CN1564681A - 用no对指甲感染的治疗 - Google Patents

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Abstract

氮氧化物产生的组合物可用于指趾甲下感染的治疗，因为意外地发现NO能穿透指甲发挥抗真菌的作用。

Description

用NO对指甲感染的治疗
本发明涉及治疗手和脚指(趾)甲感染的方法，用于这种治疗的药物以及这种药物的制备方法。
指甲感染是常见的，严重的时候很痛苦并有损外貌，影响患者的生活质量。与指甲感染有关的真菌主要是指那些由脚趾缝蔓延到指甲引起足癣(或皮癣菌病)的真菌。指甲的真菌感染称为甲癣，也称作甲真菌病、皮霉菌性甲癣或指甲“癣菌病”。
在甲癣中分离到的最常见的病原体是皮肤真菌，特别是红色发癣菌(脚趾甲56％，手指甲36％)和须疮癣菌(脚趾甲19％，手指甲11％)。酵母菌感染较少常见但其通常同白色念珠菌相关联(脚趾甲10％，手指甲30％)。
估计40～60岁的人中至少15～20％有甲癣，超过60岁的人中25～40％患有此病，但低于18岁的只有3％或更少的患有此病。但是很难对甲癣的实际发病作出精确的估算，因为至少有50％的患者没有寻求医生诊视。
轻度甲癣的症状可能只限于在指甲表面上的白斑或小凹陷，但更常见的疾病，其症状包括甲床过度角化，指甲增厚、褪色及甲松离(甲板与甲床分离)。
许多因素使患者易感染甲癣，包括糖尿病、年龄的增长、多汗症(hyperhydrosis)、甲脱离、外伤、外周循环不良、免疫抑制。此病在男性中更常见，且在青春期和绝经前的女性中很少见。
甲癣是一种真菌病，并且适合真菌生长的环境有利于甲癣的生长。相应地，80％的情况发生在脚上，特别是拇指或大脚趾并其通常同如穿紧鞋，出汉过多相联系，例如在运动中可能常遇见此情形。但是，外伤也是一个主要的病原因素，特别是在脚趾甲中，最长的脚趾特别地敏感。
并不完全确定甲癣是如何感染上的，但知道其具有传染性。感染可能来自从皮肤到指甲的真菌的蔓延或直接来自其他人的皮肤或指甲感染。在脚趾甲感染的情况下，运动员的脚菌可能蔓延到指甲里，指甲外伤经常发生，因而使真菌得以进入。
尽管甲癣是很流行的，但此病对局部药物有较强的耐药性，因而对该病的治疗受到了限制。局部的药物治疗包括罗每乐(阿莫罗芬)和Penlac(环吡酮)，但由于穿过指甲的渗透性差，且抗病原体的活性差，使其治愈率低(＜10％)，并且治疗时间长(长达12个月)。
治疗甲癣和其它指甲感染的一个特有问题在于此感染通常位于或接近甲床及指甲本身，因而损毁的指甲使得感染免受外来的攻击。治疗可包括除去指甲，使感染的组织暴露出来，尽管除去太多的指甲是不受欢迎的。另外，治疗期通常长达一年或更久。
更最近，已开发出口服治疗(特比萘芬和伊曲康唑)并获得了更高的治愈率(～70％)和更短的治疗期(12～16周)。但是对于这些较新的口服疗法却存在安全顾虑，包括肝脏毒性，严重的皮肤反应及药物交互作用。
因此，需要一种治愈率相似或更优于口服疗法且安全顾虑少的局部的或透指甲的疗法。
意外地，我们发现氮氧化物能穿透指甲并对指(趾)甲下感染的病原体的治疗有效。
因而，在第一方面，本发明提供了一种用于治疗指(趾)甲下感染的氮氧化物生成组合物。
氧化氮(NO)是本发明组合物的一个主要产物，并已知其具有抗菌和创伤愈合的效果[c.f.WO 95/22335，和Hardwick等，(2001)，Clin.Sci.，100，395～400]。
氧化氮在体里在血管内皮组织以及神经元中及活化的巨噬细胞中被合成。在汗液中可以观察到相对较高浓度的NO。尽管对于NO如何杀死微生物体没有精确的认识，但推测NO破坏细菌的DNA，或干扰含有过渡金属的细菌酶的功能。
用于治疗用途的氧化氮，最方便的制备方法是通过亚硝酸盐与酸，特别是无机亚硝酸盐和有机酸反应得到。反应所产生的亚硝酸的分子形式易分解为一分子的水和一分子的三氧化二氮，后者进一步分解形成NO和二氧化氮。反应如下所示：
                       
                       
                       
尽管N2O3在本反应中是一个中间体，但有证据表明其可独立存在，并且其对由本发明组合物所产生的杀菌效果至少具有部分作用。
在还原剂如抗坏血酸存在下，由三氧化二氮形成NO的反应更有效，并可由例如下面的反应来代表
          
例如通过酸在亚硝酸盐上的作用，特别是在生成的盐不溶的情况下，适合亚硝酸的生成。
应当意识到，本发明可使用任何适当的氮氧化物源，优选可提供至少NO级分的氮氧化物源，一般优选根据一个或更多上述反应产生氮氧化物的氮氧化物源。
适合提供氮氧化物的任何组合物均可作为本发明的组合物。在一个实施方案中，由本发明的组合物所生成的NO的比例优选至少50％，更优选至少80％。若还原酸为唯一使用的酸，则所产生的氮氧化物中的NO的含量可升至100％。
“产生氮氧化物”是指本发明的组合物用于在原位释放氮氧化物，即在其使用的部位，通常是在感染的指甲上。在一个实施方案中，其最简单的形式，可包括溶有气态NO的软膏或凝胶或，甚至其它任何适当的局部载体，如一旦将其应用到指甲上时可释放出NO。
如果只需要很少量的氮氧化物即可获得效果，那么只要有足够的氮氧化物可到达作用部位起到灭菌和抑制的效果，就不会介意在指甲表面以外是否有气体的逃逸，或是否只有少量的氮氧化物穿过指甲真正地渗透进去，或氮氧化物的量在穿过指甲的过程中是否会减少。
尽管NO及其前体一般是短寿命成分，半衰期短至数秒，但我们已证实其可足量地穿过人的指甲来治疗指(趾)甲下的感染。更令人意想不到的是，不仅证实NO或其它氮氧化物穿过指甲到达那里可能需要数小时，而且一旦NO/其它氮氧化物开始释放，则此释放可以持续达10小时，甚至更长时间。因此抛开理论的限制，似乎指甲充当贮器或池，并吸附或吸收NO或前体。NO或前体穿过指甲，并在其另一面释放NO和其它的氮氧化物。考虑到此气体的半衰期很短，可能的情况是其与蛋白质在指甲中络合并缓慢地扩散通过。
尽管已知NO有抗真菌的效果，但并不清楚NO是否必须穿过指甲，可能是当前体一旦穿过指甲时，NO是唯一的再生物质。事实上，在本发明中，产生大量NO的组合物不必有最好的效果。抛开理论的限制，在指甲表面有效而快速地产生NO可能是不利的，因为NO的半衰期很短，可能不能足量地穿过指甲。相反地，需更长时间产生NO的组合物在穿过指甲传递灭菌成分方面显得更有效，不论此成分是NO或其它的氮氧化物。
基本上只包括抗坏血酸或其它相似的还原酸及亚硝酸盐的本发明组合物易于快速产生大量的NO。尽管指甲有一定程度上的渗透性，但如果NO产生太快，则可能没有足够的时间使指甲吸收大量的生成NO，并且实验显示这些组合物与更低的穿过指甲的NO总体流量相联系。
在酸存在下，亚硝酸银易于产生NO，但效率相对较低，所以通常不被优选。然而例如在灭真菌的实验中，发现亚硝酸钠和亚硝酸钾可与乙酸、柠檬酸、马来酸和苹果酸反应生成抑制区。
当亚硝酸钠和亚硝酸钾同乙酸、柠檬酸、马来酸和苹果酸相结合时，发现杀死真菌菌丝体的水平是相似的，都产生大量的抑制区。同样的，发现用孢子所进行的实验，对于相同的酸-亚硝酸盐混合物显示出相似的抗真菌效果。通常发现溶液比乳膏可产生更强的抗真菌活性，同时发现，菌丝体比孢子对抗真菌效果更敏感。然而，通常乳膏生成氮氧化物的时间更长，当为了提高穿过指甲的渗透性，希望能延长NO或其它的氮氧化物在指甲表面上的生成时间，这成为乳膏的一个优点。
由酸-亚硝酸盐混合物生成的NO量不一定与抑制区大小必然地相关，但在一般情况下，与所产生的氮氧化物总量有关。例如，在一些实验中，可产生大量NO的抗坏血酸-亚硝酸盐溶液只有很弱的抗真菌的活性，而亚硝酸钾和苹果酸的混合物只产生大约为柠檬酸一半量的NO，但其抑制区大小没有必然地变小。
氮氧化物从指甲另一侧的延时释放是特别有益的，因为通常需要与活性物质至少要接触5分钟才能产生杀菌作用。在同活性气体接触后大约30分钟，可观察到杀菌高峰，但暴露于活性气体后，抗真菌的活性通常持续直到2小时。
氮氧化物产生的组合物可为任何适当的形式。然而，应当理解到，氮氧化物的产生是活泼的，那么通常需要将反应物彼此分开直到氮氧化物被真正地需要。尽管其一般为优选的，但不必总使用。例如，可用凝胶或基质构成一个封闭的贴片，并向其中加入可产生氮氧化物的成分，然后用一个合适的带子将贴片保护起来防止气体散发。
在此贴片中，优选基质或凝胶是有粘性的，并且其粘合强度足够克服氮氧化物脱离和推开带子的任何倾向，但应当意识到此粘性强度应使带子能很好的去除以使用此贴片。另外，为了延长NO的寿命或减小其产生速度，优选在凝胶或基质中含适当的稳定剂，如螯合剂。另外，因为NO更易溶于非水和脂类物质，在治疗中加入这些物质可延缓NO的活性以及将NO给药到感染指甲和甲床的速度。
然而，已包含有游离NO的组合物通常不能稳定任意长的时间，并且优选在制备后应尽快让患者使用。
更优选以多个部分的形式提供本发明的组合物。这些部分可各自分别地包括活性物或反应物，当将其混合时，用于产生氮氧化物。因此，第一种组合物可包括装在合适载体中的适合亚硝酸盐。第二种组合物可包括适合的酸。然后将两种组合物混合，优选充分地混合，并然后将其施于感染的指甲上，或可在原位混合。尽管通常希望将必须混合的组分数目降低到最小以获得最终氮氧化物产生的组合物，但应当意识到任何数目都是可以的。特别是，例如可优选提供包含有还原酸的三个组分。然而，当还原酸，如抗坏血酸被使用，那么通常优选将其以其本身作为酸使用或者提供将其连同主要酸(primary acid)一起在与亚硝酸盐相分开的组合物中。
