KR100614951B1 - 발광검출장치, 발광검출용 마이크로어레이플레이트 - Google Patents

Abstract

본 발명은 발광반응의 이용에 적합한 발광용 마이크로어레이플레이트와 그것을 사용한 발광검출장치이다. 개개의 마이크로어레이 미소 반응구역의 주위에 격벽을 설치하여 주위의 발광의 혼입을 방지하고, 광전도 가이드로 상기 미소 구역의 발광을 검출함으로써 주위로부터의 발광의 혼입을 삭감하여 정밀도와 감도를 개선한다.

Description

발광검출장치, 발광검출용 마이크로어레이플레이트{LUMINESCENCE DETECTING DEVICE AND LUMINESCENCE DETECTING MICROARRAY PLATE}

본 발명은 생체시료 중의 핵산이나 단백질의 발광검출법에 관한 것으로, 미량의 시료 중의 유전자나 단백질의 측정에 적합한 기술에 관한 것이다.

유전자나 단백질의 측정 건수는 최근 점점 더 증가되고 있어 측정의 자동화, 간편화가 강하게 요망되게 되어 왔다. 그러나, 측정시료는 귀중하여 소량으로의 계측이 요망되고 있다. 또 그와 같은 시료에 있어서는, 측정대상물질의 농도도 낮은 것이 많아 고감도의 측정이 요망된다. 화학발광이나 생물발광이라는 발광검출법은, 형광법이나 흡광법에 비하여 1 자릿수 이상의 고감도화가 가능하다. 종래, 발광검출방법에는 마이크로플레이트나 광학셀을 사용하는 것이 많았다(일본국 특개평6-225752호 공보, 특개평6-102182호 공보). 그러나 최근 마이크로어레이라 불리우는 슬라이드글라스상에 백 내지 수만이라는 다종류의 DNA나 단백질을 스폿으로서 고정하여, 특정한 핵산이나 단백질을 포착하여, 검출하는 기술이 각광을 받고 있다 [M. Schena 편 "Microarray Biochip Technology", Eaton Publishing(Sunnyvale, USA) 2000년 등 참조].

마이크로어레이는, 특정한 핵산이나 단백질을 고정한 영역크기의 직경이 100 내지 1000㎛ 정도이고, 슬라이드글라스상의 폭 10 내지 30mm, 길이 20 내지 50mm 정도의 면적에 걸쳐 스폿영역을 등간격으로 설치하고 있다. 이러한 마이크로어레이상의 스폿에 대하여, 형광 검출하는 기술이 흔히 사용되고 있으나, 미소 구역의 표면으로부터 발생하는 형광을 관측하기 때문에 감도가 부족되는 경우가 있어, 감도에 있어서 형광법보다 훨씬 우수한 발광법에 적합한 검출방법이 요망되고 있다.

그러나 발광계측의 경우, 미소 구역으로부터의 발광을, 위치 정밀도 좋게 계측하는 것이 어렵고, 주위로부터의 떠 도는 광(迷光)에 의한 방해도 크다. 마이크로어레이플레이트 전체를 CCD 카메라나 사진필름으로 계측하는 방법도 있으나[ D.L.Wiedbrauk and D.H.Farkas 편 "Molecular methods for virus detection", 제7장 'Detection Methods Using Chemiluminescence', Academic Press(San Diego, USA), 1995년 참조], 마이크로어레이와 같은 직경 1mm 이하의 미소 스폿이 소정의 면적 내에 다수 인접하여 병치되어 있는 경우, 개개의 미소 구역의 발광강도를 정밀도 좋게 계측하는 것은 곤란하다. 한편 미소 스폿 사이의 거리를 떨어트리면 주위의 미소 발광구역으로부터의 영향은 적어지나, 수천개소 이상이라는 다수의 미소 반응구역을 동일한 슬라이드글라스상에 설치하고 있는 마이크로어레이에 있어서, 미소 반응구역의 수가 감소하게 되어, 가능한 한 다수의 미소 반응구역에서 포착 하이브리다이제이션반응을 동시에 행하게 하고자 하는 목적에 대하여 부적합하다. 또 처리능력을 올리기 위하여 복수의 미소 구역에서 동시에 발광반응을 행하고자 하면, 역시 인접하는 미소 발광구역으로부터의 영향을 적게 할 필요가 있다. 그러나 화학발광은 발광의 수명시간도 짧기 때문에, 발광기질을 첨가한 후, 단시간 중 에 계측할 필요가 있어, 발광반응 개시후의 미소 구역 주사방식에 의한 계측은 정밀도가 좋지 않다.

