KR20040025932A - 바이오센서 및 시간분해발광에 의하여 분석물을 검출하는방법 - Google Patents

바이오센서 및 시간분해발광에 의하여 분석물을 검출하는방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 일반적으로 분석물의 광학적인 검출을 위한 마이크로칩 형태의 바이오센서 및 상기 바이오센서의 사용하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 시간분해발광 측정에 의하여 분석물을 검출하기 위한 바이오센서 및 상응하는 방법에 관한 것이다.

Description

바이오센서 및 시간분해발광에 의하여 분석물을 검출하는 방법{Biosensor and Method for Detecting Analytes by Means of Time-Resolved Luminescence}
분석할 시료의 특정 물질, 예를 들어 생분자들 (biomolecules)의 존재를 정성적 및/또는 정량적으로 검출하기 위해 전문가들 사이에서 바이오센서 또는 바이오칩으로 기술되는 본질적으로 평편한 시스템 즉, 마이크로칩 형태의 바이오센서의 사용은 이미 공지되어 있다. 이 바이오칩들은 지지체를 포함하며, 상기 지지체의 표면은 대개 복수의 검출 필드로 구성되어 있으며 대부분이 매트릭스 배열을 하고 있고, 각각의 필드 또는 영역 (region) 및/또는 영역의 그룹 각각은 검출될 특정 분석물에 대해 특이성이 서로 다르다. DNA을 검출하고자 하는 경우에는, 특정 핵산 프로브 예컨대, 올리고뉴클레오티드 또는 cDNA로서 대부분이 단일 가닥 형태이고, 검출될 핵산에 대한 개개의 특이성이 필수적으로 그들의 서열 (프로브 디자인)에 의해 사전에 결정된 프로브가 상기 지지체 표면의 개별적인영역 안에 직접적으로 또는 간접적으로 고정되어 위치하게 된다. 이 방법으로 기능화된 마이크로칩 표면을 검출할 DNA 분석물을 포함하는 시료와 접촉시키며, 이것은 적절한 검출 방법에 따라 사전에 검출할 수 있는 표지화된 타겟 핵산(들)이 존재하는 상태에서 이것들이 고정화된 프로브 분자와 혼성화 (hybridize)할 수 있는 조건에서 실시된다. 특이적으로 형성된 하나 이상의 혼성화된 복합체의 정성적 그리고 필요하다면 정량적인 검출은 대부분의 경우 광학적 발광 (optical luminescence) 측정 및 각각의 검출 필드에 얻어진 얻어진 데이터의 할당에 의하여 이루어지며, 시료의 DNA 분석물의 존재 및 필요한 경우 정량적인 측정을 할 수 있다.
상기 기술은 다른 검출할 수 있도록 표지화된 분석물 특히 단백질관련 물질들 (펩타이드, 단백질, 항체 및 이들의 기능성 단편)을 검출하는 데 사용될 수 있수며, 검출이 발광 데이터의 측정에 근거하면 된다. 예를 들어, 아미노산 티로신은 특징적인 형광을 가지고 있으며, 약 260 ㎚에서 여기 (excitation) 후의 형광의 반감기는 본 발명에 따른 사용을 가능하게 하며, 티로신 라디칼을 갖는 단백질관련 물질의 경우 추가적인 표지화 없이 사용을 가능하게 한다. 수집체 분자 (collector molecules)로서 펩타이드의 사용은 분석물로서 단백질관련 물질 예를 들어, 항체 및 이들의 단편의 검출을 가능하게 하며, 적절한 발광인자 (luminophore)로 후자를 사전에 표지하지 않고 검출할 수 있다.
다시 말하여, 상기 기술은 검출할 수 있도록 표지화된 분석물 (분석될 시료의 구성 성분) 및 수집체 분자 (고정화된 지지체 구성 성분)의 복합체의 어떠한 발광에 기초한 검출을 가능하게 하며, 분석물이 검출할 수 있는 내재적인 형광성의 특징이 있어서, 추가적인 표지화가 필요 없는 시스템도 검출할 수 있도록 한다.
더욱이, 상기 기술은 오염 물질 예컨대, 폴리사이클릭 하이드로카본 또는 다른 유기 물질의 측정에 적용할 수 있다. 폴리사이클릭 하이드로카본 군의 수 많은 대표물질들은 450 ㎱까지의 형광 반감기를 보이며, 따라서 추가적인 표지화없이 분석물로서 선택될 수 있다. 따라서, 이들 폴리사이클릭 하이드로카본은 수집체 분자로서 특별히 제조된 항체에 분석물로서 결합되고 적합한 여기 (excitation) 후에 발광을 수집하는 것에 의하여 검출될 수 있다.
상기 실제적인 바이오칩 또는 센서칩에 추가하여, 발광 검출에 기반을 둔 것으로 공지된 시스템은 특히 발광 신호를 수집하고 결합하고 평가하는 장치를 포함한다. 그러나, 시판되는 것들은 상대적으로 고가이며, 이것은 많은 수의 시스템 구성 요소가 복잡하게 연관된 상태에서 동시에 요구되고 본질적으로 더 이상 크기를 소형화할 수 없기 때문이다.
WO 99/27140은 다양한 생물학적 분석물을 발광 측정으로 검출하는 데 사용되는 내장된 (built-in) 검출기 및 선택적으로 내장된 여기원을 포함하는 마이크로칩 형태의 바이오센서를 기술하고 있다. 상기 문헌은 각각의 발광 측정시에 병렬 여기 (parallel excitation) 및 측정을 교시하고 있다. 이 경우 반드시 파장 필터가 바이오센서 상에서 발광인자가 고정된 표면 및 검출기 사이에 위치하게 되며 이것은 여기광 (excitation light)을 차단하고 방출된 발광성 광을 선택적으로 검출하기 위해서 이다. 강제적으로 제공된 이 필터는 광 수율을 감소시키고 그리고/또는 바이오센서 제조 비용을 높인다.
따라서, 본 발명의 목적은 전술한 형태로서 당업계에서 공지된 시스템의 단점을 극복하는 신규한 바이오센서을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 시료에서 하나 이상의 분석물을 검출 및/또는 결정하는 보다 민감한 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 일반적으로 분석물의 광학적인 검출을 위한 마이크로칩 형태의 바이오센서 및 상기 바이오센서의 사용하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 시간분해발광 측정에 의하여 분석물을 검출하기 위한 바이오센서 및 상응하는 방법에 관한 것이다.
도 1은 도식적으로 CMOS 공정에 의해 제조된 본 발명에 따른 바이오센서 (1)의 기능 부분을 보여준다. 광학적 검출기 예를 들어, pn 다이오드 (2)는 절연체 (예를 들어, 필드 옥시드)(4)로 씌워져 있다. 광학적 검출기 및/또는 검출기 필드의 영역에서 긁힘 보호층 (3)은 가장자리가 날카롭거나 계단방식으로 에칭되어 수집체 분자 (예를 들어, DNA 프로브) (6)가 파인 부분에 배열되도록 한다. 검출에 직접 역할을 하지 않는 센서칩의 긁힘 보호 표면은 예를 들어, 귀금속 또는 소수성/친수성 물질 (5)을 적용하여 변형될 수 있다,
도 2는 본 발명에 따르면, 바이오센서 (1)에서 모식도의 왼편에 나타나 있는 것처럼 수집체 분자 예컨대, DNA 프로브 (6)가 프린트 또는 코팅되지 않은 검출기 및/또는 검출 필드를 제공할 수 있음을 보여준다. 이와 같은 것은 혼성화된 DNA (모식도의 오른편)의 특정 검출 신호로부터 시스템 구성요소의 내재적인 형광성 등에 의해 야기되는 간섭 신호를 계산해 내기 위해서 이다.
도 3은 본 발명의 바이오센서 (1)는 검출 필드 당 수 개의 광다이오드를 갖도록 할 수 있으며, 이에 의하여 동일 타입의 수집체 분자가 상기 필드의 각각의 검출기 위에 고정된다. 이것은 주어진 분석물/수집체 복합체에 대한 다중 측정을 가능하게 하며 특정적으로 측정된 신호의 통계적인 평가를 유도할 수 있다. 예를 들어, 이것은 비특이적 및 특이적 신호 사이의 구별을 가능하게 한다.
도 4는 수 개의 검출기들(2)을 따라 연장된 검출 필드를 보여주며, 이를 통하여 본 발명의 바이오센서의 표면 상에 수집체 분자를 고정화하는 것에 있어서 비정규성의 균형을 맞출 수 있다.
본 발명의 목적은 발광에 의하여 수집체/분석물 복합체를 검출하는 마이크로칩 형태의 광학적 바이오센서에 의하여 달성되며, 상기 바이오센서는 (a) 최소 한 타입의 수집체 분자가 고정화되는 표면을 갖는 지지체; (b) 상기 표면을 가로지르는 광을 검출하는 최소 하나의 검출기, 바람직하게는 수 개의 검출기(들); 및 (c) 선택적으로 발광성 광의 방출을 유도할 수 있는 최소 하나의 여기원 (excitation source)을 포함하며, 상기 표면은 여기원으로부터의 광에 대한 어떠한 삽입된 파장필터가 없는 상기 검출기의 측정 표면 또는 상기 검출기 위에 배열된 층의 표면이다.
바람직하게 상기 바이오센서는 발광단 (luminophore)이 발광성 광을 방출하도록 유도하는 여기원을 하나 이상 포함하며 가장 바람직하게는 바이오센서에 직접된다.
바람직한 구현예에 따르면, 상기 마이크로칩은 모노리식 (monolithic) 디자인이며 상기 검출기(들)은 상기 지지체에 직접된다. 택일적으로, 필름 형태의 상기 검출기(들)가 접착제에 의하여 상기 지지체에 부착될 수 있다.
택일적으로 상기 검출기(들)는 표면 가까이에 위치하나 필요하다면, 표면으로부터 일정 거리를 둘 수 있다. 가장 바람직하게는 상기 표면 (신호가 유래하고/발광성 광이 방출되는 곳) 및 상기 검출기의 측정 표면 (신호를 검출하는 곳) 사이의 거리가 10 ㎛보다 길지 않고 보다 바람직하게는 5 ㎛, 가장 바람직하게는 1 ㎛보다 길지 않다.
바람직한 구현예에서, 상기 최소 하나의 수집체 분자는 개별적인 검출 필드에서 또는 매트릭스 형태에서 표면 상에 고정화된다. 보다 바람직하게는, 수 개 타입의 수집체 분자가 표면 상에 고정화 된다. 가장 바람직하게는 다른 타입의수집체 분자는 다른 검출 필드 또는 매트릭스의 구별되는 위치에 고정화된다.
