CN100548300C - 雷诺嗪在用于制备治疗心律失常药剂中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了以将不希望的副作用减至最低程度的方式治疗心律失常的方法，其中心律失常包括心动过速，如特发性室性心动过速、心室颤动、以及尖端扭转(TdP)。

Description

雷诺嗪在用于制备治疗心律失常药剂中的应用
要求对2002年4月4日提交的美国临时专利申请第60/370,150号、2002年9月5日提交的美国临时专利申请第60/408,292号、以及2002年10月30日提交的美国临时专利申请第60/422,589号的优先权，其披露的内容结合于此作为参考。
技术领域
本发明涉及一种治疗心脏心律失常的方法，包括给予可调节特异心脏离子通道的活性的化合物，同时将不希望的副作用减至最低程度。
背景技术
心脏本质上是一种负责循环全身血液的泵。在正常执行功能的心脏中，这种循环是由电脉冲的产生所引起，例如，其根据循环系统的需要增加或降低心率和/或收缩力。
可将心脏的电脉冲进行电检测和显示(心电图，EKG)，而EKG的电波形由可接受的习惯表征为“PQRST”复合波。PQRST复合波包括P波，其表示心房去极化波；QRS复合波，其表示心室去极化波；以及T波，其表示心细胞的复极化。因而，P波与心上室的活动有关，而QRS复合波和T波均反映下室的活动。
如果电信号以某种方式受到干扰，心脏的有效泵送作用则可能恶化，乃至完全停止。心脏的规则节律性搏动的失调是在心脏病中所看到的最常见的障碍之一。不规则节律(心律失常)可以是较轻的烦扰，或可以表示严重的问题。例如，心律失常可表示心肌、瓣膜、或动脉的潜在的异常，并且包括心脏搏动太慢(心动过缓)的情况以及心脏搏动太快(心动过速)的情况。
心动过速有两个一般变种：室上性心动过速和室性心动过速。
室上性心动过速包括阵发性室上性心动过速(PSVT)、心房纤颤、心房扑动、AV结折返、以及沃-帕-怀综合征(WPW)。室上性心动过速(SVT)是一种疾病，其中穿过心脏的电脉冲是异常的，这是由于在心脏的下室之上的某处有心脏问题。SVT可涉及140至250次/分的心律(正常为约70至80次/分)。
室性心动过速包括室性心动过速本身、以及心室颤动和尖端扭转(TdP)。室性心动过速(VT)是在心室中产生的快速心律。VT倾向于打断心室肌的有规则的收缩，因此心室的射血能力经常显著下降。与过度心率相结合，其可以降低在VT期间实际上由心脏泵送的血液量至危险水平。因此，虽然具有VT的患者有时可以感觉相对良好，但除了普遍存在的心悸之外，他们经常遭受极度的晕眩、丧失意识、乃至猝死。作为一般规则，VT并不发生在没有潜在心脏病的患者中。对于患有潜在心脏病的人，下述通常是正确的：左心室功能越差，产生威胁生命的室性心动过速的风险就越大。
室性心动过速可出现在心肌缺血状态如不稳定心绞痛、慢性心绞痛、变异型心绞痛、心肌梗死、急性冠状综合征，以及另外出现在心力衰竭(急性和慢性)。
有一种疾病称作复极化的异常延长、或长QT间期综合征(LQTS)，其反映于在Q波和T波(如由EKG所测量的)之间比平均间隔更长的间隔。QT时间的延长使患者变得易受非常迅速的、异常心律(“心律失常”)(称作尖端扭转)的攻击。当心律失常发生时，没有血液从心脏泵出，进而脑快速得不到血液，引起突然丧失意识(晕厥)并潜在地导致猝死。
LQTS是由心脏离子通道的功能不良或药物所引起。这些通道调控钾离子、钠离子、以及钙离子的流动，其流入和流出细胞产生心脏的电活性。具有LQTS的患者通常没有可识别的潜在的结构性心脏病。LQTS可以是遗传的，在某些情况下倾向于产生室性心动过速的特定变种，例如运动、给予某些药剂、乃至在睡眠期间。可替换地，患者可以获得LQTS，例如通过暴露于某些处方药物。
LQTS的获得形式可以由药剂引起。例如，在用奎尼丁治疗的患者中尖端扭转(TdP)的发病率估计在2.0到8.8％的范围内。DL-索他洛尔与在1.8到4.8％范围内的发病率有关。对于更新型III类抗心律失常药已描述类似的发病率，如多非利特和伊布利特。事实上，数目不断增加的非心血管药也已显示出聚集和/或沉淀TdP。据报道50种以上的商业上可获得的药物可以引起TdP。此问题似乎更频繁地产生自新药物而数目已从最近几年的市场上推出(例如，普尼拉明、特罗地林，以及在某些国家特非那定、阿司咪唑和西沙必利)。研究已表明，药物诱发性TdP主要由于复极化分散的增加的结果而感染，其从属于心室心肌的固有电异质性的增大。
大多数能够产生延长复极化和获得性LQTS的药剂分类成主要通过四种不同机制之一进行作用(1)K电流IKs和IKr之一或两者的延迟，实例是奎尼丁、N-乙酰普鲁卡因酰胺、铯、索他洛尔、溴苄铵、氯非铵、以及其他新型III类抗心律失常药(此作用可以被活化K通道的药物特异地拮抗，如吡那地尔和色满卡林)；(2)抑制Ito，如在4-氨基吡啶的情况下，其显示出延长复极化和诱导EADs，优先在犬心包下M细胞中，据报道其具有显著的Ito；(3)ICa的增加，如在Bay K 8644的情况下(这种作用可由钙通道阻滞剂所逆转)；(4)INa失活的延迟，如在乌头碱、藜芦定、蛙毒素、DPI、以及海葵毒素(ATX)、anthopleurin-A(AP-A)和ATX-II的情况下(此作用可以被阻断INa、和/或缓慢灭活钠电流的药物所拮抗，如利多卡因和美西律)。由于这些药物(例如，利多卡因和美西律)可以缩短延长的复极化，因而它们也可以抑制由最初的两种机制所诱导的EADs。
引起LQTS和TdP的药物清单正持续地增加。照字义，任何可以延长QT的药剂都可以诱导LQTS。TdP的发病率还未与药物的血浆浓度相联，已知其促使这种心律失常。然而，高血浆浓度，起因于这些药物中一些药物的过量或降低的代谢，可以增加促使TdP的风险。这种降低的代谢可起因于伴随使用其他干扰细胞色素P450酶的药物。据报道干扰与TdP相关的某些药物代谢的药物包括内吸收的酮康唑和结构上类似药物(氟康唑、伊曲康唑、甲硝唑)；5-羟色胺重摄取抑制剂(氟西汀、氟伏沙明、舍曲林)、以及其他抗抑郁药(奈法唑酮)、人免疫缺陷病毒(HIV)蛋白酶抑制剂(茚地那韦、利托那韦、沙奎那韦)；二氢吡啶钙通道阻滞剂(非洛地平、尼卡地平、硝苯地平)和红霉素，以及其他大环内酯抗生素。葡萄柚和葡萄柚汁也可以通过干扰细胞色素P450酶与某些药物相互作用。某些药物已与TdP相联，并不是因为它们延长QT时间，而是因为它们主要是P4503A4的抑制剂，并由此增加其他QT延长剂的血浆浓度。最好的实例是酮康唑和伊曲康唑，其是该酶的有效抑制剂并由此在特非那定、阿司咪唑、或西沙必利治疗期间引起TdP。从另一方面来说，药物相关TdP的发病率对于某些药物是非常低的：diphyhydramine、氟康唑、奎宁、锂、吲达帕胺、以及加压素。还应该注意，TdP可以起因于在含有内科疾病的患者中如肝功能不良或先天性LQTS、或在那些电解质失调(特别是低钾血症和低镁血症)的患者中使用引起QT延长的药物。
然而，有一些抗心律失常药，已知其延长QT时间但并不诱导TdP。已经发现，这类药物的共同特性是能够同时抑制其他离子电流如INa通道、和/或ICa通道。
当在若干基因之一中发生突变时则发生遗传形式的LQTS，这些基因产生或“编码”离子通道之一，其调控电复极化。至少有五种不同形式的遗传LQTS，称为LQT1、LQT2、LQT3、LQT4、以及LQT5。它们最初的特点在于EKG轨迹的不同形状，而其后则与特异性基因突变相联。来自KCNQ1(KVLQT1)或KCNE1(MinK)基因突变的LQT1形式是最常见的，其占大约55-60％的基因型患者。来自HERG或KCNE2(MiRP1)突变的LQT2形式是其次，占约35-40％，而来自SCN5A突变的LQT3形式占约3-5％。具有两种突变的患者似乎少于所有患者的1％，但当用更新的遗传技术研究更多的患者时这可以变化。
突变体基因引起形成异常通道，而当这些通道不能适当发挥作用时，心脏的电恢复则需要更长的时间，其表现为延长的QT时间。例如，在心脏钠离子通道中氨基酸残基1505-1507(KPQ)的遗传性缺失，由SCN5A编码，会引起严重的常染色体显性LQT3综合征，其与致死室性心律失常有关。在39％的LQT3患者中致死心律失常发生在睡眠或休息期间，大概由于过量后期钠离子电流异常地延长复极化，特别在低心率，由此有利于产生早期后除极(EADs)和异位搏动。在中心肌中优选减慢复极化可进一步增强复极化的透壁分散并引起单向阻断和折返性心律失常。在其他32％的LQT3患者中，致死心脏事件是由运动或情绪所引发。
据最近报道，心脏钠通道基因SCN5A的变异体与非裔美国人的心律失常有关。单链构象多态性(SCCP)和DNA序列分析揭示了在SCN5A的密码子1102中C到A的杂合易位，其引起酪氨酸(Y1102)取代丝氨酸(S1102)。S1102是位于细胞内序列中的保守残基，而细胞内序列连接通道的域II和域III。这些研究者发现，Y1102等位基因增加了心律失常敏感性。研究发现，QTc(校正的QT)被胺碘酮显著延长，导致尖端扭转室性心动过速。
需要一种药剂来以降低心律失常和TdP风险的方式治疗或预防遗传性或获得性LQTS。先前已证明雷诺嗪是治疗心绞痛的有效药剂，其对心率或血压不会带来或带来最小程度的影响。现在意外地，我们发现雷诺嗪及其相关化合物是预防和/或治疗遗传性或获得性心律失常的有效药剂。
意外地，我们发现，抑制IKr、IKs、以及后期INa离子通道的化合物呈现这种优选的活性范围。这样的化合物可延长室性动作电位时程，增加心室有效不应期，降低TDR，增加APD，并且不会产生EADs。例如，雷诺嗪，其已知可用于治疗心绞痛和充血性心力衰竭，已发现借助于其在并不阻断钙通道的剂量水平可以抑制IKr、IKs、以及后期INa离子通道的能力可用于治疗室性心动过速。这是特别意想不到的，因为美国专利第4,567,264号(其结合于此作为参考)披露了雷诺嗪是抑制钙离子通道的心选择性药物，并且提出由于其阻断钙通道的效应它可以用于治疗包括心律失常的许多疾病状态。然而，我们已发现，雷诺嗪在对钙通道具有很小或没有影响的水平起有效抗心律失常药的作用。这种在治疗量水平对钙通道活性没有或最低程度的影响是有利的，因为它可以消除众所周知的钙离子通道抑制剂的效应(例如，血压的变化)，当治疗患者的心律失常时这些效应是不需要的。我们还发现，雷诺嗪可以有效地抑制EADs和引发的活性，其是给予药物的副作用，如奎尼丁和索他洛尔。
相应地，本发明提供新颖和有效的治疗VT的方法，其重建窦性心律同时实际上没有不希望的副作用，如平均动脉压、血压、心率的变化，或其他有害效应。
发明内容
本发明的一个目的是提供治疗哺乳动物心律失常的有效方法。相应地，在第一个方面，本发明涉及一种治疗哺乳动物心律失常的方法，包括给予治疗量的化学式I的化合物：
Figure C0380787100131
化学式I
其中：
R1、R2、R3、R4以及R5每个独立地是氢、低级烷基、低级烷氧基、氰基、三氟甲基、卤基(halo)、低级烷基硫、低级烷基亚硫酰基、低级烷基磺酰基、或N-可选取代的烷基酰氨基，若R1是甲基，则R4不是甲基；
或R2和R3一起形成-OCH2O-；
R6、R7、R8、R9以及R10每个独立地是氢、低级酰基、氨基羰基甲基、氰基、低级烷基、低级烷氧基、三氟甲基、卤基、低级烷基硫、低级烷基亚硫酰基、低级烷基磺酰基、或二低级烷基氨基；或
R6和R7一起形成-CH＝CH-CH＝CH-；或
R7和R8一起形成-O-CH2O-；
R11和R12每个独立地是氢或低级烷基；以及
W是氧或硫；
或其异构体、或化学式I的化合物或其异构体的药用盐或酯。
优选的化合物是雷诺嗪，其命名为N-(2，6-二甲基苯基)-4-[2-羟基-3-(2-甲氧基苯氧基)丙基]-1-哌嗪乙酰胺{也称为1-[3-(2-甲氧基苯氧基)-2-羟基丙基]-4-[(2，6-二甲基苯基)-氨羰基甲基]-哌嗪}，作为外消旋混合物、或其异构体、或其药用盐。它优选在抑制IKr、IKs、以及后期INa离子通道但不抑制钙通道或其他离子通道的剂量水平给予。雷诺嗪，作为外消旋混合物或异构体，可以配制成游离碱或药用盐。如果配制成药用盐，则二氢氯化物盐是优选的。
在第二个方面，本发明涉及一种治疗心律失常的方法，包括将有效量的雷诺嗪、或其异构体、或化合物或其异构体的药用盐给予对其需要的哺乳动物。
在第三个方面，本发明涉及一种治疗哺乳动物心律失常的方法，包括以抑制后期INa离子通道的剂量水平给予雷诺嗪、或其异构体、或化合物或其异构体的药用盐。优选的是治疗量，其抑制IKr、IKs、以及后期INa离子通道。更优选的是治疗量，其抑制IKr、IKs、以及后期INa离子通道但不抑制钙通道。
在一个优选具体实施例中，本发明的化合物以一种方式给予，该方式提供至少350±30ng/mL的化学式I的化合物的血浆水平，时间至少为12小时。
在第二个优选具体实施例中，本发明的化合物作为缓释剂型给予，其将化学式I的化合物的血浆浓度维持在小于4000ng/mL的最大值，优选在约350至约4000ng碱/mL之间，时间至少为12小时。
在第三个优选具体实施例中，本发明的化合物以一种剂型给予，该剂型含有约10mg和700mg之间的化学式I的化合物。化学式I的优选化合物是雷诺嗪、或其异构体、或化合物或其异构体的药用盐。
在第四个优选具体实施例中，本发明的化合物以一种剂型给予，该剂型提供每升该剂型约1至约30微摩尔的剂量水平。优选的是给予一种剂型，其提供每升该剂型约1至约10微摩尔的剂量水平。
在第四个方面，本发明涉及一种预防哺乳动物心律失常的方法，包括将有效量的雷诺嗪、或其异构体、或化合物或其异构体的药用盐给予对其需要的哺乳动物。
在第五个方面，本发明涉及一种治疗哺乳动物心律失常的方法，包括将有效量的雷诺嗪、或其异构体、或化合物或其异构体的药用盐给予对其需要的哺乳动物。
在第六个方面，本发明涉及一种治疗获得性心律失常(由处方药物或其他化学药品引起的心律失常)的方法，包括将有效治疗量的雷诺嗪、或其异构体、或化合物或其异构体的药用盐给予对其需要的哺乳动物。优选地，将剂型给予由于对奎尼丁的敏感性而患有心律失常的哺乳动物。
在第七个方面，本发明涉及一种预防获得性心律失常(由对处方药物或其他化学药品的敏感性所引起的心律失常)的方法，包括将有效治疗量的雷诺嗪、或其异构体、或化合物或其异构体的药用盐给予对其需要的哺乳动物。
在第八个方面，本发明涉及一种治疗遗传性心律失常(由基因突变引起的心律失常)的方法，包括将有效量的雷诺嗪、或其异构体、或化合物或其异构体的药用盐给予对其需要的哺乳动物。
在第九个方面，本发明涉及一种预防遗传性心律失常(由基因突变引起的心律失常)的方法，包括将有效量的雷诺嗪、或其异构体、或化合物或其异构体的药用盐给予对其需要的哺乳动物。
在第十个方面，本发明涉及一种在患有遗传决定的先天性LQTS的哺乳动物中预防心律失常的方法，包括将有效量的雷诺嗪、或其异构体、或化合物或其异构体的药用盐给予对其需要的哺乳动物。
在第十一个方面，本发明涉及一种在患有遗传决定的先天性LQTS的哺乳动物中治疗心律失常的方法，包括将有效量的雷诺嗪、或其异构体、或化合物或其异构体的药用盐给予对其需要的哺乳动物。
在第十二个方面，本发明涉及一种预防尖端扭转的方法，包括将有效量的雷诺嗪、或其异构体、或化合物或其异构体的药用盐给予对其需要的哺乳动物。
在第十三个方面，本发明涉及一种在受LQT3折磨的哺乳动物中预防心律失常的方法，包括将有效量的雷诺嗪、或其异构体、或化合物或其异构体的药用盐给予对其需要的哺乳动物。
在第十四个方面，本发明涉及一种在受LQT3折磨的哺乳动物中治疗心律失常的方法，包括将有效量的雷诺嗪、或其异构体、或化合物或其异构体的药用盐给予对其需要的哺乳动物。
在第十五个方面，本发明涉及一种在受LQT1、LQT2、以及LQT3折磨的哺乳动物中预防心律失常的方法，包括将有效量的雷诺嗪、或其异构体、或化合物或其异构体的药用盐给予对其需要的哺乳动物。
