PL213555B1 - Zastosowanie azotynu i kwasu organicznego do wytwarzania leku do leczenia infekcji grzybiczych podpaznokciowych - Google Patents

Abstract

Wynalazek dotyczy kompozycji generujących tlenek azotu, które są użyteczne w leczeniu infekcji podpaznokciowych, ponieważ tlenek azotu wykazuje właściwości przenikania przez paznokieć i wykazuje działanie przeciwgrzybicze. Wynalazek dotyczy także zestawów mających zastosowanie w wymienionym leczeniu oraz zastosowania kompozycji generujących tlenek azotu do wytwarzania lekarstwa do leczenia lub profilaktyki infekcji podpaznokciowych.

Description

Opis wynalazku

Wynalazek dotyczy zastosowania komponentów generujących tlenek azotu do wytwarzania leku do leczenia lub profilaktyki infekcji grzybiczych podpaznokciowych paznokci palca ręki i palca u nogi.

Infekcje grzybicze paznokci są pospolitym schorzeniem, a jeśli są poważne to mogą być bolesne i zniekształcające, wpływając na jakość życia pacjentów. Grzyby uczestniczące w infekcjach paznokci są głównie tymi, które wywołują grzybicę międzypalcową u sportowców (lub tinea pedis) rozszerzającą się od karbu palca u nogi do paznokcia. Infekcje grzybicze paznokcia są zwane grzybicą paznokci, zwaną również tinea unguium, skórną grzybicą paznokci lub grzybicą paznokci wywoływaną przez dermatofity.

Najczęściej izolowanymi patogenami w grzybicy paznokci są dermatofity, zwłaszcza Trichophyton rubrum (paznokcie palca u nogi 56%, paznokcie palca ręki 36%) i Trichophyton mentagrophytes (paznokcie palca u nogi 19%, paznokcie palca ręki 11%). Infekcje drożdżowe są rzadsze, ale zwykle towarzyszy im Candida albicans (paznokcie palca u nogi 10%, paznokcie palca ręki 30%).

Szacuje się, że co najmniej 15 do 20% populacji w wieku 40 do 60 lat cierpi na grzybicę paznokci, 25 do 40% w wieku ponad 60 lat cierpi wskutek tego schorzenia, ale jedynie 3% lub mniej w wieku poniż ej 18 lat. Jednakże trudno jest sprecyzować stopień aktualnego występowania grzybicy paznokci, ponieważ co najmniej 50% chorych nie korzysta z opieki medycznej.

Łagodna grzybica paznokci może być po prostu ograniczona do białych wykwitów lub zagłębień na powierzchni paznokcia, ale w bardziej zaawansowanej chorobie objawy obejmują hiperkeratozę łożyska paznokcia, zgrubienie płytki paznokcia, przebarwienia i onycholizę (oddzielanie płytki paznokcia od łożyska paznokcia).

Wiele czynników predysponuje pacjentów do grzybicy paznokci, w tym cukrzyca, podeszły wiek, hiperhydroza, onychogryfoza, uraz, słabe krążenie obwodowe i immunosupresja. Grzybica jest częstsza u mężczyzn a jest rzadka przed pokwitaniem i u kobiet przez menopauzą.

Grzybica paznokci jest schorzeniem grzybiczym a warunki, które sprzyjają rozwojowi grzyba wspomagają rozwój grzybicy paznokci. Stosownie 80% przypadków dotyczy stóp, zwłaszcza palucha lub paznokcia wielkiego palca i zwykle jest związanych, na przykład, z ciasno dopasowanym obuwiem i nadmiernym poceniem, co często ma miejsce przy uprawianiu sportu. Jednak że uraz jest również istotnym czynnikiem etiologicznym, zwłaszcza w przypadku paznokcia palca u nogi, przy czym najdłuższy palec jest szczególnie podatny.

Nie jest całkiem oczywiste, jak nabywa się to schorzenie, ale grzybica paznokcia jest zaraźliwa. Infekcje mogą wynikać z rozprzestrzeniania się grzyba ze skóry do paznokci lub bezpośrednio od innych ludzi z infekcjami skóry lub paznokci. W przypadku infekcji paznokcia palca u nogi, grzybica międzypalcowa może rozprzestrzeniać się do paznokcia, a przy często występującym urazie paznokcia, otwiera się drogę grzybowi.

Leczenie grzybicy paznokci, niezależnie od prewalencji choroby, jest nieco ograniczone, gdyż stan jest wysoce oporny na leczenie miejscowe. Leczenie miejscowe obejmuje Loceryl (amorolfina) i Penlac (cyklopiroks), ale stopnie wyleczenia są niskie (<10%), a czas leczenia d ł ugi (do 12 miesię cy), wskutek słabej penetracji poprzez paznokieć, jak również słabej czynności względem organizmów wywołujących chorobę.

Pewnym szczególnym problemem leczenia grzybicy paznokcia i innych infekcji paznokcia jest to, że infekcja jest na ogół zlokalizowana w łożysku paznokcia lub w jego pobliżu a również w samym paznokciu. A zatem infekcja jest chroniona przed zewnętrznym atakiem przez sam paznokieć, który ulega odkształceniom. Leczenie może obejmować usuwanie materiału paznokcia aż do odsłonięcia organizmu infekcyjnego, aczkolwiek niepożądane jest zbytnie usuwanie paznokcia. Ponadto czas trwania leczenia wynosi do roku lub dłużej.

Ostatnio opracowano leczenie doustne (terbinafina i itrakonazol), które pozwalają uzyskać wysoki stopień wyleczenia (~70%) i krótsze okresy leczenia (12-16 tygodni). Jednakże, występuje ryzyko związane z tymi nowymi doustnymi terapiami, które obejmuje toksyczność wątroby, poważne reakcje skórne i interakcje lekowe.

A zatem istnieje zapotrzebowanie na terapię miejscową lub przezpaznokciową, która zapewniałaby poziom wyleczenia podobny lub lepszy niż terapie doustne, ale przy zmniejszonym ryzyku.

Nieoczekiwanie twórcy wynalazku stwierdzili, że do penetracji paznokcia zdolne są tlenki azotu, i że są one skuteczne w leczeniu infekcji grzybiczych podpaznokciowych wywoływanych przez organizmy.

PL 213 555 B1

Tlenek azotu (NO) jest głównym produktem kompozycji i jest ogólnie znany z jego działania przeciw mikroorganizmom czy do gojenia ran [WO 95/22335 i Hardwick i współpr., (2001), Clin. Sci., 100, 395-400].

Miejscowe podawanie na skórę kompozycji generujących tlenek azotu jest znane w leczeniu infekcji grzybiczych skóry, takich jak Tinea Pedis (stopa atlety) [Weller at al., J.Am.Acad.Dermatol., 1998, kwiecień; 38(4):559-563], w leczeniu wirusowych infekcji skóry [WO99/44622] i w leczeniu stanów gdzie problemem jest zwężenie naczyń, jak syndrom Reynauds'a [Tucker et al., Lancet, 354, 9191, 13 listopada 1999, 1670-1675].

EP 0630650 ujawnia miejscowe podawanie kompozycji do lokalnego leczenia zmian na skórze i bł onie ś luzowej. Kompozycja ta zawiera wodny kwas azotowy, produkty redukcji azotanu i niski kwas alkanowy.

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie komponentów generujących tlenek azotu do wytwarzania leku do leczenia lub profilaktyki infekcji grzybiczych podpaznokciowych. Komponenty te stanowią azotyn, wybrany z grupy obejmującej azotyny metali alkalicznych i azotyny metali ziem alkalicznych, oraz kwas organiczny wybrany spośród kwasu cytrynowego, kwasu jabłkowego, kwasu maleinowego, kwasu octowego w ilości wystarczającej, aby finalna kompozycja miała pH 5,5 lub niższe. Każdy z komponentów przed użyciem jest umieszczony osobno. Korzystnie azotyn stanowi azotyn sodu. Korzystnie stosuje się kwas cytrynowy i azotyn sodu, przy czym co najmniej jeden znajduje się w wodnym noś niku. Infekcją grzybiczą podpaznokciową jest grzybica paznokci.

Komponent azotynowy preparuje się korzystnie z zaróbką wybraną spośród Eudragitów, karbopolu, karboksymetylocelulozy, hydroksymetylocelulozy i ich mieszanin a komponent kwasowy preparuje się z zaróbką wybraną spośród karbopolu, karboksymetylocelulozy, hydroksymetylocelulozy, metylocelulozy i ich mieszanin.

Kwas i azotyn są umieszczane osobno w preparatach wodnych. Każdy z preparatów ma postać osobno wybraną spośród żeli, kremów, płynów, maści i farb nadających się do zmieszania ze sobą. Korzystnie kwas i azotyn, każdy osobno, preparuje się jako żel, farbę lub lakier lub jako ciecz lub żel, które po zmieszaniu zestalają się lub tworzą żel lub farbę.

Korzystnie azotyn stanowi 0,5 do 30% wagowych finalnej kompozycji, i bardziej korzystnie 5 do 15% wagowych finalnej kompozycji a kwas stanowi korzystnie 5 do 30% wagowych finalnej kompozycji, a bardziej korzystnie kwas stanowi 10 do 15% wagowych finalnej kompozycji.

Tlenek azotu jest syntetyzowany w organizmie w śródbłonku naczyniowym i neuronach, jak również w aktywowanych makrofagach. Względnie wysokie poziomy NO obserwowano w pocie. Nie wiadomo dokładnie jak NO zabija mikroorganizmy, spekuluje się, że NO służy do niszczenia DNA bakteryjnego lub oddziałuje na funkcjonowanie enzymów bakteryjnych zawierających metale przejściowe.

Tlenek azotu do użytku terapeutycznego najbardziej dogodnie wytwarzany jest w reakcji azotynu z kwasem, zwłaszcza azotynu nieorganicznego z kwasem organicznym. Prowadzi to do wytworzenia postaci cząsteczkowej kwasu azotawego, który łatwo dysocjuje na cząsteczkę wody i cząsteczkę tritlenku diazotu, a ten ostatni dysocjuje z utworzeniem NO i ditlenku azotu.

Reakcje przedstawiono poniżej.

ΝΟ₂' + Η⁺ - ηνο₂

2ΗΝΟ₂ ' - Ν₂Ο₃ + Η₂0

Ν₂Ο₃ - νο + νο₂

Chociaż N2O3 jest związkiem pośrednim w tej reakcji, to są dowody na to, że może istnieć niezależnie, i że może być co najmniej w części odpowiedzialny za działanie fungicydowe związane z kompozycją .

W obecności czynnika redukującego, takiego jak kwas askorbinowy, reakcja tritlenku diazotu z utworzeniem NO jest bardziej wydajna, i może być na przykład przedstawiona następująco:

N2O3 + C₆H₈O₆ 2NO + H2O + C₆H₆O₆

Kwas azotawy może być stosownie generowany działaniem kwasu na azotyn, zwłaszcza jeśli powstająca sól jest nierozpuszczalna.

PL 213 555 B1

Należy dostrzec, że aczkolwiek dowolne źródło tlenków azotu, korzystnie dostarczające co najmniej ułamek NO, może być wykorzystywane według wynalazku, to ogólnie korzystne jest, aby którykolwiek z tlenków azotu był generowany według co najmniej jednej z powyższych reakcji.

Kompozycja może być dowolna spośród tych, które dostarczają tlenki azotu. W jednym z przykładów udział NO generowanego przez kompozycje wynosi co najmniej 50%, bardziej korzystnie co najmniej 80%. Jeśli tylko stosowany kwas jest reagentem redukującym, to udział ten może wzrosnąć do 100% NO zawartości wśród generowanych tlenków azotu.

Przez „generowany tlenek azotu” należy rozumieć, że kompozycja służy do uwalniania tlenku azotu in situ, tj. w miejscu, w którym jest stosowany, które ogólnie może znajdować się na zainfekowanym paznokciu. W najprostszej postaci kompozycję może stanowić maść lub żel lub inna odpowiednia zaróbka domiejscowa, w której gazowy NO na przykład może się rozpuszczać, i która po naniesieniu jej na paznokieć, uwalnia NO.