바람직하게는 상기 수집체 분자는 단일 또는 이중-가닥 핵산, 핵산 유사체, 햅텐 (haptene), 단백질, 펩타이드, 항체 또는 이들의 단편, 당 구조물, 수용체 또는 리간드로 구성된 군으로부터 선택된다.
바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 상기 바이오센서는 조절 유닛, 최소 하나의 증폭기, 하나 이상의 신호 변환기, 하나 이상의 메모리/저장 유닛, 하나 이상의 필터, 광학 시스템, 광 가이드 (광섬유) 및 하나 이상의 보호층으로 구성된 군으로부터 하나 이상의 요소를 추가적으로 포함할 수 있다; 검출기(들) 또는 수집체 분자가 고정되는 지지체의 표면 사이에 여기원으로부터의 광 또는 여기원의 파장에 대한 파장 필터가 배열되거나 삽입되지 않는 것을 전제로 한다.
본 발명의 바이오센서가 수 개의 검출기를 포함하는 경우, 바람직하게는 각각의 검출기는 하나의 필드 또는 상기 매트릭스의 하나의 지점에 할당되고, 보다 바람직하게는 상기 필드 또는 지점 아래에 배열되고 측정 표면의 크기는 필수적으로 상기 필드 크기에 상응한다.
이에 있어서, 바람직한 구현예는 수집체 분자가 상기 표면의 함몰 (depression)의 바닥에 배열되는 것이고 상기 함몰의 바닥은 상대적으로 표면으로부터 최소 100 ㎚ 낮다.
본 발명은 동등하게 마이크로칩 형태의 광학적 바이오센서를 이용하여 시간분해발광에 의하여 분석물/수집체 복합체를 검출하는 방법에 관한 것으로 상기 바이오센서는 (a) 최소 한 타입의 수집체 분자가 고정화되는 표면을 갖는 지지체; (b) 상기 표면을 가로지르는 광을 검출하는 최소 하나 바람직하게는 수 개의 검출기(들); 및 (c) 선택적으로 발광성 광의 방출을 유도할 수 있는 최소 하나의 여기원 (excitation source)을 포함하며, 상기 방법은 단계 (1) 내지 (3)을 포함하고 단계 (1)에서 상기 수집체 분자 및/또는 상기 분석물/수집체 복합체에 결합된 발광단을 여기 시간 T1동안 여기 상태로 전환하며, 단계 (2)에서 필수적으로, 약화 (die-away) 시간 T2동안 여기가 없고 그리고 그 후 단계 (3)에서 방출된 발광성 광이 최소 하나의 검출기에 의해 T3(측정 기간) 동안 검출되며 복합체 검출을 위하여 평가된다.
일 구현예에 따르면, 단계 (3)에서 분석물/수집체 복합체는 예를 들어, 다른 파장의 발광성 광의 병렬 검출기에 의해 병렬적으로 검출될 수 있다. 동등하게, 상기 방법은 추가적인 단계 (4)를 포함할 수 있으면, 상기 단계는 단계 (3)에서 검출되는 파장과 다른 파장에서 방출되는 발광성 광이 차후적인 시간 T4동안 검출되고 두 번째 복합체를 분석하기 위하여 평가된다.
앞서 언급한 모든 경우에 있어서, 바람직한 방법은 상기 여기는 단지 단계 (1)에서만 이루어진다. 상기 단계 (1) 내지 (3) 또는 (1) 내지 (4)는 수 회 실시될 수 있다.
추가적으로, 상기된 본 발명의 방법은 수집체 분자를 수집체 분자의 리간드 (분석물)를 함유하는 것으로 추측되는 시료와 접촉시키는 선행 단계 및 선택적으로 상기 바이오센서를 세척하는 것을 추가적으로 포함할 수 있다.
바람직한 일 구현예에 따르면, 상기 분석물은 발광단으로 표지되고 분석물/수집체 복합체의 형성이 이루어지는 경우 검출이 이루어진다.
바람직하게는 상기 발광단은 희토류금속 또는 악티늄족 원소 금속, 특히 유로퓸, 테르븀 및 사마륨; 클래스 II-VI, III-V 및 IV의 반도체로 선택적으로 도핑되고 (doped), 특히, CdSe, CdS 또는 ZnS; 및 알카리 토금속 플루오라이드, 특히 CaF 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된다. 가장 특히 바람직하게는 상기 발광단은 나노크리스털, 비드 또는 킬레이트의 형태이다.
상기 방법은 특히 핵산, 핵산 유사체, 단백질, 펩타이드, 햅텐, 항체 또는 이들의 단편, 당 구조물, 수용체 또는 리간드를 검출하기 위하여 실시될 수 있다.
모든 경우에 있어서, 본 발명의 방법을 실시하기 위하여는 상기된 바이오센서를 사용하는 것이 바람직하다.
직접적으로 간접적으로 고형상에 고정된 수집체 분자에 후자의 특정 결합을 통하여 분석될 시료에서 분석물 (리간드)의 존재를 발광에 기초하여 검출을 하고 수집체/분석물 복합체에 의해 방출되는 광 세기를 복잡한 이미지 광학기 예컨대 CCD 카메라를 사용하여 차후적으로 측정하는 공지된 검출 시스템에 비하여, 본 발명은 이들 복잡한 이미지 광학기를 집적 방법에 의해 직접 기록 방식으로 대체하는 것에 근간을 둔다.
따라서, 구체적익 용어로, 본 발명은 발광에 의해 수집체/분석물 복합체 검출을 위한 마이크로칩 형태의 광학적 바이오센서에 관한 것으로, 상기 바이오센서는 (a) 최소 한 타입의 수집체 분자가 고정화되는 표면을 갖는 지지체, (b) 상기 표면을 가로지르는 광을 검출하는 최소 하나의 검출기, 및 (c) 선택적으로 발광성 광의 방출을 유도할 수 있는 최소 하나의 여기원 (excitation source)을 포함하며, 상기 표면은 여기원으로부터의 광 (즉, 여기 파장, excitation wavelength)에 대한 어떠한 삽입된 파장 필터가 없는 상기 검출기의 측정 표면 또는 상기 검출기 위에 배열된 층의 표면인 것을 특징으로 한다. 본 발명은 또한, 동등하게 마이크로칩 형태의 광학적 바이오센서를 이용하여 시간분해발광에 의하여 수집체/분석물 복합체를 검출하는 방법에 관한 것으로, 상기 바이오센서는 최소 한 타입의 수집체 분자가 고정화되는 표면을 갖는 지지체, (b) 상기 표면을 가로지르는 광을 검출하는 최소 하나의 검출기, 및 (c) 선택적으로 발광성 광의 방출을 유도할 수 있는 최소 하나의 여기원 (excitation source)을 포함하고 (바람직하게는 본 발명에 따른 상기된 바이오센서를 사용), 상기 방법은 단계 (1) 내지 (3)를 포함하며, 단계 (1)에서 상기 수집체 분자 및/또는 상기 분석물/수집체 복합체에 결합된 발광단을 여기 시간 T1동안 여기 상태로 전환하고, 단계 (2)에서 필수적으로, 약화 (die-away) 시간 T2동안 여기가 없고 그리고 그 후 단계 (3)에서 방출된 발광성 광이 최소 하나의 검출기에 의해 T3동안 검출되고 상기 복합체를 검출하기 위하여 평가되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따르면, 표현 "발광 (luminescence)"은 여기원에 의해 기상, 액상 및 고상 물질로부터 생성된 모든 광의 방출 (그리고, 확장하여 자외선 및 적외선의 방출을 포함)을 포함하며 상기 방출은 고온이 아닌 에너지를 우선 흡수하고 여기되는 것에 의해 야기된다. 발광을 나타내는 상기 물질을 발광단 (luminescence)이라 한다. 본 발명은 경우에 따라 용어 "형광 (fluorescence)" 및 "형광단 (fluorophore)"을 사용하여 상세히 설명되지만, 상기 용어는 단지 본 발명의 바람직한 구현예를 기술하는 것으로 그것으로 범위를 한정하는 것은 아니다.
당업자에 공지된 것처럼 발광은 광 (바람직하게는 단파장, X-ray 및 광전발광), 전자 (음극선발광), 이온 (이온발광), 음파 (음발광) 또는 방사선 물질 (방사발광)을 여기원으로 사용하여 조사 (irradiation)에 의해, 전지장 (전기화학발광)에 의해, 화학 반응 (화학발광) 또는 기계적 공정 (마찰발광)에 의하여 생성될 수 있다. 한편, 열발광은 열에 의해 촉발되거나 강화된 발광을 포함한다. 이런 모든 과정은 양자 역학의 기본적인 법칙에 따르며, 원자 및 분자를 여기하게 되며, 다음 기저상태로 전환되면서 빛을 방출하면서 이것이 본 발명에 따라 검출된다. "내재적 형광 (intrinsic fluorscence)" (자체-형광)은 발광단의 선행하는 표지화없이 물질 또는 분석물에서 여기된 (excited) 발광을 의미한다.
따라서, 적합한 여기원의 선택 및 필요하다면 다른 구성은 사용하고자 하는 발광 타입 및/또는 사용되는 발광단에 의존한다. 결과적으로, 여기원은 예를 들면, 전극, 광-방출 다이오드 및 초음파 진동 등의 형태로 제공될 수 있다. 여기원은 바람직하게는 전부 또는 부분적으로 본 발명의 바이오센서로 집적될 수 있다.
민감도 즉 관련 시스템의 검출의 낮은 한계는 구성 물질 성분 고유의 자체-형광 및 시스템과 연관된 광 산란에 제한을 받는다. 이에 야기되는 배경 잡음을 최소화하고 그리고/또는 최적화딘 신호 대 잡음 비를 얻기 위한 기술 산업계의 시도는 시간분해 또는 시지연 (시간분해) 발광 또는 형광 측정 기술을 이끌어 내었고 다양한 분야에서 성공적으로 적용되고 있다.
시간분해 발광 및 특히 형광 측정의 기본적인 원리는 다음과 같다: 형광 화합물의 혼합물이 예를 들어 레이저 또는 광전플래쉬 램프 (photoflash lamp)로 부터의 짧은 광 펄스의하여 여기 되면, 여기된 분자는 짧은 지속 시간 또는 긴 지속 시간 형광를 방출한다.