在第十六个方面，本发明涉及一种在受LQT1、LQT2、以及LQT3折磨的哺乳动物中治疗心律失常的方法，包括将有效量的雷诺嗪、或其异构体、或化合物或其异构体的药用盐给予对其需要的哺乳动物。
在第十七个方面，本发明涉及一种在受LQT3折磨的哺乳动物中减轻心律失常的方法，包括将有效量的雷诺嗪、或其异构体、或化合物或其异构体的药用盐给予对其需要的哺乳动物。
在第十八个方面，本发明涉及一种在受LQT1、LQT2、以及LQT3折磨的哺乳动物中减轻心律失常的方法，包括将有效量的雷诺嗪、或其异构体、或化合物或其异构体的药用盐给予对其需要的哺乳动物。
在第十九个方面，本发明涉及一种预防心律失常的方法，包括对适当群体筛选SCN5A基因突变并将有效量的雷诺嗪、或其异构体、或其药用盐给予受这种基因突变折磨的患者。对于SCN5A基因突变而言，优选的适当群体是那部分不具有钠通道的正常功能的群体。
在第二十个方面，本发明涉及一种治疗哺乳动物室性心动过速同时将不希望的副作用减至最低程度的方法。
在第二十一个方面，本发明涉及一种治疗哺乳动物室性心动过速(其由于药物治疗的结果而产生)的方法，包括在给予引起TdP(作为副作用)的药物之前、之后、或同时，给予治疗量的抑制IKr、IKs、以及后期INa离子通道的化合物。优选地，将剂型给予由于对奎尼丁或索他洛尔的敏感性而患有心律失常的哺乳动物。优选地，其中为有效地调节所述心脏IKr、IKs、以及后期钠离子通道而没有调节所述心脏钙离子通道所需的剂量水平提供所述化合物的血浆水平在1-100μM之间。更优选地，其中为有效地调节所述心脏IKr、IKs、以及后期钠离子通道而没有调节所述心脏钙离子通道所需的剂量水平提供所述化合物的血浆水平在1-50μM之间。再优选地，其中为有效地调节所述心脏IKr、IKs、以及后期钠离子通道而没有调节所述心脏钙离子通道所需的剂量水平提供所述化合物的血浆水平在1-20μM之间。最优选地，其中为有效地调节所述心脏IKr、IKs、以及后期钠离子通道而没有调节所述心脏钙离子通道所需的剂量水平提供所述化合物的血浆水平在1-10μM之间。
在第二十二个方面，本发明涉及一种在心脏受损的哺乳动物中治疗室性心动过速的方法，包括在抑制IKr、IKs、以及后期INa离子通道但不抑制钙通道的剂量水平给予治疗量的化学式I的化合物。
在第二十三个方面，本发明涉及一种治疗心律失常或室性心动过速的方法，其是通过以一种方式给予作为大丸剂的化学式I的化合物，该方式提供至少350±30ng/mL的化学式I的化合物的血浆水平，时间至少为12小时。
在第二十四个方面，本发明涉及一种治疗心律失常或室性心动过速的方法，其是通过以一种方式给予作为缓释剂型的化学式I的化合物，其将化学式I的化合物的血浆水平维持在小于4000ng/mL的最大值，优选在约350至约4000ng碱/mL之间，时间至少为12小时。
在第二十五个方面，本发明涉及一种治疗心律失常的方法，其中化学式I的化合物或其异构体、或化合物或其异构体的药用盐或酯是通过大丸剂或缓释组合物给予。
在第二十六个方面，本发明涉及一种治疗心律失常的方法，其中化学式I的化合物或其异构体、或化合物或其异构体的药用盐或酯是静脉内给予。
在第二十七个方面，本发明涉及一种将化学式I的化合物或其异构体、或化合物或其异构体的药用盐或酯用于治疗哺乳动物的心律失常。
在第二十八个方面，本发明涉及一种治疗室性心动过速的方法，其出现在心肌缺血状态如不稳定心绞痛、慢性心绞痛、变异型心绞痛、心肌梗死、急性冠状综合征，以及另外出现在心力衰竭(急性和慢性)中。
缩写词：
APD：动作电位时程
BCL：基础周长
EAD：早期后除极
ECG和EKG：心电图
IKr：快速钾通道整流电流
IKs：慢速钾通道整流电流
INa，L：后期钠通道电流
epi cells：心外膜细胞
endo cells：心内膜细胞
LQTS：长QT间期综合征
M cells：来源于心脏的中心肌区域的细胞
RMP：静息膜电位
TdP：尖端扭转
TDR：复极化的透壁分散
VT：室性心动过速
附图说明
图1是来自传导系统的假设动作电位和产生它的电流的时间进程之间的关系。
图2是正常搏动传播。
图3是在犬左心室肌细胞中雷诺嗪对延迟整流电流(IKr)的快速活化成分的影响。A：在250msec脉冲至30mV期间记录的典型的电流轨迹，其是从-40mV的保持电势，然后在雷诺嗪(50μM)之前和之后复极化回到-40mV。细胞浸在含有5μM硝苯地平的蒂罗德溶液中。B：雷诺嗪对IKr的抑制效应的浓度-反应曲线。IKr被测量为在250msec去极化脉冲至30mV之后、复极化至-40mV时的尾电流(n＝5-8)。
图4是雷诺嗪抑制延迟整流电流(IKs)的慢速活化成分。A：典型的IKs电流轨迹，记录自对犬左心室心外膜肌细胞所做的典型实验，在存在和存在100μM雷诺嗪的情况下。电流的诱发是从-50mV的保持电势通过去极化步骤至30mV时间为3sec，接着复极化步骤至0mV(4.5sec)。IKs被测量为在复极化步骤以后记录的尾电流。雷诺嗪(100μM)几乎完全阻断IKs而抑制效应在冲洗时被完全逆转。B：雷诺嗪对IKs(测量为在3sec去极化步骤至30mV之后、复极化步骤至0mV所诱发的尾电流)的抑制效应的浓度-反应曲线(n＝5-14)，在有5μM E-4031和5μM硝本地平的情况下。数值表示归一化尾电流的平均值±标准平均误差。雷诺嗪抑制IKs，其中IC50为13.4μM。
图5是雷诺嗪不影响犬心室肌细胞中的IK1。A：示出的是典型的电流轨迹，其是在暴露于雷诺嗪(100μM)之前和之后、在从-40mV的保持电势电压步骤至900msec试验电势(在-100和0mV之间)期间所记录。B：稳定状态I-V关系，通过标出在900msec脉冲端点测量的电流水平所绘制而成，其是作为试验电压的函数。高达100μM浓度的雷诺嗪并不改变IK1。数据表示为平均值±标准平均误差(n＝6)。
图6是在基础周长(BCL)为2000msec([K+]0＝4mM)的情况下雷诺嗪对心外膜和M细胞动作电位的影响。A：示出的是重叠跨膜动作电位，在基线条件下和在加入逐渐更高浓度的雷诺嗪(1-100μM)以后所记录。B和C：曲线图标出雷诺嗪对动作电位时程的浓度依赖效应(APD50和APD90)。数据表示为平均值±标准误差。*-p＜0.05，与对照比较。
图7是在基础周长为500msec([K+]0＝4mM)的情况下雷诺嗪对心外膜和M细胞动作电位时程(APD50和APD90)的影响。曲线图标出雷诺嗪对动作电位时程(APD50和APD90)的浓度依赖效应。数据表示为平均值±标准误差。*-p＜0.05，与对照比较。
图8是雷诺嗪对动作电位(Vmax)的上升支的上升速率的影响。示出的是重叠动作电位(B)和相应的微分上升支(dV/dt，A)，在基线条件下和在存在10和100μM雷诺嗪的情况下所记录(BCL＝500msec)。C：雷诺嗪对降低Vmax的影响的浓度-反应关系曲线。
图9是在基础周长为2000msec以及[K+]0＝2mM的情况下所记录的雷诺嗪对心外膜和M细胞动作电位的影响。A：示出的是重叠跨膜动作电位，在不存在和存在雷诺嗪(1-100μM)的条件下所记录。B和C：曲线图标出雷诺嗪对动作电位时程(APD50和APD90)的浓度依赖效应。数据表示为平均值±标准误差。*-p＜0.05，与对照比较。
图10是在基础周长为500msec([K+]0＝2mM)的情况下雷诺嗪对心外膜和M细胞动作电位时程(APD50和APD90)的影响。曲线图标出雷诺嗪对动作电位时程(APD50和APD90)的浓度依赖效应。数据表示为平均值±标准误差。*-p＜0.05，与对照比较。
图11是从上到下，每个图片显示ECG轨迹和跨膜动作电位，在基础周长(BCL)为2000msec的情况下记录自动脉灌注的犬左心室楔标本的中心肌(M区域)和心外膜(Epi)。重叠信号描述基线条件(对照)和在1-100μM浓度范围内雷诺嗪的影响。A：利用含有4mM KCl的蒂罗德溶液对楔进行灌注来进行。B：利用含有2mM KCl的蒂罗德溶液来进行。
图12是复合数据用曲线图说明在暴露于雷诺嗪(1-100μM)之前和之后的APD90(Epi和M的)和QT时间值(A，C)以及APD50值(B，D)。A，B：4mM KCl。C，D：2mM KCl。BCL＝2000msec。
图13是在M细胞标本中雷诺嗪对抑制d-索他洛尔诱导的早期后除极(EAD)的影响。A和B：重叠跨膜动作电位，记录自两个M细胞标本，在对照条件下，在有IKr阻断(100μM d-索他洛尔)的情况下，以及在继续有d-索他洛尔的情况下在加入逐步增加浓度的雷诺嗪(5、10、以及20μM)以后。基础周长＝2000msec。
图14是雷诺嗪对后期INa的阻断，利用穿孔膜片电压钳技术所记录。A：TTX敏感电流被示出，在对照溶液中(黑色轨迹)和在20μM雷诺嗪之后(红色轨迹)。B：2-8个细胞的浓度-反应曲线简图。
图15是雷诺嗪对Ito的影响。电流是在100ms步骤至-10(较小的向外电流)、0、以及10mV期间进行记录。Ito是在对照溶液中(左，黑色轨迹)、以及在加入50uM雷诺嗪以后4min(右，红色轨迹)进行记录。
图16是雷诺嗪对Ito的影响的汇总数据，在3个试验电势下，浓度为10μM(9个细胞)、20μM(9个细胞)、50uM(6个细胞)、以及100μM(7个细胞)。
图17是归一化Ito和雷诺嗪的影响。这些数据和图4提供的数据相同。
图18是顶部图片显示INa-Ca在对照溶液、加入100μM雷诺嗪之后4min(分钟)、以及回到对照溶液之后(红色轨迹)的重叠轨迹。下部图片显示浓度-反应曲线。
图19是在单个图形中，IKr、IKs、ICa、INa，late(后期)、以及INaCa的浓度-反应曲线。IKr、IKs、以及后期INa显示类似的对雷诺嗪的敏感性，而INaCa和ICa是相当少敏感的。
图20是雷诺嗪对浦肯野(Purkinje)纤维动作电位的影响。A和B：曲线图标出在BCL为500(A)和2000(B)msec情况下雷诺嗪(1-100μM)对动作电位时程(APD50和APD90)的浓度依赖效应。C和D：重叠跨膜动作电位，其是在BCL为500(C)和2000(D)msec情况下，在基线条件下以及在加入逐渐更高浓度的雷诺嗪之后所记录。([K+]0＝4mM)。数据表示为平均值±标准误差。*-p＜0.05，与对照比较。
图21是雷诺嗪对动作电位(Vmax)的上升支的上升速率的浓度依赖效应。示出的是重叠动作电位(B)和相应的微分上升支(dV/dt，A)，在不存在和存在雷诺嗪(1-100μM)的条件下所记录(BCL＝500msec)。C：雷诺嗪对降低Vmax的影响的浓度-反应关系曲线。
图22是在有低[K+]0的情况下雷诺嗪对浦肯野(Purkinje)纤维动作电位的影响。A和B：曲线图标出在BCL为500(A)和2000(B)msec情况下雷诺嗪(1-100μM)对动作电位时程(APD50和APD90)的浓度依赖效应。([K+]0＝3mM)。数据表示为平均值±标准误差。*-p＜0.05，与对照比较。
图23是在浦肯野(Purkinje)纤维标本中雷诺嗪对抑制d-索他洛尔诱导的早期后除极(EAD)的影响。示出的是重叠跨膜动作电位，记录自浦肯野纤维标本，在有IKr阻断(100μM d-索他洛尔)的情况下，以及在继续有d-索他洛尔的情况下在加入逐步增加浓度的雷诺嗪(5以及10μM)以后。基础周长＝8000msec。
图24A和B是索他洛尔的全部电生理数据。示出的是索他洛尔对右和左心室ERP的影响，单位是ms。
图25A和B是索他洛尔的全部电生理数据。示出的是索他洛尔对QT时间和QRS时间的影响，单位是ms。
图26是雷诺嗪的全部电生理数据。示出的是雷诺嗪对右和左心室ERP的影响，单位是ms。
图27是雷诺嗪的全部电生理数据。示出的是雷诺嗪对平均ERP-LV的影响。
图28是雷诺嗪的全部电生理数据。示出的是雷诺嗪对QT时间的影响，单位是ms。
图29是雷诺嗪的全部电生理数据。示出的是雷诺嗪对QRS时间的影响。
图30是雷诺嗪对后期INa的阻断，利用动作电位电压钳技术所记录。A：TTX敏感电流被示出，在对照溶液中和在20μM雷诺嗪之后。测量是在两个光标(cursors)处进行，对应于电压20mV和-28mV。在20mV抑制最大，但在存在雷诺嗪的情况下，在-28mV仍然有一些TTX敏感电流。在存在雷诺嗪的情况下，在动作电位初期也仍然有TTX敏感电流。
图31是雷诺嗪对INa，late的阻断。BCL＝2000ms。浓度-反应曲线的简图。误差线条(error bars)是±标准平均误差，细胞数目为3-11个细胞。
图32是雷诺嗪对INa，late的阻断。BCL＝300ms。浓度-反应曲线的简图。误差线条是±标准平均误差，细胞数目为6-10个细胞。
图33是在慢和快速刺激下雷诺嗪对INa，late的影响的简化数据。误差线条是±标准平均误差，细胞数目为6-12个细胞。
图34是在3、10、以及30μmol/L的条件下，雷诺嗪对肌细胞动作电位时程的影响。
图35是在30μmol/L的条件下，雷诺嗪对肌细胞的影响，其首先在2Hz(赫兹)、然后在0.5Hz进行起搏。
图36是在不存在和存在3、10、以及30μmol/L雷诺嗪的情况下测量的APD50和APD90的比较，起搏频率为0.5、1以及2Hz。
图37是雷诺嗪的影响，在各种起搏频率下缩短APD50和APD90。归一化为对照的百分数。
图38是在5μmol/L时奎尼丁对肌细胞的动作电位时程的影响，在0.25Hz下起搏。在10μmol/L下雷诺嗪减弱奎尼丁的影响。
图39是奎尼丁和/或雷诺嗪对EADs的影响。研究发现，10μmol/L的雷诺嗪有效抑制奎尼丁诱导的EADs。
图40是奎尼丁和/或雷诺嗪对触发激动的影响。研究发现，10μmol/L的雷诺嗪有效抑制奎尼丁诱导的触发激动。
图41是在1、3、10、以及30μmol/L下ATXII和/或雷诺嗪对豚鼠心室肌细胞中动作电位时程的影响。
图42是在1、3、10、以及30μmol/L下ATXII和/或雷诺嗪对豚鼠心室肌细胞中动作电位时程的影响。在低到1μmol/L的浓度雷诺嗪有效地消除ATXII诱导的EADs和触发激动。
图43是在1、3、10、以及30μmol/L下ATXII和/或雷诺嗪对豚鼠心室肌细胞中动作电位时程的影响。在低到1μmol/L的浓度雷诺嗪有效地消除ATXII诱导的EADs和触发激动。
图44是在1、3、10、以及30μmol/L下ATXII和/或雷诺嗪对豚鼠心室肌细胞中动作电位时程的影响。在低到1μmol/L的浓度雷诺嗪有效地消除ATXII诱导的EADs和触发激动。
图45是在1、3、10、以及30μmol/L下ATXII和/或雷诺嗪对豚鼠心室肌细胞中动作电位时程的影响。在低到1μmol/L的浓度雷诺嗪有效地消除ATXII诱导的EADs和触发激动。
图46是在1、3、10、以及30μmol/L下ATXII和/或雷诺嗪对豚鼠心室肌细胞中动作电位时程的影响。在低到1μmol/L的浓度雷诺嗪有效地消除ATXII诱导的EADs和触发激动。
图47是在K-H缓冲液灌注豚鼠分离的心脏模型中10μM的ATXII和雷诺嗪对诱导的EAD和MAP延长的影响。在低到10μM的浓度雷诺嗪减少或有效地消除ATXII诱导的EADs和MAP延长。
图48是ATXII对VT的影响。ATXII(20nM)诱导VT，自发性VT和起搏诱导的VT。
图49是ATXII(20nM)和雷诺嗪对诱导的VT的影响。在30μM的浓度雷诺嗪减少或有效地消除ATXII诱导的VT。
图50是ATXII(20nM)和雷诺嗪对诱导的EAD和ΔMAP的影响。
具体实施方式
本发明提供了治疗、降低、或预防心律失常发病率的方法。
正常心律(窦性心律)起因于动作电位(APs)，其是通过多个心细胞上的离子通道的高度整合电生理行为所产生。钠、钙以及钾通道是确定心脏动作电位形状和时程的最重要的通道。简而言之，钠和钙通道的激活导致正电荷离子流入各个心细胞，引起膜的去极化。相反地，钾通道的打开允许正电荷流出这些细胞，并且在很大程度上终止动作电位并对细胞进行复极化(图1)。