이와 같은 종래법의 문제점을 해결하도록, 본 발명은 직경 20 내지 500㎛의 복수의 미소 구역 내로부터의 발광을, 동시에 고감도로 정밀도 좋게 검출하는 방법을 검토하여 고안된 것이다. 본 발명은 특히 마이크로어레이에 적합한 발광반응 개시 직후로부터 주변 방해발광의 영향을 저감하면서 측정하기 위한 기술을 제공하는 것을 목적으로 한다. 또 본 발명은 마이크로플레이트와 같은 직경 수 mm의 웰에 비하여 직경이 그 1/1O 이하인 미소 반응구역을 화학발광법 등의 발광법으로 검출하는 데에 있어서 적합한 기술을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명에서는 발광반응을 마이크로어레이플레이트에 설치한 미소 웰 내에서 행하고, 또한 발광의 수광에 광전도 가이드를 사용하고, 광전도 가이드의 수광단과 반응면의 거리를 극소로 하여 검출발광 광량의 손실을 줄임과 동시에, 주위의 다른 미소 웰로부터의 발광 혼입을 저감하도록 연구하였다. 미소 웰에 대응한 미세한 광전도 가이드(광섬유 이용)를 사용하여 가이드 선단면과 미소 웰 내의 반응면의 거리를 좁힘으로써 발광의 손실을 저감할 수 있고, 또 소량의 시약으로 검출할 수 있도록 하였다.

또, 본 발명의 다른 형태에서는 평탄한 마이크로어레이플레이트 기판을 사용하여 이것에 소정의 배열로 관통구멍을 설치한 불투명한 시트를 맞붙여 시트의 관통구멍의 부분을 미소 웰로서 이용함으로써, 미소 반응구역 사이에 격벽을 설치하 여 방해광을 저감할 수 있도록 하였다. 관통구멍의 직경을 광전도 가이드에 가까운 치수로 하면 주위로부터의 방해 발광의 영향을 더욱 저감할 수 있다. 관통구멍의 형상이나 치수를 변화시키거나, 다른 크기의 관통구멍을 조합시킴으로써 필요에 따른 다종류의 계측이 가능하게 된다.

미소 웰을 가지는 마이크로어레이플레이트는 현미경 슬라이드글라스를 가공하여 제조할 수 있으나, 이것에 한정되지 않는다. 미소 반응구역(미소 웰) 사이의 격벽은 화학발광 반응액의 확산을 방지함과 동시에, 미소 반응구역 사이의 발광을 차단하여 방해 발광의 혼입을 저감하는 역활을 한다. 이러한 한정된 미소 공간의 발광을 개별로 측정하기 위해서는, 광섬유 케이블을 사용한 광전도 가이드가 적합하다.

발광반응에는, 화학 발광물질을 표식하는 방법, 효소 표식하여 발광성의 반응산물을 생기게 하는 방법, 효소반응으로 생물발광을 생기게 하는 방법 등이 있으나, 본 발명은 어느 방법에도 적용할 수 있다. 효소반응을 이용한 발광의 경우, 반응생성물이 수용액 중으로 확산되어 가서 통상의 평탄한 마이크로어레이로는 발광구역을 특정할 수 없게 되나, 격벽이 있으면 확산을 방지할 수 있고, 스폿의 특정이 용이하다.

