TWI306119B

TWI306119B - Biosensor and method for detectiong analytes

Info

Publication number: TWI306119B
Application number: TW091115998A
Authority: TW
Inventors: Holger Klapproth; Mirko Lehmann
Original assignee: Micronas Gmbh
Priority date: 2001-07-18
Filing date: 2002-07-18
Publication date: 2009-02-11
Also published as: DE10133844B4; EP1410030A1; KR20040025932A; DE10133844A1; WO2003008974A1; US20040249227A1; JP2005512022A; KR100907880B1; US20090317917A1

Description

A7 1306119 ____B7____ 五、發明言兒明（ ) 7'"Ή ~~~一 ’ '车Λ曰修(盡)正替換頁發明領域本發明一般是有關於光學偵測分析物之微晶片形式的生物感應器，以及利用此生物感應器之方法。特別地，本發明是有關於藉由時間解析（time-resolved)的發光測量而偵測分析物之生物感應器，以及對應之方法。 ; 先前技藝之說明基本上利用平面系統，特別是專家們說明爲生物感應器或生物晶片，也就是，微晶片形式的生物感應器，以用於在欲分析的樣品中，定性及/或定量偵測特定物質（例如，生物分子）的存在，是先前已知的。這些生物晶片包括一支持物，其表面上通常建構有複數的偵測場（detection fields)，大多數情況呈矩陣排列，藉此個別的偵測場或區：域及/或區域群，在對於要偵測的特定分析物之專一性上，彼此互相不同。在偵測DNA分析物的例子中，大部分是單股形式的特定核酸探針（例如，寡核苷酸探針或互補DNA (cDNA))，其對於要分析的核酸之個別專一性，基本上是由其序列發展（探針設計）而預定，是位於（直接或間接固定於）支持物表面的個別區域內。以此方式官能化的 f 微晶片表面，在適當的偵測方法中，在確保它們將與固定 ί 的探針分子雜合的條件下（如果先前可偵測標示之標的核丨酸存在的話），是用於接觸可能包含要偵測的DNA分析物 ί 之樣品。在大部分的例子中，一種或多種專一性形成的雜 i 合複合物之定性以及（如果需要的話）定量的偵測，是藉 3 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

Ϊ306119 A7 賴頁 .,_________ _B7 ! /__ ί五、發明說明（） Γ - : I 由光學發光測量以及個別偵測場所得到的資料之分配而事後發生，藉此可測定樣品中DNA分析物之存在，以及如果

I 需要的話，並可定量。已知這個技術也可用於偵測其他可偵測標示之分析物，特別是蛋白質的物質（胜肽、蛋白質、抗體以及其功能片段），其限制條件爲偵測反應是根據發光資料的測量而定。例如，已知胺基酸酪胺酸顯示特有的螢光，其在大約 260奈米（nm)激發後的半衰期，可用於本發明，這甚至 I 無須額外地標示具有酪胺酸基團之蛋白質物質。因此，使用胜肽作爲收集物分子，可偵測蛋白質的物質，例如，抗 I：體或其片段爲分析物，這甚至無須事先以適當的發光體標示後者。換句話說，這個技術可進行任何以發光爲基礎，而偵測可偵測標示的分析物（要分析的樣品中之成份）以及收集物分子（固定的支持物成份）之複合物，甚至包括特徵爲可偵測的固有螢光之系統，因此，不需要任何其他的標示。此外，這個技術也可應用於測量污染物，例如，多環碳氫化合物或其他的有機物質。已知許多代表性的多環碳氫化合物基團，顯示多達450奈秒（ns)之螢光半衰期，因此，可選擇作爲分析物，而無須額外的標示（例如，具有336奈米激發的在（pyrene))。因此，這些多環碳氫化合物可藉由以下事實而偵測，即它們分析物結合到如收集物分子般專一性產生的抗體，並且在適當的激發後產生發光。 4 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 χ 297公釐） (請先Μ讀背面之注意事項再填寫本頁)

1306119 __B7 __ 五、發明說明（）除了實際的生物晶片或感應器晶片之外，以發光偵測爲基礎並且在先前技藝中已知的系統，特別包括獲得、傳送以及評估發光訊號的裝置。然而，市面上的產品是相當昂貴的，因爲需要在其間具有高度複雜性之大量的系統成份，並且基本上無法再進一步的微小化。 WO 99/27140說明微晶片形式的生物感應器，其包括嵌入的偵測器，以及可視需要地，藉由發光測量而用於偵測數種生物分析物之嵌入的激發源。這份文件教示在每個發光測量中之平行（parallel)的激發以及測量。不可避免的結果是，波長濾波器是插入在發光體所固定的表面上以及偵測器之間的生物感應器上，以遮蔽激發光，並使得發光可被選擇性地偵測。強迫提供的濾波器會減少光產量，及/或使得生物感應器的製造變得更昂貴。因此，本發明的任務是要提供先前類型之新穎的生物感應器，但已克服在此技藝中所已知的系統之缺點。本發明的另一任務是要提供一種更靈敏的方法，以偵測及/或測定一種或多種假設包含分析物的樣品中之分析物。發明槪述本發明的任務是藉由微晶片形式的光學生物感應器而解決，以藉由發光而偵測收集物/分析物複合物，該生物感應器包括（a)具有表面之支持物，在其上固定有至少一種類型的收集物分子；（b)至少一個，較佳是數個偵測器，其可偵測通過表面的光；以及（c)可視需要地，至少一種 5

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本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公f ) 1306119 μ 1月叫日碑y',正替換頁 _B7_' 丨….一.一士_____^ 1 " 丨 ~ ^ 五、發明說明（）可誘發發光之激發源’其中該表面是偵測器的測量表面，；或是排列在偵測器上的一層表面，而無任何對於來自激發源的光之插入的波長濾波器。較佳地，生物感應器包括一種或多種可誘發發光體之激發源，以發散發光，以及最佳是整合至生物感應器中。根據較佳具體實例，微晶片是具有整體的設計，以及偵測器是整合至支持物中。或者，薄膜形式的偵測器可藉由黏著劑而連接到支持物。或者，偵測器的位置可接近於表面，但如果需要的話，可位在與表面有相當距離的位置。最佳地，在表面訊號來源/發光被散射處）以及偵測器的測量表面（=訊號被偵測處）之間的距離，是不超過10微米，更佳是不超過 5微米，以及最佳是不超過1微米。在一較佳具體實例中，至少一種類型的收集物分子是固定在該表面上個別偵測場或呈矩陣的形式。更佳地，數種類型的收集物分子是固定在表面上。最佳地，不同類型的收集物分子是固定在不同類型的偵測場或矩陣的不同位置上。較佳地，收集物分子是選擇自由單股或雙股核酸、核酸類似物、半抗原（haptene)、蛋白質、胜肽、抗體或其片段、糖類結構、受體或配體所組成的族群中。根據較佳具體實例，本發明之生物感應器除了一種或多種由控制單元所組成的元件之外，還可包括至少一放大器、一種或多種的訊號轉換器、一種或多種的儲存/記億體單元、一種或多種的濾波器、光學系統、光導（光學纖維 6 f請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} -------訂---------線一 j本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1306119 A7作7月y(日修(〆)正替換頁 _-^L——~ 丨五、發明說明（） )以及一種或多種的保護層；限制條件爲，對於來自激發源或激發波長的光，沒有波長濾波器被排列或插入在偵測器以及收集物分子所固定的支持物表面之間。如果本發明之生物感應器包括數個偵測器的話，則較佳地，每個偵測器都分配到矩陣的一個場或一個位置，更佳是排列在這個偵測場或位置之下，以及測量表面的大小 _ - 基本上是對應於偵測場的大小。以此觀點，較佳的具體實例是收集物分子排列在支持物表面凹處以及在後者的基底處，藉此凹處的基底是比表面降低至少100奈米（nm)。本發明同樣是有關於一種藉由時間解析（time-resolved)的發光並利用微晶片形式的光學生物感應器而偵測分析物/收集物複合物之方法，該生物感應器包括（a) 具有表面之支持物，在其上固定有至少一種類型的收集物分子；（b)至少一個，較佳是數個偵測器，其可偵測通過表面的光；以及（c)可視需要地，至少一種可誘發發光之激發源；該方法包括步驟（1)到（3)，其中，在步驟（1 )中，結合至收集物分子及/或分析物/收集物複合物之發；光體，係轉換成激發態達一段激發時間T!;在步驟（2) 中，基本上沒有一段衰減（die-away)期間T2之激發；以及在之後的步驟（3)中，所發射的發光是藉由至少一種偵測器而偵測一段時間Τ3 (測量期間）並評估，以偵測該複合物。根據一具體實例，在步驟（3)中，各種的分析物/收 7 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1306119 五、發明說明（）集物複合物可藉由，例如，不同波長的發光之平行偵測而偵測。同樣地，此方法可包括另一步驟（4)，其中，在不同於步驟（3)偵測到之波長所發射的發光，係經偵測達一段後續的期間T4並經評估，以偵測第二複合物。在上述所有的例子中，較佳的方法是激發僅發生在步驟（1)者。步驟（1)到（3)或步驟（1)到（4)可進行數次。此外，本發明上述說明之方法，可包括前述將收集物分子與假設包含收集物分子的配體分析物）之樣品接觸的步驟，以及可視需要地，淸洗生物感應器的步驟。根據較佳具體實例，分析物是經發光體而標示，並且會一直偵測，直到複合物在分析物以及收集物分子之間形成爲止。較佳地，發光體是選擇自由稀土金屬或銅系金屬（特別是銪、铽及釤）；第II-IV、III-V及IV類型的半導體，視需要是摻雜的（特別是CdSe、CdS或ZnS);以及鹼土金屬氟化物（特別是CaF)及其混合物所組成的族群中。最佳地，發光體是奈米晶體（nanocrystals)、小珠或螯合物的形式。此方法可專一性地進行，以偵測核酸、核酸類似物、蛋白質、胜肽、半抗原、抗體或其片段、糖類結構、受體或配體。在每個例子中，較佳是使用上述之生物感應器，以進行本發明之方法。

