KR20040082590A - 약제 내성을 극복할 수 있고 폐조직 지향성인 리포좀-백금착물 항암제 조성물 및 그 제조방법 - Google Patents

약제 내성을 극복할 수 있고 폐조직 지향성인 리포좀-백금착물 항암제 조성물 및 그 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 디아실콜린, 폴리에틸렌글리콜2000-아민 및 콜레스테롤로 구성된 스텔스 리포좀과 백금 착물 항암제를 포함하며, 상기 스텔스 리포좀 중의 디아실콜린, 폴리에틸렌글리콜2000-아민 및 콜레스테롤 사이의 몰비가 45 - 50 : 5 - 10 : 40 - 45이고, 백금 착물 항암제와 스텔스 리포좀 사이의 중량비가 1 : 10 - 20인, 리포좀-백금 착물 항암제 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 리포좀-백금 착물 항암제 조성물은 단순한 백금 착물 항암제에 비하여 폐조직 지향성이 뛰어나고, 시스플라틴 내성이 극복될 수 있을 뿐만 아니라, 세포흡수 면에서도 뛰어나므로 탁월한 항암 효과를 나타낸다.

Description

약제 내성을 극복할 수 있고 폐조직 지향성인 리포좀-백금 착물 항암제 조성물 및 그 제조방법{A COMPOSITION OF LUNG TARGETING LIPOSOMAL PLATINUM COMPLEXES WITHOUT DRUG RESISTANCE AND A PREPARATION METHOD THEREOF}
본 발명은 종래의 백금 착물 항암제인 시스플라틴의 심한 독성과 약제 내성을 동시에 극복할 수 있는 새로운 리포좀-백금 착물 항암제 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 백금 착물 항암제가 새로운 리포좀 조성물에 균일하게 분포되어 있는, 약제 내성을 극복할 수 있고, 폐조직 지향성이 뛰어나며, 특히 폐암치료에 적합한, 항암제 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다.
시스플라틴(cisplatin)은 인체의 각종 암 치료에 효능이 뛰어나고 가격이 저렴하여 시장성이 큰 항암제이다. 그러나, 자연적 또는 후천적인 암의 약물 저항성, 신장 독성 및 신경 독성 등의 부작용으로 인하여 그 사용이 제한되고 있다. 약물 저항성의 측면에서 트란스-1,2-디아미노사이클로헥산백금(II) 착물(DACH-Pt)의 유도체는 시스플라틴과 교차 내성이 없기 때문에 관심의 대상이 되었으나, 이들 유도체 역시 독성이 크고, 물성이 나쁘다는 점으로 인하여 생체에 대한 적용이 어려웠다.
이에 따라, 리포좀을 이용하여, 약물의 독성을 감소시키는 것과 동시에, 항암 활성을 높여 치료 효과를 향상시키려는 다수의 연구가 진행되고 있다 (Gabizon A. A.Cancer Res.,52, 891 (1992); Perez-Soler R. 등,Cancer Res.,52, 6341 (1992); Sharma A. 등,Cancer Res.,53, 5877 (1993) 등). 리포좀은 소수성 또는 친수성 백금 착물 항암제 모두에 대하여 적용 가능한 운반 시스템이며, 이를 적용하는 경우 순수한 약물에 비하여 독성이 감소하고 항암 활성이 증가되며, 특히 소수성 백금 착물을 생체에 적용하는 것이 훨씬 용이해진다는 것이 밝혀졌다.
이와 같은 약동학적인 면뿐 아니라, 암 조직에 대한 약물의 지향성을 높이기 위하여 전형적인 리포좀이나, 항체 또는 특이 단백질이 포함된 면역 리포좀 (immunoliposome) 등도 이용되었다 (Hughes B.J. 등,Cancer Res.,49, 6214 (1989), Pinnaduwage P. 및 Huang L,Biochem.,31, 2850 (1992)).
그러나, 전형적인 리포좀의 경우에는 특기할 만한 암 조직 지향성이 나타나지 않았으며, 면역 리포좀의 경우에는 표적성은 다소 증가하지만 그 합성 과정이 복잡하고 대량생산이 어려워 실용화되기 어렵다는 점이 문제이다.
한편, 친수성 백금 착물 항암제의 경우에는 약물이 포함된 수용액을 리포좀에 최소한의 부피로 혼합시켜 리포좀 제제화를 하는 것이 일반적이지만, 이와 같은 종래의 방법은 리포좀의 약물 포획 효율(entrapment efficiency)이 낮아서, 효과적으로 제제화 할 수 없었다.
따라서, 효과적인 리포좀-백금 착물 항암제 조성물은 리포좀 내에서 약물이 화학적으로 안정할 것, 효율적으로 제제화될 수 있을 것, 기존의 백금 착물 항암제에 비하여 탁월한 항암 효과를 나타낼 것 등의 요건을 갖추는 것이 필요하다. 그 이외에도, 약제 내성이 극복될 수 있어야 하며, 리포좀이 암 조직에 대하여 지향성을 가질 것이 요구된다.
