KR20040026654A

KR20040026654A - 펩티드의 제조법

Info

Publication number: KR20040026654A
Application number: KR10-2003-7014828A
Authority: KR
Inventors: 니시무라오사무; 스에나가마사토; 이토다카시; 기타다치에코
Original assignee: 가부시키가이샤 시마즈세이사쿠쇼
Priority date: 2001-05-17
Filing date: 2002-05-16
Publication date: 2004-03-31
Also published as: WO2002092829A1; JP2003070488A; US20040185525A1; KR100599419B1; EP1391518A4; EP1391518A1; CN1509336A

Abstract

본 발명은 유전자 재조합법으로 목적 펩티드를 효율적이며 또한 대량으로 제조할 수 있는 방법을 제공하는 것을 과제로 한다.

오른손용 가위(S-시아노화 반응)와 왼손용 가위(브롬시안 처리, 엔테로키나아제, 팩터 Xa 처리 등)에 의한 목적 펩티드의 절단과 직렬 반복법을 조합시킨 본 발명의 방법은 유전자 재조합 기술에 의한 펩티드, 특히 저분자량 펩티드의 대량 합성에 유용하다.

Description

펩티드의 제조법{Process for producing peptide}

펩티드를 합성하는 방법으로는 유기화학적인 방법, 효소를 사용하는 방법, 또한 유전자 재조합 기술에 의한 방법의 3종류가 알려져 있다.

이 중, 유전자 재조합 기술을 사용하는 방법으로는 펩티드의 직접 발현법에 의한 합성은 매우 곤란하다. 그 이유는, 펩티드를 직접 발현시켜도 만들어진 펩티드는 균체내의 프로테아제로 잇달아 신속하게 분해되어 버리기 때문이다.

그 때문에 유전자 재조합 기술을 사용하여 펩티드를 합성할 때에는 보호 단백질과의 융합 단백질로서 발현시키는 융합 단백질법이 일반적으로 사용되고 있다. 보호 단백질로서는 이후의 정제를 신속하고 효율적으로 행하기 위해 친화성 크로마토그래피를 사용할 수 있는 프로테인 A, β 갈락토시다아제 등이 유리하게 사용된다. 이 융합 단백질로부터 목적 펩티드를 특이적으로 절단해야 하지만, 절단 방법으로는 브롬시안(Met의 C 말단쪽을 절단한다) 등의 화학적인 방법과 엔테로키나아제 절단 사이트(Asp-Asp-Asp-Asp-Lys)나 팩터 Xa(factor Xa) 절단 사이트(Ile-Glu-Gly-Arg)라는 서열의 직후 C 말단쪽을 절단한다) 등의 효소를 사용하는 방법이 잘 알려져 있다.

또한, 융합 단백질의 보호 단백질로서 FGF 뮤테인(CS23)을 특이적인 화학 절단법으로서 S-시아노화 반응을 조합한 새로운 펩티드 합성법이 보고되어 있다(EP0887417). 이 방법은 CS23의 헤파린으로의 강한 친화성을 이용하여 융합 단백질의 정제를 효율적이며 또한 용이하게 하고, 더욱이 시스테인을 매개로 함으로써 이 위치에서의 S-시아노화 반응(Cys의 N 말단쪽을 절단한다)에 의한 특이적 절단을 꾀하여 목적 펩티드를 절단할 수 있는 유용한 방법이며, 또한 대부분의 펩티드에서 생리활성의 발현에 필수인 C 말단 아미드체의 조제도 가능한 방법이다. 또한, 이 방법은 분자내에 시스테인 잔기를 포함하지 않는 모든 펩티드에 적용 가능하다.

한편, 일반적으로 융합 단백질법은 보호 단백질과 목적 펩티드의 분자량차가 커서, 반드시 미생물(대장균)의 단백질 합성 능력을 효율적으로 이용하고 있다고는 말할 수 없는 면이 있는 것도 사실이다. 따라서, 목적 펩티드 유전자를 1분자 중에 직렬로(tandem) 여럿 연결하여 균체내에서 안정한 전구체 단백질로서 발현시킨 후에 목적 펩티드를 절단하는 직렬 반복(tandem repeat)법이 시도되고 있지만 그 성공예는 적다. 그 원인은 종래, 목적 펩티드의 N 말단쪽을 절단하여 노출시키는 방법(말하자면, 왼손용 가위)은 브롬시안 처리, 팩터 Xa법 등이 알려져 있지만, C 말단을 특이적으로 절단하여 노출시키는 방법(말하자면, 오른손용 가위)에 적절한 것이 없었던 것에 기인하고 있다.

본 발명은 목적 펩티드를 반복하여 연결한 전구체 단백질로서 안정적으로 미생물에 발현시키고, 이어서 상기 전구체 단백질의 펩티드 결합을 절단함으로써 목적 펩티드 또는 그 염을 제조하는 방법에 관한 것이다.

발명의 개시

본 발명자 등은 이 C 말단을 특이적으로 절단하여 노출시키는 방법에 대해 예의 고찰을 거듭한 결과, 앞서 언급한 S-시아노화 반응이 융합 단백질법으로의 응용과 동일하게, 예상외로 직렬 반복법에 의한 펩티드의 합성에도 유효하게 이용할 수 있는 것을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

즉, 본 발명자 등은 직렬 반복법에 필요한 왼손용 가위와 오른손용 가위 양쪽 다 입수하는 것에 성공하고, 특히 지금까지 유전자 재조합법으로의 합성이 곤란했던 분자량이 적은 펩티드의 효율적이며 또한 대량의 조제가 가능해졌다(도 1).

이와 같이, 이들 2개의 절단방법을 조합함으로써 직렬 반복법에 의한 분자량이 적은 펩티드의 효율적이며 또한 대량의 조제가 가능해졌다(도 2).

즉, 본 발명은

(1) 목적 펩티드의 N 말단 및 C 말단에 효소 또는 화학적인 절단 사이트를 부가하여 반복 연결한 전구체 단백질을 효소 또는 화학적으로 절단하는 것을 특징으로 하는 목적 펩티드 또는 그 염의 제조법(이하, 제조법 A),

(2) (1)에 있어서, 목적 펩티드의 N 말단에 효소 또는 화학적인 절단 사이트를, C 말단에 화학적인 절단 사이트를 부가하여 반복 연결한 전구체 단백질을 효소 또는 화학적으로 절단하는 것을 특징으로 하는 제조법,

(3) 목적 펩티드의 N 말단쪽에 메티오닌 잔기 또는 단백질 분해효소 절단서열을, C 말단쪽에 시스테인 잔기 또는 시스테이닐 펩티드(단, 시스테이닐 펩티드의 펩티드 부분은 목적 펩티드와 상이하고, 또한 N 말단쪽에 메티오닌 잔기를 부가하는 경우 펩티드 부분은 메티오닌 잔기를 갖지 않는다)를 부가하여 반복 연결한 전구체 단백질 중의 각 목적 펩티드의 N 말단쪽을 브롬시안 또는 단백질 분해효소로 절단하고, C 말단쪽의 시스테인 또는 시스테이닐 펩티드의 N 말단쪽에서 절단 반응으로 처리하는 것을 특징으로 하는 목적 펩티드 또는 그 염의 제조법(이하, 제조법 B),

(4) (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 있어서, 전구체 단백질이 재조합형 전구체 단백질인 제조법,

(5) (3)에 있어서, 절단 반응이 S-시아노화 반응, 이어서 암모놀리시스(ammonolysis) 또는 가수분해 반응으로 처리하는 반응인 제조법,

(6) (5)에 있어서, S-시아노화 반응을 2-니트로-5-티오시아노 안식향산(NTCB), 1-시아노-4-디메틸아미노피리듐염(DMAP-CN) 또는 CN^-이온의 존재하에서 행하는 제조법,

(7) (3)에 있어서, 단백질 분해효소가 엔테로키나아제, 팩터 Xa 또는 트롬빈인 제조법,

(8) (3)에 있어서, (가) 브롬시안을 사용하는 경우, 각 목적 펩티드의 N 말단에 메티오닌 잔기를 연결하고 목적 펩티드가 메티오닌 잔기를 갖지 않고,

(나) 단백질 분해효소가 엔테로키나아제인 경우, 각 목적 펩티드의 N 말단에 Asp-Asp-Asp-Asp-Lys 등의 엔테로키나아제 절단 사이트를 연결하고 목적 펩티드가 Asp-Asp-Asp-Asp-Lys 등으로 표시되는 아미노산 서열을 갖지 않으며,

(다) 단백질 분해효소가 팩터 Xa인 경우, 각 목적 펩티드의 N 말단에 Ile-Glu-Gly-Arg 등의 팩터 Xa 절단 사이트를 연결하고 목적 펩티드가 Ile-Glu-Gly-Arg 등으로 표시되는 아미노산 서열을 갖지 않고,

(라) 단백질 분해효소가 트롬빈인 경우, 각 목적 펩티드의 N 말단에 Gly-Pro-Arg 등 트롬빈 절단 사이트를 연결하고 목적 펩티드가 Gly-Pro-Arg 등으로 표시되는 아미노산 서열을 갖지 않는 제조법,

(9) (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 있어서, 목적 펩티드가 KiSS-1 펩티드인 제조법,

(10) (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 있어서, 목적 펩티드가 GPR8 리간드인 제조법,

(11) GPR8 리간드의 N 말단쪽에 엔테로키나아제 절단서열을, C 말단쪽에 시스테인 잔기를 부가하여 3회 반복해 연결한 전구체 단백질 중의 각 GPR8 리간드의 N 말단쪽을 엔테로키나아제로 절단하고, C 말단쪽 시스테인의 N 말단쪽에서 절단 반응으로 처리하는 것을 특징으로 하는 GPR8 리간드 또는 그 염의 제조법,

(12) (10) 또는 (11)에 있어서, GPR8 리간드가 서열번호: 44로 표시되는 아미노산 서열과 동일하거나 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩티드인 제조법,

(13) (10) 또는 (11)에 있어서, GPR8 리간드가 서열번호: 44, 서열번호: 45, 서열번호: 46, 서열번호: 47, 서열번호: 48, 서열번호: 49 또는 서열번호: 50으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드인 제조법,

(14) (10) 또는 (11)에 있어서, GPR8 리간드가 서열번호: 44로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드인 제조법,

(15) 목적 펩티드의 N 말단쪽에 메티오닌 잔기 또는 단백질 분해효소 절단서열을, C 말단쪽에 시스테인 잔기 또는 시스테이닐 펩티드(단, 시스테이닐 펩티드의 펩티드 부분은 목적 펩티드와 상이하고, 또한 N 말단쪽에 메티오닌 잔기를 부가하는 경우 펩티드 부분은 메티오닌 잔기를 갖지 않는다)를 부가하여 반복 연결한 전구체 단백질을 코드하는 DNA를 함유하는 DNA,

(16) (15)의 DNA를 함유하는 재조합 벡터,

(17) (16)에 있어서, FERM BP-8023으로 표시되는 형질전환체: 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) MM294(DE3)/pTCGPR3에 보유되는 재조합 벡터,

(18) (16)의 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체,

(19) (18)에 있어서, FERM BP-8023으로 표시되는 형질전환체: 에스케리키아 콜라이 MM294(DE3)/pTCGPR3인 형질전환체,

(20) 목적 펩티드의 N 말단쪽에 메티오닌 잔기 또는 단백질 분해효소 절단서열을, C 말단쪽에 시스테인 잔기 또는 시스테이닐 펩티드(단, 시스테이닐 펩티드의 펩티드 부분은 목적 펩티드와 상이하고, 또한 N 말단쪽에 메티오닌 잔기를 부가하는 경우 펩티드 부분은 메티오닌 잔기를 갖지 않는다)를 부가하여 반복 연결한 전구체 단백질 또는 그 염 및

(21) (4)에 있어서, 전구체 단백질이 (18)의 형질전환체를 배양하여 제조된 재조합형 전구체 단백질인 제조법을 제공한다.

