1.0 0.2-0.6 0.4
히드록시프로필 메틸셀룰로오스 0.5-5.0 1-3 2.0
스테아르산마그네슘 0.5-5.0 1-3 2.0
본 발명의 서방성 제형은 하기와 같이 제조된다: 화합물 및 pH-의존성 결합제 및 임의 선택적 부형제가 밀접하게 혼합된다 (건조-배합된다). 이어서 건조-배합된 혼합물을 배합된 분말 내로 스프레이되는 강염기 수용액의 존재 하에 과립화시킨다. 과립물을 건조, 체질, 임의의 윤활제 (예컨대 활석 또는 스테아르산마그네슘) 와 혼합하여, 정제로 압축한다. 강염기의 바람직한 수용액은 알칼리 금속 수산화물, 예컨대 수산화나트륨 또는 수산화칼륨 용액, 바람직하게는 수중 수산화나트륨이다 (임의로 25% 이하의 수-혼화성 용매, 예컨대 저급 알콜을 포함함).
생성 정제는 식별, 향미-차폐 목적 및 삼키기의 용이성을 개선시키기 위해 임의의 필름 형성제로 코팅될 수 있다. 필름 형성제는 전형적으로 정제 중량의 2% 내지 4% 범위의 양으로 존재할 것이다. 적합한 필름-형성제는 당분야에 널리 공지되어 있으며, 히드록시프로필, 메틸셀룰로오스, 양이온성 메타크릴레이트 공중합체 (디메틸아미노에틸 메타크릴레이트/메틸-부틸 메타크릴레이트 공중합체 - EudragitE-Roehm. Pharma) 등이 포함된다. 상기 필름-형성제는 임의로 착색제, 가소제 및 기타 보충 성분을 포함할 수 있다.
압축 정제는 바람직하게는 8 Kp 압축을 견디기 충분한 경도를 갖는다. 정제 크기는 정제 중 화합물의 양에 우선적으로 의존할 것이다. 정제는 300 내지 1100 mg 의 화합물 자유 염기를 포함할 것이다. 바람직하게는, 정제는 400-600 mg, 650-850 mg, 및 900-1100 mg 범위인 양의 화합물 자유 염기를 포함할 것이다.
용해 속도에 영향을 미치기 위해, 화합물 함유 분말이 습식 혼합되는 시간이 조절된다. 바람직하게는 총 분말 혼합 시간, 즉 분말이 수산화나트륨 용액에 노출되는 시간은 1 내지 10 분, 바람직하게는 2 내지 5 분 범위일 것이다. 과립화 후, 입자를 제립기로부터 제거하여 약 60℃ 에서 건조를 위해 유동층 건조기 중에 놓는다.
상기 방법으로, 화합물이 약학적으로 보다 통상적인 디히드로클로라이드 염 또는 또다른 염 또는 에스테르로서 보다 그 자유 염기로서 사용되는 경우, 낮은 피크 혈장 수준을, 그렇지만 투여 후 12 시간 이상까지 유효한 화합물의 혈장 농도를 제공하는 서방성 제형이 제조되는 것이 발견되었다. 자유 염기의 사용은 하나 이상의 하기 장점을 제공한다: 자유 염기의 분자량은 디히드로클로라이드에 비해 단지 85% 이므로, 정제 중 화합물의 비율이 증가될 수 있다. 상기 방식으로, 유효량의 화합물 전달이 달성되면서 투여 단위의 물리적 크기가 제한된다.
유용성 및 평가
본 발명의 방법은 동시적인 IKr, IKs및 후기 INa채널의 저해에 반응하는 상태의 치료에 효과적이다. 상기 상태에는 특발성 심실성 빈맥으로 예시되는 VT, 심실 세동, 전흥분 증후군, 및 토르사드 데 포인트가 포함된다.
활성 평가는 하기 실시예에 기재된 바와 같이, 및 당업자에게 자명한 방법에 의해 수행된다.
후술되는 실시예는 본 발명을 예시하기 위해 제공된다. 실시예는 본 발명의 범위를 제한하려는 것이 아니며, 단지 어떻게 본 발명의 화합물을 제조 및 이용하는지를 보이기 위해 제공된다. 실시예에서, 모든 온도는 섭씨이다.
하기 실시예는 화학식 I 의 화합물을 포함하는 대표적 약학 제형의 제조를 예시한다.
실시예 1
하기 성분을 포함하는 경질 젤라틴 캡슐을 제조하였다:
양
성분 (mg/캡슐)
활성 성분 30.0
전분 305.0
스테아르산마그네슘 5.0
상기 성분을 혼합하여 경질 젤라틴 캡슐 내로 충전하였다.
실시예 2
하기 성분을 포함하는 정제 포뮬라를 제조하였다:
성분 (mg/정제)
활성 성분 25.0
셀룰로오스, 미세결정성 200.0
콜로이드성 이산화규소 10.0
스테아르산 5.0
성분을 배합 및 압축하여 정제를 형성하였다.
실시예 3
하기 성분을 포함하는 건조 분말 흡입기 제형을 제조하였다:
성분 중량%
활성 성분 5
락토오스 95
활성 성분을 락토오스와 혼합하고, 혼합물을 건조 분말 흡입 장치에 첨가하였다.
실시예 4
각각 30 mg 의 활성 성분을 포함하는 정제를 하기와 같이 제조하였다:
양
성분 (mg/정제)
활성 성분 30.0 mg
전분 45.0 mg
미세결정성 셀룰로오스 35.0 mg
폴리비닐피롤리돈 (멸균수 중 10% 용액) 4.0 mg
나트륨 카르복시메틸 전분 4.5 mg
스테아르산마그네슘 0.5 mg
활석1.0 mg
전체 120 mg
활성 성분, 전분 및 셀룰로오스를 No.20 메쉬 U.S. 체를 통해 통과시켜 철저히 혼합하였다. 폴리비닐피롤리돈 용액을 생성 분말과 혼합한 후, 16 메쉬 U.S. 체를 통해 통과시켰다. 이렇게 제조된 과립을 50℃ 내지 60℃ 에서 건조하고, 16 메쉬 U.S. 체를 통해 통과시켰다. 미리 No.30 메쉬 U.S. 체를 통해 통과시킨 나트륨 카르복시메틸 전분, 스테아르산마그네슘, 및 활석을 과립에 첨가하여, 혼합 후 타정기 상에서 압축하여 각각 120 mg 인 정제를 얻었다.
실시예 5
각각 25 mg 의 활성 성분을 포함하는 좌약을 하기와 같이 제조하였다:
성분 양
활성 성분 25 mg
포화 지방산 글리세리드를 합쳐서 2,000 mg
활성 성분을 No.60 메쉬 U.S. 체를 통해 통과시켜 미리 필요한 최소열을 이용하여 용융시킨 포화 지방산 글리세리드 중에 현탁하였다. 이어서 혼합물을겉보기 2.0 g 용량의 좌약 주형 내로 붓고, 냉각하였다.
실시예 6
5.0 ㎖ 용량 당 각각 50 mg 의 활성 성분을 포함하는 현탁액을 하기와 같이 제조하였다:
성분 양
활성 성분 50.0 mg
잔탄 고무 4.0 mg
나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스 (11%)
미세결정성 셀룰로오스 (89%) 50.0 mg
수크로오스 1.75 g
나트륨 벤조에이트 10.0 mg
향료 및 색소 적량
정제수를 채워서 5.0 ㎖ 로
활성 성분, 수크로오스 및 잔탄 고무를 배합하고, No.10 메쉬 U.S. 체를 통해 통과시킨 후 미리 제조된 수중 미세결정성 셀룰로오스 및 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스 용액과 혼합하였다. 나트륨 벤조에이트, 향료 및 색소를 일부의 물로 희석하여 교반하며 첨가하였다. 이어서 충분한 물을 첨가하여 목적 부피로 제조하였다.
실시예 7
피하 제형을 하기와 같이 제조할 수 있었다:
성분 양
활성 성분 5.0 mg
옥수수 오일 1.0 ㎖
실시예 8
하기 조성을 갖는 주사 제조물을 제조하였다:
성분 양
활성 성분 2.0 mg/㎖
만니톨, USP 50 mg/㎖
글루콘산, USP 적량 (pH 5-6)
물 (증류, 멸균수) 적량으로 1.0 ㎖ 로 만듦
질소 기체, NF 적량
실시예 9
하기 조성을 갖는 정제 제조물을 제조하였다:
성분 그램
활성 성분 0.2-10
Span 60 2.0
Tween 60 2.0
미네랄 오일 5.0
석유 0.10
메틸 파라벤 0.15
프로필 파라벤 0.05
BHA (부틸화 히드록시 아니솔) 0.01
물 적량으로 100 으로 만듦
물을 제외한 모든 상기 성분을 조합하여 교반 하에 60℃ 로 가열하였다. 이어서, 60℃ 에서 충분한 양의 물을 성분을 유화시키기 위해 강력 교반하면서 첨가한 후, 물을 적량 첨가하여 100 g 으로 만들었다.
하기 실시예는 본 발명의 화합물의 유용성을 나타낸다.
실시예 10
I. 개과 좌심실로부터 단리된 근육세포, 조직 및 동맥-관류 쐐기 제조물에서 라놀라진의 전기생리학적 효과
A. 물질 및 방법
20-25 kg 체중의 개를 헤파린 (180 IU/kg) 으로 항응고시키고 펜토바르비톨 (30-35 mg/kg, i.v.) 로 마취하였다. 흉부를 좌측 개흉술로 개방하고, 심장을 절제하여 냉 심장정지 용액 ([K+]0= 8 mmol/ℓ, 4℃) 중에 넣었다. 모든 프로토콜은 Institutional Animal Care and Use Committee 에서 작성한 가이드라인에 따랐다.
1. 단리된 개과 심실 근육세포에서의 전압 클램프 연구
근육세포를 좌측 회선 관상동맥이 공급되는 좌심실 유리 벽의 쐐기형 절편으로부터 효소 해리로 단리하였다. 좌심실의 심장외 및 중간심근 영역 세포를 본연구에 사용하였다.
해리에 사용된 Tyrode 용액은 하기를 함유하였으며 (mM), pH 는 NaOH 로 7.4 로 조정하였다: 135 NaCl, 5.4 KCl, 1 MgCl2, 0 또는 0.5 CaCl2, 10 글루코오스, 0.33 NaH2PO4, 10 N-2-히드록시에틸피페라진-N'-2-에탄술폰산 (HEPES).
종래 전체 세포 전압 클램프 배치를 이용하여 내향 정류 칼륨 전류 (IKl), 완속 지연 정류 칼륨 전류 (IKs), 및 급속 지연 정류 칼륨 전류 (IKr) 를 37℃ 에서 기록하였다. 특정 이온 전류를 단리하기 위해 사용되는 외부 및 피펫 용액의 조성을 표 3 에 요약하였다.
나트륨-칼륨 펌프를 차단하기 위한 3 μM 오베인 (ouabain) 및 5 μM 니페디핀을 포함하는 외부 용액을 이용하여 IKl및 L-형 칼슘 전류 (ICa,L) 각각을 측정하였다. IKr및 ICa를 차단하기 위한 5μM E-4031 및 5 μM 니페디핀의 존재 하에 IKs를 측정하였다. IKr이 기록되는 경우, 외부 용액 중에는 5 μM 니페디핀이 존재하였다.