양 타입의 형광 모두 지수적으로 (exponentially) 감소하지만, 짧은 수명의 형광은 수 나노초 안에 무시할 만한 수치까지 소멸한다. 여기 후 이렇게 짧은 시간 동안 측정이 본질적으로 부재한다면, 짧은 수명의 형광으로부터의 모든 배경 신호 및 산란에 의해 야기되는 조사 펄스가 제거되고, 그 결과 긴 지속 시간 형광 신호가 매우 높은 민감도로 측정될 수 있다.
따라서, 본 발명의 방법은 단계 (1) 내지 (3)을 포함하며, 단계 (1)에서 상기 수집체 분자 및/또는 상기 고정화된 분석물/수집체 복합체에 결합된 발광단을 여기 시간 T1동안 여기 상태로 전환하고, 단계 (2)에서 필수적으로, 약화 (die-away) 시간 T2동안 여기가 없고 그리고 그 후 단계 (3)에서 방출된 발광성 광이 최소 하나의 검출기에 의해 T3동안 검출되고 상기 복합체를 검출하기 위하여 평가되는 것을 특징으로 한다. 본 발명에 따르면, 바람직하게는 T1및 T2동안 측정된 수치는 평가에 고려되지 않는다. 보다 바람직하게는 이 시간 동안 어떤 검출도 실시되지 않는다.
본 명세서에서, 표현 "필수적으로 여기되지 않은"은 여기 시간 T1과 대조적으로, 여기원을 약화 시간 T2동안, 본 발명에 있어서 바람직하게는, 완전히 끄거나 여기 기간동안 제공되는 단위 시간당 에너지의 10% 이하, 보다 바람직하게 5% 그리고 가장 바람직하게는 2%를 제공하는 것을 의미한다. 가장 바람직하게는 여기원은 활성화되지 않는 것, 즉, 약화 시간 T2및 측청 시간 T3동안에 어떤 에너지도 시스템에 제공되지 않는 것이다.
마이크로칩 형태의 바이오센서에 적용할 수 없다고 종래 기술에서 여겨지던 시간분해 발광 측정의 사용 결과로서, 신호 원천 (표면에 결합된 발광단 또는 고유의 발광을 방출하는 복합체) 및 검출기 (검출기(들)의 측정 표면) 사이에 파장 필터의 삽입없이 유리하게 실시할 수 있게 되었다. 따라서, 방출되는 발광성 광 전체를 측정 및/또는 검출에 사용할 수 있으며, 결과적으로, 바이오센서의 민감도를 종래 기술의 상응하는 센서와 비교하여 증가시킬 수 있다. 신호 원천 지점 및 검출기의 근접 (바람직하게는 10 ㎛ 이하)은 이에 대해 추가적인 기여를 한다.
본 발명에 따르면, 복합체의 고유의 발광 (예를 들어, 티로신 함유 단백질) 또는 분석될 분석물에 표지로서 사전에 도입된 발광단의 발광 등이 사용될 수 있다. 바람직하게는 후자이다. 본 발명에 특히 적합한 발광단은 반감기가 5 ns 이상인 것들로 이들 발광단은 형광 배경 (상기 참조) 소멸로 알려진 것 이후에도여전히 측정할 수 있다. 가장 바람직한 발광단은 반감기가 ㎲ 내지 ㎳ 범위이고, 특히 100 ㎲ 내지 2000 ㎲이다. 따라서, 본 발명의 방법에 따른 측정은 일반적으로 여기가 일어난 후 약 5 ㎱ 시간 경과 후 실시된다. 바람직한 구현예에 따르면, 측정 창 (measurement window)은 ㎲ 내지 ㎳ 범위에 놓이며, 100 ㎲ 내지 2000 ㎲의 범위가 특히 바람직하다.
대부분의 유기 발광단은 여기 상태에서 짧은 반감기를 나타낸다. 엄밀히 형광으로 알려진, 이런 현상은 여기원의 에너지에 의하여 더 높은 진동 에너지 레벨, 소위 단일항 상태 (singlet state)로 전이된 전자에 근거한다. 상기 상태는 단지 수 ㎱ (예를 들어, 트립토판의 경우 2.6 ㎱) 동안 안정하다. 여기에너지는 전자가 여기된 단일항 상태에서 기저 상태로 떨어지면서 방출된다. 대개 이 과정의 방출 파장은 여기원의 파장보다 길다. 여기 파장 및 방출 파장의 차이는 "Stokes Shift"라고 알려져 있다. 반면, 어떤 발광단의 경우, 여기된 단일항 상태에서 소위 삼중항 (triplet state)로의 전이가 일어난다. 이 경우 여기된 상태가 안정화되고 Stokes Shift도 커진다. 대개 삼중항 상태는 여기된 단일항 상태의 에너지 레벨의 바로 아래의 에너지 레벨이다. 삼중항 상태에서 전자는 기저 상태의 전자와 더 이상 스핀 쌍을 이루지 않는다. 따라서, 삼중항 상태에서 기저 상태로의 전이는 양자 역학적으로 금지된 전이이다. 이것은 여기된 상태의 존속시간을 안정화한다. 이 현상이 소위 인광 (phosphorescence)이며 반감기가 약 10 ㎳이다.
긴 반감기를 가지는 전형적인 발광단은 예컨대, 희토류금속 (REMs) 화합물 또는 악티늄족 원소 화합물을 포함하며, 후자의 경우 이들의 방사성으로 인하여 현재는 부차적으로 이용된다. 생물학에서 RE 금속은 킬레이트 복합체로 대부분 사용되며, 이는 발광 수율을 적합한 유기성 결합 파트너를 선택하여 상당히 증가시킬수 있기 때문이다. 이런 화합물들은 수 백 ㎚ 직경을 갖는 "미세구 (microspheres)"로 시판되고 있다 (예를 들어, FluoSphereTMEuropium Luminescent Micropheres, Molecular Probes). 특히, 바람직한 RE 금속은 유로퓸, 테르븀 및 사마륨이다.
다른 적합한 발광단은 반도체의 나노크리스털로 발광성이외에 상대적으로 작은 크기 (수 ㎚) 및 높은 안정성 (광표백성이 없음)의 특별한 특성이 있다. 반도체 물질 및 선택된 도핑에 의존하는 반감기는 수 백 ㎱에서 밀리초 범위까지 조절될 수 있다. 당업자는 수월하게 적합한 나노입자 예컨대, 실란 (silanes)으로 코팅할 수 있으며, 다음으로 유기 분자 예를 들어, 핵산 또는 항체에 결합할 수 있다. 적합한 반도체는 클래스 II-VI (MgS, MgSe, MgTe, Cas, CaSe, CaTe, SrS, SrSe, SrTe, BaS, BaSe, BaTe, ZnSe, ZnTe, CdS, CdSe, CdTe, HgS, HgSe, HgTe), III-V (GaAs, InGaAs, InP, InAs) 및 IV (Ge, Si)의 반도체를 포함한다. 상기 특성의 반도체 크리스털은 반감기가 약 200 ㎱ 또는 이상이다. 클래스 II-VI 나노크리스털은 "Quantum DotTM" (Quantum Dot Corp., 캘리포니아, 미합중국)으로 알려진 제픔이 이용가능하다. 각각의 경우, 동일한 클래스의 나노크리스털의 흡수 스펙트럼은 동일하나, 각각의 방출 스펙트럼은 주어진 입자 크기의 함수로서 다르며, 따라서 필터 광학기를 사용하면, 수 개의 병렬적인 표지를 단일의 여기 파장을 사용하여 측정할 수 있다. 표 1은 특정 나노크리스털의 특성을 나타낸다.
나노크리스털 크기 여기 방출
CdSe-CdS 2.4 ㎚ 350-450 ㎚ 533 ㎚
CdSe-CdS 4.6 ㎚ 350-450 ㎚ 630 ㎚
Mn2+-도프된 ZnS 1.5-3 ㎚ 230-320 ㎚ 550-650 ㎚
본 발명에 적합한 주목되는 발광을 갖는 다른 물질은 카드뮴 셀레니드, 카드뮴 설파이드 (cadmium sulphide) 또는 망간, 구리 또는 은으로 도프된 징크 설파이드의 크리스털이다. 이들 물질의 자체-발광은 결정 격자의 결함에서 기인한다. 도핑에 다른 금속 이온 (Ag, Cu 및 Mn)을 선택함으로써 다른 방출 스펙트럼을 얻을 수 있다. 상기 물질은 물에 용해되지 않으므로 본 발명에 따라 소위 미세입자 (microparticles)의 형태로 사용하는 것이 바람직하다. 이들 물질의 대표적인 특성이 상기 표 1에 나타나있으며 예로서 Mn2+-도프된 ZnS를 사용하였다.
본 발명에 적합한 다른 발광단은 예를 들어, 도핑 (외래 이온) 또는 방사선 조사에 의하여 생성될 수 있는 격자 결함을 갖는 알칼리 토할라이드 (alkaline earth halides)이다. 예를 들면, 칼슘 플로라이드 (CaF) 입자는 유로퓸 등으로적절히 도프된 경우 주목되는 발광을 나타낸다. CaF의 경우, 예를 들면, 열발광이 방사선으로 생성된 격자 결함으로부터 생성될 수 있으며, 약 40℃ 정도의 낮은 온도로 발광을 유도하는 데 충분하다.
본 발명의 방법에 사용하기에 바람직한 형광성 희토류금속 화합물 또는 킬레이트 특히, 유로퓸 킬레이트는 시간분해 형광기에 대한 마커 (표지)로서 통상의 형광단에 비하여 특정 이점이 있으므로 선택되었다. 형광성 유로퓸 킬레이트는 큰 "Stokes Shifts" (약 290 ㎚)를 가지며 여기 및 방출 스펙트럼 사이에 어떤 겹쳐짐도 없고 약 615 ㎚에서 매우 폭이 좁은 방출 스펙트럼 (10 ㎚ 밴드폭)을 갖는 특징이 있다. 더욱이, 긴 형광 반감기 (통상의 형광단의 경우 20 ㎱에 비하여 Eu3+의 경우 600-1000 ㎲)는 마이크로 내지 밀리초 범위에서 시간분해 형광측정을 가능하게 하고 결과적으로 배경 신호를 감소시킬 수 있다.
