KR20040031780A - Ｎｏ를 사용한 손톱 감염의 치료 방법 - Google Patents

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Abstract

NO가 손톱에 침투하여 항균 효과를 발휘할 수 있다는 것을 발견하여, 산화질소 생성 조성물이 조갑하 감염의 치료에 유용함을 알아내었다.

Description

ＮＯ를 사용한 손톱 감염의 치료 방법{TREATMENT OF NAIL INFECTIONS WITH NO}
손톱 감염은 흔히 일어나는 일이며, 심각할 경우에는 고통스럽거나 외관상 좋지 않아 환자의 삶의 질에 영향을 미칠 수 있다. 손톱 감염에 관련된 진균은 주로 발가락 틈에서부터 손톱까지 퍼지는 무좀(athlete's foot, 또는 tinea pedis)을 유발하는 것들이다. 손톱의 진균 감염은 조갑 진균증(onychomycosis)으로 알려져 있고, 또한 조갑 백선(tinea unguium), 피부 사상균성 조갑 진균증(dermatophytic onychomycosis) 또는 손톱 "백선(ringworm)"으로도 알려져 있다.
조갑 진균증에서 가장 빈번하게 분리되는 병원체는 피부사상균(dermatophytes), 특히, 트리코파이톤 루브럼(Trichophyton rubrum)(발톱 56%, 손톱36%) 및 트리코파이톤 멘타그로파이테스(Trichophyton mentagrophytes)(발톱19%, 손톱11%)이다. 효모 감염은 덜 일반적이지만, 보통 칸디다 알비칸스(Candida albicans)(발톱10%, 손톱30%)와 연관이 있다.
18세 미만에서는 단지 3% 이하이지만, 40대 내지 60대 인구의 적어도 15~20%가 조갑 진균증을 가지고 있고, 60대 이상의 25~40%가 그러한 상태로 고생하고 있는 것으로 추정된다. 그러나, 그것으로 고생하고 있는 사람의 적어도 50%가 의사의 진찰을 받지 않기 때문에, 조갑 진균증의 실제 발생에 대한 정확한 수치를 제시하기는 어렵다.
가벼운 조갑 진균증은 단순히 손톱 표면의 흰색 반점이나 움푹한 패임으로 한정될 수 있지만, 보다 진행된 병에서 그 증상으로는 조상 가각화증(nail bed hyperkeratosis), 조갑판 비후증(nail plate thickening), 변색 및 조갑 박리증(조상으로부터 조갑판이 분리되는 현상)이 포함된다.
당뇨병, 노화, 다한증, 조갑구만증(onychogryphosis), 외상, 말초 순환 장애 및 면역 저하를 포함하는 많은 요인들이 환자를 조갑 진균증에 걸리기 쉽게 한다. 남성에게서 더 일반적이고, 사춘기 이전 및 폐경기 전의 여성에게서는 드물다.
조갑 진균증은 진균 증상이며, 진균의 성장에 적합한 상황이 조갑 진균증의 발병을 촉진시킨다. 따라서, 사례의 80%가 발, 특히 엄지 발가락과 연관이 있고, 일반적으로 예를 들면, 꼭 맞는 양말 및 보통 스포츠 활동시에 흘리는 과잉의 땀과 연관이 있다. 그러나, 특히 긴 발가락의 발톱에 생길 수 있는 외상도 또한 중요한 병인학적 요인이 된다.
어떻게 발병되는 지에 대해 완전히 규명된 것은 아니지만, 조갑 진균증은 전염성이 있다. 피부에서 손톱으로의 진균의 퍼짐으로부터, 또는 피부 또는 손톱 감염을 가진 다른 사람으로부터 직접적으로 감염될 수 있다. 발톱 감염의 경우, 무좀균(athlete's foot fungus)은 손톱까지 퍼질 수 있고, 손톱 외상이 있는 경우는 종종 상기 진균의 침입을 용이하게 한다.
상기 증상이 국소적 약물 치료에 높은 내성이 있기 때문에, 질병의 유행에도 불구하고, 조갑 진균증에 대한 치료는 어느 정도로 제한되어 있다. 국소적 약물 치료에는 로세릴(Loceryl; 아모롤핀, amorolfine) 및 펜락(Penlac; 시클로피록스, ciclopirox)이 포함되지만, 원인이 되는 유기체에 대해 낮은 활성을 나타낼 뿐만 아니라, 손톱을 통해 잘 침투하지 못하기 때문에, 치료율이 낮고(<10%), 치료에 많은 시간(12달 까지)이 걸린다.
조갑 진균증 및 기타 손톱 감염의 치료에 수반되는 한가지 특수한 문제점은, 상기 감염이 손톱 그 자체 뿐만 아니라, 일반적으로 조상 내, 또는 조상에 인접하여 위치한다는 것이다. 따라서, 상기 감염은 외관이 손상되는 손톱에 의해 외부 공격으로부터 보호받는다. 전염력을 가진 유기체를 노출시키기 위해 손톱을 제거하는 것을 치료법으로서 포함할 수 있지만, 너무 많은 손톱을 제거하는 것은 바람직하지 않다. 또한, 치료 기간은 일반적으로 일년 이상이다.
보다 최근에는, 보다 높은 치료율(~70%) 및 보다 짧은 치료 기간(12~16주)을 가지는 경구용 치료제[터비나핀(terbinafine) 및 이트라코나졸(itraconazole)]가 개발되고 있다. 그러나, 이러한 새로운 경구 치료법은, 간 독성, 심각한 피부 반응 및 약물 상호 작용을 포함하는 안전성에 대한 우려가 있다.
따라서, 그러한 경구 치료법과 유사하거나 보다 우수한 치료율을 제공하면서안전성에 대한 우려는 감소된 국소적 치료법, 또는 손톱을 통한(transungual) 치료 방법이 요구된다.
본 발명은 손톱 감염 및 발톱 감염의 치료 방법, 상기 치료에 사용되는 약물 및 상기 약물의 제조 방법에 관한 것이다.
도 1은 억제 영역을 측정하는데 사용되는 테스트를 설명한다.
도 2는 본 발명의 조성물로부터의 산화질소의 용출을 측정하기 위해 설비된 프란쯔 셀(Franz cell)을 나타낸다.
도 3은 아질산염 및 산을 함유하는 겔화제를 선택한 것으로부터의, 시간에 대한 NO의 생성을 나타낸다.
도 4는 용액 및 겔에 기초한 포뮬레이션에 대한 억제 영역을 나타낸다.
도 5는 환원제의 존재하에서 관찰된 특정 포뮬레이션에 대한 억제 영역을 나타낸다.
도 6은 α-토코페롤 및 기타 환원제의 존재하에서 관찰된 특정 포뮬레이션에 대한 억제 영역을 나타낸다.
도 7은 다양한 포뮬레이션에 의해 생성된 NO 및 NO2/NO3농도의 평균 피크를 나타낸다.
도 8은 관찰된 다양한 포뮬레이션으로부터의 최대 NO 생성에 도달할때 까지의 평균 시간을 나타낸다.
도 9는 18시간 이상 10%의 산 및 10%의 아질산염 용액을 적용한 것으로부터의, 손톱을 통과한 NO의 양을 나타낸다.
도 10은 18시간 이상 5%의 산 및 5%의 아질산염 용액을 적용한 것으로부터의, 손톱을 통과한 NO의 양을 나타낸다.
도 11은 도9 및 도10에서 손톱을 통과한 NO의 양을 측정하기 위해 사용된 설비를 나타낸다.
도 12는 18시간 이상 10%의 아스코르브산 및 10%의 아질산염 용액을 적용한 것으로부터의, 손톱을 통과한 NO의 양을 나타낸다.
도 13은 본 발명의 조성물을 인간의 손톱에 적용하여 얻어진 억제 영역을 측정하는데 사용하는 프란쯔 셀 설비를 나타낸다.
놀랍게도, 본 발명자들은 산화질소가 손톱에 침투할 수 있고, 조갑하 감염의 원인이 되는 유기체의 치료에 효과적임을 발견하였다.
따라서, 첫번째 측면에서 본 발명은, 조갑하 감염의 치료에 유용한 산화질소 생성 조성물을 제공한다.
산화질소(NO)는 본 발명의 조성물의 주요 산물이며, 항균성 및 상처 치료 효과를 가지는 것으로 잘 알려져 있다[참고 WO95/22335; 및 Hardwick et al.,(2001), Clin. Sci.,100, 395-400].
산화질소는 체내 - 활성화된 마크로파지에서 뿐만 아니라, 혈관 내피(vascular endothelium) 및 뉴런 - 에서 합성된다. 비교적 높은 수준의 NO가 땀에서 관찰된다. NO가 미생물을 죽이는 기작은 정확하게 알려져 있지 않지만, NO가 박테리아성 DNA를 파괴하거나, 전이 금속을 포함하는 박테리아 효소의 기능을 방해하는데 기여하는 것으로 추측된다.
치료용의 산화질소는 아질산염을 산과 반응시키는 것, 특히 무기 아질산염을 유기 산과 반응시키는 것에 의해 가장 간편하게 생성된다. 이는 분자 형태의 아질산을 생성하고, 즉시 물분자 및 3산화 2질소(N2O3)로 해리된 후, NO 및2산화질소(NO2)로 해리된다. 그 반응을 하기 반응식1에 나타낸다.
NO2 -+ H+↔ HNO2
2HNO2↔ N2O3+ H2O
N2O3↔ NO + NO2
N2O3는 상기 반응에서의 중간 생성물이지만, 그것은 독립적으로 존재할 수 있고, 본 발명의 조성물과 관련이 있는 살균 효과에 적어도 부분적으로 관여할 것이라는 증거가 있다.
아스코르브산 등의 환원제의 존재하에서는, N2O3에서 NO로의 반응이 보다 효과적이고, 예를 들면 하기 반응식2와 같이 나타낼 수 있다.
N2O3+ C6H8O6→ 2NO + H2O + C6H6O6
예를 들면, 아질산염에 대한 산의 작용에 의하여, 특히 결과물인 염이 불용성인 경우, 아질산이 적절하게 생성될 수 있다.
본 발명에서는, 산화질소의 적합한 원료, 바람직하게는 적어도 일부의 NO를제공하는 원료를 채용할 수도 있지만, 일반적으로는 상기 반응 중 하나 또는 그 이상에 따라서 산화질소가 생성되는 것이 바람직하다.
본 발명의 조성물은 산화질소를 제공하는데 적합한 어떤 것이어도 좋다. 일실시예에서, 본 발명의 조성물에 의해 생성되는 NO의 비율은 적어도 50%인 것이 바람직하고, 적어도 80%인 것이 보다 바람직하다. 사용되는 단일산이 환원산(reducing acid)인 경우, 이 비율은 생성되는 산화질소에서 NO의 함량이 100%까지 상승할 수 있다.
"산화질소 생성"은, 본 발명의 조성물이 인 시튜, 즉, 적용되는 위치에서 산화질소를 방출한다는 것을 의미하며, 일반적으로는 감염된 손톱 위가 될 것이다. 간단한 것으로서 일실시예에서는 연고 또는 겔, 또는 실질적으로는 가스상의 NO가 용해되어, 예를 들면 일단 손톱에 적용되면 NO를 방출하는 그 외 적합한 국소 매체(vehicle)를 포함할 수 있다.
효과를 나타내는데 단지 매우 소량의 산화질소만이 요구된다고 가정하면, 가스가 손톱의 경계면에서 다른 곳으로 새어나가거나, 실질적으로 단지 소량만이 손톱을 가로질러 통과하거나, 또는 손톱을 가로지르면서 산화질소의 양이 희박화되는 경우에도 문제되지 않고, 작용 부위에 도달하여 살균 또는 억제 효과를 가지는 충분한 양의 산화질소가 제공된다.