可将亚硝酸盐组分加入到一系列的赋形剂中，包括，例如，聚甲基丙烯酸树脂L100、聚羧乙烯、羧甲基纤维素或羟甲纤维素，并将酸组分加入到另一种适合的赋形剂中，如聚羧乙烯、羧甲基纤维素、羟甲纤维素、甲基纤维素或加入到水性基质中。其它的赋形剂，如聚乙烯醇、丙二醇、聚乙烯吡咯酮(聚维酮)、明胶、瓜尔胶和虫胶已用于帮助形成薄膜，其对在原位维持组合物是很有用的。
特别是，适于将物质引入皮肤和角质层的组合物可能通常不适用于指甲，因为指甲实际上是亲水性物质，而角质层通常为疏水的。因而，易溶于水的离子和可离子化的物质在指甲中优选被吸收，并且优选可促进此吸收的赋形剂。
通常优选使用含水的碱性制剂来帮助渗透。此制剂可为流动的溶液，但似乎NO和/或其它的氮氧化物与指甲接触最短时间是最佳的，因此通常优选氮氧化物的产生不要完成的太快，以便可有充足的时间在指甲表面吸收，并通常优选的制剂形式为凝胶、乳膏、外用洗液、软膏，或其它的浓稠形式，如漆状物(lacquers)。可使用如上描述的赋形剂来实现适当的增稠和其它的特性。例如，已证实使用聚甲基丙烯酸树脂能改变氮氧化物从制剂中的释放特性。
在优选的实施方案中，组合物包括分隔开的有机酸和亚硝酸盐水性制剂。更优选地，每个制剂采取适合彼此混合的凝胶、乳膏、外用洗液、软膏或涂布剂的形式。特别优选一或两个制剂都包含有适于在混合时延缓氮氧化物释放的赋形剂。对于亚硝酸盐，优选的赋形剂是聚甲基丙烯酸树脂，如聚甲基丙烯酸树脂L100。对于两者优选的其它赋形剂如上文所列举。
被选的赋形剂可简单地为了延缓氧化物的释放，但通常也应有增稠的性质，此赋形剂的用量通常由为了提供适当的凝胶所需量来确定，其可在已知的范围内变化，本领域普通技术人员很容易的确定和认可此范围。然而，作为指导，适合量为约1％～40％，尽管不同的赋形剂有很大的区别。通常，优选地赋形剂只需使用2％～10％的量，如3％～5％，然而那些主要用作胶凝作用的赋形剂，不论是结合还是单独使用，其使用量应适于实现此目的。例如，用量为约10％～50％w/v的聚乙二醇适于用作粘合剂，但更优选约20％～35％w/v。适合的增稠剂包括聚羧乙烯和纤维素衍生物，并根据所需制剂的性质，其用量一般为约2％～10％。一种优选制剂为流动性凝胶。
可以理解发明的组合物可包括所需的其它组分，如抗氧化剂、防腐剂、着色剂和香料以及表面活性剂和/或渗透剂，尽管不需这些附加的组分，含水的亚硝酸盐和酸的组分即可提供穿过指甲的氮氧化物。
尽管本发明这里就这两种组分混合最终得到氮氧化物产生组合物方面进行了举例说明，但是应当理解，当提及这些组分时，除非显而易见或明确指出，其包括多于两种初始组分。
本发明的组合物可包括用于混合的任何适当的载体。重要的是酸和亚硝酸盐，或亚硝酸盐前体，其可按此方式反应产生需要的氮氧化物。因此，提供最终组合物的初始组分中至少有一种应优选包含有含水组分，以便让产生氮氧化物的反应发生。更优选地，两种初始组分都应包含有含水组分以有利于成分的混合，其中希望组分应缓慢反应，一或两种组分中的含水量应最小化。
对能够混合得到最终组合物的初始组分的类型没有限制，只要此最终组合物可用于产生氮氧化物。在此方面，应当理解全文所提及的“氮氧化物”包括100％的NO，尽管不是必需或优选的。
例如，此初始组分可是任何适当的形式，如液体、凝胶或固体，尽管当一种是固体，那么另一种优选为液体或凝胶。液体的分类包括溶液、悬液和胶体，并且这种情况也适用于凝胶，其通常包括液体和固体之间的任何状态。
更详细地说，凝胶根据其性质，可包括如乳膏、软膏、酊剂、蜡状物和洗剂这些状态，尽管后者可能属于液体。应当理解到，只要这种液体凝胶固体可用作活性物的载体，并没有特别的排除。
固体载体可包括例如贴片中的基质或更长链的蜡。
初始组分物应在使用前或在原位适当地被混合，用来提供可产生氮氧化物的最终组合物。例如，此混合物可直接是凝胶/凝胶混合物，将其用于指甲并留在原位。它们也可包括两种液体，在它们之间，形成凝胶、漆状物、固体或涂漆，同样的，还可包括两种凝胶，或一种液体和一种凝胶，其可固化，形成漆状物，或另外形成一种对氮氧化物的产生、保持和分散起保护的环境。
在一个优选实施方案中，将凝胶用于指甲，然后将含有基质的贴片如膏药用于凝胶上，此基质含有其它活性物，一旦接触，活性物质之间缓慢地相互作用产生氮氧化物。
在另一个优选实施方案中，活性物质可以涂布剂(paints)或漆状物的形式进行分散。合适地，一种组分如亚硝酸盐可被应用，然后将其干燥，并在上面涂上第二层。第二层中的水可使反应进行。尽管本发明的一个优点是不必使用此种溶剂和渗透增强剂，但是如果需要，可以使用快速干燥的溶剂，如乙醇或乙酸酯。然而可优选将薄膜的组分提供于彼此分离的制剂中，以便使得聚合反应例如在混合时能够发生。在一个制剂可含有某种催化剂，而在另一个中可含有一种可聚合的单体。可选择地，在制剂中，溶剂的挥发可使聚合物成凝胶状或进一步硬化。
本发明组合物的氮氧化物产生阶段通常经2或3小时或通常更少的时间而减弱，但是指甲下沉效果使为指甲的另一侧提供氮氧化物所用的时间更长，并通常直到氧化物的产生有效地停止。在氧化物产生过程中，优选将组合物在原地混合，其可通过组合物装置来实现。可供选择地，例如优选使用封闭的敷药来保护指甲。
在另一个优选实施方案中，贴片的基质，或膏药，为非水的但具有亲水性，并含有基本干燥形式的活性物的混合物。在这种情况下，术语“干燥形式”可包括例如含有结晶水的晶体。因而，尽管两种活性物质都在贴片或膏药的基质中，但在没有适量的水来充当溶剂来提供反应环境的情况下，它们不会发生反应。当想要使用贴片或膏药时，可除去保护性的带子并向基质中加入适量的水如几滴来活化活性成分。可将此活化的贴片应用于指甲上使氮氧化物产生来发挥效果。
这种提供基本上干燥的组合物并向其中加入水的方法也可用于其它的组合物。在这种情况下，应当理解术语“干燥”指游离水含量相关，所以尽管此组合物可为凝胶，例如，其水含量却很低，如1％，或更低。优选此组合物基本上无水。
本发明组合物的活性成分可以任何适当的量存在，此点对于本领域普通技术人员是显而易见的。通常，优选亚硝酸盐的量约为最终组合物重量的0.5～30％。更优选地，亚硝酸盐或其前体的量为1～20％，特别地1～15％，优选地5～15％。优选范围为1～10％，或2～10％。通常优选更高的浓度，并优选最低浓度为8～10％。在乳膏、外用洗液和凝胶中，其上限为约13.5％，尽管在适当的制剂中可能允许更高的水平。
通常优选本发明的组合物提供为两种含水凝胶、外用洗液或乳膏。更优选，一种含有柠檬酸其浓度为0.5％～20％，如0.75％、2.25％、4.5％、9％和13.5％w/w，另一种含有上文所述的亚硝酸钠，例如，0.5％、1.5％、3.0％、6％和9％w/w。优选每种活性组分的浓度范围为10％内，这样提供一种适当过量的酸。也优选两种活性组分的浓度至少在2％，优选5％w/w或更高，以便可提供有效剂量的氮氧化物穿过指甲。在一个优选实施方案中，此酸的含量为13.5％并且亚硝酸盐的量为9％，但在另一个优选实施方案中，每个组分的含量为10％。优选的酸为柠檬酸，而优选的亚硝酸盐为亚硝酸钠。
凝胶、外用洗液或乳膏可被患者以任何适当的量混合并例如敷在脚或手指甲的感染部位。每种凝胶、外用洗液或乳膏的适合量可为0.05～1g，更优选0.1～0.5g，其组分反应产生氮氧化物。
相对亚硝酸盐或其前体，优选酸的含量至少为化学计算量。更优选地，酸的含量为化学计算过量，确保有足够的酸可为亚硝酸盐提供酸性环境以产生氮氧化物。尽管将全部的亚硝酸盐生成氮氧化物并不是必须的，但有太多的亚硝酸盐没有反应通常是低效的，优选将大多数的亚硝酸盐转化为氮氧化物。
通常，优选酸的含量为足够量使得最终组合物的pH为5或更低，特别是pH为4或更低。然而，氮氧化物产生反应可在更高的pH下发生，并且pH为5.5或甚至为6可被可接受的，特别是在有过量的还原酸存在下，从而应当理解为最终组合物的pH并不是本发明的重要部分。
对于亚硝酸盐，除了其通常为药用外没有其它的限制。甚至此种需求也不是主要的考虑，因为此最终组合物通常用于患者的指甲上，使得皮肤接触为最小的，因此相应地使可能全身接触降低到最小。然而，为了安全考虑，优选使用亚硝酸盐或其前体，其通常对于局部用药是安全的。
为了简单起见，亚硝酸盐的性质通常为无机的并至少可部分溶于水。优选碱金属亚硝酸盐和碱土金属亚硝酸盐，尽管其它适合的亚硝酸盐，如过渡金属化合物也可被用，只要适合特别是溶解性合适。特别是，可以及使用钠、钾、镁和钡化合物，从价格和可得性方面考虑，通常优选钠和钾化合物。
合适的酸化剂包括无机酸，但由于其通常不可药用，一般不被优选。因而，更优选有机酸，特别是那些适于同水形成溶液并产生pH为4或更低的有机酸。这类酸包括甲酸、苹果酸、马来酸、乙酸、乳酸、柠檬酸、苯甲酸、酒石酸和水杨酸，应当理解此名单包含性的，而非排他性。其它适合的酸包括不必形成酸溶液的抗坏血酸和抗坏血酸棕榈酸盐，但其为还原酸，可增加NO的产生量，并且一旦NO产生，其也可用于稳定NO。应当意识到在此所指的酸包括所提及的适于提供酸性水溶液的酸的任意形式，只与水混合或与优选在生理上可接受的脱保护剂混合的形式，其可能在混合前最初存在于亚硝酸盐溶液或制剂中。适合形式的例子包括含酸的水合式或无水的形式，如柠檬酸一水合物和其无水的形式。
由于还原酸有利的性质，在实施方案中，当形成最终组合物时，除了主要酸外，优选提供一种还原酸。其适当的比例约为主要酸的5％～200％，以及更优选约5％～150％，特别是主要酸的5～40％，更特别地为10～20％。