금속 이온 (반감기) 상태 여기 방출
Eu3+(600 ㎲) 미세구 340-370 ㎚ 610 ㎚
Tb3+(약 1 ㎳) NTA 복합체 270 ㎚ 545 ㎚
Pt2+(> 100 ㎲) 미세구 390 ㎚ 650 ㎚
NTA:2-(트리플루오로아세틸)-나프탈렌, Molecular Probes
시간분해 형광기에 대하여 유로퓸 킬레이트의 표지로서의 이용은 이미 면역학적 분석 및 서던 또는 노던 블럿으로부터 공지되어 있다. 분석하고자 하는 시료에 존재하는 생분자 (분석물)의 적합한 표지화는 Eu3+또는 Eu3+-킬레이트제를 사용하는 확립된 프로토콜에 기초하여 실시될 수 있다 (참조: 예를 들어, E.P. Diamandis 및 T.K. Christopoulos, "Europium chelate labels in time-resolved fluorescence immunoassays and DNA hybridization assays",Anal.Chem.62:1149A-1157A (1990)).
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 택일적으로 분석물은 바오티닐화될 수 있고 스트렙타비딘에 결합된 Eu3+또는 Eu3+-킬레이트제를 사용하여 검출할 수 있다. 이 경우 바람직한 기술은 소위 "Beads"의 사용으로 적합한 희토류금속 화합물로 채워지고 따라서 발광-방출 분자의 고밀도를 확보할 수 있다. 실험으로부터, 이 방법으로 최적화된 형광기 시스템의 검출한계는 약 1 내지 5 pg의 단백질 또는 DNA이다.
본 발명에 따른 바이오센서는 바람직하게는 평편하며 또는 적절한 함몰부위 (웰, well)을 갖는 표면으로 최소 한 타입의 수집체 분자, 바람직하게는 수 개 타입의 수집체 분자가 고정되는 표면을 갖는 지지체 (기재)를 포함한다. 상기 고정화는 바람직하게는 직접 또는 간접적 (예를 들면, "스페이서 spacer" 사용)으로 표면에 공유결합하여 일어난다. 적절한 결합 기술은 당업자에게 공지되어 있다. 바람직하게는 수집체 분자는 단일 또는 이중-가닥 핵산, 핵산 유사체, 햅텐, 단백질, 펩타이드, 항체 또는 이들의 단편, 당 구조물, 수용체 또는 리간드로 구성된 군으로부터 선택된다. DNA가 특히 바람직하다.
본 발명의 바이오센서의 지지체는 기본적으로 최소한 수집체 분자가 고정화되는 지역에서 충분히 투명한 적절한 물질로 제조된다. 적절한 물질은 단단하거나 유연한 물질 예를 들어, 플라스틱 필름, 중합체, 유리, 단단한 플라스틱, 실리콘, 실리콘 니트리드, 실리콘 옥시드, 알루미늄, 알루미늄 옥시드 및 반도체 기술에서 공지된 기타 물질 및 특히 직접 반도체 (direct semiconductors)를 포함한다. 바람직하게는 후자이다. 상기 지지체는 평면의 구조를 가지며, 예컨대, 마이크로칩 형태이며, 5 ㎝, 바람직하게는 1 내지 5 ㎝ 폭; 10 ㎝까지, 바람직하게는 2 내지 10 ㎝ 길이 및 0.5 ㎝까지, 바람직하게는 0.1 내지 0.5 ㎝ 두께의 치수를 갖는다. 상기 표현 "마이크로칩"은 본 명세서에서 전자학에서 공지된 마이크로칩의 특성을 필요적으로 의미하지는 않는다. 기본적으로 상기 표현은 무엇보다도 통상적인 광학으로부터 상당히 구별되는 상기 치수를 갖는 구조의 평면 방법에 관련이 있다. 또 다른 본질적인 특징은 수집체 분자가 고정화될 수 있는 표면 (바람직하게는 평면)의 제공이다. 그러나, 통상적인 "마이크로칩"의 의미로의 사용이 바람직하다. 이런 종류의 마이크로칩은 통상적으로 모노리식 (monolithic) 조합으로, 즉, 다양한 반도체 물질 예컨대, 실리콘, 실리콘 디옥시드, 실리콘 니트리드, 알루미늄, 알루미늄 옥시드 등의 단일 조각 (piece)으로부터 제조된 것이다.
연구될 최소 하나의 살아있는 세포의 특정 생리학적 및 형태학적 매개변수를 측정하기 위한 예를 들어 EP-A-0881490에서 공지된 측정 장치를 본 발명의 방법를 실시하기 위하여 적절한 변형을 가한 후 사용할 수 있다. 상기 장치는 수 많은 센서 및/또는 검출기기이며 연구될 물질이 고정되는 지지 장치에 내재되어 있다.
바람직한 구현예에 따르면, 상기 지지체는 반도체 물질로 필수적으로 구성되며, 광학적인 검출기 층을 갖고 바람직하게는 수 개의 검출기를 포함하고, 검출기로서 광다이오드를 삽입하는 것이 바람직하다. 상기 층은 모노리식으로 상기 지지체에 삽입될 수 있다 (협의의 전자학 관점에서 마이크로칩). 택일적으로, 지지체의 아래면에 접착제에 의하여 부착될 수 있으며, 수집체 분자는 상기 지지체의 윗 표면에 고정된다.
보다 바람직한 구현예에서, 단일 과정이 바이오센서 내에서 최소 부분적으로 이루어진다. 본 발명의 일 양태에 따르면, 예컨대, 시간분해 형광은 마이크로칩 상에서 직접적으로 평가될 수 있으며, 아날로그 회로를 사용하여 여기원을 끈 후 각각의 나노초 동안 수치를 기록하여 기록된 수치들을 사전에 실시되어 마이크로칩에 저장되어 있는 참조 수치와 비교하는 것에 의한다. 더욱이, 상기 과정은 비특이적 간섭 신호 예컨대, 존재할 수 있는 시스템 부품의 자체 형광를 계산할 수 있도록 한다 (참조 도 2). GHz 범위 (<1 ㎱)까지 분해할 수 있는 것을 고려하면, 인위적인 형광으로부터의 자체 형광을 구별하는 것이 가능하다.
지지체 표면이 다수의 검출 필드가 평가 될 수 있는 마이크로에레이 (microarray arrangement) 배열로 디자인인 된다면, 발광 신호의 검출은 순차적으로 예컨대, 연속적으로 표면의 모든 열 또는 행 또는 일부를 여기 및 검출하는 것에 의하여 이루어진다 (다중 응용, multiplex application)
예를 들어, 검출기로부터의 전자적 출력 신호는 아날로그-디지탈 전환후 외부의 평가 기기에 적절한 회로를 통해 이송될 수 있다. 광다이오드 (pn, p-i-n, avalanche)에 추가하여, CCD 센서 또는 광전도체를 본 발명에 따른 적절한 검출기 또는 센서로 볼 수 있으며, 바람직하게는 선형 또는 에레이 배열 (= 패턴)의 형태에서 바이오센서의 반도체 기재에 모노리식으로 삽입된다. 광다이오드는 시간분해발광 측정에 유용하며 이는 광전자증배기에 비하여 작은 검출 표면 면적 또는 측정 표면 면적을 갖기 때문이다.
본 발명의 보다 바람직한 일 양태에 따르면, 여기원은 바이오센서의 필수 구성 요소이며 (예를 들면, 전극의 형태), 가장 바람직하게는 검출기 자체에 의하여 제공된다. 직접 반도체 물질로 제조된 pn 다이오드의 선택은 다음을 가능하게 한다: 우선 활성화는 전압을 가하는 것을 의미하며, 결과적으로 pn 다이오드의 타입 또는 특성에 의존하는 특정 방출 파장 밴드에 해당하는 광 신호가 방출되고 (LED로 사용되는 pn 다이오드) pn 다이오드의 근처에 결합되어 있는 분석물을 여기한다.pn 다이오드 (광다이오드로 사용된 pn 다이오드)를 불활성화하고 특정 약화 (die-away) 시간 경과후 요구되는 측정을 실시하기 위하여 다시 한번 활성화 된다.
상기 구현예에서 기재된 여기 조사 (excitation radiation)는 발광 조사 (radiation)가 수집되는 부품과 동일한 부품을 통하는 연결되어 있다는 사실에서, 센서 표면 또는 검출 필드의 매우 좁은 지역이 선택적으로 조사되고 이 지역에서 방출되는 발광 조사를 평가하는 것이 가능하다. 이 과정의 결과로 연구중인 검출 필드를 매우 정밀하게 비추고 연구하고자 하는 지역 밖으로부터의 발광에 의한 측정 간섭을 피하는 것이 가능하다.
추가적으로 검출기는 그룹으로 배열될 수 있으며, 개별적인 검출 필드들를 만드는 것이 가능하고 상기 필드들의 인력 신호는 검출 필드 당 단일 점유 (single occupation)보다 결과를 더 믿을 수 있도록 한다 (참조: 도 3). 검출 필드 당 다중 점유 (multiple occupation)는 측정 기술에 의하여 분석물 결합을 집중시키는 것을 가능하게 하며, 신호 처리 동안에 민감도를 매우 높이는데 기여한다.
본 발명에 따른 바이오센서의 제조는 공지된 CMOS (complementary metal oxide semiconductor) 공정에 의하며, 이런 이유로 신호 조건화 및 평가를 집적하기 위한 모든 회로 라이브러리를 변형없이 이용할 수 있고 본 발명에 구현된다. 종합적인 내용은 예컨대, WO 99/27140에서 확인할 수 있다. 본 발명에 따르는 적합한 다른 제조 공정의 예는 NMOS 공정 또는 쌍극성 공정 (bipolar process)이다.또 다른 가능성 중 비용적인 측면에서 이점이 있는 것으로는 유기 반도체에 기초하여 본 발명의 바이오센서를 제조하는 것이다 (참조: 예를 들어, EP-A-1085319).
보다 바람직한 구현예에 따르면, 개별적인 검출 필드는 서로 분리되어 있으며, 필수적으로 한편의 필드로부터의 광 방출이 다른 편 필드에 수용되지 않도록 되어 있다. 따라서, 개별적인 검출기 필드는 통상의 미소판 (microtitration plate)에서 공지된 그런 종류의 함몰 (웰)에 배열될 수 있다. 본 발명에 따르면, 구유 (trough) 형 함몰 및 바닥을 갖는 함몰로 상기 함몰의 옆벽은 필수적으로 센서칩의 표면에 상대적으로 수직으로 배열되는 것이 바람직하다. 이런 함몰의 각각의 치수는 적용 면적을 고려하여 본 발명이 속하는 분야의 당업장가 자유롭게 선택할 수 있으며, 기대되는 분석물/수집체 복합체의 발색단(들)은 상기 함몰의 안쪽에, 바람직하게는 바닥에 위치하고 필수적으로 방출된 광이 인접하는 함몰로 투과되지 않으면 된다.