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本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公f ) 1306119 A7 ____ B7_____ 五、發明說明（）圖示之簡單說明第1圖槪要顯示本發明生物感應器（1)的功能部份，其係由互補性金屬氧化物半導體（CMOS)製程所製造。' 光學偵測器，例如，pn二極體（2)，是以絕緣體（例如 ’場區氧化層）（4)而覆蓋。在光學偵測器及/或偵測器場的區域中之防刮層（3)，是向下蝕刻銳緣或階梯式的，使得收集物分子（例如，DNA探針）（6)排列在凹陷的範圍。感應器晶片的防刮層表面，其並未參與偵測本身，可藉由塗佈例如，貴金屬或疏水性/親水性材料（5)而改質。第2圖顯示根據本發明，在生物感應器（1)上，也可提供偵測器及/或偵測器場，如圖示的左半部所示，其並沒有以收集物分子（例如，DNA探針）（6)印刷或包覆。此目的是要計算來自雜合的DNA之專一性偵測訊號（圖示的右半部），干擾訊號可能是藉由，例如系統成份的固有螢光而引起。第3圖顯示本發明的生物感應器（1)，每個偵測場可配備數個光二極體（2)，藉此，相同類型的收集物分子是固定在此偵測場的每個偵測器之上。對於給定的分析物/收集物分子，這產生多重測量的機率，其可衍生出專一性測量訊號的統計估計値。例如，這使得非專一性以及專一性的訊號間之區別變得可能。第4圖顯示偵測場延伸跨越數個偵測器（2)，在本發明之生物感應器（1)的表面上，收集物分子（6)固定的不平整可被抵消。 9 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) --------訂本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1306119 A7 ^__B7___________ 五、發明說明（）發明詳述相較於先前已知的偵測系統，其中以發光爲基礎而偵測要分析的樣品中之分析物（配體）的存在，是經由將後者專一性鍵結到直接或間接固定在固體相上的收集物分子而產生，以及後續測量由收集物/分析物複合物所發散的光強度，是利用複雜的影像光學系統（例如，CCD攝影機）而產生，本發明是根據以下的事實，即這些複雜的影像光學系統可被整合型裝置所取代，以用於直接的影像記錄方法。因此，具體而言，本發明是有關於微晶片形式的光學生物感應器，以藉由發光而偵測收集物/分析物複合物，該生物感應器包括（a)具有表面之支持物，在其上固定有至少一種類型的收集物分子；（b)至少一種偵測器，其可偵測通過表面的光；以及（c)可視需要地，至少一種可誘發發光之激發源，其中該表面是偵測器測量表面，或是排列在偵測器上的一層表面，而無對於來自激發源（也就是，激發波長）的光之插入的波長濾波器。本發明同樣是有關於一種藉由時間解析發光並利用微晶片形式的光學生物感應器而偵測分析物/收集物複合物之方法，該生物感應器包括（a)具有表面之支持物，在其上固定有至少一種類型的收集物分子；（b)至少一種偵測器，其可偵測通過表面的光；以及（c)可視需要地，至少一種可誘發發光之激發源 (較佳是利用本發明以及上述的生物感應器之一）；該方法包括步驟（1)到（3)，其中，在步驟（1)中，結合至 10 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（2〗0 X 297公t ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

A7 1306119 ___B7_____ 五、發明說明（）收集物分子及/或分析物/收集物複合物之發光體，係轉換成激發態達一段激發時間1 ;在步驟（2)中，基本上沒有一段衰減期間T2之激發；以及在之後的步驟（3)中，所發射的發光是藉由至少一種偵測器而經偵測達一段時間 Τ3並經評估，以偵測該複合物。根據本發明，名詞“發光”包括所有由氣體、液體及固體物質的激發源（以及更延伸的意義，還包括紫外線及紅外線的放射線）所發射之發光，其非因高溫所引起，而是由於先前的能量吸收以及激發所引起。顯現發光的物質稱爲發光體。雖然本發明有時是利用名詞“螢光”及“螢光原”而詳細說明，但這些名詞僅係說明本發明之較佳具體實例，因此，並不構成任何的限制。如同在此技藝中之人士所熟知的，發光可利用具有光 (較佳是短波長的光以及X光、光致發光（ photoluminescence)) '具有電子（陰極發光）、離子（灕子發光）、聲波（聲光效應（sonoluminescence))或具有放射活性物質（輻射發光）的激發源，藉由電場（電化學發光）、藉由化學反應（化學發光）或機械方法（摩擦發光），以藉由照射而產生。另一方面，熱發光是涉及到由加熱所引起或增強的發光。所有的這些方法都受到一般基本的量子力學定律控制，並且引起原子及分子的激發，之後回復到具有發光的基態，再由本發明偵測。“固有登光”（自身螢光）說明可在一物質或分析物中激發，而無須先以發光體標示的發光。因此，適合的激發源之選擇，以及如果需要的話，適 11 本—紙張尺ϋ用中ϊΐ家7票準(c7js)A4^格（210 X 297 ^ "" A7 1306119 ____ B7____ 五、發明說明（）