应当理解，按照下面的实施例，特别是其中有机体为红色发癣菌的情况，本发明涉及可为任何可产生抑制区的组合物。
本发明也提供治疗指(趾)甲下感染的方法，其中在文中所描述的组合物以有效的量施用于感染的指甲。
本发明也提供氮氧化物产生的组合物在药物制备方面的用途，此药物用于治疗和预防指(趾)甲下感染。
应当意识到，本发明包括含有在文中所定义组分的试剂盒。特别是，在优选实施方案中，本发明提供了包含亚硝酸盐的含水制剂和有机酸的含水制剂的试剂盒，彼此分开放置，这两种制剂每一种均适合应用于被治疗的指甲，使得亚硝酸盐和酸可反应放出氮氧化物来渗透进入指甲。此制剂优选如文中所表述的浓度和/或形式，特别是外用洗液、凝胶、乳膏或漆状物，并适合以在可再次密封的容器中提供，以使得每个试剂盒可提供多剂或多次施用。
本发明的组合物可用来治疗任何形式的指(趾)甲下感染。然而通常优选治疗甲癣。
适合的治疗期通常由一般的医生即可容易地确定。然而通常，优选应继续治疗直到实现真正的痊愈或完全的临床治愈。在前一种情况中，病原体被杀死了，但指甲可能还很难看，因为手指甲要6个月的时间才能长出来，而脚趾甲要长达一年的时间。当感染的指甲不再有感染的迹象时即实现临床治愈，因其取决于长出的指甲，因而同真正的痊愈相比可能要用明显更长的时间。
通常优选继续治疗为至少两个月，更优选三个月，特别是3～6个月。事实上，我们的试验表明病原体在开始治疗的几天内即有可能被杀死，所以治疗一周可能是足够的，特别是例如，若一天使用二或三次该组合物。三个月的治疗方案对于实现治愈将足够了，也可使得患者能观察到健康的指甲长出来。然而，应当理解到只要需要例如直到获得临床的治愈，此治疗可一直继续下去，其可能长达14个月或更长，使得指甲痊愈并生长。
使用的组合物的剂量和数量可由下列参数来确定，如患者的年龄和体重，但更具体地，可由指甲的尺寸而定，如受体的厚度和面积来决定，并且这些可由一般的医生很容易地确定。本发明的优点在于只需少量的氮氧化物即可产生效果，所以不必要求对于不同的患者要有不同的处方，并且一种制剂可用于所有的患者。然而，可使用不同的强度，如较高强度的氧化物产生制剂用于在脚趾中的持久状况，如较低强度的制剂用于手指甲。此强度不必与生成的氧化物量相关，但可能与由给定的组合物产生氧化物的时间长短有同等地关系。
施用发明的组合物可一天2次或更多次，优选一天2～3次，其构成了发明的优选实施方案。此优选方案可当先前的药效逐渐减弱的时候，有效地提供在指甲的感染侧的氮氧化物浓度的提高。可选择的剂量应能保持氮氧化物穿过指甲传输的连续性，或如所需的间断性。
本发明的组合物可由任意适合的方法制备得到。当组合物包括有含水组分的时候，那么通常优选将活性组分溶于水，或含水的制剂中，然后将活性组分彼此分开直到需要的时候。在主要的活性组分溶解后通常加入任何赋形剂。可制备基本无水的干燥制剂，当需要活化组合物时加入水。
当最终组合物包含有液体或凝胶的时候，其可通过任何适当的方法来施用，包括手工混合。其它的方法可包括双管(double barrelled)注射器或双驱动分配器(dual actuated dispenser)，如由手指或压舌板(spatula)或其它任何适当的方法来实现最终混合。
应当理解下面的实施例对本发明范围是非限制性的。这些实施例参考附图进行举例说明，其中：
图1图解说明用于测定抑制区的实验；
图2显示测定从本发明组合物中释放的氮氧化物的Franz传感器(cell)装置；
图3表示从含有亚硝酸盐和酸的胶凝剂中的NO生成量相对于时间的关系；
图4表示对于某些溶液和凝胶状制剂的抑制区；
图5表示在还原剂存在下所试验的制剂的抑制区；
图6表示在α-维生素E和其它的还原剂存在下所试验的制剂的抑制区；
图7表示由不同制剂所产生的NO和NO2/NO3的浓度平均峰值；
图8表示由不同的试验制剂所产生的NO达到最高产量的平均时间；
图9表示由10％酸和10％亚硝酸盐溶液所产生的NO在18小时期间穿过指甲的量；
图10表示由5％酸和5％亚硝酸盐溶液所产生的NO在18小时期间穿过指甲的量；
图11表示用于测定图9和10中穿过指甲的NO量的装置；
图12表示由10％抗坏血酸和10％亚硝酸盐溶液所产生的NO在18小时期间穿过指甲的量，以及
图13表示用于测定应用于人指甲的本发明组合物所得到的抑制区的Franz传感器装置。
方法例1
用于筛选气体产生制剂的体外分析模型
测定不同乳膏和溶液的杀伤区的方法如图1所示。图示说明显示了试验的构成。将2mL的Eppendorf管的盖嵌入到Sabouraud葡萄糖琼脂层中，并在琼脂的表面涂上一层黑曲霉孢子。使用黑曲霉孢子，因为已知其与菌丝体相比对抗菌活性有更强的抗性。然后将此凹面培养得到菌丝体，或直接被用来测试发明的混合物杀孢子的能力。将本发明的混合物放在Eppendorf盖中并用移液器的底部搅拌10次。这些测试板这里也指抑制板的有壁孔区。每个制剂测试三次。
该方法提供了很好的结果，因为产生NO的混合物不与琼脂相接触，并且对照表明空孔穴不会抑制生长。此种测定法也是很灵敏的。
所用的对照如下：
i)只含有Sabouraud葡萄糖琼脂的空Eppendorf；
ii)在Eppendorf盖中的0.1ml亚硝酸钠(10％)；
iii)在Eppendorf盖中的0.1ml柠檬酸(13.5％)；
iv)在Eppendorf盖中的0.1ml亚硝酸钠(9％)；和
v)在Eppendorf盖中的0.1ml柠檬酸(10％)。
在任一个对照中都没有看到生长的抑制。
方法例2
指示有机体
同甲癣相关的皮肤癣菌是生长缓慢的生物体，在Sabouraud葡萄糖琼脂板上于25℃培养最少5天才能生成完整的培养层。这在活性制剂筛选中的限制性因素，因为至少要用一周的时间才能得到一组结果。因此，尽管一些组合物的效果由红色发癣菌来确定，但通常决定使用快速生长的指示有机体来分析制剂的效果。可选择的生物体为真菌、黑曲霉素，经常用于监测美容和局部制剂防腐和杀菌效果的生物体。
黑曲霉素用作同甲癣相关的皮肤癣菌的指示生物体，并在真菌孢子和菌丝体上进行测试。若使用菌丝体，杀伤区可由真菌孢子的发展(黑/棕)缺失来确定，白色区表示成长抑制。在真菌孢子板上，生长抑制由菌丝体的发展缺失(白色/乳酪色)来确定，所以只能看到琼脂。
方法例3
NO的检测
所生成的NO可用WPI法(World Precision Instruments，Inc.)NO检测器来测定。当用此种检测器时，NO的测定需在有水环境中实现，并且此实验适于满足此要求。这些设备也可通过添加化学药品和将本方法进行较小的改动来监测NO2/NO3的生成量。
在室温下，将Franz传感器组装起来放在磁力搅拌器上，在装有去离子水的较低的接受体中含有磁子，其可确保气体分散渗透薄膜。1/2英寸(13mm)的圆滤纸片中浸渍有NO产生制剂中的亚硝酸钠组分。将此浸渍的圆片放在薄膜上Franz传感器的上层隔室中，之后移取等量的柠檬酸组分放到上面。NO的产生量用WPI NO检测器来监测。实验如图2所示被安装。
当所测的NO的浓度到达平台时，将含有亚硝酸钠和柠檬酸混合物的圆片移开，并向接受体隔室中加入0.1ml的0.1MH2SO4+0.1M KI溶液，并用WPI探测器测定(通过转化)的NO2/NO3量。
实施例1
亚硝酸盐溶液混合的酸性制剂对黑曲霉孢子的效果
所选的酸为：柠檬酸、乙酸、抗坏血酸、马来酸和苹果酸。所选的亚硝酸盐为钠、钾和银盐。
使用方法例1中所描述的建立的测定装置。文中所有涉及杀伤区的实施例都使用方法例1中的装置，除非另外指出。
用蒸馏水配制下面的酸溶液(w/v)：
1)柠檬酸2.5％
2)柠檬酸5％
3)柠檬酸7.5％
4)柠檬酸10％
5)抗坏血酸2.5％
6)抗坏血酸5％
7)抗坏血酸7.5％
8)抗坏血酸10％
9)马来酸2.5％
10)马来酸5％
11)马来酸7.5％
12)马来酸10％
13)苹果酸2.5％
14)苹果酸5％
15)苹果酸7.5％
16)苹果酸10％
17)乙酸2.5％
18)乙酸5％
19)乙酸7.5％
20)乙酸10％
将Eppendorf微量管的盖子移开，灭菌并通过将盖子放在培养皿中并在其周围倾倒25ml琼脂的方法将Eppendorf微量管的盖子移到Sabouraud葡萄糖琼脂板中。将琼脂固定并然后用黑曲霉素来接种。上文所指的每个溶液用2.5、5、7.5和10％钠/钾/银亚硝酸盐溶液混合，通过将精确量的0.1ml的每种溶液加入到微管的盖子中并慢慢地旋转板来进行混合。对于上文所列的酸溶液用分开板进行并在32℃培养。在24小时后测定每块板的生长抑制区。结果如下表1和2所示。
                                    表1
                        亚硝酸钠抑制区结果-黑曲霉孢子
                  亚硝酸钠
    2.5％     5％     7.5％     10％
柠檬酸     2.5％     2.2     3.0     2.9     2.8
    5％     2.8     3.6     3.9     3.9
    7.5％     2.9     3.7     4.5     4.6
    10％     3.0     4.1     4.4     5.4
抗坏血酸     2.5％     0     0     0     0
    5％     0     0     0     0
    7.5％     0     0     0     0