NO 및 그의 전구체는 일반적으로 단지 수 초밖에 되지 않는 짧은 반감기를 가지지만, 본 발명자들은 NO가 조갑하 감염을 치료하는데 충분한 양으로 인간의 손톱을 통과할 수 있다는 것을 입증하였다. NO 또는 다른 산화질소가 손톱을 통과하는데 수 시간이 걸릴 수 있다는 것에 대한 증거가 있다는 것 뿐만 아니라, NO/다른 산화질소가 방출되기 시작하면, 그 방출은 10시간 이상까지 지속될 수 있다는 것은 모두 보다 놀라운 것들이다. 이론에 의해 확립된 것은 아니나, 손톱은 저장소로서 작용하며, NO 또는 그의 전구체를 흡착하거나 흡수하는 것으로 여겨진다. 상기 NO 또는 전구체는 손톱을 통과하고, NO 및 그 외 산화질소는 다른 곳에서 방출된다. 가스의 반감기가 짧다고 가정하면, 그들은 손톱 내에서 단백질을 합성하고, 서서히 확산될 가능성이 있다.
NO가 항진균 효과를 가진다는 것은 알려져 있지만, 손톱을 가로질러 침투하는데 NO가 필수적인지, 그리고 전구체가 일단 손톱을 통과하면 NO가 재생되기만 하는 것인지는 분명하지 않다. 실제로, 다량의 NO를 생성하는 조성물은 본 발명에서 최대의 효과를 나타내는 데에 필수적인 것은 아니다. 이론에 의해 확립된 것은 아니나, 짧은 반감기를 가지는 NO를 손톱을 통해 대량으로 확산시킬 수 없으므로, 손톱 표면에서 NO가 효과적으로 빨리 생성되도록 하는 것에 대한 이점이 없을 가능성이 있다. 대신, NO를 생성하는데 보다 긴 시간이 드는 조성물이, 손톱을 통해 살균 성분 - 상기 성분이 NO이건 다른 산화질소이건 - 을 운반하는데 보다 효과적인 것으로 여겨진다.
아스코르브산 또는 기타 유사한 환원산 및 아질산염 만을 필수적으로 포함하는 본 발명의 조성물은 다량의 NO를 빨리 생성하는 경향이 있다. 손톱은 어느 정도 다공성이지만, NO가 너무 빨리 생성될 경우, 손톱이 생성된 다량의 NO를 흡착하는데 시간이 불충분할 수 있고, 실험은 이들 조성물이 손톱을 통한 NO의 보다 느린전반적인 유속과 관련이 있음을 보여준다.
아질산 은은 산의 존재하에서 NO를 생성할 수 있지만, 비교적 낮은 효능을 가지므로 일반적으로 바람직하지 않다. 그러나, 아질산 나트륨 및 아질산 칼륨은 둘 다 아세트산, 시트르산, 말레산 및 말산과 반응하여, 예를 들면, 살균 테스트에 있어서 억제 영역을 조성하는 것을 발견하였다.
아질산 나트륨 및 아질산 칼륨에 있어서의 진균 균사체를 죽이는 수준은, 아세트산, 시트르산, 말레산 또는 말산과 혼합한 경우, 유사하다는 것을 알아내었고, 모두 큰 억제 영역을 나타내었다. 마찬가지로, 포자로 수행한 실험에서도 상기와 동일한 산-아질산염 혼합물에 대해서 유사한 항-진균 효과가 나타나는 것을 알아내었다. 일반적인 결과는, 용액이 크림에 비해 보다 우수한 항-진균 활성을 나타내고, 한편, 균사체가 포자보다 항-진균 효과에 더 민감하다는 것이다. 그러나, 크림은 일반적으로 더 오랫동안 산화질소를 생성하므로, 손톱을 통한 침투를 향상시키기 위하여 손톱 표면에서의 NO 또는 기타 산화질소의 생성을 연장시키고자 하는 경우에 장점이 있을 수 있다.
상기 산-아질산염 혼합물에 의해 생성되는 NO의 양은 억제 영역의 크기와 반드시 상관 관계가 있는 것은 아니지만, 생성된 산화질소의 전체량과는 일반적인 상관 관계가 있다. 예를 들면, 다량의 NO를 생성하는 아스코르브산-아질산염 용액은 일부 테스트에서 항-진균 활성을 거의 나타내지 않는 반면에, 아질산 칼륨과 말산 조합물은, 시트르산의 경우에서와 같이, 상기 NO 양의 대략 반 정도를 생성하지만, 억제 영역의 크기가 반드시 더 작은 것은 아니었다.
살균을 위해서는 일반적으로 적어도 5분간 활성 물질에 노출시켜야 하기 때문에, 손톱에서 먼 곳으로부터 산화질소를 지연 방출시키는 것은 특히 유용하다. 활성 가스에 노출시킨 후 항-진균 활성은 일반적으로 2시간까지 계속해서 증가하지만, 최고조에 이른 살균은 약 30분 즈음에 관찰된다.
상기 산화질소 생성 조성물은 적합한 형태를 취할 수 있다. 그러나, 산화질소의 생성이 활발한 경우, 그 반응물은 산화질소가 실제로 필요할 때까지 서로 분리시켜 두어야 할 것이다. 이것은 일반적으로 바람직하지만, 항상 적용되어야만 하는 것은 아니다. 예를 들면, 차단 패치를 산화질소 생성 재료가 적재된 겔 또는 매트릭스와 함께 구성하고, 가스상의 방출을 방지하기 위하여 상기 패치를 적합한 안전띠로 보호할 수 있다.
그러한 패치에 있어서, 매트릭스 또는 겔은 접착성이 있는 것이 바람직하며, 그 접착 강도는 산화질소가 안전띠를 밀어내고 새어나가는 현상을 막기에 충분한 정도가 바람직하지만, 접착 강도가 패치를 적용시킬 경우 안전띠가 제거되지 않을 정도여서는 안된다. 또한, NO의 수명을 연장하거나, 그것의 생성율을 감소시키기 위하여, 킬레이트화제 등의 적합한 안정제를 겔 또는 매트릭스 내에 제공하는 것도 바람직하다, 또한, NO는 비수성 및 지질 물질 중에서 보다 잘 용해되기 때문에, 치료제에의 그러한 물질의 첨가는 감염된 손톱 및 조상으로의 NO의 운반 및 NO의 활성을 지연시킬 수 있다.
그럼에도 불구하고, 유리된 NO를 이미 포함하는 조성물은 얼마간의 긴 시간 동안 일반적으로 불안정할 것이므로, 제조 이후에는 가능한 한 빨리 환자에게 사용하는 것이 바람직할 것이다.
보다 바람직한 것은 본 발명의 조성물을 다수개의 구성 부분으로 제공하는 것이다. 이러한 구성 부분은 각각, 따로따로 활성물 또는 반응물을 포함할 수 있고, 혼합하였을때 산화질소를 생성한다. 따라서, 제1 조성물은 적합한 매체에 제공되는 적합한 아질산염을 포함할 수 있다. 제2 조성물은 적합한 산을 포함할 수 있다. 이어서, 상기 두 조성물을, 바람직하게는 직접적으로 혼합한 후, 감염된 손톱에 적용할 수 있고, 또는 적용될 위치(in situ)에서 혼합하여도 좋다. 최종 산화질소 생성 조성물을 이루기 위해, 혼합에 필수적인 성분의 개수를 최소화하는 것이 일반적으로 바람직하지만, 수 개가 제공되어도 된다. 특히, 예를 들면, 환원산을 포함하는 제3 조성물을 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 그러나, 아스코르브산염 등의 환원산을 사용하는 경우, 그 자체를 산으로서 사용하거나, 아질산염으로부터 조성물을 분리하여, 제1 산과 함께 제공하는 것이 일반적으로 바람직하다.
상기 아질산염 성분은 예를 들면, 오이드라지트 L100(Eudragit L100, 상품명), 카르보폴(carbopol), 카르복시메틸셀룰로오즈 또는 하이드록시메틸셀룰로오즈 등을 포함하는 범위의 부형제와 함께 혼합하여도 좋고, 상기 산 조성물은 카르보폴, 카르복시메틸셀룰로오즈, 하이드록시메틸셀룰로오즈, 메틸셀룰로오즈 등의 또다른 적합한 부형제 또는 수성 염기와 함께 혼합하여도 좋다. 폴리비닐 알코올, 프로필렌 글리콜, 폴리비닐피롤리돈(포비돈), 젤라틴, 구아검(guar gum) 및 셸락(shellac) 등의 기타 부형제는 막 형성을 돕는데 유용하고, 인 시튜에서 조성물을 유지시키는데 유용하다.
특히, 진피 및 각질층을 통해 물질을 도입시키는데 적합한 조성물은 일반적으로 손톱에 대해서는 적합하지 않을 수 있는데, 이는 각질층은 일반적으로 소수성인 반면에, 손톱은 사실상 친수성 물질이기 때문이다. 따라서, 물에 쉽게 용해되는 이온성 물질 및 이온화될 수 있는 물질이 손톱으로 흡수되는 것을 바람직하게 달성할 수 있을 것이고, 부형제로 이를 촉진시키는 것은 바람직하다.
침투를 돕기 위해서는, 일반적으로 수성 포뮬레이션을 사용하는 것이 바람직하다. 그러한 포뮬레이션은 이동성이 있는 액체이어도 좋지만, 손톱에 대한 NO 및/또는 기타 산화질소의 노출은 특정한 최소 길이 만큼 하는 것이 최적일 것으로 여겨지기 때문에, 손톱 표면에의 흡수를 위한 충분한 시간을 부여하기 위해서는 산화질소의 생성이 너무 빨리 종료되지 않는 것이 일반적으로 바람직하고, 겔, 크림, 로션, 연고 형태 또는 래커 등의 기타 농축된 형태의 포뮬레이션이 일반적으로 바람직하다. 적합한 농축 정도 및 기타 특성은 상기 언급한 바와 같은 적합한 부형제의 사용에 의해 달성될 수 있다. 예를 들면, 그것은 포뮬레이션으로부터의 산화질소의 방출 형태를 변화시킬 수 있는 오이드라지트(Eudragits, 상품명)에 의해 달성된다.
바람직한 일실시예에서, 상기 조성물은 서로 분리된 유기 산의 수성 제제 및 아질산염의 수성 제제를 포함한다. 보다 바람직하게는, 각 제제는 겔, 크림, 로션, 연고, 또는 유사한 그룹에서 선택된 또다른 것과 혼합하는데 적합한 페인트의 형태이다. 하나 또는 둘 다의 제제는, 혼합 중에 산화질소의 방출을 지체시키는데 적합한 부형제를 포함하는 것이 특히 바람직하다. 아질산염의 경우, 바람직한 부형제는 오이드라지트 L100(Eudragit L100, 상품명)과 같은 오이드라지트 (Eudragit, 상품명)이다. 둘 다에 대한 기타 바람직한 부형제는 상기 예시한 바와 같다.
선택된 부형제는 단순히 산화물의 방출을 지연시키기 위한 것이어도 좋지만, 일반적으로는 농축 특성도 또한 가져야 하고, 상기 부형제의 양은 적합한 겔을 제공하는데 필요한 양에 의해 일반적으로 결정된다. 이는, 이미 당업자에 의해 결정되고 인식된, 잘 알려진 제한 범위 내에서 변경하여도 좋다. 그러나, 가이드로서 적합한 양을 약 1%와 약 40% 사이에서 변경할 수 있지만, 부형제들 간에는 큰 차이가 있다. 일반적으로, 바람직한 부형제는 3~5%와 같이 단지 2~10% 사이의 양으로 사용하는 것이 요구되지만, 주로 겔화를 위해 사용되는 것은 그 목적을 달성하기 위한 적합한 양을 조합한 형태로, 또는 각각 사용할 것이다. 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜은 점착제로서 약 10%에서 50%까지의 범위의 양으로 적합하게 사용하지만, 보다 바람직하게는 약 20~35% w/v이다. 적합한 농축제에는 카르보폴 및 셀룰로오즈 유도체가 포함되고, 이들은 요구되는 포뮬레이션의 특성에 따라 약 2%와 10% 사이의 양으로 전형적으로 채택된다. 바람직한 포뮬레이션은 이동성이 있는 겔이다.