미소 웰의 형상은 원형으로 하는 것이 가장 간단하나, 원형에 한정되지 않는다. 또 미소 웰 내에 수 마이크로미터 이하의 자성 미립자를 다수 분산시키고, 그 입자 표면에 반응성의 핵산이나 단백질을 고정하여 둠으로써 미소 반응구역을 설정하여도 좋다. 웰의 어깨부는 웰밖으로의 발광의 산란을 방지하기 위하여 웰 개구 단은 예리한 각도를 가지고, 매끄러운 표면을 가지는 것이 바람직하다.

또, 발광의 시간적 감쇠를 고려하여 발광수명이 긴 발광물질과 짧은 발광물질을 각각 다른 대상의 표식으로서 사용하고, 일정시간 간격을 두고 복수의 발광화상을 측정하면 다른 핵산사슬이나 단백질 분자를 용이하게 구별할 수 있다. 화학발광 표식물질로서는, 루미놀, 아크리디늄에스테르, 효소로서는, 서양 고추냉이 ·펠옥시다아제, 알카리성 포스파타아제 등을 발광반응에 사용할 수 있다. 감도를 더욱 올리는 방법으로서는, 반딧불 루시페라아제를 표식에 사용하는 생물발광법도 사용할 수 있다.

본 발명은, 소정의 간격으로 정렬한 마이크로어레이플레이트의 복수의 미소 웰 중에 포착된 발광 반응물질을 검출하는 발광 검출장치로서, 이 장치는 마이크로어레이플레이트를 유지하는 유지수단과, 마이크로어레이플레이트에 형성된 미소 웰의 간격과 동일한 간격으로 선단을 미소 웰에 삽입 가능한 복수의 광전도 가이드 및 광전도 가이드와 조합되어 개개의 미소 웰에 발광반응의 기질용액을 도입하기 위한 기질용액 주입수단을 가지고, 유지수단의 위쪽에 위치하고 유지수단에 대하여 상하이동 가능한 발광검지유닛과, 발광검지유닛을 유지수단에 대하여 상하방향으로 구동하는 구동수단과, 구동수단에 의해 아래쪽으로 구동되는 발광검지유닛을 광전도 가이드의 선단이 마이크로어레이플레이트의 미소 웰에 삽입되고, 또한 미소 웰의 바닥면에 접촉하지 않는 소정위치에 정지시키는 수단과, 발광검지유닛으로 수광된 미소 웰로부터의 발광을 개별로 검출 가능한 광검출수단을 구비하는 것을 특징으로 한다.

광전도 가이드 사이의 중심 간격은 약 40 내지 2000㎛의 범위이다.

상기 장치는, 광전도 가이드의 선단이 마이크로어레이플레이트의 미소 웰에 삽입되고, 또한 미소 웰의 바닥면에 접촉하지 않는 소정위치에 정지시킨 후, 기질용액 주입수단에 의해 미소 웰에 발광기질 용액을 첨가하여 발광강도를 계측하는 제어수단을 구비한다.

본 발명에 의한 발광검출용 마이크로어레이플레이트는, 평탄한 표면을 가지는 기판과, 소정의 간격으로 정렬된 복수의 관통구멍을 가지고 기판의 평탄한 표면상에 접착된 불투명 시트를 구비하며, 불투명 시트의 관통구멍의 바닥에 노출된 기판 표면에 반응성 물질 고정구역을 설정하는 것을 특징으로 한다.

불투명 시트는 발수성을 가지는 것이 바람직하다. 관통구멍은 직경이 1O㎛내지 1OOO㎛의 범위에 있다.