Zakładając, że jedynie zupełnie niewielkie ilości tlenków azotu są konieczne dla skutecznego działania, to nie ma znaczenia, że gaz ucieka gdzie indziej, niż na styku paznokcia, lub jeśli tylko małe ilości rzeczywiście przenikają przez paznokieć czy jeśli tylko pewna ilość tlenków azotu jest opóźniana w swym przenikaniu przez paznokieć , pod warunkiem, ż e wystarczająca ilość tlenków azotu osiąga miejsce działania dając efekt leczniczy lub inhibujący.

Aczkolwiek NO i jego prekursorzy są substancjami o krótkim okresie trwania, o okresach półtrwania co najwyżej kilkusekundowych, ustalono, że mogą przenikać przez ludzkie paznokcie w wystarczających ilościach, aby leczyć infekcje grzybicze podpaznokciowe. Jest to tym bardziej zaskakujące, że nie tylko może zająć kilka godzin, aby zaistniał jakikolwiek dowód, że NO lub inny z tlenków azotu przenika przez paznokieć, ale po tym, jak rozpoczęło się uwalnianie NO/innych tlenów azotu, uwalnianie może być kontynuowane nawet przez 10 godzin lub dłużej. Wydaje się, że paznokieć działa jako zbiornik lub rezerwuar i absorbuje NO lub jego prekursor. NO lub jego prekursor przemieszcza się przez paznokieć, a NO i inne tlenki azotu są uwalnianie w innym miejscu. Dla danego krótkiego okresu półtrwania gazów, możliwe jest, że są one kompleksowane przez białka paznokcia i powoli dyfundują przez paznokieć.

Wprawdzie wiadomo, że NO wykazuje działanie przeciwgrzybicze, ale nie jest jasne czy koniecznie właśnie NO przenika przez paznokieć i być może, że NO jest tylko generowany po przeniknięciu prekursora przez paznokieć. W rzeczywistości kompozycje wytwarzające duże ilości NO niekoniecznie mają największe działanie w ich zastosowaniu według wynalazku. Nie jest korzystne wydajne i szybkie generowanie NO na powierzchni paznokcia, jako ż e NO wskutek krótkiego okresu pół trwania nie może ilościowo dyfundować przez paznokieć. Natomiast kompozycje wolniej generujące NO wydają się bardziej skuteczne w dostarczaniu leczniczego środka przez paznokieć, którym to środkiem może być NO lub inny tlenek azotu.

Kompozycje zawierające tylko kwas askorbinowy lub inny podobny środek redukujący i azotyn mają tendencję do szybkiego wytwarzania dużych ilości NO. Chociaż paznokieć jest nieco porowaty, to jeśli NO jest wytwarzany zbyt szybko, czas może być zbyt krótki dla paznokcia aby zaadsorbować większość wytworzonego NO. Eksperymenty wykazują, że takim kompozycjom towarzyszy niższy ogólny przepływ NO przez paznokieć.

Azotyn srebra może wytwarzać NO w obecności kwasów ale ma stosunkowo niską wydajność, tak więc na ogół nie jest korzystny. Natomiast zarówno azotyn sodu jak i azotyn potasu reagują z kwasem, na przykład octowym, cytrynowym, maleinowym i jabłkowym z utworzeniem stref inhibowania w testach fungicydowych.

Poziomy uśmiercania grzybni w przypadku azotynu sodu i potasu, w zestawieniu z kwasem octowym, cytrynowym, maleinowym lub jabłkowym okazują się podobne, wszystkie dając duże strefy inhibowania. Podobnie eksperymenty przeprowadzone z zarodnikami wykazały podobne działanie przeciwgrzybicze dla tych samych mieszanin kwas-azotyn. Ogólnie, badanie polegało na tym, że roztwory wykazały silniejsze działanie przeciwgrzybicze w porównaniu z kremami, natomiast grzybnie były bardziej podatne na działanie przeciwgrzybicze niż zarodniki. Jednakże, kremy na ogół wytwarzają tlenki azotu przez dłuższy czas, co może być zaletą, jeśli wskazane jest przedłużenie wytwarzania NO lub innego tlenku azotu na powierzchni paznokcia, w celu zwiększenia przenikania przez paznokieć.

Ilość wytworzonego NO przez mieszaniny kwas-azotyn nie koniecznie koreluje z wielkością strefy inhibowania, aczkolwiek istnieje ogólna korelacja z całkowitą ilością wytworzonych tlenków azotu. Na przykład, roztwory kwasu askorbinowego-azotynu, wytwarzające duże ilości NO, wykazują jedynie słabą czynność w niektórych testach, a z kolei zestawienia azotynu potasu i kwasu jabłkowego

PL 213 555 B1 wytwarzają tylko w przybliżeniu połowę ilości NO co kwas cytrynowy, a jednak rozmiary stref inhibowania nie są wcale mniejsze.

Opóźnione uwalnianie tlenków azotu od oddalonej strony paznokcia jest szczególnie użyteczne, jako że zwykle konieczna jest co najmniej 5 minutowa ekspozycja na substancję czynną aby wytworzyć efekt uśmiercania. Szczytowe uśmiercania obserwuje się po 30 minutach ale czynność przeciwgrzybicza stale rośnie do 2 godzin po ekspozycji na gaz czynny.

Kompozycja wytwarzająca tlenek azotu może mieć jakąkolwiek odpowiednią postać. Jednakże należy uwzględnić, że aby uzyskać czynne generowanie tlenków azotu, to do chwili zapotrzebowania na tlenek azotu reagenty należy utrzymywać osobno. Wprawdzie jest to korzystne i niekoniecznie musi być zawsze stosowane. Na przykład plaster okluzyjny może być skonstruowany z żelem lub matrycą, do których składniki generujące tlenki azotu są zapakowane, ale plaster jest zabezpieczony stosowną taśmą zapobiegającą przed uwalnianiem gazowej mieszaniny.

W takim plastrze matryca lub ż el maj ą korzystnie postać kleistą , a moc przyklejenia jest wystarczająca do przezwyciężenia tendencji tlenku azotu do ucieczki i wypychania taśm, choć należy uwzględnić, że moc przyklejenia nie może być taka, aby taśma nie mogłaby być zadowalająco usunięta do zastosowania plastra. Ponadto, korzystne jest dostarczenie odpowiednich stabilizatorów, takich jak środki chelatujące, w żelu lub matrycy, w celu przedłużenia okresu trwania NO, lub w celu spowolnienia szybkości jego wytwarzania. W dodatku NO jest lepiej rozpuszczalny w substancjach niewodnych i lipidowych, i dodanie takich substancji do środka leczniczego może przedłużyć czynność i dostarczanie NO do leczonego paznokcia i do łożyska paznokcia.

Niemniej kompozycje zawierające już wolny NO na ogół nie będą trwałe przez dłuższy czas i powinny być użyte przez pacjenta możliwie jak najszybciej po przygotowaniu.

Bardziej korzystne jest dostarczenie kompozycji stosowanych według wynalazku w wielu częściach. Części te mogą zawierać osobno środki czynne lub reagenty, które po zmieszaniu służą do generowania tlenków azotu. A zatem pierwsza kompozycja może zawierać odpowiedni azotyn dostarczony we właściwej zaróbce. Druga kompozycja może zawierać odpowiedni kwas. Te dwie kompozycje mogą potem być zmieszane, korzystnie jednorodnie, a następnie nanoszone na zainfekowany paznokieć lub mogą być zmieszane in situ. Wprawdzie jest na ogół pożądane zminimalizowanie liczby komponentów niezbędnych do zmieszania dla uzyskania finalnej kompozycji generującej tlenek azotu, to jednak należy uwzględnić, że może być dostarczona dowolna ich liczba. W szczególności może być korzystne dostarczenie trzeciej kompozycji zawierającej na przykład kwas redukujący. Jednakże, jeśli używany jest kwas redukujący, taki jak askorbinowy, to na ogół korzystne jest użycie go również jako kwasu, z jednej strony, lub dostarczenie go łącznie z podstawowym kwasem w oddzielnej kompozycji, niż azotyn.

Komponent azotynowy może być dołączony do szeregu zaróbek, obejmujących na przykład Eudragit L100, karbopol, kaboksymetylocelulozę lub hydroksymetylocelulozę, a komponent kwasowy może być dołączony do innej odpowiedniej zaróbki, takiej jak karbopol, karboksymetyloceluloza, hydroksymetyloceluloza, metyloceluloza lub do bazy wodnej. Inne zaróbki, takie jak alkohol poliwinylowy, glikol propylenowy, poliwinylopirolidon (powidon), żelatyna, żywica guarowa i szelak, mogą być użyte dla wspomożenia tworzenia błony, użytecznej dla utrzymania kompozycji in situ.

W szczególnoś ci kompozycje odpowiednie do wprowadzania substancji poprzez skórę wł a ś ciwą i warstwę rogową, mogą na ogół nie być odpowiednie dla paznokcia, jako że paznokieć jest w sumie substancją hydrofilową a warstwa rogowa jest ogólnie hydrofobowa. A zatem substancje jonowe i jonizowalne, łatwo rozpuszczalne w wodzie, mogą być korzystnie pobierane do paznokcia i zaróbki wspomagające są tu korzystne.

Ogólnie korzystne jest zastosowanie preparatów wodnych aby wspomagać przenikanie. Takie preparaty mogą być ruchliwymi roztworami, ale ponieważ wydaje się, że określona minimalna długość ekspozycji NO i/lub innych tlenków azotu jest optymalna, to ogólnie jest korzystne, aby jakiekolwiek wytwarzanie tlenków azotu nie kończyło się zbyt szybko, aby zapewnić wystarczający czas do pobrania na styku paznokcia, i na ogół jest korzystne, aby preparaty miały postać żeli, kremów, płynów, maści lub innych zagęszczonych postaci, takich jak lakiery. Właściwe zagęszczenie i inne charakterystyki można uzyskać przez zastosowanie odpowiednich zaróbek, przedstawionych powyżej. Na przykład wykazano, że Eudragity mają zdolność do modyfikowania profilu uwalniania tlenków azotu z preparatu.

W korzystnej realizacji kompozycja zawiera oddzielne preparaty wodne kwasu organicznego i azotynu. Bardziej korzystnie, każ dy z preparatów ma postać ż elu, kremu, pł ynu, maś ci lub farby do

PL 213 555 B1 zmieszania z pozostałym, który jest również wybrany z podobnej grupy. Szczególnie korzystnie jeden lub oba preparaty zawierają zaróbkę odpowiednią do opóźniania uwalniania tlenków azotu po zmieszaniu. W przypadku azotynu korzystną zaróbką jest Eudragit, taki jak Eudragit L100.

Wybrane zaróbki mogą mieć za zadanie opóźnianie uwalniania tlenku, ale na ogół mają również właściwości zagęszczające, przy czym ilość zaróbki jest ogólnie określana przez ilość niezbędną do dostarczenia właściwego żelu. Może ona ulegać zmianie w obrębie ogólnie znanego zakresu, który jest łatwy do określenia i rozpoznania przez znawcę. Jednakże, jako wskazówkę należy przyjąć, że odpowiednie ilości mogą zmieniać się w zakresie od 1% do 40%, aczkolwiek występuje duże zróżnicowanie pomiędzy zaróbkami. Na ogół, korzystne zaróbki wymagają ilości od 2% do 10%, korzystnie 3% do 5%, natomiast te używane głównie do żelowania są stosowane w ilościach odpowiednich do uzyskania tego celu, w zestawieniu albo osobno. Na przykład glikol polietylenowy jest stosownie używany jako środek zwiększający lepkość w ilościach w zakresie od 10% do 50%, ale bardziej korzystnie 20% do 35% wag./obj. Odpowiednie środki zagęszczające obejmują karbopole i pochodne celulozy, a te są zwykle używane w ilościach od 2% do 10%, stosownie do rodzaju wymaganego preparatu. Korzystnym preparatem jest ruchliwy żel.

Należy uwzględnić, że kompozycje stosowane według wynalazku mogą zawierać inne składniki według potrzeb, takie jak przeciwutleniacze, środki konserwujące, barwiące i zapachowe, jak również środki powierzchniowo czynne i/lub penetrujące, według potrzeb, aczkolwiek wodne zestawienia azotynu i kwasu są zdolne do łatwego dostarczania tlenków azotu przez paznokieć, nie wymagając dodatkowych składników.