도면의 간단한 설명

도 1은 본 발명의 펩티드 제조법의 개략도를 나타낸다.

도면 중, 아랫방향 화살표를 왼손용 가위(N 말단 절단 및 노출 방법)-A로, 윗방향 화살표는 오른손용 가위(C 말단 절단 및 노출 방법)-B로 하였다. 왼손용 가위로서는 브롬시안 처리, 팩터 Xa법, 엔테로키나아제법 등의 C 말단쪽에서 펩티드를 절단하여 새로운 N 말단을 노출할 수 있는 효소를 들 수 있다. 방법으로서는 Met 또는 Ile-Glu-Gly-Arg, Asp-Asp-Asp-Asp-Lys의 C 말단쪽을 절단하여 목적 펩티드의 N 말단을 노출시킨다.

오른손용 가위는 S-시아노화를 행하여 Cys의 N 말단쪽을 절단하고 목적 펩티드의 C 말단을 노출시킨다.

도 2는 본 발명의 펩티드 제조법의 개략도를 나타낸다.

도 3은 본 발명의 펩티드 제조법을 사용한 KiSS-1 펩티드 제조법의 개략도를 나타낸다.

Xxx: Met(브롬시안) 또는 Ile-Glu-Gly-Arg(팩터 Xa), Asp-Asp-Asp-Asp-Lys(엔테로키나아제) 등이다.

단, (Xxx)는 일반적으로 목적 펩티드가 Met를 포함하는 경우에는 팩터 Xa나엔테로키나아제 외에 추가로(본 KiSS-1 펩티드의 경우에는 고려하지 않아도 된다) ① 목적 펩티드가 Pro를 포함하지 않을 때에는 프롤린 특이적 엔도펩티다아제(Proline Specific endopeptidase), ② 목적 펩티드가 Lys를 포함하지 않을 때에는 라이실 엔도펩티다아제(lysyl endopeptidase), ③ 목적 펩티드가 Arg를 포함하지 않을 때에는 아르기닐 엔도펩티다아제(Arginyl endopeptidase), ④ 목적 펩티드가 Glu와 Asp를 포함하지 않을 때에는 V8 프로테아제, ⑤ 목적 펩티드가 염기성 아미노산을 포함하지 않을 때에는 트립신, ⑥ 목적 펩티드가 방향족 아미노산을 포함하지 않을 때에는 키모토립신 등을 사용할 수 있다.

도 4는 실시예 1~3에서 제조된 hGPR8L(서열번호: 44)의 GPR8 발현 CHO세포에 대한 GTPγS 결합활성을 측정한 결과를 나타낸다. 가로축은 hGPR8L의 농도를, 세로축은 GTPγS 결합활성을 나타낸다. -●-는 합성한 hGPR8L(서열번호: 44)을, -○-는 본 발명의 펩티드 제조법(직렬 반복법)으로 제조한 hGPR8L(서열번호: 44)을 사용했을 때의 결과를 나타낸다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

본 발명의 방법에 있어서, 목적의 펩티드(간단히 「목적 펩티드」라 칭하는 경우가 있다)로서는 절단에 사용하는 방법에 의한 절단 사이트를 분자내에 갖지 않는 펩티드라면 어떤 펩티드를 사용해도 되고, 그 아미노산 서열은 유전자 재조합 기술을 사용하여 생산할 수 있는 것이라면 어느 것이어도 된다.

목적 펩티드의 아미노산 잔기의 수는 특별히 한정되지 않지만, 통상 약10~100개 정도, 바람직하게는 약 10~50개 정도, 더욱 바람직하게는 약 20~40개 정도이다.

목적 펩티드의 분자량도 특별히 한정되지 않지만, 통상 약 1000~10000 달톤, 바람직하게는 약 1000~5000 달톤, 더욱 바람직하게는 약 2000~4000 달톤 정도이다.

목적 펩티드의 구체예로서는 예를 들면 KiSS-1 펩티드(WO00/24890), RFRP-1 (WO00/29441), 아펠린(Apelin)(WO99/33976), PrRP(WO97/24436), GALP(WO99/48920), GPR8 리간드(WO01/98494), 안지오텐신, 브래디키닌(bradykinin), 칼시토닌 (calcitonin), 코노톡신(conotoxin), 코르티코트로핀(corticotropin) 방출인자, 다이노르핀(dynorphin), 엔도르핀, 엔케팔린(enkephalin), 갈라닌(galanin), 가스트린(gastrin), 글루카곤, 성장호르몬 방출인자, FMRF-아미드, 뉴로키닌, 뉴로메딘, 뉴로펩티드, 노시셉틴, 노시스타틴, 오렉신-B, 세크레틴, 서브스탠스 P, 유로코르틴, VIP, PACAP, ACTH, 각종 오피오이드펩티드류 및 상기의 펩티드 단편 등을 들 수 있고, 그 중에서도 KiSS-1 펩티드, RFRP-1, GPR8 리간드, 아펠린, PrRP, GALP 등이 바람직하다.

목적 펩티드는 펩티드 표기의 관례에 따라 왼쪽 끝이 N 말단(아미노 말단), 오른쪽 끝이 C 말단(카르복실 말단)이다.

KiSS-1 펩티드로서는 예를 들면, WO00/24890에 기재된 인간 KiSS-1 펩티드가 사용되고, 구체적으로는 서열번호: 1로 표시되는 54개의 아미노산 잔기로 된 아미노산 서열에 있어서 N 말단으로부터 제47~54번째의 아미노산 서열을 함유하고, 8 내지 54개의 아미노산 잔기로 된 펩티드 등을 들 수 있다.

「서열번호: 1로 표시되는 아미노산 서열에 있어서 N 말단으로부터 제47~54번째의 아미노산 서열을 함유하고, 8 내지 54개의 아미노산 잔기로 된 펩티드」로서는, 서열번호: 1로 표시되는 아미노산 서열에 있어서 N 말단으로부터 제47~54번째의 아미노산 서열을 함유하고, 또한 8 내지 54개의 아미노산 잔기로 된 펩티드라면 어떤 것이어도 되지만, 펩티드가 갖는 활성(예를 들면, 펩티드와 리셉터의 결합활성, 펩티드에 의해 일어나는 리셉터 발현세포의 세포자극활성 등) 등이 실질적으로 동일한 것을 의미한다. 구체적으로는 ① 서열번호: 1로 표시되는 아미노산 서열로 표시되는 펩티드, ② 본 발명의 서열번호: 1로 표시되는 아미노산 서열에 있어서 N 말단으로부터 제47~54번째의 아미노산 서열을 C 말단에 갖고, 8 내지 15개의 아미노산 잔기로 된 펩티드 등이 사용된다.

보다 구체적으로는 KiSS-1 펩티드로서는 ① 서열번호: 1로 표시되는 아미노산 서열로 표시되는 펩티드, ② 서열번호: 1로 표시되는 아미노산 서열의 N 말단으로부터 제40~54번째로 된 아미노산 서열로 표시되는 펩티드, ③ 서열번호: 1로 표시되는 아미노산 서열의 N 말단으로부터 제45~54번째로 된 아미노산 서열(서열번호: 2로 표시되는 아미노산 서열)로 표시되는 펩티드, ④ 서열번호: 1로 표시되는 아미노산 서열의 N 말단으로부터 제46~54번째로 된 아미노산 서열로 표시되는 펩티드, ⑤ 서열번호: 1로 표시되는 아미노산 서열의 N 말단으로부터 제47~54번째로 된 아미노산 서열로 표시되는 펩티드, ⑥ 서열번호: 1로 표시되는 아미노산 서열의 N 말단으로부터 제35~54번째로 된 아미노산 서열로 표시되는 펩티드 등을 들 수 있다.

상기 KiSS-1 펩티드는 WO00/24890에 기재된 리셉터 단백질 OT7T175에 대해 리간드활성을 갖는다.

RFRP-1로서는 예를 들면, Hinuma et al., Nature Cell Biology, Vol 2, p703-708(2000)에 기재된 RF 아미드-관련 펩티드(amide-related peptides)나 WO00/29441에 기재된 폴리펩티드 등을 들 수 있고, 구체적으로는 서열번호: 1 또는 서열번호: 9로 표시되는 아미노산 서열을 함유하며 Hinuma et al., Nature Cell Biology, Vol 2, p703-708(2000)이나 WO00/29441에 기재된 리셉터 OT7T022에 대해 리간드활성을 갖는 펩티드라면 어떤 것이어도 된다.

보다 구체적으로는 예를 들면, 서열번호: 6, 서열번호: 7, 서열번호: 8, 서열번호: 9, 서열번호: 10 또는 서열번호: 11로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 등이 사용된다.

아펠린으로서는 예를 들면, Biochem. Biophys. Res. Commun.,251, 471-476(1998)에 기재된 아펠린-36(서열번호: 18로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드), 아펠린-13(서열번호: 18의 제24~36번째의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드), 아펠린-13의 N 말단의 아미노산(Gln)이 피로글루타민산화된 펩티드 등을 들 수 있고, 그 리셉터인 APJ(O'Dowd. B.F., et al., Gene,436, 355-359, 1993)에 대해 리간드활성을 갖는 펩티드라면 어떤 것이어도 된다. 구체적으로는, 예를 들면 WO99/33976에 기재된 「서열번호: 3으로 표시되는 아미노산 서열과 동일하거나 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 함유하는 리셉터 단백질에 결합능을 갖는 폴리펩티드」 등을 들 수 있다.

PrRP(19P2 리간드)로서는 예를 들면 WO97/24436에 기재된 펩티드가 사용되고, 구체적으로는 소 19P2L(b19P2L 또는 소 PrRP)(서열번호: 20), 랫트 19P2L9(r19P2L 또는 랫트 PrRP)(서열번호: 21), 인간 19P2L(h19P2L 또는 인간 PrRP)(서열번호: 22)과 동일하거나 실질적으로 동일한 펩티드 또는 그들의 아미드, 에스테르 또는 그 염 등을 들 수 있다.

「실질적으로 동일」이란 리셉터 결합활성 등이 성질적으로 동질인 것을 나타낸다. 따라서, 리셉터 결합활성의 강도 등의 강약, 펩티드의 분자량 등의 양적 요소는 상이해도 된다.

예를 들면, 서열번호: 20, 서열번호: 21 또는 서열번호: 22로 표시되는 아미노산 서열을 함유하는 펩티드 등 외에 서열번호: 20, 서열번호: 21 또는 서열번호: 22로 표시되는 아미노산 서열과 각각 약 50~99.9%(바람직하게는 70~99.9%, 보다 바람직하게는 80~99.9%, 더욱 바람직하게는 90~99.9%)의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 함유하고, 서열번호: 20, 서열번호: 21 또는 서열번호: 22로 표시되는 아미노산 서열을 함유하는 펩티드와 실질적으로 동질의 활성을 갖는 펩티드 등을 들 수 있다(단, 해당 펩티드는 아미노산 서열 중에 시스테인을 포함하지 않는 것으로 한다).

서열번호: 20, 서열번호: 21 또는 서열번호: 22로 표시되는 아미노산 서열을 함유하는 펩티드와 실질적으로 동일한 펩티드의 보다 구체적인 예로서는, 예를 들면 서열번호: 23(서열번호: 23 중 제10번째의 Xaa는 Ala 또는 Thr, 제11번째의 Xaa는 Gly 또는 Ser, 제21번째의 Xaa는 OH, Gly 또는 Gly-Arg를 나타낸다)에 기재된부분 펩티드를 함유하는 펩티드 등을 들 수 있다.