合的激發源之不同建構，是根據要使用何種類型的發光產生及/或所使用的發光體而定。結果，激發源可以例如，電極、發光二極體、超音波震盪等的形式而提供。較佳地，激發源可整個或部份地整合至本發明之生物感應器。長期已知，相關系統的靈敏度以及偵測的下限，是受限於在建構材料成份中固有的自身螢光，以及受限於與系統有關的光散射。工程界企圖將由此所引起的背景雜訊減到最小，及/或企圖獲得最適的訊雜比，除了別的以外，這已導致時間解析或時間延遲（時間解析）的發光或螢光測量之技術，其也已成功地用在各種的應用領域中。時間解析的發光以及專一性螢光測量之一般原理如下 :當螢光化合物的混合物受到短的光脈衝（例如，從雷射或閃光燈）而激發時，激發的分子會發散短續性或長續性的螢光。 I έ 雖然兩種類型螢光的減少都會對數性地繼續，但短時間的螢光在數奈秒內會衰退成微不足道的値。其限制條件爲在已產生激發之後，這個短時間內基本上測量是不存在的，所有短時間的螢光中之背景訊號以及所有由散射引起的輻射脈衝都被消除，結果，長時間的螢光訊號可非常高靈敏度地測量。因此，本發明之方法包括步驟（1)到（3)，其中，在步驟（1)中，結合至收集物分子及/或分析物/收集物複合物之發光體，係轉換成激發態達一段激發時間Τ,;在步驟（2)中，基本上沒有一段衰減期間τ2之激發；以及在 12 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） A7 1306119 ^___B7__________ 五、發明說明（）之後的步驟（3)中，所發射的發光是藉由至少一種偵測器而經偵測達一段時間T3並經評估，以偵測該複合物。根據本發明，較佳地，在Τ,及Τ2期間所偵測的測量値，並沒有考慮到評估。更佳地，在這些時間內並沒有進行偵測。在本說明書中，用語“基本上不會激發”（轉換爲“ 基本上無激發”），是指與激發時間Τ,相反，激發源在衰減期間Τ2是完全地關閉，或在激發期間，每單位時間（秒 )供應系統少於10%，更佳是少於5%，以及最佳是少於 2%的能量。最佳地，激發源沒有被活化，也就是，在衰減期間Τ2以及測量期間Τ3，沒有供應系統任何的能量。由於使用時間解析發光測量，其在先前技藝中已視爲不適用於微晶片形式的生物感應器，因此，現在是令人驚訝地變成可以有利的方式進行，而無須在訊號原始位置（例子可能是發散固有發光的表面連接的發光體或複合物）以及偵測位置（例子可能是測量表面或偵測器）之間插入波長濾波器。因此’整個發光可用於測量及/或偵測，相較於先前技藝中對應的感應器，結果可增加生物感應器的靈敏度。訊號起源點以及偵測器的緊密位置（較佳是小於或等於10微米），對此產生進一步的貢獻。根據本發明，先前作爲標記而導入至要分析的分析物中之複合物（例如，包含酪胺酸的蛋白質）的固有發光或發光體的發光’可用於這個目的。後者是較佳的。特別適合於本發明之發光體是半衰期確實超過5奈秒的發光體， 13 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公f ) ------------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

^1 ^1 1 n 一 (DJfl I n n n 1· 1» I 1306119 A7 B7 ______ '' .… 五、發明說明（）使得這些發光體在已知爲螢光背景（參見上述）已衰退後仍可測量。最佳的是半衰期在微秒（#S)到毫秒（mS)範圍的發光體，特別是在100微秒到2000微秒的範圍之間。因此，在本發明方法的說明中之測量，一般是在激發後大約5奈秒的期間過去之後進行。根據較佳具體實例’測量視窗是位於微秒到毫秒的區域內，藉此，在1〇〇微秒到 2000微秒之間的範圍是特別較佳的。最基本的發光體在激發態中僅顯示短的半哀期。這個已知在文字的較嚴格意義中之螢光的作用’是根據由激發源能量所引起之要被提升到較高振動能量的電子’所謂的激發單態（singlet state)而定。這個狀態僅具有數奈秒（例如，對於色胺酸2.6奈秒）的穩定性。激發能量接著被釋放，如同電子從激發單態降回基態般的輕微。通常’在這個方法中的發散波長是較長於激發源的發散波長。激發波長以及發散波長間的差異已知爲史托克轉移（Stokes Shift)。另一方面，在部份發光體的例子中，轉變是從激發單態到已知爲三態（triplet state)而發生。在這個例子中，激發態是穩定的，以及史托克轉移擴大。通常，這個三態是在低於激發單態的能量位階上。在三態中，電子不再與電子的基態自旋配對。因此，從三態轉變到基態是涉及到量子力學的禁止轉變。這可穩定激發態的使用期。這個作用稱爲碟光，並且具有多達10毫秒的半衰期。具有長的半衰期之典型發光體包括，例如，稀土金屬 14 •丨丨— —— I —丨丨丨I 丨丨丨 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ΪΓ---------線j 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公t ) A7 1306119 __ B7________ 五、發明說明（） (REMs)或锕系化合物，但由於放射性之緣故，因此後者現在僅扮演次要的角色。在生物學中，稀土金屬離子是最常使用作爲螯合複合物，因爲發光量可藉由選擇適合的有機鍵結搭檔而引人注目地增加。這樣的化合物可在市面上購得，如具有數百奈米直徑之已知的“微球體”（例如， FluoSphere®銪發光微球體，分子探針公司）。特別較佳的稀土金屬是銪、铽以及釤。其他適合的發光體是半導體的奈米晶體，除了發光性質之外，其特別的性質是相當小的大小（數奈米）以及高的穩定性（不會光漂白）。根據所選擇的半導體材料以及摻雜，其半衰期可位於從數百奈秒到毫秒區域的廣泛範圍。熟悉與此技藝者可易於以例如，矽烷，而包覆適當的奈米微粒，之後，並將它們連接到有機分子，例如，核酸或抗體。適合的半導體包括第II-VI ( MgS、MgSe、MgTe、 CaS、CaSe、CaTe、SrS、SrSe、SrTe、BaS、BaSe、BaTe 、ZnSe、ZnTe、CdS、CdSe、CdTe、HgS、HgSe)，III-V (GaAs、InGaAs、InP、InAs )、及 IV(Ge、Si)類型的半導體。這個特質的半導體晶體具有大約200奈秒的區域內或更多之半衰期。第Π-Vi類型的奈米晶體可在市面上購得，如已知爲“Quantum Dots®” （量子點公司，加州，美國 )。在每個例子中，在同一類型中的奈米晶體之吸收光譜是相同的，但個別的發光光譜是隨著顆粒大小的作用而不同，使得當利用光學纖維時，數個平行的標示可利用單一激發波長而測量。表1顯示部份奈米晶體之性質。 15 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) --------訂·1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公f ) A7 B7 1306119 五、發明說明（）表1 ^^米^晶體大小激發發散_____- CdSe-CdS 2.4奈米 350-450 奈米 533 奈^-— CdSe-CdS 4.6奈米 350-450 奈米 630 楚L一- Mn2+摻雜的ZnS 1 1.5-3奈米 230-320 奈米 550-650 奈米適合用於本發明之其他具有明顯發光的物質’是慘雜錳、銅或銀的硒化鎘、硫化鎘或硫化鋅晶體。這些物質的自身發光是由於晶格的缺陷而引起。不同的發光光譜可藉由選擇用於摻雜之不同的金屬離子（Ag、Cu、Mn)而產生。由於該等物質是不溶於水的’因此’較佳是根據本發明以已知爲微顆粒的形式而使用它們。這群物質的部份代表物之性質是如上述表1所示，以Mn2+摻雜的ZnS做爲例子。其他適合於本發明之發光體是具有晶格缺陷的鹼土金屬鹵化物，其可藉由例如，摻雜（異質性離子）或放射性照射而製造。例如，當適當地摻雜（例如，銪）時’氟化鈣顆粒顯示明顯的發光。例如，在CaF的例子中’熱發光也可以放射性產生的晶格缺陷而製造，藉此，低到大約40 °C的溫度是足以誘發發光。較佳地，選擇發螢光的稀土金屬化合物或螯合物，例如，特別是銪螯合物，以用於本發明，因爲相較於傳統的螢光原作爲標記（標籤）以用於時間解析的螢光測量，其顯示特別的優點。發螢光的銪螯合物具有大的“史托克轉移”（大約290奈米），而在激發及發光光譜之間沒有任 16 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) --------訂--------- A7 1306119 五、發明說明（）請先閱讀背