특히, 바람직한 함몰은 바닥이 최소 100 ㎚, 바람직하게는 100 ㎚ 내지 10 ㎛ 그리고 보다 바람직하게는 100 내지 5000 ㎚, 본 발명의 바이오센서의 표면으로부터 들어간 것이다. 택일적으로, 동일한 효과를 평판한 표면 상에 위쪽으로 위치시킨 분리 수단을 배열하는 것에 얻어질 수 있으며, 상기 치수는 적용 면적 및 예상되는 수집체/분석물 복합체의 기하학적 치수를 고려하여 당업자가 수월하게 선택할 수 있다. 적절한 분리 수단의 설치는 양극의 결합 (anodic bonding) 또는소위 플립-칩 공정 (Flip-Chip process)에 의해 실시될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 마이크로칩 형태의 바이오센서에 채널 (channels)이 적용된다. 예를 들어, 상기 채널은 수집체 분자의 어레이가 결합되는 검출 필드의 열 (row)을 제공할 수 있다. 예를 들어, 이것은 교정 (calibration) 측정을 가능하게 한다. 보다 바람직한 구현예에서 병렬 측정이 동일한 어레이에 대해 예를 들어, 병별 시료에 대해 실시될 수 있으며, 분석당 비용을 상당히 줄일 수 있다. 이런 목적으로, 마이크로칩은 마이크로채널에 의해 예컨대, 8 개의 동일한 구획으로 세분된다.
지지체의 물질, 표면 및 검출기(들)의 선택은 검출되는 발광단의 방출 파장에 의존한다는 것은 당업자에게 명확하다. 기본적으로, 상기 검출기는 물질 (실리콘 또는 게르마늄)의 선택에 의존하는 파장에 대하여 다른 민감도를 가지며 이것은 소위 " 반도체 밴드 갭 (gap)" 때문이다. 따라서, 실리콘 광다이오드의 사용의 바람직한 경우는 민감도 범위가 적외선에서 자외선 파장까지 확장되고 상기 범위에서 민감도가 가장 크다.
더욱이, 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 바이오센서는 조절 유닛, 최소 하나의 증폭기, 하나 이상의 신호 변환기, 하나 이상의 메모리/저장 유닛, 하나 이상의 필터, 광학 시스템, 광 가이드 및 하나 이상의 보호층으로 구성된 군으로부터 하나 이상의 요소를 추가적으로 포함할 수 있다; 검출기(들) 또는 수집체 분자가 고정되는 지지체의 표면 사이에 여기원으로부터의 광 또는 후자 (latter)의 파장에 대한 파장 필터가 배열되거나 삽입되지 않는 것을 전제로 한다. 수집체 분자가 검출기의 측정 표면에 고정되는 것이 가장 바람직한 구현예이다 (예를 들면, pn 다이오드의 최상층).
모노리식으로 집적될 수 있는 반도체 물질을 수집체 분자에 대한 지지체 및 표면으로 사용하고 검출기를 형성하면, 동일한 기재에 모노리식으로 직접된 회로를 제조하는 것이 가능하며, 결과적으로 전자 검출기 출력 신호의 전-처리가 실험물 (수집체/분석물 복합체) 바로 부근에 일어날 수 있다. 따라서, 본 발명의 바람직한 구현예는 순수하게 수동적인 센서보다 능동적으로 행동하는 "지능적인" 바이오센서를 포함한다. 예를 들면, 전기-광학적 검출기로부터의 출력 신호는 공집적 회로 (co-integrated circuit)에 의해 전-처리되어 출력 신호가 출력 회로 및 외부에 접촉된 커넥터를 통하여 릴레이되고 처리되어, 즉 비교적 문제 없는 방식으로 평가된다. 더욱이, 전-처리는 아날로그 검출기 신호를 디지털화하고 적절한 데이터 흐름으로 전환하는 것으로 구성될 수 있다.
더욱이, 짧은 신호 거리 때문에, 본 발명에 따른 바이오센서에서 구현된 검출기 및 신호-처리 위치의 근접성으로 인하여 신호-잡음 비가 매우 개선될 수 있다. 또한, 데이터의 양이 감소하거나, 외부 처리 및 표시를 도우는 추가적인 처리 단계가 있을 수 있다. 광학적 신호의 남아있는 평가 및 표시를 개인 컴퓨터 (PC)로 실시할 수 있도록 해준다. 추가적으로, 본 발명의 바이오센서는 데이터 바람직하게는 밀집 및/또는 처리된 데이터가 적외선 또는 무선 링크를 통하여 상응하여 갖추어진 수용 지점 (reception station)으로 전달될 수 있도록 제조될 수 있다.
기재상의 연결된 장치의 조절은 조절 장치의 조절 신호를 통하여 실시될 수 있으며, 상기 조절 상치는 바람직하게는 전부 또는 부분적으로 기재상에 구성되거나 또는 외부에서 연결된다.
통상적을 구입가능한 컴퓨터를 통하여 본 발명의 방법에 따른 광학적/전기적 신호를 평가할 수 있는 가능성은 적절한 프로그램을 통하여 데이터의 평가 및 저장을 자동화할 수 있는 이점이 있고 결과적으로, 데이터 분석에서 있어서, 본 발통상의 외부 이미지 광학기를 사용하여 얻어지는 데이터에 비하여 본 발명의 바이오센서을 사용하는 경우 어떤 종류의 제한도 없다.
본 발명의 바이오센서로부터 발광의 직접적인 기록은 특정 검출에 필요한 수집 분자체를 직접으로 또는 통상의 거리 홀더 (distance holder)(스페이서) 및/또는 연결 매트릭스를 통하여 표면에 위치시키는 것에 의하여 달성되며 상기 표면은 검출기의 측정 표면 또는 상기 측정 표면의 바로 위에 배열된 층의 표면이며, 어떠한 삽입된 파장 필터가 없다. 이런 배열은 신호가 생기는 (발광성 광의 방출) 곳 및 검출기 위치 사이의 거리를 감소시키며, 따라서, 발광성 광의 수율을 최대화 한다.
바람직한 구현예 따르면, 광학적 검출기는 최소 하나의 광다이오드의 형태로 제공되며, 수 개의 다른 분석물 (리간드)의 병렬 및/또는 순차적인 검출을 위하여는 다수의 광다이오드 존재가 바람직하다. 그러나, 단지 하나의 발광단을 사용하는 경우에도, 상기 다중 배열은 이점을 제공하며, 검출 필드당 수 개의 검출기는 프로파일 (profiles)을 기록할 수 있도록 하며 이의 도움으로 수집체 분자 및 분석물의 결합과정의 위치-특이적 분배가 집중에 의해 개선될 수 있다. 공지된 마이크로-어레이 배열에서 도움을 받는 본 발명의 구현예에서, 개개의 광다이오드는 일정한 그룹 또는 측정 필드로 함께 그룹화될 수 있으며, 결과적으로 후속적인 발광 측정의 민감도, 상기 방법으로 얻어진 데이터의 재현성 및 신뢰성이 상당히 증가될 수 있다.
바람직한 구현예에 따르면, 선택적으로 노출된 (그렇지 않으면, 상기 바이오센서는 예를 들어 보호층에 의해 씌워져 있다) 각각의 광다이오드 (검출기 또는 선택적으로 동시에 여기원) 표면은 SiO2또는 Si3N4으로 구성된다. 추가적으로, 수집체/분석물 결합 및 검출의 특정 공정 매개 변수는 마이크로칩 형태의 바이오센서의표면 물질의 선택에 의하여 유익한 영향을 받을 수 있다. 예를 들어, Si3N4을 일정 장소에 적용하고 SiO2(또는 예를 들어,Al2O3)또는 귀금속을 다른 곳에 적용할 수 있으며, 보다 소수성 또는 보다 친수성의 특성을 갖는 생분자 또는 스페이서에 대해 바람직한 지역을 센서 또는 개별적인 검출 필드 상에 제공하여, 예를 들어, 수집체 분자로서 DNA의 부착을 국소적으로 촉진하거나 억제할 수 있다. 추가적으로, 본 발명에 따르면, 귀금속 전극의 부착은 바람직한 바이오센서를 제조할 수 있게 하며, 예를 들어, 혼성화가 촉진되거나 전기적으로 여기될 수 있는 발색단으로부터 유래한 형광을 다른 전압의 적용으로 선택적으로 각각의 검출 필드에 대해 유도할 수 있다.
예를 들어, 하나 이상의 백색광 램프, LED (light-emitting didodes), (반도체) 레이저 또는 UV 튜브 형태에서 그리고 piezo-요소 (초음파) 또는 광 에너지를 방출하는 가스 및/또는 액체 (화학적 여기) 또는 전극에 의하여 제공되는 여기원은 충분히 강력하고 바람직하게는 고진동수에서 반복될 수 있어야 한다. 후자의 특성은 광원이 짧은 시간에 활성화되거나 꺼질 수 있다면 존재하게 된다. 만약, 광학적 여기원이 사용된다면, 필수적으로, 꺼진 후 (예를 들어, 백열 후 (after-glow)의 결과로서) 추가적인 광자 (photon)가 검출기에 충돌하지 않도록 즉, 어떤 에너지도 상기 시스템에 공급되지 않도록 꺼질 수 있어야 한다. 필요하다면, 기계적인 차단기 및 광학적 여기원으로 LED 또는 레이저를 선택하는 것에 의하여 확실히 할 수 있다.
여기원은 광학적으로 기계적으로 바이오센서 및 검출기에 결합되는 것이 바람직하고 후자의 방향으로 조사 필드 (radiation field)를 생성하고 여기원 및 신호 원천 판, 즉 수집체 분자가 고정화되는 표면, 사이의 공간 거리를 가능한 한 작게한다. 그러나, 공간 거리는 리간드/분석물 및 수집체 분자간의 의도된 용도에 필요한 반응이 영향을 받지 않도록 충분히 멀어야 한다. 이에 관하여, 여기원 -지지체 상에 제공된 다수의 검출 필드에 상응하는- 은 다수의 포인트-크기 조사 (radiation)원으로 구성되며 상기 조사원은 개별적으로 또는 그룹으로 예를 들어, 조절 장치에 의하여 활성화될 수 있다. 여기원 (LED) 및 검출기 (광다이오드)로서 pn 다이오드의 동시 사용이 바람직하다. 조사는 직접적으로 즉, 어떤 삽입된 광학체 없이 실시될 수 있으며, 소위 마이트로-어레이의 사용에 있어서, 여기원에서 방출된 광이 매우 집중되어 매우 좁은 검출 필드를 보장할 수 있는 것을 전제로 한다. 택일적으로, 그러나, 예를 들어, 센서 표면 상의 매우 밀집된 수집체 분자들 때문에 이것이 바람직한 한에서는 여기원으로부터 조사 경로는 적절한 렌즈에 의해 집중될 수 있다. 이것이 비특이적인 간섭 신호 예를 들어, 자체-형광을 감소시키는 추가적인 수단을 제공한다는 것은 당업자에게 명확하다.