APs在起搏点自它们的起点进行传播，通过窦房结，通过心房肌，然后通过房室结(AV)，通过浦肯野(Purkinje)传导系统，以及最后到心室。
心律失常，在心脏中冲动引发和传播的正常顺序的打断，可以起因于原发性心血管疾病、肺障碍、自律障碍、全身性障碍、药物相关副作用、遗传效应(基因突变)、或电解质失衡。
正常窦性心律和心律失常可在电心图(ECGs)上变得可见。ECG电位变化的图形轨迹，其是由心肌的兴奋所引起并在身体表面进行检测。从心电图可以测量：心率；PR间隔时间(intervalduration)，其反映V结传导时间；QRS时程，其反映在心室中的传导时间；以及QT时间，其是室性动作电位时程的测量。在窦性心律期间产生的ECG的图像示于图2。
室性心动过速是由增强的自发节律性、后除极以及触发的自律性和折返所引起。增强的自发节律性发生在通常显示自发的舒张期去极化的细胞中。B-adreneric刺激、低钾血症、以及心肌细胞的机械牵张可增加4期斜率并因而加速起搏点速率，而乙酰胆碱通过降低4期斜率和通过超极化可降低起搏点速率。当冲动从增强的正常或异常自发节律性区域传播以刺激其余的心脏心律失常结果。
后除极和触发的自律性发生在某些病理生理条件下，其中正常心脏动作电位被打断或继之以异常去极化。如果这种异常去极化达到阈值，它又可以产生次级上升支，然后其可以传播并产生异常节律。这些异常次级上升支仅发生在初始正常、或“触发”上升支以后，因而称为触发节律。公认有两种主要形式的触发节律：(1)延迟后除极(DAD)，其可以发生在细胞内钙过载条件下(心肌缺血、肾上腺素能应激等等)。如果这种后极化达到阈值，则可以发生次级触发搏动或多次搏动，以及；(2)当心脏动作电位有明显的延长时早期后除极(EADs)经常发生。当此发生时，3期复极化可以被EAD打断。当潜在的心律较慢、细胞外K+较低、以及存在某些延长动作电位时程的药物时，体外EAD中介触发和临床心律失常是最常见的。EADs起因于动作电位的复极化阶段净向内电流的增加。
TdP是用许多不同类型药物进行治疗时常见和严重的副作用；并且可以由EADs和作为结果而产生的触发所引起。然而，有其他测量TdP风险的疾病，包括低钾血症、低镁血症、低钙血症、高度房室传导阻滞、先天性障碍、以及重度心动过缓。
长QT间期综合征(LQTS)是由心脏细胞中蛋白结构(称作离子通道)的功能不良所引起。这些通道调控离子的流动，如钾、钠、以及钙分子。这些离子流入和流出细胞可产生心脏的电效能。这些通道的异常可以是获得性的或遗传的。获得性形式通常由处方药物引起。
当在若干基因之一中发生突变时，则发生遗传形式，这些基因产生或“编码”离子通道之一，其调控电复极化。突变体基因产生要形成的异常通道，而当这些异常通道不像正常通道那样有效时，心脏的电恢复则需要更长的时间。这在心电图(ECG、EKG)上表现为延长的QT时间。QT延长使心脏易受多形VTs的攻击，其中的一种是快速、异常的心律，称作“尖端扭转”。
先天性LQTS是由6种基因中至少一种基因的突变所引起。
  疾病   基因   染色体   离子通道
  LQT1   KVLQT1<sup>*</sup>   11p15.5   I<sub>Ks</sub>亚单位
  LQT2   HERG   7q35-36   I<sub>Kr</sub>
  LQT3   SCN5A   3q21-24   Na
  LQT4   E1425G   4q25-27   Ca<sup>2+</sup>
  LQT5   MinK   21   I<sub>Ks</sub>亚单位
*KVLQT1的新颖突变的纯合载体具有耶-兰综合征。KVLQT1和MinK共同装配以形成IKs通道。
列于上表的LQT疾病和离子通道对于获得性LQTS和对于遗传LQTS是相同的。
应该注意到，如果在哺乳动物中存在LQTS的遗传或获得性形式，并且已出现VT的症状，那么给予化学式I的化合物，尤其是雷诺嗪，可降低VT的发生和/或频率。如果存在LQTS的遗传或获得性形式，但没有VT的症状，那么给予化学式I的化合物，尤其是雷诺嗪，可预防VT的发作。
已知戊巴比妥钠可以延长QT时间，但也降低复极化的透壁分散。它是通过最显著地抑制IKr、IKs和INa来实现。透壁分散降低表现为在心外膜和心内膜细胞中比在M细胞中具有更大延长的APD。戊巴比妥钠在M细胞中还抑制d-索他洛尔诱导的EAD活性。因而，尽管其具有延长QT的作用，但戊巴比妥并不诱导TdP。
已知胺碘酮可以延长QT并以较低的实例诱导TdP。研究发现，胺碘酮通过在心外膜和心内膜细胞中比在M细胞中表现出更大延长的APD可以降低复极化的透壁分散。胺碘酮阻断心脏中的钠、钾和钙通道。当长期给予时(30-40mg/kg/天，口服30-45天)，它还抑制IKr阻滞剂d-索他洛尔诱导复极化的明显分散或EAD活性的能力。
研究发现，在来自犬左心室的动脉灌注的楔标本中雷诺嗪优先延长心外膜(epc)细胞的APD90。研究发现在更高浓度下透壁分散的降低更显著，因为雷诺嗪还缩短M细胞的APD90同时延长心外膜细胞的APD90。
在来自犬左心室的分离肌细胞中还进行了试验以确定是否雷诺嗪诱导EADs以及雷诺嗪对后期钠电流和钙电流的作用是否能够拮抗浦肯野(Purkinje)纤维中d-索他洛尔进行的EAD诱导。在存在雷诺嗪的情况下没有观察到EADs。研究发现。雷诺嗪在低到5微摩尔/L的浓度可以抑制d-索他洛尔诱导的EADs。
还发现雷诺嗪阻断钙通道，但这是在远高于药物治疗浓度(～2至8μM)的浓度(296微摩尔/L)下进行的。
因而，即使雷诺嗪表现出延长的QT时间，它不会诱导EADs或TdP。
因为雷诺嗪可以引起延长的QT时间，因而雷诺嗪可以增加心室肌细胞的APD时程。表面EKG的QT时间反映心室复极化的时程。
研究发现，雷诺嗪降低了豚鼠肌细胞的APD(在冲洗时可逆转)。还发现在有奎尼丁的情况下雷诺嗪可以降低APD。已知奎尼丁可以触发EADs或TdP。研究发现雷诺嗪抑制奎尼丁诱导的EADs和其他触发激动。
ATXII(海葵毒素)可以放慢钠通道开放状态的失活，触发EADs，延长QT时间，以及在复极化的透壁分散中引起急速上升，这是由于在M细胞中APD更大延长的的结果。数据表明，在有ATXII的情况下雷诺嗪引起APD的减少。因而，雷诺嗪抑制由ATXII诱导的EADs。ATXII是钠离子激活剂，其与LTQ3综合征(其导致TdP)极为相似。因而，雷诺嗪并不导致TdP，而是抑制由ATX引起的TdP。
定义
如在本说明书中所使用的，下述单词和词组一般具有如以下所述的含义，除非它们在其中使用的上下文中表示其他含义。
“氨羰基甲基”指具有以下结构的基团：
Figure C0380787100331
其中A表示连接点。
“卤基”或“卤素”指氟基、氯基、溴基、或碘基。
“低级酰基”指具有以下结构的基团：
Figure C0380787100332
其中R是如本文所定义的低级烷基，而A表示连接点，并且包括这样的基团，如乙酰基、丙酰基、正丁酰基等等。
“低级烷基”指1-4个碳的无支链的饱和烃链，如甲基、乙基、正丙基、以及正丁基。
“低级烷氧基”指-OR基团，其中R是如本文所定义的低级烷基。
“低级烷基硫”指-SR基团，其中R是如本文所定义的低级烷基。
“低级烷基亚硫酰基”指以下化学式的基团：
Figure C0380787100341
其中R是如本文所定义的低级烷基，而A表示连接点。
“低级烷基磺酰基”指以下化学式的基团：
其中R是如本文所定义的低级烷基，而A表示连接点。
“N-可选取代的烷基酰氨基”指具有以下结构的基团：
Figure C0380787100343
其中R独立地是氢或低级烷基而R′是如本文所定义的低级烷基，以及A表示连接点。
术语“药物”指处方药物以及非处方药物和所有的药剂。
“异构体”指具有相同原子质量和原子序数但具有一种或多种不同物理或化学性能的化合物。化学式I的化合物的所有异构体都在本发明的范围内。
“可选的”或“可选地”指随后描述的事件或情况可能发生或可能不发生，并且该描述包括其中所述事件或情况发生的例子以及不发生的例子。
术语“治疗有效量”指化学式I的化合物的量，当给予需要这类治疗的哺乳动物时，其足以达到治疗目的，如下面所定义。治疗有效量会随受治疗者和要治疗的疾病状态、受治疗者的体重和年龄、疾病状态的严重程度、给药方式等等不同而不同，其对该领域的普通技术人员而言，很容易加以确定。
术语“治疗”或“处理”指对哺乳动物疾病的任何治疗，包括：
(i)预防疾病，即，使引起疾病的临床症状不显现；
(ii)抑制疾病，即，阻止临床症状的发展；和/或
(iii)缓解疾病，即，使临床症状消退。
心律失常指任何异常心率。心动过缓指异常缓慢的心率而心动过速指异常快速的心率。如在本文所使用的，心律失常的治疗包括治疗室上性心动过速如心房纤颤、心房扑动、AV结折返性心动过速、房性心动过速，和室性心动过速(VTs)，包括特发性室性心动过速、心室颤动、预激综合征、以及尖端扭转(TdP)。
窦性心律指正常心率。
术语“心脏受损哺乳动物”指具有心脏病理性疾病状态的哺乳动物，例如，心绞痛、充血性心力衰竭、缺血等等。
在许多情况下，由于存在氨基和/或羧基或类似的基团，本发明的化合物可以形成酸式和/或碱式盐。术语“药用盐(药学上可接受的盐)”是指这样的盐，其保留化学式I的化合物的生物功效和性能，并且其并不是在生物上或其它方面不理想的。药用碱加成盐可以通过无机碱和有机碱来制备。衍生自无机碱的盐，包括，仅作为例子的，钠盐、钾盐、锂盐、铵盐、钙盐、和镁盐。衍生自有机碱的盐，包括但不限于伯胺、仲胺、以及叔胺的盐，例如烷基胺、二烷基胺、三烷基胺、取代的烷基胺、二(取代的烷基)胺、三(取代的烷基)胺、链烯基胺、二链烯基胺、三链烯基胺、取代的链烯基胺、二(取代的烯基)胺、三(取代的烯基)胺、环烷基胺、二(环烷基)胺、三(环烷基)胺、取代的环烷基胺、二取代的环烷基胺、三取代的环烷基胺、环烯基胺、二(环烯基)胺、三(环烯基)胺、取代的环链烯基胺、二取代的环链烯基胺、三取代的环链烯基胺、芳基胺、二芳基胺、三芳基胺、杂芳基胺、二杂芳基胺、三杂芳基胺、杂环胺、二杂环胺、三杂环胺、混合的二胺和三胺，其中在胺上的至少两个取代基不同并且选自由烷基、取代的烷基、链烯基、取代的链烯基、环烷基、取代的环烷基、环链烯基、取代的环链烯基、芳基、杂芳基、杂环、以及类似物组成的组。还包括下述胺，即其中两个或三个取代基，与氨基氮一起，形成杂环基或杂芳基。
适合胺的特定实例包括，仅作为例子的如，异丙胺、三甲胺、二乙胺、三(异丙基)胺、三(正丙基)胺、乙醇胺、2-二甲氨基乙醇、三甲胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡碱、普鲁卡因、海巴明、胆碱、甜菜碱、乙二胺、葡糖胺、N-烷基葡糖胺、可可碱、嘌呤、哌嗪、哌啶、吗啉、N-乙基哌啶以及类似物。
药用酸加成盐可以通过无机酸和有机酸来制备。衍生自无机酸的盐包括盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、以及类似物的盐。衍生自有机酸的盐包括乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、苹果酸、丙二酸、丁二酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、苯乙醇酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸、以及类似物的盐。
在本文所用的“药用载体(药学上可接受的载体)”包括任何和所有的溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂、以及类似物。这类在药物活性物质方面的介质和药剂的应用是本技术领域所熟知的。除了在任何与活性成分不相容的常规介质和药剂范围内，可以设想其在治疗组合物方面的应用。辅助活性成分也可以结合到该组合物中。
药物组合物和给药
本发明的化合物通常以药物组合物的形式给予。因而本发明提供药物组合物，其含有：作为活性成分，一种或多种本发明的化合物、或其药用盐或酯，以及一种或多种药用赋形剂；载体，包括惰性固态稀释剂和填充剂；稀释剂，包括无菌水溶液和各种有机溶剂；渗透增强剂；增溶剂；以及佐剂。本发明的化合物可以单独给予或与其他治疗药剂共同给予。这样的组合物以制药技术领域中公知方式进行制备(参见，例如，Remington’s Pharmaceutical Sciences，MacePublishing Co.，Philadelphia，PA 17thEd.(1985)以及“ModernPharmaceutics”，Marcel Dekker，Inc.3rdEd.(G.S.Banker & C.T.Rhodes，Eds.))。
本发明的化合物可以通过任何具有类似效用的可接受的给药方式以单剂量或多剂量给予，例如，正如在那些结合于本文作为参考的专利和专利申请中所描述的，包括直肠、口腔、鼻内、和经皮途径，通过动脉内注射、静脉内给药、腹膜内给药、胃肠道外给药、肌内给药、皮下给药、口服、局部给药、作为吸入剂，或经过浸渍或涂布装置如支架，例如，或插入动脉的圆柱状聚合物。
一种给药方式为胃肠外给药，尤其是通过注射。本发明新型的组合物可结合于其中用于注射给药的形式，包括水或油悬浮液、或乳浊液，采用芝麻油、玉米油、棉子油、或花生油、以及酏剂、甘露醇、右旋糖、或无菌水溶液，以及类似的药物载体。通常也将盐水溶液用于注射，但在本发明中是较少优选的。也可以使用乙醇、丙三醇、丙二醇、液态聚乙二醇、及其类似物(以及其合适的混合物)、环糊精衍生物、和植物油。适当的流动性可以通过如下方法来保持，例如，包衣的使用，如卵磷脂，在分散的情况下通过保持所需要的颗粒尺寸，以及通过使用表面活性剂。可通过使用各种抗菌剂和抗真菌剂来达成预防微生物的作用，例如，对羟基苯甲酸酯类、氯代丁醇、苯酚、山梨酸、乙基汞硫代水杨酸钠、及其类似物。
可注射的无菌溶液的制备如下：在具有如上文所列举的各种其它成分的适当溶剂中加入所需量的化学式I的化合物，如果需要的话，接着通过过滤灭菌。一般，分散剂的制备如下：将各种经灭菌的活性成分加入无菌载体中，其包括基本的分散介质和以上所列举的所需的其它成分。在无菌粉末用于制备可注射无菌溶液的情况下，优选的制备方法是采用真空干燥和冰冻干燥技术，其从先前无菌过滤的溶液产生活性成分粉末以及任何额外的所需成分的粉末。
口服给药是给予化学式I的化合物的另一种途径。给药可通过胶囊或肠溶衣片剂、或类似物。在制备包括化学式I的至少一种化合物的药物组合物时，活性成分通常用赋形剂稀释和/或封装在这样的载体中，以致可以呈现胶囊剂、小药囊、纸、或其它包装物形式。当赋形剂用作稀释剂时，它可以是固体、半固体、或液体材料(如上所述)，就活性成分而言，其起到赋形剂、载体、或介质的作用。因此，该组合物的形式可以是片剂、丸剂、散剂、锭剂、小药囊、扁囊剂、酏剂、悬浮剂、乳剂、溶液、糖浆剂、气雾剂(作为固体或在液体介质中)、含有例如高达10％重量活性化合物的软膏剂、软胶囊剂和硬胶囊剂、可注射无菌溶液、以及无菌封装的散剂。
合适赋形剂的一些例子包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯树胶、磷酸钙、藻酸盐、黄芪胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、无菌水、糖浆、以及甲基纤维素。配方也包括润滑剂如滑石粉、硬脂酸镁、和矿物油；湿润剂；乳化剂和悬浮剂；防腐剂如羟苯甲酯和羟苯丙酯；甜味剂；以及增香剂。