I 何的重疊，並且，其特徵在於搭約615奈米之非常窄的（ 10奈米頻寬）發光光譜。此外，由於它們長的螢光半衰期 (對於Eu3+有600-1000微秒，相較於傳統螢光原的5-20 奈秒），因此，可容許在微秒或毫秒區域內使用時間解析的螢光測量，其可減少上述的背景訊號。表2 金靨離子（半衰期）狀態激發繼 Eu3+ (600 微秒）微球體 340-370 奈米 610奈米 Tb3+ (大約1毫秒） NTA複合物 270奈米 545奈米 Pt2+ (>100 微秒）微球體 390奈米 650奈米 NTA : 2-(三氟乙醯基)-萘，分子探針公司 4 使用銪螯合物作爲時間解析的螢光測量中之標示，長久以來是從免疫分析以及南方及西方墨漬應用中已知。適當的標示可能存在於要分析的樣品中之生物分子（分析物 )，可根據已建立的Eu3+或Eu3+螯合劑方法而進行（例如，參見 E.P_ Diamandis 及 Τ·Κ. Christopoulos “在時間解析的螢光免疫分析以及DNA雜合分析中之銪螯合物標示”， 62 : 1149A-1157A ( 1990))。根據本發明的方法之較佳具體實例，可選擇地，分析物可被生物素化，以及偵測可利用連結抗生物素蛋白鏈菌素（streptavidin)的Eu3+或Eu3+螯合劑而進行。在這方面，特別較佳的技術是使用已知爲帶有適當選擇的稀土金屬化合物之“小珠”，藉此確保非常高密度的發光之分子。 17 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） A7 1306119 ___________B7 ____ 五、發明說明（）從實驗中已知，以此方式，最適的螢光測量系統之偵測極限是大約1到5微微克（pg)的蛋白質或DNA。本發明之生物感應器包括具有表面之支持物（基底），較佳是平坦的或配備有適合的凹處（孔洞），在其上固定有至少一種類型的收集物分子，較佳是數種類型的收集物分子。固定化作用較佳是經由直接或間接（例如，利用 “間隔物”）共價鍵結到表面而進行。適合的連接技術是在此技藝中之人士所熟知的。較佳地，收集物分子是選擇自由單股或雙股核酸、核酸類似物、半抗原、蛋白質、胜肽、抗體或其片段、糖類結構、受體或配體所組成的族群中。特別較佳的是DNA。基本上，本發明的生物感應器之支持物是由任何適合的材料所製得，其至少在收集物分子固定的區域中是足夠透明的。適合的材料包括堅硬及有彈性的材料，例如，塑膠薄膜、聚合物、玻璃、硬化塑膠、矽、四氮化三矽、二氧化矽、鋁、氧化鋁以及其他半導體技術已知的材料，特別是直接的半導體。通常較佳的是後者。支持物通常具有· 一平面（平坦）結構，例如，以微晶片的形式，並可具有· 至多5公分，較佳是1到5公分的寬度，至多10公分，較佳是2到5公分的長度，以及至多0.5公分，較佳是〇1 到〇_5公分的厚度之尺寸。此處所使用的名詞“微晶片” 並不必然意味著已知如電子學的微晶片之性質。基本上，這個名詞首先是有關於與尺寸大小一起建構的平面方法，其明顯不同於傳統的光學。另一個基本的特徵是供給^ ( 18 本紙張尺度適用中國國家標準（〇NS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

n I n II 一^J1 (n n HI · 1306119 A7 __ B7_ 五、發明說明（）較佳是平面）表面，其上可固定有收集物分子。然而，在傳統的意義中使用“微晶片”是較佳的。這類型的微晶片通常是各種半導體材料（例如，矽、二氧化矽、四氮化三矽、鋁、氧化鋁等等）的整體組合，也就是，從單一片段的整體組合。例如，在適當修飾之後，可使用歐洲專利ΕΡ-Α-0 881 490已知用於測量要硏究的至少一個活細胞之特定生理學及形態學參數之測量裝置，以進行本發明之方法。已說明的裝置具有許多感應器及/或偵測器，其爲支持裝置的整體部份，在其上固定有要硏究的材料。根據較佳具體實例，支持物基本上是由固定在內之具有光學偵測器層的半導體材料所組成，較佳是包括數個偵測器，藉此，較佳地是倂入光二極體作爲偵測器。此層可接著被整體倂入到支持物中（較窄的電子意義之微晶片）。可選擇地，其可藉由膠黏劑而連接到支持物的底面，而收集物分子是固定在後者的上表面處。在一特別較佳具體實例中，訊號處理至少部份是發生在生物感應器內。根據本發明的一種形態，時間解析的螢光可例如，藉由使用模擬電路，藉由記錄例如，在關閉激發源後的每奈秒之數値，然後比較這些（記錄的數値）與先前進行測量並也儲存在微晶片上在的參考數値，而在微晶片上直接評估。此外，這個方法也可計算出非專一性的干擾訊號，例如，可能存在的系統成份之自身螢光（也參見第2圖）。假設就在這一段時間裡，其可解析甚至GHz 19 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -· I------訂-------- 1306119 μ 矿1 p _、謂备頁丨 ________ί--1 _Ί

^々- 一’” •《中 *.».*-·» I 五、發明說明（）區域（< 1奈秒）的話，其將可區別自身螢光與人工螢光。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 假如支持物表面是設計成微陣列排列（其中可評估複數的偵測場）的話，則發光訊號的偵測可相繼地藉由，例如，連續地激發及偵測完整的表面或其部份之線條或縱列而進行（多路的應用）。例如，在類比-數位轉換之後，偵測器的電子輸出訊號可藉由適當的電路而帶至外部的評估裝置。除了光二極體之外（pn、p-i-n、崩潰光二極體），也可考慮CCD感測器或感光體，作爲本發明之適合的光學偵測器或感應器，較佳是整體倂入到線形或陣列排列形式的生物感應器之半導體基底中（=光柵[矩陣])。在時間解析的發光測量中，可有利地使用光二極體，因爲相較於光電倍增管，它們具有小的偵測表面積或測量表面積。根據本發明之特別較佳的形態，激發源是生物感應器 (例如，電極形式）的整體結構成分，最佳是由偵測器本身提供。 · . 選擇由直接半導體材料所製得的pn二極體，使下列成爲可能：由於在第一個例子中，活化代表提供電壓，因此，根據pn二極體的種類及特性，而發散出位於特定發散波段的光訊號（使用pn二極體作爲LED [發光二極體])，並且引起位於此pn二極體近端之結合的分析物之激發。在將pn二極體去活化之後（使用pn二極體作爲光二極體）以及在特定哀減期間過去之後，其接著被再一次活化，以進行所需的測量。 20 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） A? 1306119 ____B7 五、發明說明（）