Wprawdzie wynalazek jest na ogół zilustrowany tu w odniesieniu do dwóch kompozycji mieszanych z dostarczeniem finalnej kompozycji generującej tlenek azotu, to należy dostrzec, że takie odniesienie obejmuje odniesienie do więcej niż dwóch początkowych kompozycji, o ile nie jest to skądinąd oczywiste lub wskazane.

Kompozycje stosowane według wynalazku mogą zawierać jakiekolwiek odpowiednie zaróbki do zmieszania. Ważne jest to, aby kwas i azotyn, lub prekursor azotynu, mogły reagować tak, aby generować żądane tlenki azotu. A zatem co najmniej jedna z początkowych kompozycji dostarczających finalną kompozycję, powinna korzystnie zawierać składnik wodny, aby umożliwić zajście reakcji generowania tlenku azotu. Bardziej korzystnie, obie początkowe kompozycje powinny zawierać wodne składniki dla ułatwienia wymieszania składników, aczkolwiek, jeśli wymaga się, aby składniki reagowały tylko powoli, ilość wody może być zminimalizowana i w jednej lub w obu początkowych kompozycjach.

Nie ma ograniczeń co do rodzajów początkowych kompozycji, które mają być zmieszane w celu uzyskania finalnej kompozycji, pod warunkiem, że finalna kompozycja służy do generowania tlenków azotu. Należy zauważyć, że odniesienie do „tlenków azotu” obejmuje odniesienie do 100% NO, aczkolwiek nie jest to koniecznie wymagane lub korzystne.

Na przykład początkowe kompozycje mogą mieć dowolną postać, taką jak ciecz, żel lub ciało stałe, chociaż, jeśli jedna jest stała, to pozostała korzystnie jest cieczą lub żelem. Kategoria cieczy obejmuje roztwory, zawiesiny lub koloidy, i takie rozważania mają zastosowanie również do żeli, które ogólnie obejmują jakikolwiek stan pomiędzy cieczami i ciałami stałymi.

Bardziej szczegółowo, żele obejmują takie formy jak kremy, maści, tynktury, woski i płyny, chociaż ten ostatni może mieścić się w cieczach, zależnie od jego właściwości. Należy uwzględnić, że nie ma konkretnego wykluczenia, pod warunkiem, że ciało stałe ciekłego żelu służy jako zaróbka dla substancji czynnej.

Stałe zaróbki mogą obejmować na przykład matryce w plastrach lub woski o dłuższych łańcuchach.

Początkowe kompozycje mogą być odpowiednio wymieszane, przed nanoszeniem lub in situ, w celu dostarczenia finalnej kompozycji do generowania tlenków azotu. Takie kompozycje mogą być wprost mieszaninami żel/żel, na przykład, które następnie mogą być nanoszone na paznokieć i pozostawione w tym miejscu. Mogą również obejmować dwie ciecze, które między sobą tworzą żel, lakier, ciało stałe lub farbę oraz podobnie dwa żele lub ciecz i żel, mogą służyć do zestalenia, tworzenia lakieru lub inaczej tworzą środowisko ochronne do generowania, utrzymywania i wydzielania tlenków azotu.

Przykładowo, żel może być nanoszony na paznokieć a następnie plaster, taki jak przylepiec niosący matrycę zawierającą inną substancje czynną, jest nanoszony na żel i wskutek zetknięcia substancje czynne powoli reagują generując tlenek azotu.

PL 213 555 B1

W innej praktycznej realizacji, substancje czynne mogą być rozprowadzone jako farby lub lakiery. Odpowiednio jeden składnik, na przykład azotyn, może być naniesiony i pozostawiony do wyschnięcia a następnie drugi jest namalowywany na wierzchu. Woda zawarta w tym drugim składniku umożliwia zajście reakcji. Jeśli tak jest wymagane, może być zastosowany szybko wysychający rozpuszczalnik, taki jak alkohol lub octan, aczkolwiek zaletą wynalazku jest to, że takie rozpuszczalniki i środki wspomagające przenikanie nie są konieczne. Jednakże może być pożądane dostarczenie składników błony w oddzielnych preparatach tak, że na przykład po zmieszaniu zachodzi reakcja polimeryzacji. W jednym preparacie może być dostarczony katalizator, a w pozostałym dobrane polimeryzowalne monomery. Alternatywnie, odparowanie rozpuszczalnika może umożliwić żelowanie polimeru w preparacie lub twardnienie.

Faza generująca tlenek azotu kompozycji stosowanej według wynalazku na ogół zanika w ciągu dwóch lub trzech godzin, a często szybciej, chociaż efekt wysysający paznokcia zapewnia tlenki azotu po drugiej stronie paznokcia przez znacznie dłuższy czas, a często aż do wydajnego zaniku wytwarzania tlenku. W trakcie wytwarzania tlenku korzystne jest utrzymywanie kompozycji mieszankowej in situ, co można osiągnąć przez zatężenie kompozycji. Alternatywnie, może być pożądane zabezpieczenie paznokcia, na przykład opatrunkiem okluzyjnym.

Przykładowo, matryca plastra lub przylepca jest niewodna, ale hydrofilowa i zawiera mieszaninę substancji czynnych zasadniczo w suchej postaci. W tym przypadku termin „postać sucha” może obejmować kryształy na przykład z wodą dołączoną lub wodą krystalizacyjną. Zatem, chociaż obie substancje czynne są obecne w matrycy plastra lub przylepca, to nie mogą reagować ze sobą przy braku odpowiedniej ilości wody funkcjonującej jako rozpuszczalnik, zapewniającej reaktywne środowisko. Jeśli zaistnieje potrzeba nałożenia plastra lub przylepca, taśma ochronna może być usunięta i odpowiednia ilość wody, taka jak kilka kropel, może być naniesiona na matrycę aktywując składniki czynne. Aktywowany plaster może być następnie nałożony na paznokieć umożliwiając generowanym tlenkom azotu wywarcie właściwego im efektu.

Zasada dostarczenia zasadniczo suchej kompozycji, do której dodaje się wodę, może być także zastosowana do innych kompozycji.

W takich przypadkach należy uwzględnić, że termin „suchy” dotyczy zawartości wolnej wody tak, że jeśli na przykład kompozycja ma być żelem, to zawartość wody będzie skrajnie niska, taka jak 1% lub nawet niższa. Korzystnie takie kompozycje są zasadniczo bezwodne.

Składniki czynne zastosowanej kompozycji według wynalazku mogą być obecne w dowolnych właściwych ilościach, co jest oczywiste dla specjalisty w dziedzinie. Na ogół, korzystnie ilość azotynu wynosi w przybliżeniu 0,5 do 30% wagowych finalnej kompozycji. Bardziej korzystnie ilość azotynu lub jego prekursora wynosi 1 do 20%, a zwłaszcza 1 do 15%, korzystnie 5 do 15%. Korzystnym zakresem jest 1 do 10% lub 2 do 10%. Wyższe stężenia są na ogół korzystne, a minimalne korzystne stężenie wynosi 8-10%. W kremach, płynach i żelach zalecany jest górny limit 13,5%, aczkolwiek odpowiednie preparaty mogą dopuszczać wyższe poziomy.

Ogólnie jest korzystne, aby zastosowana kompozycja według wynalazku była dostarczana w postaci dwóch wodnych żeli, płynów lub kremów. Bardziej korzystnie jeden zawiera kwas cytrynowy w stężeniu między 0,5% i 20%, takim jak 0,75%, 2,25%, 4,5%, 9% i 13,5% wag./wag., a pozostały zawiera azotyn sodu podany powyżej, na przykład 0,5%, 1,5%, 3,0%, 6% i 9% wag./wag. Korzystne stężenia znajdują się w zakresie 10% dla każdego ze składników, co zapewnia odpowiedni nadmiar kwasu. Korzystne jest, aby obie substancje czynne były obecne w co najmniej 2%, korzystnie 5% wag./wag. lub wyższym, aby zapewnić skuteczną dawkę tlenków azotu przenikającą przez paznokieć. Przykładowo, kwas jest obecny w ilości 13,5% a azotyn w 9%, lub w innej sytuacji każdy z nich jest obecny w ilościach 10%.

Korzystnym kwasem jest kwas cytrynowy, natomiast korzystnym azotynem jest azotyn sodu.

Żele, płyny lub kremy mogą być mieszane w dowolnych odpowiednich ilościach przez pacjenta, na przykład, aby pokryć zainfekowaną część paznokcia(paznokci) palca u nogi lub ręki. Właściwe ilości każdego żelu, płynu lub kremu mogą znajdować się w zakresie 0,005 do 1 g, bardziej korzystnie 0,1-0,5 g, gdzie składniki wstępują w reakcję wytwarzają tlenki azotu.

Korzystnie kwas jest obecny w co najmniej stechiometrycznej ilości w stosunku do azotynu lub jego prekursora. Bardziej korzystnie, kwas jest obecny w stechiometrycznym nadmiarze wystarczającym do zapewnienia kwaśnego środowiska dla wystarczającej ilości azotynu, aby generować tlenki azotu. Aczkolwiek nie jest konieczne, aby całość azotynu generowała tlenki azotu, to jest ogólnie nie8

PL 213 555 B1 efektywne pozostawienie zbyt dużej nieprzereagowanej ilości azotynu, i korzystne jest, aby większość azotynu została przekształcona w tlenki azotu.

Ogólnie, korzystnie kwas jest obecny w wystarczającej ilości, aby finalna kompozycja miała pH 5 lub niższe, zwłaszcza 4 lub niższe. Jednakże, reakcja generowania tlenku azotu może zachodzić przy wyższym pH i pH 5,5 lub 6 może być do przyjęcia, zwłaszcza w obecności nadmiaru kwasów redukujących, a więc należy uwzględnić, że pH finalnej kompozycji nie stanowi zasadniczo istotnej części wynalazku.

Nie ma ograniczeń co do azotynu innych niż to, że musi być farmaceutycznie dopuszczalny. Nawet to wymaganie nie ma zasadniczego znaczenia, jako że finalna kompozycja na ogół będzie nakładana na palec pacjenta, a więc kontakt skórny jest minimalny i minimalna potencjalna ekspozycja układowa. Niemniej ze względów bezpieczeństwa korzystne jest, aby azotyny lub ich prekursory ogólnie były bezpieczne do podawania miejscowego.

Rodzaj azotynu, dla uproszczenia rozważań, ogólnie powinien być nieorganiczny i co najmniej częściowo rozpuszczalny w wodzie. Korzystne są azotyny metali alkalicznych i azotyny metali ziem alkalicznych, aczkolwiek inne odpowiednie azotyny, takie jak związki metali przejściowych, mogą być również używane, nadające się zwłaszcza pod względem rozpuszczalności. Zwłaszcza mogą być stosowane związki sodu, potasu, magnezu i baru, przy czym związki sodu i potasu są ogólnie korzystnie ze względu na ich cenę i dostępność.

Odpowiednie środki zakwaszające obejmują kwasy nieorganiczne, ale ze względu na ich ogólną niedopuszczalność farmaceutyczną, nie są one na ogół korzystne. Zatem bardziej korzystne są kwasy organiczne, zwłaszcza te zdolne do tworzenia roztworów w wodzie, dające pH 4 lub niższe.

Takie kwasy obejmują kwas mrówkowy, kwas jabłkowy, kwas maleinowy, kwas octowy, kwas mlekowy, kwas cytrynowy, kwas benzoesowy, kwas winowy i kwas salicylowy, i należy uwzględnić, że lista ta jest raczej alternatywna. Inne odpowiednie kwasy obejmują kwas askorbinowy i palmitynian askorbylu, które niekoniecznie tworzą takie kwaśne roztwory, ale które są kwasami redukującymi i mają tę zaletę, ż e zwiększają ilość generowanego NO, i które mogą służyć również do stabilizowania wytworzonego NO. Należy uwzględnić, że odniesienie do kwasów obejmuje odniesienie do jakiejkolwiek postaci kwasu, odpowiednio dostarczonego wodnego roztworu kwasu z samą wodą lub korzystnie z fizjologicznie dopuszczalnym środkiem odbezpieczającym, który może być obecny początkowo w roztworze azotynu lub preparacie, przed zmieszaniem. Przykłady odpowiednich postaci obejmują uwodnione i bezwodne postacie kwasu, takie jak monohydrat kwasu cytrynowego i jego postać bezwodna.