따라서, 본 발명의 목적은 백금 착물 항암제의 인체에 대한 독성 감소, 항암 활성의 증가, 시스플라틴과의 교차 내성 극복 등이 가능하며, 폐조직에 대한 지향성을 갖는, 새로운 리포좀-백금 착물 항암제 조성물 및 그 제조방법을 제공하는 것이다.
상술한 것과 같은 본 발명의 목적은 아미노산백금(II) 착물 유도체에 스텔스(stealth) 리포좀을 적용하는 것을 통하여 달성된다. 즉, 본 발명에 따른 리포좀-백금 착물 항암제 조성물은 스텔스 리포좀에 아미노산백금(II) 착물 항암제가 균일하게 포획되어 있는 것이다.
본 발명에서는 종래의 스텔스 리포좀에 많이 쓰이는 디스테로일 (disteroyl, "DS") 계열 이외에도, 디올레오일 (dioleoyl, "DO") 또는 디미리스토일 (dimyristoyl, "DM") 계열의 지질 분자를 사용함으로써, 실온에서도 리포좀이 고르게 형성되도록 한다. 또한, 이들 계열의 전이온도를 고려하여 인체 내에서 안정하면서도 유동성이 있는 리포좀 체계를 형성시킴으로써, 세포 친화성을 더욱 향상시켰다. 또한 생체 내에서 장시간 순환 가능한 분자인 폴리에틸렌글리콜2000-아민 ("PEG2000-PE")의 구성비 및 전체 리포좀의 크기를 나노크기로 적절하게 조절함으로써, 폐조직 지향성이며, 시스플라틴의 약물 내성 또한 극복될 수 있는 리포좀-백금 착물 항암제 조성물을 개발하였다.
이하에서는 본 발명의 리포좀-백금 착물 항암제 조성물에 대하여 설명한다.
스텔스 리포좀의 제조를 위한 지질 분자로는 디아실콜린, 폴리에틸렌글리콜2000 ("PEG2000")-아민 및 콜레스테롤을 사용한다. 상기 디아실콜린으로는 디올레오일 포스포콜린 (Dioleoyl phosphocoline, "DOPC"), 디미리스토일 포스포콜린 (Dimyristoyl phosphocoline, "DMPC") 또는 디스테로일 포스포콜린 (Disteroyl phosphocoline, DSPC)을, 폴리에틸렌글리콜2000-아민의 아민으로는 디올레오일 포스포에탄올아민 (Dioleoyl phosphoethanolamine, "DOPE"), 디미리스토일 포스포에탄올아민 (Dimyristoyl phosphoethanolamine, "DMPE") 또는 디스테로일 포스포에탄올아민 (Disteroyl phosphoethanolamine, "DSPE")을 사용한다.
디아실실콜린과 PEG2000-아민을 선택할 때에는, DO, DM 및 DS 계열을 각각 구분하여, 같은 계열에 속하는 디아실콜린과 PEG2000-아민을 함께 사용한다.
리포좀 조성물에 콜린을 사용하는 것은 이들의 세포 친화성 때문이며, 본 발명자들은 특히 DO 및 DM 계열의 지질 분자가 백금 착물에 대하여 우수한 친화성을 나타낸다는 것을 발견하였다. PEG2000은 생체의 혈액 내에서 오랜 시간 동안 순환하는 특성을 나타내므로, 폐 조직에 백금 착물을 선택적으로 축적시키는 역할을 하는 것으로 추정된다. 콜레스테롤은 리포좀-백금 착물의 물리적 외형적 안정성을 향상시키기는 역할을 한다.
본 발명자들은 스텔스 리포좀을 구성하는 위의 세 가지 지질 성분 사이의 혼합 비율을 변화시키면서 예비 시험을 수행하였으며, 그 결과 디아실콜린 : PEG2000-아민 : 콜레스테롤이 몰비로 45 - 50 : 5 - 10 : 40 - 45 인 경우에, 최종적으로 얻어지는 리포좀-백금 착물 항암제 조성물의 물리-화학적 성질이 가장 우수하고, 폐 지향성 및 항암 효과 또한 우수하다는 것을 발견하였다.
또한, 본 발명자들은 위의 지질 조성물과 백금 착물을 이하에서 설명하는 것과 같은 방법으로 제제화하는 경우에 시스플라틴과의 교차 내성이 극복될 수 있다는 것을 발견하였다. 따라서, 이하에서는 본 발명에 따른 리포좀-백금 착물 항암제 조성물의 제조방법에 관하여 설명한다.
본 발명자들은 먼저 약물을 균일하게 포함하고 있는 예비 리포좀 분말(pre-liposomal powder)을 제조한 다음, 이 예비 리포좀 분말에 재구성 용액을 첨가하여 제제화하는 경우에 리포좀의 친수성 약물 포획 효율을 향상시킬 수 있다는 것과, 얻어지는 리포좀-백금 착물 항암제 조성물을 장기간 보관하는 것이 가능해진다는 것을 발견하였다. 본 발명에 따른 예비 리포좀 분말에는 백금 착물 항암제가 균일하게 내포되어 있다.