보다 구체적으로는 서열번호: 20, 서열번호: 21 또는 서열번호: 22로 표시되는 아미노산 서열 중의 1개 이상 15개 이하, 바람직하게는 1개 이상 10개 이하, 보다 바람직하게는 1개 이상 5개 이하의 아미노산이 결실된 아미노산 서열, 서열번호: 20, 서열번호: 21 또는 서열번호: 22로 표시되는 아미노산 서열에 1개 이상 80개 이하, 바람직하게는 1개 이상 50개 이하, 보다 바람직하게는 1개 이상 10개 이하의 아미노산이 부가된 아미노산 서열, 서열번호: 20, 서열번호: 21 또는 서열번호:22로 표시되는 아미노산 서열 중의 1개 이상 15개 이하, 바람직하게는 1개 이상 10개 이하, 보다 바람직하게는 1개 이상 5개 이하의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열을 함유하는 펩티드 등을 들 수 있다.

더욱 구체적으로는 예를 들면, 서열번호: 23, 서열번호: 24, 서열번호: 25, 서열번호: 26, 서열번호: 27, 서열번호: 28, 서열번호: 29, 서열번호: 30, 서열번호: 31, 서열번호: 32, 서열번호: 33, 서열번호: 34, 서열번호: 35, 서열번호: 36, 서열번호: 37, 서열번호: 38, 서열번호: 39, 서열번호: 40, 서열번호: 41, 서열번호: 42 또는 서열번호: 43으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 펩티드 등을 들 수 있다.

또한, 본 발명의 PrRP에는 Gln의 N 말단쪽이 생체내에서 절단되어 상기 Gln이 피로글루타민산화된 것 등도 포함된다.

GALP로서는 WO99/48920에 기재된 펩티드가 사용된다.

GPR8 리간드로서는 7회 막관통형 리셉터 단백질 GPR8(O'Dowd, B. F. et al.,Genomics, 28권, 84-91페이지, 1995년)에 대한 리간드활성, 예를 들면 GPR8과의 결합활성, GPR8 발현세포에 대한 세포자극활성(예를 들면, 아라키돈산 유리(遊離), 아세틸콜린 유리, 세포내 Ca²⁺유리, 세포내 cAMP 생성, 세포내 cGMP 생성, 이노시톨인산 생산, 세포막 전위변동, 세포내 단백질의 인산화, c-fos의 활성화, pH의 저하, GTPγS 결합활성 등을 촉진하는 활성 등)을 갖는 폴리펩티드라면 어떤 것이어도 되고, 예를 들면 WO01-98494에 기재된 펩티드 등이 사용된다.

GPR8에 대한 리간드 폴리펩티드로서 보다 구체적으로는 서열번호: 44로 표시되는 아미노산 서열과 동일하거나 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩티드 등을 들 수 있다.

서열번호: 44로 표시되는 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열로서는, 예를 들면 서열번호: 45로 표시되는 아미노산 서열, 서열번호: 46으로 표시되는 아미노산 서열, 서열번호: 47로 표시되는 아미노산 서열, 서열번호: 48로 표시되는 아미노산 서열, 서열번호: 49로 표시되는 아미노산 서열 및 서열번호: 50으로 표시되는 아미노산 서열 등을 들 수 있다.

즉, 서열번호: 44로 표시되는 아미노산 서열과 동일하거나 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩티드의 구체예로서는,

① 서열번호: 44로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 GPR8 리간드,

② 서열번호: 45로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 GPR8 리간드,

③ 서열번호: 46으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 GPR8 리간드,

④ 서열번호: 47로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 GPR8 리간드,

⑤ 서열번호: 48로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 GPR8 리간드,

⑥ 서열번호: 49로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 GPR8 리간드,

⑦ 서열번호: 50으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 GPR8 리간드 등이 사용된다.

목적 펩티드의 염으로서는 생리학적으로 허용되는 염기(예를 들면 알칼리금속 등)나 산(유기산, 무기산)과의 염이 사용되지만, 특히 생리학적으로 허용되는 산 부가염이 바람직하다. 이러한 염으로서는 예를 들면 무기산(예를 들면, 염산, 인산, 브롬화수소산, 황산)과의 염 또는 유기산(예를 들면, 초산, 포름산, 프로피온산, 푸마르산, 말레산, 숙신산, 타르타르산, 구연산, 사과산, 옥살산, 안식향산, 메탄설폰산, 벤젠설폰산)과의 염 등이 사용된다.

본 발명의 제조법 A에 있어서, 목적 펩티드의 N 말단에 부가할 수 있는 효소적인 절단 사이트로서는, 예를 들면

(1) 단백질 분해효소인 엔테로키나아제의 절단 사이트인 Asp-Asp-Asp-Asp-Lys(서열번호: 58)(염기서열: GATGACGACGACAAG(서열번호: 59)를 갖는 DNA에 의해 코드된다) 등,

(2) 단백질 분해효소인 팩터 Xa의 절단 사이트인 Ile-Glu-Gly-Arg(서열번호: 60)(염기서열: ATTGAAGGCCGC(서열번호: 61)를 갖는 DNA에 의해 코드된다) 등,

(3) 단백질 분해효소인 트롬빈의 절단 사이트인 Gly-Pro-Arg(서열번호: 62)(염기서열: GGCCCGCGC(서열번호: 63)를 갖는 DNA에 의해 코드된다) 등을 들 수 있다.

목적 펩티드의 N 말단에 부가할 수 있는 화학적인 절단 사이트로서는 예를들면 브롬시안의 절단 사이트인 메티오닌 잔기 등을 들 수 있다.

목적 펩티드의 C 말단에 부가할 수 있는 화학적인 절단 사이트로서는 예를 들면 시스테인 잔기 또는 시스테이닐 펩티드 등을 들 수 있다.

시스테이닐 펩티드의 펩티드 부분은 1 또는 2개 이상(예를 들면, 1~5개 정도)의 아미노산 잔기로 된다. 아미노산 잔기의 종류는 특별히 한정되지 않지만, Gly, Ala, Ser, Leu 등이 바람직하다. 또한, 시스테이닐 펩티드의 펩티드 부분은 목적 펩티드와 상이하다. 더욱이, 목적 펩티드의 N 말단에 메티오닌 잔기를 부가하는 경우(브롬시안을 사용하는 경우), 시스테이닐 펩티드의 펩티드 부분은 메티오닌 잔기를 갖지 않는다.

목적 펩티드의 N 말단 및 C 말단에 효소 또는 화학적인 절단 사이트를 부가하여 반복 연결한 전구체 단백질(전구체 펩티드를 포함한다)이란, 목적 펩티드의 N 말단 및 C 말단에 상기한 효소 또는 화학적인 절단 사이트가 부가된 펩티드를 2개 이상(예를 들면, 2~100개, 바람직하게는 2~20개 정도, 보다 바람직하게는 2~10개 정도) 반복하여 연결한 단백질이다.

본 발명의 제조법 B에 있어서, 목적 펩티드의 N 말단쪽에 메티오닌 잔기 또는 단백질 분해효소 절단서열을, C 말단쪽에 시스테인 잔기 또는 시스테이닐 펩티드(단, 시스테이닐 펩티드의 펩티드 부분은 목적 펩티드와 상이하고, 또한 N 말단쪽에 메티오닌 잔기를 부가하는 경우(브롬시안을 사용하는 경우), 펩티드 부분은 메티오닌 잔기를 갖지 않는다)를 부가하여 반복 연결한 전구체 단백질(전구체 펩티드도 포함한다)이란, 상기한 목적 펩티드의 N 말단에 메티오닌 잔기 또는 단백질분해효소의 절단 사이트를 갖고, C 말단에 시스테인 잔기 또는 시스테이닐 펩티드를 가지며, 추가로 말단에 아미노산 잔기를 갖고 있어도 되는 단백질을 2개 이상(예를 들면 2~100개, 바람직하게는 2~20개 정도, 보다 바람직하게는 2~10개 정도) 반복하여 연결한 것이어도 된다.

단백질 분해효소 절단서열 및 시스테이닐 펩티드는 상기와 동일하다.

본 발명의 제조법 A 또는 B에서 사용되는 이들 전구체 단백질은 바람직하게는 유전자 공학적 수법을 사용하여 제조되는 재조합형 전구체 단백질이다.

상기 재조합형 전구체 단백질은 예를 들면, 후술하는 전구체 단백질을 코드하는 DNA를 함유하는 벡터를 함유하는 형질전환체를 배양하여 상기 전구체 단백질을 발현시킴으로써 제조할 수 있다.

전구체 단백질을 코드하는 DNA는 상기한 전구체 단백질을 코드하는 것이라면 어떤 것이어도 되고, 전체 염기서열을 화학적으로 합성해도 된다. 그 경우의 제조법으로서는 예를 들면, 공지의 포스포아미다이드법, 인산트리에스테르법, 디에스테르법, 하이드로젠포스포네이트법 등이 사용되고, 짧은 것이라면 한번에, 긴 것은 분할하여 합성한 후에 T4DNA 리가아제를 사용해 연결하여 제작할 수 있다.

전구체 단백질을 코드하는 DNA를 제조하기 위해 사용되는 각 목적 펩티드를 코드하는 DNA로서는 공지의 DNA를 사용하는 것도 가능하고, 공지의 방법을 사용하여 클로닝할 수 있다. DNA의 염기서열은 각 목적 펩티드를 코드하는 것이라면 천연형의 염기서열이어도 되고, 천연형의 염기서열 중의 코돈을 동일 아미노산을 코드하는 다른 코돈으로 바꿔 넣은 염기서열이어도 된다.

목적 펩티드의 N 말단 및 C 말단에 효소 또는 화학적인 절단 사이트를 부가하여 반복 연결한 전구체 단백질을 코드하는 DNA는 각 목적 펩티드를 코드하는 DNA 염기서열의 5'-말단 및 3'-말단에 효소 또는 화학적인 절단 사이트를 코드하는 염기서열을 결합시켜 반복서열로서 구축한다.

목적 펩티드의 N 말단쪽에 메티오닌 잔기 또는 단백질 분해효소 절단서열을, C 말단쪽에 시스테인 잔기 또는 시스테이닐 펩티드를 부가하여 반복 연결한 전구체 단백질을 코드하는 DNA는, 각 목적 펩티드를 코드하는 DNA 염기서열의 5'-말단에 펩티드 결합 N 말단쪽의 절단 반응에 사용하는 브롬시안 또는 단백질 분해효소의 절단 사이트를 코드하는 염기서열을 결합하고, 추가로 각 목적 펩티드를 코드하는 DNA 염기서열의 3'-말단에 1-시아노-4-디메틸아미노피리듐염(DMAP-CN)을 사용하여 S-시아노화 반응 후 암모놀리시스 또는 가수분해함으로써 절단하는 사이트를 코드하는 염기서열(예를 들면, 시스테인을 코드하는 TGT 또는 TGC, 시스테이닐 펩티드를 코드하는 염기서열)을 결합시켜 반복서열로서 구축한다.

또한, 전구체 단백질의 C 말단은 시스테인 잔기 또는 시스테이닐 펩티드 중 어떤 것이어도 된다.

KiSS-1 펩티드를 코드하는 DNA로서는 상기한 KiSS-1 펩티드를 코드하는 DNA라면 어떤 것이어도 되지만, 예를 들면 ① 서열번호: 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 인간 KiSS-1 펩티드를 코드하는 DNA로서는 서열번호: 3으로 표시되는 염기서열을 갖는 DNA가, ② 서열번호: 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 KiSS-1(45-54) 펩티드를 코드하는 염기서열로서는 서열번호: 4로 표시되는 염기서열을 갖는DNA 등이 사용된다. 또한, 코돈을 동일 아미노산을 코드하는 다른 코돈으로 적절히 바꿔 넣어도 된다.