비록 아질산염 및 산의 수성 조합물이 그러한 부가적인 조성물의 어떤 것도 필요로 하지 않고, 손톱을 통해 산화질소를 쉽게 제공할 수 있지만, 본 발명의 조성물이 필요에 따라 표면 활성화 시료 및/또는 침투 시료 뿐만 아니라, 필요에 따라 산화 방지제, 방부제, 착색제 및 향 등의 기타 성분을 포함하여도 좋은 것이 이해될 것이다.
여기서 본 발명은, 최종 조성물인 산화질소 생성 조성물을 제공하기 위하여, 일반적으로 두개의 조성물을 혼합하는 것으로 설명하지만, 그러한 언급은 명확하거나 지적한 경우가 아니라면, 두개 이상의 초기 조성물에 대한 언급을 포함하는 것으로 인식하여야 할 것이다.
본 발명의 조성물은 혼합을 위해 어떤 적합한 매체를 포함하여도 좋다. 중요한 것은, 산과 아질산염 또는 아질산염 전구체가 원하는 산화질소를 생성하도록 반응할 수 있는 것이어야 한다는 것이다. 따라서, 최종 조성물을 제공하는 초기 조성물 중 적어도 하나는 산화질소 생성 반응이 일어나도록 수성 조성물을 포함하는 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는, 재료의 혼합을 촉진하기 위해 초기 조성물 둘 다가 수성 성분을 포함하여야 하지만, 상기 재료들을 단지 천천히 반응시키고자 하는 경우에는, 초기 조성물 중 하나 또는 둘 다의 물의 양을 최소화하는 것이 좋다.
최종 조성물을 수득하기 위해 혼합되어 상기 최종 조성물이 산화질소를 생성하도록 제공되는 초기 조성물은 그 형태에 어떤 제한도 없다. 이러한 측면에서 전체적으로, "산화질소"에 대한 언급은, 100%의 NO에 대한 언급을 포함하는 것으로 받아들여질 것이나, 반드시 요구되거나 바람직한 것은 아니다.
예를 들면, 초기 조성물은 액체, 겔 또는 고체 등의 어떤 적합한 형태이어도 좋지만, 하나가 고체일 경우, 다른 하나는 바람직하게는 액체 또는 겔이다. 액체의 카테고리에는 용액, 현탁액 및 콜로이드가 포함되고, 그러한 관점은 또한 겔에도 적용되며, 일반적으로 액체와 고체 사이의 어떤 상태를 포함한다.
특히, 겔은 크림, 연고, 팅크(tinctures), 왁스 및 로션과 같은 상태를 포함하지만, 로션은 그의 특징에 따라 액체의 범주에 속할 수 있다. 어떤 특정한 배제없이, 액체, 겔, 고체는 활성용 매체로서 제공될 수 있다.
고체 매체는 패치 내의 매트릭스, 또는 예를 들면 보다 긴 사슬의 왁스를 포함할 수 있다.
초기 조성물은, 최종 조성물이 산화질소를 생성하도록 하기 위해서, 적용하기 전에 혼합하거나, 또는 그 위치에서 적합하게 혼합할 수 있다. 그러한 혼합물은, 예를 들면, 손톱에 적용하여 그곳에 남겨둘 수 있는 겔/겔 혼합물일 수도 있다. 또한, 두개의 액체를 포함하여, 그들 간에 겔, 래커, 고체 또는 페인트와 같은 것을 형성할 수도 있으며, 또한, 두개의 겔 또는 액체와 겔을 포함하여, 고체화되거나, 래커를 형성하거나, 그렇지 않으면 보호성 환경을 형성하여 산화질소를 생성, 유지 및 분산하도록 할 수도 있다.
바람직한 일실시예에서, 겔이 손톱에 적용된 후, 기타 활성물이 함유된 매트릭스를 지닌 회반죽 등의 패치가 겔 상에 적용되고, 일단 접촉되면, 상기 활성물은 천천히 상호 작용하여 산화질소를 생성한다.
또다른 바람직한 일실시예에서, 상기 활성물은 페인트 또는 래커로서 분산시킬 수 있다. 바람직하게는, 제1 조성물, 예를 들면 아질산염을 적용하여 건조시킨 후, 제2 조성물을 그 위에 도포한다. 제2 조성물 내의 물은 반응을 촉진시킨다. 필요에 따라, 알코올 또는 아세테이트 등의 급속 건조 용매를 사용할 수 있지만,그러한 용매 및 침투 촉진제가 필수적이지 않은 것이 본 발명의 장점이다. 그러나, 예를 들면, 혼합 중에 중합 반응이 일어나도록, 분리시켜둔 제제 내에 막 재료를 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 촉매는 한 제제 내에 제공될 수 있고, 한편 중합 가능한 모노머로 선택한 것은 다른 하나의 제제 내에 제공될 수 있다. 또한, 용매가 증발되는 것은 제제 내의 폴리머를 더욱 겔화시키거나, 경화시킬 수 있다.
본 발명의 조성물의 산화질소 생성 양상은 일반적으로 2시간 또는 3시간이 경과됨에 따라 감소되기 시작하지만, 드물게는 손톱의 흡수 효과가 이보다 현저하게 긴 시간동안 손톱의 다른쪽 부분에서 산화질소를 제공한 후, 비로소 산화물의 생성이 효과적으로 중지된다. 산화물이 생성되는 동안, 혼합된 조성물은 인 시튜에 두는 것이 바람직하고, 그것은 조성물을 세팅하는 것에 의해 달성될 수 있다. 선택적으로, 예를 들면, 차단용 붕대로 손톱을 보호하는 것이 바람직할 수 있다.
또다른 바람직한 일실시예에서, 패치의 매트릭스 또는 회반죽은 비수성(non-aqueous)이지만, 친수성(hydrophilic)이고, 실질적으로 건조된 형태로 활성물의 혼합물을 함유한다. 이 경우, "건조된 형태"란 용어는, 예를 들면 결정화된 물과 결합한 결정체를 포함할 수 있다. 따라서, 둘 다의 활성물이 패치의 매트릭스 또는 회반죽 내에 존재하더라도, 반응 환경을 제공하는, 용매로서 작용하는 적절한 양의 물이 없으면 반응할 수 없다. 패치 또는 회반죽을 적용하는 것이 요구될 경우, 보호용 안전띠를 제거할 수 있고, 몇 방울의 적절한 양의 물을 매트릭스에 적용하여 활성물 재료가 활성화되도록 할 수 있다. 이와 같이 활성화된 패치는 손톱에 적용되어, 생성된 산화질소가 그 효과를 발휘하도록 할 수 있다.
실질적으로 건조된 조성물에 물을 첨가하여 제공하는 이와 같은 원칙은 또한 다른 조성물에도 적용할 수 있다. 그러한 경우에서, "건조된"이란 용어는 물과 유리된 내용물에 적용하고, 한편 조성물은 물 함유량이 1% 또는 그보다 낮은 극소량인 겔일 수 있다. 조성물은 실질적으로 무수물인 것이 바람직하다.
본 발명의 조성물의 활성화 재료는 적절한 양으로 존재하는 것이 좋고, 이는 당업자에게 있어서 분명할 것이다. 일반적으로, 아질산염의 양은 중량부로서 최종 조성물의 약 0.5~30%인 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는, 아질산염 또는 그의 전구체의 양은 1~20%, 특히 1~15%, 바람직하게는 5~15%이다. 바람직한 범위는 1~10% 또는 2~10%이다. 보다 고농도인 것이 일반적으로 바람직하고, 최소 농도가 8~10%인 것이 바람직하다. 크림, 로션 및 겔에서, 상한이 약 13.5%인 것으로 파악되지만, 적합한 포뮬레이션은 보다 높은 수준도 허용할 수 있다.
본 발명의 조성물은 두가지의 수성 겔, 로션 또는 크림으로서 제공되는 것이 일반적으로 바람직하다. 보다 바람직하게는, 한가지는 0.75%, 2.25%, 4.5%, 9% 및 13.5% w/w와 같이, 0.5~20% 사이의 농도로 시트르산을 함유하고, 다른 한가지는 상기 언급한 바와 같이, 예를 들면 0.5%, 1.5%, 3.0%, 6% 및 9% w/w로 아질산 나트륨을 함유한다. 각 활성화 성분에 대한 바람직한 농도는 10% 범위 이내이고, 이는 적합한 초과량의 산을 제공한다. 또한, 손톱을 통해 산화질소의 유효량을 제공하기 위하여, 둘 다의 활성화물은 적어도 2%, 바람직하게는 5% w/w 또는 그 이상으로 존재하는 것이 바람직하다. 바람직한 일실시예에서, 산은 13.5%의 양으로 존재하고, 아질산염은 9%으로 존재하는 반면, 또다른 일실시예에서, 각각은 10%의 양으로존재한다. 바람직한 산은 시트르산이고, 바람직한 아질산염은 아질산 나트륨이다.
상기 겔, 로션 또는 크림은 예를 들면, 발톱 또는 손톱(들)의 감염된 부위를 도포하기 위하여, 환자에 의해 적절한 양으로 혼합될 수 있다. 각각의 겔, 로션 또는 크림의 적합한 양은 0.05~1g, 보다 바람직하게는 0.1~0.5g이고, 상기 성분들이 반응하여 산화질소를 생성한다.
산은 아질산염 또는 그의 전구체와 비교하여, 적어도 화학양론적인 양으로 존재하는 것이 바람직하다. 상기 산은, 충분한 양의 아질산염이 산화질소를 생성하도록 산성 환경을 조성하기에 충분하도록, 화학양론적으로 과잉인 양으로 존재하는 것이 보다 바람직하다. 상기 아질산염의 전량이 산화질소를 생성하는데 필수적인 것은 아니지만, 일반적으로 너무 많은 아질산염을 미반응 상태로 두는 것은 효과적이지 않고, 대부분의 아질산염을 산화질소로 전환시키는 것이 바람직하다.
일반적으로, 상기 산은 최종 조성물의 pH가 5 또는 그 이하, 특히 pH 4 또는 그 이하이도록, 충분한 양으로 존재하는 것이 바람직하다. 그러나, 산화질소 생성 반응은 보다 높은 pH에서 일어나고, 특히 과잉의 환원산의 존재하에서는 pH 5.5 또는 pH 6도 수용될 수 있으므로, 최종 조성물의 pH는 본 발명의 필수적인 부분을 형성하는 것은 아니다.
상기 아질산염은 일반적으로 약학적으로 허용되는 것 이외의 것이라도 어떤 제한은 없다. 최종 조성물은 일반적으로 환자의 손톱에 적용될 것이기 때문에, 이러한 요건도 중요한 고려 사항이 아니므로, 피부 접촉을 최소화함으로써 동시에 잠재적인 조직 노출(systemic exposure)을 최소화한다. 그럼에도 불구하고, 안전성의 관점에서, 상기 아질산염 또는 그의 전구체는 국소 투약용으로 일반적으로 안전한 것이 바람직하다.
편의상, 상기 아질산염의 성질은 일반적으로 무기성(inorganic)이고, 적어도 부분적으로 물에 용해되는 것이다. 바람직한 것은 알칼리 금속 아질산염 및 알칼리 토금속 아질산염이지만, 적합하다면, 특히 용해성이 있다면, 전이 금속 화합물 등의 기타 적합한 아질산염도 또한 사용할 수 있다. 특히, 나트륨, 칼륨, 마그네슘 및 바륨 화합물을 사용할 수 있고, 비용 및 유용성의 관점에서 상기 나트륨 및 칼륨 화합물이 일반적으로 바람직하다.
적합한 산성화제(acidifying agent)에는 무기산이 포함되지만, 통상 약학적으로 불허되는 것은 일반적으로 바람직하지 않다. 따라서, 보다 바람직한 것은 유기 산이며, 특히 물과 함께 용액을 형성하고 pH 4 이하로 될 수 있는 것이 바람직하다. 그러한 산에는 포름산, 말산, 말레산, 아세트산, 락트산, 시트르산, 벤조산, 타르타르산 및 살리실산이 포함되고, 이러한 목록은 배타적이기 보다는 포괄적일 것이다. 또다른 적합한 산으로는 아스코르브산 및 아스코르빌 팔미트산염이 포함되고, 이들은 산성 용액을 반드시 형성하지 않지만, 환원산이며, 생성되는 NO의 양을 증가시키는 장점이 있고, 또한, 일단 NO가 생성되면 생성된 상기 NO를 안정화시킬 수 있다. 여기서의 산에 대한 언급은, 혼합하기 이전에 처음부터 아질산염 용액이나 제제 내에 존재해 있을 수 있는 생리학적으로 바람직하게 허용되는 탈보호기제(deprotecting agent)와 함께, 또는 다만 물과 함께 산의 수성 용액을 제공하는데 적합한 어떠한 형태의 산에 대한 언급도 포함한다. 적합한 형태의 일예로는, 시트르산 1수화물 및 그의 무수물 형태 등의, 상기 산의 수화물 형태 및 무수물의 형태가 포함된다.