즉, 본 발명에서는 예비 리포좀 분말을 제조하여 이를 -20oC 에 저장시켰다가 사용 직전에 재구성 수용액을 첨가하여 리포좀-백금 착물 항암제를 제조하는, 냉동건조-재수화 (lyophilization-rehydration) 제제화 방법을 적용하여 리포좀-백금 착물 항암제 조성물을 제조한다. 이를 보다 자세히 설명하면 다음과 같다.
먼저 지질 분자들을 유기 용매 내에서 앞에서 기술한 것과 같은 몰비로 균일하게 혼합시킨 다음, 혼합물 중의 유기 용매를 회전 증발기로 제거한다. 상기 유기 용매로는 클로로포름을 사용하는 것이 좋다. 여기서 얻어지는 건조된 지질막에 메탄올에 용해시킨 백금 착물 항암제를 첨가하고, 농축기를 사용하여 40℃를 넘지 않는 온도에서 조심스럽게 메탄올을 제거한다. 이어서, 지질 및 백금 착물 항암제가 포함된 건조 슬러리에t-부탄올을 가하고, 40 - 50℃에서 10 여분 동안 흔들어 투명한 균일 용액으로 만든 다음, 드라이아이스-아세톤 중탕에서 동결시킨다. 동결 건조기를 사용하여 하룻밤 동안 건조시켜 예비 리포좀 분말을 얻은 다음, 이를 밀봉하여 -20℃의 냉동실에 저장한다.
사용 직전에, 저장된 예비 리포좀 분말에, 생리 식염수, 5 - 10% 덱스트로즈 또는 피비에스(PBS) 용액과 같은 재구성 용액을, 얻어지는 용액의 농도가 50 - 100 mg/ml가 되도록 첨가하고, 40℃에서 250 rpm으로 30여분 동안 흔들어 준 다음, 4 - 5회 강하게 교반(vortexing)하여, 다중막 리포좀을 얻는다. 얻어진 다중막 리포좀을 익스트루더 (Avanti Polar Lipids)를 사용하여 지정된 기공 크기 (예를 들면, 100, 200, 400 nm)를 갖는 멤브레인에 수 차례 통과시켜 균일한 나노 입자 크기의 리포좀을 얻는다.
이와 같은 방법으로 제제화된 본 발명에 따른 리포좀-백금 착물 항암제 조성물에 있어서, 백금 착물과 리포좀 사이의 비율은 중량비로 1 : 10 - 20인 것이 가장 적합하다. 백금 착물과 리포좀의 배합비가 1 : 10 이하일 때에는 재수화 후 수용액 중에서 리포좀의 안정도가 떨어지며, 배합비가 1 : 20 이상일 때에는 백금 착물의 농도가 너무 낮아 항암 효과가 떨어진다.
한편, 상술한 방법에 의하여 얻은 다중막 리포좀을 소니케이터로 30초 - 1분씩 3회 초음파 처리하여, 100 nm 또는 그 이하의 입자 크기를 갖는 단일막 리포좀을 얻을 수 있다.
리포좀-백금 착물 항암제 조성물로 제제화한 후에, 입도 측정기로 리포좀의 크기를 측정하고, 현미경으로 물리적 안정도를 검사한다.
실시예
본 발명을 이하의 실시예를 통하여 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
(L-글루타메이토-O,O')(트란스(±)-1,2-디아미노사이클로헥산-N,N')백금(II)착물 [Pt(dach)(Glu)]의 다중막 리포좀 제조
디올레오일콜린 (550 mg), 폴리에틸렌글리콜2000-디올레오일에탄올아민 (200 mg) 및 콜레스테롤 (250 mg)을 클로로포름 용매 내에서 균일하게 혼합시킨 다음, 회전 증발기기로 클로로포름을 제거하였다. 건조된 지질 조성물에 백금 착물, Pt(dach)(Glu) 100 mg을 메탄올 10 ml에 녹인 용액을 첨가한 다음, 회전 증발기로 메탄올을 제거하였다. 이어서,t-부탄올 100 ml를 가하고, 40 - 50℃의 중탕기 내에서 10 여분 동안 흔들어 균일한 용액으로 만든 다음, 드라이아이스-아세톤 용액에서 동결시키고, 동결 건조기로 건조시켜 예비 리포좀 분말을 얻었다. 얻어진 예비 리포좀을 -20℃의 냉동실에 보관하였다.
위와 같은 방법으로 제조하여 보관한 에비 리포좀 분말에 재충전 용액을 50mg/ml 농도가 되도록 사용 직전에 가하고, 40℃에서 30 분 동안 250 rpm으로 흔들어 준 다음, 3 - 4회 강하게 교반(vortexing)하여, 다중막 리포좀을 얻었다. 최종 제품의 화학 조성은 다음과 같다.