단리된 근육세포를 역상 현미경 단상의 온도 조절 0.5 ㎖ 챔버 (Medical Systems, Greenvale, NY) 중에 놓고, 2 ㎖/분 의 속도로 관류시켰다. 세포로부터 100 ㎛ 에 놓인 8-배럴 석영 마이크로매니폴드 (ALA Scientific Instruments Inc., Westbury, NY) 를 이용하여, 하기 농도 (μM) 의 라놀라진을 적용하였다: 0.1, 0.5, 1.0, 5.0, 10 및 100.0. Axopatch 1D 증폭기 (Axon Instruments, Foster City, CA) 를 전압 클램프 모드에서 작동시켜 전류를 기록하였다. 전체 세포 전류를 5 kHz 에서 3-극 로우-패스 Bessel 필터 (low-pass Bessel filter) 로 여과하여, 2-5 kHz 사이에서 디지탈화시키고 (Digidata 1200A, Axon Instruments) 컴퓨터에 저장하였다. Clampex 7 입수 및 분석 소프트웨어 (Axon Instruments) 를 이용하여 이온 전류를 기록하고 분석하였다. 피펫 팁 저항은 1.0-2.0 MΩ이었고, 씰 (seal) 저항은 5GΩ초과였다. 시리즈 저항의 전기 보상은 평균 76% 였다. 문서에 보고된 전압은 패치 전극 팁 전위에 대해 교정되었다. 세포막 및 패치 피펫 사이의 씰은 초기에 1 mM CaCl2를 포함하는 외부 용액 중에 형성되었다. Ag/AgCl 접지 전극 및 외부 용액 간에 3 M KCl-아가 (agar) 가교를 이용하여 실험 용액으로의 교체 시 접지 전위의 발생을 배제하였다.
유지 전위 -50 mV 로부터 3 초 동안 40 mV 로 탈분극시킨 후 0 mV 로의 재분극 단계 (4.5 초) 에 의해 IKs을 일으켰다. 재분극에 의해 일어난 시간-의존성 꼬리 전류를 IKs로 명명하였다. 상기 프로토콜을 매 20 초마다 5 회 반복하였다. Ito는 차단되지 않았지만, 그 빠르고 완전한 불활성화로 인해 IKs측정에 대해서는 거의 영향을 미치지 않았다. 모든 측정은 IKs의 상당한 소실이 관찰되지 않는 간격인 패치 파열 후 5-12 분에 얻어졌다.
IKr은 -40 mV 전위에 이어 30 mV 로의 짧은 250 ms 탈분극 펄스로 일으킨 시간-의존성 꼬리 전류로 측정되었다. 데이타는 평균 ±S.E.M. 로 나타내었다. IKl는 유지 전위 -40 mV 로부터 시험 전위 -100 mV 내지 0 mV 범위로 적용되는 900 msec 전압 단계 도중 기록되었으며, 시험 펄스 말기의 일정 상태 전류의 5 msec 평균으로 특징지워졌다.
2. 단리된 개과 심실 심장외 및 M 영역 조직에서의 작용 전위 연구
심장외 및 중간심근 (M) 세포 제조물 (대략 1 ×0.5 ×0.15 cm 의 스트립) 을 좌심실로부터 단리하였다. 조직 슬라이스를 조직 바쓰 (5 ㎖ 부피, 12 ㎖/분 의 유속) 중에 넣고, 산소화 Tyrode 용액 (pH=7.35, t0=37 ±0.5℃) 으로 관류시키고, 필드 자극을 이용하여 2 Hz 의 기본 주기 길이 (BCL) 로 박동시키면서 4 시간 이상 동안 평형화시켰다. Tyrode 용액의 조성 (mM) 은 하기와 같았다: NaCl 129, KCl 4, NaH2P040.9, NaHCO320, CaCl21.8, MgSO40.5, 및 D-글루코오스5.5.
작용 전위 기록: 막통과 전위는 높은 입력-임피던스 증폭 시스템 (World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA) 에 연결된, 2.7 M KCl 이 충전된 표준 유리 마이크로전극 (10 내지 20MΩDC 저항) 을 이용하여 기록하였다. 증폭된 신호를 Tektronix (Beaverton,OR, USA) 오실로스코프 상에 나타내고, 증폭하고 (모델 1903-4 프로그램형 증폭기 [Cambridge Electronic Designs (C.E.D.), Cambridge, England]), 디지탈화하고 (모델 1401 AD/DA 시스템 [C.E.D.]), 분석하여 (Spike 2 입수 및 분석 모듈 [C.E.D.]), 자기 매체 상에 저장하였다.
연구 프로토콜: 작용 전위를 심장외 및 M 세포 제조물로부터 기록하였다. 대조군 기록은 4-6 시간 평형 기간 후에 얻었다. 라놀라진의 효과는 각 농도의 약물 첨가 30 분 후에 시작되는 기록과 함께, 1, 5, 10, 50, 및 100 μM 농도에서 결정되었다. 라놀라진 작용의 속도 의존성은 기본 박동 주기 길이 (BCL) 300, 500, 800, 1000, 2000, 5000 msec 에서 막통과 작용 전위를 기록하여 결정되었다. BCL 500 및 2000 msec 에서 기록된 데이타를 나타내었다.
하기 작용 전위 파라미터를 측정하였다:
1) 50% 및 90% 재분극에서의 작용 전위기.
2) 크기
3) 오버슈트 (Overshoot)
4) 휴지막 전위
5) 작용 전위 업스트로크의 상승 속도 (Vmax)
Vmax는 대조군 조건 하에, 및 10 및 100 μM 라놀라진의 존재 하에 기록되었다. Vmax는 BCL 500 msec 에서 측정되었다. 낮은 세포외 K 는 약물-유도 APD 연장 및 초기 후탈분극을 촉진하는 것으로 알려져 있으므로, 하나는 정상 [K+]0(4 mM) 로 및 다른 하나는 낮은 [K+]0(2 mM) 로의 2 개 개별 실험 세트를 수행하였다.
3. 동맥-관류 개과 좌심실 쐐기 제조물에서의 작용 전위 연구
대략 12 mm ×35 mm ×12 mm 크기의 전층 좌심실 쐐기물을 좌심실 벽의 중간-내지-기저 전방 영역에서 절단하고, 좌측 전방 하행 관상동맥의 사선 가지에 관을 삽입하여 관류액 (Tyrode 용액) 을 전달하였다. Tyrode 용액의 조성은 하기와 같았다 (mM): NaCl 129, KCl 4, NaH2PO40.9, NaHCO320, CaCl21.8, MgSO40.5, 및 D-글루코오스 5.5; pH=7.4. 2 mM KCl 을 포함하는 Tyrode 용액을 이용하여 개별 실험 세트를 수행하였다.
막통과 작용 전위를 부유 마이크로전극을 이용하여 심장외 (EPI) 및 하부심장내 영역 (M) 에서 기록하였다. 전층 가 (pseudo)-심전도 (ECG) 를 막통과 기록에서와 동축을 따라, 제조물의 심장외 (+) 및 심장내 (-) 표면으로부터 대략 1 cm 에 놓인 2 개의 K-아가 전극 (1.1 mm, i.d.) 을 이용하여 기록하였다.
심실 쐐기물을 심장내 표면에 접촉하는 은 이중극 전극을 이용하여 기본 주기 길이 2000 msec 에서 박동시키면서 2 시간 동안 챔버 중에서 평형화시켰다. 허혈 전에 관류압 40-50mmHg 에 도달하도록 일정한 유속을 설정하였다. 관류액 및 조직-챔버를 둘러싼 인접 물-챔버를 동일한 가열기/순환조로 가열하여, 온도를 37 ±0.5℃ 로 유지하였다. 각 실험에서 맨위가 덮이지 않은 조직-챔버를 플라스틱 시이트로 그 표면의 ~75% 를 덮어서 추가 열 손실을 방지하고; 나머지 25% 는 덮지 않고 놔두어서, ECG 전극 및 부유 마이크로전극의 위치를 잡고 조종하였다. 제조물을 실험 과정 전반에 걸쳐 세포외 용액 중에 완전 침지시켰다.
QT 간격은 QRS 복합체의 초기 굴절 및 T 파의 말단부의 가장 가파른 부분에 그려진 접선이 등전선을 교차하는 지점 사이의 시간 간격으로 정의된다.
B. 연구 프로토콜
실험 시리즈 1: 제조물을 1 내지 100 μM 범위 농도의 라놀라진으로 관류시킨 후 ([K+]0= 4 mM), 재분극 시간 (50 및 90% 재분극에서의 작용 전위기 [각각 APD50및 APD90] 및 QT 간격 [ECG]) 뿐만 아니라 부정맥 발생에 대한 조직의 취약성의 변화를 측정하기 위한 것임.
막통과 작용 전위를 유리 부유 마이크로전극을 이용하여 심장외 (Epi), 하부심장내 영역 (M 영역) 에서 기록하였다. 동시에 전층 ECG 를 기록하였다.
a. 일정-상태 자극: 기본 주기 길이 (BCL) 를 300 에서 2000 msec 로 변화시켜, 하기의 라놀라진 농도에서 재분극 시간 (APD 및 ECG) 의 속도 의존성 변화를조사하였다: 1, 5, 10, 50 및 100 μM.
b. 프로그래밍된 전기 자극 (PES): 부정맥을 유도하기 위한 약물 농도 이전 및 이후에 이른 자극을 심장외 표면에 적용하였다. 주기 길이 2000 msec 에서 매 5 회 또는 10 회 기본 박동 (S1) 후 1 회씩 단일 펄스 (S2) 를 전달하였다. 불응성이 나타날 때까지 S1-S2 커플링 간격을 점진적으로 감소시켰다 (S2 자극은 이완기 역치의 3-5 배와 동일한 강도로 2-3 msec 기간이었다).
실험 시리즈 2: 제조물을 1 내지 100 μM 범위 농도의 라놀라진으로 관류시킨 후 ([K+]0= 2 mM), 재분극 시간 (50 및 90% 재분극에서의 작용 전위기 [각각 APD50및 APD90] 및 QT 간격 [ECG]) 뿐만 아니라 부정맥 발생에 대한 제조물의 취약성의 변화를 측정하기 위한 것임.
a. 일정-상태 자극: 기본 주기 길이 (BCL) 500 및 2000 에서 수행됨.
b. 프로그래밍된 전기 자극 (PES): 상기를 참고.
약물: 라놀라진 디히드로클로라이드를 100% 증류수 중에 50 mM 스톡 용액으로 용해시켰다. 각각의 실험을 위해 약물을 새로 제조하였다.
통계학: 통계 분석은 Bonferroni 테스트에 따라 단일 방식 반복 측정 편차 분석 (ANOVA) 을 이용하여 수행하였다.
실시예 11.