通过采用本领域已知的方法可以配制出本发明的组合物，在对患者给药后，可提供活性成分的快速、持续、或延缓释放。用于口服给药的控释给药系统包括含有聚合物涂布的贮囊或药物-聚合物基体剂型的渗透泵系统和溶解系统。控释系统的实例在美国专利第3,845,770号、第4,326,525号、第4,902,514号、第5,616,345号、以及WO 0013687中给出。本发明使用方法的另一个配方采用透皮递药装置(“贴剂”)。这类透皮贴剂可用于提供本发明化合物在受控量下的连续或不连续注入。用于递药的透皮贴剂的结构和使用是本领域熟知的。例如，参见美国专利第5,023,252号、第4,992,445号、和第5,001,139号。这类贴剂构成用于连续、脉冲、或按需要给药。
这些组合物优选配制成单位剂型。术语“单位剂型”指物理上分离的单位，适用于人类和其它哺乳动物的单位剂量，每个单位包括预定量的活性材料，其经计算以产生所需要的治疗效应，以及合适的药物赋形剂(例如，片剂、胶囊剂、和针剂)。化学式I的化合物在宽剂量范围内是有效的，并且通常给予有效药物量。优选地，对于口服给药而言，每剂量单位含有10mg至2g的化学式I的化合物，更优选的是10至700mg，而对于胃肠外给药来说，优选的是10至700mg的化学式I的化合物，更优选的是约50至200mg。然而，需要理解的是，实际给予的化学式I的化合物的量将由医生根据相关的情况决定，包括要治疗的疾病、选择的给药途径、给予的实际化合物及其相对活性、每个患者的年龄、体重和反应、患者症状的严重程度以及类似情况。
为了制备片剂这样的固体组合物，主要的活性成分与药物赋形剂混合形成含有本发明化合物的均相混合物的固体预制剂组合物。当提到这些预制剂组合物为均相时，它是指活性成分均匀地分散到整个组合物中，从而使该组合物可以容易地细分成等效的单位剂型，如片剂、丸剂、和胶囊剂。
本发明的片剂或丸剂可以进行包衣或通过其它方式进行混合以提供剂型，其具有作用时间长，或保护免受胃的酸性条件的作用的优点。例如，片剂或丸剂可包括内部剂量成分和外部剂量成分，后者以包封的形式裹住前者。这两种成分可用肠溶层隔开，该肠溶层用于阻止成分在胃中的崩解并使得内部成分完整无损地送入十二指肠或被延缓释放。各种材料都可用于肠溶层或包衣，这些材料包括许多高分子酸以及高分子酸与紫胶、十六烷醇、和乙酸纤维素的混合物。
在一个具体实施例中，配制本发明的优选组合物，以便给予患者以后提供活性成分的快速、持续、或延迟释放，尤其是缓释剂型。本发明的最优选化合物是雷诺嗪，将其命名为(±)-N-(2，6-二甲基-苯基)-4-[2-羟基-3-(2-甲氧基苯氧基)丙基]-1-哌嗪-乙酰胺。除非另有说明，在本说明书和实施例中使用的雷诺嗪血浆浓度指的是雷诺嗪游离碱。
用于吸入剂或吹入剂的组合物包括药用溶液或有机溶剂、或其混合物、以及粉末。液体或固体组合物可以包含适当的如上文所述的药用赋形剂。优选地，这些组合物可通过口服或鼻吸入途径给予，产生局部或系统的效应。存在于优选的药用溶剂中的组合物可通过使用惰性气体进行雾化。雾化的溶液可通过雾化装置直接吸入或者雾化装置与面罩吸入器、或间歇式正压呼吸机相连。从以适当方式递送成分的装置可给予溶液、悬浮剂、或粉末组合物，优选口服或鼻内给药。
雷诺嗪的静脉内剂型是通过无菌填充方法进行制备，具体如下。在适当的容器中，将所需量的右旋糖一水合物溶解于注射用水(WFI)，其大约为最后一次投料重量的78％。在连续搅拌下，将所需量的雷诺嗪游离碱加入右旋糖溶液。为了促进雷诺嗪的溶解，用0.1N或1N盐酸溶液将溶液pH调节到指标3.88-3.92。另外，0.1NHCl或1.0N NaOH可以用来将溶液最终调节到指标pH3.88-3.92。雷诺嗪溶解后，用WFI将一次投料量调节到最终重量。在证实已满足处理过程中的规范以后，用通过两个0.2μm无菌过滤器的无菌过滤对雷诺嗪本体溶液进行灭菌。其后，无菌雷诺嗪本体溶液在无菌条件下被填充进无菌玻璃小瓶并在无菌条件下用无菌塞子塞住。然后将塞住的小瓶用清洁的顶部翻转(flip-top)的铝封层进行密封。
利用本领域技术人员熟知的方法并根据本专利披露的内容，本发明的化合物可以通过例如扩散渗入进支架，或如以凝胶形式涂布于支架。
雷诺嗪的静脉内剂型是通过无菌填充方法进行制备，具体如下。在适当的容器中，将所需量的右旋糖一水合物溶解于注射用水(WFI)，其大约为最后一次投料重量的78％。在连续搅拌下，将所需量的雷诺嗪游离碱加入右旋糖溶液。为了促进雷诺嗪的溶解，用0.1N或1N盐酸溶液将溶液pH调节到3.88-3.92的指标。另外，0.1N HCl或1.0N NaOH可以用来将溶液最终调节到目标pH3.88-3.92。雷诺嗪溶解后，用WFI将一次投料量调节到最终重量。在证实已满足处理过程中的规范以后，用通过两个0.2μm无菌过滤器的无菌过滤对雷诺嗪本体溶液进行灭菌。其后，无菌雷诺嗪本体溶液在无菌条件下被填充进无菌玻璃小瓶并在无菌条件下用无菌塞子塞住。然后将塞住的小瓶用清洁的顶部翻转的铝封层密封。
本发明的优选缓释剂型优选为压制片剂的形式，包括化合物和部分中和的pH依赖性粘合剂的紧密混合物，其中粘合剂在从胃中pH(通常大约2)到肠中pH(通常大约5.5)的范围内控制在水介质中的溶解速率。
为了保证化合物的持续释放，可以选择一种或多种pH依赖性粘合剂以控制化合物的溶解分布，这样当剂型通过胃和胃肠道时，剂型就可以缓慢并连续地释放药物。在缓释剂型中pH依赖性粘合剂的溶解控制能力特别重要，这是因为如果化合物释放太快(“剂量倾倒(dose-dumping)”)那么含有足够两次日给药的化合物的缓释剂型可引起不良副作用。
相应地，适用于本发明的pH依赖性粘合剂是那些粘合剂，其在片剂滞留在胃(此处pH是低于约4.5)中期间抑制药物从片剂快速释放，并且其在下部胃肠道(此处pH通常大于约4.5)促进从剂型释放治疗量的化合物。在制药领域已知的作为“肠溶”粘合剂和包衣材料的许多材料具有所需要的pH溶解性能。这些材料包括：苯二甲酸衍生物如乙烯基聚合物和共聚物的苯二甲酸衍生物；羟烷基纤维素、烷基纤维素、乙酸纤维素、羟烷基乙酸纤维素、纤维素醚、烷基乙酸纤维素、及其偏酯；以及低级烷基丙烯酸和低级烷基丙烯酸酯的聚合物和共聚物，及其偏酯。
可以与化合物一起使用以产生缓释剂型的优选的pH依赖性粘合剂材料是甲基丙烯酸共聚物。甲基丙烯酸共聚物是甲基丙烯酸与中性丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯(如丙烯酸乙酯或甲基丙烯酸甲酯)的共聚物。最优选的共聚物是甲基丙烯酸共聚物-C型USP(其是甲基丙烯酸和丙烯酸乙酯的共聚物，具有在46.0％和50.6％之间的甲基丙烯酸单元)。这样的共聚物可购自
Figure C0380787100431
Pharma，作为
Figure C0380787100432
L 100-55(作为粉末)或L30D-55(作为在水中的30％的分散体)。其他可以单独使用或与缓释剂型联合使用的pH依赖性粘合剂材料包括羟丙基纤维素邻苯二甲酸酯、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、醋酞纤维素、聚乙酸乙烯邻苯二甲酸酯、聚乙烯吡咯烷酮邻苯二甲酸酯、以及类似物。一种或多种pH依赖性粘合剂可存在于本发明的剂型中，其数量范围是从约1至约20wt％、更好从约5至约12wt％、并且最好约10wt％。
在口服剂型中一种或多种pH依赖性粘合剂可以用于缓释剂型。应该注意到，pH依赖性粘合剂和粘度增强剂，如羟丙基甲基纤维素、羟丙基纤维素、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、中性聚甲基丙烯酸酯、以及类似物，它们本身并不提供所需的溶解控制，其是由可识别的pH依赖性粘合剂所提供。pH依赖性粘合剂存在于本发明的剂型中，其数量范围是从约1至约10wt％、更好从约1至约3wt％、并且最好约2.0wt％。
如表1所示，本发明的优选化合物雷诺嗪在pH高于约6.5的水溶液中是相对不溶的，而在低于约pH6溶解度开始显著增加。在以下的实施例中，雷诺嗪在水中的溶液或pH高于6的溶液是由雷诺嗪二氢氯化物构成。在以下实施例的讨论部分中，雷诺嗪的浓度(作为实验的结果而得出)计算为雷诺嗪游离碱。
表1
  溶液pH   溶解度(mg/mL)  USP溶解度等级
  4.81   161   易溶
  4.89   73.8   可溶
  4.90   76.4   可溶
  5.04   49.4   可溶
  5.35   16.7   略微可溶
  5.82   5.48   微溶
  6.46   1.63   微溶
  6.73   0.83   极微溶
  7.08   0.39   极微溶
  7.59(非缓冲水)   0.24   极微溶
  7.79   0.17   极微溶
  12.66   0.18   极微溶
在剂型中增加pH依赖性粘合剂含量可在pH低于4.5(是胃中pH的特征)时降低化合物的缓释剂型的释放速率。由粘合剂形成的肠溶性包衣是较少可溶的并在高于pH4.5可增加相对释放速率，其中化合物的溶解度较低。pH依赖性粘合剂的适当选择便于在pH4.5之上化合物从剂型有更快的释放速率，同时显著影响在低pH时的释放速率。粘合剂的部分中和促进粘合剂转化成胶乳状薄膜，其围绕各个颗粒而形成。相应地，选择pH依赖性粘合剂的类型和数量及部分中和组合物的量以精密控制化合物自剂型的溶解速率。
本发明的剂型应具有足量的pH依赖性粘合剂以产生缓释剂型，从该缓释剂型可以控制化合物的释放速率，以致在低pHs(低于约4.5)溶解速率显著变慢。在甲基丙烯酸共聚物C型USP(
Figure C0380787100441
L 100-55)的情况下，适当数量的pH依赖性粘合剂是在5％和15％之间。pH依赖性粘合剂通常具有从约1至约20％的粘合剂甲基丙烯酸，其中羧基被中和。然而，优选地，中和程度的范围是从约3至6％。缓释剂型也可以含有与化合物和pH依赖性粘合剂紧密掺合的药物赋形剂。药用赋形剂可以包括，例如，pH依赖性粘合剂或成膜剂如羟丙基甲基纤维素、羟丙基纤维素、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、中性聚甲基丙烯酸酯(例如，甲基丙烯酸甲酯/丙烯酸乙酯共聚物，由
Figure C0380787100451
Pharma在商标NE下进行出售)、淀粉、明胶、糖类、羧甲基纤维素、以及类似物。其他有用的药物赋形剂包括：稀释剂如乳糖、甘露醇、干淀粉、微晶纤维素等等；表面活性剂如聚氧乙烯山梨醇酐酯、山梨醇酐酯等等；以及着色剂和增香剂。也可选地存在润滑剂(如滑石粉和硬脂酸镁)和其他压片助剂。
本发明的缓释剂型的化合物含量按重量计算较好为约50％至约95％或更多、更好在约70％至约90％之间、并且最好从约70至约80％；pH依赖性粘合剂含量在5％和40％之间、优选在5％和25％之间、并且更优选在5％和15％之间；而剂型的剩余部分包括pH依赖性粘合剂、填充剂、以及其他可选的赋形剂。本发明的一些优选缓释剂型列于下面的表2。
表2
                        重量      优选的重量    最优选的重量
成分
                        范围(％)  范围(％)      范围(％)
活性成分                0-95      70-90         75
微晶纤维素(填充剂)      1-35      5-15          10.6
甲基丙烯酸共聚物        1-35      5-12.5        10.0
氢氧化钠                0.1-1.0   0.2-0.6       0.4
羟丙基甲基纤维素        0.5-5.0   1-3           2.0
硬脂酸镁                0.5-5.0   1-3           2.0
本发明的缓释剂型的制备如下：紧密混合(干混合)化合物和pH依赖性粘合剂以及任何可选的赋形剂。然后在有强碱水溶液的情况下使干混合的混合物成颗粒，其中强碱水溶液是喷到混合的粉末。颗粒被干燥，筛选，与可选的润滑剂(如滑石粉或硬脂酸镁)混合，然后压制成片剂。优选的强碱水溶液是碱金属氢氧化物溶液，如氢氧化钠或氢氧化钾水溶液，优选氢氧化钠水溶液(可选地含有高达25％的水混溶溶剂如低级醇)。
生成的片剂可以涂布以可选的成膜剂，用于识别、掩蔽味道、以及使吞咽更容易。成膜剂通常存在的数量范围是在片剂重量的2％和4％之间。适当的成膜剂是本技术领域公知的并且包括羟丙基甲基纤维素、阳离子甲基丙烯酸酯共聚物(二甲基氨乙基甲基丙烯酸酯/甲基丁基甲基丙烯酸酯共聚物-
Figure C0380787100461
E，
Figure C0380787100462
Pharma)、以及类似物。这些成膜剂可以可选地含有着色剂、增塑剂、以及其他辅助成分。
优选地，压制片剂具有足以耐8Kp压力的硬度。片剂大小将主要取决于在片剂中化合物的量。这些片剂将包括300至1100mg的化合物游离碱。优选地，这些片剂所含化合物游离碱的数量范围是400-600mg、650-850mg、以及900-1100mg。
为了影响溶解速率，对湿式混合含化合物的粉末的时间进行控制。优选地，总的粉末混合时间，即粉末暴露于氢氧化钠溶液的时间，将在1-10分钟的范围内，并且优选2-5分钟。在成粒以后，从颗粒机取出颗粒并放置在约60℃的流化床干燥器中进行干燥。
已经发现，这些方法产生缓释剂型，当化合物作为其游离碱而不是作为药用上更常见的二氢氯化物盐或作为另一个盐或酯时，这些缓释剂型在给药后提供较低的峰值血浆水平但有效的化合物血浆浓度高达12小时和更长。游离碱的使用提供至少一个优点：在片剂中化合物的比例可以增加，因为游离碱的分子量仅为二氢氯化物重量的85％。已这种方式，可以实现递送有效量的化合物，同时限制剂量单位的物理大小。
效用和试验
本方法可有效治疗对同时抑制IKr、IKs及后期INa通道有反应的疾病。这种疾病包括VT，以特发性室性心动过速、心室颤动、预激综合征、及尖端扭转为例。
如在以下实施例中所描述的，进行活性试验，并用对本领域技术人员来说显而易见的方法。
下述实施例用来说明本发明。这些实施例绝不是限制本发明的范围，而是表明如何制备和应用本发明的化合物。在这些实施例中，所有温度都是摄氏温度。
下述实施例说明了含有化学式I的化合物的典型药物剂型的制备。
实施例1
制备含有以下成分的硬质胶囊：
数量
成分                                (mg/胶囊剂)
活性成分                            30.0
淀粉                                305.0
硬脂酸镁                            5.0
混合以上成分并填充进入硬质凝胶胶囊中。
实施例2
用以下成分制备片剂：
成分                        (mg/片剂)
活性成分                    25.0
纤维素，微晶                200.0
胶体二氧化硅                10.0
硬脂酸                      5.0
将成分混合并挤压以形成片剂。
实施例3
制备含有以下成分的干粉吸入剂型：：
成分                        重量％
活性成分                    5
乳糖                        95
将活性成分与乳糖混合，而混合物则加入干粉吸入装置。
实施例4
每个含有30mg活性成分的片剂的制备如下：
数量
成分                        (mg/片剂)
活性成分                    30.0mg
淀粉                        45.0mg
微晶纤维素                  35.0mg