백금 착물의 조성식: C11H21N3O4Pt·2H2O
리포좀의 조성(몰비) DOPC : PEG2000-DOPE : 콜레스테롤 = 50 : 5 : 45
리포좀과 백금 착물 사이의 중량비 = 10 : 1
실시예 2
(L-글루타메이토-O,O')(트란스(±)-1,2-디아미노사이클로헥산-N,N')백금(II) 착물 [Pt(dach)(Glu)]의 균일막 리포좀 제조
디미리스토일콜린 (450 mg), 폴리에틸렌글리콜2000-디미리스토일에탄올아민 (350 mg) 및 콜레스테롤 (200 mg)을 클로로포름 용매 내에서 균일하게 혼합시킨 다음, 클로로포름을 제거하였다. 건조된 지질막에 백금 착물 Pt(dach)(Glu) 100 mg을 첨가하여, 실시예 1에서와 동일한 방법으로 예비 리포좀 분말을 얻었다.
재충전 용액을 가하고, 40℃에서 30 여분 동안 250 rpm으로 흔들어 준 다음, 100 - 300 nm의 다공성 멤브레인이 들어있는 익스트루젼 세트에 연결시켜 여러 번 여과하여 균일한 막을 가진 리포좀을 얻었다. 최종 제품의 화학적 조성은 다음과 같다.
백금 착물의 조성식: C11H21N3O4Pt·2H2O
리포좀의 조성(몰비) DMPC : PEG2000-DMPE : 콜레스테롤 = 50 : 10 : 40
리포좀과 백금 착물 사이의 중량비 = 10 : 1
실시예 3
(L-글루타메이토-O,O')(트란스(±)-1,2-디아미노사이클로헥산-N,N')백금(II)착물 [Pt(dach)(Glu)]의 단일막 리포좀 제조
디스테오릴콜린 (560 mg), 폴리에틸렌글리콜2000-디스테오릴에탄올아민(200 mg) 및 콜레스테롤 (240 mg)을 클로로포름 용매 내에서 균일하게 혼합시킨 다음, 클로로포름을 제거하였다. 건조된 지질조성물에 백금 착물, Pt(dach)(Glu) 100 mg을 첨가하여 실시예 1에서와 동일한 방법으로 예비 리포좀 분말을 얻었다. 재충전 용액을 50mg/ml 농도가 되도록 가하고, 40℃에서 30 여분 동안 250 rpm으로 흔들어 준 다음, 3 - 4회 강하게 교반(vortexing)하고 2 - 3회 초음파 처리하여, 100 nm 이하의 입자 크기를 갖는 단일막 리포좀을 제조하였다. 최종 제품의 화학적 조성은 다음과 같다.
백금 착물의 조성식: C11H21N3O4Pt·2H2O
리포좀의 조성(몰비) DSPC : PEG2000-DSPE : 콜레스테롤 = 50 : 5 : 45
리포좀과 백금 착물 사이의 중량비 = 10 : 1
실시예 4
(L-글루타메이토-O,O')(트란스(±)-1,2-디아미노사이클로헥산-N,N')백금(II)착물 [Pt(dach)(Glu)]의 리포좀 제조
디미리스토일콜린 (1050 mg), 폴리에틸렌글리콜2000-디미리스토일에탄올아민(410 mg) 및 콜레스테롤 (540 mg)을 클로로포름 용매 내에서 균일하게 혼합시킨 다음, 클로로포름을 제거하였다. 건조된 지질막에 백금 착물 Pt(dach)(Glu) 100 mg을 첨가하여 실시예 1에서와 동일한 방법으로 예비 리포좀 분말을 얻었다. 최종 제품의 화학적 조성은 다음과 같다.
백금 착물의 조성식: C11H21N3O4Pt·2H2O
리포좀의 조성(몰비) DMPC : PEG2000-DMPE : 콜레스테롤 = 50 : 5 : 45
리포좀과 백금 착물사이의 중량비 = 20 : 1
실시예 5
(N-프로피오닐-L-글루타메이토-O,O')(트란스(±)-1,2-디아미노사이클로헥산-N,N')백금(II)착물 [Pt(dach)(ProGlu)]의 리포좀 제조
디올레오일콜린 (470 mg), 폴리에틸렌글리콜2000-디올레오일에탄올아민 (340 mg) 및 콜레스테롤 (190 mg)을 클로로포름 용매 내에서 균일하게 혼합시킨 다음, 클로로포름을 제거하였다. 건조된 지질에 백금 착물 Pt(dach)(ProGlu) 100 mg을 첨가하여 실시예 1에서와 동일한 방법으로 예비 리포좀 분말을 얻었다. 최종 제품의 화학적 조성은 다음과 같다.