由於上述具體實例中的激發輻射是經由相同的成份而連接，其發光輻射也同時被收集，因此，可達到選擇性地照射非常小區域的感應器表面或非常小區域的偵測場之狀態，並可評估從這個區域發出的發光輻射。由於這個方法，因此，可在非常精密的硏究下反映偵測場，並可避免由於硏究的外部區域之發光而對測量之干擾。當然，偵測器也可以群體的方式排列，藉此，可產生個別的偵測場，其輸入訊號可確保比每個偵測場個別佔據更可信賴的結果（參見第3圖）。藉由每個偵測場的多重佔據，其可確保分析物結合事件藉由測量技術而集中，這可促成在訊號處理期間靈敏度的明顯增加。本發明的生物感應器之製造，可利用CMOS (互補性金屬氧化物半導體）製程而進行，其本身爲已知的，因此，所有整合訊號條件作用以及評估的電路資料庫都可利用而不須修飾，並可在本發明中實施。綜合性的描述可參見，例如，WO 99/27 H0。其他也適合於本發明之製造方法的例子，是NMOS製程或雙載子（bipolar)製程。另一種從成本觀點特別有吸引力的可能性，是根據有機半導體而製造本發明之生物感應器（例如，參見歐洲專利 EP-A-1 085 319)。根據另一較佳具體實例，個別的偵測場.是以基本上沒有光可被另一偵測場的偵測器接收而從一偵測場中發散的方式分離。因此，個別的偵測場可排列在已知通常的微滴定盤之凹處（孔洞）。根據本發明，較佳是槽形的凹處以 21 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1306119 A7 _ B7 ________ 五、發明說明（）及具有底部的凹處，其側壁基本上是以垂直於感應器晶片的表面而排列。這樣的凹處之個別尺寸’可根據應用領域的知識，由熟悉於此技藝者而自由選擇’限制條件是期待的分析物/收集物複合物之發光體’是位於凹處的內側’較佳是在其基底上，並且基本上沒有發光可穿透至鄰近的凹處。在一特別較佳的凹處中，其基底是凹進本發明的生物感應器之表面至少100奈米’較佳是100奈米到10微米，以及更佳是100到5000奈米。可選擇地’相同的效果可在基本上的平面表面上，藉由向上分離嵌塡的方法而達成，其尺寸可根據所需應用領域的知識以及預期的收集物/分析物複合物之幾何尺寸，由熟悉於此技藝者而易於選擇。例如，適當的分離工具之安裝，可藉由陽極接合或藉由已知爲覆晶（Flip-Chip)的製程而進行。在一較佳具體實例中，將管道加到微晶片形式的生物感應器中。例如，管道可提供偵測場的行列，在其上結合著收集物分子的陣列。例如，這使得校正測量可以進行。在另一較佳具體實例中，平行測量可在相同的陣列上或在平行的樣品上進行，以此方是，可引人注目地減少每個分析的成本。爲了這個目的，將微晶片藉由微管道而再細分爲，例如，8個相同的隔間。對於在此技藝中之人士明顯的是，支持物材料、表面以及偵測器之選擇，是根據要偵測的發光體發散波長而定。基本上應該說，由於已知的“半導體帶間隔”，因此偵 22 表紙張尺度適用中國國^票^ (CNS)A4l^i(21〇l297公复) " ' " (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) n I I H ^1 ^1 —^1 A7 1306119 B7 ~——-*-------- 五、發明說明（）測器具有對於所選擇材料（例如，矽或鍺）的波長具有不同的靈敏度，因此，在使用矽光二極體的較佳例子中，產生了從紅外線延伸到紫外線光譜的靈敏度範圍，靈敏度在這些區域之間是最大的。此外，根據較佳具體實例，本發明之生物感應器可包括一種或多種由控制單元、至少一放大器、一種或多種的訊號轉換器、一種或多種的儲存/記憶體單元、一種或多種的濾波器、光學系統、光導（光學纖維）以及一種或多種的保護層所組成的族群中之額外元件；限制條件爲，對於來自激發源或激發波長的光，沒有波長濾波器被排列或插入在偵測器以及收集物分子所固定的支持物表面之間。最佳的具體實例是’收集物分子固定在偵測器的測量表面上 (例如，pn二極體的最上層）。如果使用整體可積集的半導體材料作爲收集物分子的支持物及表面並形成偵測器的話，則也可在相同的基底上建構整體的積體電路，因爲電子偵測器輸出訊號的前處理，可在非常接近主體檢測（收集物/分析物複合物）的地方進行。因此，本發明的這個較佳具體實例，是涉及到比純粹被動式感應器可進行更多功能的“智慧型”感應器。例如，電光學偵測器中的輸出訊號，可以此方式藉由共同的積體電路而前處理，以使其可經由輸出電路及連接器接點而傳達至外部，並以較沒有問題的方式在該處處理（也就是，評估）。此外，前處理可包含將類比偵測器的訊號數位化，以及將其轉換成適合的資料流。 23 ^. —---- 訂---------· (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公t ) ^06119 A7 ___ _ B7 五、發明說明（）此外，由於短的訊號路徑’因此訊雜比可藉由在本發明的生物感應器中執行之接近偵測器的訊號處理位置而非常大幅地改善。此外，也可以有’例如’可減少資料量或可協助外部處理及表現之額外的處理步驟。這使得剩下的光學訊號之評估及其表現，可藉由個人電腦（PC)而進行。此外，本發明之生物感應器可以這樣的方式而建構’亦即，可將資料（較佳是經壓縮及/或處理的資料）經由紅外 ’線或無線連結而傳送至對應配備的接收站。在基底上的組合裝置之控制，可經由控制裝置中的控制訊號而進行，其較佳也是整個或部份地建構在基底上’ 或是外部連接。在本發明的方法中，經由一般市售電腦而評估光學/電子訊號的可能性，具有額外的優點，在於經由適當程式而將資料評估及儲存廣泛的自動化是可能的，結果，相較於利用傳統的外部顯像光學儀器所產生的資料，由於使用本發明之生物感應器，因此，在資料分析中是沒有任何類型的限制。從本發明的生物感應器中直接記錄發光是可達到的’ 其中，特定偵測所需的收集物分子，是直接或經由一般距離的支架（間隔物）及/或結合聯結基質，而位於一表面上，其爲偵測器的測量表面或是在緊接此測量表面上排列@ 一層表面，而沒有任何插入的波長濾波器。這個排列可幫助減少訊號來源（發光）的位置以及偵測位置間之距離’ 因此，可使可發光的產量最大化。 24 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