또, 본 발명에 의한 타겟 생체 고분자의 검출방법은, 소정의 간격으로 복수의 미소 웰이 형성된 마이크로어레이플레이트의 미소 웰에 타겟 생체 고분자를 포착하는 반응성 물질을 고정한 미립자군을 침강시키는 단계와, 시료용액을 미소 웰에 분주하는 단계와, 시료가 분주된 마이크로어레이플레이트를 소정시간, 소정온도로 유지하는 단계와, 타겟 생체 고분자와 결합하는 발광표식 프로브 핵산사슬을 미소 웰에 첨가하는 단계와, 미소 웰에 발광반응의 기질용액을 첨가하여 발광을 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

타겟 생체 고분자는 특정한 염기배열을 가지는 핵산이나 특정한 단백질이며, 특정한 단백질은, 예를 들면 항체, 항원, 수용체, 렉틴 중 어느 하나로 할 수 있 다.

본 발명에 의하면, 마이크로어레이플레이트의 미소 반응구역의 개개의 발광량을 정밀도 좋고 감도 좋게 측정할 수 있다.

도 1은 본 발명에서 사용하는 발광검출용 마이크로어레이플레이트의 일례를 나타내는 설명도로서, (a)는 사시도, (b)는 그 A-A 단면도,

도 2는 본 발명에서 사용하는 발광검출용 마이크로어레이플레이트의 다른 예를 나타내는 설명도로서, (a)는 사시도, (b)는 그 A-A 단면도,

도 3은 본 발명에 의한 발광검출장치의 일례를 나타내는 개략도,

도 4는 마이크로어레이플레이트에 접근하여 발광구역으로부터의 발광을 검출하고 있는 발광검출유닛의 모식도,

도 5는 광전도 가이드와 기질 주입 캐필러리를 일체화한 발광검지유닛의 하나가 미소 웰에 삽입된 상태에서의 횡단면도,

도 6은 도 5의 측단면도,

도 7은 표식 프로브, 시료핵산사슬, 포착 프로브의 상호관계를 나타내는 반응 모식도,

도 8은 본 발명에 의한 마이크로어레이플레이트 및 발광계측장치를 사용한 다른 실험예에 대한 설명도이다.

본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위하여 첨부하는 도면에 따라 이것을 설 명한다.

도 1은 본 발명에서 사용하는 발광검출용 마이크로어레이플레이트의 일례를 나타내는 설명도로서, (a)는 사시도, (b)는 그 A-A 단면도이다.

도 1에 나타내는 마이크로어레이플레이트(10)는, 슬라이드글라스와 같은 유리판의 표면의 일부에 얕은 직사각형의 오목부(시료 도입구역)(11)가 형성되고, 또한 그 직사각형 오목부의 바닥면에 복수의 원형의 함몰부(미소 웰)(12)가 어레이형상으로 형성되어 있다. 복수의 미소 웰(12)은 각각 평탄한 바닥부를 가지며, 그 바닥부의 일부가 시료 중의 타겟 핵산과 하이브리다이즈하는 핵산 프로브를 고정하는 반응분자 고정화구역으로 되어 있다. 시료 도입구역(11)은 다수의 성분을 함유하는 1 종류의 시료를, 이 구역 내에 집합하고 있는 모든 미소 웰(12)에 동시에 분주하기 위하여 설치되어 있다. 개개의 미소 웰(12)에 시료를 일정량씩 분주할 수 있는 경우에는 시료 도입구역(11)은 불필요하다.

시료 도입구역이나 미소 웰의 치수는, 특별히 한정한 것은 아니나, 일례를 들면 시료 도입구역은, 세로 15mm ×가로 15mm ×깊이 0.2mm, 바닥면에 핵산 프로브 고정용 반응분자 고정화구역을 설치한 미소 웰은 직경이 약 150㎛의 원형이고, 깊이 약 100㎛ 이다. 원형의 미소 웰의 중심간 거리는 300㎛ 이다.

마이크로어레이플레이트(10)의 재질은 유리 외에 플라스틱이나 실리콘 등이어도 좋다. 또 투명일 필요는 없고, 오히려 검정색 등 빛을 흡수하는 색으로 착색되어 있으면, 빛의 반사도 줄고, 인접하는 반응분자 고정화구역에 있어서의 발광끼리의 간섭을 방지할 수 있어 적합하다. 미소 웰(12)은 절삭가공이나 화학에칭으로 형성하여도 좋으나, 몰드형으로 형성하여도 좋다.