    10％     0     0     0     0
马来酸     2.5％     2.5     2.6     3.9     3.0
    5％     3.0     3.2     3.7     3.1
    7.5％     3.4     3.9     4.6     4.9
    10％     3.1     4.4     5.1     5.8
苹果酸     2.5％     2.4     2.9     3.8     3.6
    5％     2.9     3.4     3.8     4.2
    7.5％     2.9     3.8     4.6     4.3
    10％     3.2     4.2     5.8     5.1
乙酸     2.5％     2.5     2.7     3.4     3.6
    5％     2.8     3.3     4.0     4.0
    7.5％     2.6     3.5     4.1     4.1
    10％     3.4     3.6     4.4     5.2
                                   表2
                    亚硝酸钾抑制区结果-黑曲霉孢子
                    亚硝酸钾
    2.5％     5％     7.5％     10％
柠檬酸     2.5％     0     0     0     1.5
    5％     0     1.5     1.8     2.8
    7.5％     0     1.7     2.1     3.4
    10％     0     2.2     3.2     3.8
抗坏血酸     2.5％     0     0     0     0
    5％     0     0     0     0
    7.5％     0     0     0     0
    10％     0     0     0     0
马来酸     2.5％     0     1.3     1.5     1.4
    5％     0     2.5     3.0     2.5
    7.5％     0     2.5     3.2     3.2
    10％     0     3.0     3.2     5.0
苹果酸     2.5％     0     1.3     1.5     1.8
    5％     0     2.1     2.5     2.2
    7.5％     0     2.4     2.5     2.7
    10％     0     2.8     2.7     3.5
乙酸     2.5％     1.7     2.3     2.5     2.5
    5％     2.1     3.5     3.2     4.0
    7.5％     3.0     3.7     4.0     4.5
    10％     3.5     4.0     4.5     4.6
表格中没有显示亚硝酸银的结果，因为对任何被试验的酸，其与亚硝酸银反应没有观察到抑制区。
某些抗坏血酸混合物混合时会膨胀以至于在凹孔上形成半球形隆起，偶尔在将板向培养箱转移的过程中会导致少量溢出到琼脂上，其可产生抑制区。在无溢出物存在下，用抗坏血酸溶液没有观察到抑制区。其它的酸没有任何溢出或膨胀的迹象。这些测试表明除了那些含有亚硝酸银或抗坏血酸的混合物外，所有被测的混合物都是有效的。
实施例2
用亚硝酸盐混合的酸制剂对黑曲霉菌丝体的作用
酸溶液按实施例1中所描述的方法制备。在加入气体产生制剂前，将板在32℃培养过夜以得到完全的生长膜。然后如实施例1中所描述地方法将溶液加入到凹孔中。将板在32℃再培养24小时。，当孢子生成区(黑)和非孢子生成区(白/淡黄)形成的时候测定生长抑制区。结果如表3、4和5所示。
                                    表3
                    亚硝酸钠抑制区结果-黑曲霉菌丝体
                    亚硝酸钠
    2.5％     5％     7.5％     10％
柠檬酸     2.5％     3.0     0     0     0
    5％     2.8     1.2     1.8     2.4
    7.5％     3.2     1.4     3.1     3.4
    10％     3.4     3.1     3.7     4.6
抗坏血酸     2.5％     0     0     0     0
    5％     0(2)     0     0(2.1)     0(2.5)
    7.5％     0(2.5)     0(3.4)     0(2.5)     0
    10％     0(2.0)     0(1.9)     0(3.0)     0(3.9)
马来酸     2.5％     3.4     3.5     3.4     3.0
    5％     3.9     4.4     4.6     4.4
    7.5％     4.0     5.0     4.8     6.0
    10％     4.2     5.4     6.2     8.0
苹果酸     2.5％     3.5     3.7     3.3     3.1
    5％     3.7     4.2     4.1     4.1
    7.5％     3.5     5.0     4.9     6.0
    10％     3.7     5.6     5.0     6.4
乙酸     2.5％     2.6     3.8     3.7     3.3
    5％     3.0     3.6     3.6     4.0
    7.5％     3.0     4.3     4.1     4.4
    10％     3.6     4.5     4.7     6.2
                                      表4
                      亚硝酸钾抑制区结果-黑曲霉菌丝体
                  亚硝酸钾
    2.5％     5％     7.5％     10％
柠檬酸     2.5％     2.7     3.1     3.2     3.5
    5％     3.1     3.9     4.2     5.0
    7.5％     3.6     3.9     4.2     5.4
    10％     3.7     3.9     5.3     6.2
抗坏血酸     2.5％     0     0     0     0
    5％     0(1.5)     0     0(2.0)     0(2.4)
    7.5％     0(3.1)     0(2.5)     0     0(3.1)
    10％     0(2.0)     0(2.4)     0(3.0)     0(3.2)
马来酸     2.5％     3.5     3.5     3.4     3.5
    5％     3.8     3.8     5.0     5.0
    7.5％     4.1     3.9     6.5     7.8
    10％     4.5     4.3     8.0     9.0
苹果酸     2.5％     3.4     3.9     3.8     3.4
    5％     3.7     4.0     5.2     5.0
    7.5％     3.8     4.4     5.4     5.8
    10％     4.2     5.0     6.3     6.4
乙酸     2.5％     2.7     2.8     3.4     3.6
    5％     3.4     3.0     4.2     4.4
    7.5％     3.6     3.7     4.3     4.7
    10％     4.4     4.9     4.6     5.1
                                 表5
                 亚硝酸银抑制区结果-黑曲霉菌丝体
               亚硝酸银
    0.025％     0.05％     0.075％     0.10％
柠檬酸     2.5％     0     0     0     0
    5％     0     0     0     0
    7.5％     0     0     0     0
    10％     0     0     0     0
抗坏血酸     2.5％     0     0     0     0