A7 ^06119 _ B7_____ 31、發明說明（）根據較佳具體實例，光學偵測器是以至少一種光二極體的形式而提供，藉此，複數的這些光二極體之存在，尤其是用於數種不同分析物（配體）的平行及/或連續偵測，是特別較佳的。然而，即使當僅利用一種類型的發光體時 ’這個多重的排列仍可提供優點，由於每個偵測場有數個偵測器，因此，可記錄圖像，其輔助收集物分子及分析物的結合事件之定點分配，可藉由集中而改善。在這些具體實例中，其專一性地以就其本身而言已知的微陣列爲目標 ’個別的光二極體可有利地分類成定義群或測量場，結果 ’後續發光測量的靈敏度以及所得的測量資料之再現性及可信賴性，藉此可明顯增加。根據較佳具體實例，每個光二極體（作爲偵測器，以及視需要可同時作爲激發源）的表面，視需要是暴露的（否則生物感應器是被例如，保護層而覆蓋），是由Si02. Si3N4所組成。此外，收集物/分析物鍵結以及偵測的特定方法參數，可受到選擇微晶片形式的生物感應器之表面材料而受益地影響。例如，在某些地方可使用Si3N4，而在其他地方使用si〇2 (或例如ai2o3)或貴金屬，結果，具有例如，更疏水性或更親水性性質的生物分子或間隔物之較佳區域，可在感應器上或甚至在個別的偵測場中提供，以便以局部的方式，促進或抑制例如DNA作爲收集物分子之連結。此外，根據本發明，可驅使的貴金屬電極之連結，可產生較佳的生物感應器，其中，例如，可加速雜合事件 ’或可藉由施加不同的電位（視需要對每個偵測場）而誘 25 ---- I---訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公f ) 13〇6119 A7 _____ B7_____ 五、發明說明（）發起源於電激發的發光體（電化學發光）之螢光^ 例如，可以一種或多種白光燈、LEDs (發光二極體）、（半導體）雷射或UV燈管的形式而提供，以及可藉由壓電元素（超音波）或藉由氣體及/或液體發光能量（化學激發）或藉由電極而提供的激發源，須足夠有效以及較佳可高頻率重複。如果光源可短時間活化及熄滅的話，則存在後者的性質。如果使用光學激發源的話，則須可以下列方式而關閉，亦即，在關閉後，偵測器上本質上沒有另外的光子照射（例如，由於餘輝），也就是，沒有能量以上述的意義而提供到系統。如果需要的話，這可藉由使用機械關閉孔（英文：“遮光器”），以及藉由選擇LEDs或雷射作爲光激發源而確保。較佳地，激發源是以此方式而光學地及機械地連接到生物感應器及偵測器，以便以後者的方向產生輻射場，藉此，在激發源以及訊號來源平面（也就是，收集物分子所固定的表面）之間的空間距離，是儘可能的小。然而，空間距離必須是足夠大的，使得在配體/分析物及收集物分子之間必須使用的反應不會受損。以此觀點，對於由複數個點大小的輻射源所組成之激發源（對應於支持物上所提供的複數偵測場）可能是適合的，其可藉由例如，控制裝置而個別或集體活化。同時使用pn二極體作爲激發源（LED )以及偵測器（光二極體），在此是特別較佳的。照射可直接進行（也就是，無任何插入的光學儀器），前提爲激發源所發散的光束已經高度聚焦，以確保非常小的偵測場 26 (請先閱讀背面之注意事項寫本頁) 11裝 ” 寫 4 訂--------- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1306119 B7 五、發明說明（），特別是在使用已知爲微陣列之中。然而，可選擇地，從激發源而來的輻射路徑，可藉由使用適合的透鏡而聚焦，由於例如，在感應器表面上的收集物分子之非常密集的總數，因此，在這個範圍內是適當的。對於在此技藝中之人士明顯的是，這提供了另一種減少非專一性干擾訊號（例如，自身螢光）的方法。點大小的輻射源之排列，其由例如，集中的光學纖維或微小化的LED_s (發光二極體）所組成或以其他方式實施，是有利於線條或場的形式，並且因此功能性地適合於在感應器表面上的收集物分子之排列。爲了使用在利用各種 RE (稀土）金屬螯合物的分析中，有利的是可完全調諧的激發源或存在不同波長的激發源。此外，爲了特別想要之目的，也有利的是可調頻的激發源。在此關連中，使用調節強度的激發光，藉此，當在奈秒範圍內測量半衰期時，調節可以數兆赫（MHz)而進行。因此，在此技藝中之人士所熟知名爲FLIM (英文：“螢光時序影像顯微鏡學” )之方法，是包括於本發明的另一較佳具體實例中。以上說明代表不同或完全可調諧的偵測器，可存在於偵測器側邊上，以記錄由收集物/分析物複合物所發願的光能量。當涉及光二極體時，波長專一性的光元件是使用於本發明的生物感應器中。具有傳統光二極體，配備疊加、應用、氣相沈積或整合的波長瀘波器之生物感應器，也適合於進行本發明之方法。因此，與二氧化矽相反的是，例如，已知四氮化三矽 27 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ------丨丨訂--------- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) A7 1306119 ____B7_____ 五、發明說明（）對UV光是不透光的，以及多晶矽會吸收UV輻射。因此，在一般的CMOS製程中，氮化物或多晶矽可沈積於閘極氧化層上，導致在光二極體上對應的濾波器之產生。因此，例如，NADH (菸鹼醯胺腺嘌呤二核苷酸）具有350奈米的激發波長以及450奈米的發散波長。因此，靈敏度可藉由提供濾除350奈米的濾波器而增加。這個效果可用於本發明之方法，以產生差別性的偵測，例如，當利用兩個不同的平行（in parallel)發光體時，例如，其中僅有一個發散UV區域內的光，因爲此目的提供的偵測器是UV靈敏的構築或不是UV靈敏的構築。此外，這個效果也提供機會，即當需要排除測量方法時，具有已知發散波長的材料之可能存在的干擾自身螢光，可藉由提供適當的濾波器而排除。這個例子是銪螯合物（在大約620奈米發散）以及摻雜銅的硫化鋅（在大約525奈米發散）之平行使用，由於彼此的發散波長範圍是足夠不同的，因此，其可藉由例如，一半的偵測場之偵測器配備具有低通濾波器（low-pass filter)，另一半相同偵測場之偵測器配備具有高通濾波器 (high-pass filter)，而在例如，一個偵測場的區域內進行兩種顏色的偵測。然而，最佳改善靈敏度的方式是省略使用波長濾波器。此外或可選擇地，不同的發光體可平行地使用，限制條件爲它們的物理極/或光學性質是足夠相異的。例如，可利用要使用的兩個發光體A及B之不同的激發波長，及/ 28 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) i9 訂—:------線 A7 1306119 ____B7 _ 五、發明說明（）或它們不同的半衰期。這可藉由例如，提供兩種不同摻雜的奈米晶體而產生。在後者不同半衰期的例子中’發散可在兩個連續的測量時間τ3及τ4中被記錄。對於特定的收集物/分析物，複合物之測定以及可視需要地定量之偵測，需要至少一種類型，較佳是數種類型的收集物分子，定位（以及較佳是固定）在生物感應器支持物的表面上。根據較佳具體實例，這個固定化作用可利用在表面上沈積成一層的連接物質而進行。爲了這個目的，通常是將金屬或準金屬氧化物（例如，氧化鋁、石英玻璃或玻璃）製成的生物感應器表面，下沈到具有例如，鹵素-矽烷（例如，氯矽烷）或烷氧基矽烷基團的雙官能分子（已知爲“連接子”）之溶液中，以連接到支持物表面，結果，經由在感應器表面以及受體之間產生共價鍵結，而形成自組織單層（SAM)。例如，塗佈可以縮水甘油三乙氧基矽烷而進行，其可藉由例如，浸入到1%在甲苯的矽烷之溶液、緩慢收回並藉由在120°C “烘乾”固定而進行。以此方式產生的外層，一般是具有數埃（A)的厚度。在連接子以及收集物分子之間的連結，是經由另外適合的官能基（例如，胺基或環氧基）而進行。用於將許多不同受體分子（特別包括生物來源的分子 )連結到複數支持物表面之適合的雙官能連接子，是在此技藝中之人士所熟知的。在涉及到核酸之要偵測的生物分子範圍內，適合的 DNA探針作爲收集物分子’之後可利用目前可獲得的印刷 29 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ----I---------------訂---------^^^1. (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1306119 A7 ___ B7__ 五、發明說明（）設備而應用以及固定。例如，與生物素化的DNA之雜合，現在可在以此方是製造的生物感應器上，藉由使用已建立的方法而進行。例如，這些可藉由PCR (聚合酶鏈鎖反應）以及倂入到生物素-尿苷三磷酸（dUTP)而產生。在雜合期間，生物素化的DNA結合到固定在個別偵測場中的生物感應器上之互補股（存在於該處）。陽性的（成功的）雜合事件，接著可藉由加入抗生物素蛋白鏈菌素/抗生物素蛋白（avidin) 的結合物（conjugate)以及發光體而顯示。根據本發明，以下是特別適合作爲發光體的結合物：銪、铽及釤螯合物，以及經由抗生物素蛋白/抗生物素蛋白鏈菌素而載有銪、釤及/或铽螯合物之微球體（“小珠”）。特別適合於此觀點的是發光的微球體，例如，FluoSphere銪（分子探針公司：F-20883 )因爲它們可以單一鍵結固定大量的螢光色原。也適合本發明的是例如，由量子點公司所提供，名爲“ Quantum Dots®”類型的奈米晶體。在淸洗移除未鍵結標示的分析物及/或游離漂浮的發光染劑之後，鍵結的測量是藉由具有關閉的激發光源之適合的時間解析螢光之激發及測量而進行。根據本發明’激發期間（激發時間）是描述爲1，在激發及測量之間的時間（衰減期間）爲T2，以及測量時間 (測量期間）爲Τ3 ’以及如果需要的話，第二測量期間爲 Τ4。較佳地，時間凡是1奈秒到2毫秒，時間Τ2是1奈秒到500微秒，較佳是1到5奈秒，以及時間Τ3是5奈秒 30 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公爱） 1306119 A7 _ B7 一一_·_ -----* 五、發明說明（）到10毫秒，較佳是5奈秒到2毫秒。本發明之方法可包括額外的前步驟，亦即’將收集物分子與假設包含收集物分子的配體之樣品接觸的步驟’以及如果需要的話，淸洗生物感應器。較佳地’分析物是經發光體而標示，並且一直持續偵測，直到複合物在分析物以及收集物之間形成爲止。 _ 從偵測器來的訊號是藉由記錄單兀而記錄。記錄單元具有非常快速的轉換器，以將類比偵測器訊號變換成數位數値而儲存。數位數値的評估較佳是即時進行’然而’其也可在一段時間延遲後進行。一般的微處理器可用於評估數位數値。這個評估是只有在測量期間T3，以及如果需要的話，在第二測量期間Τ4進行。在發光訊號太弱以致無法淸楚偵測的強況下，偵測靈敏度的增強，在本發明之較佳具體實例中，可藉由整合數個個別的測量而達成。爲了進行這項工作，相同的測量可進行數次（重複步驟（1)到（3)或（1)到（4)數次），並且加總測量的結果。這可在測量之後直接在感應器晶片上進行，或是經由適合的軟體而進行。例如’包括步驟（1 )到（3 )的個別測量，具有下列現象：在激發時間凡期間，作爲偵測器的光二極體相對於激發態是在不靈敏的模式。激發源在這個期間內是活動的。在時間Τ2的期間’激發源以及光二極體都是不活動的。在這個期間內，背景發光可衰減。在時間Τ3的期間，光二極體是活動的，並且在發光體的一個及數個入射光子之間 31 本紙張尺玉適用ϋ國家標準（CNS)A4^格（210 X 297公釐) ^ - 1306119 A7 _____ B7 _ _ 五、發明說明（）偵測。偵測程序可藉由將光二極體重新設定至不活動的模式而重複。個別的時間間隔可選擇爲，例如，2毫秒（Τι )、5奈秒（T2)以及2毫秒（τ3)。提供一個適當的訊號強度，時間間隔Τ3也可能明顯較短於所使用的發光體之激發態半衰期。根據反覆激發的特別較佳具體實例，在時間間隔τ3所獲得的偵測器數値，視需要在數位化以及進一步電子處理之後，是儲存在分配爲個別時間間隔的記億體單元中。例如’此類型的儲存記憶體具有100或更多個分配於連續時間間隔的記憶體單元。這樣的時間間隔，較佳是位於從1 到100奈秒的範圍內。特別較佳者爲，從偵測器中所獲得的訊號，也可以關於從訊號來源的個別分子數目（收集物/分析物複合物）所得之訊號強度及測定而分析’藉此，不僅可定性分析，而且還可定量分析。對應於發光體數目的多重單元數値，現在是儲存於記憶體單元中。上述之記憶體儲存方法是對每個個別的測量重新進行，如果需要重複激發的話’則進行加總，也就是，重複步驟（1)到（3 )數次。在這個方法中，在測量後儲存於特定記憶體單元中之單元數値，或如果需要的話，多重單元數値，是加到已存在於單元中之數値。以此方式，可評估對於特定偵測場的測量所獲得的加總曲線，以確定哪些及/ 或多少發光分析物是在偵測場中結合。原則上，那些也可用於複數不同分析物所得的訊號曲線之評估方法，可應用 32 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210x297公釐）