본 발명의 방법에 있어서 사용되는 KiSS-1 펩티드를 코드하는 DNA를 함유하는 DNA의 구체예로서는, 예를 들면

GGTAGCGCGA TGTATAACTG GAACAGCTTT GGTCTGCGTT TTTGTGGCTC GGCGATGTAC

AATTGGAATT CCTTCGGCCT GCGCTTCTGC GGCTCGGCGA TGTATAACTG GAACTCCTTT

GGCCTGCGCT TTTGCGGTTC TGCT

로 표시되는 염기서열(서열번호: 5)을 함유하는 DNA 등을 들 수 있다. 이 염기서열은 KiSS-1 펩티드(45-54)를 코드하는 서열번호: 4로 표시되는 염기서열의 5'-말단에 브롬시안의 절단 사이트를 코드하는 염기서열(ATG)이 결합되고, 추가로 그 3'-말단에 1-시아노-4-디메틸아미노피리듐염(DMAP-CN)의 절단 사이트를 코드하는 염기서열(TGT)이 결합된 것이다. 이 염기서열을 반복 연결함으로써 KiSS-1 펩티드의 전구체 단백질을 코드하는 DNA를 제조할 수 있다.

RFRP-1을 코드하는 DNA로서는 상기한 RFRP-1을 코드하는 DNA라면 어떤 것이어도 되지만, 예를 들면 ① 서열번호: 6으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 RFRP-1을 코드하는 DNA로서는 서열번호: 12로 표시되는 염기서열을 갖는 DNA가, ② 서열번호: 7로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 RFRP-1을 코드하는 DNA로서는 서열번호: 13으로 표시되는 염기서열을 갖는 DNA가, ③ 서열번호: 8로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 RFRP-1을 코드하는 DNA로서는 서열번호: 14로 표시되는 염기서열을 갖는 DNA가, ④ 서열번호: 9로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 RFRP-1을 코드하는 DNA로서는 서열번호: 15로 표시되는 염기서열을 갖는 DNA가, ⑤ 서열번호: 10으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 RFRP-1을 코드하는 DNA로서는 서열번호: 16으로 표시되는 염기서열을 갖는 DNA가, ⑥ 서열번호: 11로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 RFRP-1을 코드하는 DNA로서는 서열번호: 17로 표시되는 염기서열을 갖는 DNA 등이 사용된다.

아펠린을 코드하는 DNA로서는 상기한 아펠린을 코드하는 DNA라면 어떤 것이어도 되지만, 예를 들면 ① 서열번호: 18로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 아펠린 18을 코드하는 DNA로서는 서열번호: 19로 표시되는 염기서열을 갖는 DNA 등이 사용된다.

PrRP를 코드하는 DNA로서는 상기한 PrRP를 코드하는 DNA라면 어떤 것이어도 되지만, 구체적으로는 WO97-24436호에 기재된 DNA가 사용된다.

GALP를 코드하는 DNA로서는 상기한 GALP를 코드하는 DNA라면 어떤 것이어도 되지만, 구체적으로는 WO99-48920호에 기재된 DNA가 사용된다.

GPR8 리간드를 코드하는 DNA로서는 상기한 GPR8 리간드를 코드하는 DNA라면 어떤 것이어도 되지만, 구체적으로는 ① 서열번호: 44로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 GPR8 리간드를 코드하는 DNA로서는 서열번호: 51로 표시되는 염기서열을 갖는 DNA가, ② 서열번호: 45로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 GPR8 리간드를 코드하는 DNA로서는 서열번호: 52로 표시되는 염기서열을 갖는 DNA가, ③ 서열번호: 46으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 GPR8 리간드를 코드하는 DNA로서는 서열번호: 53으로 표시되는 염기서열을 갖는 DNA가, ④ 서열번호: 47로 표시되는 아미노산 서열을갖는 GPR8 리간드를 코드하는 DNA로서는 서열번호: 54로 표시되는 염기서열을 갖는 DNA가, ⑤ 서열번호: 48로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 GPR8 리간드를 코드하는 DNA로서는 서열번호: 55로 표시되는 염기서열을 갖는 DNA가, ⑥ 서열번호: 49로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 GPR8 리간드를 코드하는 DNA로서는 서열번호: 56으로 표시되는 염기서열을 갖는 DNA가, ⑦ 서열번호: 50으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 GPR8 리간드를 코드하는 DNA로서는 서열번호: 57로 표시되는 염기서열을 갖는 DNA 등이 사용된다.

본 발명의 방법에 있어서 사용되는 GPR8 리간드를 코드하는 DNA를 함유하는 DNA의 구체예로서는, 예를 들면

GATGACGATG ACAAATGGTA TAAACATGTG GCGAGCCCGC GTTATCATAC CGTGGGCCGC GCGGCCGGTC TGCTGATGGG CCTGTGTCAA TTGGGTGGTG ATGACGATGA CAAATGGTAT AAACATGTGG CGAGCCCGCG TTATCATACC GTGGGCCGCG CGGCCGGTCT GCTGATGGGC CTGTGTGAGC TCGGCTCTGA CGACGATGAT AAATGGTACA AACACGTTGC CTCCCCGCGC TACCACACGG TTGGTCGTGC CGCGGGCCTG CTGATGGGTC TGTGCGGT

로 표시되는 염기서열(서열번호: 64)을 함유하는 DNA 등을 들 수 있다. 이 염기서열은 GRP8 리간드(23 잔기)를 코드하는 서열번호: 44로 표시되는 염기서열의 5'-말단에 엔테로키나아제 절단서열(Asp-Asp-Asp-Asp-Lys; 서열번호: 58)을 코드하는 염기서열(서열번호: 59)이 결합되고, 추가로 그 3'-말단에 1-시아노-4-디메틸아미노피리듐염(DMAP-CN)의 절단 사이트를 코드하는 염기서열(TGT)이 결합된 것이다. 이 염기서열을 반복 연결함으로써 GPR8 리간드(23 잔기)의 전구체 단백질을 코드하는DNA를 제조할 수 있다.

또한, 목적 펩티드를 반복 연결한 전구체 단백질을 코드하는 DNA를 종래의 유전자 기술, 예를 들면 부위특이적 돌연변이 유발기술을 사용하여 목적 펩티드의 뮤테인을 코드하는 DNA로 변환할 수 있다.

부위특이적 돌연변이 유발기술은 공지이고, 알 에프 레이더(Lather, R. F.) 및 제이 피 레코크(Lecoq, J. P.), 제네틱 엔지니어링(Genetic Engineering), 아카데믹프레스사(1983년) 제31-50페이지 등에 기재되어 있다. 올리고뉴클레오티드에 지시된 변이 유발은 엠 스미스(Smith, M.) 및 에스 길람(Gillam, S.), 제네틱 엔지니어링: 원리와 방법, 플레넘프레스사(1981년) 3권 1-32페이지 등에 기재되어 있다.

전구체 단백질을 코드하는 DNA를 함유하는 벡터로서 사용되는 플라스미드로서는, 예를 들면 대장균(에스케리키아 콜라이) 유래의 pBR322[Gene, 2, 95(1977)], pBR313[Gene, 2, 75(1977)], pBR324, pBR325[Gene, 4, 124(1978)], pBR327, pBR328[Gene, 9, 287(1980)], pBR329[Gene, 17,79(1982)], pKY2289[Gene, 3, 1(1978)], pKY 2700[생화학, 52, 770(1980)], pACYC177, pACYC184[Journal of Bacteriology, 134, 1141(1978)], pRK248, pRK646, pDF[Methods in Enzymology, 68, 268(1979)], pUC18, pUC19[야니슈페론 등, Gene, 33, 103(1985)] 등을 들 수 있다.

또한, 박테리오 파지, 예를 들면 λ 파지를 사용한 λgt계의 λgt·λC[Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 71, 4579(1974)], ·t·λB[Proc. Nat.Acad. Sci. U.S.A. 72, 3461(1975)], λDam[Gene, 1, 255(1977)]이나 샤론벡터[Science, 196, 161(1977); Journal of Virology, 29, 555(1979)], 섬유형상 파지를 사용한 mp계의 mp18, mp19[야니슈페론 등, Gene, 33, 103(1985)] 벡터 등도 들 수 있다.

상기 DNA는 ATG의 상류에 프로모터를 갖고 있는 것이 바람직하고, 상기 프로모터는 형질전환체의 제조에 사용하는 숙주에 대응하여 적절한 프로모터라면 어떤 것이어도 된다. 예를 들면, 숙주가 대장균(에스케리키아 콜라이)인 경우 trp 프로모터, lac 프로모터, rec A 프로모터, λPL 프로모터, lpp 프로모터, T7 프로모터 등이 사용된다.

T7 프로모터의 계를 사용하는 경우에는 T7 프로모터로서는 T7 DNA 상에서 발견되고 있는 17종류의 프로모터[J. L. Oakley 등, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 74: 4266-4270(1977), M. D. Rosa, Cell 16: 815-825(1979), N. Panayotatos 등, Nature, 280: 35(1979), J. J. Dunn 등, J. Mol. Biol., 166: 477-535(1983)] 중 어느 것이어도 되지만 Ø10 프로모터[A. H. Rosenberg 등, Gene, 56: 125-135(1987)]가 바람직하다.

전사 터미네이터로서는 대장균의 계에서 작동하는 터미네이터, 바람직하게는 TØ 터미네이터[F. W. Studier 등, J. Mol. Biol. 189: 113-130(1986)] 등이 사용된다.

T7 RNA 폴리머라아제 DNA로서는 T7 DNA[F. W. Studier 등, J. Mol. Biol., 189: 113-130(1986)] 등이 사용된다.

벡터는 상기 벡터에 T7 프로모터, T7 터미네이터를 삽입하여 구축되는 것이 바람직하고, 이러한 벡터로서는 pET-1, pET-2, pET-3, pET-4, pET-5[A. H. Rosenberg, Gene 56: 125-135(1987)], pTB960-2[EP-A-499990] 등이 사용되고, 바람직하게는 pTB960-2가 사용된다.

형질전환체는 상기 방법에서 얻어지는 발현용 플라스미드를 공지의 방법[예, 코엔 S. N. 등, Pro. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 69, 2110(1972)]으로 숙주를 형질전환함으로써 제조할 수 있다.

형질전환되는 미생물의 숙주로서는 예를 들면, 에스케리키아(Escherichia)속 균 등을 들 수 있다.

상기 에스케리키아속 균의 예로서는 에스케리키아 콜라이(E. coli)를 들 수 있고, 구체적으로는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) K12DH1[Pro. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 60, 160(1968)], JM-103[Nucleic Acids Research, 9, 309(1981)], JA221[Journal of Molecular biology, 120, 517(1978)], HB101[Journal of Molecular biology, 41, 459(1969)], C600[Genetics, 39, 440(1954)], N4830[Cell, 25, 713(1981)], K-12MM294[Pro. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 73, 4174(1976)] BL-21 등이 사용된다.

T7 프로모터의 계를 사용하는 경우에는 그 형질전환체의 숙주로서는 T7 RNA 폴리머라아제 DNA(T7 DNA1)[F. W. Studier 등, J. Mol. Biol. 189: 113-130(1986)]를 삽입한 대장균주(예를 들면, MM294, DH-1, C600, JM109, BL21), T7 RNA 폴리머라아제 DNA(T7 DNA1)를 다른 플라스미드와 함께 삽입한 대장균주 등이 사용된다.바람직하게는 T7 DNA1을 삽입한 λ 파지가 용원화(溶原化)된 MM294주 및 BL21주가 사용된다. 이 경우 T7 DNA1의 프로모터로서는 이소프로필-1-티오-β-D-갈락토피라노시드(IPTG라고 약칭하는 경우가 있다)로 발현이 유도되는 lac 프로모터가 사용된다.

재조합형 전구체 단백질은 상술한 형질전환체를 배지에 배양하여 생산된 재조합형 전구체 단백질을 채취함으로써 제조할 수 있다.