    5％     0     0     0     0
    7.5％     0     0     0     0
    10％     0     0     0     0
马来酸     2.5％     0     0     0     0
    5％     0     0     0     0
    7.5％     0     0     0     0
    10％     0     0     0     0
苹果酸     2.5％     0     0     0     0
    5％     0     0     0     0
    7.5％     0     0     0     0
    10％     0     0     0     0
乙酸     2.5％     0     0     0     1.1
    5％     0     0     0     1.2
    7.5％     0     0     0     1.2
    10％     0     0     0     1.3
这些测试结果表明，除了那些大多数含有亚硝酸银或抗坏血酸的混合物外，所有被测的混合物都是有效的。
实施例3
用亚硝酸盐溶液混合的酸性含水乳膏制剂对黑曲霉孢子的效果
除了用含水乳膏代替溶液外，遵循实施例1中所描述的相同的方法，使用相同浓度酸和亚硝酸盐。结果如表6和7所示。
                                表6
                亚硝酸钠乳膏对黑曲霉孢子上影响
                 亚硝酸钠
    2.5％     5％     7.5％     10％
柠檬酸     2.5％     0     0     0     0
    5％     0     0     0     1.5
    7.5％     0     0     1.6     2.3
    10％     0     0     1.7     2.9
抗坏血酸     2.5％     0     0     0     0
    5％     0     0     0     0
    7.5％     0     0     0     0
    10％     0     0     0     0
马来酸     2.5％     0     0     0     0
    5％     0     0     0     1.6
    7.5％     0     0     1.7     2.2
    10％     0     0     1.9     2.5
苹果酸     2.5％     0     0     0     0
    5％     0     0     1.2     2.0
    7.5％     0     0     1.6     2.4
    10％     0     0     1.7     2.7
乙酸     2.5％     0     0     0     0
    5％     0     0     0     1.7
    7.5％     0     0     1.7     2.3
    10％     0     0     2.2     2.8
                                   表7
                   亚硝酸钾乳膏对黑曲霉孢子的影响
                   亚硝酸钾
    2.5％     5％     7.5％     10％
柠檬酸     2.5％     0     0     0     0
    5％     0     0     1.6     1.7
    7.5％     0     1.7     1.65     1.8
    10％     0     1.8     1.8     1.9
抗坏血酸     2.5％     0     0     0     0
    5％     0     0     0     0
    7.5％     0     0     0     0
    10％     0     0     0     0
马来酸     2.5％     0     0     0     1.5
    5％     0     0     1.5     1.7
    7.5％     0     0     1.6     2.0
    10％     0     0     2.3     2.9
苹果酸     2.5％     0     1.4     1.4     1.6
    5％     0     1.5     2.1     1.8
    7.5％     0     1.65     2.3     2.3
    10％     0     1.7     2.35     2.7
乙酸     2.5％     0     0     1.3     1.5
    5％     0     1.3     2.0     1.7
    7.5％     0     1.8     2.4     2.5
    10％     1.7     2.4     2.6     2.7
表格中没有显示亚硝酸银的结果，因为对任何被试验的酸，其与亚硝酸银反应没有观察到抑制区。这些测试表明除了那些含有亚硝酸银或抗坏血酸的混合物外，所有被测的混合物都是有效的。
实施例4
用亚硝酸盐溶液混合的酸性含水乳膏制剂对黑曲霉菌丝体的影响
除了用含水乳膏代替溶液外，遵循实施例2中所描述的相同的方法，使用相同浓度酸和亚硝酸盐。结果如表8、9和10所示。
                                表8
               亚硝酸钠乳膏对黑曲霉菌丝体的影响
                   亚硝酸钠
    2.5％     5％     7.5％     10％
柠檬酸     2.5％     0     0     1.2     1.4
    5％     0     1.2     1.4     3.1
    7.5％     0     1.8     3.1     3.7
    10％     0     2.4     3.4     4.6
抗坏血酸     2.5％     0     0     0     0
    5％     0     0     0     0
    7.5％     0     0     0     0
    10％     0     0     0     0
马来酸     2.5％     0     0     1.2     1.6
    5％     0     1.3     2.7     3.2
    7.5％     0     1.9     4.1     4.4
    10％     0     2.1     4.4     4.5
苹果酸     2.5％     0     0     1.6     2.6
    5％     0     1.2     3.1     3.5
    7.5％     0     1.3     3.6     4.4
    10％     0     1.65     4.3     5.2
乙酸     2.5％     1.2     1.3     2.0     2.4
    5％     2.0     2.1     2.7     3.2
    7.5％     2.6     2.2     3.0     4.0
    10％     2.4     3.0     3.7     4.7
                                 表9
                亚硝酸钾乳膏对黑曲霉菌丝体的影响
                 亚硝酸钾
    2.5％     5％     7.5％     10％
柠檬酸     2.5％     0     0     0     0
    5％     0     1.5     1.7     2.2
    7.5％     0     1.8     2.1     3.2
    10％     1.5     2.8     3.4     3.8
抗坏血酸     2.5％     0     0     0     0
    5％     0     0     0     0
    7.5％     0     0     0     0
    10％     0     0     0     0
马来酸     2.5％     0     0     0     0
    5％     1.3     2.5     2.5     3.0
    7.5％     1.5     3.0     3.2     3.2
    10％     1.4     2.5     3.2     5.0
苹果酸     2.5％     0     0     0     0
    5％     1.3     2.1     2.4     2.8