환원산은 유익한 특질을 가지고 있기 때문에, 일실시예에서 최종 조성물을 형성할때, 첫번째 산에 더하여 환원산을 제공하는 것이 바람직하다. 적합한 비율은 첫번째 산의 약 5%에서 약 200% 사이이며, 보다 바람직하게는 5% 내지 약 150%까지이고, 특히 첫번째 산의 5%에서 40% 사이, 더욱 바람직하게는 10%에서 20% 사이이다.
본 발명은 첨부한 실시예에 따라, 특히 유기체가 트리코파이톤 루브럼(T. rubrum)인 경우, 억제 영역을 생성할 수 있는 어떠한 조성물까지도 확장된다.
또한, 본 발명은, 여기서 설명하는 조성물의 유효량이 감염된 손톱에 적용되는데 있어서, 조갑하 감염의 치료 방법에까지 확장된다.
또한, 본 발명은, 조갑하 감염의 치료 또는 예방를 위한 의약의 제조에 있어서의 산화질소 생성 조성물의 용도에까지 확장된다.
본 발명은 여기에서 정의한 바와 같은 조성물을 포함하는 구성 부분들의 키트를 포함한다. 특히, 바람직한 일실시예에서, 본 발명은 아질산염의 수성 제제 및 유기 산의 수성 제제를 포함하며, 그들이 서로 분리되어 배치된 키트를 제공하고, 상기 두 가지의 제제는 상기 아질산염과 산이 반응하여 손톱 내로의 침투를 위한 산화질소를 방출할 수 있으므로 각각 손톱에 적용하여 치료하는데 적합하다. 상기 제제는 여기서 설명한 바와 같은 농도 및/또는 형태, 특히 로션, 겔, 크림 또는 래커인 것이 바람직하고, 각 키트가 복수개의 복용량 또는 적용량을 제공할 수있도록 재밀봉이 가능한 용기에 넣어 적절하게 제공한다.
본 발명의 조성물을 사용함으로써 어떤 형태의 조갑하 감염도 치료할 수 있다. 그러나, 일반적으로 조갑 진균증을 치료하는데 바람직하다.
일반적으로, 적절한 치료 기간은 숙련된 의사에 의해 미리 결정되어질 것이다. 그러나, 일반적으로는 실질적인 치료 또는 완전한 임상 치료가 달성될 때까지 치료를 계속하는 것이 바람직하다. 전자의 경우, 원인이 된 유기체는 죽지만, 손톱은 새로이 자라나는데 6달이 소요되고 발톱은 1년까지 걸릴 수 있기 때문에, 손톱의 외관이 여전히 손상되어 있을 수 있다. 임상 치료는, 감염된 손톱이 더 이상 감염의 기미를 나타내지 않을때 달성되고, 이는 손톱이 새로이 자라나는데 좌우되기 때문에 실질적인 치료보다 현저하게 긴 시간이 걸릴 수 있다.
일반적으로는 적어도 2달 동안 치료를 지속하는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 3달, 특히 3~6달 사이가 바람직하다. 사실, 본 발명자들의 테스트는 치료에 착수한지 수일 이내에 원인이 된 유기체가 죽는 것으로 여겨짐을 보여주기 때문에, 특히, 예를 들면 조성물을 하루에 2회 또는 3회 적용할 경우, 1주간의 치료가 충분할 수 있다. 치료하는 데에는 3개월의 치료 계획이 알맞을 것으로 파악되고, 이는 또한 환자에게서 건강한 손톱이 자라나는 것의 관찰을 가능하게 한다. 그러나, 치료는 원하는 바에 따라, 예를 들면 임상적 치료가 달성될 때까지 계속되어도 좋고, 그것은 치료 및 손톱의 성장을 가능하게 하는 14달 이상까지가 될 수 있다.
적용할 조성물의 1회 분량은 환자의 연령 및 체중 등의 지표에 따를 수 있지만, 특히 적용되는 곳의 두께 및 범위와 같은, 손톱의 너비에 따라 달라질 수 있고, 그것은 숙련된 의사에 의해 미리 결정될 것이다. 본 발명은 효과를 얻기 위해 소량의 산화질소만을 필요로 하므로, 환자에 따라 처방을 달리하는 것이 필수적으로 요구되는 것은 아니며, 한 종류의 포뮬레이션을 모든 환자에 대해 사용할 수 있다는데 장점이 있다. 그러나, 예를 들면, 발톱에서의 지속적인 상태에 대해서는 보다 높은 산화물 생성 포뮬레이션을, 손톱에 대해서는 보다 약한 포뮬레이션을 채택하는 것과 같이, 강도를 달리하는 것은 채택될 수 있다. 그러한 강도는, 생성되는 산화물의 양과 반드시 관련되어 있지 않지만, 주어진 조성물에 의해 산화물이 생성되는 시간의 길이와 동등하게 관련되어 있을 수 있다.
본 발명의 조성물을 투여하는 것은 하루에 2회 이상, 바람직하게는 하루에 2회 또는 3회인 것이 본 발명의 바람직한 일실시예를 형성한다. 이는, 이전 투여의 효과가 사라질때 즈음에 손톱의 감염된 측면에 산화질소의 수준을 효과적으로 상승시킬 수 있다. 1회 분량은 손톱을 통한 산화질소의 연속적인 운반, 또는 원하는 바에 따라 비연속적인 운반을 유지하도록 선택할 수 있다.
본 발명의 조성물은 어떤 적합한 수단으로 제조하여도 좋다. 상기 조성물이 수성 성분 - 일반적으로 활성화 재료를 물에 용해시킨 것이 바람직함 - 을 포함하거나, 또는 수성 제제를 포함할 경우, 필요로 할 때까지 다른 활성화물과 분리시켜 둘 수 있다. 일반적으로, 첫번째 활성화 재료를 용액화한 후, 부형제를 첨가할 수 있다. 건조된 포뮬레이션은 물을 첨가하지 않고 실질적으로 완벽하게 제조할 수 있으며, 물은 상기 조성물의 활성화가 요구될 때 첨가한다.
최종 조성물이 액체 또는 겔을 포함할 경우, 적합한 방법을 적용할 수 있으며, 수동 혼합도 포함된다. 또다른 방법으로서, 예를 들면 손가락 또는 주걱에 의한 최종 혼합을 병행하는 2중 원통형 시린지(double barrelled syringe) 또는 2중 가동 디스펜서(dual actuated dispenser)를 포함할 수 있고, 또다른 방법도 적합하다.
하기의 실시예는 본 발명을 제한하는 것은 아니다. 실시예는 첨부한 도면을 참조하여 설명한다.
방법예 1
가스 생성 포뮬레이션을 검사하기 위한 분석 시험관 모델
다양한 크림 및 용액의 살균 영역(killing zone)을 분석하기 위한 방법을도1에 나타내었다. 범례는 테스트의 재료를 나타낸다. 2㎖ 에펜도르프 튜브의 뚜껑을 사부로 덱스트로오즈 한천(Sabouraud dextrose agar)층에 끼워두고, 상기 한천의 표면을 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger) 포자로 도포하였다. 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger) 포자를 사용하는 것은, 이들이 균사체에 비하여 항균 활성에 대해 보다 큰 내성이 있는 것으로 알려져 있기 때문이다. 이어서, 배지를 인큐베이션하여 균사체를 수득하거나, 본 발명의 혼합물의 포자를 죽이는 능력을 테스트하기 위해 그대로 사용하였다. 상기 본 발명의 혼합물을 에펜도르프 뚜껑에 놓고, 피펫의 끝부분으로 10회 저어주었다. 여기서는 이들 테스트 플레이트를 또한, 사방이 막힌 억제 플레이트의 공간이라 칭한다. 각 포뮬레이션을 3회 테스트하였다.
이러한 테크닉은 NO 생성 혼합물이 상기 한천에 접촉되지 않기 때문에 우수한 결과를 제공하고, 대조군은 아무것도 함유되지 않는 공간에서는 성장이 억제되지 않음을 보여주었다. 이러한 분석은 또한 민감도가 높다.
사용된 대조군은 하기와 같다.
ⅰ) 사부로 덱스트로오즈 한천 내의 아무것도 포함하고 있지 않은 에펜도르프 뚜껑
ⅱ) 에펜도르프 뚜껑 내의 0.1㎖의 아질산 나트륨(10%)
ⅲ) 에펜도르프 뚜껑 내의 0.1㎖ 시트르산(13.5%)
ⅳ) 에펜도르프 뚜껑 내의 0.1㎖ 아질산 나트륨(9%)
ⅴ) 에펜도르프 뚜껑 내의 0.1㎖ 시트르산(10%)
어떤 대조군에서도 성장이 억제되는 것은 관찰되지 않았다.
방법예 2
지표 유기체
조갑 진균증과 연관이 있는 피부 사상균은 25℃에서 인큐베이션된 사부로 덱스트로오즈 한천 플레이트 상을 전체적으로 뒤덮도록 성장하는데 최소한 5일이 걸리는, 천천히 자라는 유기체이다. 이것은 결과물의 한 세트를 생성하는데 적어도 1주가 걸리기 때문에 활성 포뮬레이션을 검사하는데 있어서의 제한 요인이 된다. 따라서, 포뮬레이션의 유효성을 분석하기 위해서는 일반적으로 빨리 성장하는 지표 유기체를 사용하고자 하지만, 일부 조성물의 유효성이 트리코파이톤 루브럼(T. rubrum) 상에서 확인되었다. 선택된 유기체는 표면 및 국소 포뮬레이션의 예방 효능 및 항균 효능을 모니터하는데 종종 사용되는 유기체인 진균, 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger)이다.
아스퍼질러스 니거(A. niger)는 조갑 진균증과 연관성이 있는 진균에 대한 지표 유기체로서 사용하였고, 테스트는 진균 포자 및 균사체 둘 다에 대해 행하였다. 상기 균사체를 사용한 경우, 살균 영역은 진균 포자의 발생이 결여된 것(흑색/갈색)으로 나타났고, 백색 영역은 성장이 억제된 것을 나타낸다. 진균 포자 플레이트 상에서, 억제 영역은 균사체가 전혀 발생되지 않은 것(백색/담황색)으로 나타내어 지고, 단지 한천만이 관찰된다.
방법예 3
NO 검출
생성된 NO는 WPI(World Precision Instruments, Inc. 제) NO 검출기를 사용하여 측정하였다. NO의 측정은 이러한 센서를 사용할 때 수성 환경에서 행하는 것이 요구되고, 실험은 이러한 요구 사항에 적합하도록 조정되었다. 또한, 이러한 장치는, 화학 물질을 첨가하고 방법을 약간 수정하는 것에 의해, NO2/NO3생성을 모니터하는 기능도 있다.
멤브레인을 침투하는 가스의 분산을 확인하기 위한 자기 추적자(magnetic follower)를 포함하는 하부 리셉터 내에 탈이온수를 넣고, 실온에서 자석 교반기 상에 프란쯔 셀을 조립하여 위치시켰다. NO 생성 포뮬레이션의 아질산 나트륨 성분이 1/2인치(13㎜) 필터 페이퍼 디스크에 스며들게 하였다. 스며들어진 디스크 상에 동일한 부피의 시트르산 성분을 피펫팅하기 전에, 상기 디스크를 프란쯔 셀 상부 구획의 상기 멤브레인 상단에 두었다. 생성된 NO의 양을 WPI NO 프로브를 사용하여 모니터하였다. 상기 실험을 도2에 나타낸 바와 같이 설비하였다.