聚乙烯吡咯烷酮
                            4.0mg
(作为10％的无菌水溶液)
羧甲基淀粉钠                4.5mg
硬脂酸镁                    0.5mg
滑石粉                      1.0mg
总计                        120mg
活性成分、淀粉、和纤维素通过一个20目美国筛(No.20meshU.S.sieve)并彻底地进行混合。聚乙烯吡咯烷酮溶液与生成的粉末混合，然后通过一个16目美国筛(No.16mesh U.S.sieve)。如此制备的颗粒在50℃至60℃干燥，并通过一个16目美国筛。先前通过30目美国筛的羧甲基淀粉钠、硬脂酸镁、和滑石粉加入到颗粒中，混合后，在压片机上进行挤压以得到每个重量为120mg的片剂。
实施例5
每个含有25mg活性成分的栓剂的制备如下：
成分                        含量
活性成分                    25mg
饱和脂肪酸甘油酯，达        2,000mg
活性成分通过60目美国筛并悬浮在饱和脂肪酸甘油酯中，该脂肪酸甘油酯利用所需的最低热量进行熔化。然后，将混合物注入公称2.0g的栓剂模具中并使其冷却。
实施例6
每个含有50mg活性成分/5.0mL剂量的混悬剂的制备如下：
成分                        含量
活性成分                    50.0mg
黄原胶                      4.0mg
羧甲基纤维素钠(11％)
                            50.0mg
微晶纤维素(89％)
蔗糖                        1.75g
苯甲酸钠                    10.0mg
香料和着色剂                按所需之量
净化水，达                  5.0mL
将活性成分、蔗糖、和黄原胶进行混合，通过10目美国筛，然后与先前制备的微晶纤维素和羧甲基纤维素钠的水溶液混合。搅拌加入用水稀释的苯甲酸钠、香料、与着色剂。然后加入足够的水以生成所需要的容积。
实施例7
皮下剂型可制备如下：
成分                            数量
活性成分                        5.0mg
玉米油                          1.0mL
实施例8
制备注射用制剂，其具有下述组分：
成分                            含量
活性成分                        2.0mg/ml
甘露醇，美国药典(USP)           50mg/ml
葡萄糖酸，美国药典(USP)         适量(pH5-6)
水(蒸馏，无菌)                  适量至1.0ml
氮气，美国处方集(NF)            适量
实施例9
制备局部用制剂，其具有以下组成：
成分                            克
活性成分                        0.2-10
山梨糖醇酯类(Span 60)           2.0
吐温(Tween 60)                  2.0
矿物油                          5.0
凡士林                          0.10
羟苯甲酸甲酯(methyl paraben)    0.15
对羟苯甲酸丙酯(propyl paraben)  0.05
BHA(丁基化羟基苯甲醚)           0.01
水                              适量至100
除水之外，合并所有上述其它成分并加热到60℃，同时搅拌。然后，在60℃下加入足量的水，同时剧烈搅拌，以便对成分进行乳化，然后加入适量至100g的水。
下述实施例证明本发明的化合物的效用。
实施例10
I.在来自犬左心室的分离肌细胞、组织和动脉灌注的楔标本中雷诺嗪的电生理效应
A.材料和方法
用肝素(180IU/kg)对体重20-25kg的狗进行抗凝然后用戊巴比妥(30-35mg/kg，静脉注射)进行麻醉。通过左开胸术打开胸部，切除心脏并放在冷心脏麻痹液中([K+]0＝8mmol/L，4℃)。所有实验方案与动物护理和使用委员会(Institutional Aminal Care and UseCommittee)建立的准则一致。
1.对分离的犬心室肌细胞的电压钳研究
肌细胞是通过酶分离分离自由左旋支冠状动脉提供的左心室游离壁的楔形切片。在本研究中使用来自左心室的心外膜和中心肌区域的细胞。
在分离中使用的蒂罗德溶液含有(单位mM)：135NaCl、5.4KCl、1MgCl2、0或0.5CaCl2、10葡萄糖、0.33NaH2PO4、10N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸(HEPES)，而pH用NaOH调节到7.4。
向内整流钾电流(IK1)、缓慢延迟的整流钾电流(IKS)、以及快速延迟的整流钾电流(IKr)在37℃下利用传统的全细胞电压钳构型进行记录。用来分离特定离子电流的外部溶液和吸管溶液的组成总结于表3。
表3
Figure C0380787100521
IK1是利用外部溶液进行测量，外部溶液含有3μM哇巴因苷元和5μM硝苯地平以分别阻断钠-钾泵和L型钙电流(ICa，L)。IKs的测量是在有5μM E-4031和5μM硝苯地平的情况下进行以阻断IKr和ICa。当记录IKr时，在外部溶液中存在5μM硝苯地平。
分离的肌细胞放置在倒置显微镜载物台上的温度受控的0.5ml室中(Medical System，Greenvale，NY)并以2ml/min的速率超融合。距离细胞100μm放置的8套管石英微支管(ALA ScientificInstruments公司，Westbury，NY)被用来施加雷诺嗪，浓度(单位μM)为：0.1、0.5、1.0、5.0、10、及100.0。以电压钳方式操作Axopatch 1D放大器(Axon Instruments，Foster City，CA)以记录电流。全细胞电流在5kHz下用3极低通Bessel滤波器进行滤波，在2-5kHz之间进行数字化(Digidata 1200A，Axon Instruments)存储于计算机。使用Clampex 7获取和分析软件(Axon Instruments)来记录和分析离子电流。吸管尖端电阻是1.0-2.0MΩ而密封电阻大于5GΩ。串联电阻的电子补偿平均为76％。对本文报道的电压作膜片(patch)电极尖端电位方面的校正。细胞膜和膜片吸管之间的密封最初形成在含有1mM CaCl2的外部溶液中。3M KCl-琼脂桥被用在Ag/AgCl接地电极和外部溶液之间以避免在切换到实验溶液时产生地电位。
通过从-50mV的保持电势去极化到40mV 3sec、接着复极化步骤到0mV(4.5sec)来诱导IKs。由复极化诱导的时间相关尾电流被称为IKs。这种实验方案每20sec重复5次。Ito未受到阻断，但它对我们的IKs测量结果几乎没有影响，原因在于其快速和完全失活。所有测量结果是在斑点破裂后5-12分钟(min)获得，因为在此期间没有观察到显著的IKs减少。
IKr是测量为时间相关尾电流，其是在-40mV的电位在较短的250ms去极化脉冲至30mV以后所诱导。数据表示为平均值±标准平均误差。IKr是在900msec电压步骤(施加自-40mV的保持电势)至试验电位(在-100mV至0mV的范围内)期间所记录，并且被称为在试验脉冲末端的稳定电流的5msec平均值。
2.在分离犬心室心外膜和M区域组织中动作电位研究
心外膜和中心肌(M)细胞标本(大约1×0.5×0.15cm的条)是分离自左心室。组织薄片放置在组织浴(5ml容积，流速为12ml/min)中允许平衡至少4小时，同时用充氧蒂罗德溶液(pH＝7.35，t0＝＝37±0.5℃)进行超融合并利用场刺激置于2Hz的基础周长(BCL)。蒂罗德溶液的组成(单位mM)为：NaCl 129、KCl 4、NaH2PO40.9、NaHCO320、CaCl21.8、MgSO40.5、及D-葡萄糖5.5。
动作电位记录：跨膜电位是利用标准玻璃微电极进行记录，其中微电极填充以2.7M KCl(10-20MΩ DC电阻)并连接于高输入阻抗放大系统(World Precision Instruments，Sarasota，FL，美国)。放大信号显示于Tektronix(Beaverton，OR，美国)示波器并放大(型号1903-4可编程放大器[Cambridge Electronic Designs(C.E.D.)，Cambridge，英国])，数字化(型号1401AD/DA系统[C.E.D.])，分析(Spike 2获取和分析模块[C.E.D.])，并存储于磁性介质。
研究实验方案：动作电位是记录自心外膜和M细胞参数。对照记录是在4-6小时平衡期以后获得。在1、5、10、50、及100μM的浓度测定了雷诺嗪的影响，其中在加入每种药物浓度以后30分钟开始记录。雷诺嗪作用的速率相关性是在300、500、800、1000、2000、5000msec的基础起搏周长(BCL)下通过记录跨膜动作电位来测定。提供了在500和2000msec基础周长下记录的数据。
测量了以下动作电位参数：
1)在50％和90％复极化时的动作电位时程。
2)振幅
3)过冲
4)静息膜电位
5)动作电位(Vmax)的上升支的上升速率
Vmax是在对照条件下以及在有10和100μM雷诺嗪的情况下进行记录。Vmax是在BCL为500msec的条件下进行测量。
因为已知低细胞外钾离子可促进药物诱发APD延长和早期后除极，因而进行了两套分开的实验，一组在正常[K+]0(4mM)而另一组具有较低[K+]0(2mM)。
3.在动脉灌注犬左心室楔标本中动作电位研究
尺寸大约为12mm×35mm×12mm的透壁左心室楔是解剖自左心室壁的中部至基底前区域而左前下行冠状动脉的对角分支被插上套管以递送灌注液(蒂罗德溶液)。蒂罗德溶液的组成(单位mM)为：NaCl 129、KCl 4、NaH2PO4 0.9、NaHCO3 20、CaCl2 1.8、MgSO40.5、以及D-葡萄糖5.5；pH＝7.4。利用含有2mM KCl的蒂罗德溶液进行了一组单独的实验。
跨膜动作电位是利用浮动微电极记录自心外膜(EPI)和心内膜下区域(M)。透壁假心电图(ECG)是利用两个K-琼脂电极(1.1mm，内径)进行记录，其中K-琼脂电极是置于离标本的心外膜(+)和心内膜(-)表面大约1cm处并沿着与跨膜记录相同的轴。
允许心室楔在室中平衡2小时，同时利用接触心内膜表面的银双向电极在2000msec的基础周长进行起搏。在缺血达到40-50mmHg的灌注压之前设定恒定的流速。通过用同样的加热器/循环浴加热灌注液和邻近的围绕组织腔的水室，温度维持在37±0.5℃。组织腔的顶部未覆盖部分在每次实验中用塑料板覆盖其表面的约75％以进一步防止热损失；剩余的25％保持未覆盖以安置和操作ECG电极和浮动微电极。在整个实验期间标本被完全浸泡在细胞外溶液中。
QT时间定义为在QRS复合波的初期偏移和接近T波的未端部分的最陡斜部分的切线穿过等电位线的点之间的时间间隔。
B.研究实验方案
实验系列1：为了测定复极化时间(在50和90％复极化[分别为APD50和APD90]时的动作电位时程和QT时间[ECG])的变化以及在用雷诺嗪(1-100μM的浓度范围)灌注标本后组织对心律失常发生的易伤性。[K+]0＝4mM。
跨膜动作电位是利用玻璃浮动微电极记录自心外膜(Epi)、心内膜下区域(M区域)。同时记录透壁ECG。
a.稳态刺激：基础周长(BCL)是从300到2000msec不等以检查雷诺嗪浓度为1、5、10、50、和100μM时复极化时间(APD和ECG)的速率相关变化。
b.程序性电刺激(PES)：在给予每个药物浓度前后对心外膜表面施加过早刺激以诱导心律失常。在2000msec的循环时间之内，在每个第五或第十个基本搏动(S1)之后供给单脉冲(S2)一次。S1-S2偶联间期逐渐减小直到遇到不应性(S2刺激是2-3msec时程，强度等于舒张阈值的3-5倍)。
实验系列2：为了测定复极化时间(在50和90％复极化[分别为APD50和APD90]时的动作电位时程和QT时间[ECG])的变化以及在用雷诺嗪(1-100μM的浓度范围)灌注标本后标本对心律失常发生的易伤性。[K+]0＝2mM。
a.稳态刺激：在基础周长(BCL)为500和2000的条件下进行。
b.程序性电刺激(PES)：见上文。
药物：雷诺嗪二氢氯化物用100％蒸馏水稀释成50mM的储备溶液。对于每个实验制备新鲜的药物。
统计：利用单向重复测量方差分析(ANOVA)再加上Bonferroni检验进行统计分析。
实施例11
雷诺嗪对I Kr 、I Ks 、以及I K1 的影响
雷诺嗪以浓度依赖方式抑制IKr和IKs，但并不改变IK1。IKr是测量为在-40mV、在250msec激活脉冲至30mV之后的时间依赖性尾电流。图3A表示在对照溶液中和在50μM雷诺嗪之后记录的电流。IKr几乎被该浓度的雷诺嗪完全阻断。图3B表示抑制IKr尾电流的浓度-反应关系曲线，其中IC50为11.5μM。
IKs由3sec步骤至+40mV所诱导并测量为在后退至0mV之后所记录的峰值时间依赖性尾电流。图4A所示的是在对照条件下、在100μM雷诺嗪之后、以及在冲洗药物之后所记录的电流。雷诺嗪(100μM)主要消除在0mV记录的尾电流并且这种效应在冲洗后被完全逆转。抑制IKs尾电流的浓度-反应关系曲线说明于图4B，其中指出IC50为13.4μM。
向内整流电流IK1是利用穿孔膜片电压钳技术进行记录。图5A显示在-100和0mV电压之间(以10mV间隔递增)、在对照条件下(左图片)以及在有100μM雷诺嗪的情况下所记录的IK1。在此和5个类似实验中，雷诺嗪并不改变向内整流电流。图片B标出复合数据，说明电流-电压关系，其构造自在每个试验脉冲的未端测量的平均电流。
实施例12
在分离犬心室组织中动作电位研究
在[K+]0＝4mM和BCL＝2000msec时，雷诺嗪引起M细胞标本中APD50和APD90的浓度依赖性缩短(图6)。在某些标本中，雷诺嗪产生双相效应：在低浓度时延长APD而在高浓度时则缩短APD(图4A)。心外膜复极化较少受该药物的影响，显示倾向于APD延长。在中等雷诺嗪浓度下复极化的透壁分散被减少而在更高浓度下则几乎被消除。
在BCL为500msec时，雷诺嗪引起心外膜组织中APD的浓度依赖性延长而在M细胞标本中则引起APD的浓度依赖性缩短。在浓度为100μM时，心外膜APD超过M细胞的APD。从而，复极化的透壁分散被减少或消除。在雷诺嗪的最高浓度(100μM)，透壁复极化梯度发生逆转。值得注意的是，在心外膜标本中雷诺嗪诱导APD90的使用依赖性延长，即，在更快的速率下延长更大(图6和图7)。
为了评估雷诺嗪对INa的作用，测量了动作电位(Vmax)的上升支的上升速率。雷诺嗪引起Vmax的下降。这种效应在10μM时是适中的(n.s.)，但在100μM雷诺嗪的情况下则更显著(图8)。
在高达50μM的浓度时，在M细胞标本中雷诺嗪对振幅、过冲、以及静息膜电位产生很小至没有影响(表4)。
表4
雷诺嗪(单位：μM)
BCL＝500msec
 对照   1.0   5.0   10.0   50.0   100.0
  振幅  107±14   109±9   114±8   113±9   104±7   91±19<sup>*</sup>
  RMP  -86±5   -86±3   -86±3   -86±2   -86±5   -86±7