예를 들어, 집중된 광학적 섬유 또는 소형화된 LED (light Emittion Diodes) 또는 어떤 방법으로 구현된 것으로 구성되는 포인트-크기 조사원의 배열은 열 또는필드의 형태에서 유용하며, 센서 표면 상의 수집체 분자의 배열에 따라 기능적으로 조절된다. 다양한 RE (rare earth) 금속 킬레이트를 사용하는 분석에 있어서, 여기원은 완전히 조절가능하거나 (tunable) 또는 다른 파장에 대해 다른 여기원이 존재하는 것이 유용하다. 추가적으로, 특히 의도되는 목적에 대해 여기원이 진동수-조절되는 것이 유용하다. 이와 관련하여, 강도-조절된 여기광이 사용되고, 측정 반감기가 나노초 범위인 경우 수 MHz에서 조절이 이루어진다. 따라서, 소위 FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy)으로 당업자에게 공지된 방법이 본 발명에 따른 구현예에 포함된다. 상기 언급은 다른 또는 완전히 조절가능한 검출기가 수집분자체/분석물 복합체에 의해 방출되는 빛을 기록하기 위하여 검출기 면에 존재할 수 있는 것을 의미한다. 광다이오드가 포함되는 경우, 파장-특이적 광요소 (photoelement)를 본 발명의 바이오센서에 대해 사용한다.
적재된 (superimposed), 어플라이된 (applied), 증기-침착된 (vapour-deposited) 또는 집적집적된 (integrated) 파장 필터를 갖는 통상적인 광다이오드 바이오센서도 또한 본 발명의 방법을 실시하는 데 적합하다. 따라서, 실리콘 디옥시드와 대조적으로 예를 들어, 실리콘 니트리드 (silicon nitride)는 UV에 불투명하고 폴리실리콘은 UV를 흡수한다. 따라서, 니트리드 또는 폴리실리콘은 통상의 CMOS 공정에 있어서, 게이트 옥시드 층상에 침착될 수 있고 결과적으로 광다이오드 상에 상응하는 필터가 제조된다. 예를 들어, NADH (nicotinamide adenine dinucleotide)는 350 ㎚의 여기 파장을 가지며, 450 ㎚의 방출 파장을 갖는다.따라서, 350 ㎚를 여과하는 필터를 적용하여 민감도를 높일 수 있다. 상기 효과는 본 발명의 방법에 사용되어 분별 검출을 가능하게 할 수 있으며, 예를 들어, 두 다른 발색단을 병렬로 사용하는 경우, 이 중 단지 하나는 UV 영역에서 광을 방출하며, 이는 상기 목적을 위해 제공된 검출기가 UV-민감성 구조이거나 또는 아니기 때문이다. 추가적으로 상기 효과는 측정과정으로부터 적당한 필터를 제공하는 것에 의하여 존재하게 되는 공지된 방출 파장을 갖는 물질의 간섭적인 자체 형광을 제거하는 기회를 제공한다.
이것의 한 예가 유로퓸 (약 620 ㎚ 방출) 및 구리 도프된 징크 설피드 (약 525 ㎚ 방출)의 병렬 사용으로 충분히 서로 다른 방출 파장 범위는 한 검출 필드 내에서 이색 검출을 가능하게 하며, 이것은 예를 들어, 검출 필드의 검출기 반은 저-패스 (low-pass) 필터로 나머지 반은 고-패스 (high-pass) 필터로 설치하는 것에 의한다.
첨가적으로 또는 택일적으로, 다른 발색단을 병렬로 사용할 수 있으며, 이들의 물리적 및/도는 광학적 특성이 충분히 달라야 한다. 예를 들어, 사용되는 두 발색단 A 또는 B의 다른 여기 파장 및/또는 이들의 다른 반감기를 이용하다. 예를 들어, 두 개의 다르게 도프된 나노크리스털을 제공하는 것에 의하여 이루어진다. 후자의 다른 반감기의 경우 방출을 두 연속적인 측정 시간 T3및 T4에서 기록한다. 특정 수집체/분석물 복합체의 검출 또는 측정 및 선택적으로 정량은 최소 한 타입의 바람직하게는 수개 타입의 수집 분자체를 바이오센서 지지체의 표면상에 부동화 (fixation) 및 바람직하게는 고정화 (immobilisation)하는 것을 필요로 한다. 바람직한 구현예에 따르면, 상기 고정은 표면 상에 층으로 침착된 연결 물질을 사용하여 이루어진다. 상기 목적을 위하여, 전형적으로 금속 또는 메탈로이드 옥시드 예를 들어, 알루미늄 옥시드, 석영 유리 또는 유리로 제조된 바이오센서 표면을 이작용기성 물질 (소위 "링커 (linker)"), 예를 들어, 지지체 표면에 연결될 할로겐-실란 (예를 들어, 클로로실란) 또는 알콕시실란 기를 갖는 물질의 용액에 담가 자체-조직화 단일층 (self-organising monolayer, SAM)이 형성되며, 이를 통하여 센서 표면 및 수용체 사이의 공유 결합이 형성된다 예를 들어, 코팅은 글리시딜 트리에톡시 실란으로 실시될 수 있으며, 1% 실란 톨루엔 용액에 담그고 천천히 빼내어 120℃에서 구워서 이루어진다. 이 방법으로 제조된 코팅은 일반적으로 수 옴스트롱 (angstrom)의 두께를 가진다. 링커 및 수집체 분자 사이의 연결은 적절한 추가적인 작용기 예를 들어, 아미노 또는 에폭시기을 통하여 이루어진다. 다양한 다른 수용체 분자들, 특히 생물체에서 유래한 것을 포함하는 분자들을 다수의 지지체 표면에 연결하는 것에 적절한 이작용기성 링커는 당업자에게 공지되어 있다.
검출될 생분자들이 핵산을 포함하는 경우에는 적합한 DNA 프로브가 수집체 분자로서 적용되고 고정화될 수 있으며, 이것은 현재 이용가능한 프린팅 기기에 의한다.
예를 들어, 바이오틴화된 DNA을 이용한 혼성화는 정립된 방법에 따라 상기 방법으로 제조된 바이오센서 상에서 실시될 수 있다. 예를 들어, PCR (polymer chain reaction) 및 바이오틴 dUTP의 삽입에 의하여 생성될 수 있다. 혼성화 동안, 상기 바이오틴화 된 DNA는 각각의 검출 필드에 바이오센서 상에 고정화된 상보적인 가닥에 결합한다. 양성의 (성공적인) 혼성화는 스트렙타비딘/아비딘 및 발광단의 접합체를 첨가하여 보여질 수 있다. 본 발명에 따르면, 다음의 것이 발광단 접합체로 특히 적절하다: 유로퓸, 테리븀 및 사마륨 킬레이트 및 아비딘/스트렙타비딘을 통하여 Eu, Sm 및/또는 Tb 킬레이트로 로드된 미세구 ("bead"). 특히 적절한 것은 발광 미세구 예컨대, FluoSpheres Europium (Molecular Probes F-20883)으로 많은 수의 형광단을 단일 결합으로 고정할 수 있기 때문이다. 또한 본 발명에 따라 적합한 것은 나노크리스털로서 예컨대, Quantum Dot 사의 " Quantum-DotsTM" 등의 것이 있다. 비결합된 표지된 분석물 및/또는 부유하는 발광 다이 (dye)들을 제거하기 위하여 세척하고 적절한 여기 (excitation) 및 여기광원을 끈 상태에서 시간분해 형광의 측정을 통하여 상기 결합의 측정이 이루어진다.
본 발명에 따르면, 여기 기간 (여기 시간 )은 T1로, 여기 및 측정 (약화 시간, die-away time) 사이의 기간은 T2로 그리고 측정 기간 (측정 지속 시간)은 T3으로 그리고 필요하다면, 두 번째 측정 기간은 T4로 기개된다. 바람직하게 T1은 1 나노초 내지 2 밀리초이고 T2는 1 나노초 내지 500 마이크로초, 바람직하게 1 내지 5 ㎱, 그리고 T3은 5 나노초 내지 10 밀리초, 바람직하게는 5 ㎱ 내지 2 ㎳이다.
본 발명의 방법은 추가적인 선행하는 단계로 수집체 분자를 상기 수집체 분자에 대한 리간드를 포함하는 것으로 생각되는 시료에 접촉시키는 단계 및 필요하다면 바이오센서를 세척하는 단계를 포함할 수 있다. 바람직하게 분석물은 발광단으로 표지화되고 검출은 분석물 및 수집체 사이의 복합체 형성전에는 이루어지지 않는다.
검출기 또는 검출기(들)로부터의 신호는 기록 유닛에 의하여 기록된다. 기록 유닛은 아날로그 검출기 신호를 저장되는 디지털 값으로 전환하는 매우 빠른 전환기를 갖는다. 상기 디지털 값의 평가는 바람직하게는 실시간으로 실행되나, 시간이 지난 후 이루어질 수 도 있다. 통상의 마이크로프로세서를 디지털 값을 평가하기 위하여 사용할 수 있다. 상기 평가는 측정 기간 T3 동안에만 이루어지고 필요하다면 T4에서 이루어진다.
발광 신호가 너무 약하여 불명확한 검출이 이루어지는 경우에는, 수 개의 개별적인 측정을 합하는 것에 의한 검출의 바람직한 구현예에 따름으로 하여 검출기의 민감도의 확장을 달성할 수 있다. 이를 실행함에 있어서, 동일한 측정을 수회하고 (단계 (1) 내지 (3) 또는 (1) 내지 (4) 수회 반복) 측정의 결과를 합한다. 이것은 센서칩에서 직접적으로 이루어지거나 적절한 소프트웨어를 통하여 측정 후 이루어진다.