I Kr , I Ks 및 I Kl 에 대한 라놀라진의 효과
라놀라진은 농도-의존적 방식으로 IKr및 IKs를 저해하였지만, IKl는 변화시키지 않았다. IKr은 30 mV 로의 250 msec 활성화 펄스 후에 -40 mV 에서 시간-의존성 꼬리 전류로 측정되었다. 도 3A 는 대조군 용액 중 및 50 μM 라놀라진 후에 기록된 전류를 나타낸다. IKr은 상기 라놀라진 농도에서 거의 완전히 차단되었다. 도 3B 는 11.5 μM 의 IC50로 IKr꼬리 전류 저해에 대한 농도-반응 상관관계를 나타낸다.
IKs는 +40 mV 로의 3 초 단계에 의해 일어나서, 0 mV 로 돌아온 후 기록된 피크 시간-의존성 꼬리 전류로 측정되었다. 도 4A 는 대조군 조건 하에, 100 μM 라놀라진 후에, 및 약물의 세척 후에 기록된 전류를 나타낸다. 라놀라진 (100 μM) 은 0 mV 에서 기록된 꼬리 전류를 대부분 소실하였으며, 상기 효과는 세척 시 완전 역전되었다. IKs꼬리 전류의 저해에 대한 농도-반응 상관관계는 도 4B 에 나타내었으며, IC50은 13.4 μM 로 나타났다.
내향 정류 IKl은 천공-패치 전압 클램프 기법을 이용하여 기록되었다. 도 5A 는 대조군 조건 하에 (좌측 패널) 및 100 μM 라놀라진의 존재 하에 -100 및 0 mV 사이에서 10 mV 단계씩 증분된 전압에서 기록된 IKl을 나타낸다. 상기 및 5 개의 유사한 실험에서, 라놀라진은 내향 정류 전류에 변화를 일으키지 않았다. 패널 B 는 각각의 시험 펄스 말기에 측정된 평균 전류로부터 구축된 전류-전압 상관관계를 나타내는 복합 데이타를 도시한다.
실시예 12
단리된 개과 심실 조직에서의 작용 전위 연구
라놀라진은 [K+]0= 4 mM 및 BCL = 2000 msec 에서 M 세포 제조물의 APD50및 APD90모두의 농도-의존적 단축을 일으켰다 (도 6). 일부 제조물에서, 라놀라진은 낮은 농도에서는 APD 를 연장시키고, 높은 농도에서는 APD 를 단축시키는 2 상 효과를 일으켰다 (도 4A). 심장외 재분극은 약물에 의해 영향을 덜 받았으며, APD 연장으로의 경향을 나타내었다. 재분극의 전층 분산은 중간 농도의 라놀라진에서는 감소되었으며, 더 높은 농도에서는 실질적으로 소실되었다.
BCL 500 msec 에서, 라놀라진은 심장외 조직에서 APD 의 농도-의존적 연장을 일으키고, M 세포 제조물에서 단축을 일으켰다. 100 μM 농도에서, 심장외 APD 는 M 세포에서 보다 높았다. 결과적으로, 재분극의 전층 분산은 감소되거나 소실되었다. 라놀라진의 최고 농도에서 (100 μM), 전층 재분극 구배는 역전되었다. 라놀라진이 심장외 제조물에서 APD90의 사용-의존적 연장을 유도한다, 즉 , 연장이 더 빠른 속도에서 더 크다는 점은 주목할 만하다 (도 6 및 7).
INa에 대한 라놀라진 작용을 평가하기 위해, 작용 전위 업스트로크의 상승 속도 (Vmax) 를 측정하였다. 라놀라진은 Vmax를 감소시켰다. 상기 효과는 10 μM 에서는 중간이었으나 (n.s.), 100 μM 라놀라진으로는 더욱 상당하였다 (도8).
최대 50 μM 의 농도에서, 라놀라진은 M 세포 제조물에서 크기, 오버슈트, 및 휴지막 전위에 대한 효과를 거의 나타내지 않았다 (표 4).
시험된 최고 용량 (100 μM) 에서, 라놀라진은 0 상 크기를 감소시켰다. 작용 전위 뿐만 아니라 휴지막 전위의 오버슈트도 감소되었지만, 이들은 통계적 유의성에는 도달하지 못했다.
심장외 제조물에서, 라놀라진은 휴지막 전위, 오버슈트 및 0 상 크기를 거의 변화시키지 않았다 (표 5).
낮은 [K+]0존재 하 및 느린 속도 (BCL = 2000 msec) 에서, 라놀라진은 M 세포의 APD90를 유의미하게 변화시키지 않았으나, APD50을 농도-의존적으로 단축시켰다 (도 9). 대조적으로, 심장외막에서는 약물이 APD50을 거의 변화시키지 않았으나, APD90은 농도-의존적으로 연장시켰다. 재분극의 전층 분산은 매우 감소되었다.
BCL 500 msec 에서, 라놀라진은 M 세포의 재분극을 거의 변화시키지 않았지만, 심장외막에서 APD90을 현저히 농도-의존적으로 연장시켰다 (도 10).
실시예 13.
동맥-관류 개과 좌심실 쐐기 제조물에서의 작용 전위 연구
도 11 의 각 패널은 라놀라진 (1-100 μM) 의 부재 및 존재 하 기본 주기 길이 (BCL) 2000 msec 에서 동맥 관류 개과 좌심실 쐐기 제조물의 중간심근 (M 영역)및 심장외막 (Epi) 으로부터 기록된 ECG 및 막통과 작용 전위를 나타낸다. 약물의 효과는 4 mM (좌측 패널) 또는 2 mM (우측 패널) KCl 을 포함하는 관상동맥 관류액으로 연구하였다.
4 mM KCl 의 존재 하에서, 라놀라진은 APD90을 유의미하게 변화시키지 않았으나, 높은 약물 농도 (50 및 100 μM) 에서는 APD50을 유의미하게 감소시켰다. 대조적으로, 2 mM KCl 의 존재 하에서, 5-100 μM 농도의 라놀라진은 APD90을 유의미하게 연장시켰지만, 어느 농도에서도 APD50은 유의미하게 변화시키지 않았다 (표 6).
라놀라진은 [K+]04 mM 에서 M 세포에서 보다 심장 외막의 APD90을 더 연장시켰다. 결과적으로, 재분극의 전층 분산이 감소되었으나, 이는 유의성에는 도달하지 못했다. [K+]02 mM 에서, 라놀라진은 심장외막에서 보다 M 세포에서 APD90을 더 연장시켜 재분극의 전층 분산을 증가시켰으나, 역시 유의성에는 도달하지 못했다 (표 7).
도 12 는 APD90및 QT 간격 (상부 패널) 및 APD50(하부 패널) 에 대한 라놀라진의 농도-의존적 효과에 대한 복합 데이타를 나타낸다. [K+]04 mM 에서, QT 및 APD90은 어느 약물 농도에서도 거의 영향받지 않았고; APD50은 50 및 100 μM농도에서 유의미하게 단축되었다. [K+]02 mM 에서, M 세포의 QT 및 APD90은 5 μM 초과의 라놀라진 농도에서 약간 연장되었으나, APD50은 거의 영향받지 않았다.
표 8 은 토르사드 데 포인트 부정맥이 자발적으로 발생하지 않을 뿐 아니라, 개과 좌심실 쐐기 제조물이 관여되는 임의의 프로토콜 하의 프로그래밍된 전기 자극에 의해서도 유도되지 않는다는 사실을 강조한다. 대조군 조건 하에 또는 임의 농도의 라놀라진에 의해서는 부정맥이 관찰되지 않았다.
라놀라진 유도 토르사드 데 포인트
자발적 자극-유도
라놀라진 (1-100 μM)4 mM [K+]0 0/4 0/4
라놀라진 (1-100 μM)2 mM [K+]0 0/3 0/3
어느 농도의 라놀라진으로 사전 처리된 조직 또는 쐐기 제조물에서도 초기 또는 지연된 후탈분극은 관찰되지 않았다. 실제로, 라놀라진은 도 13 에 나타낸 바와 같이, 다른 IKr차단제, 예컨대 d-소탈롤에 대한 M 세포 제조물의 노출에 의해 유도되는 EAD 의 억제에 효과적인 것으로 나타났다. M 세포 제조물에서 D-소탈롤은 현저한 재분극의 연장을 일으켰으며, EAD 를 유도하였다. 라놀라진은 농도-의존적으로 작용 전위를 단축시키고, EAD 를 제거하였다. 라놀라진 (5-20 μM) 의 EAD 활성을 억제하고 APD 를 단축시키는 유사한 효과가 4/4 M 세포 제조물에서 관찰되었다.
실시예 14
II. 단리된 개과 좌심실 근육세포에서 후기 INa, ICa, Ito및 INa-Ca에 대한 라놀라진의 전기물리학적 효과.
A. 물질 및 방법
1. 단리된 개과 심실 근육세포에서의 전압 클램프 연구
웅성 잡종 성견에 180 IU/kg 헤파린 (나트륨 염) 을 주고, 35 mg/kg i.v. 펜토바르비톨 나트륨으로 마취시켜서, 이들의 심장을 빨리 제거하여 Tyrode 용액에 넣었다. 좌측 회선 관상동맥이 공급되는 심실 유리 벽의 쐐기형 절편을 효소적으로 해리하여 단일 근육세포를 수득하였다. 좌심실의 심장외 및 중간심근 영역의 세포를 사용하였다. 모든 절차는 Institutional Animal Care and Use Committee 에서 작성한 가이드라인에 따랐다.
해리에 사용된 Tyrode 용액은 하기를 포함하였으며 (mM), pH 는 NaOH 로 7.4 로 조정하였다: 135 NaCl, 5.4 KCl, 1 MgCl2, 0 또는 0.5 CaCl2, 10 글루코오스, 0.33 NaH2PO4, 10 N-2-히드록시에틸피페라진-N'-2-에탄술폰산 (HEPES).
L-형 칼슘 전류 (ICa), 일시적 외향 전류 (Ito), 및 나트륨-칼슘 교환 전류 (INa-Ca) 를 표준 패치 전극을 이용하여 37℃ 에서 기록하였다. 외부 및 피펫 용액의 조성을 각각 표 9 및 10 에 나타낸다. 후기 INa는 천공 패치 기법을 이용하여 기록하였다.