  过冲  21±13   23±10   27±7   25±8   19±3   9±13
数据表示为平均值±标准误差，对所有试验组，n＝5，*-p＜0.05，与对照比较
在试验的最高剂量(100μM)下，雷诺嗪引起0相位振幅的下降。动作电位的过冲以及静息膜电位被降低，虽然这些并没有达到统计显著性。
在心外膜标本中，雷诺嗪对静息膜电位、过冲、以及0相位振幅产生很小至没有影响(表5)。
表5
雷诺嗪(单位：μM)
BCL＝500msec
  对照   1.0   5.0   10.0   50.0   100.0
  振幅   95±3   93±5   101±2   94±5   86±12   93±3
  RMP   -84±3   -84±4   -89±1   -88±2   -86±1   -85±3
  过冲   11±2   10±4   12±3   8±4   0±11   8±4
数据表示为平均值±标准误差，除100.0μM雷诺嗪(n＝2)之外，n＝4。在剩余的两个心外膜标本中，100.00μM雷诺嗪产生过度的APD延长，导致复极化交替和/或2∶1反应。
在有低[K+]0和慢速率(BCL＝2000msec)的情况下，雷诺嗪并不引起M细胞的APD90发生显著变化，但引起APD50浓度依赖性缩短(图9)。相反，在心外膜中，该药物几乎没有引起APD50的变化，但引起APD90的浓度依赖性延长。复极化的透壁分散显著减弱。
在BCL为500msec时，雷诺嗪几乎没有引起M细胞的复极化的变化，但在心外膜中引起APD90的显著浓度依赖性延长(图10)。
实施例13
在动脉灌注犬左心室楔标本中动作电位研究
图11中的每个图片显示：在基础周长(BCL)为2000msec时以及在不存在和存在雷诺嗪(1-100μM)的情况下，记录自动脉灌注犬左心室楔标本的中心肌(M区域)和心外膜(Epi)的ECG和跨膜动作电位。该药物的这些效应是用含有4mM(左图片)或2mM(右图片)KCl的冠状灌注液进行研究。
在存在4mM KCl的情况下，雷诺嗪并不显著改变APD90，但在高浓度药物(50和100μM)下则显著减少APD50。相反，在存在2mM KCl的情况下，在浓度为5-100μM时雷诺嗪显著延长APD90，但在任何浓度下并不显著改变APD50(表6)。
在[K+]0为4mM时，雷诺嗪延长心外膜的APD90大于延长M细胞的APD90。因此，复极化的透壁分散被降低，虽然这并没有达到显著水平。在[K+]0为2mM时，雷诺嗪延长M细胞的APD90大于延长心外膜的APD90，这导致复极化的透壁分散的增加，其也没有达到显著水平(表7)。
图12显示雷诺嗪对APD90和QT时间(顶部图片)以及对APD50(底部图片)的浓度依赖效应的复合数据。在[K+]0为4mM的情况下，在任何药物浓度下QT和APD90几乎不受影响；在50和100μM浓度下APD50显著缩短。在[K+]0为2mM的情况下，在雷诺嗪浓度大于5μM时，M细胞的QT和APD50稍微延长，而APD50几乎不受影响。
表6
犬左心室楔：4mM[KCl]0，BCL＝2000
Figure C0380787100611
*p＜0.05，与对照比较n≤4
表7
犬左心室楔：2mM[KCl]0，BCL＝2000
Figure C0380787100621
*p＜0.05，与对照比较n≤4
表8强调以下事实：并未观察到自发地产生尖端扭转心律失常，在任何涉及犬左心室楔标本的程序下它们也不能由程序性电刺激所诱导。在对照条件下或在任何浓度的雷诺嗪以后没有观察到心律失常。
表8
雷诺嗪诱导的尖端扭转
  自发的   刺激诱导的
  雷诺嗪(1-100μM)4mM[K<sup>+</sup>]<sub>0</sub>   0/4   0/4
  雷诺嗪(1-100μM)2mM[K<sup>+</sup>]<sub>0</sub>   0/3   0/3
在用任何浓度的雷诺嗪进行预处理的组织或楔标本中既没有观察到早期后除极也没有观察到延迟后除极。实际上，雷诺嗪证明是可有效抑制通过M细胞标本暴露于其他IKr阻滞剂(如d-索他洛尔)所诱导的EADs，如图13所说明的。D-索他洛尔产生复极化的显著延长并在M细胞标本中诱导EADs。雷诺嗪浓度依赖性地缩短动作电位并消除EADs。在4/4M细胞标本中观察到雷诺嗪(5-20μM)抑制EAD活性和缩短APD的类似效应。
实施例14
II.在分离的犬左心室肌细胞中雷诺嗪对后期INa、ICa、Ito、以及INa-Ca的电生理效应
A.材料和方法
1.对分离的犬心室肌细胞的电压钳研究
给予成年雄性杂种狗180IU/kg肝素(钠盐)，然后用35mg/kg(静脉注射)戊巴比妥钠进行麻醉，其心脏被快速切除并放在蒂罗德溶液中。单肌细胞是通过酶分离获自由左旋支冠状动脉提供的左心室游离壁的楔形切片。使用了来自左心室的心外膜和中心肌区域的细胞。所有程序与动物护理和使用委员会建立的准则一致。
在分离中使用的蒂罗德溶液含有(单位mM)：135NaCl、5.4KCl、1MgCl2、0或0.5CaCl2、10葡萄糖、0.33NaH2PO4、10N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸(HEPES)，而pH用NaOH调节到7.4。
在37℃下利用标准膜片电极记录了L型钙电流(ICa)、瞬变向外电流(Ito)、以及钠-钙交换电流(INa-Ca)。外部溶液和吸管溶液的组成分别示于表9和表10。后期INa是利用穿孔膜片技术进行记录。
表9
外部溶液
  I<sub>NaCa</sub>、I<sub>Na，late</sub>、及I<sub>Ca</sub>全细胞/穿孔膜片(mM)   I<sub>to</sub>全细胞(mM)
  10葡萄糖   10葡萄糖
  -   4KCl
  1MgCl<sub>2</sub>   1MgCl<sub>2</sub>
  2CaCl<sub>2</sub>   2CaCl<sub>2</sub>
  140甲磺酸钠   140N-甲基-D-葡糖胺-Cl
  10HEPES   10HEPES
  用甲磺酸调节到pH7.4   用HCl调节到pH7.4
表10
内部溶液
  I<sub>Na，late</sub>穿孔膜片(mM)   I<sub>Ca</sub>全细胞(mM)   I<sub>NaCa</sub>全细胞(mM)   I<sub>to</sub>全细胞(mM)
  135天冬氨酸铯   140天冬氨酸铯   140天冬氨酸铯   130天冬氨酸钾
  0.010CaCl<sub>2</sub>   -   -   20KCl
  10NaOH   10NaOH   10NaOH   -
  1MgCl<sub>2</sub>   1MgCl<sub>2</sub>   1MgCl<sub>2</sub>   1MgCl<sub>2</sub>
  -   5MgATP   5MgATP   5MgATP
  10HEPES   10HEPES   10HEPES   10HEPES
  -   10EGTA   0.1EGTA   5EGTA
  用CsOH调节到pH7.1   用CsOH调节到pH7.1   用CsOH调节到pH7.1   用KOH调节到pH7.1
将分离的细胞放置在倒置显微镜载物台上的温度受控的0.5ml室中(Medical System，Greenvale，NY)并以2ml/min的速率进行超融合。距离细胞100μm放置的10套管石英微支管(ALA ScientificInstruments公司，Westbury，NY)被用来施加雷诺嗪、河豚毒素(TTX)、或镉。以电压钳方式操作Axopatch 200A放大器(AxonInstruments，Foster City，CA)以在37℃下记录电流。全细胞电流在5kHz下用4极低通Bessel滤波器进行滤波，在2-5kHz之间进行数字化(Digidata 1200A，Axon Instruments)并存储于计算机。使用pClamp 8.2软件(Axon Instruments)来记录和分析离子电流。吸管尖端电阻是1.0-1.5MΩ而密封电阻大于5GΩ。串联电阻的电子补偿平均为76％。对报道的电压作膜片电极尖端电位方面的校正。细胞膜和膜片吸管之间的密封最初形成在含有1mM CaCl2的蒂罗德溶液中。3M KCl-琼脂桥被用在Ag/AgCl接地电极和外部溶液之间以避免在切换到实验溶液时产生地电位。
在水中制备河豚毒素(TTX)并以1∶100的比例稀释，以在外部溶液中获得10μM的最终浓度。在水中制备50mM浓度的雷诺嗪并在外部溶液中稀释到1-800μM范围内的最终浓度。
ICa被定义为峰值向内电流减去在试验脉冲末端的电流。外部溶液含有10μM TTX以阻断后期INa的稳定态分量。在诱发800ms斜线上升至-60mV以及15ms步骤至-50mV以灭活钠通道和保持电压控制之前细胞在-90mV静息20秒，后面立即是500ms步骤至0mV以记录对照溶液中的ICa。这种程序以0.5Hz的速率对每个药物浓度重复5次。雷诺嗪的稳态效应测量为在序列的第5脉冲期间ICa的分数变化。在半对数尺度上画出了ICa的变化对药物浓度的关系曲线并拟合到对数方程。
后期INa被定义为在试验脉冲至-30mV的最后5ms内所测量的平均TTX敏感电流。在500ms脉冲的起初发生的电压控制的瞬时损失并不影响在脉冲的末端测量的电流。一系列以1Hz速率重复的500ms脉冲被用来测定稳态阻断。在半对数尺度上标绘出在第10个脉冲期间后期INa的下降，其是作为药物浓度的函数，并且拟合到对数方程。
Ito是在存在300μM CdCl2(以阻断ICa)的情况下进行记录，并且被定义为峰值向外电流减去在试验脉冲末端的稳定电流。保持电势是-80mV并在诱发100ms脉冲至-10、0、及10mV之前进行5ms脉冲至-50mV，其是以0.1Hz的速率进行重复。在加入每个药物浓度4分钟以后评估了雷诺嗪的效应。结果没有标绘成对数函数，因为雷诺嗪对Ito具有最低效应。作为替代，所有结果表示为平均值±标准误差。双尾t检验用来确定平均值之间的差异。
为了借助于正常钙瞬变状态引发INa-Ca，3ms脉冲至-50mV之后是5ms步骤至0mV以激活ICa和钙瞬变状态。此两步骤程序后面立即是到-80mV的脉冲以记录INa-Ca。INa-Ca被看作是传输的总电荷(pA x ms)。电压钳程序之前是一系列10个脉冲至20mV，其以0.5Hz的速率传送并继之以6秒的静息以维持SR的钙负荷。在半对数尺度上标绘出INa-Ca的下降，其是作为药物浓度的函数，并且拟合到对数方程。
实施例15
图14A显示在对照溶液中以及在20μM雷诺嗪加入外部溶液4分钟后的TTX敏感电流。图14B显示类似实验的概括结果，其中雷诺嗪(5-50μM)被加入外部溶液。后期INa的半抑制发生在21μM的药物浓度。
在-10、0、及10mV的试验电势测定了雷诺嗪对Ito的影响。Ito是非常耐雷诺嗪的抑制作用。图15显示在对照溶液中(左图片)和在加入50μM雷诺嗪4分钟后所记录的电流。药物将峰值Ito减少不足10。
在10mV时，浓度为50μM的雷诺嗪将Ito减少10±2％(6个细胞，p＜0.001)。在-10和0mV时雷诺嗪的影响并没有达到显著程度。在试验电势0和10mV时，浓度为100μM的雷诺嗪分别将Ito减少16±3％和17±4％(7个细胞，p＜0.001)。在任何试验电压下，浓度为10μM(9个细胞)和20μM(9个细胞)的雷诺嗪没有影响。示于图16的结果被归一化到每个对照电流并总结于图17。
图18的顶部图片显示在对照溶液中、在加入100μM雷诺嗪4分钟以后、以及在回到对照溶液以后INa-Ca的重叠轨迹。图18的下部图片显示获自3-14个细胞的浓度-反应曲线。雷诺嗪抑制INa-Ca的IC50是91μM。
图19显示在单个图形中IKr、IKs、ICa、后期INa、以及INaCa的浓度-反应曲线。在试验的最高浓度(100μM)Ito的抑制不足以产生完整的曲线。IKr、IKs、及后期INa显示类似的对雷诺嗪的敏感性。
实施例16
III.在分离的犬浦肯野纤维中雷诺嗪的电生理效应
A.材料和方法
用肝素对体重20-25kg的狗进行抗凝然后用戊巴比妥(30-35mg/kg，静脉注射)进行麻醉。通过左开胸术打开胸部，切除心脏并放在冷心脏麻痹液中([K+]0＝8mmol/L，4℃)。自由流动的浦肯野纤维是分离自左心室和右心室。标本是放置在组织浴(5ml容积，流速为12ml/min)中并允许平衡至少30分钟，同时用充氧蒂罗德溶液(pH＝7.35，t0＝37±0.5℃)进行超融合并利用点刺激置于1Hz的基础周长(BCL)。蒂罗德溶液的组成(单位mM)如下：NaCl 129、KCl 4、NaH2PO40.9、NaHCO320、CaCl21.8、MgSO40.5、及D-葡萄糖5.5。
动作电位记录：跨膜电位是利用标准玻璃微电极进行记录，其中微电极填充以2.7M KCl(10-20MΩ DC电阻)并连接于高输入阻抗放大系统(World Precision Instruments，Sarasota，FL，美国)。放大信号显示于Tektronix(Beaverton，OR，美国)示波器并放大(型号1903-4可编程放大器[Cambridge Electronic Designs(C.E.D.)，Cambridge，英国])，数字化(型号1401 AD/DA系统[C.E.D.])，分析(Spike 2获取和分析模块[C.E.D.])，然后存储于磁性介质(个人计算机)。
B.研究试验方案
对照记录是在30分钟平衡期以后获得。测定了雷诺嗪的增加的浓度(1、5、10、50、以及100μM)，其中在加入每种药物浓度以后20分钟开始记录。雷诺嗪作用的速率相关性是在300、500、800、1000、2000、及5000msec的基础周长(BCL)下通过记录动作电位来评估。在本报告中，仅提供500和2000msec基础周长，作为相对快速和缓慢起搏速率的代表。
测量了以下动作电位参数：
a.在50％(APD50)和90％(APD90)复极化时的动作电位时程。
b.振幅
c.过冲
d.静息膜电位
e.动作电位(Vmax)的上升支(upstroke)的上升速率。
因为已知低细胞外钾离子可促进药物诱发APD延长和早期后除极，我们在有正常(4mM)和低(3mM)[K+]0的情况下测定了雷诺嗪的效应。
在最后阶段种，我们评定了雷诺嗪对由d-索他洛尔(100μM)、一种相当特异的IKr阻滞剂所诱导的EADs的影响。
雷诺嗪二氢氯化物用蒸馏水稀释以制成50mM的储备溶液。对于每个实验制备新鲜的药物。
统计：利用单向重复测量方差分析(ANOVA)再加上Bonferroni检验进行统计分析。
实施例17
正常细胞外钾离子浓度(4mM)
雷诺嗪(1-100μM)对浦肯野纤维的复极化产生浓度依赖和速率相关效应(图20)。低浓度的雷诺嗪(1-10μM)不产生效应或产生相对较小的APD缩短。在快和慢速率下高浓度的雷诺嗪(50和100μM)显著缩短APD50。相反，在慢起搏速率下APD90被显著缩短，但在快起搏速率下则没有(图20)。在药物的任何浓度下没有观察到EAD的征兆。
为了评估雷诺嗪对INa的影响，我们测定了药物对动作电位(Vmax)的上升支的上升速率的影响。在浓度为50和100μM时雷诺嗪引起Vmax的显著下降(图21)，表明药物对INa的抑制。
在浓度为1-50μM时，雷诺嗪对振幅、过冲、或静息膜电位产生很小至没有影响(表11)。
表11
在浦肯野纤维中雷诺嗪对0相位(phase 0)振幅、静息膜电位(RMP)、及动作电位过冲的影响在存在正常[K+]0的情况下
雷诺嗪(单位：μM)
  对照   1.0   5.0   10.0   50.0   100.0