예를 들어, 단계 (1) 내지 (3)을 포함하는 개별적인 측정은 다음과 같다: 여기 시간 T1동안 검출기로서의 광다이오드는 여기 상태에 상대적으로 무감각 모드에 있다. 여기원은 이 기간동안 활성 상태에 있다. T2기간 동안 여기원 및 광다이오드는 비활성 상태에 있다. 이 기간 동안 배경 발광이 약화 (die-away)된다. T3기간 동안 상기 광다이오드는 활성 상태이고 발광단으로부터의 하나 내지 수 개의 부수적인 광자를 검출한다. 검출 과정은 광다이오드를 비활성 모드로 재설정하여 반복할 수 있다. 각각의 시간 간격은 예를 들어, 2 ㎳ (T1), 5 ㎱ (T2) 및 2 ㎳ (T3)으로 선택될 수 있다. 적절한 신호 강도를 고려하여, T3시간 간격은 사용된 발광단(들)의 여기 상태의 반감기 보다 매우 짧게 할 수 있다.
반복적인 여기의 특히 바람직한 구현예에 따르면, T3시간 간격에서 얻어진 검출기 수치는, 선택적으로 디지털화 및 추가적인 전자적 처리 후에, 개별적인 시간 간격에 할당된 메모리 셀에 보관된다. 예를 들어, 이런 종류의 보관 메모리는연속적인 시간 간격에 할당된 100 또는 그 이상의 메모리 셀을 갖는다. 상기 시간 간격은 바람직하게는 1 내지 100 나노초 범위이다.
보다 바람직하게, 검출기로부터 얻어진 신호는 신호 세기에 따라 분석될 수 있으며, 신호의 원천인 개별적인 분자의 수 (수집체/분석물 복합체의 수)에 관한 결정이 가능하며 따라서, 정성적일 뿐만 아니라 정량적인 분석도 가능하게 된다. 발광단의 수에 상응하는 단위 수치의 곱은 메모리 셀에 저장된다.
상기의 메모리 보관 과정은 각각의 개별적인 측정에 대해 새롭게 이루어지며, 반복 여기가 요구된다면, 즉, 단계 (1) 내지 (3)를 수회 거친다면, 합산이 실행된다. 상기 과정에서, 측정 후 특정 메모리 셀에 보관된 단위 수치 또는 필요하다면 이들의 곱은 셀에 이미 존재하는 수치에 더해진다. 특정 검출 필드에 대한 측정에서 이런 방법으로 얻어진 합계 곡선은 어떤 및/또는 얼마나 많은 발광성 분석물이 검출 필드에 결합되어 있는 가를 확인하기 위하여 평가될 수 있다. 원리적으로 다수의 다른 분석물에서 얻어진 신호 곡선에 대해 사용될 수 있는 이런 평가 방법은 합계 곡선에 적용할 수 있다. 수 피코초의 정밀도를 갖는 발광 현상의 절대적인 기록은 광자 통계의 글로벌 분석을 가능하게 한다. 글로벌 광자 분포에서 특징적인 축적 또는 정지를 인식하고 결정할 수 있다. 이것은 시스템의 트리플렛 지속 기간 및 반응 동역학의 결정을 가능하게 한다. 동일하게 이런 방법으로 검출 부피를 통하여 확산 시간을 측정할 수 있으며, 이것은 분석물 분자의크기를 결정하는 것을 가능하게 한다. 입력된 조사 (radiation)에서의 광자수에 상대적으로 5 내지 10%의 총 광자 수집 효율을 이런 시스템에서는 달성할 수 있다. 이것은 약 80%의 발광단 흡수 효율, 약 90% 방출 확률 및 70% 까지의 검출기 민감도로부터 기인한다.
본 명세서에서, 조절 유닛은 바람직하게는 T1시간 간격 동안 여기원을 활성화하고 T2시간 간격의 경과 후 T3 시간 간격 동안 검출기를 활성화하도록 디자인된다. 이런 조절 유닛은 시간분해 발광 측정을 가능하게 한다. 여기원이 활성화되는 T1시간 간격의 목적은 분석물 상에 고정되어 복합체에 결합된 발광단을 여기 상태로 전이시키고 발광성 광의 방출과 함께 더 낮은 에너지 상태로 전이하도록 하는 것이다. 약화 시간 T2의 목적은 시료 및/또는 지지체 물질의 어떤한 자발적인 발광으로 검출하고자 하는 분자의 군에서 방출되는 것이 아닌 발광을 측정에서 제거하기 위함이다.
검출기(들)는 최소 측정 기간 T3(및 선택적으로 T4) 동안 활성화되고 수집체/분석물 복합체로부터의 발광 조사를 수용한다. 선택되는 T3의 바람직한 시간은 5 ㎱ 내지 2 ㎳이다. T3시간 동안, 검출기 신호는 신호 높이 및 시간에 대하여 기록 유닛에 수집되고 평가된다. 개개의 또는 최소 수 개의 분자에 대하여 측정이 실시되는 경우 T3시간 간격에 얻어지는 것은 전형적인 방광 소멸 곡선이 아니고 예를 들어 단일 분자의 경우, 그것은 개별적인 분자가 시간 또는 시간 간격에서 모멘트를 특징화하는 신호 피크이다. 상기 측정을 반복함으로써 통계적인 평가를 통하여 발광 지속기간(lifetime)을 확인하는 것이 가능하다.
보다 바함직한 구현예에서, 수집체 분자로서 아직 혼성화되지 않은 DNA로부터 및/또는 수집체 분자가 고정화되지 않은 검출기로부터 (배경 발광) 및/또는 비표지된 수집체/분석물 복합체, 즉, 어떤 발광단을 디스플레이하지 않는 것 (예컨대, 발광단이 없는 혼성화된 DNA)으로부터의 신호를 메모리에 참조치 또는 대조치로서 저장하여 발광단의 실제적인 검출 동안 검출 신호로부터 기록된 "간섭 신호"를 계산할 수 있도록 만들 수 있다 (참조 도 4).
통계적인 평가에 따라 T3내의 수정의된 시간 간격에서 얻어진 세기를 합할 수 있다.
상기 방법을 사용하는 방법은 당업자에게 명확하다. 참고로서, WO 98/09154에 기재된 것을 참조한다.
본 발명은 실시예 사용 및 첨부된 도면을 참조로 자세히 예시된다.
마이크로칩 형태의 본 발명에 따른 바이오센서의 제조
센서를 6"(인치) 와퍼 (wafer)를 사용하여 0.5 ㎛ CMOS 공정으로 제조한다. 각각의 pn 광다이오드를 p-기재 상의 n-트로프 (trough)에 배열한다. 필드 산화 후에, 광다이오드의 p-영역의 데피니숀 (definition) 및 10 ㎚ 두께의 게이트 옥시드 층의 적용이 이루어 진다. 그 다음, 실리콘 다이옥시드 층을 적재 및 구조화가 이루어 진다. 마지막으로 다른 통상의 CMOS 단계 예컨대, 배선층 (wiring layer)의 적용 및 표면 안정화 (긁힘 보호)를 실시한다.
CMOS 바이오센서의 코팅
상기처럼 제조된 CMOS 센서를 1% GOPS (glycidyloxypropyl triethoxysilane) 및 0.1% 트리에틸아민의 톨루엔 용액에 약 2 시간 담가 (dipping) 실란으로 코팅한다. 마이크로칩을 용액으로부터 분리하여 잠시 적하 건조 (dripping dry)하고 건조 상자에 120℃에서 2시간 동안 고정한다. 상기 방법으로 코팅된 마이크로칩은 생접합 (bioconjugation)시까지 습기가 없는 상태에서 보관될 수 있다.
올리고뉴클레오티드 프로브 생접합
통상적인 기술을 사용하여, 상기처럼 코팅된 마이크로칩을 5'-아미노-변형된 비-접촉 공정에 의해 올리고뉴클레오티드 프로브로 프린트하였다. 이를 위하여, 올리고뉴클레오티드 프로브를 PBS 완충액내 5 μM 용액으로 제조된다. 프린팅 후, 50℃, 습윤 챔버에서 커플링 반응을 계속 실시한다. 그 다음, 마이크로칩을 증류수로 씻어주고 메탄올로 세척하여 건조한다. 연기후드에서 증발시켜 어떤 용매도 존재하지 않도록 한다.
시료의 준비
해모크로마토스 (haemochromatose) 유전자 단편을 인간 DNA 분리주 (isolates)로부터 PCR (Polymerase Chain Reaction)에 의해 증폭한다. 적합한 프라이머 서열을 증폭에 사용하며, 그 예는 US 특허 제 5,712,098 호에 기재되어 있다.
상기 반응 혼합물은 다음의 표준 시약을 (프라이머: 0.5 μM, dATP, dCTP, dGTP: 0.l mM, dTTP 0.08 mM, PCR 완충액, MgCl2: 4 mM, HotStarTaq (Perkin Elmer) 2 units/50 ㎕)포함하며 Biotin-11-dUTP (0.06 mM)을 첨가한다. PCR 반응 (35 사이클, 5 분 95℃, 30초 95℃, 30초 60℃, 30초 72℃, 7분 72℃) 동안 Biotin-dUTP는 새로 합성되는 DNA에 삽입된다. T7 Gen6-exonuclease (100 units/50 ㎕ PCR mix)를 첨가하고 상기 혼합물을 가열 (30분 37℃, 10분 85℃)하여 단일 가닥 DNA를생산한다.
혼성화 (hybrising)
상기 반응 배치를 현미경 덮개 유리 아래에서 5 x SSPE, 0.1%SDS (12 ㎕) 완충액 내에서 2시간 동안 50℃, 습윤 챔버에서 마이크로칩에 혼성화한다. 그 다음 2 x SSPE, 0.1% SDS로 씻어주고 마이크로칩을 물로 세척한다.
표지화
5% BSA, 0.2% Tween 20 및 4 x SSC 완충액으로 구성되고 0.001% 고형 미세구 (Europium Luminescence Microsphere, Neutravidin-caoted 0.04 μM, Molecular Probes F20883)가 현탁된 표지화 용액을 마이크로칩에 부어 표지화를 실시한다. 상기 반응은 편심 텀블러 혼합기 (eccentric tumbler mixer)로 교반하면서 30분 동안 실시한다. 그 다음 존재할지 모르는 비-결합 미세구는 2 x SSC, 0.1% SDS로 세척하여 제거한다.