백금 착물의 조성식: C14H25N3O5Pt·2H2O
리포좀의 조성(몰비) DOPC : PEG2000-DOPE : 콜레스테롤 = 45 : 10 : 45
리포좀과 백금 착물사이의 중량비 = 10 : 1
실시예 6
(N-프로피오닐-L-글루타메이토-O,O')(트란스(±)-1,2-디아미노사이클로헥산-N,N')백금(II)착물 [Pt(dach)(ProGlu)]의 리포좀 제조
디미리스토일콜린 (1050 mg), 폴리에틸렌글리콜2000-디미리스토일에탄올아민 (410 mg) 및 콜레스테롤 (540 mg)을 클로로포름 용매 내에서 균일하게 혼합시킨 다음, 클로로포름을 제거하였다. 건조된 지질막에 백금 착물 Pt(dach)(ProGlu) 100 mg을 첨가하여 실시예 1에서와 동일한 방법으로 예비 리포좀 분말을 얻었다. 최종 제품의 화학적 조성은 다음과 같다.
백금 착물의 조성식: C14H25N3O5Pt·2H2O
리포좀의 조성(몰비) DMPC : PEG2000-DMPE : 콜레스테롤 = 50 : 5 : 45
리포좀과 백금 착물사이의 중량비 = 20 : 1
실시예 7
(N-피발릴-L-글루타메이토-O,O')(트란스(±)-1,2-디아미노사이클로헥산-N,N')백금(II)착물 [Pt(dach)(PivGlu)]의 리포좀 제조
디올레오일콜린 (470 mg), 폴리에틸렌글리콜2000-디올레오일에탄올아민 (340 mg) 및 콜레스테롤 (190 mg)을 클로로포름 용매 내에서 균일하게 혼합시킨 다음, 클로로포름을 제거하였다. 건조된 지질막에 Pt(dach)(PivGlu) 백금 착물 100 mg을 첨가하여 실시예 1에서와 동일한 방법으로 예비 리포좀 분말을 얻었다. 최종 제품의 화학적 조성은 다음과 같다.
백금 착물의 조성식: C16H29N3O5Pt·2H2O
리포좀의 조성(몰비) DOPC : PEG2000-DOPE : 콜레스테롤 = 50 : 10 : 40
리포좀과 백금 착물사이의 중량비 = 10 : 1
실시예 8
(N-피발릴-L-글루타메이포-O,O')(트란스(±)-1,2-디아미노사이클로헥산-N,N')백금(II)착물 [Pt(dach)(PivGlu)]의 리포좀 제조
디미리스토일콜린 (1050 mg), 폴리에틸렌글리콜2000-디미리스토일에탄올아민 (410 mg) 및 콜레스테롤 (540 mg)을 클로로포름 용매 내에서 균일하게 혼합시킨 다음, 클로로포름을 제거하였다. 건조된 지질막에 백금 착물 Pt(dach)(PivGlu) 100 mg을 첨가하여 실시예 1에서와 동일한 방법으로 예비 리포좀 분말을 얻었다. 최종 제품의 화학적 조성은 다음과 같다.
백금 착물의 조성식: C16H29N3O5Pt·2H2O
리포좀의 조성(몰비) DMPC : PEG2000-DMPE : 콜레스테롤 = 50 : 5 : 45
리포좀과 백금 착물사이의 중량비 = 20 : 1
실시예 9
(N-프탈로일-L-글루타메이포-O,O')(트란스(±)-1,2-디아미노사이클로헥산-N,N')백금(II)착물 [Pt(dach)(PhthGlu)]의 리포좀 제조
디올레오일콜린 (470 mg), 폴리에틸렌글리콜2000-디올레오일에탄올아민 (340 mg) 및 콜레스테롤 (190 mg)을 클로로포름 용매 내에서 균일하게 혼합시킨 다음, 클로로포름을 제거하였다. 건조된 지질막에 백금 착물 Pt(dach)(PhthGlu) 100 mg을첨가하여 실시예 1에서와 동일한 방법으로 예비 리포좀 분말을 얻었다. 최종 제품의 화학적 조성은 다음과 같다.
백금 착물의 조성식: C19H23N3O6Pt·2H2O
리포좀의 조성(몰비) DOPC : PEG2000-DOPE : 콜레스테롤 = 50 : 10 : 40
리포좀과 백금 착물사이의 중량비 = 10 : 1
실시예 10
(N-프탈로일-L-글루타메이토-O,O')(트란스(±)-1,2-디아미노사이클로헥산-N,N')백금(II)착물 [Pt(dach)(PhthGlu)]의 리포좀 제조
디미리스토일콜린 (530 mg), 폴리에틸렌글리콜2000-디미리스토일에올아민 (200 mg) 및 콜레스테롤 (270 mg)을 클로로포름 용매 내에서 균일하게 혼합시킨 다음, 클로로포름을 제거하였다. 건조된 지질막에 백금 착물 Pt(dach)(PhthGlu) 100 mg을 첨가하여 실시예 1에서와 동일한 방법으로 예비 리포좀 분말을 얻었다. 최종 제품의 화학적 조성은 다음과 같다.