외부 용액
INaCa, INa, 후기, 및 ICa전체 세포/Perf-패치 (mM) Ito전체 세포 (mM)
10 글루코오스 10 글루코오스
- 4 KCl
1 MgCl2 1 MgCl2
2 CaCl2 2 CaCl2
140 Na-메탄술포네이트 140 N-메틸-D-글루카민-Cl
10 HEPES 10 HEPES
메탄 술폰산으로 pH 7.4 로 HCl 로 pH 7.4 로
내부 용액
INa, 후기Perf-패치 (mM) ICa전체 세포 (mM) INaCa전체 세포 (mM) Ito전체 세포 (mM)
135 Cs-아스파르테이트 140 Cs-아스파르테이트 140 Cs-아스파르테이트 130 K-아스파르테이트
0.010 CaCl2 - - 20 KCl
10 NaOH 10 NaOH 10 NaOH -
1 MgCl2 1 MgCl2 1 MgCl2 1 MgCl2
- 5 MgATP 5 MgATP 5 MgATP
10 HEPES 10 HEPES 10 HEPES 10 HEPES
- 10 EGTA 0.1 EGTA 5 EGTA
CsOH 로 pH 7.1 CsOH 로 pH 7.1 CsOH 로 pH 7.1 KOH 로 pH 7.1
해리된 세포를 역상 현미경 단상의 온도 조절 0.5 ㎖ 챔버 (Medical Systems, Greenvale,NY) 중에 넣고, 2 ㎖/분 으로 관류시켰다. 세포로부터 10 0 ㎛ 에 놓인 10 개 배럴의 석영 마이크로-매니폴드 (ALA Scientific Instruments InC., Westbury, NY) 를 이용하여, 라놀라진, 테트로도톡신 (TTX), 또는 카드뮴을 적용하였다. Axopatch 200A 증폭기 (Axon Instruments, Foster City, CA) 를 전압 클램프 모드에서 작동시켜, 37℃ 에서 전류를 기록하였다. 전체 세포 전류를 5 kHz 에서 4 극 로우-패스 Bessel 필터로 여과하고, 2-5 kHz 사이로 디지탈화시켜 (Digidata 1200A, Axon Instruments) 컴퓨터에 저장하였다. pClamp 8.2 소프트웨어 (Axon Instruments) 를 이용하여, 이온 전류를 기록 및 분석하였다. 피펫 팁 저항은 1.0-1.5 MΩ 였고, 씰 저항은 5GΩ초과였다. 시리즈 저항의 전기적 보상은 평균 76% 였다. 보고된 전압은 패치 전극 팁 전위에 대해 교정되었다. 세포막 및 패치 피펫 사이의 씰은 처음에 1 mM CaCl2를 포함하는 Tyrode 용액으로 형성되었다. Ag/AgCl 접지 전극 및 외부 용액 사이에 3 M KCl-아가 가교를 이용하여 실험 용액으로의 교체 시 접지 전위의 발생을 배제하였다.
테트로도톡신 (TTX) 을 수중에서 제조하고, 외부 용액 중 10 μM 의 최종 농도에 대해 1:100 으로 희석하였다. 라놀라진은 수중에서 50 mM 농도로 제조하고, 외부 용액 중에서 1-800 μM 범위의 최종 농도로 희석하였다.
ICa는 피크 내향 전류 - 시험 펄스 말기의 전류로 정의되었다. 외부 용액은 후기 INa의 일정 상태 성분을 차단하기 위해 10 μM TTX 를 포함하였다. 세포를 20 초 동안 -90 mV 에서 휴지시킨 후, -60 mV 로 800 ms 램프시킨 후 -50 mV 로 15 ms 단계를 처리하여 나트륨 채널을 불활성화시키고 전압 조절을 유지하며, 직후에 0 mV 로의 500 ms 단계를 처리하여 대조군 용액 중 ICa를 기록하였다. 상기 프로토콜을 각각의 약물 농도에 대해 0.5 Hz 속도에서 5 회 반복하였다. 라놀라진의 일정 상태 효과를 추적 5 번째 펄스 도중 ICa의 분할 변화로서 측정하였다. ICa의 변화를 세미-로그 규모로 약물 농도에 대해 도시하고, 논리 공식에 맞췄다.
후기 INa는 최종 5 ms 동안 -30 mV 로의 시험 펄스에서 측정된 평균 TTX-감수성 전류로 정의되었다. 500 ms 펄스 개시 시에 일어나는 전압 조절의 일시적 손실은 펄스3의 말기에 측정되는 전류에 영향을 미치지 않았다. 1 Hz 속도에서 반복되는 500 ms 펄스 자취를 이용하여, 일정 상태 차단점을 결정하였다. 10 번째 펄스 도중 후기 INa의 감소를 세미-로그 규모로 약물 농도에 대해 도시하고,논리 공식에 맞췄다.
Ito를, ICa를 차단하는 300 μM CdCl2의 존재 하에 기록하고, 시험 펄스의 말기에 피크 외향 전류 - 일정 상태 전류로 정의하였다. 유지 전위는 -80 mV 였으며, -50 mV 로의 5 ms 펄스 후 0.1 Hz 속도로 반복되는 -10, 0, 및 10 mV 로의 100 ms 펄스를 일으켰다. 각각의 약물 농도 첨가 4 분 후에 라놀라진의 효과를 평가하였다. 결과는 라놀라진이 Ito에 최소 효과를 가지는 논리 함수로서 도시되지 않았다. 대신에, 모든 결과를 평균 ±표준 편차로 나타내었다. 2-꼬리화 Student t-테스트를 이용하여, 평균 간 차이를 결정하였다.
정상 칼슘으로 INa-Ca를 유발하기 위해, -50 mV 로의 일시적인 3-ms 펄스 후에 0 mV 로의 5 ms 단계를 수행하여 ICa및 일시적 칼슘을 활성화시켰다. 상기 2 단계 프로토콜 직후에 -80 mV 로의 펄스를 가하여 INa-Ca를 기록하였다. INa-Ca는 총 수송 전하 (pA ×ms) 로 정량하였다. 전압 클램프 프로토콜에 앞서, 0.5 Hz 속도로 전달되는 20 mV 로의 10 회 펄스 자취 후 나머지 6 초의 휴지로 SR 의 칼슘 로딩을 유지하였다. INa-Ca의 감소를 세미-로그 규모에서 약물 농도의 함수로 도시하고, 논리 공식에 맞췄다.
실시예 15
도 14A 는 대조군 용액 중에 및 외부 용액으로의 20 μM 라놀라진 첨가 4 분 후 TTX-감수성 전류를 나타낸다. 도 14B 는 라놀라진 (5-50 μM) 이 외부 용액에 첨가된 유사 실험의 요약 결과를 나타낸다. 후기 INa의 절반 억제는 약물 농도 21 μM 에서 일어났다.
Ito에 대한 라놀라진의 효과는 시험 전위 -10, 0, 및 10 mV 에서 결정되었다. Ito는 라놀라진에 의한 저해에 상당히 저항적이었다. 도 15 는 대조군 용액 중에 (좌측 패널) 및 50 μM 라놀라진 첨가 4 분 후에 기록된 전류를 나타낸다. 약물은 피크 Ito를 10 미만 감소시켰다.
50 μM 농도 라놀라진은 10 mV 에서 Ito를 10 ±2% 감소시켰다 (6 개 세포, p < 0.001). -10 및 0 mV 에서 라놀라진의 효과는 유의성에 도달하지 못했다. 100 μM 농도의 라놀라진은 각각 0 및 10 mV 의 시험 전위에서 Ito를 16 ±3% 및 17 ±4% 감소시켰다 (7 개 세포, p < 0.001). 라놀라진은 모든 시험 전압에서 10 μM (9 개 세포) 및 20 μM (9 개 세포) 농도에서는 효과가 없었다. 도 16 에 나타낸 결과를 각각의 대조군 전류에 대해 정상화하여, 도 17 에 요약하였다.
도 18 의 상부 패널은 100 μM 라놀라진의 첨가 4 분 후 및 대조군 용액으로의 복귀 후, 대조군 용액 중 INa-Ca의 겹쳐진 자취를 나타내었다. 도 18 의 하부 패널은 3-14 개 세포에서 수득된 농도-반응 곡선을 나타낸다. INa-Ca을 저해하는 라놀라진의 IC50은 91 μM 이었다.
도 19 는 단일 도면에서 IKr, IKs, ICa, 후기 INa, 및 INa-Ca에 대한 농도-반응곡선을 나타낸다. 시험된 최고 농도 (100 μM) 에서의 Ito의 저해는 완전 곡선을 만들기에 불충분했다. IKr, IKs, 및 후기 INa는 라놀라진에 대해 유사한 감수성을 나타내었다.
실시예 16
III. 단리된 개과 푸르키니에 섬유에서 라놀라진의 전기생리학적 효과.
A. 물질 및 방법.
20-25 kg 체중의 개를 헤파린으로 항응고화시키고, 펜토바르비톨로 마취시켰다 (30-35 mg/kg, i.v.). 좌측 개흉술로 흉부를 개방하고, 심장을 절단하여 저온 심장정지 용액 중에 넣었다 ([K+]0= 8 mmol/ℓ, 4℃). 유리되어 흐르는 푸르키니에 섬유를 좌심실 및 우심실로부터 단리하였다. 제조물을 조직 배쓰 (5 ㎖ 부피, 12 ㎖/분 의 유속) 중에 넣고, 산소화 Tyrode 용액 (pH = 7.35, t0= 37 ±0.5℃) 으로 관류하고 포인트 자극을 이용하여 기본 주기 길이 (BCL) 1 Hz 로 박동시키면서 30 분 이상 평형화시켰다. Tyrode 용액의 조성은 하기와 같았다 (mM): NaCl 129, KCl 4, NaH2PO40.9, NaHCO320, CaCl21.8, MgSO40.5, 및 D-글루코오스 5.5.
작용 전위 기록: 막통과 전위는 고입력-임피던스 증폭 시스템 (World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA) 에 연결된, 2.7 M KCl 이 충전된 표준 유리 마이크로전극 (10 내지 20 MΩDC 저항) 을 이용하여 기록하였다. 증폭된신호는 Tektronix (Beaverton, OR, USA) 오실로스코프 상에 나타내어 증폭시키고 (모델 1903-4 프로그램가능한 증폭기 [Cambridge Electronic Designs (C.E.D.), Cambridge, England]), 디지탈화하여 (모델 1401 AD/DA 시스템 [C.E.D.]), 분석하고 (Spike 2 입수 및 분석 모듈 [C.E.D.]), 자기 매체 (개인 컴퓨터) 에 저장하였다.
B. 연구 프로토콜.
대조군 기록은 평형화 기간 30 분 후에 수득하였다. 각 농도의 약물 첨가 20 분 후부터 기록을 시작하여, 증가하는 농도의 라놀라진 (1, 5, 10, 50, 및 100 μM) 을 평가하였다. 라놀라진 작용의 속도 의존성은 기본 주기 길이 (BCL) 300, 500, 800, 1000, 2000, 및 5000 msec 에서 작용 전위를 기록하여 평가하였다. 상기 보고에서는, BCL 500 및 2000 msec 만을 비교적 급속 및 완속 박동 속도의 대표로서 나타내었다.
하기 작용 전위 파라미터를 측정하였다:
a. 50% (APD50) 및 90% (APD90) 재분극에서의 작용 전위기.
b. 크기
c. 오버슈트
d. 휴지막 전위
e. 작용 전위 업스트로크의 상승 속도 (Vmax).
낮은 세포외 K+는 약물-유도 APD 연장 및 초기 후탈분극을 촉진시킨다고 알려져 있으므로, 연구자들은 정상 (4 mM) 및 낮은 (3 mM)[K+]0의 존재 하에 라놀라진의 효과를 결정하였다.
마지막 상에서, 연구자들은 매우 특이적인 IKr차단제인 d-소탈롤 (100 μM) 에 의해 유도되는 EAD 에 대한 라놀라진의 효과를 평가하였다.
라놀라진 디히드로클로라이드를 증류수 중에 희석하여, 50 mM 스톡 용액을 제조하였다. 각각의 실험을 위해 약물을 새로 제조하였다.