배지의 pH는 약 6~8이 바람직하다. 에스케리키아속 균을 배양할 때의 배지로서는 예를 들면 글루코오스, 카사미노산을 포함하는 M9 배지[Miller, Journal of Experiments in Molecular Genetics, 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972]가 바람직하다. 여기에 필요에 따라 프로모터를 효율적으로 작동시키기 위해 예를 들면 3β-인돌릴 아크릴산이나 이소프로필 βD-티오갈락토피라노시드와 같은 약제를 가할 수 있다.

숙주가 에스케리키아속 균인 경우 배양은 통상 약 15~43℃에서 약 3~24시간 행하고, 필요에 따라 통기나 교반을 가하는 것도 가능하다.

T7 프로모터의 계를 사용하고 있는 경우에는 (1) lac 프로모터의 하류에 연결되어 있는 T7 DNA(RNA 폴리머라아제 DNA)를 발현시킬 때는 IPTG 등을 첨가하거나, (2) λPL 프로모터의 하류에 연결되어 있는 T7 DNA(RNA 폴리머라아제 DNA)를 발현시킬 때는 배양 온도를 상승시킴으로써 생성되는 T7 파지 RNA 폴리머라아제 1에 의해 특이적으로 T7 프로모터를 작동시킨다.

배양 후 공지의 방법으로 균체를 모아 예를 들면 완충액에 현탁한 후, 예를들면 단백변성제 처리, 초음파 처리나 리소자임 등의 효소 처리, 유리비즈(glass beads) 처리, 프렌치 프레스 처리, 동결융해 처리 등을 행하여 균체를 파쇄하고, 원심분리 등 공지의 방법에 의해 봉입체(inclusion body) 또는 가용체(상청)를 취득하지만 봉입체로서 취득하는 것이 바람직하다.

상기에 의해 얻어진 봉입체는 변성제를 사용해 가용화하여 다음의 반응공정을 진행시켜도 된다. 상청으로부터 재조합형 전구체 단백질을 단리하기 위해서는 통상 알려져 있는 단백질의 정제법을 따르면 된다. 예를 들면, 겔 여과법, 이온교환 크로마토그래피, 흡착 크로마토그래피, 고속액체 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 소수 크로마토그래피, 전기영동 등을 적절하게 조합하여 행할 수 있다. 또한, 상기 전구체 단백질은 정제하지 않고, 또는 부분정제 상태로 다음의 반응공정을 진행시켜도 된다.

상기와 같이 하여 얻어진 재조합형 전구체 단백질 중의 각 목적 펩티드의 N 말단쪽의 절단 반응에는 브롬시안 또는 단백질 분해효소 등이 사용된다.

단백질 분해효소로서는 단백질 분해효소로서 알려져 있는 것이라면 어떤 것이어도 되지만, 예를 들면 엔테로키나아제, 팩터 Xa, 트롬빈 등이 바람직하고, 특히 엔테로키나아제나 팩터 Xa 등이 바람직하게 사용된다.

재조합형 폴리펩티드 1 mg당 단백질 분해효소의 사용량은 통상 약 0.01유닛~약 100유닛, 바람직하게는 약 0.1유닛~약 10유닛이다.

상기 절단 반응에 브롬시안을 사용하는 경우, 재조합형 전구체 단백질 중의 목적 펩티드의 N 말단에 브롬시안 절단 사이트인 메티오닌 잔기를 연결한다. 또한,이 경우 목적 펩티드는 메티오닌 잔기를 갖지 않는 것인 것이 바람직하다.

단백질 분해효소로서 엔테로키나아제를 사용하는 경우에는 재조합형 전구체 단백질 중의 목적 펩티드의 N 말단에 엔테로키나아제 절단 사이트를 나타내는 서열(Asp-Asp-Asp-Asp-Lys; 서열번호: 54) 등을 연결한다. 또한, 이 경우, 목적 펩티드는 Asp-Asp-Asp-Asp-Lys 등으로 표시되는 아미노산 서열을 갖지 않는 것인 것이 바람직하다.

단백질 분해효소로서 팩터 Xa를 사용하는 경우에는 재조합형 전구체 단백질 중의 목적 펩티드의 N 말단에 팩터 Xa 절단 사이트를 나타내는 서열(Ile-Glu-Gly-Arg; 서열번호: 56) 등을 연결한다. 또한, 이 경우, 목적 펩티드는 Ile-Glu-Gly-Arg 등으로 표시되는 아미노산 서열을 갖지 않는 것인 것이 바람직하다.

단백질 분해효소로서 트롬빈을 사용하는 경우에는 재조합형 전구체 단백질 중의 목적 펩티드의 N 말단에 트롬빈 절단 사이트를 나타내는 서열(Gly-Pro-Arg; 서열번호: 58) 등을 연결한다. 또한, 이 경우, 목적 펩티드는 Gly-Pro-Arg 등으로 표시되는 아미노산 서열을 갖지 않는 것인 것이 바람직하다.

단백질 분해효소에 의한 펩티드 결합의 절단 반응의 반응온도는 통상 약 0℃~약 60℃이고, 바람직하게는 약 0℃~약 40℃이다.

사용하는 용매로서는 특별히 한정되지는 않지만, 예를 들면 트리스-염산 완충액, 트리스-초산 완충액, 인산 완충액, 붕산 완충액 등을 들 수 있다.

상기 반응에 있어서의 pH는 통상 약 1~약 12, 바람직하게는 약 4~약 8이다.

재조합형 전구체 단백질 중의 목적 펩티드의 C 말단쪽의 절단 반응은 예를들면, EP887417에 기재되어 있는 방법을 사용하여 행할 수 있다. 즉, 재조합형 전구체 단백질 중의 목적 펩티드의 C 말단쪽 시스테인의 N 말단쪽에서 절단 반응으로 처리한다.

상기 절단 반응으로서는 예를 들면, S-시아노화 반응에 이어서 가수분해 반응을 들 수 있다. 목적 펩티드의 아미드 또는 그 염을 최종물로서 얻는 경우에는 상기 절단 반응으로서는 예를 들면, S-시아노화 반응에 이어서 암모놀리시스를 행하는 것을 들 수 있다. 상기 S-시아노화 반응은 원료화합물에 S-시아노화 시약을 작용시킴으로써 행한다.

S-시아노화 시약으로서는 예를 들면, 2-니트로-5-티오시아노 안식향산(NTCB), 1-시아노-4-디메틸아미노피리듐염(DMAP-CN), CN^-이온 등을 들 수 있다.

상기 S-시아노화 시약의 양은 몰수가 전체 티올기의 약 2배~50배량이면 되고, 바람직하게는 약 5배~10배량이다.

반응온도는 약 0℃~80℃의 범위라면 모두 되고, 약 0℃~50℃의 범위가 보다 바람직하다. 사용하는 용매로서는 S-시아노화 시약과 반응하지 않는 것이라면 어떤 완충액이어도 되지만, 예를 들면 트리스-염산 완충액, 트리스-초산 완충액, 인산 완충액, 붕산 완충액 등을 들 수 있다. 또한, 유기용매는 S-시아노화 시약과 반응하지 않는 것이라면 존재하고 있어도 된다.

상기 반응은 pH 1~12의 범위에서 행하는 것이 좋다. 특히, NTCB를 사용하는경우에는 pH 7~10, DMAP-CN을 사용하는 경우에는 S-S교환 반응을 방지하기 위해 pH 2~7의 범위가 바람직하다. 또한, 반응액 중에는 염산구아니딘 등의 변성제가 존재하고 있어도 된다.

상기 암모놀리시스 또는 가수분해 반응으로서는 예를 들면 알칼리 처리를 취하는 것을 들 수 있다.

상기 알칼리 처리로서는 원료화합물을 함유하는 수용액의 pH를 7~14로 조정함으로써 행해진다.

상기 pH의 조정은 예를 들면 암모니아, 수산화나트륨, 아미노화합물, 트리즈마 베이스(Trizma Base)(트리스[히드록시메틸]-아미노메탄), 인산제2나트륨, 수산화칼륨, 수산화바륨 등의 용액을 원료화합물을 함유하는 수용액에 적당량 가하여 행하지만, 특히 암모니아 등이 바람직하다.

상기 반응시 용액의 농도로서는 예를 들면 암모니아 또는 아미노화합물의 경우는 약 0.01~15 N, 바람직하게는 약 0.1~3 N, 수산화나트륨의 경우는 약 0.01~2 N, 바람직하게는 약 0.05~1 N, 트리즈마 베이스의 경우는 약 1 mM~1 M, 바람직하게는 약 20 mM~200 mM, 인산제2나트륨의 경우는 약 1 mM~1 M, 바람직하게는 약 10 mM~100 mM, 수산화칼륨의 경우는 약 0.01~4 N, 바람직하게는 약 0.1~2 N을 들 수 있다. 반응온도는 약 -20℃~80℃의 범위라면 모두 되고, 약 -10℃~50℃의 범위가 보다 바람직하다.

반응시간은 바람직하게는, S-시아노화 반응은 약 1~60분, 바람직하게는 약 15~30분을, 가수분해 반응은 약 5분~100시간, 바람직하게는 10분~15시간을, 암모놀리시스는 약 5분~24시간, 바람직하게는 약 10~180분을 들 수 있다.

상기 아미노화합물로서는 예를 들면, 식 R¹-(NR²)-H(식중, R¹및 R²는 동일하거나 상이하고, (i) 수소원자, (ii) C_1-20알킬기, C_3-6시클로알킬기, C_6-14아릴(aryl)기 또는 C_6-14아릴-C_1-3알킬기(이들은 치환기를 갖고 있지 않거나 또는 1~3개의 아미노기, 수산기 등을 탄소원자 상에 갖고 있어도 된다), (iii) 치환되어 있어도 되는 아미노기, (iv) 수산기 또는 C_1-6알콕시기를 나타낸다.)로 표시되는 화합물 등을 들 수 있다.

상기 절단 반응에 의해 절단되는 목적 펩티드를 단리하기 위해서는 통상 알려져 있는 펩티드의 정제법을 따르면 된다. 예를 들면, 겔 여과법, 이온교환 크로마토그래피, 고속액체 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 소수 크로마토그래피, 박층 크로마토그래피, 전기영동 등을 적절히 조합하여 행할 수 있다.

또한, 상기 목적 펩티드는 필요에 따라 이것을 동결건조에 의해 분말로 하는 것도 가능하다. 동결건조시에는 소르비톨, 만니톨, 덱스트로스, 말토스, 트레할로스, 글리세롤 등의 안정화제를 가하는 것이 가능하다.

본 발명의 제조법으로 얻어진 목적 펩티드의 C 말단은 아미드(-CONH₂), 카르복실기(-COOH), 카르복실레이트(-COO^-), 알킬아미드(-CONHR) 또는 에스테르(-COOR)이어도 된다. 에스테르 또는 알킬아미드의 R로서는 예를 들면, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필 또는 n-부틸 등의 C_1-6알킬기, 시클로펜틸, 시클로헥실 등의 C_3-8시클로알킬기, 페닐, α-나프틸 등의 C_6-12아릴기, 벤질, 펜에틸, 벤즈히드릴 등의 페닐-C_1-2알킬 또는 α-나프틸메틸 등의 α-나프틸-C_1-2알킬 등의 C_7-14아랄킬기 외에 경구용 에스테르로서 범용되는 피발로일옥시메틸기 등을 들 수 있다.