백금 착물의 조성식: C19H23N3O6Pt·2H2O
리포좀의 조성(몰비) DMPC : PEG2000-DMPE : 콜레스테롤 = 50 : 5 : 45
리포좀과 백금 착물사이의 중량비 = 10 : 1
실시예 11: 포획효율 및 리포좀 내에서의 약물의 안정도 시험
각 실시예에서 제조된 리포좀-백금 착물 항암제 조성물에 프로테민 설페이트 (protamine sulfate) 용액을 첨가한 다음 원심 분리하여, 리포좀에 포획된 백금 착물의 포획효율을 계산하였다. 원심분리 후 프로테민 설페이트와 함께 가라앉은 리포좀 결정체에 함유된 백금 착물과 용액 층에 포함된 백금 착물의 농도를 각각 ICP 원자방출 분석기로 측정하였다. 포획효율 (% EE)을 백금 착물의 총량에 대한 리포좀 결정체에 포획된 백금 착물의 양의 퍼센트 비율로서 나타내었다.
아래의 표 1은 DO, DM 및 DS 계열을 각각 사용한 리포좀-백금 착물 항암제의 포획효율과 약물 유실 정도를 나타낸 것이다. 약물 유실 정도는 약물이 리포좀으로부터 유실되는 정도를 초기의 포획효율에서 6 시간 후의 포획효율을 뺀 값이다. DM과 DS 계열의 지질 분자를 포함하는 리포좀 입자가 DO 보다 더 효율적으로 약물을 포획하고 있다는 것과, 약물 유실이 미미하다는 것을 표 1로부터 확인할 수 있다.
실온에서의 리포좀 제제 능력과 물성의 면에 있어서, 리포좀을 구성하는 지질분자의 긴 사슬구조가 DO나 DS 계열보다는 DM 계열에서 더 쉽고 균일하게 형성되었음을 육안으로 확인할 수 있었다.
지질 종류(비율 50:5:45) %EE 약물 유실(%EE6h- %EE0h)
DOPC:PEG2000-DOPE:콜레스테롤 58.7 7.2
DMPC:PEG2000-DMPE:콜레스테롤 72.5 2.5
DSPC:PEG2000-DSPE:콜레스테롤 72.8 2.7
실시예 12: 인간 난소암 세포주(A2780 및 A2780/PDD)에서의 세포독성 시험
난소암 세포주에 대한 세포독성을 엠티티 (MTT) 염색법으로 시험하였다. 96-웰(well) 접시에 암 세포주를 하룻밤 동안 배양한 다음, 표 2에 나타낸 것과 같은 여러 가지 약물을 첨가하였다. 약물 노출 약 48 - 72시간 후에 MTT 염색 시약을 넣고, 37℃에서 4시간 동안 배양하고, 디메틸설폭사이드 (DMSO)를 가하여 발색시킨다음, 570 nm에서 흡광도를 측정하여 세포독성을 계산하였다. 아래의 표 2는 난소암인 A2780 세포에 대한 백금 착물의 세포독성 (ID50: 암세포 증식을 50% 이내로 억제하는데 필요한 최소 약물 농도)시험 결과를 나타낸 것이다.
세포 독성 시험 결과, 백금 착물이 포함되지 않은 리포좀에서는 독성이 거의 나타나지 않았으며, 실시예 4에서 얻어진 리포좀-백금 착물 항암제의 경우에는 순수한 백금 착물에 비하여 비내성 난소암 세포인 A2780/S에서는 약 2배, 시스플라틴 내성 난소암 세포인 A2780/PDD 에서는 약 4.8배 정도 더 강하게 나타났다 이것은 리포좀에 포획된 것으로 인하여 약물의 세포 흡수가 크게 향상되었기 때문에 나타나는 결과이다. 특히 시스플라틴 내성 세포주에서 그 효과가 더욱 크게 나타났음을 알 수 있다.
내성 극복의 저항지수 ID50(내성세포)/ID50(비내성세포)를 보면 시스플라틴과 순수한 백금 착물의 경우 약 5 - 6 이었으나, 본 발명의 실시예 4에서 제조된 리포좀-백금 착물의 경우에는 2 - 3으로 나타났으며, 이에 따라 본 발명에 따른 리포좀-백금 착물이 시스플라틴 내성을 극복할 수 있는 시스템이라는 것이 증명되었다.