통계학. Bonferroni 테스트에 따른 단일 방식 반복 측정 편차 분석 (ANOVA) 을 이용하여 통계 분석을 수행하였다.
실시예 17
정상 농도의 세포외 K + (4 mM)
라놀라진 (1-100 μM) 은 푸르키니에 섬유의 재분극에 대해 농도- 및 속도-의존적 효과를 일으켰다 (도 20). 낮은 농도의 라놀라진 (1-10 μM) 은 APD 에 영향을 미치지 않거나 비교적 적은 약화를 일으켰다. 높은 농도의 라놀라진 (50 및 100 μM) 은 급속 및 완속 속도에서 APD50을 유의미하게 단축시켰다. 대조적으로, APD90은 완속에서 현저히 단축되었으나, 급속 박동 속도에서는 그렇지 않았다 (도 20). 어느 약물 농도에서도 EAD 징후는 관찰되지 않았다.
INa에 대한 라놀라진의 효과를 평가하기 위해, 작용 전위의 업스트로크 상승 속도 (Vmax) 에 대한 약물의 효과를 결정하였다. 라놀라진은 50 및 100 μM 농도에서 Vmax의 유의미한 감소를 일으켰으며 (도 21), 약물에 의한 INa저해를 시사하였다.
1-50 μM 농도의 라놀라진은 크기, 오버슈트 또는 휴지막 전위에 대해 영향이 없거나 거의 없었다 (표 11).
시험된 최고 농도 (100 μM) 에서, 라놀라진은 Vmax및 INa를 감소시키는 약물 효과와 일관되게, 0 상 크기 및 오버슈트의 통계적으로 유의한 감소를 일으켰다.
낮은 농도의 세포외 K + (3 mM)
세포외 K+의 저하는 라놀라진의 효과를 실질적으로 변화시키지 않았다.가장 뚜렷한 차이에는 중간 농도에서 APD90을 연장시키는 약물의 경향, 및 BCL 2000 msec 에서 최고 농도의 약물에 의한 APD 의 더 적은 약화 유도가 포함된다 (도 22, 표 12).
5-10 μM 을 초과하는 농도는 APD50을 유의미하게 단축시켰다. 더 높은 수준의 [K+]0에서와 마찬가지로, 0 상 크기 및 작용 전위의 오버슈트는 높은 농도의 라놀라진 (50 및 100 μM) 에 의해 유의미하게 감소되었다. EAD 는 관찰되지 않았다.
d-소탈롤 유도 EAD 의 라놀라진 억제
특이적 IKr차단제인 d-소탈롤 (100 μM ) 은 6 개의 푸르키니에 섬유 제조물 중 4 개에서 EAD 활성을 유도하였다. 라놀라진은 5 μM 만큼 낮은 농도에서즉각적으로 4 개의 푸르키니에 섬유 중 4 개에서 소탈롤-유도 EAD 를 제거하였다 (도 23). 더 높은 수준의 라놀라진 (10 μM) 은 더 큰 작용 전위의 약화를 일으켰다.
실시예 18
IV. 마취된 개에서 QT 연장 및 부정맥 유도에 대한 라놀라진의 효과: 소탈롤과의 비교
A. 물질 및 방법
개에 Atravet (0.07 mg/kg sc) 을 사전처리한 15 분 후 케타민 (5.3 mg/kg iv) 및 발륨 (0.25 mg/kg iv), 이어서 이소플루란 (1-2%) 으로 마취하고, 관을 삽입하여 기계적으로 환기시켰다. 이어서 이들을 무선주파수 절제로 AV 를 차단시켰다. 정중 흉골절제술 (median sternotomy) 을 수행하고, 카테터를 혈압 (BP) 기록을 위해 대퇴부 동맥 내로, 및 시험 약물의 주입을 위해 두 대퇴부 정맥에 삽입하였다. 이중극 전극을 불응기의 프로그래밍된 자극 결정 (외부자극 기법) 을 위해서 뿐만 아니라 다양하게 조절되는 기본 주기 길이 (BCL) 에서 QT 간격 및 QRS 기간의 평가를 위해서 두 심실에 삽입하였다. TdP 를 볼루스 정맥내 용량 10, 20, 30, 40 및 50 ㎍/kg 으로 주어지는 페닐에프린의 접종에 의해 유도하였다. 각 용량 후에, ECG 를 연속해서 모니터링하여 부정맥을 관측하였다. BP 는 항상 페닐에프린 후에 상승하였고, 다음 용량의 페닐에프린 투여 전에 BP 를 정상화시키기 위해 충분한 시간 (10 분 이상) 이 허용되었다. 시험 약물 효과를 하기 프로토콜에 따라 평가하였다.
데이타는 평균 ±S.E.M. 으로 나타내었다. 통계 비교는 Student's t 시험으로 수행하였다. 2-꼬리화 개연성 < 0.05 를 통계적 유의성을 나타내는 것으로 간주하였다. 데이타 표에서, * 는 P < 0.05 를, ** 는 P < 0.01 를 나타내었다.
B. 연구 디자인 (프로토콜)
시험 약물을 하기와 같이 주입하였다: 1 군 (5 마리 개): 소탈롤을 로딩 용량 8 mg/kg 및 유지 용량 4 mg/kg/hr 로 iv 로 투여하였다. 2 군 (6 마리 개): 5 마리 개에 라놀라진을 0.5 mg/kg iv 로딩 후에 각각 1.0, 3.0 및 15 mg/kg/hr 의 제 1, 제 2 및 제 3 연속 iv 주입으로 투여하였다. 1 마리 개에는 라놀라진을 1.5 mg/kg iv 로딩 후 15 및 30 mg/kg/hr 주입으로 투여하였다. 유지 주입 개시 20 분 후 (소탈롤에 대해) 또는 각각의 iv 주입 속도 개시 30 분 후 (라놀라진에 대해) 전기생리학적 측정 (우심실 및 좌심실 ERP, QT 및 QRS) 을 BCL 300, 400, 600 및 1000 ms 에서 수득하였다. 이어서 페닐에프린을 각각의 약물 주입 속도로 전체 용량을 접종하고, 임의 부정맥을 모니터링하였다.
실시예 19
표 13 에는 모델에서 소탈롤의 친(pro)부정맥 효과 (2 단현상, 3 단현상, 토르사드 데 포인트 및 심실 세동으로 변질되는 토르사드 데 포인트) 를 요약하였다.
소탈롤 군에서의 부정맥 발생
ID Sot 8 + 4 PE10 PE20 PE30 PE40 PE50
Sot1 - - - - 2 단현상- 3 단현상 -tdp30박동CL-206.9-tdp16박동CL-194.7-tdp VF-tdp7박동CL-230-tdp VF사망
Sot2 -S1=1000,S2=275VT4 박동CL=186.7-S1=1000,S2=270VT4 박동CL=173.7-S1=1000,S2=265tdp21 박동CL=144-S1=300,S2=230tdp VF-tdp VF - VT모노tdp VF사망
Sot3 - -tdp13박동CL=201.7 -2 단현상-3 단현상 -2 단현상-3 단현상 -VT 모노 5박동 CL=250-tdp21박동CL=195-tdp VF-tdp VF-tdp VF사망
Sot4 -S1=1000,S2=235VT7 박동CL=137 - -2 단현상 -2 단현상 -2 단현상 -3 단현상-VT모노19박동CL=300-tdp VF-tdp VF사망
Sot5 - - - -tdp VF사망
VT = 심실성 빈맥, VF = 심실 세동, mono = 단일형태성, tdp = 토르사드 데 포인트, CL = 주기 길이, sot= 소탈롤, PE10, 20, 30, 40, 50 = 각각 10, 20, 30,40, 50 ㎍/kg 의 페닐에프린
5 마리 개 중 2 마리가 페닐에프린 접종 없이 친부정맥을 가졌으며, 모든 5 마리가 페닐에프린 접종 시 친부정맥을 가졌다. 모든 개는 실제로 소탈롤 주입 및 페닐에프린 볼루스의 조합으로 유도되는, 심실 세동으로 변질되는 토르사드 데 포인트로 사망하였다. 소탈롤은 반비례하는 사용-의존적 양상으로 우심실 (RV) 및 좌심실 (LV) 유효 불응기를 증가시켰다 (표 14 및 도 24A 및 B). 소탈롤은 매우 반비례하는 사용-의존적 양상으로 QT 간격을 증가시켰으며, QRS 기간에는 영향을 미치지 않았다 (표 15 및 도 25A 및 B).
표준 라놀라진 주입 프로토콜을 따른 5 마리 개에 대한 결과가 얻어졌다. 고용량의 개는 30 mg/kg/hr 주입 도중 펌프 부전으로 심실 부정맥 없이 사망하여, 상기 개의 전기생리학적 연구는 수행할 수 없었다. 표 16 은 상기 소탈롤에 대한 것과 동일한 프로토콜에 따라 페닐에프린 볼루스 (10-50 ㎍/kg) 과 조합된, 및 단독 라놀라진의 존재 하의 부정맥 발생을 요약하였다. 페닐에프린 볼루스와 함께 또는 단독으로 라놀라진을 주입하는 동안, 토르사드 데 포인트 및/또는 심실 세동은 유도할 수 없었다.
라놀라진은 ERP 를 약간 증가시켰으며 (평균 증가 약 10% 미만), 반비례하는 사용 의존성은 없었다 (표 17A 및 B 및 도 26 및 27). QT 간격은 중간 정도, 그러나 유의미하지는 않게 증가하였으며 (최대 증가는 대략 10% 였음), 최대 효과는 시간 당 3 mg/kg 이었고, 더 높은 용량에서는 감소하였다 (표 18A 및 B 및 도28 및 29).
실시예 20
작용 전위 전압 클램프 도중 후기 INa에 대한 라놀라진의 효과
웅성 잡종 성견에 180 IU/kg 헤파린 (나트륨염) 을 투여하고, 35 mg/kg i.v. 펜토바르비톨 나트륨으로 마취하여, 이들의 심장을 빠르게 제거하고 Tyrode 용액 중에 넣었다. 좌측 회선 관상동맥에 공급되는 심실 유리 벽의 쐐기형 절편을 효소적으로 해리하여 단일 근육세포를 수득하였다. 좌심실의 중간심근 영역의 세포를 사용하였다. 모든 절차는 Institutional Animal Care and UseCommittee 에서 작성한 가이드라인에 따랐다.
해리에 사용된 Tyrode 용액은 하기를 함유하였고 (mM), pH 는 NaOH 로 7.4 로 조정하였다: 135 NaCl, 5.4 KCl, 1 MgCl2, 0 또는 0.5 CaCl2, 10 글루코오스, 0.33 NaH2PO4, 10 N-2-히드록시에틸피페라진-N'-2-에탄술폰산 (HEPES). 사용된 외부 및 내부 용액의 조성을 표 19 에 요약하였다.