도 2는 본 발명에서 사용하는 발광검출용 마이크로어레이플레이트의 다른 예를 나타내는 설명도로서, (a)는 사시도, (b)는 그 A-A 단면도이다.

이 마이크로어레이플레이트(20)는, 직사각형의 오목부(시료 도입구역)(21)를 형성한 유리 또는 플라스틱으로 이루어지는 슬라이드글라스(13)에 관통구멍이 어레이형상으로 배열된 불투명 시트(23)를 접착하여, 도 1에 나타낸 것과 동일한 구조로 한 것이다. 구체적으로는 평균 두께 약 1mm의 슬라이드글라스에 세로 15mm × 가로 15mm이고, 깊이 약 0.5mm의 직사각형 오목부를 형성하고, 그것과는 별도로 직경 350㎛의 관통구멍을 소정의 배열로 복수개 형성한 세로 15mm ×가로 15mm, 두께 약 250㎛의 검정색 카본함유 폴리에틸렌제 시트(23)를 준비하였다. 그리고 폴리에틸렌제 시트(23)의 한쪽 면에 에폭시계 접착제를 도포하여 슬라이드글라스에 형성한 오목부에 한쪽 끝으로부터 밀착하도록 부착하였다. 이와 같이 하여 제조된 마이크로어레이플레이트(20)는 시트에 형성한 관통구멍의 부분이 바닥면에 미소반응구역이 설정되는 미소 웰(22)이 되고, 미소 웰 사이에 존재하는 시트재료가 차광벽이 되어 인접하는 미소 웰로부터의 발광이 방해광이 되는 것을 방지하기 때문에, 계측의 재현성을 향상할 수 있다.

시트의 재질로서는, 시료나 기질액의 침윤이 없는 것이 요망되고, 발수성의 재료가 적합하다. 흡수성의 재료로서는 주위에 용액이 침투하여 계측에 부적당하다. PTFE(폴리테트라플루오로에틸렌)와 같은 불소계 고분자재 등도 이러한 목적에 적합하다. 시트 표면의 색으로서는 검정색과 같은 산란광을 일으키기 어려운 색이 바람직하나, 반드시 검정색에 한정되지 않는다.

도 3은 본 발명에 의한 발광검출장치의 일례를 나타내는 개략도이다. 여기서는 도 1에 나타낸 마이크로어레이플레이트(10)를 사용하는 예에 의하여 설명한다.

발광검출장치는, 상면에 마이크로어레이플레이트(10)를 유지하는 마이크로어레이플레이트 고정대(31), 고정대(31)에 대하여 상하이동 가능한 발광검지유닛 (32), 발광검지유닛(32)을 상하이동시키기 위한 발광검지유닛 이동아암(33), 발광검지유닛 이동아암(33)을 지지하는 지주(34)를 구비한다. 또 발광기질액이 들어 간 발광기질액 병(35), 병(35)으로부터 발광기질액을 마이크로실린지(37)에 송출하기 위한 펌프(36), 마이크로실린지(37) 중의 발광기질액을 마이크로어레이플레이트 (10)의 각 미소 웰에 주입하기 위한 플런저 밀어내림기구(38)를 구비한다. 이들 요소는, 외광을 차광하는 박스체(30) 중에 설치되어 있다. 발광검지유닛(32)은, 광전도 가이드 번들(39)에 의해 포토 카운팅장치(40)와 접속되어 있다. 발광검지유닛 이동아암(33), 펌프(36), 플런저 밀어 내림기구(38) 및 포토 카운팅장치 (40)는 제어부(45)에 의해 제어된다.