訂 4 A7 1306119 __ B7 __ 五、發明說明（）於加總曲線中。具有數微微秒（PS)準確度的發光事件之絕對記錄，可進行光子統計學之總體分析。可辨認或測定在總體光子分布中的特徵累積或中斷。這可進行系統的三組期間之測量以及反應動力學之測定。同樣地’以此方式可經由偵測體積測量擴散時間，其可推斷有關分析物分子的大小。總共5到10%的光子收集效率，相對於輸入輻射的光子數目，可經由這樣的系統而達成。這是起因於大約 80%的發光體吸收效率，大約90%的發散機率’以及至多 70%的偵測器靈敏度所致。在這個應用中，控制單元較佳是設計成活化激發源一段時間間隔1，以及在時間間隔乃過去之後，活化偵測器一段時間T3。這類型的控制單元可進行時間解析的發光測量。對於活化激發源的時間間隔乃之目的，是要將固定在分析物上並結合在複合物中的發光體傳遞到激發態，其中，它們經歷轉變成低能量的狀態，並且伴隨著發光。衰減期間Τ2之目的，是要排除任何自發性的樣品及/或支持物材料（其並非發散自要偵測的分子族群）之發光的測量。偵測器至少在測量期間Τ3 (或視需要地Τ4)被活化，並且從收集物/分析物複合物中接受發光輻射。所選擇的時間Τ3較佳是在5奈秒到2毫秒之間。在這個時間Τ3期間，偵測器訊號是藉由關於其訊號高度及計時的記錄單元而獲得，之後並且進行評估。當測量是在個別分子或至少非常少的分子上進行時，在時間間隔Τ3中所獲得者，並不是典型的發光延遲曲線，而是例如在單一分子的例子中，所 33 ----I-----I--i —丨丨—丨丨訂--------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 4. 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公t ) 1306119 B7 五、發明說明（）獲得者係訊號波峰，其特徵在於個別的分子發散輻射之及時的瞬間或時間間隔。由於重複地進行測量’因此，可有統計上的評估，從其中可確定發光的半衰期。在特別較佳具體實例中，可從尙未雜合的DNA作爲收集物分子中，及/或從沒有收集物分子固定的偵測器中（背景發光），及/或從未標示的收集物/分析物複合物中提供訊號，也就是，儲存在記憶體中作爲參考或對照數値之未顯示任何發光體者，以便在具有發光體的實際偵測事件之偵測訊號中，具有可計算所記錄的“干擾訊號”之能力 (參見第4圖）。在統計評估中，可加總在T3內一定義時間間隔所獲得的強度。如何使用本發明之方法，對於熟悉於此技藝者是明顯的。作爲補充的是，請注意WO 98/09154之說明。本發明將利用實施例以並參考所附圖示，而詳細說明如下。實施例 Μ晶片形式的本發明牛物感應器之製浩：感應器是利用6英吋晶圓，以0.5微米CMOS製程所製造。每個pn光二極體都是在p-基底上的η-槽中排列。在場氧化之後，進行光二極體的ρ-區域定義，以及提供10 奈米厚的閘極氧化層。這是在二氧化矽層的疊加及建構之後進行。最後，進行一般的CMOS步驟，例如，提供接線 34 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1 裝 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

n n n n^OJI n n n I n n I l3〇6li9 A7 _ B7___ 1、發明說明（）靥以及表面鈍態化（防刮）。塗佈CMOS牛物感應器：將上述製造的CMOS感應器，藉由下沈到1%G0PS ( 縮水甘油氧基丙基三乙氧基矽烷）及〇·1%在甲苯的三乙胺之溶液，大約2小時的時間，而以矽烷塗佈。之後，將微晶片從溶液中移出，在短時間滴乾後，將其在120°C的乾燥箱中固定大約2小時的時間。以此方式塗佈的微晶片，可在不含水分的環境中儲存，直到生物連結爲止。以寡核苷酸探針牛物連結：利用傳統的技術，將上述塗佈的微晶片藉由與5’-胺基 -修飾的寡核苷酸探針之非接觸製程而印刷。爲了這個目的 ’寡核苷酸探針是在PBS中，以0.5//Μ濃度的溶液而製備。在印刷之後，連結反應是在恆濕箱中，以5(TC持續進行。之後，將微晶片以蒸餾水潤洗，接著藉由以甲醇淸洗而乾燥。然後，將任何剩餘的溶劑殘留物，在排氣櫃下藉由蒸發而移除。獲得樣品：利用PCR(=聚合酶鏈鎖反應），將血色質基因之片段從人類DNA分離物中增殖。在增殖反應中，使用適合的引子序列’例如，如美國專利第5,712,098號之說明。反應混合物包含以下的標準試劑：（引子 dATP、dCTP、dGTP 〇·ι m]VI，dTTP 0.08 mM ; PCR 緩衝 35 本紙張尺度^中國^標準（CNS)A4規公爱)- (請先閱讀背面之注意事項 · n n in n 一 -OJI up n· .^1 kn I 1^1 I 寫本頁)