Ze względu na dogodne właściwości kwasów redukujących, w jednej realizacji korzystnie jest dostarczony kwas redukujący w dodatku do kwasu podstawowego, do tworzenia finalnej kompozycji. Odpowiednie udziały wynoszą od 5% do 200% kwasu podstawowego, przy czym 5% do 150% jest bardziej korzystne, w szczególności od 5 do 40% kwasu podstawowego, a bardziej korzystnie od 10 do 20%.

Ujawniono zestaw zawierający wodny preparat azotynowy i wodny preparat kwasu organicznego, osobno rozmieszczone, z których to każdy z dwóch preparatów nadaje się do nanoszenia na leczony paznokieć tak, że azotyn i kwas mogą reagować uwalniając tlenki azotu do penetrowania paznokcia. Preparaty są korzystnie w określonych stężeniach i/lub postaciach, zwłaszcza płynach, żelach kremach lub lakierach i są odpowiednio dostarczane w zamykanych pojemnikach wielokrotnego użytku tak, że każdy zestaw może zapewniać wielokrotne dawki lub nanoszenia.

Z zastosowaniem kompozycji według wynalazku moż e być leczona dowolna postać infekcji podpaznokciowej. Jednakże, na ogół jest stosowana do leczenia grzybicy paznokci.

Właściwe czasy trwania leczenia na ogół są łatwe do określenia dla lekarza. Na ogół jednakże korzystne jest kontynuowanie leczenia aż do osiągnięcia właściwego wyleczenia lub pełnego klinicznego wyleczenia. W pierwszym przypadku mikroorganizmy chorobotwórcze są uśmiercane, ale paznokieć może być nadal zniekształcony, jako że odrośnięcie paznokci palców ręki może zająć 6 miesięcy, natomiast paznokci palców u nóg - do roku. Wyleczenie kliniczne osiąga się, gdy zainfekowany paznokieć nie wykazuje więcej oznak infekcji, a że to zależy od odrastania paznokcia, to może trwać znacznie dłużej niż właściwe wyleczenie.

Na ogół jest korzystne kontynuowanie leczenia przez co najmniej dwa miesiące, bardziej korzystnie trzy miesiące, a zwłaszcza 3 do 6 miesięcy. W rzeczy samej nasze testy wykazują, że organizmy prawdopodobnie są uśmiercane w ciągu kilku dni od rozpoczęcia leczenia, a więc leczenie przez tydzień może być w zupełności wystarczające, zwłaszcza jeśli kompozycja jest nanoszona na przykład

PL 213 555 B1 dwa lub trzy razy dziennie. Jest zalecane aby trzymiesięczny harmonogram leczenia był adekwatny do efektu wyleczenia, pozwalając aby pacjent był w stanie obserwować odrastanie zdrowego paznokcia. Jednakże należy uwzględnić, że leczenie może być kontynuowane tak długo jak to konieczne, na przykład do osiągnięcia klinicznego wyleczenia, które może trwać do 14 miesięcy lub dłużej, pozwalając na wyleczenie i odrost paznokcia.

Dawki i ilości kompozycji do nanoszenia mogą być uzależnione od parametrów, takich jak wiek i waga pacjenta, ale bardziej właściwie mogą być uzależnione od wymiarów paznokcia, takich jak grubość i pole powierzchni, od biorcy, i mogą być łatwo wyznaczone przez lekarza specjalistę. Zaletą wynalazku jest to, że jedynie niewielkie ilości tlenków azotu są potrzebne aby były skuteczne, tak, że nie jest koniecznym wymogiem, aby różnicować recepty dla różnych pacjentów i jeden rodzaj preparatu może być stosowany dla wszystkich pacjentów. Jednakże mogą być stosowane różne moce dawek, jak na przykład preparaty wytwarzające więcej tlenków w stanach nawrotowych palca u nogi, a preparaty mniejszej mocy do paznokci palców ręki. Moc niekoniecznie musi dotyczyć ilości wytworzonych tlenków, ale na równi może dotyczyć długości czasu generowania tlenków azotu przez daną kompozycję.

Podawanie kompozycji dwa lub więcej razy dziennie, korzystnie dwa lub trzy razy dziennie, stanowi korzystne ich zastosowanie według wynalazku. Może to skutecznie dostarczać zwiększone poziomy tlenków azotu na zainfekowanej stronie paznokcia blisko momentu, gdy działanie poprzedniej dawki wygasa. Dawki mogą być dobrane tak, aby utrzymać ciągłe przenoszenie tlenków azotu przez paznokieć, lub nieciągłe, jeśli wymagane.

Kompozycje mogą być wytworzone dowolnymi właściwymi środkami. Jeśli kompozycje zawierają wodne komponenty, to na ogół korzystne jest rozpuszczenie składników czynnych w wodzie lub w wodnym preparacie, które to składniki czynne mogą następnie być pozostawione osobno, aż do zużycia. Dowolne zarobki można na ogół dodać po rozpuszczeniu głównego składnika czynnego. Preparaty suche mogą być wytworzone zasadniczo jako całość, ale bez dodawania wody, którą dodaje się, gdy jest konieczne aktywowanie kompozycji.

Jeśli finalna kompozycja zawiera ciecze lub żele, to te mogą być nanoszone dowolnymi właściwymi środkami, nawet mieszane ręcznie. Inne środki mogą obejmować na przykład strzykawkę dwucylindrową lub dualnie uruchamiany dozownik, z końcowym mieszaniem palcem lub łopatką lub dowolne inne środki.

Należy zauważyć, że poniższe przykłady nie ograniczają zakresu wynalazku. Przykłady zilustrowano w odniesieniu do załączonych rysunków, na których:

fig. 1 przedstawia test użyty do pomiaru stref inhibowania;

fig. 2 przedstawia zestaw celki Franz'a do pomiaru wydzielania tlenków azotu z kompozycji; fig. 3 przedstawia wytwarzanie NO w czasie, z wybranych środków żelujących zawierających azotyny i kwasy;

fig. 4 przedstawia strefy inhibowania dla określonych preparatów typu roztworów i żeli;

fig. 5 przedstawia strefy inhibowania dla określonych preparatów w obecności środków redukujących;

fig. 6 przedstawia strefy inhibowania dla określonych preparatów badanych w obecności α-tokoferolu i innych środków redukujących;

fig. 7 przedstawia przybliżone maksymalne stężenia NO i NO2/NO3 wytwarzane przez różne preparaty;

fig. 8 przedstawia przybliżony czas osiągnięcia maksimum wytwarzania NO przez różne badane preparaty;

fig. 9 przedstawia ilość NO, która przenika przez paznokieć z roztworów 10% kwasu i 10% azotynu przez okres 18 godzin;

fig. 10 przedstawia ilość NO, która przenika przez paznokieć z roztworów 5% kwasu i 5% azotynu przez okres 18 godzin;

fig. 11 przedstawia zestaw użyty do pomiaru ilości NO przenikających przez paznokieć według fig. 9 i 10;

fig. 12. przedstawia ilość NO, która przenika przez paznokieć z roztworów 10% kwasu askorbinowego i 10% azotynu przez okres 18 godzin a fig. 13 przedstawia zestaw celki Franz'a użyty do pomiaru stref inhibowania uzyskanych dla kompozycji naniesionych na ludzki paznokieć.

PL 213 555 B1

P r z y k ł a d sposobu 1

Analityczny model in vitro do skriningu preparatów wytwarzających gazy

Metodę oznaczania strefy uśmiercania dla różnych kremów i roztworów przedstawiono na fig. 1. Klucz wskazuje komponenty testu. Wieko 2 ml probówki Eppendorfa zatopiono w warstwie dekstrozowego agaru Sabouraud'a, a powierzchnię agaru powleczono zarodnikami A. niger. Użyto zarodniki Apergillus niger, jako że te są znane ze znacznie większej oporności na czynność przeciwmikrobową w porównaniu z grzybnią . Pł ytki takż e inkubowano do otrzymania grzybni lub uż yto bezpoś rednio do testowania zdolności mieszanin stosowanych do uśmiercania zarodników. Mieszaniny stosowane według wynalazku umieszczono w nakrywce Eppendorfa i zamieszano 10 razy końcem pipety. Te płytki testowe są także nazywane płytkami przyściennej studzienkowej strefy inhibowania. Każdy preparat testowano trzykrotnie.

Technika ta zapewnia doskonałe wyniki, jako że mieszanka wytwarzająca NO nie wchodzi w styczność z agarem, a próby kontrolne wykazuj ą , ż e nie wystę puje inhibowanie rozwoju przez puste studzienki. Oznaczenie to jest również czułe.

Użyto następujące próby kontrolne:

i) tylko puste wieko Eppendorfa w dekstrozowym agarze Sabouraud'a;

ii) 0,1 ml azotynu sodu (10%) na wieku Eppendorfa;

iii) 0,1 ml kwasu cytrynowego (13,5%) na wieku Eppendorfa;

iv) 0,1 ml azotynu sodu (9%) na wieku Eppendorfa;

v) 0,1 ml kwasu cytrynowego (10%) na wieku Eppendorfa.

Nie zaobserwowano inhibowania rozwoju w którejkolwiek z prób kontrolnych.

P r z y k ł a d sposobu 2

Organizm wskaźnikowy

Dermatofity towarzyszące grzybicy paznokci są wolno rozwijającymi się organizmami, 5 dni zajmuje wytworzenie pełnego dywanu wzrostowego na płytce agaru dekstrozowego Sabouraud'a inkubowanej w 25°C. Jest to czynnik limitujący w skriningu czynnych preparatów i co najmniej tydzień zajmuje stworzenie jednego zestawu wyników. Dlatego też zdecydowano użyć szybciej rosnący organizm wskaźnikowy do oznaczenia skuteczności preparatów, chociaż skuteczność niektórych kompozycji wykazano na T. rubrum. Wybranym organizmem był grzyb Aspergillus niger, organizm często stosowany do monitorowania środków konserwujących i skuteczności przeciw-mikroorganizmom preparatów kosmetycznych i miejscowych.

A. niger użyto jako organizm wskaźnikowy dla grzybów towarzyszących grzybicy paznokci, a testy przeprowadzano zarówno na zarodnikach grzybów, jak i na grzybni. Jeś li uż ywano grzybnię , to strefa śmiertelności jest wskazana przez zanik rozwoju zarodników grzyba (strefa czarno/brązowa), a biała strefa wskazuje na inhibowanie rozwoju. W przypadku płytek z zarodnikami grzyba, inhibowanie rozwoju jest wskazane przez brak rozwoju grzybni (biało-kremowa) tak, że widoczny jest tylko agar.

P r z y k ł a d sposobu 3

Wykrywanie NO

Wytworzone NO mierzono z użyciem detektora NO WPI (World Precision Instrument, Inc.). Pomiary NO muszą być wykonywane w środowisku wodnym przy użyciu tego czujnika, i eksperymenty zostały dostosowane tak, aby spełniać ten wymóg. Urządzenia te są w stanie również monitorować wytwarzanie NO2/NO3 po dodaniu odczynników i po niewielkich modyfikacjach metody.

Zmontowano celkę Franz'a i umieszczono na mieszadle magnetycznym w temperaturze pokojowej, z wodą dejonizowaną w niższym odbieralniku zawierającym magnetyczny element mieszający dla zapewnienia dyspergowania gazu penetrującego membranę. Półcalowy (13 mm) krążek bibuły filtracyjnej zaimpregnowano składnikiem preparatu do wytwarzania NO - azotynem sodu. Impregnowany krążek umieszczono w górnej komorze celki Franz'a na wierzchu membrany przed odpipetowaniem na nią równoważnej ilości składnika - kwasu cytrynowego. Ilość wytworzonego NO monitorowano z użyciem sondy NO WPI. Eksperyment zestawiono tak, jak na fig. 2.

Gdy mierzone poziomy NO osiągnęły plateau, usunięto krążek zawierający mieszaninę azotynu sodu i kwasu cytrynowego, a do komory odbieralnika dodano 0,1 ml roztworu 1M H2SO4 + 0,1M Kl i zmierzono ilość NO2/NO3 (poprzez konwersję) z użyciem detektora WPI.