제어부(45)는 발광검지유닛 이동아암(33)의 승강을 제어하여, 반응전에 각 반응구역의 표면 가까이까지 각 광전도 가이드(41)를 하강시키고, 플런저 밀어 내림기구(38)의 조작에 의하여 발광기질용액을 첨가하여 발광반응을 개시시킨다. 또한 그 발광강도를 포토 카운팅장치(40)로 계측한다. 그후 각 광전도 가이드(41) 선단을 세정하여 기질성분 등의 오염을 제거한다. 다음에 마이크로어레이플레이트 상의 다른 미소 반응구역의 위로 이동하여, 다음구역에서의 발광반응을 일으켜 계측한다. 이 반응, 계측, 세정을 반복하여 전 미소 반응구역에 대하여 행하고, 그 발광강도를 측정하여 데이터처리장치에 데이터를 송부한다.

도 4는 마이크로어레이플레이트에 접근하여 발광구역으로부터의 발광을 검출하고 있는 발광검출유닛의 모식도이다.

발광검지유닛(32)은, 마이크로어레이플레이트(10)에 설치된 복수의 미소 웰(12)과 동일한 간격으로 배치된 복수의 광전도 가이드(41)를 구비한다. 복수의 광전도 가이드(41)는 간격을 갖춘 발광검지유닛 이동아암(33)의 고정구멍에 고정되고, 이 아래쪽 위치에서 동일하게 간격을 갖춘 광전도 가이드 고정스페이서(42)의 고정구멍에 고정되고 일체화되어 있다. 또 발광검지유닛(32)은, 광전도 가이드 (41)에 섞여 발광검지유닛 이동아암(33)으로부터 아래쪽으로 연장되는 1개 또는 수개의 높이 제어용 막대형상부재(62)(도 6 참조)를 구비한다. 발광검지유닛(32)은 그 광전도 가이드(41)가 마이크로어레이플레이트(10)에 설치된 복수의 미소 웰(12)에 위치 맞춤된 상태에서 발광검지유닛 이동아암(33)을 하강함으로써 각 광전도 가이드(41)의 선단이 미소 웰 내에 삽입된다. 이때 높이 제어용 막대형상부재(62)가 마이크로어레이플레이트(10)에 맞닿은 위치에서 발광검지유닛(32)의 하강을 정지함으로써, 광전도 가이드(41)의 선단은 미소 웰(12)의 바닥면에 접촉하는 일은 없다. 발광검지유닛(32)의 각 광전도 가이드(41)의 선단 수광면에서 수광된 빛은 포토 카운팅장치(40)에 내장된 멀티채널 광전자 증배관에 의해 개별로 검출된다.

도 5는 광전도 가이드와 기질주입 캐필러리를 일체화한 발광검지유닛의 하나 가 미소 웰에 삽입된 상태에서의 횡단면도이고, 도 6은 그 측단면도이다.

광전도 가이드(41)는, 코어(41a), 클래드(41b) 및 피복(41c)으로 이루어진다. 코어(41a)의 직경은 약 50㎛, 피복(41c)의 외경은 약 120㎛ 이다. 광전도 가이드(41)에는 각각 기질주입 캐필러리(51)가 일체화하여 설치되어 있다. 기질주입캐필러리(51)는, 예를 들면 외경 30㎛, 내경 20㎛의 유리 세관(細管)이며, 광전도 가이드(41)의 피복 표면에 접착제층(52)으로 고정되어 있다. 개개의 기질주입 캐필러리(51)의 상단에는 마이크로실린지(37)가 실리콘 고무관 등으로 접속되어 있고, 이 마이크로실린지(37)의 플런저에 플런저 밀어 내림기구(38)로부터 약간의 일정한 압력을 가함으로써 주입 캐필러리(51)의 하단으로부터 미소 웰(12)에 발광 반응기질액을 주입할 수 있다. 주입 캐필러리(51)의 선단은 광전도 가이드(41)의 선단면에 갖추어져 있고, 발광 반응기질액이 표면을 통하여 미소 웰(12)의 바닥면에 설치된 반응분자 고정화구역(61)과의 간극으로 침투하도록 되어 있다. 도 6은 마이크로어레이플레이트(10)의 미소 웰(12)에 기질용액 주입 캐필러리로부터 주입된 화학발광반응의 기질용액(65)이 고여 있는 상태를 나타내고 있다.