  振幅   122±5   120±9   124±3   122±7   117±7   106±12<sup>*</sup>
  RMP   -91±1   -90±2   -90±2   -90±3   -89±3   -87±3<sup>*</sup>
  过冲   32±4   32±7   34±7   32±6   28±7   19±11<sup>*</sup>
[K+]0＝4.0mM；BCL＝500msec
数据表示为平均值±标准误差，n＝7，*p＜0.05，与对照比较
在试验的最高浓度(100μM)，雷诺嗪引起0相位振幅和过冲的统计上显著的下降，其和药物降低Vmax和INa的效应一致。
低细胞外钾离子浓度(3mM)
降低细胞外钾离子并不显著改变雷诺嗪的效应。最明显的差异包括在中等浓度下药物倾向于延长APD90以及在BCL为2000msec时由最高浓度的药物诱导APD的较小缩短(图22、表12)。
表12
在浦肯野(Purkinje)纤维中雷诺嗪对0相位振幅、静息膜电位(RMP)、及动作电位过冲的影响在存在低[K+]0的情况下
雷诺嗪(单位：μM)
  对照   1.0   5.0   10.0   50.0  100.0
  振幅   130±9   132±6   130±5   128±4   121±7<sup>*</sup>  114±7<sup>*</sup>
  RMP   -92±1   -92±1   -92±1   -92±1   -92±1  -90±2
  过冲   38±9   40±5   38±4   37±4   29±6<sup>*</sup>  24±7<sup>*</sup>
[K+]0＝3.0mM；BCL＝500msec
数据表示为平均值±标准误差，n＝5，*p＜0.05，与对照比较
大于5-10μM的浓度显著缩短APD50。如同更高水平的[K+]0一样，高浓度雷诺嗪(50和100μM)显著降低0相位振幅和动作电位过冲。从来没有观察到EADs。
雷诺嗪抑制d-索他洛尔诱导的EADs
在6个浦肯野纤维标本的4个标本中特异IKr阻滞剂d-索他洛尔(100μM)诱导EAD活性。雷诺嗪，在低到5μM的浓度，在4个浦肯野纤维标本的4个标本中迅速地消除d-索他洛尔诱导的EADs(图23)。更高水平的雷诺嗪(10μM)产生动作电位的更大缩短。
实施例18
IV.在经麻醉的狗中雷诺嗪对QT延长和心律失常诱导的影响：与索他洛尔比较
A.材料和方法
狗用Atravet(0.07/mg/kg sc)预处理，15分钟后用氯胺酮(5.3mg/kg iv)和安定(0.25mg/kg iv)、接着用异氟烷(1-2％)麻醉，用插管法治疗并进行机械通气。然后，通过射频消融使它们进行AV阻断。进行正中胸骨切开术，然后导管插入股动脉用于记录血压(BP)并插入两个股静脉用于输注试验药物。双向电极被插入两个心室，用于程序性刺激测定不应期(额外刺激技术)，以及用于在各种受控基础周长(BCLs)下评估QT时间和QRS时程。TdP是由去氧肾上腺素的激发所诱导，其是作为10、20、30、40、以及50μg/kg的推注静脉剂量给予。在每个剂量以后，连续监测ECG以检测心律失常。在给予去氧肾上腺素以后BP总是上升，然后提供足够的时间(至少10分钟)以便在给予去氧肾上腺素的下一剂量之前使BP正常化。试验药物效应是根据以下程序进行评估。
数据表示为平均值±标准平均误差。用t检验进行统计比较。双尾概率＜0.05被认为是表明具有统计显著性。在数据表中，*代表P＜0.05，**代表P＜0.01。
B.研究设计(实验方案)
输注试验药物：第1组(5只狗)：静脉注射给予索他洛尔，负荷剂量为8mg/kg而维持剂量为4mg/kg/hr。第2组(6只狗)：5只狗接受雷诺嗪0.5mg/kg静脉注射负荷，接着是分别为1.0、3.0、及15mg/kg/hr的第一次、第二次、及第三次连续静脉输注(ivinfusion)。1只狗接受雷诺嗪1.5mg/kg静脉注射负荷，接着是输注15和30mg/kg/hr。在开始维持输注(对于索他洛尔)20分钟以后或在开始每个静脉输注速率(对于雷诺嗪)30分钟以后，在BCLs为300、400、600、及1000ms下获得电生理测量结果(右和左心室ERP、QT和QRS)。然后，给予去氧肾上腺素加强剂量，其中在每个药物输注速率下给予所有剂量，并监测任何心律失常。
实施例19
表13总结了在模型中索他洛尔的前心律失常(proarrhythmic)效应(二联律、三联律、尖端扭转、以及尖端扭转退化成心室颤动)。
表13
在索他洛尔组中心律失常发病率
  ID   Sot 8+4   PE10   PE20   PE30   PE40   PE50
  Sot1   -   -   -   -二联律-三联律   -tdp 30次搏动CL-206.9-tdp 16次搏动CL-194.7-tdpVF-tdp 7次搏动CL-230-tdpVF死亡
  Sot2   -S1＝1000，S＝275VT 4次搏动CL＝186.7-S1＝1000，S2＝270VT 4次搏动CL＝173.7-S1＝1000，S2＝265tdp 21次搏动CL＝144-S1＝300，S2＝230tdp VF-tdpVF   -VTmonotdpVF死亡
  Sot3   -   -tdp 13次搏动CL＝201.7   -二联律-三联律   -二联律-三联律   -VT mono 5次搏动CL＝250-tdp 21次搏动CL＝195-tdpVF-tdpVF-tdpVF死亡
  Sot4   -S1＝1000，S2＝235VT 7次搏动CL＝137   -   -二联律   -二联律   -二联律   -三联律-VT mono 19次搏动CL＝300-tdpVF-tdpVF死亡
  Sot5   -   -   -   -tdpVF死亡
VT＝室性心动过速，VF＝心室颤动，mono＝单形的，tdp＝尖端扭转，CL＝周长，sot＝索他洛尔，PE10、20、30、40、50分别＝10、20、30、40、50μg/kg去氧肾上腺素。
5只狗中的两只在没有去氧肾上腺素激发的情况下患有前心律失常(proarrhythmia)，而所有5只狗在去氧肾上腺素激发后患有原心律失常。所有这些狗最后死于退化成心室颤动的尖端扭转，其是由索他洛尔输注和去氧肾上腺素推注的结合所诱导。索他洛尔以反向使用依赖方式增加右心室(RV)和左心室(LV)有效不应期(表14以及图24A和图24B)。索他洛尔以显著的反向使用依赖方式增加QT时间并且不影响QRS时程(表15以及图25A和图25B)。
表14：索他洛尔对右和左心室ERP的影响(ms)
             平均ERP RV
BCL     CTL             sot 8+4
1000    206.00±8.86    255.50±9.56**
600     191.00±7.1     223.50±9.07**
400     174.00±7.85    195.67±7.53**
300     162.00±6.82    181.33±8.21**
              平均ERP LV
BCL     CTL             sot 8+4
1000    252.50±17.5    286.25±16.25**
600     227.50±12.5    262.50±27.5**
400     202.50±15      226.25±21.25
300     182.50±10      201.25±18.75
BCL＝基础周长Sot 8+4＝8mg/kg的索他洛尔静脉注射负荷剂量+0mg/kg/hr的维持剂量
CTL＝对照
*p＜0.05
**p＜0.01
表15：对QT和QRS时间(ms)的影响：
    QT        QT
BCL                   BCL  SE CTL  SE sot8+4
    CTL       sot 8+4
1000    332.70±77.00    440.93**±76.93   1000    26.7±2.37     14.06±5.39
600     309.85±73.60    354.67**±74.73   600     21.33±2.50    15.54±3.11
400     262.73±74.53    299.14*±73.53    400     17.37±2.38    16.75±3.76
300     238.40±74.07    266.40*±74.07    300     16.95±1.86    13.11±3.68
对于接受标准雷诺嗪输注实验方案的5只狗可以获得其结果。高剂量狗在30mg/kg/hr输注期间死于泵衰竭，对该狗不可能进行室性心律失常和电生理研究。表16总结了在有雷诺嗪的情况下的心律失常发病率，其中根据和上述对于索他洛尔的一样的实验方案单独和与去氧肾上腺素推注(10-50μg/kg)一起。在雷诺嗪输注(有或没有去氧肾上腺素推注)期间我们不能诱导任何尖端扭转和/或心室颤动。
表16
在雷诺嗪组中心律失常发病率
Figure C0380787100761
Rano＝雷诺嗪，VT＝室性心动过速，IDV＝心室自身逸搏，CL＝周长，PE＝去氧肾上腺素，inf.＝输注
雷诺嗪稍微增加ERP(平均增加不大于约10％)，且没有反向使用依赖性(表17A和B以及图26和27)。QT时间适度地增加(最大增加大约为10％)但不显著，其中最大效应在每小时3mg/kg并且在更高剂量下会降低(表18A和B以及图28和29)。
表17A：雷诺嗪对右和左心室ERP(ms)的影响
平均ERP-RV+标准误差
BCL     CTL             0.5+1            3               15
1000    240.20±9.9     254.00*±9.31    249.50±6.19    253.16±7.77
600     218.50±8.93    227.50±8.87     224.50±4.83    229.50±6.19
400     194.00±6.83    201.50±6.45     199.66±3.75    206.50±5.79
300     175.00±5.25    182.84±6.67     181.00±2.32    185.00±5.76
表17B：雷诺嗪对右和左心室ERP(ms)的影响
平均ERP-LV+标准误差
BCL     CTL              0.5+1            3               15
1000    252.16±14.13    259.38±18.18    265.43±19.42   260.43±19.32
600     226.16±11.29    233.13±12.43    238.13±13.25   237.50±14.11
400     198.50±9.7      204.38±11.01    211.45±9.2     215.00±10.05
300     180.50±7.18     185.00±8.1      189.38±8.32    196.88*±7.53
表18A：雷诺嗪对QT时间(ms)的影响
平均QT±标准误差
BCL     CTL             0.5+1           3               15
1000    348.40±9.07    352.52±9.05    384.02±13.9    369.80±11.6
600     318.20±8.58    323.50±7.74    345.00±10.04   336.34±11.43
400     285.40±6.02    286.50±5.76    306.46±10.38   302.18±9.33
300     263.60±6.61    266.16±6.36    272.72±6.09    274.82±6.48
表18B：雷诺嗪对QRS时间的影响
平均QT±标准误差
BCL     CTL            0.5+1          3              15
1000    72.10±2.96    72.51±3.35    74.24±2.9     78.50±2.6
600     70.90±3.27    71.68±2.94    73.72±2.29    74.84*±2.56
400     71.37±3.53    72.36±3.39    73.18±2.57    76.82±3.06
300     70.65±3.52    73.60±2.87    3.26±2.337    8.48*±2.8
实施例20
在动作电位电压钳期间雷诺嗪对后期INa的影响
给予成年雄性杂种狗180IU/kg肝素(钠盐)然后用35mg/kg(静脉注射)戊巴比妥钠进行麻醉，其心脏被快速切除并放在蒂罗德溶液中。单肌细胞是通过酶分离获自由左旋支冠状动脉提供的心室游离壁的楔形切片。使用了来自左心室的中心肌区域的细胞。所有程序与动物护理和使用委员会建立的准则一致。
在分离中使用的蒂罗德溶液含有(单位mM)：135NaCl、5.4KCl、1MgCl2、0或0.5CaCl2、10葡萄糖、0.33NaH2PO4、10N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸(HEPES)，而pH用NaOH调节到7.4。使用的外部溶液和内溶液的组成总结于表19。
表19
  外部溶液   内部溶液
  I<sub>Na，late</sub>全细胞(mM)   I<sub>Na，late</sub>(mM)
  10葡萄糖   135天冬氨酸铯
  1MgCl<sub>2</sub>   1MgCl<sub>2</sub>
  10NaOH
  2CaCl<sub>2</sub>   10EGTA
  150甲磺酸钠   5Mg-ATP
  10HEPES   10HEPES
  用甲磺酸调节到pH7.4   用CsOH调节到pH7.1
在37℃下利用标准膜片电极记录后期INa。将分离的细胞放置在倒置显微镜载物台上的温度受控的0.5ml室中(Medical System，Greenvale，NY)并以2ml/min的速率进行超融合。距离细胞100μm放置的4套管石英微支管(ALA Scientific Instruments公司，Westbury，NY)被用来施加雷诺嗪和河豚毒素(TTX)。在管线中的加热器(Harvard/Warner，Holliston，MA)被用来维持在石英微支管内的溶液的温度。以电压钳方式操作Axopatch 700A放大器(AxonInstruments，Foster City，CA)以在37℃下记录电流。全细胞电流在5kHz下用4极低通Bessel滤波器进行滤波，在2-5kHz之间进行数字化(Digidata 1200A，Axon Instruments)并存储于计算机。使用pClamp 8.2软件(Axon Instruments)来记录和分析离子电流。吸管尖端电阻是1.0-1.5MΩ而密封电阻大于5GΩ。串联电阻的电子补偿平均为76％。对报道的电压作膜片电极尖端电位方面的校正。细胞膜和膜片吸管之间的密封最初形成在含有1mM CaCl2的蒂罗德溶液中。将3M KCl-琼脂桥用在Ag/AgCl接地电极和外部溶液之间以避免在切换到实验溶液时产生地电位。
在水中制备河豚毒素(TTX)并以1∶100的比例稀释，以在外部溶液中获得10μM的最终浓度。在水中制备5mM浓度的雷诺嗪二氢氯化物并在外部溶液中稀释到1-50μM范围内的最终浓度。