측정되는 NO 수준이 안정된 수준에 이르렀을때, 아질산 나트륨 및 시트르산의 혼합물을 함유하는 디스크를 제거하고, 0.1㎖의 0.1M H2SO4+ 0.1M KI 용액을 수용기 구획에 첨가한 후, WPI 검출기를 사용하여 NO2/NO3의 양을 측정(전환)하였다.
실시예 1
아질산염 용액과 혼합한 산 제제의 A. 니거 포자에 대한 효과
선택한 산은 시트르산, 아세트산, 아스코르브산, 말레산 및 말산이다. 선택한 아질산염은 아질산 나트륨, 아질산 칼륨, 아질산 은이다.
분석에는 상기 방법예1에서 설명한 바와 같은 설비를 사용하였다. 다른 언급이 없는 한, 여기서 살균 영역을 포함하는 모든 실시예는 상기 방법예1의 설비를 사용하였다.
하기 산 용액(w/v)를 증류수 내에서 제조하였다.
1) 시트르산 2.5%
2) 시트르산 5%
3) 시트르산 7.5%
4) 시트르산 10%
5) 아스코르브산 2.5%
6) 아스코르브산 5%
7) 아스코르브산 7.5%
8) 아스코르브산 10%
9) 말레산 2.5%
10) 말레산 5%
11) 말레산 7.5%
12) 말레산 10%
13) 말산 2.5%
14) 말산 5%
15) 말산 7.5%
16) 말산 10%
17) 아세트산 2.5%
18) 아세트산 5%
19) 아세트산 7.5%
20) 아세트산 10%
2㎖ 에펜도르프 마이크로 튜브의 뚜껑을 떼어낸 후, 살균하고, 상기 뚜껑을 페트리 디쉬에 두고 그 주변에 25㎖의 한천을 부어 넣음으로써, 사부로 덱스트로오즈 한천 플레이트에 삽입시켰다. 상기 한천을 배치한 후, A. 니거(A. niger)를 살포하였다. 마이크로 튜브의 뚜껑에 각 용액을 정확하게 0.1㎖ 양만큼 첨가하고, 상기 플레이트를 부드럽게 흔들어줌으로써, 상기에 나타낸 각 용액을 2.5, 5, 7.5 및 10%의 아질산 나트륨/아질산 칼륨/아질산 은 용액과 혼합하였다. 분리해둔 플레이트들을 상기에서 나열한 각각의 산 용액에 대해 배치하여, 32℃에서 인큐베이션하였다. 24시간 후에 각 플레이트 상에서의 성장 억제 영역을 측정하였다. 그 결과를 하기 표1 및 표2에 나타낸다.
아질산 나트륨의 억제 영역의 결과 - 아스퍼질러스 니거 포자
아질산 나트륨
2.5% 5% 7.5% 10%
시트르산 2.5% 2.2 3.0 2.9 2.8
5% 2.8 3.6 3.9 3.9
7.5% 2.9 3.7 4.5 4.6
10% 3.0 4.1 4.4 5.4
아스코르브산 2.5% 0 0 0 0
5% 0 0 0 0
7.5% 0 0 0 0
10% 0 0 0 0
말레산 2.5% 2.5 2.6 3.9 3.0
5% 3.0 3.2 3.7 3.1
7.5% 3.4 3.9 4.6 4.9
10% 3.1 4.4 5.1 5.8
말산 2.5% 2.4 2.9 3.8 3.6
5% 2.9 3.4 3.8 4.2
7.5% 2.9 3.8 4.6 4.3
10% 3.2 4.2 5.8 5.1
아세트산 2.5% 2.5 2.7 3.4 3.6
5% 2.8 3.3 4.0 4.0
7.5% 2.6 3.5 4.1 4.1
10% 3.4 3.6 4.4 5.2
아질산 칼륨의 억제 영역의 결과 - 아스퍼질러스 니거 포자
아질산 칼륨
2.5% 5% 7.5% 10%
시트르산 2.5% 0 0 0 1.5
5% 0 1.5 1.8 2.8
7.5% 0 1.7 2.1 3.4
10% 0 2.2 3.2 3.8
아스코르브산 2.5% 0 0 0 0
5% 0 0 0 0
7.5% 0 0 0 0
10% 0 0 0 0
말레산 2.5% 0 1.3 1.5 1.4
5% 0 2.5 3.0 2.5
7.5% 0 2.5 3.2 3.2
10% 0 3.0 3.2 5.0
말산 2.5% 0 1.3 1.5 1.8
5% 0 2.1 2.5 2.2
7.5% 0 2.4 2.5 2.7
10% 0 2.8 2.7 3.5
아세트산 2.5% 1.7 2.3 2.5 2.5
5% 2.1 3.5 3.2 4.0
7.5% 3.0 3.7 4.0 4.5
10% 3.5 4.0 4.5 4.6
아질산 은과 함께 테스트한 상기 산의 어떤 것에서도 억제 영역이 관찰되지 않았기 때문에 아질산 은에 대한 표는 나타내지 않았다.
일부 아스코르브산 혼합물은 혼합 중에 융기하여 그 내용물이 웰의 상단위로 반구형으로 부풀어 오르고, 종종 상기 플레이트를 인큐베이터로 옮기는 도중 한천 상에 소량 넘쳐 흘러, 억제 영역을 형성하였다. 넘쳐 흐르지 않은 아스코르브산 용액에 의해서는 어떤 억제 영역도 관찰되지 않았다. 그 외의 산은 넘쳐 흐르거나 부풀어 오를 어떤 기미도 보이지 않았다. 이러한 결과로부터, 아질산 은 또는 아스코르브산을 포함하는 것은 제외하고, 테스트된 모든 혼합물들이 효과가 있는 것으로 나타났다.
실시예 2
아질산염 용액과 혼합한 산 제제의 A. 니거 균사체에 대한 효과
실시예1에서 설명한 바와 같이 산 용액을 제조하였다. 가스 생성 포뮬레이션을 첨가하기 전에, 상기 플레이트를 32℃에서 하룻밤 인큐베이션하여 전체적으로 뒤덮이도록 성장시켰다. 이어서, 실시예1에서 설명한 바와 같이 웰에 용액을 첨가하였다. 이어서, 상기 플레이트를 더욱 24시간 동안 32℃에서 인큐베이션하였다. 포자가 형성된 영역(흑색) 및 포자가 형성되지 않은 영역(백색/크림색)이 만나는 지점으로써 성장 억제 영역을 측정하였다. 결과를 표3, 4 및 5에 나타낸다.
아질산 나트륨의 억제 영역의 결과 - 아스퍼질러스 니거 균사체
아질산 나트륨
2.5% 5% 7.5% 10%
시트르산 2.5% 3.0 0 0 0
5% 2.8 1.2 1.8 2.4
7.5% 3.2 1.4 3.1 3.4
10% 3.4 3.1 3.7 4.6
아스코르브산 2.5% 0 0 0 0
5% 0(2) 0 0(2.1) 0(2.5)
7.5% 0(2.5) 0(3.4) 0(2.5) 0
10% 0(2.0) 0(1.9) 0(3.0) 0(3.9)
말레산 2.5% 3.4 3.5 3.4 3.0
5% 3.9 4.4 4.6 4.4
7.5% 4.0 5.0 4.8 6.0
10% 4.2 5.4 6.2 8.0
말산 2.5% 3.5 3.7 3.3 3.1
5% 3.7 4.2 4.1 4.1
7.5% 3.5 5.0 4.9 6.0
10% 3.7 5.6 5.0 6.4
아세트산 2.5% 2.6 3.8 3.7 3.3
5% 3.0 3.6 3.6 4.0
7.5% 3.0 4.3 4.1 4.4
10% 3.6 4.5 4.7 6.2
아질산 칼륨의 억제 영역의 결과 - 아스퍼질러스 니거 균사체
아질산 칼륨
2.5% 5% 7.5% 10%
시트르산 2.5% 2.7 3.1 3.2 3.5
5% 3.1 3.9 4.2 5.0
7.5% 3.6 3.9 4.2 5.4
10% 3.7 3.9 5.3 6.2
아스코르브산 2.5% 0 0 0 0
5% 0(1.5) 0 0(2.0) 0(2.4)
7.5% 0(3.1) 0(2.5) 0 0(3.1)
10% 0(2.0) 0(2.4) 0(3.0) 0(3.2)
말레산 2.5% 3.5 3.5 3.4 3.5
5% 3.8 3.8 5.0 5.0
7.5% 4.1 3.9 6.5 7.8
10% 4.5 4.3 8.0 9.0
말산 2.5% 3.4 3.9 3.8 3.4
5% 3.7 4.0 5.2 5.0
7.5% 3.8 4.4 5.4 5.8
10% 4.2 5.0 6.3 6.4
아세트산 2.5% 2.7 2.8 3.4 3.6
5% 3.4 3.0 4.2 4.4
7.5% 3.6 3.7 4.3 4.7
10% 4.4 4.9 4.6 5.1
아질산 은 억제 영역의 결과 - 아스퍼질러스 니거 균사체
아질산 은
0.025% 0.05% 0.075% 0.10%
시트르산 2.5% 0 0 0 0
5% 0 0 0 0
7.5% 0 0 0 0
10% 0 0 0 0
아스코르브산 2.5% 0 0 0 0
5% 0 0 0 0
7.5% 0 0 0 0
10% 0 0 0 0
말레산 2.5% 0 0 0 0
5% 0 0 0 0
7.5% 0 0 0 0
10% 0 0 0 0
말산 2.5% 0 0 0 0
5% 0 0 0 0
7.5% 0 0 0 0
10% 0 0 0 0
아세트산 2.5% 0 0 0 1.1
5% 0 0 0 1.2
7.5% 0 0 0 1.2
10% 0 0 0 1.3
이들 테스트로부터, 아질산 은 또는 아스코르브산을 함유하는 대부분의 것들은 제외하고는, 테스트된 모든 혼합물들이 효과가 있는 것으로 나타났다.
실시예 3
아질산염 용액과 혼합한 산성의 수성 크림 제제의 A. 니거 포자에 대한 효과
용액 대신 수성 크림을 사용하는 것을 제외하고, 산과 아질산염 둘 다의 농도를 동일하게 사용하여 실시예1에서 설명한 바와 같은 동일한 과정을 행하였다.결과를 표6 및 7에 나타낸다.
아스퍼질러스 니거 포자에 대한 아질산 나트륨 크림의 효과
아질산 나트륨
2.5% 5% 7.5% 10%
시트르산 2.5% 0 0 0 0
5% 0 0 0 1.5
7.5% 0 0 1.6 2.3
10% 0 0 1.7 2.9
아스코르브산 2.5% 0 0 0 0
5% 0 0 0 0
7.5% 0 0 0 0
10% 0 0 0 0
말레산 2.5% 0 0 0 0
5% 0 0 0 1.6
7.5% 0 0 1.7 2.2
10% 0 0 1.9 2.5
말산 2.5% 0 0 0 0
5% 0 0 1.2 2.0
7.5% 0 0 1.6 2.4
10% 0 0 1.7 2.7
아세트산 2.5% 0 0 0 0
5% 0 0 0 1.7
7.5% 0 0 1.7 2.3
10% 0 0 2.2 2.8
아스퍼질러스 니거 포자에 대한 아질산 칼륨 크림의 효과
아질산 칼륨
2.5% 5% 7.5% 10%
시트르산 2.5% 0 0 0 0
5% 0 0 1.6 1.7
7.5% 0 1.7 1.65 1.8
10% 0 1.8 1.8 1.9
아스코르브산 2.5% 0 0 0 0
5% 0 0 0 0
7.5% 0 0 0 0
10% 0 0 0 0
말레산 2.5% 0 0 0 1.5
5% 0 0 1.5 1.7
7.5% 0 0 1.6 2.0
10% 0 0 2.3 2.9
말산 2.5% 0 1.4 1.4 1.6
5% 0 1.5 2.1 1.8
7.5% 0 1.65 2.3 2.3
10% 0 1.7 2.35 2.7
아세트산 2.5% 0 0 1.3 1.5
5% 0 1.3 2.0 1.7
7.5% 0 1.8 2.4 2.5
10% 1.7 2.4 2.6 2.7
아질산 은과 함께 혼합한 산성 크림의 어떤 것에서도 억제 영역이 관찰되지 않았기 때문에 아질산 은에 대한 표는 나타내지 않았다. 이들 테스트로부터, 아질산 은 또는 아스코르브산을 함유하는 것들은 제외하고, 테스트된 모든 혼합물들이 효과가 있는 것으로 나타났다.