구분 ID50(㎍/ml)(A2780/S) ID50(㎍/ml)(A2780/PDD)
리포좀 단독 ID80= 200 ID80< 200
(dach)Pt(Glu) ID50= 50 ID50= 100
실시예 4 ID50= 10 ID50= 25
시스플라틴 ID50= 20 ID50= 120
실시예 13: 인간 자궁경부암 세포주(ME180 및 ME180/PDD)에서의 세포독성 시험
인간 자궁경부암 세포주 ME180과 ME180/PDD에 대하여 실시예 11에서와 동일한 방법으로 세포 독성 시험을 실시하여, 그 결과를 아래의 표 3에 나타내었다. 이로부터, A2780 세포주에 대한 독성 검색 결과와 매우 유사하다는 것을 확인할 수 있다. 즉, 리포좀 자체에서는 거의 독성이 없고, 실시예 4에서 얻어진 리포좀-백금 착물 항암제의 경우에는 순수한 백금 착물에 비하여 비내성 세포주인 ME180에서는 약 2 - 3배, 시스플라틴 내성 세포주인 ME180/PDD에서는 약 5 - 10배 정도로 세포 독성이 더 강하게 나타났다.
저항지수를 보면 시스플라틴과 순수한 백금 착물은 약 4 - 5 이었으나, 본 발명의 실시예 4에서 제조된 리포좀-백금 착물의 경우에는 1.5 - 2로 나타났다. 따라서, 본 발명의 리포좀-백금 착물이 ME180 세포주에서 더욱 효과적으로 시스플라틴 내성을 극복할 수 있는 시스템이라는 것이 증명되었다.
구분 ID50(㎍/ml)(ME180/S) ID50(㎍/ml)(ME180/PDD)
리포좀 단독 ID80= 200 < 500
(dach)Pt(Glu) ID50= 45 100
실시예 4 ID50= 18.6 25
시스플라틴 ID50= 30 120
실시예 14: 동물을 이용한 항암 효과 시험
항암 활성을 쥐의 백혈병 세포주 L1210을 사용하여 시험하였다. 우선 L1210세포주 (1 x 106개, 0.2 ml 식염수 내)를 BDF 쥐에 복부로 주사하였다. 그리고 1, 5, 9일 후 처치할 약물을 용량에 따라 투여한 다음, 약물을 처치하지 않은 대조군에 대한 처치군의 생존 증가율을 %T/C 로 나타내었다. 아래의 표 4는 약물 투여량, %T/C 및 60일 생존 개체수를 나타낸 것이다.
쥐를 이용한 동물실험에서 실시예 4에서 제조된 리포좀-백금 착물 항암제는 순수한 백금 착물에 비하여 약 1/2 - 1/4 에 해당하는 백금 착물을 투여하였음에도, 항암 효과가 유사한 것으로 나타났다. 이러한 생체 내 항암 활성 시험 결과로부터, 실시예 11과 12의 생체 외 세포독성 시험 결과에서와 마찬가지로, 백금 착물의 세포독성 감소에 따라 항암 활성이 증가된다는 것이 증명되었다. 실시예 4에서 제조된 리포좀-백금 착물 항암제는 시스플라틴에 비해서도 탁월한 항암 효과를 나타낸다는 것을 알 수 있다.
구분 투여량(mg/kg) T/C (%) 60 일 생존수
(dach)Pt(Glu) 40 182 8마리 중 1마리
20 > 459 8마리 중 5마리
실시예 4 400 toxic 모두사망
200 > 442 8마리 중 3마리
시스플라틴 4 185 모두사망
실시예 15: 동물을 이용한 약물의 조직분포 시험
동물을 이용한 암 조직에 대한 표적성 실험을 B16F10 멜라노마 고형암을 가지고 있는 쥐를 이용하여 실시하였다. 먼저 멜라노마 세포주 B16F10을 등 부분의 피하지방으로 주사하면 2주일 후에 10 mm정도의 고형암이 된다. 이 쥐의 꼬리 정맥을 이용하여 실시예 4에서 제조된 리포좀-백금 착물과 카보플라틴을 각각 200mg/kg과 20mg/kg으로 투여하고 2 시간 및 24 시간 경과 후에, 검사에 필요한 기관과 조직을 적출하였다.
심장에서는 혈액을 채취하고, 암, 신장, 근육, 간 및 폐 조직은 적출하여, 각 기관에 적체된 백금의 양을 ICP-MS 기기로 측정하였으며, 그 결과를 아래의 표 5에 나타내었다. 이로부터, 비슷한 이탈기(카복실기)를 가지고 있는 카보플라틴에 비하여 리포좀-Pt(dach)(Glu)가 폐에 특이하게 다량으로, 즉, 2시간 후에 50% 이상 적체되었다는 것과, 24 시간 경과 후에도 40% 이상 적체되어 있는 것이 확인되었다. 따라서, 본 발명에 따른 리포좀-백금 착물이 폐 지향성을 나타낸다는 것을 알 수 있다.
실시예 4 (%) 카보플라틴 (%)
투여 2시간 후 투여 24시간 후 투여 2시간 후 투여 24시간 후
혈액 8.3 2.3 10.5 13.0
암 조직 2.5 3.1 14.0 10.5
일반조직 1.3 1.1 10.8 9.0
콩팥 19.2 15.3 30.1 33.4
간 14.1 28.4 24.3 22.6
폐 54.6 49.8 10.3 11.5
합계 100 100 100 100
본 발명에 따라 백금 착물 항암제의 독성 감소, 항암 활성의 증가, 시스플라틴과의 교차 내성 극복 등이 가능하며, 폐조직에 대한 지향성을 갖는 리포좀-백금 착물 항암제 조성물 및 그 제조방법이 제공되었다.