본 발명의 제조법으로 얻어진 목적 펩티드, 그 아미드, 그 에스테르 또는 그 염은 멸균수, 인간 혈청 알부민(HSA), 생리식염수, 기타 공지의 생리학적으로 허용되는 담체와 혼합할 수 있고, 안전한 의약으로서 포유동물(예, 인간, 원숭이, 소, 말, 양, 돼지, 랫트, 마우스, 모르모트 등)에 대해 비경구적으로 또는 국소에 투여할 수 있다. 예를 들면, 그 1일 투여량은 1인당 약 0.01 mg~약 50 mg, 바람직하게는 약 0.1 mg~약 10 mg을 정맥주사 또는 근육주사 등에 의해 비경구적으로 투여할 수 있다.

본 발명의 목적 펩티드를 함유하는 제제는 염, 희석제, 아주반트, 다른 담체, 완충제, 결합제, 계면활성제, 보존제와 같은 생리적으로 허용되는 다른 활성성분도 함유하고 있어도 된다. 비경구적 투여제제는 멸균수용액 또는 생리학적으로 허용되는 용매와의 현탁액 앰플, 또는 생리학적으로 허용되는 희석액으로 사용시 희석하여 사용할 수 있는 멸균분말(통상 펩티드 용액을 동결건조하여 얻어진다) 앰플로서 제공된다.

본 명세서 및 도면에 있어서 아미노산, 펩티드, 보호기, 활성기, 그 밖에 약호로 표시하는 경우, 그들은 IUPAC-IUB(Commission on Biochemical Nomenclature)에 의한 약호 또는 해당 분야에 있어서의 관용 약호를 토대로 하는 것으로 그 예를 다음에 든다. 또한, 아미노산 등에 관하여 광학이성체가 있을 수 있는 경우는 특별히 명시하지 않으면 L체를 나타내는 것으로 한다.

DNA : 데옥시리보핵산

A : 아데닌

T : 티민

G : 구아닌

C : 시토신

RNA : 리보핵산

EDTA : 에틸렌디아민사초산

Gly : 글리신

Ala : 알라닌

Val : 발린

Leu : 류신

Ile : 이소류신

Ser : 세린

Thr : 트레오닌

Met : 메티오닌

Glu : 글루타민산

Asp : 아스파라긴산

Lys : 리신

Arg : 아르기닌

His : 히스티딘

Phe : 페닐알라닌

Tyr : 티로신

Trp : 트립토판

Pro : 프롤린

Asn : 아스파라긴

Gln : 글루타민

ATP : 아데노신삼인산

T7P : T7 프로모터

T7T : T7 터미네이터

본 발명 명세서의 서열번호는 이하의 것을 나타낸다.

[서열번호: 1]

인간 KiSS-1 펩티드의 아미노산 서열을 나타낸다.

[서열번호: 2]

인간 KiSS-1(45-54) 펩티드의 아미노산 서열을 나타낸다.

[서열번호: 3]

서열번호: 1로 표시되는 인간 KiSS-1 펩티드를 코드하는 DNA의 염기서열을나타낸다.

[서열번호: 4]

서열번호: 2로 표시되는 인간 KiSS-1(45-54) 펩티드를 코드하는 DNA의 염기서열을 나타낸다.

[서열번호: 5]

인간 KiSS-1(45-54) 펩티드의 전구체 단백질을 코드하는 DNA를 함유하는 DNA의 염기서열을 나타낸다.

[서열번호: 6]

9 아미노산 잔기로 된 RFRP-1의 아미노산 서열을 나타낸다.

[서열번호: 7]

12 아미노산 잔기로 된 RFRP-1의 아미노산 서열을 나타낸다.

[서열번호: 8]

20 아미노산 잔기로 된 RFRP-1의 아미노산 서열을 나타낸다.

[서열번호: 9]

37 아미노산 잔기로 된 RFRP-1의 아미노산 서열을 나타낸다.

[서열번호: 10]

9 아미노산 잔기로 된 RFRP-1의 아미노산 서열을 나타낸다.

[서열번호: 11]

17 아미노산 잔기로 된 RFRP-1의 아미노산 서열을 나타낸다.

[서열번호: 12]

서열번호: 6의 아미노산 서열로 표시되는 폴리펩티드를 코드하는 DNA의 염기서열을 나타낸다.

[서열번호: 13]

서열번호: 7의 아미노산 서열로 표시되는 폴리펩티드를 코드하는 DNA의 염기서열을 나타낸다.

[서열번호: 14]

서열번호: 8의 아미노산 서열로 표시되는 폴리펩티드를 코드하는 DNA의 염기서열을 나타낸다.

[서열번호: 15]

서열번호: 9의 아미노산 서열로 표시되는 폴리펩티드를 코드하는 DNA의 염기서열을 나타낸다.

[서열번호: 16]

서열번호: 10의 아미노산 서열로 표시되는 폴리펩티드를 코드하는 DNA의 염기서열을 나타낸다.

[서열번호: 17]

서열번호: 11의 아미노산 서열로 표시되는 폴리펩티드를 코드하는 DNA의 염기서열을 나타낸다.

[서열번호: 18]

아펠린-36의 아미노산 서열을 나타낸다.

[서열번호: 19]

아펠린-36을 코드하는 DNA의 염기서열을 나타낸다.

[서열번호: 20]

소 PrRP의 아미노산 서열을 나타낸다.

[서열번호: 21]

랫트 PrRP의 아미노산 서열을 나타낸다.

[서열번호: 22]

인간 PrRP의 아미노산 서열을 나타낸다.

[서열번호: 23]

서열번호: 20, 서열번호: 21 또는 서열번호: 22로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 펩티드와 실질적으로 동일한 펩티드의 구체예를 나타낸다.

[서열번호: 24]

WO97/24436에 기재된 소 시상하부 유래 리간드 폴리펩티드를 정제하여 P-3 획분의 N 말단서열을 분석한 결과 얻어진 아미노산 서열을 나타낸다.

[서열번호: 25]

WO97/24436에 기재된 소 시상하부 유래 리간드 폴리펩티드를 정제하여 P-2 획분의 N 말단서열을 분석한 결과 얻어진 아미노산 서열을 나타낸다.

[서열번호: 26]

WO97/24436에 기재된 소 시상하부 유래 리간드 폴리펩티드의 아미노산 서열을 나타낸다.

[서열번호: 27]

[서열번호: 28]

[서열번호: 29]

[서열번호: 30]

[서열번호: 31]

[서열번호: 32]

WO97/24436에 기재된 랫트형 리간드 폴리펩티드의 아미노산 서열을 나타낸다.

[서열번호: 33]

[서열번호: 34]

[서열번호: 35]

[서열번호: 36]

[서열번호: 37]

[서열번호: 38]

WO97/24436에 기재된 인간형 리간드 폴리펩티드의 아미노산 서열을 나타낸다.

[서열번호: 39]

[서열번호: 40]

[서열번호: 41]

[서열번호: 42]

[서열번호: 43]

[서열번호: 44]

GPR8에 대한 리간드 폴리펩티드(인간형·1-23)의 아미노산 서열을 나타낸다.

[서열번호: 45]

GPR8에 대한 리간드 폴리펩티드(돼지형·1-23)의 아미노산 서열을 나타낸다.

[서열번호: 46]

GPR8에 대한 리간드 폴리펩티드(랫트·마우스형·1-23)의 아미노산 서열을 나타낸다.

[서열번호: 47]

GPR8에 대한 리간드 폴리펩티드(인간형·1-30)의 아미노산 서열을 나타낸다.

[서열번호: 48]

GPR8에 대한 리간드 폴리펩티드(돼지형·1-30)의 아미노산 서열을 나타낸다.

[서열번호: 49]

GPR8에 대한 리간드 폴리펩티드(랫트형·1-30)의 아미노산 서열을 나타낸다.

[서열번호: 50]

GPR8에 대한 리간드 폴리펩티드(마우스형·1-30)의 아미노산 서열을 나타낸다.

[서열번호: 51]

GPR8에 대한 리간드 폴리펩티드(인간형·1-23)를 코드하는 DNA의 염기서열을 나타낸다.

[서열번호: 52]

GPR8에 대한 리간드 폴리펩티드(돼지형·1-23)를 코드하는 cDNA의 염기서열을 나타낸다.

[서열번호: 53]

GPR8에 대한 리간드 폴리펩티드(랫트·마우스형·1-23)를 코드하는 DNA의 염기서열을 나타낸다.

[서열번호: 54]

GPR8에 대한 리간드 폴리펩티드(인간형·1-30)를 코드하는 DNA의 염기서열을 나타낸다.

[서열번호: 55]

GPR8에 대한 리간드 폴리펩티드(돼지형·1-30)를 코드하는 DNA의 염기서열을나타낸다.

[서열번호: 56]

GPR8에 대한 리간드 폴리펩티드(랫트형·1-30)를 코드하는 DNA의 염기서열을 나타낸다.

[서열번호: 57]

GPR8에 대한 리간드 폴리펩티드(마우스형·1-30)를 코드하는 DNA의 염기서열을 나타낸다.

[서열번호: 58]

엔테로키나아제 절단서열을 표시하는 아미노산 서열을 나타낸다.

[서열번호: 59]

엔테로키나아제 절단서열을 코드하는 DNA의 염기서열을 나타낸다.

[서열번호: 60]

팩터 Xa 절단서열을 표시하는 아미노산 서열을 나타낸다.

[서열번호: 61]

팩터 Xa 절단서열을 코드하는 DNA의 염기서열을 나타낸다.

[서열번호: 62]

트롬빈 절단서열을 표시하는 아미노산 서열을 나타낸다.

[서열번호: 63]

트롬빈 절단서열을 코드하는 DNA의 염기서열을 나타낸다.

[서열번호: 64]

인간 GPR8 리간드(서열번호: 44)의 전구체 단백질을 코드하는 DNA를 함유하는 DNA의 염기서열을 나타낸다.

[서열번호: 65]

실시예 1에 있어서 구조유전자의 제조에 사용한 DNA 올리고머의 염기서열을 나타낸다.

[서열번호: 66]

[서열번호: 67]

[서열번호: 68]

[서열번호: 69]

[서열번호: 70]

[서열번호: 71]

[서열번호: 72]

[서열번호: 73]

[서열번호: 74]

이하의 실시예 1에서 얻어진 형질전환체 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) MM294(DE3)/pTCGPR3은 2002년 4월 17일부터 이바라키켄 쯔쿠바시 히가시 1-1-1 츄오 제6(우편번호 305-8566)의 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터에 기탁번호 FERM BP-8023으로서, 2002년 3월 14일부터 오사카후 오사카시 요도가와구 쥬우산본마치 2-17-85(우편번호 532-8686)의 재단법인 발효연구소(IFO)에 기탁번호 IFO 16773으로서 기탁되어 있다.

이하에 실시예를 나타내어 본 발명을 보다 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들에 한정되지는 않는다.

실시예 1

(a) 인간 GPR8 리간드(hGPR8L; 서열번호: 44)를 3회 직렬로 코드하는 유전자의 제조

이하에 나타내는 10종류의 DNA 단편(서열표 중, 서열번호: 65~74)을 사용하여 hGPR8L을 3회 직렬로 코드하는 구조유전자를 제조하였다.