실시예 4
아질산염 용액과 혼합한 산성의 수성 크림 제제의 A. 니거 균사체에 대한 효과
용액 대신 수성 크림을 사용하는 것을 제외하고, 산과 아질산염 둘 다의 농도를 동일하게 사용하여 실시예2에서 설명한 바와 같은 동일한 과정을 행하였다. 결과를 표8, 9 및 10에 나타낸다.
아스퍼질러스 니거 균사체에 대한 아질산 나트륨 크림의 효과
아질산 나트륨
2.5% 5% 7.5% 10%
시트르산 2.5% 0 0 1.2 1.4
5% 0 1.2 1.4 3.1
7.5% 0 1.8 3.1 3.7
10% 0 2.4 3.4 4.6
아스코르브산 2.5% 0 0 0 0
5% 0 0 0 0
7.5% 0 0 0 0
10% 0 0 0 0
말레산 2.5% 0 0 1.2 1.6
5% 0 1.3 2.7 3.2
7.5% 0 1.9 4.1 4.4
10% 0 2.1 4.4 4.5
말산 2.5% 0 0 1.6 2.6
5% 0 1.2 3.1 3.5
7.5% 0 1.3 3.6 4.4
10% 0 1.65 4.3 5.2
아세트산 2.5% 1.2 1.3 2.0 2.4
5% 2.0 2.1 2.7 3.2
7.5% 2.6 2.2 3.0 4.0
10% 2.4 3.0 3.7 4.7
아스퍼질러스 니거 균사체에 대한 아질산 칼륨 크림의 효과
아질산 칼륨
2.5% 5% 7.5% 10%
시트르산 2.5% 0 0 0 0
5% 0 1.5 1.7 2.2
7.5% 0 1.8 2.1 3.2
10% 1.5 2.8 3.4 3.8
아스코르브산 2.5% 0 0 0 0
5% 0 0 0 0
7.5% 0 0 0 0
10% 0 0 0 0
말레산 2.5% 0 0 0 0
5% 1.3 2.5 2.5 3.0
7.5% 1.5 3.0 3.2 3.2
10% 1.4 2.5 3.2 5.0
말산 2.5% 0 0 0 0
5% 1.3 2.1 2.4 2.8
7.5% 1.5 2.5 2.5 2.7
10% 1.8 2.2 2.7 3.5
아세트산 2.5% 1.7 2.1 3.0 3.5
5% 2.3 3.5 3.7 4.0
7.5% 2.5 3.2 4.0 4.5
10% 2.5 4.0 4.5 4.6
아스퍼질러스 니거 균사체에 대한 아질산 은 크림의 효과
아질산 은
2.5% 5% 7.5% 10%
시트르산 2.5% 0 0 0 0
5% 0 0 0 0
7.5% 0 0 0 0
10% 0 0 0 0
아스코르브산 2.5% 0 0 0 0
5% 0 0 0 0
7.5% 0 0 0 0
10% 0 0 0 0
말레산 2.5% 0 0 0 0
5% 0 0 0 0
7.5% 0 0 0 0
10% 0 0 0 0
말산 2.5% 0 0 0 0
5% 0 0 0 0
7.5% 0 0 0 0
10% 0 0 0 0
아세트산 2.5% 0 0 1.1 0
5% 0 0 1.8 1.2
7.5% 0 1.6 2.0 1.6
10% 1.2 2.0 2.5 2.5
이들 테스트로부터, 아질산 은 또는 아스코르브산을 함유하는 대부분의 것들은 제외하고, 테스트된 모든 혼합물들이 효과가 있는 것으로 나타났다.
실시예 5
산 및 아질산염의 혼합물에 의하여 제조된 NO의 양
각각의 산 및 아질산염 용액에 의하여 생성된 대략적으로 측정된 양의 NO를 WPI NO 프로브를 사용하여, 실시예 3에 기재된 방법과 같이 계산하였다. 각 실험에서 아질산염 성분(50㎕)을 산 용액 10㎖에 가하였다.
우선, NO 프로브를 산 구성요소에 침지(각 실험당 10% 용액)시켰다. 아질산염을 첨가하기 전에 평형을 맞추기 위하여, 프로브를 산에 넣어두었다. 기준선이 설정되면, 기기를 0점으로 하고, 아질산염을 가하였다. 최저 농도를 처음 가한 후, 커브가 평평해지기 시작할때 다시 가하였다. 작성된 그래프는, 생성된 NO의 양의 대략적인 표시만을 나타내며, 이 때 측정된 값은 아니다. WPI에 의하여 열거된 표준 프로토콜을 사용한 각 기록 세트에 앞서, 보정 곡선(calibration curve)이 작성되었으며, WPI에서 제시된 바와 같이, 각각 다른 온도에서 NO를 감지한 경우의 작은 변화를 계산하였다.
아질산나트륨과 아질산칼륨, 2.5, 5, 7.5 및 10% 용액을 각 산에 다양한 지점에서 가하였다. 아질산은(Ag)은 대단히 불용성이므로, 아주 낮은 농도가 사용되었고, 0.025, 0.05, 0.075 및 0.1% 용액만을 산에 가했다.
보정 곡선 및 NO 방출 프로파일은 모든 산 및 아질산염을 위하여 생성되었다. 아스코르브 산과 혼합된 아질산나트륨과 아질산칼륨 둘 다에 있어서, 자기 추적자(magnetic follower)와 NO 프로브의 주위에 거품이 형성되었다.
포뮬레이션 일부에서 NO2/NO3의 상대적인 양을 측정하기 위하여 간단한 연구가 진행되었다. 이것은 방법예 3에 기재된 대로, NO 생성 포뮬레이션이 최고점에 달하였을 때, 0.1M H2SO4와 0.1M KI 1ml 를 가하여 행하였다. 0.1M H2SO4와 0.1M KI는, NO2/NO3를 NO로 변환시켰으며, WPI NO 프로브를 사용하여 기록하었다.수득된 결과는 다음과 같다:
10ml 시트르 산(10%) + 50㎕ NaNO2(10%)는 4000pA 의 NO 를 생성하였다.
0.1M H2SO4및 0.1M KI를 가하자, 피크 값은 20000pA 까지 달하였다. NO2/NO380%와 함께 NO가 약 20% 생성되는 것이 측정되었다.
10ml 시트르 산(10%) + 50㎕ KNO2(10%)는 2200pA 의 NO 를 생성하였다.
0.1M H2SO4및 0.1M KI를 가하자, 피크는 10700pA 에 달하였다. NO2/NO380%와 함께 NO가 약 20% 생성되는 것이 측정되었다.
10ml 아스코르브 산(10%) + 50㎕ AgNO2(0.1%)는 5200pA 의 NO 를 생성하였다. 0.1M H2SO4및 0.1M KI를 가하자, 피크의 변화가 관찰되지 않았다. NO2/NO3없이, NO가 약 100% 생성되는 것이 측정되었다.
10ml 아세트 산(10%) + 50㎕ AgNO2(0.1%)는 70pA 의 NO 를 생성하였다.
0.1M H2SO4및 0.1M KI를 가하자, 피크는 2700pA 에 달하였다. NO2/NO397%와 함께 NO가 약 3% 생성되는 것이 측정되었다.
아스코르브 산을 채용한 혼합물에서는 억제 영역이 식별되지 않는다는 이전의 실시예의 결과에도 불구하고, 아스코르브 산을 사용한 컴비네이션이 상당한 양의 NO를 생성하는 것으로 보인다는 점은 매우 의외의 사실이다. 그러나, 아스코르브 산은 아질산은 과는 NO2/NO3을 거의 또는 전혀 생성하지 않았다. 테스트된 다른 산은 모두 NO 보다 더 많은 양의 NO2/NO3을 생성하였다.
말레산-아질산칼륨 NO 프로파일 및 시트르산-아질산칼륨 NO 프로파일은, 이전의 실시예에서 나타난 억제 영역의 크기 및 생성된 NO의 양과의 사이에는 거의 상관성이 없는 것을 보여준다. 이들 두가지 산은 매우 유사한 크기의 억제 영역을 생성하였으나, 말레산은 아질산나트륨과 함께 약 1/3의 NO만을 생성하였다.
실시예 6
포뮬레이션 평가
오이드라지트(Eudragits)
래커에 기초한 오이드라지트는, 포뮬레이션의 NO 방출 프로파일을 변경하는 능력이 관찰되었다. 일반적으로, 폴리메타크릴레이트(오이드라지트)는 필름 코팅 제제로서 경구 정제/캡슐 포뮬레이션으로 사용된다. 다른 필름의 선택은 상이한 약물 방출 속도를 만들 수 있다. 구입가능한 다른 오이드라지트는, 오이드라지트 E, 오이드라지트 L, 및 오이드라지트 S를 포함한다. 오이드라지트 L 및 S는 장용성 코팅 제제로서 사용되며, 또한 위액(gastric fluid)에 내성이 있다. 오이드라지트 L 및 S는 상이한 pH 수준에서 용해될 수 있으며, 예를 들면 오이드라지트 L 100 은 〉pH 6 에서 용해될 수 있으며, 오이드라지트 S 100 은 〉pH 7 에서 용해될 수 있다. 오이드라지트는 상이한 약물 방출 특성을 수득하도록 결합될 수 있다. 연구는, 활성 가스의 생성을 위한 아질산염과 산을 모두 포함하는 오이드라지트 포뮬레이션 상에서 수행되었다.
오이드라지트 L 100 은 아질산나트륨과 결합된 것으로 시험되었으며, 5 에서 25~30분동안 NO의 방출이 지속되었다(데이타는 나타내지 않음). 산 구성요소를 리버스 오이드라지트(E100)에서 조제하는 것은, NO의 생성을 지속시키는 효과를 거의 또는 전혀 가지고 있지 않는 것으로 보인다. 따라서, 적합한 포뮬레이션은, 겔 형태로, 충분히 존재하는 산 구성요소와 함께, L 100 에서의 아질산 나트륨이다.
실시예 7
대체적인 겔 포뮬레이션
다양한 겔형 제제의 포뮬레이션으로, 아질산 및 산의 조합이 시각적으로 분석되었다. 상기 겔형 제제로 사용된 것은 하기와 같다:
3% 카르복시메틸셀룰로오즈(CMC);
3% 메틸셀룰로오즈(MC);
3% 카르보폴 934;
3% 젤라틴 A;
3% 젤라틴 B;
20% 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 400;
20% PEG 600;
20% PEG 1000;
3% 하이드록시메틸셀룰로오즈(HMC); 및
3% 폴리비닐 알코올(PA)
모든 겔은
(i) 시트르산 10% 용액, 및
(ii) 아질산나트륨 10% 용액
과 함께 제조되었다.
시각적 분석은 pH 테스트(리트머스 종이)도 함께 수행되었다. 결과를 하기 표 11 및 표 12에 나타내었다.
10% 아질산나트륨 겔
겔형 제제 pH 특성
CMCMC카르보폴 934젤라틴 A젤라틴 BPEG 400PEG 600PEG 1000HMCPA 889.58.588.58.598.58 짙고 엷은 노랑 겔을 형성함엷고 노랑 색, 침전이 나타남짙고 엷은 노랑 불투명 겔오렌지색 투명한 액체노란색 투명한 액체엷은 노란색 투명한 액체엷은 노란색 투명한 액체엷은 노란색 투명한 액체짙고 엷은 노란색 겔엷은 노란색 액체, 침전이 있음
상기 표 11로부터, CMC, HMC 및 카르보폴은 모두 10%의 아질산나트륨의 존재하에서 안정한 겔을 형성하는 것으로 볼 수 있다.