P r z y k ł a d 1

Działanie preparatów kwasowych zmieszanych z roztworami azotynów na zarodniki A. niger

Wybrano kwasy: kwas cytrynowy, octowy, askorbinowy, maleinowy i jabłkowy.

Wybrano azotyny: azotyn sodu, potasu i srebra.

PL 213 555 B1

Użyto zestaw do oznaczeń przedstawiony w przykładzie 1.

We wszystkich przykładach wykorzystuje się strefy uśmiercania z użyciem zestawu z przykładu 1, o ile nie zaznaczono inaczej.

Przygotowano następujące roztwory kwasów (wag/obj.) w wodzie destylowanej:

1) Kwas cytrynowy 2,5%

2) Kwas cytrynowy 5%

3) Kwas cytrynowy 7,5%

4) Kwas cytrynowy 10%

5) Kwas askorbinowy 2,5%

6) Kwas askorbinowy 5%

7) Kwas askorbinowy 7,5%

8) Kwas askorbinowy 10%

9) Kwas maleinowy 2,5%

10) Kwas maleinowy 5%

11) Kwas maleinowy 7,5%

12) Kwas maleinowy 10%

13) Kwas jabłkowy 2,5%

14) Kwas jabłkowy 5%

15) Kwas jabłkowy 7,5%

16) Kwas jabłkowy 10%

17) Kwas octowy 2,5%

18) Kwas octowy 5%

19) Kwas octowy 7,5%

20) Kwas octowy 10%

Wieka 2 ml mikroprobówek Eppendorfa usunięto, wysterylizowano i dołączono do płytki z agarem dekstrozowym Sabouraud'a, umieszczając wieka na płytce Petriego i wylewając 25 ml agaru dookoła nich. Pozostawiono agar do stężenia, a następnie zaszczepiono A. niger. Każdy z roztworów wskazanych powyżej zmieszano z 2,5, 5, 7,5 i 10% roztworami azotynu sodu/potasu/srebra dodając dokładnie 0,1 ml ilości każdego roztworu na wieko mikroprobówki i mieszając delikatnie obracano płytką. Ustawiono oddzielne płytki dla każdego z roztworów kwasów i inkubowano w 32°C.

Strefy inhibowania rozwoju na każdej płytce mierzono po 24 godzinach.

Wyniki przedstawiono w poniższych tablicach 1 i 2.

T a b l i c a 1

	Azotyn sodu
		2,5%	5%	7,5%	10%
Kwas cytrynowy	2,5%	2,2	3,0	2,9	2,8
5%	2,8	3,6	3,9	3,9
7,5%	2,9	3,7	4,5	4,6
10%	3,0	4,1	4,4	5,4
Kwas askorbinowy	2,5%	0	0	0	0
5%	0	0	0	0
7,5%	0	0	0	0
10%	0	0	0	0
Kwas maleinowy	2,5%	2,5	2,6	3,9	3,0
5%	3,0	3,2	3,7	3,1
7,5%	3,4	3,9	4,6	4,9
10%	3,1	4,4	5,1	5,8

PL 213 555 B1 cd. tablicy 1

Kwas jabłkowy	2,5%	2,4	2,9	3,8	3,6
5%	2,9	3,4	3,8	4,2
7,5%	2,9	3,8	4,6	4,3
10%	3,2	4,2	5,8	5,1
Kwas octowy	2,5%	2,5	2,7	3,4	3,6
5%	2,8	3,3	4,0	4,0
7,5%	2,6	3,5	4,1	4,1
10%	3,4	3,6	4,4	5,2

T a b l i c a 2

Wyniki dla strefy inhibowania azotynu potasu - zarodniki Aspergillus niger

	Azotyn potasu
		2,5%	5%	7,5%	10%
Kwas cytrynowy	2,5%	0	0	0	1,5%
5%	0	1,5	1,8	2,8
7,5%	0	1,7	2,1	3,4
10%	0	2,2	3,2	3,8
Kwas askorbinowy	2,5%	0	0	0	0
5%	0	0	0	0
7,5%	0	0	0	0
10%	0	0	0	0
Kwas maleinowy	2,5%	0	1,3	1,5	1,4
5%	0	2,5	3,0	2,5
7,5%	0	2,5	3,2	3,2
10%	0	3,0	3,2	5,0
Kwas jabłkowy	2,5%	0	1,3	1,5	1,8
5%	0	2,1	2,5	2,2
7,5%	0	2,4	2,5	2,7
10%	0	2,8	2,7	3,5
Kwas octowy	2,5%	1,7	2,3	2,5	2,5
5%	2,1	3,5	3,2	4,0
7,5%	3,0	3,7	4,0	4,5
10%	3,5	4,0	4,5	4,6

Nie przedstawiono tablicy dla azotynu srebra, jako że nie zaobserwowano stref inhibowania dla któregokolwiek z kwasów testowanych z azotynem srebra.

Niektóre mieszaniny kwasu askorbinowego pęczniały po mieszaniu do takiego stopnia, że wybrzuszały się ponad górny brzeg studzienki, czasami powodując małe wycieki na agarze w trakcie przenoszenia płytek do inkubatora, które tworzyły strefy inhibowania. Nie obserwowano stref inhibowania dla roztworów kwasu askorbinowego, gdy wycieki nie następowały. Żaden z innych kwasów nie wykazywał jakichkolwiek oznak przelewania się lub pęcznienia. Z tych testów okazało się, że wszystkie testowane mieszaniny, poza tymi z azotynem srebra lub z kwasem askorbinowym, są skuteczne.

P r z y k ł a d 2

Działanie preparatów kwasowych zmieszanych z roztworami azotynów na grzybnię A. niger

PL 213 555 B1

Roztwory kwasów przygotowano tak, jak przedstawiono w przykładzie 1. Przed dodaniem preparatów wytwarzających gazy, płytki inkubowano w 32°C przez noc do rozwinięcia pełnego dywanu wzrostowego. Następnie dodano roztwory do studzienek, jak w przykładzie 1. Płytki następnie inkubowano w 32°C przez kolejne 24 godziny. Zmierzono strefy inhibowania rozwoju, jako punkt gdzie spotyka się obszar tworzenia zarodników (czarny) i obszar bez tworzących się zarodników (biało/kremowy). Wyniki przedstawiono w tablicach 3, 4 i 5.

T a b l i c a 3

Wyniki dla strefy inhibowania azotynu sodu - grzybnia Aspergillus niger

	Azotyn sodu
		2,5%	5%	7,5%	10%
Kwas cytrynowy	2,5%	3,0	0	0	0
5%	2,8	1,2	1,8	2,4
7,5%	3,2	1,4	3,1	3,4
10%	3,4	3,1	3,7	4,6
Kwas askorbinowy	2,5%	0	0	0	0
5%	0 (2)	0	0 (2,1)	0 (2,5)
7,5%	0(2,5)	0 (3,4)	0 (2,5)	0
10%	0 (2,0)	0 (1,9)	0 (3,0)	0(3,9)
Kwas maleinowy	2,5%	3,4	3,5	3,4	3,0
5%	3,9	4,4	4,6	4,4
7,5%	4,0	5,0	4,8	6,0
10%	4,2	5,4	6,2	8,0
Kwas jabłkowy	2,5%	3,5	3,7	3,3	3,1
5%	3,7	4,2	4,1	4,1
7,5%	3,5	5,0	4,9	6,0
10%	3,7	5,6	5,0	6,4
Kwas octowy	2,5%	2,6	3,8	3,7	3,3
5%	3,0	3,6	3,6	4,0
7,5%	3,0	4,3	4,1	4,4
10%	3,6	4,5	4,7	6,2

T a b l i c a 4

Wyniki dla strefy inhibowania azotynu potasu - grzybnia Aspergillus niger

	Azotyn potasu
		2,5%	5%	7,5%	10%
Kwas cytrynowy	2,5%	2,7	3,1	3,2	3,5
5%	3,1	3,9	4,2	5,0
7,5%	3,6	3,9	4,2	5,4
10%	3,7	3,9	5,3	6,2
Kwas askorbinowy	2,5%	0	0	0	0
5%	0 (1,5)	0	0 (2,0)	0 (2,4)
7,5%	0 (3,1)	0(2,5)	0	0(3,1)
10%	0 (2,0)	0 (2,4)	0 (3,0)	0 (3,2)

PL 213 555 B1 cd. tablicy 4

Kwas maleinowy	2,5%	3,5	3,5	3,4	3,5
5%	3,8	3,8	5,0	5,0
7,5%	4,1	3,9	6,5	7,8
10%	4,5	4,3	8,0	9,0
Kwas jabłkowy	2,5%	3,4	3,9	3,8	3,4
5%	3,7	4,0	5,2	5,0
7,5%	3,8	4,4	5,4	5,8
10%	4,2	5,0	6,3	6,4
Kwas octowy	2,5%	2,7	2,8	3,4	3,6
5%	3,4	3,0	4,2	4,4
7,5%	3,6	3,7	4,3	4,7
10%	4,4	4,9	4,6	5,1

T a b l i c a 5

Wyniki dla strefy inhibowania azotynu potasu - grzybnia Aspergillus niger

	Azotyn srebra
		0,025%	0,05%	0,075%	0,10%
Kwas cytrynowy	2,5%	0	0	0	0
5%	0	0	0	0
7,5%	0	0	0	0
10%	0	0	0	0
Kwas askorbinowy	2,5%	0	0	0	0
5%	0	0	0	0
7,5%	0	0	0	0
10%	0	0	0	0
Kwas maleinowy	2,5%	0	0	0	0
5%	0	0	0	0
7,5%	0	0	0	0
10%	0	0	0	0
Kwas jabłkowy	2,5%	0	0	0	0
5%	0	0	0	0
7,5%	0	0	0	0
10%	0	0	0	0
Kwas octowy	2,5%	0	0	0	1,1
5%	0	0	0	1,2
7,5%	0	0	0	1,2
10%	0	0	0	1,3

P r z y k ł a d 3

Działanie wodnych kwasowych preparatów - kremów - zmieszanych z roztworami azotynów na zarodniki A. niger

PL 213 555 B1

Postępowano według procedury przedstawionej w przykładzie 1, z tym wyjątkiem, że zamiast roztworów użyto wodnych kremów, stosując te same stężenia zarówno kwasów jak i azotynów. Wyniki przedstawiono w tablicach 6 i 7.

T a b l i c a 6

Działanie kremów z azotynem sodu na zarodniki Aspergillus Niger

	Azotyn sodu
		2,5%	5%	7,5%	10%
Kwas cytrynowy	2,5%	0	0	0	0
5%	0	0	0	1,5
7,5%	0	0	1,6	2,3
10%	0	0	1,7	2,9
Kwas askorbinowy	2,5%	0	0	0	0
5%	0	0	0	0
7,5%	0	0	0	0
10%	0	0	0	0
Kwas maleinowy	2,5%	0	0	0	0
5%	0	0	0	1,6
7,5%	0	0	1,7	2,2
10%	0	0	1,9	2,5
Kwas jabłkowy	2,5%	0	0	0	0
5%	0	0	1,2	2,0
7,5%	0	0	1,6	2,4
10%	0	0	1,7	2,7
Kwas octowy	2,5%	0	0	0	0
5%	0	0	0	1,7
7,5%	0	0	1,7	2,3
10%	0	0	2,2	2,8

T a b l i c a 7

Działanie kremów z azotynem potasu na zarodniki Aspergillus niger

	Azotyn potasu
		2,5%	5%	7,5%	10%
Kwas cytrynowy	2,5%	0	0	0	0
5%	0	0	1,6	1,7
7,5%	0	1,7	1,65	1,8
10%	0	1,8	1,8	1,9
Kwas askorbinowy	2,5%	0	0	0	0
5%	0	0	0	0
7,5%	0	0	0	0
10%	0	0	0	0

PL 213 555 B1 cd. tablicy 7

Kwas maleinowy	2,5%	0	0	0	1,5
5%	0	0	1,5	1,7
7,5%	0	0	1,6	2,0
10%	0	0	2,3	2,9
Kwas jabłkowy	2,5%	0	1,4	1,4	1,6
5%	0	1,5	2,1	1,8
7,5%	0	1,65	2,3	2,3
10%	0	1,7	2,35	2,7
Kwas octowy	2,5%	0	0	1,3	1,5
5%	0	1,3	2,0	1,7
7,5%	0	1,8	2,4	2,5
10%	1,7	2,4	2,6	2,7

Nie przedstawiono tablicy dla azotynu srebra, gdyż nie obserwowano jakichkolwiek stref inhibowania dla któregokolwiek z kremów kwasowych zmieszanych z azotynem srebra. Na podstawie tych testów, okazuje się, że wszystkie badane mieszaniny, poza tymi z azotynem srebra lub kwasem askorbinowym, są skuteczne.