    7.5％     1.5     2.5     2.5     2.7
    10％     1.8     2.2     2.7     3.5
乙酸     2.5％     1.7     2.1     3.0     3.5
    5％     2.3     3.5     3.7     4.0
    7.5％     2.5     3.2     4.0     4.5
    10％     2.5     4.0     4.5     4.6
                              表10
               亚硝酸银乳膏对黑曲霉菌丝体的影响
                  亚硝酸银
    2.5％     5％     7.5％     10％
柠檬酸     2.5％     0     0     0     0
    5％     0     0     0     0
    7.5％     0     0     0     0
    10％     0     0     0     0
抗坏血酸     2.5％     0     0     0     0
    5％     0     0     0     0
    7.5％     0     0     0     0
    10％     0     0     0     0
马来酸     2.5％     0     0     0     0
    5％     0     0     0     0
    7.5％     0     0     0     0
    10％     0     0     0     0
苹果酸     2.5％     0     0     0     0
    5％     0     0     0     0
    7.5％     0     0     0     0
    10％     0     0     0     0
乙酸     2.5％     0     0     1.1     0
    5％     0     0     1.8     1.2
    7.5％     0     1.6     2.0     1.6
    10％     1.2     2.0     2.5     2.5
这些测试表明除了那些大多数含有亚硝酸银或抗坏血酸的混合物外，所有被测的混合物都是有效的。
实施例5
由酸和亚硝酸盐混合物所产生的NO量
用WPI NO检测器来计算每种酸和亚硝酸盐溶液所产生的NO量的粗略估计，如方法实施例3中所描述。在每个试验里，将亚硝酸盐组分(50μl)加入到10ml酸溶液中。
首先将NO探测器浸入到酸组分(每个实验中的10％的溶液)中。在加入亚硝酸盐以前，将此检测器留酸中平衡。当基线形成时，将仪器调零，并加入亚硝酸盐。先加入最低浓度的，当曲线开始变平时再加入随后的添加物。所产生的曲线只能提供生成的NO量的粗略估计，在此情况下不能测定其值。在每套读数之前在使用利用WPI的详细标准方案，作出校准曲线，可供在不同温度下NO检测过程中的任何细微的变化之用，如由WPI所建议的。
对于亚硝酸钠和亚硝酸钾，将2.5、5、7.5和10％浓度的溶液在不同点加入到每种酸中。亚硝酸银较难溶，只有使用很低浓度，所以只将0.025、0.05、0.075和0.1％浓度的溶液加入到酸中。
得到所有酸和亚硝酸盐的校准曲线和NO释放曲线。对于同抗坏血酸相混合的亚硝酸钠和亚硝酸钾，其在磁子和NO检测器附近有气泡产生。
对某些制剂，可用下述简单研究来估计NO2/NO3相对量。其可通过上述方法例3中所描述的，即当NO产生制剂达到最大值时，通过加入1ml的0.1M H2SO4和0.1M KI。0.1MH2SO4和0.1M KI将NO2/NO3转化为NO，后者可用WPI NO检测器来记录。得到的结果为：
●10ml柠檬酸(10％)+50μl NaNO2(10％)生成4000pA的NO。
加入0.1MH2SO4和0.1M KI后，峰值达到20000pA。可以估计出约有20％的NO及80％的NO2/NO3。
●10ml柠檬酸(10％)+50μl KNO2(10％)生成2200pA的NO。
加入0.1MH2SO4和0.1M KI后，峰值达到10700pA。可以估计出约有20％的NO及80％的NO2/NO3。
●10ml抗坏血酸(10％)+50μl AgNO2(0.1％)生成5200pA的NO。
加入0.1MH2SO4和0.1M KI后，没有观察到峰值的改变。可以估计出约有100％的NO，没有NO2/NO3。
●10ml乙酸(10％)+50μl AgNO2(0.1％)生成70pA的NO。
加入0.1MH2SO4和0.1M KI后，峰值达到2700pA。可以估计出约有3％的NO及97％的NO2/NO3。
意外地注意到，即使前面实施例的结果，确定使用抗坏血酸的混合物没有产生抑制区，但使用抗坏血酸的组合可产生相当量的NO。然而，抗坏血酸同亚硝酸银一起却产生很少或不产生NO2/NO3。被测试的所有其它酸，产生的NO2/NO量都比NO量大。
同样值得注意地，苹果酸-亚硝酸钾NO产生曲线及柠檬酸-亚硝酸钾NO产生曲线显示出NO产生量和前面实施例中所见的区域大小两者之间几乎没有相关性。这两种酸产生非常相似的区域大小，但苹果酸同亚硝酸钠一起只产生约三分之一量的NO。
实施例6
制剂评价
聚甲基丙烯酸树脂
考察了聚甲基丙烯酸树脂漆状物改变制剂的NO释放的能力。通常，聚甲基丙烯酸酯(Eudragit)被用于口服药片/胶囊制剂的薄膜包衣剂。选择不同的薄膜可产生不同的药物释放速率。可用的不同的聚甲基丙烯酸树脂包括：聚甲基丙烯酸树脂E、聚甲基丙烯酸树脂L和聚甲基丙烯酸树脂S。聚甲基丙烯酸树脂E被用作简单地绝热薄膜形成物，并可在pH低于5时溶于胃液中。聚甲基丙烯酸树脂L和S用作肠溶衣剂，对胃液具有抗性。不同形式的聚甲基丙烯酸树脂L和S可溶于不同的pH，例如聚甲基丙烯酸树脂L100溶于pH大于6的溶液，聚甲基丙烯酸树脂S100溶于pH大于7的溶液。可将聚甲基丙烯酸树脂组合起来获得不同的药物释放特性。考察了含有酸和亚硝酸盐的聚甲基丙烯酸树脂制剂的活性气体产生。
测试表明组合亚硝酸钠的聚甲基丙烯酸树脂L100将NO的释放时间从5分钟延长到25～30分钟(数据没有显示)。将酸组分配制在聚甲基丙烯酸树脂(E100)中，对延缓NO的生成具有很少的或没有效果。因而，适合的制剂为将亚硝酸钠配制在L100中，大量的酸存在于凝胶中。
实施例7
替代性的凝胶制剂
视觉考察了酸及亚硝酸盐组合的不同胶凝剂制剂中情况。所用的胶凝剂如下：
3％羧甲基纤维素(CMC)；
3％甲基纤维素(MC)；
3％聚羧乙烯934；
3％明胶A；
3％明胶B；
20％聚乙二醇(PEG)400；
20％PEG 600；
20％PEG 1000；
3％羟甲纤维素(HMC)；和
3％聚乙烯醇(PA)。
所有的凝胶都由下面两种溶液来制备：
(i)10％柠檬酸溶液，以及
(ii)10％亚硝酸钠溶液。
进行了视觉判定和pH检测(用石蕊试纸)。结果如表11和12所示。
                            表11
                    10％亚硝酸钠凝胶
胶凝剂         pH         性状
CMC            8          形成浓的淡黄色凝胶
MC             8          水状、黄色，可见沉淀物
聚羧乙烯934    9.5        浓的淡黄色不透明凝胶
明胶A          8.5        橙色透明液体
明胶B          8          黄色透明液体
PEG400         8.5        淡黄色透明液体
PEG600         8.5        淡黄色透明液体
PEG1000        9          淡黄色透明液体
HMC            8.5        浓的淡黄色凝胶
PA             8          淡黄色液体，有沉淀物
从表11中可以看出CMC、HMC和聚羧乙烯，在10％亚硝酸钠存在下都形成稳定的凝胶。
                             表12
                    10％柠檬酸凝胶的特性
胶凝剂         pH          性状
CMC            2           流动性凝胶，不透明(无色)
MC             1           流动性凝胶，透明
聚羧乙烯934    1           流动性凝胶，不透明
明胶A          2           淡黄色透明液体
明胶B          2           淡黄色透明液体
PEG400         1           透明液体
PEG600         1           透明液体
PEG1000        2           透明液体
HMC            1           透明的浓凝胶
PA             2           透明液体
从表12中可以看出HMC、CMC、MC和聚羧乙烯，在10％柠檬酸存在下都形成稳定的凝胶。