10% 시트르산 겔의 특성
겔형 제제 pH 특성
CMCMC카르보폴 934젤라틴 A젤라틴 BPEG 400PEG 600PEG 1000HMCPA 2112211212 유동성 겔, 불투명(무색)유동성 겔, 투명함유동성 겔 불투명엷은 노란색 투명한 액체엷은 노란색 투명한 액체투명한 액체투명한 액체투명한 액체투명하고 짙은 겔투명한 액체
상기 표 12로부터, HMC, CMC, MC 및 카르보폴은 모두 10%의 시트르산의 존재하에서 안정한 겔을 형성하는 것으로 볼 수 있다.
이들 테스트는, 약간의 예비적 표시를 나타낸다. 특히, 젤라틴은 바람직한 겔형 제제이며, 관습적으로 20% 내지 40%, 더 일반적으로는 약 30% 정도로, 높은 수준으로 사용되는 것이 바람직하다.
실시예 8
티 루브럼( T. rubrum )에 대한 NO-생성 포뮬레이션의 효과
다양한 NO-생성 포뮬레이션의 피부사상균 살균 활성을 테스트하기 위하여, 벽으로 둘러싸인 웰 억제 영역 플레이트을 사용하여, 상기 실시예 2에서 언급한 방법을 적용하였다. 다음의 포뮬레이션을 제조하여, 티 루브럼(T. rubrum)을 미리 뿌려놓은 벽으로 둘러싸인 웰 한천 플레이트에 가하였다.
10% 아질산나트륨(50㎕)을 포함하는 오이드라지트 L 100 와 혼합된 10% 시트르 산(50㎕)을 포함하는 카르보폴
10% 아질산나트륨(50㎕)을 포함하는 CMC 와 혼합된 10% 시트르 산(50㎕)을 포함하는 CMC.
10% 아질산나트륨(50㎕)을 포함하는 수성 크림과 혼합된 10% 시트르 산(50㎕)을 포함하는 수성 크림.
10% 아질산나트륨(50㎕)을 포함하는 HMC 와 혼합된 10% 시트르 산(50㎕)을 포함하는 HMC.
10% 아질산나트륨(50㎕)을 포함하는 오이드라지트 L100 과 혼합된 10% 시트르 산(50㎕)을 포함하는 MC.
10% 아질산나트륨(50㎕)과 혼합된 10% 시트르 산 50㎕.
10% 아질산나트륨(50㎕)을 포함하는 오이드라지트 L100 과 혼합된 10% 시트르 산 50㎕.
양성 대조군(어떠한 포뮬레이션도 부가되지 않음).
결과 - 5일후의 억제 영역 크기
NO 생성 포뮬레이션 억제 영역(cm)
10% 시트르산 10% 아질산나트륨
카르보폴CMC수성 크림HMCE100MC용액용액없음 L100CMC수성크림HMCL100L100용액L100없음 7.75.63.48.507.78.58.50
이러한 결과는 티 루브럼(T. rubrum)이 본 발명에 따른 포뮬레이션에 의하여 대단히 죽기 쉬우며, 큰 살생 영역을 가지고 있음을 보여준다.
실시예 9
래커/겔형 제제로부터의 NO 생성에 대한 WPI 측정
NO 생성 포뮬레이션으로부터 NO를 방출하는 시간의 길이를 분석하기 위하여 실험을 준비하였다. 포뮬레이션을 직접, 프란쯔 셀 내의 0.2㎛ 기공 필터의 표면에 위치시켜, 프란쯔 셀의 하부 용기에서 이루어지는 반응으로, 필터를 통하여 포뮬레이션을 걸렀다. 따라서, 항생 디스크들을 NO 생성 포뮬레이션의 아질산나트륨 구성요소가 스며들도록 한 후, 멤브레인의 최상부에 있는 프란쯔 셀의 상부 구획에 위치시키고, 이후 스며든 디스크 상에 시트르산 구성요소와 동일한 부피를 피페팅하였다. 생성된 NO의 양을 WPI NO 프로브를 사용하여 모니터링하였다. 실험을 도 2에 도시된 바와 같이 수행하였다.
하기 세 개의 포뮬레이션이 평가되었다.
카르보폴 934 에서의 10% 시트르산 및 오이드라지트 L100에서의 10% 아질산나트륨
HMC 에서의 10% 시트르산 및 오이드라지트 L100에서의 10% 아질산나트륨
용액에서의 10% 시트르산 및 용액에서의 10% 아질산나트륨
결과는 도 3에 나타내었으며, 아질산염 및 산을 포함하는 겔형 제제를 선택하여, 시간에 따른 NO의 생성을 보여준다. 카르보폴 및 L100 NO 생성 포뮬레이션은 피크가 50000pA 까지 달하였으며, 이는 WPI 계량기의 감지 한계를 넘는 것이다. 그러나, 이 포뮬레이션은, 실험이 완료되었을 때, 상당히 꾸준하고 일정한 속도로 23분동안 NO를 방출하였음을 볼 수 있다. 대조적으로, 용액에 의하여 생성된 NO는 더 조기에, 속도가 느려졌으며, 이것은 생성된 대부분의 NO 용액 밖으로 거품으로 되어 나가고, 대기로 방출되었을 가능성이 높다. 유사한 패턴이 HMC와의 샘플에서도 나타난다. 이것은 포뮬레이션의 접근이 상이한 방출을 수득하는 데에 사용될 수 있음을 보여준다.
실시예 10
테스트용 포뮬레이션
하기 표 14에 열거된 포뮬레이션에 대하여 억제 영역, NO 방출 프로파일, 및NO2/NO3방출을 조사하였다. 표 14에 나타난 구성요소의 농도는 혼합되기 이전의 것이다.
샘플 번호 10% 아질산나트륨을 10% 시트르산을함유한 포뮬레이션(% w/w) 함유한 포뮬레이션(%w/w)
1234567891011121314151617181920212223 카르복시메틸셀룰로오즈(CMC)(3%) + 카르보폴(3%)CMC(3%) + 하이드록시메틸셀룰로오즈(HMC)(3%)CMC(3%) + 메틸셀룰로오즈(MC)(3%)CMC(3%) + CMC (3%)CMC(3%) + 용액(DW)L100(오이드라지트)(5%) + 카르보폴(3%)L100 (5%) + HMC(3%)L100 (5%) + MC(3%)L100 (5%) + CMC(3%)L100 (5%) + 용액(DW)하이드록시메틸셀룰로오즈(HMC)(3%) + 카르보폴(3%)HMC(3%) + HMC(3%)HMC(3%) + MC(3%)HMC(3%) + CMC(3%)HMC(3%) + 용액(DW)용액(증류수(DW)) + 카르보폴(3%)용액(DW) + HMC(3%)용액(DW) + MC(3%)용액(DW) + CMC(3%)용액(DW) + 용액(DW)크림(DW에 용해된 50% 수성크림) + 크림(DW에 용해된 50% 수성크림)용액(DW) + 1M 아스코르브산 나트륨용액(DW) + 1M 아황산수소염(SHS)
하기 표 15의 조합은 억제 영역만 평가되었다.
샘플 번호 포뮬레이션(% w/w)
242526272829303132333435*36*37** 시트르산(20%) + 아스코르브산(20%) + 아질산나트륨(20%)시트르산(20%) + 아스코르브산(16%) + 아질산나트륨(20%)시트르산(20%) + 아스코르브산(12%) + 아질산나트륨(20%)시트르산(20%) + 아스코르브산(8%) + 아질산나트륨(20%)시트르산(20%) + 아스코르브산(4%) + 아질산나트륨(20%)시트르산(16%) + 아스코르브산(20%) + 아질산나트륨(20%)시트르산(12%) + 아스코르브산(20%) + 아질산나트륨(20%)시트르산(8%) + 아스코르브산(20%) + 아질산나트륨(20%)시트르산(4%) + 아스코르브산(20%) + 아질산나트륨(20%)시트르산(20%) + 1M Na2S2O4+ 아질산나트륨(20%)시트르산(20%) + 1M 아스코르브산나트륨 + 아질산나트륨(20%)시트르산(20%) + 1M Na2S2O4+ 아질산나트륨(20%)시트르산(20%) + 1M 아스코르브산나트륨DW
기재된 각 구성요소들은 혼합되기 이전의 초기 농도(탈이온수(DW)에서의 % w/w) 를 나타낸다.
* 및 ** 는, 각각 양성 및 음성 대조군을 나타낸다.
억제 영역은 선택적인 환원제, α-토코페롤로 분석될 수 있다. 이 제제를 사용한 분석을 위한 조합이 표 16에 열거되었다. 아질산나트륨과 시트르산 및, 아스코르브산(샘플 24번), Na2S2O4(샘플 33번), 또는 아스코르브산 나트륨(샘플 34번) 을 대조군으로서 또한 포함시켰다.
샘플번호 포뮬레이션(% w/w)
383940* 9g DW + 1g 시트르산 + 50㎕α-토코페롤 + 아질산염나트륨(20%)4g DW + 1g 시트르산 + 5g 에탄올 + 50㎕α-토코페롤 + 아질산염나트륨(20%)DW + DW
열거된 각 구성요소는 혼합되기 전의, 개시 농도(% w/w)를 나타낸다.
* 는 음성 대조군을 나타낸다.
실시예 11
A)억제 영역
표 4,5,6 는 실시예 10의 포뮬레이션의 억제 영역에 대한 효과를 나타낸다. 명확하게, 샘플 번호 32(낮은 농도의 시트르산과 높은 농도의 아스코르브산) 및 샘플 번호 39(에탄올에서 포뮬레이트된 α-토코페롤)가 다른 포뮬레이션에 비하여 낮은 활성을 나타냈음에도 불구하고, 조사된 대부분의 포뮬레이션에서, 뚜렷한 억제 영역의 상이점이 관찰되지 않았다는 결론을 얻었다. 그러나, 높은 농도(20%)의 아스코르브산(샘플 24-31)은 억제 영역 평가에서 보여준 바와 같이, 항진균 활성의 감소가 나타나지 않았다.
도 4는 표 14에 기재된 포뮬레이션에 기초한 겔 및 용액에 대한 억제 영역을 나타낸다.
도 5는 표 15에 기재된 환원 제의 존재하에 조사된 포뮬레이션에 대한 억제 영역을 나타낸다.
도 6은 표 16에 기재된 다른 환원제와 α-토코페롤의 존재하에 조사된 포뮬레이션에 대한 억제 영역을 나타낸다.
B)NO 및 NO 2 /NO 3 방출
WPI 기기로부터 제작된, 생성된 NO의 양에 대한 데이터는 pA로 계산되었다. 보정 곡선은 방출된 NO의 농도를 계산하기 위하여 제작되었다(데이터는 나타나지 않음). 일반적으로, 얻어진 프로파일은, 용액에 기초한 포뮬레이션이 겔에 기초한 포뮬레이션보다 더 빨리 NO를 방출한다는 것을 나타낸다. 용액에 기초한 포뮬레이션 중에서도, 샘플 번호 20(시트르산과 아질산나트륨의 용액)은 가장 짧은 시간에 높은 NO 방출을 나타낸다. 그러나, 카르보폴(샘플 번호 16) 및 CMC(샘플 번호 19)에서의 시트르산과 아질산나트륨 용액을 포함하는 용액 포뮬레이션 조합은, 연장된 주기시간에 결쳐 가장 많은 양의 NO를 생성하는 것을 나타낸다. CMC 기초 포뮬레이션과 함께 한 경우, 일반적으로 가장 적은 양의 NO가 방출되는 것으로 나타났다.
도 7은 다양한 포뮬레이션에 의하여 생성된 NO 및 NO2/NO3농도의 평균 피크를 조사한 것을 보여준다. 겔 기초 포뮬레이션이 조사된 것에 의하면, CMC 포뮬레이션은 남아있는 겔 기초 포뮬레이션(L100, HMC 및 카르보폴)에 비하여 낮은 농도의 N을 생성하는 것으로 나타났다. 조사된 다양한 포뮬레이션으로부터 시간의 함수로서 생성된 NO 농도의 평균 피크를 도 8에 나타내었다. 데이터는, 샘플 번호 19(CMC를 포함하는)를 예외로 하고는, 용액들(샘플 번호 5, 10, 16-20)이 겔 포뮬레이션에 비하여, 현저히 빨리 NO 농도 피크에 도달하는 것을 보여준다.