INa，late是在一系列30个脉冲期间以300和2000ms的重复率进行记录。在该系列的最后5个脉冲期间的电流被平均以降低噪声，而后期INa被定义为TTX敏感电流。在无药物溶液中、在加入雷诺嗪后2至4分钟、以及紧接着在加入10μM TTX以后对实验方案进行重复以完全阻断INa，late。
动作电位而不是矩形脉冲被用于电压钳INa，late。在BCL为300ms下，测量是在中间通过在13mV电压的坪以及在3期复极化(在-28mV的电压)期间进行。在BCL为2000ms下，测量是在20mV和-28mV的电压下在类似位置进行。在半对数尺度上画出了后期ICa的下降(作为药物浓度的函数)并拟合到对数方程。
图30显示在对照溶液中以及在20μM雷诺嗪加入外部溶液3分钟后的TTX敏感电流。每2000ms对细胞加以脉冲，脉冲数为30。该图显示，坪电流比钠电流(在动作电位箝位后期所记录)对雷诺嗪更敏感。在20mV抑制最大，但在有雷诺嗪的情况下，在-28mV仍然有一些TTX敏感电流。
图31显示类似实验的简明结果，其中雷诺嗪(1-50μM)被加入外部溶液。后期INa的半抑制分别发生在5.9μM和20.8μM的药物浓度。图32显示在坪期间抑制更有效，甚至在细胞每300ms被加以脉冲时。
图33显示类似实验的复合数据，其中雷诺嗪被加入外部溶液。当以2000ms和300ms的基础周长加以脉冲时，后期INa的半抑制分别发生在20.8μM和11.5μM的药物浓度。
实施例21
雷诺嗪对豚鼠心室肌细胞的动作电位时程的影响
心室肌细胞的分离
单心室肌细胞分离自成年雄性豚鼠(Harlan)的心脏。简而言之，心脏以下述次序灌注以热(35℃)和充氧溶液：1)蒂罗德溶液，含有(单位mmol/L)：140NaCl、4.6KCl、1.8CaCl2、1.1MgSO4、10葡萄糖、以及5HEPES，pH7.4，5分钟；2)无钙离子溶液，含有(单位mmol/L)：100NaCl、30KCl、2MgSO4、10葡萄糖、5HEPES、20牛磺酸、以及5丙酮酸盐，pH7.4，5分钟；以及3)无钙离子溶液，含有sollagenase(120单位/ml)和白蛋白(2mg/ml)，20分钟。在灌注的最后，心室被移走，切碎，然后在3#溶液中轻轻地振荡10分钟。分离的细胞收集自细胞悬浮液。
动作电位时程的测量
肌细胞被放置在记录室中并在35℃用蒂罗德溶液进行超融合。借助于超融合液施加药物。利用填充以溶液的玻璃微电极测量动作电位，其中溶液含有(单位mmol/L)120天冬氨酸钾、20KCl、1MgCl2、4Na2ATP、0.1Na3GTP、10葡萄糖、1EGTA、以及10HEPES(pH7.2)。微电极电阻是1-3MΩ。使用Axopatch-200放大器、DigiData-1200A接口以及pCLAMP6软件来进行电生理测量。动作电位是由在各种频率(如指出的)下施加的5ms去极化脉冲所诱导。动作电位时程是在50％(APD50)和90％(APD90)复极化下进行测量。当对药物的反应已达到稳定的最大值时进行测量。
实验方案
1)在0.5、1、或2Hz频率下对心室肌细胞进行电刺激。每个肌细胞用3、10、以及30μmol/L雷诺嗪进行处理。从4个肌细胞测定了在每个起搏频率下雷诺嗪对动作电位时程的影响。
2)在0.25Hz频率下诱发了动作电位，并在有5μmol/L奎尼丁的情况下检查了雷诺嗪(10μmol/L)对动作电位时程的影响。对4个肌细胞进行了实验。
统计分析
数据表示为平均值±标准平均误差。将成对t检验(Student’st-test)用于成对数据的统计分析，然后，单向重复测量ANOVA再加上Student-Newman-Keuls检验用于多重比较。p值＜0.05被认为是统计显著的。
在各种起搏频率下雷诺嗪的影响
在不存在药物的情况下，在0.5(n＝4)、1(n＝4)以及2(n＝1)Hz的刺激频率下测量的APD50和APD90分别为250±20、221±18、以及208±9ms、和284±22、251±20、以及245±9ms。因而，增加起搏频率导致动作电位时程的速率相关缩短。与起搏频率无关，雷诺嗪引起APD50和APD90的中等和浓度依赖缩短。图34显示3、10、以及30μmol/L雷诺嗪降低在0.5、1、或2Hz下受刺激的肌细胞的动作电位时程。由雷诺嗪引起的动作电位时程的缩短在清除药物后是部分地可逆的。
图35显示获自单肌细胞的结果，其中单肌细胞首先在2Hz、然后在0.5Hz进行起搏。在两个起搏频率下，雷诺嗪(30μmol/L)引起动作电位时程的类似缩短。在不存在和存在3、10、及30μmol/L雷诺嗪的情况下并在0.5、1、及2Hz的起搏频率下测量的APD50和APD90的比较示于图36。在各种起搏频率下由雷诺嗪引起的APD50和APD90的缩短被归一化为对照的百分数，并示于图37。
在有奎尼丁的情况下雷诺嗪的影响
图38A显示奎尼丁(5μmol/L)增加在0.25Hz下被起搏的肌细胞的动作电位时程。雷诺嗪(10μmol/L)被证明已减弱奎尼丁的影响。
除延长动作电位时程以外，已知奎尼丁还可以诱导早期后除极(EADs)、触发激动、以及尖端扭转。如图39和40所示，奎尼丁(2.5μmol/L)诱导EADs和触发激动。研究发现，雷诺嗪(10μmol/L)可以有效抑制奎尼丁诱导的EADs(图39)和触发激动(图40)。
实施例22
按照实施例21的程序和实验方案，在有雷诺嗪的情况下对豚鼠心室肌细胞进行了电刺激，其是单独或在有ATXII[海葵毒素，已知可以模拟LQT3综合征，其是通过放慢自开放状态的钠离子通道失活并借此增加心肌细胞的峰值和后期钠离子电流(INa)]的情况下进行。已知ATXII可以诱导早期后除极(EADs)、触发激动、以及室性心动过速。
研究发现，ATXII(10-40nmol/L)明显增加在50％复极化(APD50)下测量的动作电位时程：从273±9ms到1,154±61ms(n＝20，p＜0.001)，如图41所示，并且在所有细胞中诱导EADs。常常观察到多个EADs和产生的持续去极化。低到1μmol/L浓度的雷诺嗪有效地消除ATXII诱导的EADs和触发激动。浓度为1、3、10、及30μmol/L的雷诺嗪显著地(p＜0.001)减弱由ATXII引起的APD50的延长，分别为60±4％(n＝7)、80±2％(n＝7)、86±2％(n＝12)、及99±1％(n＝8)，如图42、43、44、45、以及46所示。这些图形描述5个不同的实验。
实施例23
为了研究雷诺嗪对ATXII诱导的MAP(单相动作电位)时程延长、EADs、以及室性心动过速(VT)的影响，使用了K-H缓冲液灌注的豚鼠分离心脏模型。
研究发现ATXII(10-20nM)在4个没有快速室性心律失常的心脏中延长MAPD906％。在10/14豚鼠分离心脏中ATXII明显诱导EADs和多形VT。在有ATXII的情况下，5、10、及30μM的雷诺嗪显著抑制EADs和VT，特别是持续VT。在消除雷诺嗪以后雷诺嗪的保护效应是可逆的。这些结果示于图47至图50。
图47显示对照、ATXII(20nM)、及ATXII(20nM)加上雷诺嗪(10μM)的MAP和ECG。该图表明雷诺嗪降低了ATXII诱导的EAD和MAP延长。
图48显示ATXII(20nM)诱导VT的MAP和ECG，自发VT或起搏诱导的VT。
图49显示雷诺嗪降低了ATXII诱导的VT。该图显示单独ATXII(20nM)和ATXII(20nM)加上雷诺嗪(30μM)的MAP和ECG。
图50显示雷诺嗪(10μM)逆转了ATXII诱导的EAD和ΔMAP。
实施例24
为了测定雷诺嗪是否抑制ATX-II诱导的1)EADs和触发激动(TA)、以及2)室性心动过速(VT)，分别使用了豚鼠心室肌细胞和分离的心脏。
利用全细胞膜片电极技术记录动作电位。室性单相动作电位和电图是记录自分离的心脏。ATX-II(10-20nmol/L)增加在50％复极化(APD50)下测量的APD：从271±7ms到1,148±49ms(n＝24，p＜0.001)，并且在所有细胞中诱导EADs。常常观察到多个EADs和持续去极化。浓度≥1μmol/L的雷诺嗪消除ATX-II诱导的EADs和TA。浓度为0.1、0.3、1、3、10、以及30μmol/L的雷诺嗪显著地(p＜0.001)降低由ATX-II引起的APD50的延长，分别为29±1％(n＝5)、47±1％(n＝5)、63±3％(n＝11)、79±1％(n＝10)、86±2％(n＝12)、以及99±1％(n＝8)。雷诺嗪(10μmol/L)还抑制由2.5μmol/L奎尼丁(n＝2)诱导的EADs和TA。在10/14分离心脏中ATX-II(10-20nmol/L)引起EADs和VT；5-30μmol/L的雷诺嗪显著降低ATX-II诱导的EADs并终止TVs。
实施例25
为了测定INa(L)的ATX-II(其模拟SCN5A突变)的增加是否促进E-4031和293B(延迟整流电流(IK)的快速和慢速成分的钾通道阻滞剂)延长APD和诱导EADs的效应，以及雷诺嗪是否逆转ATX-II和钾离子阻滞剂的效应，使用了豚鼠心室肌细胞以及分离的心脏。
分别在50％(APD50)和90％(MAPD90)复极化下测量了豚鼠分离肌细胞和心脏的室性APD。低浓度的ATX-II(3nmol/L)仅稍微增加APD506±2％。然而，当施加E-4031或293B时，ATX-II大大地加强这些钾离子阻滞剂延长APD的效应。在不存在和存在ATX-II的情况下，APD50分别被E-4031(1μmol/L)增加11±2％和104±41％，而APD50被293B(30μmol/L)增加40±7％和202±59％。此外，在存在ATX-II的情况下E-4031和293B诱导EADs，但在不存在ATX-II的情况下E-4031和293B则不诱导EADs。在存在ATX-II加上E-4031或293B的情况下雷诺嗪(10μmol/L)完全消除EADs并显著地逆转APD50的延长约70％。ATX-II(7nmol/L)、E-4031(1μmol/L)、以及293B(1μmol/L)分别单独增加MAPD9032±0.1％、30.1±0.1％、以及6.3±0.2％。当施加ATX-II时，E-4031和293B增加MAPD90分别为127.1±0.4％和31.6±0.1％。在存在ATX-II加上E-4031的情况下雷诺嗪(10μmol/L)显著降低MAPS9024.5±0.1％，而在存在ATX-II加上293B的情况下雷诺嗪(10μmol/L)则降低MAPS908.3±0.1％。

Claims (32)

1.雷诺嗪或其异构体、或雷诺嗪或其异构体的药用盐在制备用于治疗、减轻、或预防哺乳动物获得性心律失常，即由对处方药物或其他化学药品的敏感性所引起的心律失常、或者遗传性心律失常，即由基因突变所引起的心律失常的药物组合物中的应用，所述雷诺嗪被命名为N-(2，6-二甲基苯基)-4-[2-羟基-3-(2-甲氧基苯氧基)丙基]-1-哌嗪乙酰胺。
2.根据权利要求1所述的应用，其中包含所述雷诺嗪的药物组合物是用于提供抑制IKr、IKs、以及后期INa离子通道但不抑制钙通道的剂量水平的雷诺嗪。
3.根据权利要求1所述的应用，其中雷诺嗪为药用盐形式。
4.根据权利要求3所述的应用，其中所述药用盐是二氢氯化物盐。
5.根据权利要求1所述的应用，其中雷诺嗪为游离碱形式。
6.根据权利要求1所述的应用，其中包含所述雷诺嗪的药物组合物是用于在给予时提供包括抑制后期INa离子通道的剂量水平的雷诺嗪。
7.根据权利要求1所述的应用，其中包含所述雷诺嗪的药物组合物是用于在给予时提供包括抑制IKr、IKs、以及后期INa离子通道的剂量水平的雷诺嗪。
8.根据权利要求1所述的应用，其中包含所述雷诺嗪的药物组合物是用于在给予时提供包括抑制IKr、IKs、以及后期INa离子通道但不抑制钙通道的剂量水平的雷诺嗪。
9.根据权利要求1所述的应用，其中包含所述雷诺嗪的药物组合物是用于在给予时以至少350±30ng/mL的血浆水平、时间至少为12小时的方式提供雷诺嗪。
10.根据权利要求1所述的应用，其中包含所述雷诺嗪的药物组合物作为缓释剂型，其维持雷诺嗪的血浆浓度在小于4000ng/mL的最大值，时间至少为12小时。
11.根据权利要求10所述的应用，其中包含所述雷诺嗪的药物组合物作为缓释剂型，其维持雷诺嗪的血浆浓度在350至4000ng碱/mL之间，时间至少为12小时。
12.根据权利要求1所述的应用，其中所述药物组合物包含在10mg和700mg之间的雷诺嗪。
13.根据权利要求12所述的应用，其中所述雷诺嗪是其异构体、或雷诺嗪或其异构体的药用盐。
14.根据权利要求1所述的应用，其中在给予时所述药物组合物提供每升药物组合物1至30微摩尔的剂量水平。
15.根据权利要求14所述的应用，其中所述药物组合物提供每升药物组合物1至10微摩尔的剂量水平。
16.根据权利要求1所述的应用，其中所述治疗、减轻、或预防哺乳动物获得性心律失常或遗传性心律失常选自治疗或预防具有遗传决定的先天性LQTS的哺乳动物的心律失常。
17.根据权利要求1所述的应用，其中所述治疗、减轻、或预防哺乳动物获得性心律失常或遗传性心律失常选自预防尖端扭转。
18.根据权利要求1所述的应用，其中所述治疗、减轻、或预防哺乳动物获得性心律失常或遗传性心律失常选自治疗或预防受LQT3折磨的哺乳动物的心率失常。
19.根据权利要求1所述的应用，其中所述治疗、减轻、或预防哺乳动物获得性心律失常或遗传性心律失常选自治疗或预防受LQT1、LQT2、或LQT3折磨的哺乳动物的心律失常。
20.根据权利要求1所述的应用，其中所述治疗、减轻、或预防哺乳动物获得性心律失常或遗传性心律失常选自预防受SCN5A基因突变折磨的患者的心律失常。
21.根据权利要求1所述的应用，其中所述药物组合物提供同时抑制IKr、IKs、以及后期钠离子通道的所述雷诺嗪，并且所述治疗、减轻、或预防哺乳动物获得性心律失常或遗传性心律失常选自治疗室性心动过速。
22.根据权利要求21所述的应用，其中所述药物组合物在并不抑制心脏钙离子通道的剂量水平提供抑制心脏IKr、IKs、以及后期钠离子通道的所述雷诺嗪。
23.根据权利要求22所述的应用，其中所述室性心动过速是尖端扭转。
24.根据权利要求22所述的应用，其中所述药物组合物以有效地调节所述心脏IKr、IKs、以及后期钠离子通道而没有调节所述心脏钙离子通道所需的剂量水平提供血浆水平在1-100μM之间的所述雷诺嗪。
25.根据权利要求24所述的应用，其中所述药物组合物以有效地调节所述心脏IKr、IKs、以及后期钠离子通道而没有调节所述心脏钙离子通道所需的剂量水平提供血浆水平在1-50μM之间的所述雷诺嗪。
26.根据权利要求25所述的应用，其中药物组合物以有效地调节所述心脏IKr、IKs、以及后期钠离子通道而没有调节所述心脏钙离子通道所需的剂量水平提供血浆水平在1-20μM之间的所述雷诺嗪。
27.根据权利要求26所述的应用，其中药物组合物以有效地调节所述心脏IKr、IKs、以及后期钠离子通道而没有调节所述心脏钙离子通道所需的剂量水平提供血浆水平在1-10μM之间的所述雷诺嗪。
28.根据权利要求1所述的应用，其中所述药物组合物是通过大丸剂或缓释组合物给予的。
29.根据权利要求1所述的应用，其中所述药物组合物是静脉内给予的。
30.根据权利要求1所述的应用，其中所述治疗、减轻、或预防哺乳动物获得性心律失常或遗传性心律失常选自治疗出现在心肌缺血、以及另外出现在急性和/或慢性心力衰竭中的室性心动过速。
31.根据权利要求1所述的应用，其中所述哺乳动物获得性心律失常或遗传性心律失常是心房纤颤。
32.根据权利要求30所述的应用，其中所述心肌缺血选自不稳定心绞痛、慢性心绞痛、变异型心绞痛、心肌梗死、急性冠状综合征。
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