후기 INa를 표준 패치 전극을 이용하여 37℃ 에서 기록하였다. 해리된 세포를 역상 현미경 단상의 온도 조절 0.5 ㎖ 챔버 (Medical Systems, Greenvale, NY) 중에 넣고, 2 ㎖/분 으로 관류시켰다. 세포에서 100 ㎛ 에 놓인 4-배럴 석영 마이크로-매니폴드 (ALA Scientific Instruments Inc., Westbury, NY) 를 이용하여, 라놀라진 및 테트라도톡신 (TTX) 을 적용하였다. 인라인 히터 (Harvard/Warner, Holliston, MA) 를 이용하여 석영 매니폴드 내 용액의 온도를 유지하였다. Axopatch 700A 증폭기 (Axon Instruments, Foster City, CA) 를 전압 클램프 모드에서 작동시켜 37℃ 에서 전류를 기록하였다. 전체 세포 전류를 5 kHz 에서 4-극 로우-패스 Bessel 필터로 여과하여, 2-5 kHz 사이에서 디지탈화시키고 (Digidata 1200A, Axon Instruments) 컴퓨터에 저장하였다. pClamp 8.2 소프트웨어 (Axon Instruments) 를 이용하여 이온 전류를 기록하고 분석하였다. 피펫 팁 저항은 1.0-1.5 MΩ이었고, 씰 저항은 5GΩ초과였다. 시리즈 저항의 전기 보상은 평균 76% 였다. 보고된 전압은 패치 전극 팁 전위에 대해 교정되었다. 세포막 및 패치 피펫 사이의 씰은 초기에 1 mM CaCl2를 포함하는 Tyrode 용액 중에 형성되었다. Ag/AgCl 접지 전극 및 외부 용액 간에 3 M KCl-아가 가교를 이용하여 실험 용액으로의 교체 시 접지 전위의 발생을 배제하였다.
테트로도톡신 (TTX) 은 수중에서 제조하여, 외부 용액 중 최종 농도 10 μM 로 1:100 희석하였다. 라놀라진 디히드로클로라이드를 수중에서 5 mM 농도로 제조하고, 외부 용액 중에 1-50 μM 범위의 최종 농도로 희석하였다.
INa, 후기를 300 및 2000 ms 의 반복 속도에서 30 펄스 자취 동안 기록하였다. 자취의 최종 5 개 펄스 동안의 전류를 평균하여 노이즈를 감소시키고, 후기 INa를 TTX-감수성 전류로 정의하였다. 프로토콜을 INa, 후기를 완전히 차단하기 위한 10 μM TTX 첨가 직후 및 라놀라진 첨가 2 내지 4 분 후 무약물 용액 중에서 반복하였다.
제곱 펄스가 아닌 작용 전위를 이용하여 전압 클램프 INa, 후기를 수행하였다. BCL 300 ms 에서, 13 mV 전압에서의 안정기 및 -28 mV 전압에서 3 상 재분극 도중에 걸쳐 중간에서 측정을 수행하였다. BCL 2000 ms 에서, 20 mV 및 -28 mV 전압에서 유사 위치에서 측정을 수행하였다. 후기 INa의 감소를 세미-로그 규모로 약물 농도의 함수로서 도시하고, 논리 공식에 맞췄다.
도 30 은 대조군 용액 중, 및 외부 용액으로 20 μM 라놀라진의 첨가 3 분 후 TTX-감수성 전류를 나타낸다. 세포에 30 개 펄스에 대해 매 2000 ms 마다 펄스를 가하였다. 상기 도면은 안정기 전류가 작용 전위 클램프에서 후기에 기록되는 나트륨 전류보다 라놀라진에 더욱 감수성임을 나타낸다. 저해는 20 mV 에서 최대였지만, 일부 TTX-감수성 전류는 라놀라진 존재 하에 -28 mV 에 남아 있었다.
도 31 은 라놀라진 (1-50 μM) 이 외부 용액에 첨가된 유사 실험의 요약 결과를 나타낸다. 후기 INa의 절반 저해는 각각 약물 농도 5.9 μM 및 20.8 μM 에서 일어났다. 도 32 는 세포가 매 300 ms 마다 펄스를 받는 경우에도 안정기 동안에 저해가 더욱 강력함을 나타낸다.
도 33 은 라놀라진이 외부 용액에 첨가된 유사 실험의 복합 데이타를 나타낸다. INa, 후기의 절반 저해는 각각 기본 주기 길이 2000 ms 및 300 ms 에서 펄스를 받는 경우 약물 농도 20.8 μM 및 11.5 μM 에서 일어났다.
실시예 21
기니아픽 심실 근육세포의 작용 전위기에 대한 라놀라진의 효과
심실 근육세포의 단리
단일 심실 근육세포를 성체 웅성 기니아픽 (Harlan) 의 심장으로부터 단리하였다. 간단하게, 심장을 따뜻한 (35℃) 산소화 용액으로 하기 순서로 관류시켰다: 1) 하기를 포함하는 Tyrode 용액 (pH 7.4) 으로 5 분 동안 (mmol/ℓ): 140 NaCl, 4.6 KCl, 1.8 CaCl2, 1.1 MgSO4, 10 글루코오스 및 5 HEPES; 2) 하기를 함유하는 무-Ca2+용액 (pH 7.4) (mmol/ℓ): 100 NaCl, 30 KCl, 2 MgSO4, 10 글루코오스, 5 HEPES, 20 타우린, 5 피루베이트; 및 3) 솔라게나아제 (120 단위/㎖) 및 알부민 (2 mg/㎖) 을 함유하는 무-Ca2+용액으로 20 분 동안. 관류 말기에 심실을 제거하여 다지고, 용액 #3 중에서 10 분 동안 부드럽게 진탕하였다. 단리된 세포를 세포 현탁액으로부터 회수하였다.
작용 전위기의 측정
근육세포를 기록 챔버 중에 넣고, 35℃ 에서 Tyrode 용액으로 관류시켰다. 약물을 수퍼퓨세이트 (superfusate) 를 통해 적용하였다. 작용 전위를 하기를 함유하는 용액 (pH 7.2) (mmol/ℓ) 이 충전된 유리 마이크로전극을 이용하여 측정하였다: 120 K-아스파르테이트, 20 KCl, 1 MgCl2, 4 Na2ATP, 0.1 Na3GTP, 10 글루코오스, 1 EGTA 및 10 HEPES. 마이크로전극 저항은 1-3 MΩ였다. Axopatch-200 증폭기, DigiData-1200A 인터페이스 및 pCLAMP6 소프트웨어를 이용하여 전기생리학적 측정을 수행하였다. 작용 전위를 나타낸 바와 같은 다양한 빈도로 적용되는 5-ms 탈분극 펄스로 유도하였다. 작용 전위기는 50% (APD50) 및 90% (APD90) 재분극에서 측정하였다. 측정은 약물에 대한 반응이 안정한 최대치에 도달하였을때 수행하였다.
실험 프로토콜
1) 심실 근육세포를 0.5, 1 또는 2 Hz 의 빈도로 전기적으로 자극하였다. 각각의 근육세포를 3, 10 및 30 μmol/ℓ 라놀라진으로 처리하였다. 각각의 박동 빈도에서 작용 전위기에 대한 라놀라진의 효과를 4 개 근육세포에서 결정하였다.
2) 작용 전위를 0.25 Hz 빈도에서 일으키고, 작용 전위기에 대한 라놀라진 (10 μmol/ℓ) 의 효과를 5 μmol/ℓ 퀴니딘의 존재 하에 조사하였다. 실험은 4 개 근육세포에서 수행하였다.
통계 분석
데이타는 평균 ±SEM 으로 나타내었다. 페어드 Student's t-테스트를 페어드 데이타의 통계 분석을 위해 이용하고, 단일 방식 반복 측정 ANOVA 후에 Student-Newman-Keuls 테스트를 적용하여 다중 비교하였다. p 값 < 0.05 를 통계적으로 유의미한 것으로 간주하였다.
다양한 박동 빈도에서 라놀라진의 효과
약물 부재 하에, 자극 빈도 0.5 (n=4), 1 (n=4) 및 2 (n=4) Hz 에서 측정된APD50및 APD90은 각각 250 ±20, 221 ±18, 및 208 ±9 ms, 및 284 ±22, 251 ±20 및 245 ±9 ms 이었다. 따라서, 증가하는 박동 빈도는 작용 전위기의 속도 의존적 단축을 일으켰다. 박동 빈도와 무관하게, 라놀라진은 APD50및 APD90둘 다에서 중간 정도의 농도-의존적 단축을 일으켰다. 도 34 는 3, 10, 및 30 μmol/ℓ의 라놀라진이 0.5, 1, 및 2 Hz 에서 자극된 근육세포의 작용 전위기를 감소시킴을 나타내었다. 라놀라진에 의해 일어나는 작용 전위기의 단추은 약물의 세척 후 부분적으로 가역적이었다.
도 35 는 먼저 2 Hz, 이어서 0.5 Hz 에서 박동된 단일 근육세포에서 수득한 결과를 나타낸다. 2 개의 박동 빈도에서, 라놀라진 (30 μmol/ℓ) 은 유사한 작용 전위기의 단축을 일으켰다. 박동 빈도 0.5, 1 및 2 Hz 에서 3, 10 및 30 μmol/ℓ 라놀라진의 존재 및 부재 하에 측정된 APD50및 APD90의 비교를 도 36 에 나타낸다. 다양한 박동 빈도에서 라놀라진에 의한 APD50및 APD90의 단축은 대조군의 백분율로 정상화시켰으며, 도 37 에 나타낸다.
퀴니딘의 존재 하 라놀라진의 효과
도 38A 는 퀴니딘 (5 μmol/ℓ) 이 0.25 Hz 에서 박동된 근육세포의 작용 전위기를 증가시킴을 나타내었다. 라놀라진 (10 μmol/ℓ) 은 퀴니딘의 효과를 약화시키는 것으로 나타났다.
퀴니딘은 작용 전위기를 연장시키는데 부가하여, 초기 후탈분극 (EAD), 유발 활성 및 토르사드 데 포인트를 유도하는 것으로 알려져 있다. 도 39 및 40 에나타낸 바와 같이, 퀴니딘 (2.5 μmol/ℓ) 은 EAD 및 유발 활성을 유도하였다. 라놀라진 (10 μmol/ℓ) 은 퀴니딘에 의해 유도되는 EAD (도 39) 및 유발 활성 (도 40) 을 억제하는데 효과적인 것으로 나타났다.
실시예 22
실시예 21 의 절차 및 프로토콜에 따라, 기니아픽 심실 근육세포를 ATXII [개방 상태에서 Na+-채널 불활성화를 느리게 하여 심근육세포의 피크 및 후기 Na+전류 (INa) 를 증가시켜 LQT3 증후군을 모방하는 것으로 알려진 말미잘 독소] 의 존재 하에 또는 단독으로 라놀라진의 존재 하에 전기적으로 자극하였다. ATXII 는 초기 후탈분극 (EAD) 및 유발 활성과 심실성 빈맥을 유도하는 것으로 알려져 있다.