P r z y k ł a d 4

Działanie wodnych kwasowych preparatów - kremów - zmieszanych z roztworami azotynów na grzybnię A. niger

Postępowano według tej samej procedury jak przedstawionej w przykładzie 2, z tym wyjątkiem, że zamiast roztworów użyto wodnych kremów, stosując te same stężenia zarówno kwasów jak i azotynów. Wyniki przedstawiono w tablicach 8, 9 i 10.

T a b l i c a 8

Działanie kremów z azotynem sodu na grzybnię Aspergillus niger

	Azotyn sodu
		2,5%	5%	7,5%	10%
Kwas cytrynowy	2,5%	0	0	1,2	1,4
5%	0	1,2	1,4	3,1
7,5%	0	1,8	3,1	3,7
10%	0	2,4	3,4	4,6
Kwas askorbinowy	2,5%	0	0	0	0
5%	0	0	0	0
7,5%	0	0	0	0
10%	0	0	0	0
Kwas maleinowy	2,5%	0	0	1,2	1,6
5%	0	1,3	2,7	3,2
7,5%	0	1,9	4,1	4,4
10%	0	2,1	4,4	4,5
Kwas jabłkowy	2,5%	0	0	1,6	2,6
5%	0	1,2	3,1	3,5
7,5%	0	1,3	3,6	4,4
10%	0	1,65	4,3	5,2

PL 213 555 B1 cd. tablicy 8

Kwas octowy	2,5%	1,2	1,3	2,0	2,4
5%	2,0	2,1	2,7	3,2
7,5%	2,6	2,2	3,0	4,0
10%	2,4	3,0	3,7	4,7

T a b l i c a 9

Działanie kremów z azotynem potasu na grzybnię Aspergillus niger

	Azotyn potasu
		2,5%	5%	7,5%	10%
Kwas cytrynowy	2,5%	0	0	0	0
5%	0	1,5	1,7	2,2
7,5%	0	1,8	2,1	3,2
10%	1,5	2,8	3,4	3,8
Kwas askorbinowy	2,5%	0	0	0	0
5%	0	0	0	0
7,5%	0	0	0	0
10%	0	0	0	0
Kwas maleinowy	2,5%	0	0	0	0
5%	1,3	2,5	2,5	3,0
7,5%	1,5	3,0	3,2	3,2
10%	1,4	2,5	3,2	5,0
Kwas jabłkowy	2,5%	0	0	0	0
5%	1,3	2,1	2,4	2,8
7,5%	1,5	2,5	2,5	2,7
10%	1,8	2,2	2,7	3,5
Kwas octowy	2,5%	1,7	2,1	3,0	3,5
5%	2,3	3,5	3,7	4,0
7,5%	2,5	3,2	4,0	4,5
10%	2,5	4,0	4,5	4,6

T a b l i c a 10

Działanie kremów z azotynem srebra na grzybnię Aspergillus niger

	Azotyn srebra
		2,5%	5%	7,5%	10%
Kwas cytrynowy	2,5%	0	0	0	0
5%	0	0	0	0
7,5%	0	0	0	0
10%	0	0	0	0
Kwas askorbinowy	2,5%	0	0	0	0
5%	0	0	0	0
7,5%	0	0	0	0
10%	0	0	0	0

PL 213 555 B1 cd. tablicy 10

Kwas maleinowy	2,5%	0	0	0	0
5%	0	0	0	0
7,5%	0	0	0	0
10%	0	0	0	0
Kwas jabłkowy	2,5%	0	0	0	0
5%	0	0	0	0
7,5%	0	0	0	0
10%	0	0	0	0
Kwas octowy	2,5%	0	0	1,1	0
5%	0	0	1,8	1,2
7,5%	0	1,6	2,0	1,6
10%	1,2	2,0	2,5	2,5

Na podstawie tych wyników okazuje się, że wszystkie badane mieszaniny, poza większością tych z azotynem srebra lub kwasem askorbinowym, są skuteczne.

P r z y k ł a d 5

Ilości NO wytworzone przez mieszaniny kwasów i azotynów

Zgrubnie oszacowano ilości NO wytworzone przez każdy roztwór kwasu i azotynu z użyciem sondy WPI NO, tak jak podano w przykładzie 3. W każdym eksperymencie składnik azotynowy (50 μΙ) dodawano do roztworu kwasu.

Wstępnie sondę NO zanurzono w składniku kwasowym (10% roztwór w każdym eksperymencie). Sondę pozostawiono do zrównoważenia w kwasie, zanim dodano roztwór azotynu. Po ustaleniu linii podstawowej, aparat wyzerowano i dodano azotyn. Najpierw dodano najniższe stężenie, a kolejne dodawano, gdy krzywa zaczynała się spłaszczać. Uzyskany wykres zapewnia jedynie zgrubne wskazanie ilości wytworzonego NO, wartości w tym przypadku nie były mierzone. Przed każdym zbiorem odczytów, przygotowywano krzywą kalibracji przy wykorzystaniu standardowego postępowania sprecyzowanego przez WPI, aby umożliwić pewne niewielkie zmiany wykrywania NO w różnych temperaturach, zgodnie z sugestią WPI.

W przypadku azotynu sodu i azotynu potasu, roztwory 2,5, 5, 7,5 i 10% dodawano w różnych chwilach do każdego kwasu. Azotyn srebra jest bardzo źle rozpuszczalny i może być użyty tylko w bardzo małych stężeniach, a więc tylko roztwory 0,025, 0,05, 0,075 i 0,1% dodawano do kwasów.

Krzywe kalibracji i profile uwalniania NO wygenerowano dla wszystkich kwasów i azotynów. W przypadku azotynu sodu i azotynu potasu zmieszanych z kwasem askorbinowym, wokół magnetycznego elementu mieszającego i sondy NO tworzyły się bąbelki.

Wykonano pobieżne badanie w celu oszacowania względnych ilości NO2/NO3 w niektórych preparatach. Wykonano to tak, jak w przykładzie 3 dodając 1 ml 0,1M H2SO4 i 0,1M KI, jak tylko preparat wytwarzający NO osiągnął maksimum. 0,1M H2SO4 i 0,1M Kl przekształca NO2/NO3 w NO, który jest rejestrowany z użyciem sondy NO WPI. Uzyskano następujące wyniki:

• 10 ml kwasu cytrynowego (10%) + 50 μΙ NaNO2 (10%) wytwarza 4000 pA NO. Po dodaniu 0,1M H2SO4 i 0,1M Kl szczytowa wartość osiąga 20000 pA. Oszacowano, że następuje wytwarzanie NO w przybliżeniu w 20%, a NO2/NO3 w 80%.

• 10 ml kwasu cytrynowego (10%) + 50 μ Ι KNO2 (10%) wytwarza 2200 pA NO. Po dodaniu 0,1M H2SO4 i 0,1M Kl szczytowa wartość osiąga 10700 pA. Oszacowano, że następuje wytwarzanie NO w przybliżeniu w 20%, a NO2/NO3 w 80%.

• 10 ml kwasu askorbinowego (10%) + 50 μΙ AgNO2 (0,1%) wytwarza 5200 pA NO. Po dodaniu 0,1M H2SO4 i 0,1M Kl nie obserwowano zmiany piku. Oszacowano, że następuje wytwarzanie NO w przybliż eniu w 100%, bez NO2/NO3.

• 10 ml kwasu octowego (10%) + 50 μ Ι AgNO2 (0,1%) wytwarza 70 pA NO. Po dodaniu 0,1M H2SO4 i 0,1M Kl szczytowa wartość osiąga 2700 pA. Oszacowano, że następuje wytwarzanie NO w przybliż eniu w 3%, a NO2/NO3 w 97%.

PL 213 555 B1

Nieoczekiwanie zaobserwowano, że niezależnie od wyników z poprzednich przykładów, w których nie stwierdzono stref inhibowania dla mieszanin z użyciem kwasu askorbinowego, to zestawienia z wykorzystaniem kwasu askorbinowego wydawały się wytwarzać znaczące ilości NO. Jednakże kwas askorbinowy wytwarza niewiele lub wcale NO2/NO3 z azotynem sodu. Wszystkie pozostałe testowane kwasy wytwarzają większe ilości NO2/NO3 niż NO.

Warto również zaznaczyć, że profil NO dla kwasu jabłkowego-azotynu potasu i profil NO dla kwasu cytrynowego-azotynu potasu wykazuje słabą korelację pomiędzy ilościami wytworzonego NO i rozmiarami stref obserwowanymi w uprzednich przykładach. Te dwa kwasy wytwarzają bardzo podobne rozmiary stref, ale kwas jabłkowy wytwarza tylko trzecią część ilości NO, z azotynem sodu.

P r z y k ł a d 6

Ocena preparatu

Eudragity

Zbadano lakiery na bazie Eudragitu pod względem ich zdolności do zmieniania profilu uwalniania NO z preparatu. Na ogół polimetakrylany (Eudragity) są stosowane do doustnych preparatów tabletek/kapsułek jako środki powlekające filmu. Dobór różnych filmów może prowadzić do różnych szybkości uwalniania leku. Dostępne są różne Eudragity obejmujące: Eudragit E, Eudragit L i Eudragit

S. Eudragit E jest stosowany do tworzenia zwykłego izolującego filmu i rozpuszcza się w płynie żołądkowym poniżej pH 5. Eudragity L i S są stosowane jako środki do powłok dojelitowych i zarazem są odporne na płyn żołądkowy. Różne postacie Eudragitów L i S są rozpuszczalne przy różnych poziomach pH, na przykład Eudragit L100 rozpuszcza się przy pH > 6, a Eudragit S100 rozpuszcza się przy pH > 7. Eudragity można łączyć uzyskując różne charakterystyki uwalniania leku. Przeprowadzono badania na preparatach Eudragitowych zawierających zarówno kwas jak i azotyn pod względem wytwarzania gazu czynnego.

Eudragit L100 testowano w połączeniu z azotynem sodu i przedłużono uwalnianie NO z 5 do 25-30 minut (dane nie przedstawione). Preparowanie komponentu kwasowego w odwrotnym Eudragicie (E100) wydawało się nie mieć lub mieć bardzo mały wpływ na wytwarzanie NO. A zatem właściwym preparatem jest azotyn sodu w L100, z komponentem kwasowym znajdującym w zagęszczonym żelu.

P r z y k ł a d 7

Alternatywne preparaty żelowe

Dokonano oceny wizualnej zestawień azotynu i kwasu w preparatach z różnymi środkami żelującymi. Użyto następujące środki żelujące:

3% karboksymetyloceluloza (CMC);

3% metyloceluloza (MC);

3% karbopol 934;

3% żelatyna A;

3% żelatyna B;

20% glikol polietylenowy (PEG) 400;

20% PEG 600;

20% PEG 1000;

3% hydroksymetyloceluloza (HMC) oraz 3% alkohol poliwinylowy (PA).

Wszystkie żele preparowano z:

(i) 10% roztworem kwasu cytrynowego, i (ii) 10% roztworem azotynu sodu.

Przeprowadzono także ocenę wizualną i sprawdzenie pH (z użyciem papierka lakmusowego). Wyniki przedstawiono tablicach 11 i 12.

T a b l i c a 11

Żele z 10% azotynem sodu

Środek żelujący	pH	Charakterystyka
CMC	8	Powstaje gęsty, lekko żółty żel
MC	8	Wodnisty, o żółtej barwie, widoczny osad
Karbopol 934	9,5	Gęsty, lekko żółty, nieprzezroczysty żel

PL 213 555 B1 cd. tablicy 11

Żelatyna A	8,5	Klarowna pomarańczowa ciecz
Żelatyna B	8	Klarowna żółta ciecz
PEG 400	8,5	Lekko żółta klarowna ciecz
PEG 600	8,5	Lekko żółta klarowna ciecz
PEG1000	9	Lekko żółta klarowna ciecz
HMC	8,5	Gęsty, lekko żółty żel
PA	8	Lekko żółta ciecz, z osadem

Na podstawie tablicy 11 możne uznać, że CMC, HMC i karbopol tworzą trwałe żele w obecności 10% azotynu sodu.