본 발명에 따른 리포좀-백금 착물 항암제 조성물은 리포좀의 세포 흡수율이 향상되는 것에 의하여 순수한 백금 착물 항암제에 비하여 훨씬 우수한 항암 활성을나타내며, 약제 내성을 극복할 수 있고, 특히 폐조직에 대한 지향성이 우수하다.

Claims (10)

  1. 디아실콜린, 폴리에틸렌글리콜2000-아민 및 콜레스테롤로 구성되는 스텔스 리포좀과 백금 착물 항암제를 포함하며, 상기 스텔스 리포좀 중의 디아실콜린, 폴리에틸렌글리콜2000-아민 및 콜레스테롤 사이의 몰비가 45 - 50 : 5 - 10 : 40 - 45이고, 백금 착물 항암제와 스텔스 리포좀 사이의 중량비가 1 : 10 - 20인, 리포좀-백금 착물 항암제 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 디아실콜린이 디올레오일 포스포콜린, 디미리스토일 포스포콜린 및 디스테로일 포스포콜린으로 구성된 군에서 선택되고, 상기 폴리에틸렌글리콜2000-아민이 폴리에틸렌글리콜2000-디올레오일 포스포에탄올아민, 폴리에틸렌글리콜2000-디미리스토일 포스포에탄올아민 및 폴리에틸렌글리콜2000-디스테로일 포스포에탄올아민으로 구성된 군에서 선택되는 리포좀-백금 착물 항암제 조성물.
  3. 제 2 항에 있어서, 폴리에틸렌글리콜2000-아민 중의 아민이 디아실콜린과 동일 계열에 속하는 것으로 선택되는, 리포좀-백금 착물 항암제 조성물.
  4. (1) 지질 분자를 소정의 몰비로 클로로포름 용매 내에서 균일하게 혼합시킨 다음 클로로포름을 증발시켜 건조된 지질막을 얻는 단계,
    (2) 건조된 지질막에 메탄올에 용해시킨 백금 착물 항암제를 첨가한 다음 메탄올을 제거하여, 지질과 백금 착물 항암제를 포함하는 건조 슬러리를 얻는 단계, 및
    (3) 지질과 백금 착물 항암제를 포함하는 건조 슬러리에t-부탄올을 가하고 40 - 50℃에서 교반하여 투명한 용액으로 만든 다음, 동결 건조시켜, 예비 리포좀 분말을 얻는 단계를 포함하는, 리포좀-백금 착물 항암제 조성물의 제조방법.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 단계 (3)에서 얻어지는 예비 리포좀 분말에, 재구성 용액을, 얻어지는 용액의 농도가 50 - 100 mg/ml이 되도록 첨가하고, 40℃에서 교반하여, 다중막 리포좀을 얻는 단계 (4)를 추가적으로 포함하는, 리포좀-백금 착물 항암제 조성물의 제조방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 재구성 용액이 생리 식염수, 5 - 10% 덱스트로즈 또는 피비에스 용액인 리포좀-백금 착물 항암제 조성물의 제조방법.
  7. 제 5 항에 있어서, 상기 단계 (4)에서 얻어지는 다중막 리포좀을 기공 크기가 100, 200 또는 400 nm 인 멤브레인에 통과시켜 나노 크기의 리포좀-백금 착물 입자를 얻는 단계를 추가적으로 포함하는, 리포좀-백금 착물 항암제 조성물의 제조방법.
  8. 제 4 항에 있어서, 단계 (2)에서 백금 착물 항암제를, 최종적으로 얻어지는 리포좀-백금 착물 항암제 조성물에서의 백금 착물 항암제와 리포좀 사이의 중량비가 1 : 10 - 20이 되도록 첨가하는, 리포좀-백금 착물 항암제 조성물의 제조방법.
  9. 제 4 항에 있어서, 상기 지질 분자가 디아실콜린, 폴리에틸렌글리콜2000-아민 및 콜레스테롤이고, 이들 사이의 몰비가 45 - 50 : 5 - 10 : 40 - 45인, 리포좀-백금 착물 항암제 조성물의 제조방법.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 디아실콜린이 디올레오일 포스포콜린, 디미리스토일 포스포콜린 및 디스테로일 포스포콜린으로 구성된 군에서 선택되고, 상기 폴리에틸렌글리콜2000-아민이 폴리에틸렌글리콜2000-디올레오일 포스포에탄올아민, 폴리에틸렌글리콜2000-디미리스토일 포스포에탄올아민 및 폴리에틸렌글리콜2000-디스테로일 포스포에탄올아민으로 구성된 군에서 선택되는 것인, 리포좀-백금 착물 항암제 조성물의 제조방법.
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