#1

5'-TATGGATGACGATGACAAATGGTATAAACATGTGGCGAGCCCGCGTTATCATACCG

(서열번호: 65)

#2

5'-GCGCGGCCCACGGTATGATAACGCGGGCTCGCCACATGTTTATACCATTTGTCATCGTCATCCA

(서열번호: 66)

#3

5'-TGGGCCGCGCGGCCGGTCTGCTGATGGGCCTGTGTCAATTGGGTTTGAACTTCTCTGTCTCCGC

CGCCGGAG(서열번호: 67)

#4

5'-GATCCTCCGGCGGCGGAGACAGAGAAGTTCAAACCCAATTGACACAGGCCCATCAGCAGACCGGCC

(서열번호: 68)

#5

5'-AATTGGGTGGTGATGACGATGACAAATGGTATAAACATGTGGCGAGCCCGCGTTATCATACCG

(서열번호: 69)

#6

5'-CGGCCCACGGTATGATAACGCGGGCTCGCCACATGTTTATACCATTTGTCATCGTCATCACCACCC

(서열번호: 70)

#7

5'-TGGGCCGCGCGGCCGGTCTGCTGATGGGCCTGTGTGAGCTCGGCTCTGACGACGATGATAAATGGT

AC(서열번호: 71)

#8

5'-CAACGTGTTTGTACCATTTATCATCGTCGTCAGAGCCGAGCTCACACAGGCCCATCAGCAGACCGG

CC(서열번호: 72)

#9

5'-AAACACGTTGCCTCCCCGCGCTACCACACGGTTGGTCGTGCCGCGGGCCTGCTGATGGGTCTGTGC

GGTTGAG(서열번호: 73)

#10

5'-GATCCTCAACCGCACAGACCCATCAGCAGGCCCGCGGCACGACCAACCGTGTGGTAGCGCGGGGAG

G(서열번호: 74)

#2 및 #3의 DNA 올리고머 각각을 25 ㎕의 인산화 반응액[DNA 올리고머 10㎍, 50 mM Tris-HCl, pH 7.6, 10 mM MgCl₂, 1 mM 스페르미딘(spermidine), 10 mM 디티오스레이톨(dithiothreitol, 이후 DTT로 약기), 0.1 mg/ml 소 혈청 알부민(이후 BSA로 약기), 1 mM ATP, 10유닛 T4 폴리뉴클레오티드키나아제(다카라주조)] 중 37℃에서 1시간 반응시켜 각 올리고머의 5'말단을 인산화하였다. 페놀 처리한 후 2배량의 에탄올을 가하여 -70℃로 냉각한 후 원심으로 DNA를 침전시켰다.

상기에서 얻어진 DNA 단편과 #1 및 #4를 합하여 120 ㎕로 하였다. 이 혼합액을 90℃에서 10분간 유지한 후, 실온까지 천천히 냉각하여 어닐링을 행한 후, TaKaRa DNA Ligation Kit ver.2(다카라주조)를 사용하여 라이게이션 반응을 행하였다. 어닐링액 30 ㎕에 Ⅱ액 30 ㎕를 가하여 잘 혼합한 후 I액 60 ㎕를 가해 16℃에서 1시간 반응시켜 라이게이션하였다. 페놀 처리한 후 수층을 회수하여 2배량의 에탄올을 가하고, -70℃로 냉각한 후 원심으로 DNA를 침전시켰다. 이와 같이 하여 얻어진 DNA 단편을 T4 폴리뉴클레오티드키나아제(다카라주조)에 의한 인산화를 행하여 구조유전자를 작성하였다.

발현용 벡터로서는 pTCⅡ(WO00/20643)을 NdeI 및 BamHI(다카라주조)로 37℃에서 4시간 소화한 후 1% 아가로스 겔 전기영동에 의해 4.4 kb의 DNA 단편을 QIAquick Gel Extraction Kit(퀴아겐사)를 사용해 추출하여 25 ㎕의 TE 완충액에 용해하였다. 이 pTCⅡ의 NdeI, BamHI 단편과 상기에 의해 제조한 구조유전자를 TaKaRa DNA ligation kit ver.2(다카라주조)를 사용하여 라이게이션 반응을 행하였다. 이 반응액 10 ㎕를 사용하여 대장균 JM109 콤피턴트 셀(competent cell, 도요보)로 형질전환하고, 10 ㎍/ml의 테트라사이클린을 포함하는 LB 한천배지 상에 뿌려 37℃에서 하룻밤 배양하여 생성된 테트라사이클린 내성 콜로니를 선택하였다. 이 형질전환체를 LB 배지에서 하룻밤 배양하고, QIAprep8 Miniprep Kit(퀴아겐사)를 사용하여 플라스미드 pTCGPR1을 조제하였다. 이 pTCGPR1을 MunI 및 BamHI(다카라주조)로 37℃에서 4시간 소화한 후 1% 아가로스 겔 전기영동에 의해 4.5 kb의 DNA 단편을 QIAquick Gel Extraction Kit(퀴아겐사)를 사용해 추출하여 25 ㎕의 TE 완충액에 용해하였다.

#6, #7, #8, #9의 DNA 올리고머 각각을 25 ㎕의 인산화 반응액[DNA 올리고머 10 ㎍, 50 mM Tris-HCl, pH 7.6, 10 mM MgCl₂, 1 mM 스페르미딘, 10 mM DTT, 0.1 mg/ml BSA, 1 mM ATP, 10유닛 T4 폴리뉴클레오티드키나아제(다카라주조)] 중 37℃에서 1시간 반응시켜 각 올리고머의 5' 말단을 인산화하였다. 페놀 처리한 후 2배량의 에탄올을 가하여 -70℃로 냉각한 후 원심으로 DNA를 침전시켰다. 이 DNA 단편과 #5 및 #10을 합하여 120 ㎕로 하였다. 이 혼합액을 90℃에서 10분간 유지한 후, 실온까지 천천히 냉각하여 어닐링을 행한 후, TaKaRa DNA Ligation Kit ver.2(다카라주조)를 사용하여 라이게이션 반응을 행하였다. 어닐링액 30 ㎕에 Ⅱ액 30 ㎕를 가하여 잘 혼합한 후 I액 60 ㎕를 가해 37℃에서 1시간 반응시켜 라이게이션하였다. 페놀 처리한 후 수층을 회수하여 2배량의 에탄올을 가하고, -70℃로 냉각한 후 원심으로 DNA를 침전시켰다. 이와 같이 하여 얻어진 DNA 단편을 T4 폴리뉴클레오티드키나아제(다카라주조)에 의한 인산화를 행하였다. 이 구조유전자 부분과 pCTGPR1의 MunI, BamHI 단편을 TaKaRa DNA ligation kit ver.2(다카라주조)를 사용하여 라이게이션 반응을 행하였다. 이 반응액을 10 ㎕ 사용하여 대장균 JM109 콤피턴트 셀(도요보)로 형질전환하고, 10 ㎍/ml의 테트라사이클린을 포함하는 LB 한전배지 상에 뿌려 37℃에서 하룻밤 배양하여 생성된 테트라사이클린 내성 콜로니를 선택하였다. 이 형질전환체를 LB 배지에서 하룻밤 배양하고, QIAprep8 Miniprep Kit(퀴아겐사)를 사용하여 플라스미드 pTCGPR3을 조제하였다. 이 pTCGPR3의 전구체 단백질 구조유전자 부분의 염기서열을 어플라이드 바이오시스템즈사 모델 377 DNA 시퀀서를 사용하여 확인하였다. 플라스미드 pTCGPR3을 대장균 MM294(DE3)에 형질전환하여 전구체 단백질의 발현주 MM294(DE3)/pTCGPR3을 얻었다.

(b) 전구체 단백질의 제조

MM294(DE3)/pTCGPR3을 10 mg/L의 테트라사이클린을 포함하는 LB 배지에 30 ml(1% 펩톤, 0.5% 효모추출물, 0.5% 염화나트륨)를 사용하여 200 ml 용량의 플라스크 중에서 37℃에서 8시간 진탕 배양하였다. 얻어진 배양액 15 ml를 300 ml의 주발효배지(1.68% 인산1수소나트륨, 0.3% 인산2수소칼륨, 0.1% 염화암모늄, 0.05% 염화나트륨, 0.025% 황산마그네슘, 0.00025% 염산티아민, 1.5% 포도당, 1.5% 카사미노산(casamino acid))를 채운 1000 ml 용량의 플라스크에 이식하여 37℃에서 진탕 배양을 개시하였다. 배양액의 혼탁도가 150클렛(Klett) 단위가 되었을 때 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드의 최종농도가 10 mg/L이 되도록 첨가하고 추가로 3시간 배양하였다. 배양종료 후 배양액(300 ml)을 원심분리하여 약 2 g의습균체(濕菌體)를 취득하였다.

실시예 2

실시예 1에서 얻은 균체 2 g에 10 mM EDTA(pH 6.0) 10 ml를 가하여 초음파 처리(BRANSON SONIFIER MODEL450)한 후 원심분리(15000 rpm, 15분)하였다. 침전물에 다시 동일한 조작을 행하였다. 침전물에 7 M 구아니딘용액 5 ml(pH 5.0)를 가하여 2시간 교반한 후 원심분리(15000 rpm, 15분)하였다. 상청액에 트리스(2-카르복시에틸)-포스핀 하이드로클로라이드(TCEP-HCl) 17 mg을 첨가하여 50℃에서 10분간 환원 처리한 후 0.1% TFA로 평형화한 C4P-50(1 cm×25 cm, 쇼와덴코)에 액을 통과시켜 흡착, 세척한 후 20-60% B(B: 80% 아세토니트릴/0.1% 트리플루오로초산)의 단계 구배(勾配)를 2 ml/분의 유속으로 용출하여 전구체 단백질 획분(용출시간 약 27분)을 모은 후 동결건조하여 전구체 단백질의 동결건조 분말을 얻었다.

실시예 3

실시예 2에서 얻은 전구체 동결건조 분말을 0.1 M 초산, 6 M 요소용액 1 ml로 용해한 후 DMAP-CN을 3.5 mg 첨가하여 25℃에서 15분간 반응시켰다. 반응종료 후 0.1% TFA로 평형화한 C4P-50(1 cm×25 cm, 쇼와덴코)에 액을 통과시켜 흡착, 세척한 후 20-60% B(B: 80% 아세토니트릴/0.1% 트리플루오로초산)의 단계 구배를 2 ml/분의 유속으로 용출하여 S-시아노화된 전구체 단백질 획분(용출시간 약 27분)을 모은 후 동결건조하여 S-시아노화된 전구체 단백질의 동결건조 분말을 얻었다. 이동결건조 분말을 6 M 요소 0.8 ml로 용해한 후 1 N 가성소다용액 0.2 ml를 첨가하여 0℃에서 15분간 반응시켰다. 반응종료 후 초산으로 pH 7.4로 조제하였다. 이 절단 반응액에 9 ml의 50 mM NaCl, 2 mM CaCl₂, 20 mM 트리스/HCl(pH 7.4) 용액을 가한 후 엔테로키나아제(Novagen사) 10단위를 가하여 25℃에서 20시간 반응시켰다. 반응종료 후 0.1% 트리플루오로초산으로 평형화한 C4P-50(1 cm×25 cm, 쇼와덴코)에 액을 통과시켜 흡착, 세척한 후 20-60% B(B: 80% 아세토니트릴/0.1% 트리플루오로초산)의 단계 구배를 2 ml/분의 유속으로 용출하여 hGPR8L 획분(용출시간 약 22분)을 모은 후 동결건조하여 hGPR8L 동결건조 분말 약 70 ㎍을 얻었다.

실시예 4 (hGPR8L의 특징 결정)

a) N 말단 아미노산 서열 분석

N 말단 아미노산 서열을 기상(氣相) 프로테인 시퀀서(PE 어플라이드 바이오시스템즈 모델 491)를 사용하여 결정하였다. 그 결과, hGPR8L의 DNA 염기서열로부터 예상되는 N 말단 아미노산 서열과 일치하였다(표 1).

1) 페닐티오히단토인

b) 질량분석

얻어진 hGPR8L의 질량을 분석하여 측정한 결과 2583.7 Da(이론값: 2584.0)이 되었다.

c) 활성

WO01/98494호의 실시예 6과 동일한 방법을 사용하여 GPR8 발현 CHO세포의 막획분을 사용한 GTPγS 결합활성을 측정하여 화학합성품과 동등함을 확인하였다.

실시예 5 대장균에서의 KiSS-1 펩티드 전구체 단백질 발현 플라스미드의 구축

서열번호: 1로 표시되는 아미노산 서열의 35번째부터 54번째에 상당하는 KiSS-1(35-54) 펩티드의 전구체 단백발현 플라스미드는 하기와 같이 구축한다.