항-디그옥시게닌-IgG 코팅된 미세구(anti-digoxigenin-IgG-coated microspheres)의 제조
미세구의 제조사 (Molecular Probes)의 지침서에 따라 0.04 μM의 플루오스피어 플래티늄 발광 미세구 (Fluospheres Platinum Luminescent Microspheres, F20886)를 단일항체 항-디그옥시게닌-IgG 항체 (염소)로 변형한다. 그 다음, 코팅된 미세구 배제 크기가 300 kD의 투석 슬리브 (sleeve)로 PBS에 대해 투석하고 5회 완충액을 교환하였다.
센서칩 상에서의 이색 검출 (Two-colour detection)
상기처럼 두 개의 PCR 결과물을 제조하고 그 중 하나의 경우 바이오틴-11-dUTP를 등몰량 (equimolar amount)의 디그옥시게닌-dUTP으로 대체한다. 두 반응 배치를 동일한 방법으로 다루며, 마이크로칩 상에서 1:1 혼합물로 혼성화되었다. 표지화는 상기 고형 미세구 (Europium Luminescence Microsphere, Neutravidin-caoted 0.04 μM, Molecular Probes F20883) 및 표지화 완충액 내의 항체-변형된 구의 1:1 혼합물로 실시한다. 플래티늄구의 여기 (excitation)는 400 ㎚ (광원: 제논 램프 및 단색광화 장치)에서 실시하며, 유로피움구의 여기는 370 ㎚ (광원: 제논 램프 및 단색광화 장치)에서 실시한다. 마이크로칩의 조사 (illumination)는 광섬유을 통하여 실시하며, 염색물질의 발광 스펙트럼은 개별적으로 기록된다. 택일적으로, UV-LED (필터 없이)로 조사하고 양 염색물질의 발광을 기록하고 다음에 발광 붕괴 동역학의 프로파일을 통하여 평가한다.

Claims (29)

  1. (a) 최소 한 타입의 수집체 분자가 고정화되는 표면을 갖는 지지체,
    (b) 상기 표면을 가로지르는 광을 검출하는 최소 하나의 검출기, 및
    (c) 선택적으로 발광성 광의 방출을 유도할 수 있는 최소 하나의 여기원 (excitation source)을 포함하며, 상기 표면은 상기 여기원으로부터의 광에 대한 어떠한 삽입된 파장 필터가 없는 상기 검출기의 측정 표면 또는 상기 검출기 위에 배열된 층의 표면인 것을 특징으로 하는 발광에 의하여 수집체/분석물 복합체를 검출하기 위한 마이크로칩 형태의 광학적 바이오센서.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 바이오센서는 발광단 (luminophore)이 발광성 광을 방출하도록 유도하는 여기원을 포함하는 것을 특징으로 하는 광학적 바이오센서.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 표면 및 상기 검출기의 상기 측정 표면 사이의 공간 거리가 10 ㎛ 이하인 것을 특징으로 하는 광학적 바이오센서.
  4. 선행하는 청구항 중 어느 항 항에 있어서, 상기 수집체 분자는 상기 표면에공유결합되어 있고 그리고/또는 상기 검출기(들)은 상기 지지체에 집적된 것을 특징으로 하는 광학적 바이오센서.
  5. 선행하는 청구항 중 어느 항 항에 있어서, 필름 형태의 상기 검출기(들)는 상기 지지체에 접착되어 있는 것을 특징으로 하는 광학적 바이오센서.
  6. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 항 항에 있어서, 상기 검출기(들)는 마이크로칩의 부근에 배열되고 마이크로 칩으로부터 일정한 거리를 두는 것을 특징으로 하는 광학적 바이오센서.
  7. 선행하는 청구항 중 어느 항 항에 있어서, 최소 하나의 상기 검출기(들)는 여기원으로 동시에 작용할 수 있는 광다이오드인 것을 특징으로 하는 광학적 바이오센서.
  8. 선행하는 청구항 중 어느 항 항에 있어서, 상기 최소 하나의 타입의 수집체 분자는 개별적인 검출 필드 또는 매트릭스 또는 패턴의 형태로 상기 표면에 고정화된 것을 특징으로 하는 광학적 바이오센서.
  9. 선행하는 청구항 중 어느 항 항에 있어서, 상기 수 개 타입의 수집체 분자가 상기 표면에 고정화된 것을 특징으로 하는 광학적 바이오센서.
  10. 제 8 항에 있어서, 다른 수집체 분자는 다른 검출 필드 또는 상기 매트릭스의 구분되는 위치에 고정되는 것을 특징으로 하는 광학적 바이오센서.
  11. 선행하는 청구항 중 어느 항 항에 있어서, 상기 수집체 분자는 단일 또는 이중-가닥 핵산, 핵산 유사체, 햅텐, 단백질, 펩타이드, 항체 또는 이들의 단편, 당 구조물, 수용체 또는 리간드로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 광학적 바이오센서.
  12. 선행하는 청구항 중 어느 항 항에 있어서, 상기 바이오센서는 조절 유닛, 최소 하나의 증폭기, 하나 이상의 신호 변환기, 하나 이상의 메모리/저장 유닛, 하나 이상의 필터, 광학 시스템, 광 가이드 및 하나 이상의 보호층으로 구성된 군으로부터 하나 이상의 요소를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 광학적 바이오센서.
  13. 선행하는 청구항 중 어느 항 항에 있어서, 상기 바이오센서는 수 개의 검출기를 포함하는 것을 특징으로 하는 광학적 바이오센서.
  14. 제 13 항에 있어서, 각각의 검출기는 하나의 필드 또는 상기 매트릭스의 하나의 지점에 할당되고, 바람직하게는 상기 필드 또는 지점 아래에 배열되고 측정 표면 영역의 크기는 필수적으로 상기 필드 크기에 상응하는 것을 특징으로 하는 광학적 바이오센서.
  15. 선행하는 청구항 중 어느 항 항에 있어서, 상기 수집체 분자는 상기 표면의 함몰 (depression)의 바닥에 배열되고 상기 함몰의 바닥은 표면으로부터 최소 100 ㎚ 들어간 것을 특징으로 하는 광학적 바이오센서.
  16. (a) 최소 한 타입의 수집체 분자가 고정화되는 표면을 갖는 지지체,
    (b) 상기 표면을 가로지르는 광을 검출하는 최소 하나의 검출기, 및
    (c) 선택적으로 발광성 광의 방출을 유도할 수 있는 최소 하나의 여기원을 포함하는 마이크로칩 형태의 광학적 바이오센서를 이용하여 시간분해발광 (time-resolved luminescence)에 의하여 수집체/분석물 복합체를 검출하는 방법에 있어서, 단계 (1)에서 상기 수집체 분자 및/또는 상기 분석물/수집체 복합체에 결합된 발광단을 여기 시간 T1동안 여기 상태로 전환하며, 단계 (2)에서 필수적으로 , 약화 (die-away) 시간 T2동안 여기가 없고 그리고 그 후 단계 (3)에서 방출된 발광성 광이 최소 하나의 검출기에 의해 T3동안 검출되며 복합체 검출을 위하여 평가되는 것을 특징으로 하는 수집체/분석물 복합체를 검출하는 방법.
  17. 제 16 항에 있어서, 상기 단계 (3)에서 분석물/수집체 복합체는 다른 파장의 발광성 광의 병렬 검출에 의해 병렬적으로 검출되는 것을 특징으로 하는 수집체/분석물 복합체를 검출하는 방법.
  18. 제 16 항 또는 제 17 항에 있어서, 상기 방법은 단계 (3)에서 검출되는 파장과 다른 파장에서 방출되는 발광성 광이 차후적인 시간 T4동안 검출되고 두 번째 복합체의 검출을 위하여 평가되는 단계 (4)를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로하는 수집체/분석물 복합체를 검출하는 방법.
  19. 제 16 항 내지 제 18 항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 여기는 단계 (1)에서만 이루어지는 것을 특징으로 하는 수집체/분석물 복합체를 검출하는 방법.
  20. 제 16 항 내지 제 19 항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (1) 내지 (3) 또는 (1) 내지 (4)는 수 회 실시되는 것을 특징으로 하는 수집체/분석물 복합체를 검출하는 방법.
  21. 제 16 항 내지 제 20 항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 수집체 분자를 분석물로서 수집체 분자의 리간드를 함유하는 것으로 추측되는 시료와 접촉시키는 선행 단계 및 필요한 경우 상기 바이오센서을 세척하는 것을 추가적으로 포함하는 하는 것을 특징으로 하는 수집체/분석물 복합체를 검출하는 방법.
  22. 제 16 항 내지 제 21 항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 리간드는 발광단으로 표지되고 분석물/수집체 복합체의 형성이 이루어지는 경우 검출이 이루어지는것을 특징으로 하는 수집체/분석물 복합체를 검출하는 방법.
  23. 제 16 항 내지 제 22 항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 T1은 1 나노초 (nanosecond) 내지 2 밀리초 (millisecond)인 것을 특징으로 하는 수집체/분석물 복합체를 검출하는 방법.
  24. 제 16 항 내지 제 23 항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 T2는 1 나노초 (nanosecond) 내지 500 밀리초 (millisecond)인 것을 특징으로 하는 수집체/분석물 복합체를 검출하는 방법.
  25. 제 16 항 내지 제 24 항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 T3은 5 나노초 (nanosecond) 내지 10 밀리초 (millisecond)인 것을 특징으로 하는 수집체/분석물 복합체를 검출하는 방법.
  26. 제 16 항 내지 제 25 항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 발광단은 희토류금속 또는 악티늄족 원소 금속, 특히 유로퓸, 테르븀 및 사마륨; 클래스 II-VI, III-V 및 IV의 반도체로 선택적으로 도핑되고 (doped), 특히, CdSe, CdS 또는 ZnS; 및 알카리 토금속 플루오라이드, 특히 CaF 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 수집체/분석물 복합체를 검출하는 방법.
  27. 제 26 항에 있어서, 상기 발광단은 나노크리스털, 비드 또는 킬레이트의 형태로 사용되는 것을 특징으로 하는 수집체/분석물 복합체를 검출하는 방법.
  28. 제 16 항 내지 제 27 항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 핵산, 핵산 유사체, 단백질, 펩타이드, 햅텐, 항체 또는 이들의 단편, 당 구조물, 수용체 또는 리간드를 검출하기 위한 것을 특징으로 하는 수집체/분석물 복합체를 검출하는 방법.
  29. 제 16 항 내지 제 28 항 중의 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 제 1 항 내지 15 항 중 어느 항 항의 바이오센서를 사용하는 것을 특징으로 하는 수집체/분석물 복합체를 검출하는 방법.
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