T a b l i c a 12

Charakterystyki żeli z 10% kwasem cytrynowym

Środek żelujący	PH	Charakterystyka
CMC	2	Ruchliwa ciecz, nieprzezroczysta (bezbarwna)
MC	1	Ruchliwy żel, klarowny
Karbopol 934	1	Ruchliwy, nieprzezroczysty żel
Żelatyna A	2	Lekko żółta klarowna ciecz
Żelatyna B	2	Lekko żółta klarowna ciecz
PEG 400	1	Klarowna ciecz
PEG 600	1	Klarowna ciecz
PEG1000	2	Klarowna ciecz
HMC	1	Klarowny gęsty żel
PA	2	Klarowna ciecz

Na podstawie tablicy 12 możne uznać, że HMC, CMC i karbopol tworzą trwałe żele w obecności 10% kwasu cytrynowego.

Testy te dostarczają pewne wskazania wstępne. W szczególności, żelatyna jest korzystnym środkiem żelującym, i korzystne jest użycie jej w typowych zwiększonych ilościach, takich jak 20% do 40%, bardziej ogólnie 30%.

P r z y k ł a d 8

Działanie preparatów wytwarzających NO na T. rubrum

Metoda przedstawiona w przykładzie 2, z użyciem płytki przyściennej studzienkowej strefy inhibowania, została zaadaptowana do testowania czynności przeciw-dermatofitowej różnych preparatów wytwarzających NO. Przygotowano poniższe preparaty i dodano do studzienkowej płytki agarowej ze ściankami, uprzednio zaszczepionej T. rubrum:

• karbopol zawierający 10% kwas cytrynowy (50 μ!) zmieszany z Eudragitem L100 zawierającym 10% azotyn sodu (50 μΙ);

• CMC zawierająca 10% kwas cytrynowy (50 μΙ) zmieszana z CMC zawierającą 10% azotyn sodu (50 μΙ);

• wodny krem zawierający 10% kwas cytrynowy (50 μΙ) zmieszany z wodnym kremem zawierającym 10% azotyn sodu (50 μΙ);

• HMC zawierająca 10% kwas cytrynowy (50 μΙ) zmieszana z HMC zawierającą 10% azotyn sodu (50 μΙ);

• Eudragit E100 zawierający 10% kwas cytrynowy (50 μΙ) zmieszany z Eudragitem L100 zawierającym 10% azotyn sodu (50 μΙ);

• MC zawierająca 10% kwas cytrynowy (50 μΙ) zmieszana z Eudragitem L100 zawierającym 10% azotyn sodu (50 μΙ);

• 50 μΙ 10% kwasu cytrynowego zmieszanego z 10% azotynem sodu (50 μΙ);

PL 213 555 B1 • 50 μ Ι 10% kwasu cytrynowego zmieszanego Eudragitem L100 zawieraj ą cym 10% azotyn sodu (50 μΙ);

• pozytywna próba kontrolna (bez dodanego preparatu).

T a b l i c a 13

Wyniki - rozmiary stref po pięciu dniach

Preparat wytwarzający NO	Strefa inhibowania (cm)
10% kwas cytrynowy	10% azotyn sodu
Karbopol	L100	7,7
CMC	CMC	5,6
Wodny krem	Wodny krem	3,4
HMC	HMC	8,5
E100	L100	0
MC	L100	7,7
Roztwór	Roztwór	8,5
Roztwór	L100	8,5
Bez kwasu	Bez azotynu	0

Wyniki wykazują, że T. rubrum jest wysoce podatny na działanie preparatów, gdyż obserwuje się duże strefy śmiertelności.

P r z y k ł a d 9

Pomiary WPI wytwarzania NO z lakierów/środków żelujących

Przygotowano eksperyment w celu zbadania długości czasu uwalniania NO z preparatów wytwarzających NO. Po umieszczeniu preparatu bezpośrednio na powierzchni filtra o porach 0,2 μm w celce Franz'a następuje ługowanie preparatu przez filtr, z reakcją następującą w dolnym zbiorniczku celki Franz'a. Odpowiednio, krążki antybiotykowe zaimpregnowano azotynem sodu - komponentem preparatu wytwarzającego NO, krążek umieszczono w górnej komorze celki Franz'a, na wierzchu membrany, a następnie odpipetowano równoważną objętość komponenta-kwasu cytrynowego na zaimpregnowany krążek. Ilość wytworzonego NO monitorowano z użyciem sondy No WPI. Eksperyment zestawiono tak, jak przedstawiono na fig. 2

Oceniano trzy preparaty:

• 10% kwas cytrynowy w karbopolu 934 z 10% azotynem sodu w Eudragicie L100;

• 10% kwas cytrynowy w HMC z 10% azotynem sodu w Eudragicie L100;

• 10% kwas cytrynowy w roztworze z 10% azotynem sodu w roztworze. Wyniki przedstawiono na fig. 3., która przedstawia wytwarzanie NO w zależności od czasu, dla wybranych środków żelujących zawierających azotyny i kwasy. Preparaty wytwarzające NO z karbopolem i L100 osiągały szczytową wartość 50000 pA, która przekracza limit detekcji miernika WPI. Jednakże, można dostrzec na wykresie, że ten preparat uwalnia NO z szybkością w zasadzie ustaloną i zgodną przez 23 minuty, po których eksperyment przerwano. Dla porównania, wytwarzanie NO przez roztwory zaczyna ulegać spowolnieniu znacznie wcześniej, i jest prawdopodobne, że większość wytworzonego NO bąbelkuje z roztworu i jest uwalniania do atmosfery. Podobne zależności obserwowano dla próbki z HMC. Dowodzi to, że taki sposób przygotowania preparatu może być wykorzystany do uzyskania różnych profili uwalniania NO.

P r z y k ł a d 10

Preparaty do testów

Preparaty wymienione w tablicy 14 badano pod względem strefy inhibowania, profili uwalnia NO i uwalniania NO2/NO3.

Stężenia komponentów wymienionych w tablicy 14 są stężeniami (% wag./wag. w wodzie dejonizowanej) przed zmieszaniem.

PL 213 555 B1

T a b l i c a 14

Próbka nr	Preparaty zawierające 10% azotyn sodu (% wag./wag.)	Preparaty zawierające 10% kwas cytrynowy (% wag./wag.)
1	Karboksymetyloceluloza (CMC) (3%)	+	Karbopol (3%)
2	CMC (3%)	+	Hydroksymetyloceluloza (HMC) (3%)
3	CMC (3%)	+	Metyloceluloza (MC) (3%)
4	CMC (3%)	+	CMC (3%)
5	CMC (3%)	+	Roztwór (DW)
6	L100 (Eudragit) (5%)	+	Karbopol (3%)
7	L100 (5%)	+	HMC (3%)
8	L100 (5%)	+	MC (3%)
9	L100 (5%)	+	CMC (3%)
10	L100 (5%)	+	Roztwór (DW)
11	Hydroksymetyloceluloza (HMC) (3%)	+	Karbopol (3%)
12	HMC (3%)	+	HMC (3%)
13	HMC (3%)	+	MC (3%)
14	HMC (3%)	+	CMC (3%)
15	HMC (3%)	+	Roztwór (DW)
16	Roztwór (destylowana woda (DW))	+	Karbopol (3%)
17	Roztwór (DW)	+	HMC (3%)
18	Roztwór (DW)	+	MC (3%)
19	Roztwór (DW)	+	CMC (3%)
20	Roztwór (DW)	+	Roztwór (DW)
21	Krem (50% wodny krem rozpuszczony w DW)	+	Krem (50% wodny krem rozpuszczony w DW)
22	Roztwór (DW)	+	1M askorbinian sodu
23	Roztwór (DW)	+	1M kwaśny siarczyn sodu (SHS)

Zestawienia z tablicy 15 oceniano tylko pod względem strefy inhibowania.

T a b l i c a 15

Próbka nr	Preparaty (% wag./wag.)
24	kwas cytrynowy (20%) + kwas askorbinowy (20%)	+	azotyn sodu (20%)
25	kwas cytrynowy (20%) + kwas askorbinowy (16%)	+	azotyn sodu (20%)
26	kwas cytrynowy (20%) + kwas askorbinowy (12%)	+	azotyn sodu (20%)
27	kwas cytrynowy (20%) + kwas askorbinowy (8%)	+	azotyn sodu (20%)
28	kwas cytrynowy (20%) + kwas askorbinowy (4%)	+	azotyn sodu (20%)
29	kwas cytrynowy (16%) + kwas askorbinowy (20%)	+	azotyn sodu (20%)
30	kwas cytrynowy (12%) + kwas askorbinowy (20%)	+	azotyn sodu (20%)
31	kwas cytrynowy (8%) + kwas askorbinowy (20%)	+	azotyn sodu (20%)
32	kwas cytrynowy (4%) + kwas askorbinowy (20%)	+	azotyn sodu (20%)
33	kwas cytrynowy (20%) + 1M Na2S2O4	+	azotyn sodu (20%)
34	kwas cytrynowy (20%) + 1M askorbinian sodu	+	azotyn sodu (20%)
35*	kwas cytrynowy (20%) + 1M Na2S2O4
36*	kwas cytrynowy (20%) + 1M askorbinian sodu
37**	DW

PL 213 555 B1

Indywidualne komponenty dotyczą stężeń początkowych (% wag./wag. w wodzie dejonizowanej (DW)) przed zmieszaniem.

* oraz ** oznacza, odpowiednio, pozytywne i negatywne próby kontrolne.

Strefy inhibowania oceniano również dla alternatywnego reagenta redukującego, α-tokoferolu.

Zestawienia do oceny z użyciem tego środka przedstawiono w tablicy 16. Dołączono dla porównania również preparaty zawierające zestawienia azotynu sodu i kwasu cytrynowego albo z kwasem askorbinowym (próbka nr 24), z Na2S2O4 (próbka nr 33) albo z askorbinianem sodu (próbka nr 34).

T a b l i c a 16

Próbka nr	Preparat (% wag./wag.)
38	9 g DW + 1 g kwasu cytrynowego + 50 pl α-tokoferolu	+	azotyn sodu (20%)
39	4 g DW + 1 g kwasu cytrynowego + 5 g etanolu + 50 pl α-tokoferolu	+	azotyn sodu (20%)
40*	DW	+	DW

Wymienione indywidualne komponenty dotyczą stężeń początkowych (% wag./wag.) przed zmieszaniem.

* oznacza negatywną próbę kontrolną.

P r z y k ł a d 11

A) Strefy inhibowania

Fig. 4, 5 i 6 przedstawiają wpływ preparatów z przykładu 10 na strefę inhibowania. Bez wątpienia można wywnioskować, że nie ma istotnych różnic co do obserwowanej strefy inhibowania dla większości badanych preparatów, aczkolwiek próbka nr 32 (niskie stężenie kwasu cytrynowego z wysokim stężeniem kwasu askorbinowego) i próbka nr 39 (α-tokoferol preparowany w etanolu) wykazują niższą czynność od innych preparatów. Jednakże, inne preparaty zawierające zestawienia o wysokim stężeniu (20%) kwasu askorbinowego (próbki 24-31) nie wykazują istotnego ograniczenia czynności grzyba, na co wskazuje oznaczenie strefy inhibowania.

Fig. 4 pokazuje strefy inhibowania dla preparatów w roztworze i żelowych wymienionych w tablicy 14.

Fig. 5 pokazuje strefy inhibowania preparatów badanych w obecności środków redukujących wymienionych w tablicy 15.

Fig. 6 pokazuje strefy inhibowania preparatów badanych w obecności α-tokoferolu i innych środków redukujących wymienionych w tablicy 16.