A7 1306119 _E7____ 五、發明說明（）液：MgCh 4 mM，HotStarTag (Perkin Elmer) 2 單位/50 微升）加上生物素-11-dUTP (0.06 mM)。在PCR反應期間（35 個循環：5 分鐘，95°C ; 30 秒，95°C ; 30 秒，60°C ;30秒，72°C ; 7分鐘，721 )，生物素-dUTP被倂入到新合成的DNA中。之後，單股DNA是藉由加入T7 Gen6-核酸外切酶（100單位/50微升的PCR混合物）並將混合物加熱（37°C，30分鐘；85°C，10分鐘）而產生。雜合：將上述反應批次在顯微鏡蓋玻片下，在5x SSPE、0.1 %SDS的緩衝液（12微升）中之微晶片上，在恆濕箱中以 50°C雜合2小時。之後，將其以2x SSPE、0.1%SDS潤洗，並將微晶片藉由在水中淸洗而淸潔。標示：將包含5%BSA、0_2%Tween 20及4x SSC緩衝液的標示溶液，其中懸浮有〇·〇〇1%固體微球體（銪發光微球體，以中性抗生物素蛋白包覆，0.04//Μ，分子探針公司：F-20883 )，倒在微晶片上以進行標示。反應是藉由偏心轉筒混合器，以震動進行30分鐘。之後，將任何可能存在的非鍵結微球體，藉由2x SSC、0.1%SDS的淸洗，而從混合物中移除。製備杭-里羥某洋地黃毒苌配某（digoxigenin) -IgG-包覆的微球體： 36 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1306119 A7 ____ _B7___ 五、發明說明（）將〇·〇4//Μ 的 FluoSpheres 鉛發光微球體（F20886) ’根據微球體製造商（分子探針公司）之說明，以單株抗_ 異羥基洋地黃毒苷配基-IgG抗體（山羊）而修飾。之後，將包覆的微球體在透析套中，以300仟道耳吞（kD)的排除大小’ 5次更換緩衝液，以對抗PBS而透析。在感應器晶片h夕雙色偵測：將兩個PCR產物以上述說明而製備，藉此在產物之一，將生物素-ΙΙ-dUTP以等克分子量的異羥基洋地黃毒苷配基-dUTP而取代。兩個反應批次都以相同的方式處理，然後在微晶片上，在1 : 1的混合物中雜合。標示是以上述固體微球體（銪發光微球體，以中性抗生物素蛋白包覆， 0.04//M，分子探針公司：F-20883 )以及所說明的在標示緩衝液中之抗體修飾的球體，以1 : 1的混合物而進行。鉑球體之發光是發生在400奈米（光源：氙燈以及單波分光儀），而銪球體之發光則是在370奈米進行（氣燈以及單波分光儀）。微晶片之照射’是經由光學纖維而進行’並且分別記錄染劑的發光光譜。可選擇地’照射是以UV_ LEDs (無濾波器）而進行’並且記錄兩種染劑的發光’之後並經由發光衰退動力學的圖像而評估。 37 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

Claims

Ι&0®419η~— -- as 年月日修(更)正本 | ·' 一_ _ ------ 六、申請專利範圍 1. 一種微晶片形式的光學生物感應器，其係藉由發光而偵測收集物/分析物複合物，其包括： (a) 具有表面之支持物，在其中固定有至少一種類型的收集物分子； (b) 至少一種可偵測通過表面的光之偵測器；以及 (c) 可視需要地，至少一種可誘發發光體發光之激發源；其中該表面是偵測器的測量表面，或是排列在偵測器上的一層表面，而無任何對於來自激發源的光之插入的波長瀘波器，其中該偵測器（單或複數）係整合至支持物，且爲單數光二極體或複數光二極體，分別地，其可同時扮演激發源。 2. 根據申請專利範圍第1項之生物感應器，其中在表面以及偵測器（單或複數）的測量表面之間的間隔距離不超過10微米。 3. 根據申請專利範圍第1或2項之生物感應器，其中收集物分子是共價鍵結到表面。 4·根據申請專利範圍第1項之生物感應器，其中薄膜形式的偵測器（單或複數）是黏著連接到支持物。 5..根據申請專利範圍第1項之生物感應器，其中至少一種類型的收集物分子固定在該表面上個別偵測場或呈矩陣的形式。 6·根據申請專利範圍第1項之生物感應器，其中數種本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297公釐） -裝------ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂： A8 1306119 1 六、申請專利範圍類型的收集物分子是固定在表面上。 / 7. 根據申請專利範圍第5項之生物感應器，其中不同的收集物分子是固定在不同的偵測場或矩陣的不同位置上〇 8. 根據申請專利範圍第1或第7項之生物感應器，其中收集物分子是選擇自由單股或雙股核酸、核酸類似物、半抗原（haptenes)、蛋白質、胜肽、抗體或其片段、糖類結構、受體或配體所組成的族群中。 .9.根據申請專利範圍第1項之生物感應器，更包括一種或多種由控制單元、至少一放大器、一種或多種的訊號轉換器、一種或多種的記憶體/儲存單元、一種或多種的濾波器、光學系統、光導以及一種或多種的保護層所組成的族群中之元件。 10. 根據申請專利範圍第1、6或7項之生物感應器，其包括數個偵測器。 11. 根據申請專利範圍第10項之生物感應器，藉此每個偵測器都分配到矩陣的一個場或一個位置，較佳是排列在這個場或位置之下，以及測量表面積的大小基本上是對應於場的大小。 12 ·根據申請專利範圍第1、6及7項中任一項之生物感應器’其中收集物分子是排列在其基底上的表面之凹處內部，藉此，凹處的基底相應於表面係凹進至少100奈米。 13. —種藉由時間解析的發光並利用微晶片形式的光 2 本紙張尺度適用中國國家標「準(CNS)A4規格(210 X 297公釐〉 ' (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

AH B8 C3 D8 發 1306119 、申請專利範圍學生物感應器而偵測分析物/收集物複合物之方g，_ 感應器包括： X ^ (Ο具有表面之支持物，在其中固定有至少〜镇轉刑的收集物分子； (b) 至少一個可偵測通過偵測器（單或複數）表光之偵測器，係整合至支持物之光二極體；以及 ' (c) 可視需要地，至少一種可誘發發光之發射的鐵源，其中該偵測器可同時扮演激發源； .其中，在步驟（1)中，結合至收集物分子及/或分_ 物/收集物複合物之發光體，係轉換成激發態達一段激發時間T!;在步驟（2)中，基本上沒有一段衰減期間& ; 發，以及在之後的步驟（3)中’所發射的發光是藉由至少一種偵測器而偵測達一段時間Τ3並經評估，以偵測該複合物。 Η.根據申請專利範圍第13項之方法，其中在步驟（ 3)中，各種的分析物/收集物複合物是藉由不同波長的發光之平行（parallel1)偵測而平行地偵測。 15. 根據申請專利範圍第13或14項之方法，更包括步驟（4 )，其中’在不同於步驟（3 )偵測到之波長所發射的發光，係經偵測達一段後續的期間T4並經評估，以偵測第二複合物。 16. 根據申請專利範圍第13項之方法，其中激發僅發生在步驟（1)。 17. 根據申請專利範圍第13項之方法，其中步驟（1 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -11; 線一本紙張夂度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297公釐) A8B8CSD8 1306119 六、申請專利範圍 )到（3)或步驟（1：)到（4)是進行數次。/ W·根據申請專利範圍第13項之方法，更包括將收集物分子與假設包含收集物分子的配體以作爲分析物之樣品接觸’以及如果需要的話，清洗生物感應器的前步驟。 19_根據申請專利範圍第13項之方法，其中配體是以發光體標示，以及偵測係僅在當分析物/收集物複合物形成時進行。 20.根據申請專利範圍第13或17項之方法，其中時間/^是1奈秒到2毫秒。 21·根據申請專利範圍第I3、I4、16及17項中任一項之方法，其中時間T2是1奈秒到500微秒。 22. 根據申請專利範圍第13或π項之方法，其中時間Τ3是5奈秒到1〇毫秒。 23. 根據申請專利範圍第13或Π項之方法，其中發光體是選擇自由稀土金屬或锕系金屬，特別是銪、斌及釤 :第II-VI、III-V及IV類型的半導體，視需要是摻雜的，特別是CdSe、CdS或之nS ;以及鹼土金屬氟化物，特別是 CaF，以及其混合物所組成的族群中。 24. 根據申請專利範圍第23項之方法，其中發光體是以奈米晶體、小珠或螯合物的形式而使用。 25. 根據申請專利範圍第13或17項之方法，係用以偵測核酸、核酸類似物、蛋白質、胜肽、半抗原、抗體或其片段、糖類結構、受體或配體。 26. 根據申請專利範圍第13或17項之方法，其中係 4 本紙張尺度適用令國國家標準(CNS)A4规格(2〗0 X 297¾) 一 (請先閱讀背面之注意事項再塡寫本頁) .0 訂：線一 Λ888 ABCD 1306119 申請專利範圍使用如申請專利範圍第1項之生物感應器。/ 27·根據申請專利範圍第1項之光學生物感應器，其不包括激發源(c)，其中激發之發生是經由化學反應，且其中該發射之發光是化學發光。 (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) 4-0 線本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4规格(210 X 297公釐)