这些测试提供了某些初步结果。特别地，明胶是优选的胶凝剂，并优选以常规的较高浓度使用，如20％～40％，更通常为约30％。
实施例8
NO-产生制剂对红色发癣菌的效果
方法如上述方法例2中所描述，使用抑制板的有壁孔区，用来检测不同NO产生制剂对皮肤癣菌的灭菌活性。配制下述制剂并将其加入到预先接种红色发癣菌的有壁琼脂板孔上：
●含有10％柠檬酸的聚羧乙烯(50μl)与含有10％亚硝酸钠的聚甲基丙烯酸树脂L100(50μl)混合。
●含有10％柠檬酸的CMC(50μl)与含有10％亚硝酸钠的CMC(50μl)混合。
●含有10％柠檬酸的含水乳膏(50μl)与含有10％亚硝酸钠的含水乳膏(50μl)混合。
●含有10％柠檬酸的HMC(50μl)与含有10％亚硝酸钠的HMC(50μl)混合。
●含有10％柠檬酸的聚甲基丙烯酸树脂E100(50μl)与含有10％亚硝酸钠的聚甲基丙烯酸树脂E100(50μl)混合。
●含有10％柠檬酸的MC(50μl)与含有10％亚硝酸钠的聚甲基丙烯酸树脂L100(50μl)混合。
●50μl的10％柠檬酸与10％亚硝酸钠溶液(50μl)混合。
●50μl的10％柠檬酸与含有10％亚硝酸钠的聚甲基丙烯酸树脂L100(50μl)混合。
●阳性对照(不加入制剂)。
                           表13
                   结果-五天后的区域大小
           产生NO的制剂                抑制区
10％柠檬酸             10％亚硝酸钠    (cm)
聚羧乙烯               L100            7.7
CMC                    CMC             5.6
含水乳膏               含水乳膏        3.4
HMC                    HMC             8.5
E100                   L100            0
MC                     L100            7.7
溶液                   溶液            8.5
溶液                   L100            8.5
无                     无              0
结果表明红色发癣菌对由本发明的制剂所产生的杀伤力有很高的敏感性，可观察到大的杀伤区。
实施例9
从漆状物/胶凝剂中所生成的NO的WPI测定
建立一种实验方法来分析NO产生制剂中NO的释放时间。将制剂直接地放到Franz传感器中的0.2μm孔径的滤器表面上，导致制剂滤过滤纸，且反应在Franz传感器的较低容器中进行。相应地，将抗菌圆片用NO产生制剂中的亚硝酸钠组分渗入，并将此圆片放在膜上Franz传感器的上层隔室中，之后移取等量的柠檬酸组分放到浸渍的圆片上面。用WPI NO检测器来监测NO的产生量。实验装置如图2所示。
评价了三种制剂：
●10％柠檬酸的聚羧乙烯934和10％亚硝酸钠的聚甲基丙烯酸树脂L100
●10％柠檬酸的HMC和10％亚硝酸钠的聚甲基丙烯酸树脂L100溶液
●10％柠檬酸溶液和10％亚硝酸钠溶液
此结果如图3所示，其显示出从含有亚硝酸盐和酸的胶凝剂中所产生的NO的量随时间的变化。聚羧乙烯和L100 NO产生制剂达到50000pA的峰值，高于WPI仪表的检测限。然而，从此曲线图中可观察到制剂以相当稳定的速度释放NO，并在实验结束时以恒定速率持续了23分钟。与之形成对比的是，由溶液所产生的NO速率在很早的时候就开始慢下来了，可能是因为所产生的NO中的大部分从溶液中冒泡并释放到空气中。对于HMC的样品可观察到相似的模式。结果表明可用制剂方法得到不同的NO释放形式。
实施例10
用于测试的制剂
在表14中所列出的制剂用于考察抑制区、NO释放形式以及NO2/NO3释放。列在表14中的组分的浓度是混合前的浓度(％w/w在去离子水中)。
                          表14
样品号   含10％亚硝酸钠(％w/w)          含10％柠檬酸(％w/w)的制剂
         的制剂
1        羧甲基纤维素(CMC)(3％)      +  聚羧乙烯(3％)
2        CMC(3％)                    +  羟甲纤维素(HMC)(3％)
3        CMC(3％)                    +  甲基纤维素
4        CMC(3％)                    +  CMC(3％)
5        CMC(3％)                    +  溶液(DW)
6        L100(聚甲基丙烯酸树脂)(5％) +  聚羧乙烯(3％)
7        L100(5％)                   +  HMC(3％)
8        L100(5％)                   +  MC(3％)
9        L100(5％)                   +  CMC(3％)
10       L100(5％)                   +  溶液(DW)
11       羟甲纤维素(HMC)(3％)        +  聚羧乙烯(3％)
12      HMC(3％)          +  HMC(3％)
13      HMC(3％)          +  MC(3％)
14      HMC(3％)          +  CMC(3％)
15      HMC(3％)          +  溶液(DW)
16      溶液(蒸馏水(DW))  +  聚羧乙烯(3％)
17      溶液(DW)          +  HMC(3％)
18      溶液(DW)          +  MC(3％)
19      溶液(DW)          +  CMC(3％)
20      溶液(DW)          +  溶液(DW)
21      乳膏(溶于DW的     +  乳膏(溶于DW的
        50％含水乳膏)        50％含水乳膏)
22      溶液(DW)          +  1M抗坏血酸钠
23      溶液(DW)          +  1M硫氢化钠(SHS)
只评价了表15的组合物的抑制区。
                            表15
样品号  制剂(％w/w)
24      柠檬酸(20％)+抗坏血酸(20％)     +  亚硝酸钠(20％)
25      柠檬酸(20％)+抗坏血酸(16％)     +  亚硝酸钠(20％)
26      柠檬酸(20％)+抗坏血酸(12％)     +  亚硝酸钠(20％)
27      柠檬酸(20％)+抗坏血酸(8％)      +  亚硝酸钠(20％)
28      柠檬酸(20％)+抗坏血酸(4％)      +  亚硝酸钠(20％)
29      柠檬酸(16％)+抗坏血酸(20％)     +  亚硝酸钠(20％)
30      柠檬酸(12％)+抗坏血酸(20％)     +  亚硝酸钠(20％)
31      柠檬酸(8％)+抗坏血酸(20％)      +  亚硝酸钠(20％)
32      柠檬酸(4％)+抗坏血酸(20％)      +  亚硝酸钠(20％)
33      柠檬酸(20％)+1M Na2S2O4     +  亚硝酸钠(20％)
34      柠檬酸(20％)+1M抗坏血酸钠       +  亚硝酸钠(20％)
35*    柠檬酸(20％)+1M Na2S2O4     +  亚硝酸钠(20％)
36*    柠檬酸(20％)+1M抗坏血酸钠       +  亚硝酸钠(20％)
37**   DW                              +  亚硝酸钠(20％)
所列出的单独组分代表混合前的初始浓度(％w/w在去离子水中(DW))。
*和**分别代表阳性和阴性对照。
评价了可选择的还原剂α-维生素E对抑制区的影响。使用此还原剂的组合物列在表16中。也包括作为比较的含有亚硝酸钠和柠檬酸及抗坏血酸(样品号24)、Na2S2O4(样品号33)或抗坏血酸钠(样品号34)的组合物的制剂。
                            表16
样品号  制剂(％w/w)
38      9g DW+1g柠檬酸+50μlα-维生素E    +  亚硝酸钠
                                             (20％)
39      4g DW+1g柠檬酸+5g乙醇+50μl       +  亚硝酸钠
        α-维生素E                           (20％)
40*    DW                                +  DW
所列出的单独组分代表混合前的初始浓度(％w/w)。
*代表阴性对照。
实施例11
A)抑制区
图4、5和6显示实施例10的制剂对抑制区的效果。明显地，可得出大多数被考察的制剂在观察的抑制区方面没有明显的不同的结论，尽管样品号32(低浓度的柠檬酸和高浓度的抗坏血酸)及样品号39(配制在乙醇中的α-维生素E)显示出比其它制剂更低的活性。然而，其它含有高浓度(20％)抗坏血酸(样品24～31)组合物的制剂显示出在抗真菌活性方面没有明显的减弱，如抑制区分析中所示。