도 7은 조사된 다양한 포뮬레이션으로부터 생성된 NO 및 NO2/NO3농도의 평균 피크를 보여준다.
도 8은 조사된 다양한 포뮬레이션으로부터의 최대 NO 생성량에 도달하는 평균 시간을 보여준다.
실시예 12
인간의 손톱을 가로지른 NO의 경로
18h, 10% 용액
도 11에 나타난 설비를 사용하였다. T0에서, 10% 아질산나트륨 100㎕와 10% 시트르산 100㎕를, 손톱 프란쯔 셀(노출 표면 0.1963㎠)상에 고정된, 인간 손톱 단편의 표면 상에 피페팅하였다. 손톱을 통하여 지나가는 NO의 양을 WPI NO 감지기를 사용하여 18시간 주기에 걸쳐 모니터링하였다. 결과를 도 9에 나타내었다.
18h, 5% 용액
도 11에 나타난 장치를 사용하였다. T0에서, 5%의 아질산 나트륨 100㎕와 5% 시트르산 100㎕을, 손톱 프란쯔 셀(노출 표면 0.1963㎠)상에 고정된, 인간 손톱 단편의 표면 상에 피페팅하였다. 손톱을 통하여 지나가는 NO의 양을 WPI NO 감지기를 사용하여 18시간 주기에 걸쳐 모니터링하였다. 결과를 도 10에 나타내었다.
음성 대조군
탈이온수 200㎕로 이루어진 음성 대조군을, 프란쯔 셀에 고정된 인간 손톱 단편의 표면상에 피페팅하였으며, 그 밖의 것은 10% 및 5%의 절차와 동일한 조건을 채용하였다.
도면에서 나타나는 바와 같이, 10% 용액은 NO에서의 명확한 초기방울을 제공하였다. 그러나, 4시간 이후(상이한 실험은 상이한 지체 시간을 야기하며, 데이터는 나타내지 않음), NO가 갑자기 증가하며, 이후 약 10시간의 주기동안 높은 수준으로 유지된다. 5% 용액은, 10% 포뮬레이션보다는 약간 낮지만, 양성 수준의 NO을 생성하였다. 음성 대조군은 실험의 개시시의 초기 침지 후, 기준선에서 벗어나지 않는다(데이터는 나타나지 않음).
실시예 13
10% 아질산나트륨과 10% 아스코르브산을 사용한, 인간 손톱을 가로지른 NO 경로 측정
실험의 초기 부분에서, 도 11의 듀얼 암 손톱 프란쯔 셀을 설치하였으며, 다만 인간 손톱의 자리에 가스 투과 멤브레인 단편을 사용하였다. 포뮬레이션을 가하기 전에 시스템을 약 40분 동안 방치하였다. 10% 아스코르브산 100㎕와 10% 아질산나트륨 100㎕용액을, 실시예 12에서와 같이 프란쯔 셀의 상부에 가하고, 프란쯔 셀 상부를 파라필름으로 커버하였다.
실험 중 생성된 NO의 양은 감지기의 감지 한계를 초과하였으며, 플롯은 한시간이 넘은 직후 단위(10μM)를 벗어났다. 피크내의 최초 방울은 관찰되지 않았다. 생성된 NO의 양은 시트르산(10%)와 아질산나트륨(10%)과 으로 나타난것보다 약 20배였다.
이번에는 인간의 손톱 단편을 사용하여 실험을 반복하였다. 이후 10% 아스코르브산 100㎕과 10% 아질산나트륨 100㎕를 직접 손톱 표면 상부에 가하고 혼합하였다. 프란쯔 셀을 파라필름으로 커버하고, 손톱을 통하여 지나간 NO의 양을 WPI를 사용하여 모니터하였다. 결과를 도 12에 나타내었다.
피크 내의 방울은, 인간 손톱과 NO생성 포뮬레이션을 포함하는 실험 내의 표준 인공물로 보인다. 피크내에서의 증가에 잇따른 감소는, 하나에서 다른 것으로부터의 점차적인 변화를 수반하지 않는 매우 갑작스러운 것이다.
도 12로부터, 아스코르브산을 포함하는 혼합물은 손톱을 가로지르는 NO의 일관된 방출을 제공할 수 있는 반면, 시트르산을 사용하였을 때 보다 약 10x 낮은 수준이다.
실시예 14
인간 손톱을 가로지르는 항-진균 침투에 대한 프란쯔 셀 손톱 생물학적 분석 (Bioassay)
프란쯔 셀들을 도 13과 같이 설치하고, 하부 영역을 유출구 홀의 8mm 아래까지 용융된 사부로 덱스트로오즈 한천(Sabouraud dextrose agar)으로 채웠다. 한천을 냉각시켜 설치한 후, 아스퍼질러스 니거(A. niger) 포자 현탁액 20㎕를, 상기유출구 홀 위를 밀폐법으로 맞춘 인간 손톱 부분과 한천의 표면상에 피펫팅하고, 조였다. 이후 셀을 32℃에서 24시간동안 인큐베이팅하여 균사체 카펫(carpet of mycelium)을 얻었다.
균사체를 기른 후, 셀들을 인큐베이터에서 꺼내어, 0.1 ml의 시트르산과 0.1ml의 아질산 나트륨으 프란쯔 셀의 깔대기로 피페팅하고 피펫팁을 사용하여 혼합하였다. 음성 대조군에, 10% 아질산나트륨 0.2ml 용액 또는 10% 시트르산 0.2ml을 가하였다. 모든 프란쯔 셀의 깔대기 상부를 파라필름으로 커버하였다. 셀을 상온에 방치하였다. 2시간 10분 후, 각 프란쯔 셀 내의 용액을 제거하고 동등물 용액으로 대치하고, 이러한 과정을 매 2시간 10분마다 반복하고 부가적인 2개의 적용으로 총 4개의 적용을 가하였다. 용액의 마지막 적용 이후, 셀들을 상온에서 커버하여 방치하고, 24시간 동안 유기물이 서서히 성장하도록 방치하였다.
24시간 후, 시트르산 및 아질산염의 혼합물을 포함하는 모든 6개의 셀은, 활성 가스에 의하여 죽어버린 손톱/포뮬레이션에 가장 가까운 아스퍼질러스 니거(A.niger)의 중앙 영역을 포함하였다. 이것은 할로 효과에 의하여 증명되었으며, 죽은 영역인 흰색 균사체는 포자를 형성한 균사체인 검은색 링으로 둘러싸였다. 24시간이 더 지난 후, 아스퍼질러스 니거(A. niger)는 죽지 않은 최외각 영역으로부터 성장하여 중심쪽을 향하여 회복되었다.
아질산나트륨 또는 시트르산을 포함하는 모든 셀은, 포자를 형성한 풀 카펫의 균사체 성장을 나타냈으며, 진한 검은색 원으로 증명되었다.
이러한 결과는 분명히, 본 발명의 포뮬레이션이 손톱을 가로지르는 효과적인가스형 구성요소를 생성하는 능력이 있음을 보여준다. 이는 분명히 활성 가스가 완전한 인간 발톱을 침투하여, 직접 아스퍼질러스 니거(A. niger)의 성장에 영향을 미친다는 것을 나타낸다. 부가적으로, 포뮬레이션은 손톱을 침투하여, 부가적인 8mm 거리를 넘어 유기물의 성장에 영향을 미치고 있으며, 생체 내에서의 분리는 실질적으로 무시할 수 있다. 대조군들은 할로 효과를 일으키는 것이 활성 가스임을 확증한다.
실시예 15
키트
두개의 수성 겔 제제를 포함하는 키트를 제작하였다. 제제는 하기의 포뮬레이션을 갖는다.
A. 아질산나트륨 겔(2ml)
아질산나트륨 6.6%
하이드록시메틸셀룰로오즈10.0%
폴리비닐 피롤리돈 5.0%
폴리에틸렌 글리콜20.0%
벤질 알코올 1.0%
착색제 0.005%
물100% 가 될때까지
B. 시트르산 겔(2ml)
시트르산 10.0%
카르보폴 5.0%
폴리비닐 피롤리돈 5.0%
폴리에틸렌 글리콜30.0%
메틸 파라반 0.2%
프로필 파라반 0.02%
물100% 가 될때까지
착색제 0.005%
포뮬레이션 A 및 B는 개별적으로 재밀봉이 가능하며, 손톱에 적용되기 전 또는 손톱에 적용될 때 즉시 혼합될 수 있도록 짤 수 있는 튜브로 제공되었다.

Claims (24)

  1. 아질산염 및 유기 산을 포함하며, 상기 아질산염 및 유기 산은 사용에 앞서 각각 개별적으로 배치되어 있는, 조갑하 감염의 치료에 사용되는 산화질소 생성 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 산은, 최종 조성물의 pH 가 5.5 이하가 되기에 충분한 양으로 존재하는
    조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 산은, 포름산, 말산, 말레산, 아세트산, 락트산, 시트르산, 벤조산, 타르타르산과 살리실산, 아스코르브산, 아스코르빌 팔미트산염 및 이들의 혼합물로부터 선택된 것인
    조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 아질산염은 알칼리금속 아질산염 및 알칼리토금속 아질산염으로부터 선택된 것인
    조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 아질산염은 아질산 나트륨, 아질산 칼륨, 아질산 마그네슘, 아질산 바륨 중 선택된 것인
    조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    구연산 및 아질산 나트륨을 포함하며, 이들은 각각 사용에 앞서 개별적으로 배치되며,
    적어도 하나가 수성 매체로 존재하는 것인
    조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조갑하 감염은 조갑진균증인
    조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 아질산염 구성요소는 오이드라지트, 카르보폴, 카르복시메틸셀룰로오즈, 하이드록시메틸셀룰로오즈, 및 이들의 혼합물로부터 선택된 부형제와 함께 조제되는
    조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 산 구성요소는 카르보폴, 카르복시메틸셀룰로오즈, 하이드록시메틸셀룰로오즈, 메틸셀룰로오즈 및 이들의 혼합물로부터 선택된 부형제와 함께 조제되는
    조성물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 산 및 아질산염은 수성에 기초한 포뮬레이션 내에 각각 개별적으로 배치되는
    조성물.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 각 제제는 개별적으로, 서로 혼합되기에 적합한 겔, 크림, 로션, 연고 및 페인트로부터 선택된 형태인
    조성물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 산 및 아질산염은 각각 개별적으로, 겔, 페인트 또는 래커로 조제되는
    조성물.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 산 및 아질산염은, 각각 개별적으로 액상 또는 겔로 조제되어, 혼합시, 고형화되거나 겔 또는 페인트의 형태를 이루는
    조성물.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 아질산염은 최종 조성물을 기준으로 약 0.5 내지 30중량%인
    조성물.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 아질산염은 최종 조성물을 기준으로 5 내지 15중량%인
    조성물.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 산은 최종 조성물을 기준으로 약 5 내지 30중량%인
    조성물.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 산은 최종 조성물을 기준으로 약 10 내지 15중량%인
    조성물.
  18. 첨부된 실시예에 따른, 억제 영역을 생성할 수 있는 조성물.
  19. 산화질소 생성 조성물을 조갑하 감염의 예방 또는 치료용 약제 - 상기 약제는 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 조성물임 - 의 제조에 사용하는 용도.
  20. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 조성물의 유효량을 감염된 손톱에 적용하는, 조갑하 감염의 예방 또는 치료 방법.
  21. 제1항 또는 제18항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 키트.
  22. 제21항에 있어서,
    각각 개별적으로 배치되어 있는 아질산염의 수성 제제 및 유기 산의 수성 제제를 포함하며, 상기 두 제제는 각각 치료될 손톱에 적용되어 아질산염 및 산이 반응하여 손톱 내에 침투되기 위한 산화질소를 방출할 수 있기에 적합한 것인
    키트.
  23. 제22항에 있어서,
    상기 각각의 제제는 로션, 겔, 크림 및 래커로부터 선택된 형태인
    키트.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서,
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