실시예 1에 기재한 방법과 동일하게 10종류의 DNA 단편을 사용하여 KiSS-1(35-54) 펩티드를 3회 직렬로 코드하는 구조유전자를 조제한다. 이 구조유전자를 pTCⅡ 벡터의 NdeI 및 BamHI 단편과 상기의 구조유전자를 TaKaRa DNA ligation kit ver.2(다카라주조)를 사용하여 라이게이션 반응을 행한다. 이 반응액 10 ㎕를 사용하여 대장균 JM109 콤피턴트 셀(도요보)을 형질전환하고, 10 ㎍/ml의 테트라사이클린을 포함하는 LB 한천배지 상에 뿌려 37℃에서 하룻밤 배양하여 생성된 테트라사이클린 내성 콜로니를 선택한다. 이 형질전환체를 LB 배지에서 하룻밤 배양하고, QIAprep8 Miniprep Kit(퀴아겐사)를 사용하여 플라스미드 pTCKiSS3554를 조제한다. 이 폴리펩티드 DNA의 염기서열을 어플라이드 바이오시스템즈사 모델 377 DNA 시퀀서를 사용하여 확인하다. 플라스미드 pTCKiSS 3554를 대장균(에스케리키아 콜라이) MM294(DE3)에 형질전환하여 전구체 단백질 발현주 에스케리키아 콜라이 MM294 (DE3)/pTCKiSS3554를 얻는다.

실시예 6 전구체 단백질의 제조

실시예 5의 에스케리키아 콜라이 MM294(DE3)/pTCKiSS3554를 5.0 mg/L의 테트라사이클린을 포함하는 LB 배지·1 L(1% 펩톤, 0.5% 효모추출물, 0.5% 염화나트륨)를 사용하여 2 L 용량의 플라스크 중에서 37℃에서 8시간 진탕 배양하였다. 얻어진 배양액을 19 L의 주발효배지(1.68% 인산1수소나트륨, 0.3% 인산2수소칼륨, 0.1% 염화암모늄, 0.05% 염화나트륨, 0.05% 황산마그네슘, 0.02% 소포제, 0.00025% 황산제1철, 0.0005% 염산티아민, 1.5% 포도당, 1.5% 하이케이스아미노(Hy-Case Amino, 상품명))를 채운 50 L 용량의 발효조에 이식하여 30℃에서 통기교반을 개시한다. 배양액의 혼탁도가 500클렛 단위가 되었을 때 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드의 최종농도가 10 mg/L이 되도록 첨가하고 추가로 4시간 배양한다. 배양종료 후 배양액을 원심분리해 습균체를 취득하여 -80℃에서 보존한다.

실시예 7 KiSS-1(35-54)의 취득

실시예 6에서 얻어지는 균체 100 g에 10 mM EDTA(pH 6) 200 ml를 가하여 초음파 처리(BRANSON SONIFIER MODEL 450)한 후 원심분리(10000 rpm, 60분)한다. 침전물에 다시 동일한 조작을 행한다. 침전물에 0.1 M 초산, 8 M 요소용액 50 ml를 가하여 2시간 교반하고 원심분리(10000 rpm, 60분)한다. 상청액에 1-시아노-4-디메틸아미노피리디늄염(DMAP-CN) 200 mg을 가하여 실온에서 15분간 반응시킨다. 반응종료 후 반응액을 10% 초산으로 평형화한 Sephadex G-25 칼럼(48 mmID×600 mmL, 파르마시아)에 액을 통과시키고 평형화에 사용한 10% 초산을 6 ml/분의 유속으로 전개하여 S-시아노화된 폴리펩티드를 얻는다. 이 용출액을 펠리콘 미니 카세트(Pellicon Mini Cassette, 밀리포어사)로 농축·탈염을 행하여 최종농도 6 M이 되도록 요소를 첨가하고, 추가로 3 M 농도가 되도록 25% 암모니아수를 가하여 15℃에서 15분간 반응시킨다. 반응종료 후 초산으로 pH 6.0으로 조정한다. 이 반응액을 0.1% 트리플루오로초산(TFA)으로 평형화한 ODS-120T(21.5 mm×300 mm, 토소)에 액을 통과시켜 흡착, 세척한 후 20-60% B(B: 80% 아세토니트릴/0.1% TFA)의 단계 구배에서 용출을 행하여 C 말단이 아미드화된 펩티드 획분을 모으고, 이 획분을 동결건조하여 펩티드의 동결건조 분말을 얻는다. 이 펩티드를 10 ml의 70% 포름산용액으로 용해하고 브롬시안 10 mg을 첨가하여 24시간 실온에서 반응시킨다. 반응종료 후 0.1% 트리플루오로초산(TFA)으로 평형화한 ODS-120T(21.5 mm×300 mm, 토소)에 액을 통과시켜 흡착, 세척한 후 20-60% B(B: 80% 아세토니트릴/0.1% TFA)의 단계 구배에서 용출하여 KiSS-1(35-54) 획분을 모으고 동결건조하여 KiSS-1(35-54)의 동결건조 분말을 얻는다.

실시예 8 KiSS-1(45-54)의 제조

실시예 1에 기재된 방법에 따라 서열번호: 1로 표시되는 아미노산 서열의 45번째부터 54번째에 상당하는 KiSS-1(45-54) 펩티드의 전구체 단백발현 플라스미드 pTCKiSS4554를 구축한다. 이 플라스미드는 KiSS-1(45-54)을 9회 직렬로 코드하는 구조유전자를 갖는다. 플라스미드 pTCKiSS4554를 대장균(에스케리키아 콜라이) MM294(DE3)에 형질전환하여 전구체 단백질 발현주 에스케리키아 콜라이 MM294(DE3)/pTCKiSS4554를 얻는다. 이 발현주의 배양을 행하고, 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드에 의한 발현유도 후의 균체로부터 실시예 6과 동일하게 하여KiSS-1(45-54)을 얻는다.

Claims

목적 펩티드의 N 말단 및 C 말단에 효소 또는 화학적인 절단 사이트를 부가하여 반복 연결한 전구체 단백질을 효소 또는 화학적으로 절단하는 것을 특징으로 하는 목적 펩티드 또는 그 염의 제조법.
제1항에 있어서, 목적 펩티드의 N 말단에 효소 또는 화학적인 절단 사이트를, C 말단에 화학적인 절단 사이트를 부가하여 반복 연결한 전구체 단백질을 효소 또는 화학적으로 절단하는 것을 특징으로 하는 제조법.
목적 펩티드의 N 말단쪽에 메티오닌 잔기 또는 단백질 분해효소 절단서열을, C 말단쪽에 시스테인 잔기 또는 시스테이닐 펩티드(단, 시스테이닐 펩티드의 펩티드 부분은 목적 펩티드와 상이하고, 또한 N 말단쪽에 메티오닌 잔기를 부가하는 경우 펩티드 부분은 메티오닌 잔기를 갖지 않는다)를 부가하여 반복 연결한 전구체 단백질 중의 각 목적 펩티드의 N 말단쪽을 브롬시안 또는 단백질 분해효소로 절단하고, C 말단쪽의 시스테인 또는 시스테이닐 펩티드의 N 말단쪽에서 절단 반응으로 처리하는 것을 특징으로 하는 목적 펩티드 또는 그 염의 제조법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 전구체 단백질이 재조합형 전구체 단백질인 제조법.
제3항에 있어서, 절단 반응이 S-시아노화 반응, 이어서 암모놀리시스 또는 가수분해 반응으로 처리하는 반응인 제조법.
제5항에 있어서, S-시아노화 반응을 2-니트로-5-티오시아노안식향산(NTCB), 1-시아노-4-디메틸아미노피리듐염(DMAP-CN) 또는 CN^-이온의 존재하에서 행하는 제조법.
제3항에 있어서, 단백질 분해효소가 엔테로키나아제, 팩터 Xa 또는 트롬빈인 제조법.
제3항에 있어서,

(1) 브롬시안을 사용하는 경우, 각 목적 펩티드의 N 말단에 메티오닌 잔기를 연결하고 목적 펩티드가 메티오닌 잔기를 갖지 않고,

(2) 단백질 분해효소가 엔테로키나아제인 경우, 각 목적 펩티드의 N 말단에 Asp-Asp-Asp-Asp-Lys를 연결하고 목적 펩티드가 Asp-Asp-Asp-Asp-Lys로 표시되는 아미노산 서열을 갖지 않으며,

(3) 단백질 분해효소가 팩터 Xa인 경우, 각 목적 펩티드의 N 말단에 Ile-Glu-Gly-Arg를 연결하고 목적 펩티드가 Ile-Glu-Gly-Arg로 표시되는 아미노산 서열을 갖지 않고,

(4) 단백질 분해효소가 트롬빈인 경우, 각 목적 펩티드의 N 말단에 Gly-Pro-Arg를 연결하고 목적 펩티드가 Gly-Pro-Arg로 표시되는 아미노산 서열을 갖지 않는 제조법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 목적 펩티드가 KiSS-1 펩티드인 제조법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 목적 펩티드가 GPR8 리간드인 제조법.
GPR8 리간드의 N 말단쪽에 엔테로키나아제 절단서열을, C 말단쪽에 시스테인 잔기를 부가하여 3회 반복해 연결한 전구체 단백질 중의 각 GPR8 리간드의 N 말단쪽을 엔테로키나아제로 절단하고, C 말단쪽의 시스테인의 N 말단쪽에서 절단 반응으로 처리하는 것을 특징으로 하는 GPR8 리간드 또는 그 염의 제조법.
제10항 또는 제11항에 있어서, GPR8 리간드가 서열번호: 44로 표시되는 아미노산 서열과 동일하거나 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩티드인 제조법.
제10항 또는 제11항에 있어서, GPR8 리간드가 서열번호: 44, 서열번호: 45, 서열번호: 46, 서열번호: 47, 서열번호: 48, 서열번호: 49 또는 서열번호: 50으로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드인 제조법.
제10항 또는 제11항에 있어서, GPR8 리간드가 서열번호: 44로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드인 제조법.
목적 펩티드의 N 말단쪽에 메티오닌 잔기 또는 단백질 분해효소 절단서열을, C 말단쪽에 시스테인 잔기 또는 시스테이닐 펩티드(단, 시스테이닐 펩티드의 펩티드 부분은 목적 펩티드와 상이하고, 또한 N 말단쪽에 메티오닌 잔기를 부가하는 경우 펩티드 부분은 메티오닌 잔기를 갖지 않는다)를 부가하여 반복 연결한 전구체 단백질을 코드하는 DNA를 함유하는 DNA.
제15항의 DNA를 함유하는 재조합 벡터.
제16항에 있어서, FERM BP-8023으로 표시되는 형질전환체: 에스케리키아 콜라이 MM294(DE3)/pTCGPR3에 보유되는 재조합 벡터.
제16항의 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체.
제18항에 있어서, FERM BP-8023으로 표시되는 형질전환체: 에스케리키아 콜라이 MM294(DE3)/pTCGPR3인 형질전환체.
목적 펩티드의 N 말단쪽에 메티오닌 잔기 또는 단백질 분해효소 절단서열을, C 말단쪽에 시스테인 잔기 또는 시스테이닐 펩티드(단, 시스테이닐 펩티드의 펩티드 부분은 목적 펩티드와 상이하고, 또한 N 말단쪽에 메티오닌 잔기를 부가하는 경우 펩티드 부분은 메티오닌 잔기를 갖지 않는다)를 부가하여 반복 연결한 전구체 단백질 또는 그 염.
제4항에 있어서, 전구체 단백질이 제18항의 형질전환체를 배양하여 제조된 재조합형 전구체 단백질인 제조법.