B) Uwalnianie NO oraz NO2/NO3

Dane uzyskane w aparatu WPI co do ilości wytworzonego NO kwantyfikowano w jednostkach pA. Przygotowano krzywą kalibracji celem wyliczenia stężenia uwolnionego NO (dane nie przedstawione). Ogólnie, uzyskane profile wykazują, że preparaty w roztworze szybciej uwalniają NO niż preparaty żelowe. Spośród preparatów roztworowych, próbka nr 20 (roztwór azotynu sodu i kwasu cytrynowego) wykazuje wysokie uwalnianie NO w najkrótszym czasie. Jednakże zestawienia preparatów roztworowych zawierających roztwór azotynu sodu i kwasu cytrynowego w karbopolu (próbka nr 16) i CMC (próbka nr 19) okazują się wytwarzać największe ilości NO przez wydłużony czas. Najniższa ilość uwalnianego NO na ogół cechuje preparat na bazie CMC.

Fig. 7 przedstawia przeciętne maksymalne stężenia NO i NO2/NO3 wytworzone przez różne badane preparaty. Spośród badanych żelowych preparatów, preparaty CMC okazały się wytwarzać niższe stężenia NO w porównaniu z pozostałymi preparatami żelowymi (L100, HMC i karbopol). Przeciętne szczytowe stężenia NO wytworzone w funkcji czasu przez różne badane preparaty przedstawiono na fig. 8.

Za wyjątkiem próbki nr 19 (która zawierała CMC), dane dowodzą, że roztwory (próbki nr 5, 10, 16-20) znacznie szybciej osiągają szczytowe stężenia NO w porównaniu z preparatami żelowymi.

P r z y k ł a d 12

Przenikanie NO przez ludzki paznokieć godzin, 10% roztwory

Zastosowano zestaw przedstawiony na fig. 11. W T_o jedną dawkę 100 μl 10% azotynu sodu i 100 pl 10% kwasu cytrynowego odpipetowano na powierzchnię kawałka ludzkiego paznokcia umieszczonego w paznokciowej celce Franz'a (powierzchnia ekspozycji 0,1963 cm²). Ilość NO, która przeniknęła przez paznokieć, monitorowano z użyciem detektora NO WPI przez 18 godzin. Wyniki przedstawiono na fig. 9.

PL 213 555 B1 godzin, 5% roztwory

Zastosowano zestaw przedstawiony na fig. 11. W T0 jedną dawkę 100 μΙ 5% azotynu sodu i 100 μ! 5% kwasu cytrynowego odpipetowano na powierzchnię kawałka ludzkiego paznokcia umieszczonego w paznokciowej celce Franz'a (powierzchnia ekspozycji 0,1963 cm²). Ilość NO, która przeniknęła przez paznokieć, monitorowano z użyciem detektora NO WPI przez okres 18 godzin. Wyniki przedstawiono na fig. 10.

Negatywna próba kontrolna

Negatywna próba kontrolna obejmowała 200 μ! dejonizowanej wody odpipetowanej na powierzchnię kawałka ludzkiego paznokcia umieszczonego w paznokciowej celce Franz'a, z wykorzystaniem tych samych warunków, jak dla procedur z roztworami 10% i 5%.

Jak można zauważyć na rysunku, 10% roztwory dostarczają niewątpliwie początkowo mniej NO. Jednakże po 4 godzinach (różne eksperymenty dają różny czas zwłoki, dane przedstawione), zwiększa się nagle ilość NO, która jest następnie utrzymywana na wysokim poziomie przez okres 10 godzin. 5% roztwory wytwarzają pozytywne poziomy NO, ale nieco niższe niż preparaty 10%. Negatywna próba kontrolna nigdy nie odchyla się od linii podstawowej, po początkowym pochyleniu na wstępie eksperymentu (dane nie przedstawione).

P r z y k ł a d 13

Pomiar NO przenikającego przez ludzki paznokieć z użyciem 10% kwasu askorbinowego i 10% azotynu sodu

W pierwszej części eksperymentu zestawiono dwuramienną paznokciową celkę Franz'a według fig. 11, ale z użyciem kawałka membrany przepuszczalnej dla gazu zamiast ludzkiego paznokcia. Zestaw pozostawiono na 40 minut przed dodaniem preparatu. Od góry celki Franz'a dodano 100 μ! 10% roztworu kwasu askorbinowego i 100 μΙ 10% azotynu sodu, jak w przykładzie 12, a następnie od góry przykryto celkę Franz'a parafilmem.

Ilość NO wytworzona w trakcie tego eksperymentu przekroczyła granice wykrywania detektora NO i wykres wywędrował poza skalę (10 μΜ) już po jednej godzinie. Nie obserwowano początkowego obniżenia piku. Ilość wytworzonego NO była w przybliżeniu 20 razy wyższa niż obserwowana dla kwasu cytrynowego (10%) i azotynu sodu (10%).

Eksperyment następnie powtórzono, tym razem używając kawałka ludzkiego paznokcia. Następnie 100 μ! 10% kwasu askorbinowego i 100 μ! 10% azotynu sodu naniesiono bezpośrednio na górną powierzchnię paznokcia i wymieszano. Komórkę Franz'a przykryto parafilmem i ilość NO przechodzącego przez paznokieć monitorowano z użyciem miernika WPI. Wyniki przedstawiono na fig. 12.

Obniżenie piku wydaje się być standardowym artefaktem w eksperymentach z użyciem !udzkiego paznokcia i preparatów wytwarzających NO. Zwiększenie piku w następstwie spadku było bardzo nagłe, bez stopniowej zmiany, z jednego do drugiego.

Na podstawie fig. 12 można dostrzec, że aczko!wiek mieszaniny z kwasem askorbinowym mogą zapewniać przedłużone uwa!nianie NO przez paznokieć, to poziomy są 10X niższe aniże!i przy użyciu kwasu cytrynowego.

P r z y k ł a d 14

Biooznaczenie w paznokciowej ce!ce Franz'a przenikania gazu przeciwgrzybiczego przez !udzki paznokieć

Ce!ki Franz'a zestawiono tak, jak pokazano na fig. 13, przy czym do!ną część napełniono stopionym dekstrozowym agarem Sabouraud'a do 8 mm poniżej otworu wy!otowego. Po ochłodzeniu i stężeniu agaru, odpipetowano 25 μ! zawiesiny zarodników A. niger na powierzchnię agaru, wycinek !udzkiego paznokcia dopasowano w trybie gazoszcze!nym powyżej otworu wy!otowego i umocowano zaciskiem. Ce!ki następnie inkubowano w 32°C przez 4 godziny do otrzymania dywanu grzybni.

Po rozwinięciu się grzybni, ce!ki wyjęto z inkubatora i 0,1 m! kwasu cytrynowego oraz 0,1 m! azotynu sodu odpipetowano do !ejka ce!ki Franz'a i wymieszano końcem pipety. Do negatywnych prób kontro!nych dodano a!bo 0,2 m! roztwór 10% azotynu sodu a!bo 0,2 m! 10% kwasu cytrynowego. Wierzch !ejka we wszystkich ce!kach Franz'a przykryto parafi!mem. Ce!ki pozostawiono w temperaturze pokojowej. Po okresie 2 godz. i 10 min., usunięto roztwory z każdej ce!ki Franz'a, zastąpiono równoważnym roztworem, i proces powtarzano przez każde ko!ejne 2 godz. i 10 min. w dwóch ko!ejnych nanoszeniach, co dało w sumie 4 nanoszenia. Po ostatnim naniesieniu roztworu ce!ki pozostawiono przykryte w temperaturze pokojowej, aby umoż!iwić powo!ny rozwój organizmu przez 24 godziny.

Po 24 godzinach, we wszystkich sześciu ce!kach z mieszaninami kwasu cytrynowego i azotynu sodu, występuje centra!ny region ko!onii A. niger tuż przy paznokciu/preparacie, który został uśmierPL 213 555 B1 cony przez gaz czynny. Dowodzi tego efekt halo, gdzie obszar uśmierconej, białej grzybni był otoczony przez pierścień czarnej, zarodnikującej grzybni. Po kolejnych 24 godzinach, A. niger zdrowiał, odrastając ze skrajnie zewnętrznego obszaru, który nie został uśmiercony, w kierunku do środka.

Wszystkie celki, z azotynem sodu albo z kwasem cytrynowym, wykazywały pełny dywan wzrostu grzybni, która tworzyła zarodniki, czego dowodziło stałe, czarne koło.

Wynik ten jasno dowodzi zdolności preparatów stosowanych według wynalazku do generowania skutecznego komponentu gazowego w paznokciu. Definitywnie wykazano, że gaz czynny przenika przez cały ludzki paznokieć palca u nogi i bezpośrednio wpływa na rozwój A. niger. Ponadto preparat penetruje paznokieć i wpływa na rozwój organizmu na przestrzeni dodatkowych 8 mm, przy czym separacja in vivo jest rzeczywiście pomijalna. Próba kontrolna potwierdza, że występuje gaz czynny, który powoduje efekt halo.

P r z y k ł a d 15

Zestawy

Wytworzono zestaw zawierający dwa wodne preparaty żelowe. Preparaty miały następujące składy:

A. Żel azotynu sodu (2 ml):
azotyn sodu	6,6%;
hydroksymetyloceluloza	10,0%;
poliwinylopirolidon	5,0%;
glikol polietylenowy	20,0%;
alkohol benzylowy	1,0%;
barwnik	0,005%;
woda	do 100%.
B. Żel kwasu cytrynowego:
kwas cytrynowy	10,0%;
karbopol	5,0%;
poliwinylopirolidon	5,0%;
glikol polietylenowy	30,0%;
metyloparaben	0,2%;
propyloparaben	0,02%;
woda	do 100%;
barwnik	0,005%.
Preparaty A i B dostarczono osobno w zamykanych tubkach (z zamknięciem do wielokrotnego

użytku) do wyciskania, do mieszania ze sobą bezpośrednio przed naniesieniem na paznokieć lub na samym paznokciu.

Claims (14)

1. Zastosowanie komponentów generujących tlenek azotu do wytwarzania leku do leczenia lub profilaktyki infekcji grzybiczych podpaznokciowych, które to komponenty stanowią azotyn, wybrany z grupy obejmującej azotyny metali alkalicznych i azotyny metali ziem alkalicznych, oraz kwas organiczny wybrany spośród kwasu cytrynowego, kwasu jabłkowego, kwasu maleinowego, kwasu octowego w ilości wystarczającej, aby finalna kompozycja miała pH 5,5 lub niższe, przy czym każdy z komponentów przed użyciem jest umieszczony osobno.

2. Zastosowanie według zastrz. 1, w którym azotyn stanowi azotynu sodu.

3. Zastosowanie według zastrz. 1, w którym stosuje się kwas cytrynowy i azotyn sodu, przy czym co najmniej jeden znajduje się w wodnym nośniku.

4. Zastosowanie według zastrz. 1, w którym infekcją grzybiczą podpaznokciową jest grzybica paznokci.

5. Zastosowanie według zastrz. 1 albo 3, albo 4, w którym komponent azotynowy preparuje się z zaróbką wybraną spośród Eudragitów, karbopolu, karboksymetylocelulozy, hydroksymetylocelulozy i ich mieszanin.

PL 213 555 B1

6. Zastosowanie według zastrz. 1, w którym komponent kwasowy preparuje się z zaróbką wybraną spośród karbopolu, karboksymetylocelulozy, hydroksymetylocelulozy, metylocelulozy i ich mieszanin.

7. Zastosowanie według zastrz. 1 albo 3, w którym kwas i azotyn są umieszczone osobno w wodnych preparatach.

8. Zastosowanie według zastrz. 7, w którym każdy z preparatów ma postać osobno wybraną spośród żeli, kremów, płynów, maści i farb nadających się do zmieszania ze sobą.

9. Zastosowanie według zastrz. 1, w którym kwas i azotyn, każdy osobno, preparuje się jako żel, farbę lub lakier.

10. Zastosowanie według zastrz. 1, w którym kwas i azotyn, każdy osobno, preparuje się jako ciecz lub żel, które po zmieszaniu zestalają się lub tworzą żel lub farbę.

11. Zastosowanie według zastrz. 1, w którym azotyn stanowi 0,5 do 30% wagowych finalnej kompozycji.

12. Zastosowanie według zastrz. 11, w którym azotyn stanowi 5 do 15% wagowych finalnej kompozycji.

13. Zastosowanie według zastrz. 1, w którym kwas stanowi 5 do 30% wagowych finalnej kompozycji.

14. Zastosowanie według zastrz. 13, w którym kwas stanowi 10 do 15% wagowych finalnej kompozycji.