ATXII (10-40 nmol/ℓ) 는 도 41 에 나타낸 바와 같이 50% 재분극 (APD50) 에서 측정되는 작용 전위기를 273 ±9 ms 에서 1,154 ±61 ms 로 현저히 증가시키는 것으로 나타났으며 (n=20, p < 0.001), 모든 세포에서 EAD 를 유도하였다. 다중 EAD 및 결과적인 연장 탈분극이 종종 관찰되었다. 1 μmol/ℓ만큼 낮은 농도에서의 라놀라진은 ATXII 유도 EAD 및 유발 활성을 효과적으로 제거하였다. ATXII 에 의해 야기된 APD50의 연장은 도 42, 43, 44, 45, 및 46 에 나타낸 바와 같이 각각 1, 3, 10 및 30 μmol/ℓ 농도의 라놀라진에 의해 60 ±4% (n=7), 80 ±2% (n=7), 86 ±2% (n=12) 및 99 ±1% (n=8) 로 유의미하게 약화되었다 (p < 0.001). 상기 도면들은 5 개의 상이한 실험을 도시한다.
실시예 23
ATXII 유도 MAP (단일상 작용 전위) 기간 연장, EAD 및 심실성 빈맥 (VT) 에 대한 라놀라진의 효과를 연구하기 위해, K-H 완충액이 관류된 기니아픽의 단리된 심장 모델을 이용하였다.
ATXII (10-20 nM) 는 급속 심실 부정맥 없이 4 개 심장에서 MAPD90을 6% 연장시키는 것으로 나타났다. ATXII 는 10/14 개의 기니아픽 단리된 심장에서 EAD 및 다형성 VT 를 현저히 유도하였다. 5, 10 및 30 μM 의 라놀라진은 ATXII 의 존재 하에 EAD 및 VT, 특히 지속성 VT 를 억제하였다. 라놀라진의 보호적 효과는 라놀라진의 세척 시 가역적이었다. 상기 결과는 도 47 내지 50 에 나타내었다.
도 47 은 대조군, ATXII (20 nM), 및 ATXII (20 nM) + 라놀라진 (10 μM) 에 대한 MAP 및 ECG 를 나타내었다. 상기 도면은 라놀라진이 ATXII-유도 EAD 및 MAP 연장을 감소시킴을 나타내었다.
도 48 은 자발적인 VT 또는 박동-유도 VT 인 ATXII (20 nM)-유도 VT 에 대한 MAP 및 ECG 를 나타내었다.
도 49 는 라놀라진이 ATXII-유도 VT 를 감소시킴을 나타내었다. 상기 도면은 ATXII (20 nM) 단독 및 ATXII (20 nM) + 라놀라진 (30 μM) 에 대한 MAP 및 ECG 를 나타내었다.
도 50 은 라놀라진 (10 μM) 이 ATXII-유도 EAD 및 ΔMAP 를 역전시킴을 나타내었다.
실시예 24
라놀라진이 ATX-II 유도 1) EAD 및 유발 활성 (TA), 및 2) 심실성 빈맥 (VT) 을 억제하는지 여부를 결정하기 위해, 각각 기니아픽 심실 근육세포 및 단리된 심장을 사용하였다.
작용 전위는 전체-세포 패치-전극 기법을 이용하여 기록하였다. 심실 단일상 작용 전위 및 전기기록도 (electrogram) 는 단리된 심장으로부터 기록하였다. ATX-II (10-20 nmol/ℓ) 는 50% 재분극에서 측정된 APD (APD50) 를 271 ±7 ms 에서 1,148 ±49 ms 증가시켰으며 (n=24, p < 0.001), 모든 세포에서 EAD 를 유도하였다. 다중 EAD 및 지속적 탈분극이 종종 관찰되었다. ≥1 μmol/ℓ 농도의 라놀라진은 ATX-II 유도 EAD 및 TA 를 제거하였다. ATX-II 로 유도된 APD50의 연장은 0.1, 0.3, 1, 3, 10 및 30 μmol/ℓ농도의 라놀라진에 의해 각각 29 ±1% (n=5), 47 ±1% (n=5), 63 ±3% (n=11), 79 ±1% (n=10), 86 ±2% (n=12) 및 99 ±1% (n=8) 로 유의미하게 감소되었다 (p < 0.001). 라놀라진 (10 mol/ℓ) 은 또한 2.5 mol/ℓ 퀴니딘으로 유도되는 EAD 및 TA 를 억제하였다 (n=2). ATX-II (10-20 nmol/ℓ) 는 14 개의 단리된 심장 중 10 개에서 EAD 및 VT 를 일으켰으며; 5-30 μmol/ℓ 라놀라진에 의해 ATX-II 유도 EAD 가 유의미하게 감소되고 VT 가 종결되었다.
실시예 25
ATX-II (SCN5A 돌연변이를 모방함) 에 의한 INa(L)의 증가가 E-4031 및 293B의 효과 (지연된 정류 (IK) 의 급속 및 완속 성분의 칼륨 채널 차단제) 를 촉진시켜 APD 를 연장시키고 EAD 를 유도하는지의 여부, 및 라놀라진이 ATX-II 및 K+차단제의 효과를 역전시키는지 여부를 결정하기 위해, 기니아픽 심실 근육세포 및 단리된 심장을 사용하였다.
기니아픽의 단리된 근육세포 및 심장의 심실 APD 를 각각 50% (APD50) 및 90% (MAPD90) 재분극에서 측정하였다. 낮은 농도 (3 nmol/ℓ) 에서의 ATX-II 만이 APD50을 6 ±2% 로 약간 증가시켰다. 그러나, E-4031 또는 293B 와 함께 적용되는 경우, ATX-II 는 상기 K+차단제가 APD 를 연장시키는 효과를 크게 증강시켰다. ATX-II 의 부재 및 존재 하에, APD50은 각각 E-4031 (1 μmol/ℓ) 에 의해 11 ±2% 및 104 ±41%, 및 293B (30 μmol/ℓ) 에 의해서는 40 ±7% 및 202 ±59% 증가하였다. 또한, E-4031 및 293B 는 ATX-II 의 존재 하에 EAD 를 유도하였으나 부재 하에서는 그렇지 않았다. 라놀라진 (10 μmol/ℓ) 은 ATX-II + E-4031 또는 293B 의 존재 하에 EAD 를 완전 제거하였고, APD50연장을 약 70% 로 유의미하게 역전시켰다. ATX-II (7 nmol/ℓ), E-4031 (1 μmol/ℓ) 및 293B (1 μmol/ℓ) 단독은 각각 MAPD90을 32 ±0.1%, 30.1 ±0.1% 및 6.3 ±0.2% 증가시켰다. ATX-II 와 함께 적용되는 경우, E-4031 및 293B 는 각각 MAPD90을 127.1 ±0.4% 및 31.6 ±0.1% 증가시켰다. 라놀라진 (10 μmol/ℓ) 은 MAPD90을 ATX-II + E-4031 의 존재 하에 24.5 ±0.1% 및 ATX-II + 293B 의 존재 하에 8.3 ±0.1% 로 유의미하게 감소시켰다.

Claims (40)

  1. 하기 화학식 I 의 화합물 또는 이들의 이성질체, 또는 화학식 I 의 화합물의 약학적으로 허용가능한 염 또는 에스테르 또는 그 이성질체의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 포유류에서의 부정맥 치료 방법:
    [화학식 I]
    (식 중,
    R1, R2, R3, R4및 R5는 각각 독립적으로 수소, 저급 알킬, 저급 알콕시, 시아노, 트리플루오로메틸, 할로, 저급 알킬티오, 저급 알킬 술피닐, 저급 알킬 술포닐, 또는 N-임의 치환 알킬아미도이며, 단 R1이 메틸인 경우, R4는 메틸이 아니거나; 또는 R2및 R3이 함께 -OCH20- 를 형성하며;
    R6, R7, R8, R9및 R10은 각각 독립적으로 수소, 저급 아실, 아미노카르보닐메틸, 시아노, 저급 알킬, 저급 알콕시, 트리플루오로메틸, 할로, 저급 알킬티오, 저급 알킬 술피닐, 저급 알킬 술포닐, 또는 디-저급 알킬 아미노이거나; 또는
    R6및 R7이 함께 -CH=CH-CH=CH- 를 형성하거나; 또는
    R7및 R8이 함께 -O-CH20- 를 형성하고;
    R11및 R12는 각각 독립적으로 수소 또는 저급 알킬이고;
    W 는 산소 또는 황이다).
  2. 제 1 항에 있어서, 화학식 I 의 화합물이 N-(2,6-디메틸페닐)-4-[2-히드록시-3-(2-메톡시페녹시)프로필]-1-피페라진아세트아미드로 명명되는 라놀라진, 또는 이들의 이성질체, 또는 상기 화합물의 약학적으로 허용가능한 염 또는 그의 이성질체인 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 화학식 I 의 화합물이 IKr, IKs, 및 후기 INa이온 채널은 저해하지만 칼슘 채널은 저해하지 않는 용량 수준으로 투여되는 방법.
  4. 제 2 항에 있어서, 라놀라진이 약학적으로 허용가능한 염의 형태인 방법.
  5. 제 4 항에 있어서, 약학적으로 허용가능한 염이 디히드로클로라이드 염인 방법.
  6. 제 2 항에 있어서, 라놀라진이 자유 염기의 형태인 방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 투여가 후기 INa이온 채널을 저해하는 용량 수준을 포함하는 방법.
  8. 제 1 항에 있어서, 투여가 IKr, IKs, 및 후기 INa이온 채널을 저해하는 용량 수준을 포함하는 방법.
  9. 제 1 항에 있어서, 투여가 IKr, IKs, 및 후기 INa이온 채널은 저해하지만 칼슘 채널은 저해하지 않는 용량 수준을 포함하는 방법.
  10. 제 1 항에 있어서, 화학식 I 의 화합물이 12 시간 이상 동안 350 ±30 ng/㎖ 이상의 화학식 I 의 화합물의 혈장 수준을 제공하는 방식으로 투여되는 방법.
  11. 하기 화학식 I 의 화합물 또는 이들의 이성질체, 또는 화학식 I 의 화합물의 약학적으로 허용가능한 염 또는 에스테르 또는 그 이성질체를 12 시간 이상 동안 최대 4000 ng/㎖ 미만, 바람직하게는 약 350 내지 약 4000 ng 기재/㎖ 인 화학식 I 의 화합물의 혈장 농도를 유지하는 서방성 제형으로 투여하는 것을 포함하는, 포유류에서의 부정맥 치료 방법:
    [화학식 I]
    (식 중,
    R1, R2, R3, R4및 R5는 각각 독립적으로 수소, 저급 알킬, 저급 알콕시, 시아노, 트리플루오로메틸, 할로, 저급 알킬티오, 저급 알킬 술피닐, 저급 알킬 술포닐, 또는 N-임의 치환 알킬아미도이며, 단 R1이 메틸인 경우, R4는 메틸이 아니거나; 또는 R2및 R3이 함께 -OCH20- 를 형성하며;
    R6, R7, R8, R9및 R10은 각각 독립적으로 수소, 저급 아실, 아미노카르보닐메틸, 시아노, 저급 알킬, 저급 알콕시, 트리플루오로메틸, 할로, 저급 알킬티오, 저급 알킬 술피닐, 저급 알킬 술포닐, 또는 디-저급 알킬 아미노이거나; 또는
    R6및 R7이 함께 -CH=CH-CH=CH- 를 형성하거나; 또는
    R7및 R8이 함께 -O-CH20- 를 형성하고;
    R11및 R12는 각각 독립적으로 수소 또는 저급 알킬이고;
    W 는 산소 또는 황이다).