图4显示表14中的溶液和凝胶制剂的抑制区。
图5显示表15中在还原剂存在下所研究制剂的抑制区。
图6显示表16中在α-维生素E和其它还原剂存在下所研究制剂的抑制区。
B)NO和NO2/NO3释放
用pA为单位来表示由WPI仪器测定的NO产生量的数据。制作标准曲线图来计算NO释放浓度(数据没有显示)。通常，所获得的曲线显示溶液制剂释放NO比凝胶制剂更快。在溶液制剂中，样品号20(亚硝酸钠和柠檬酸的溶液)显示出在最短的时间内有很高的NO释放量。然而，含有聚羧乙烯(样品号16)和CMC(样品号19)中的亚硝酸钠溶液和柠檬酸的溶液制剂的组合物，在一段长期的时间可产生最大量的NO。发现通常CMC制剂释放的NO量最低。
图7表示不同研究制剂产生的NO平均峰值和NO2/NO3浓度。在所考察的凝胶制剂中，发现CMC制剂同其余的凝胶制剂(L100，HMC和聚羧乙烯)相比，产生更低浓度的NO。不同制剂所产生的NO浓度的平均峰值与时间的关系如图8所示。除样品19(包含CMC)外，数据证实与凝胶制剂相比，溶液(样品号5、10、16～20)可明显更快地达到NO浓度顶点。
图7表示不同制剂所产生的NO的平均峰值和NO2/NO3浓度。
图8表示不同制剂达到最大NO产生量的平均时间。
实施例12
NO透过人指甲情况
18小时，10％溶液
使用如图11所示的装置。在T0点，将100μl的10％亚硝酸钠和100μl的10％柠檬酸移液到一片人指甲表面上，后者固定在Franz传感器上(暴露面为0.1963cm2)。穿过指甲的NO量由WPI NO检测器监控18小时。结果如图9所示。
18h，5％溶液
使用如图11所示的装置。在T0点，将100μl的5％亚硝酸钠和100μl的5％柠檬酸移液到一片人指甲表面上，后者固定在Franz传感器上(暴露面为0.1963cm2)。穿过指甲的NO量由WPI NO检测器监控18小时。结果如图10所示。
阴性对照
阴性对照包括将200μl的去离子水移液到一片人指甲表面上，后者放在Franz传感器上，其他操作与10％和5％的操作过程相同。
从图中可看出，10％溶液的NO产生在开始时候明显地下降。然而，经过约4小时后(不同的实验产生不同的时间滞后，没有显示数据)，NO突然增加，然后在高水平保持约10小时。5％的溶液可产生正浓度水平的NO，虽然其水平比10％的制剂稍低。在实验开始有最初下降后，阴性对照从没有偏离基线(数据没有显示)。
实施例13
测定利用10％抗坏血酸和10％亚硝酸钠的穿过人指甲NO的情况
在实验的第一阶段，装配好图11的双臂指甲Franz传感器，但用一片透气性的薄膜来代替人指甲。在制剂加入前，将此系统保持约40分钟。如实施例12中那样，将100μl的10％抗坏血酸和100μl的10％亚硝酸钠溶液加入到Franz传感器的顶部，并用parafilm覆盖顶部。
在实验过程中所产生的NO量超过了NO检测器的检测限，并且曲线图仅在1小时后即偏离标尺(10μM)。没有在顶峰处观察到有初始的下降。所产生的NO量约比柠檬酸(10％)和亚硝酸钠(10％)产生的量高20倍。
然后重复该实验，此次使用一片人指甲。然后将100μl的10％抗坏血酸和100μl的10％亚硝酸钠直接施用到指甲表面并混合。将Franz传感器用parafilm覆盖，并且用WPI仪表来监测穿过指甲的NO量。结果如图12所示。
最高点上的下降似乎是涉及人指甲和NO产生制剂实验的普通的假象。下降之后最高点的增加是很突然的，两者之间不是逐步改变的。
从图12中可以看出，尽管包含有抗坏血酸的混合物可提供持续释放的NO穿过指甲，但其水平比使用柠檬酸要低约10倍(10×)。
实施例14
对于穿过人指甲的抗真菌气体穿透性的Franz传感器指甲生物测试
如图13所示将Franz传感器装配好，下层部分充满熔融的Sabouraud葡萄糖琼脂一直到出口孔下方约8mm处。待琼脂冷却并固定后，将25μl的黑曲霉孢子悬液移液到琼脂表面上，并将指甲切片以空气密封方式装在出口孔上方，并在适当的位置夹紧。然后将此容器在32℃培养24小时获得一层菌丝体。
当菌丝体长出时，将容器从培养箱中移出，并将0.1ml的柠檬酸和0.1ml的亚硝酸钠移液到Franz传感器的漏斗中，并用移液器头混合。阴性对照加入0.2ml的10％亚硝酸钠溶液或0.2ml的10％柠檬酸。然后将所有Franz传感器的漏斗顶端用parafilm覆着。将容器放置在室温中。经过2小时10分钟后，将每个Franz传感器中的溶液移出，并用相当溶液代替，并且每2小时10分钟将此过程重复一次，再重复了两次，总共用进行四次。在使用最后一次溶液后，在室温下将此容器盖上，让有机体慢慢生长24小时。
在24小时后，装有柠檬酸和亚硝酸钠混合物的所有六个容器在最靠近指甲/制剂的位置，都有黑曲霉素菌落的中心区域，其已被活性气体所杀死。这可由晕效应得到证实，在晕效应中死的白色菌丝体面积被一圈黑色的孢子形成的菌丝体所包围。再经过24小时，黑曲霉素可通过从没被杀死的最远区域向中心生长并恢复。
含有亚硝酸钠或柠檬酸的所有容器均显示有一层完整的菌丝体生长膜，其有形成的孢子，由固体黑圈证实。
此结果清楚地证实本发明的制剂产生穿过指甲有效气体组分的能力。明确表明此活性气体能穿透人完整的脚趾甲，并直接影响黑曲霉素的生长。另外，此制剂穿透指甲并影响在其他8毫米范围内的有机体的生长，在活体内的间隔事实上可以忽略不计。对照确定的确是活性气体引起晕轮效应。
实施例15
试剂盒
配制含有两种含水凝胶制剂的试剂盒。所述制剂有如下配方：
A.亚硝酸钠凝胶(2ml)
亚硝酸钠           6.6％
羟甲纤维素         10.0％
聚乙烯吡咯烷酮     5.0％
聚乙二醇           20.0％
苯甲醇             1.0％
着色剂             0.005％
水                 至100％
B.柠檬酸凝胶(2ml)
柠檬酸             10.0％
聚羧乙烯           5.0％
聚乙烯吡咯烷酮     5.0％
聚乙二醇           30.0％
羟苯甲酸甲酯       0.2％
对羟苯甲酸丙酯     0.02％
水                 至100％
着色剂             0.005％
制剂A和B被分别装在可再密封的、可挤压的软管中，以方便在应用到指甲前立即混合或在指甲上混合。

Claims (25)

1.一种可用于治疗指甲下的感染氮氧化物产生的组合物。
2.根据权利要求1的组合物，其包括在使用前彼此分开放置的亚硝酸盐和有机酸。
3.根据权利要求2组合物，其中酸为足量存在的使得最终组合物pH为5.5或更低。
4.根据权利要求2或3的组合物，其中酸选自甲酸、苹果酸、马来酸、乙酸、乳酸、柠檬酸、苯甲酸、酒石酸和水杨酸、抗坏血酸、抗坏血酸棕榈酸盐及其混合物。
5.根据权利要求2～4中任一项的组合物，其中亚硝酸盐选自碱金属亚硝酸盐和碱土金属亚硝酸盐。
6.根据权利要求5的组合物，其中亚硝酸盐选自钠，钾、镁和钡亚硝酸盐。
7.根据前述权利要求中任一项的组合物，其包括柠檬酸和亚硝酸钠，每一个在使用前彼此分开放置，至少有一个存在于含水的载体中。
8.根据前述权利要求种任一项组合物，其中指甲下的感染为甲癣。
9.根据权利要求2～8中任一项的组合物，其中亚硝酸盐组分与赋形剂进行配制，赋形剂选自聚甲基丙烯酸树脂、聚羧乙烯、羧甲基纤维素、羟甲纤维素及其混合物。
10.根据权利要求2～8中任一项的组合物，其中酸组分用选自聚羧乙烯、羧甲基纤维素、羟甲纤维素、甲基纤维素及其混合物的赋形剂进行配制。
11.根据前述权利要求中任一项的组合物，其中酸和亚硝酸盐被分开置于水性制剂中。
12.根据权利要求11的组合物，其中每个制剂形式分别选自适于彼此混合的凝胶、乳膏、外用洗液、软膏和涂布剂。
13.根据前述权利要求中任一项的组合物，其中酸和亚硝酸盐分别配制成凝胶、涂布剂或漆状物。
14.根据前述权利要求中任一项的组合物，其中酸和亚硝酸盐分别配制成液体或凝胶，当两者混合时固化或形成凝胶或涂布剂。
15.根据前述权利要求中任一项的组合物，其中亚硝酸盐约为最终组合物重量的0.5～30％。
16.根据权利要求15的组合物，其中亚硝酸盐约为最终组合物重量的5～15％。
17.根据前述权利要求中任一项的组合物，其中酸约为最终组合物重量的5～30％。
18.根据权利要求17的组合物，其中酸约为最终组合物重量的10～15％。
19.一种根据实施例可产生抑制区的组合物。
20.氮氧化物产生的成分在用于治疗或预防指甲下感染的药剂制备中的用途，其中此药剂为权利要求2～19中任一项所定义的组合物。
21.一种用于治疗或预防指甲下感染的方法，其中将权利要求1～19中任一项所定义的组合物以有效量施于感染的指甲。
22.包含如权利要求1～19中任一项所定义的组合物的试剂盒。
23.根据权利要求22的试剂盒，包括亚硝酸盐的水性制剂和有机酸的水性制剂，彼此分开放置，两种制剂各自均适合施用于治疗的指甲上，使得亚硝酸盐和酸反应释放出氮氧化物渗透进入指甲。
24.根据权利要求23的试剂盒，其中每个制剂为选自外用洗液、凝胶、乳膏和漆状物的形式。
25.根据权利要求23或24的试剂盒，其中制剂被装在可再密封的容器中。
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