  12. 제 1 항에 있어서, 화학식 I 의 화합물이 약 10 mg 내지 700 mg 의 화학식 I 의 화합물을 포함하는 제형 중에 투여되는 방법.
  13. 제 12 항에 있어서, 화학식 I 의 화합물이 라놀라진, 또는 이들의 이성질체, 또는 상기 화합물의 약학적으로 허용가능한 염 또는 그의 이성질체인 방법.
  14. 제 1 항에 있어서, 화합물이 제형 1 리터 당 약 1 내지 약 30 마이크로몰의 용량 수준을 제공하는 제형 중에 투여되는 방법.
  15. 제 14 항에 있어서, 상기 제형이 제형 1 리터 당 약 1 내지 약 10 마이크로몰의 용량 수준을 제공하는 방법.
  16. 라놀라진, 또는 이들의 이성질체, 또는 상기 화합물의 약학적으로 허용가능한 염 또는 그의 이성질체의 유효량을 이를 필요로 하는 포유류에게 투여하는 것을 포함하는, 포유류에서 부정맥의 치료 또는 예방 방법.
  17. 라놀라진, 또는 이들의 이성질체, 또는 상기 화합물의 약학적으로 허용가능한 염 또는 그의 이성질체의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 포유류에게 투여하는 것을 포함하는, 획득 부정맥 (처방 약제 또는 다른 화학물질에 의해 야기되는부정맥) 의 치료 또는 예방 방법.
  18. 라놀라진, 또는 이들의 이성질체, 또는 상기 화합물의 약학적으로 허용가능한 염 또는 그의 이성질체의 유효량을 이를 필요로 하는 포유류에게 투여하는 것을 포함하는, 유전 부정맥 (유전자 돌연변이로 야기된 부정맥) 의 치료 또는 예방 방법.
  19. 라놀라진, 또는 이들의 이성질체, 또는 상기 화합물의 약학적으로 허용가능한 염 또는 그의 이성질체의 유효량을 이를 필요로 하는 포유류에게 투여하는 것을 포함하는, 유전적으로 결정된 선천성 LQTS 를 갖는 포유류에서 부정맥의 치료 또는 예방 방법.
  20. 라놀라진, 또는 이들의 이성질체, 또는 상기 화합물의 약학적으로 허용가능한 염 또는 그의 이성질체의 유효량을 이를 필요로 하는 포유류에게 투여하는 것을 포함하는, 토르사드 데 포인트 (Torsade de Pointe) 의 예방 방법.
  21. 라놀라진, 또는 이들의 이성질체, 또는 상기 화합물의 약학적으로 허용가능한 염 또는 그의 이성질체의 유효량을 이를 필요로 하는 포유류에게 투여하는 것을 포함하는, LQT3 을 앓는 포유류에서 부정맥의 치료 또는 예방 방법.
  22. 라놀라진, 또는 이들의 이성질체, 또는 상기 화합물의 약학적으로 허용가능한 염 또는 그의 이성질체의 유효량을 이를 필요로 하는 포유류에게 투여하는 것을 포함하는, LQT1, LQT2, 및 LQT3 을 앓는 포유류에서 부정맥의 치료 또는 예방 방법.
  23. 라놀라진, 또는 이들의 이성질체, 또는 상기 화합물의 약학적으로 허용가능한 염 또는 그의 이성질체의 유효량을 이를 필요로 하는 포유류에게 투여하는 것을 포함하는, LQT3 을 앓는 포유류에서 부정맥의 감소 방법.
  24. 라놀라진, 또는 이들의 이성질체, 또는 상기 화합물의 약학적으로 허용가능한 염 또는 그의 이성질체의 유효량을 이를 필요로 하는 포유류에게 투여하는 것을 포함하는, LQT1, LQT2, 및 LQT3 을 앓는 포유류에서 부정맥의 감소 방법.
  25. 적절한 집단을 SCN5A 유전자 돌연변이에 대해 스크리닝하고, 라놀라진, 또는 이들의 이성질체, 또는 상기 화합물의 약학적으로 허용가능한 염 또는 그의 이성질체의 유효량을, 상기 유전자 돌연변이를 갖는 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 부정맥의 예방 방법.
  26. IKr, IKs, 및 후기 나트륨 이온 채널을 동시에 저해하는, 하기 화학식 I 의화합물 또는 이들의 이성질체, 또는 상기 화합물의 약학적으로 허용가능한 염 또는 에스테르 또는 이들의 이성질체의 치료적 유효량을 치료를 필요로 하는 포유류에 투여하는 것을 포함하는, 포유류에서 심실성 빈맥의 치료 방법:
    [화학식 I]
    (식 중,
    R1, R2, R3, R4및 R5는 각각 독립적으로 수소, 저급 알킬, 저급 알콕시, 시아노, 트리플루오로메틸, 할로, 저급 알킬티오, 저급 알킬 술피닐, 저급 알킬 술포닐, 또는 N-임의 치환 알킬아미도이며, 단 R1이 메틸인 경우, R4는 메틸이 아니거나; 또는 R2및 R3이 함께 -OCH20- 를 형성하며;
    R6, R7, R8, R9및 R10은 각각 독립적으로 수소, 저급 아실, 아미노카르보닐메틸, 시아노, 저급 알킬, 저급 알콕시, 트리플루오로메틸, 할로, 저급 알킬티오, 저급 알킬 술피닐, 저급 알킬 술포닐, 또는 디-저급 알킬 아미노이거나; 또는
    R6및 R7이 함께 -CH=CH-CH=CH- 를 형성하거나; 또는
    R7및 R8이 함께 -O-CH20- 를 형성하고;
    R11및 R12는 각각 독립적으로 수소 또는 저급 알킬이고;
    W 는 산소 또는 황이다).
  27. 제 26 항에 있어서, 화합물이 심장 칼슘 이온 채널을 저해하지 않는 용량 수준에서 심장 IKr, IKs, 및 후기 나트륨 이온 채널을 저해하는 방법.
  28. 제 27 항에 있어서, 심실성 빈맥이 토르사드 데 포인트인 방법.
  29. 제 26 항에 있어서, 화합물이 N-(2,6-디메틸페닐)-4-[2-히드록시-3-(2-메톡시페녹시)프로필]-1-피페라진아세트아미드로 명명되는 라놀라진, 또는 이들의 이성질체, 또는 상기 화합물의 약학적으로 허용가능한 염 또는 그의 이성질체인 방법.
  30. 제 27 항에 있어서, 심장 칼슘 이온 채널을 조절하지 않으면서 심장 IKr, IKs, 및 후기 나트륨 이온 채널을 효과적으로 조절하는데 필요한 용량 수준이 상기 화합물의 1-100 μM 의 혈장 수준을 제공하는 방법.
  31. 제 30 항에 있어서, 심장 칼슘 이온 채널을 조절하지 않으면서 심장 IKr, IKs, 및 후기 나트륨 이온 채널을 효과적으로 조절하는데 필요한 용량 수준이 상기화합물의 1-50 μM 의 혈장 수준을 제공하는 방법.
  32. 제 31 항에 있어서, 심장 칼슘 이온 채널을 조절하지 않으면서 심장 IKr, IKs, 및 후기 나트륨 이온 채널을 효과적으로 조절하는데 필요한 용량 수준이 상기 화합물의 1-20 μM 의 혈장 수준을 제공하는 방법.
  33. 제 32 항에 있어서, 심장 칼슘 이온 채널을 조절하지 않으면서 심장 IKr, IKs, 및 후기 나트륨 이온 채널을 효과적으로 조절하는데 필요한 용량 수준이 상기 화합물의 1-10 μM 의 혈장 수준을 제공하는 방법.
  34. 심장 칼슘 이온 채널을 조절하지 않으면서 심장 IKr, IKs, 및 후기 나트륨 이온 채널을 조절하는 화합물의 치료적 유효량을 치료를 필요로 하는 포유류에 투여하는 것을 포함하는, 심장 약화 포유류에서 심실성 빈맥의 치료 방법.
  35. 심장 IKr, IKs, 및 후기 나트륨 이온 채널을 저해하는 화합물의 치료적 유효량을 치료를 필요로 하는 포유류에 투여하는 것을 포함하는, 포유류에서 약물 유도 심실성 빈맥의 치료 또는 예방 방법.
  36. 심장 IKr, IKs, 및 후기 나트륨 이온 채널을 저해하는 화합물의 치료적 유효량을 치료를 필요로 하는 포유류에 투여하는 것을 포함하는, 포유류에서 유전된 심실성 빈맥의 치료 또는 예방 방법.
  37. 제 1 항에 있어서, 화합물이 볼루스 또는 서방성 조성물로 투여되는 방법.
  38. 제 1 항에 있어서, 화합물이 정맥 내 투여되는 방법.
  39. 포유류에서 부정맥 치료를 위한, 하기 화학식 I 의 화합물 또는 이들의 이성질체, 또는 상기 화합물의 약학적으로 허용가능한 염 또는 에스테르 또는 그의 이성질체의 용도:
    [화학식 I]
    (식 중,
    R1, R2, R3, R4및 R5는 각각 독립적으로 수소, 저급 알킬, 저급 알콕시, 시아노, 트리플루오로메틸, 할로, 저급 알킬티오, 저급 알킬 술피닐, 저급 알킬 술포닐, 또는 N-임의 치환 알킬아미도이며, 단 R1이 메틸인 경우, R4는 메틸이 아니거나; 또는 R2및 R3이 함께 -OCH20- 를 형성하며;
    R6, R7, R8, R9및 R10은 각각 독립적으로 수소, 저급 아실, 아미노카르보닐메틸, 시아노, 저급 알킬, 저급 알콕시, 트리플루오로메틸, 할로, 저급 알킬티오, 저급 알킬 술피닐, 저급 알킬 술포닐, 또는 디-저급 알킬 아미노이거나; 또는
    R6및 R7이 함께 -CH=CH-CH=CH- 를 형성하거나; 또는
    R7및 R8이 함께 -O-CH20- 를 형성하고;
    R11및 R12는 각각 독립적으로 수소 또는 저급 알킬이고;
    W 는 산소 또는 황이다).
  40. 하기 화학식 I 의 화합물 또는 이들의 이성질체, 또는 상기 화합물의 약학적으로 허용가능한 염 또는 에스테르 또는 그의 이성질체의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 불안정성 협심증, 만성 협심증, 변이형 협심증, 심근 경색, 급성 관상동맥 증후군, 및 부가적으로 심부전 (급성 및/또는 만성) 과 같은 심근 허혈 상황에서 야기되는 심실성 빈맥의 치료 방법:
    [화학식 I]
    (식 중,
    R1, R2, R3, R4및 R5는 각각 독립적으로 수소, 저급 알킬, 저급 알콕시, 시아노, 트리플루오로메틸, 할로, 저급 알킬티오, 저급 알킬 술피닐, 저급 알킬 술포닐, 또는 N-임의 치환 알킬아미도이며, 단 R1이 메틸인 경우, R4는 메틸이 아니거나; 또는 R2및 R3이 함께 -OCH20- 를 형성하며;
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    W 는 산소 또는 황이다).
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