높이 제어용의 막대형상부재(62)는, 광전도 가이드(41)와 기질용액 주입 캐필러리(51)의 선단을 미소 웰(12)의 바닥면으로부터 일정한 높이에서 정지시키기 위하여 사용된다. 광전도 가이드(41)의 선단면이 미소 웰(12) 내의 반응분자 고정화구역(61)과 접촉하고 있으면, 기포, 공극 등에 의해 화학발광 반응기질용액(65)이 표식효소 등에 접촉하기 어렵게 되기 때문에, 반응분자 고정화구역(61) 표면과 광전도 가이드(41)의 선단면과의 사이에 일정한 거리를 두는 것이 바람직하다. 도 시한 예의 경우, 높이 제어용의 막대형상부재(62)는 선단이 광전도 가이드(41)의 선단보다도 위쪽에 있고, 각 광전도 가이드(41)의 선단이 미소 웰에 정렬하여 삽입되었을 때, 미소 웰 밖의 위치에서 마이크로어레이플레이트 표면과 접촉하도록 설계되어 있다. 본 예에서는, 높이 제어용의 막대형상부재(62)의 선단부가 마이크로어레이플레이트 표면과 접촉한 상태에서 광전도 가이드(41)의 선단면과 웰 바닥면과의 사이에 약 20㎛의 간극이 생기도록 설정하였다. 이에 의하여 다수의 미소 반응구역에서의 동시측정이 가능하게 되어, 처리능력을 대폭으로 향상할 수 있었다.

높이 제어용 가이드를 광전도 가이드로 구성하는 것도 가능하다. 그 경우에는 검지용 광원으로부터 높이 제어용 광전도 가이드를 통하여 도입된 광이 미소 웰 (12)의 바닥면에서 반사하여, 다시 높이 제어용 광전도 가이드를 되돌아 오는 반사광 강도에 큰 변화가 생김으로써 높이 제어용 광전도 가이드의 선단면이 마이크로어레이플레이트에 접촉한 것을 검지할 수 있다. 높이의 제어는 반사광에서의 검지 이외에, 메카니컬한 상하 이동거리 측정으로도 행할 수 있다. 또 높이 제어용 부재는, 미소 웰(12)의 바닥면과 접촉하도록 설계할 수도 있다. 그 경우에는 높이 제어용 부재의 선단을, 광전도 가이드(41)보다 아래쪽으로 돌출시켜 둔다.

다음에 본 발명에 의한 마이크로어레이플레이트 및 발광계측장치를 사용한 실험예에 대하여 설명한다.

도 1에 나타낸 마이크로어레이플레이트(10)를 세정 후, 각 미소 웰(12)의 바닥면에 술프히드릴(SH)기를 가지는 실란화제를 반응시켜, SH기를 표면에 도입하였다. 다음에 아미노기를 말단에 도입한 포착용 핵산 프로브를 함유하는 용액과 m- 말레이미드벤조일-N-하이드록시숙신이미드·에스테르용액을 혼합·반응시킨 후, 마이크로어레이작성장치(어레이어)를 사용하여 각 스폿영역에 1 nl씩 스폿하여 미소 웰(12)의 바닥면에 설정한 반응분자 고정화구역(61)의 중앙에 도입한 SH기와 반응시켜 고정화하였다. 고정화 포착용 핵산 프로브는, 건조후 고정되지 않았던 불필요 시약과 공존성분을 순수로 세정하여 청정한 마이크로어레이플레이트로 하였다.

미소 웰(12)을 함유하는 시료 도입구역(11)(세로 15mm ×가로 15mm × 깊이 0.2mm)전체에 똑같이 피검 시료를 40㎕ 분주하여 각 미소 웰 내의 고정화 포착용 핵산 프로브와 반응시켰다. 측정대상으로서 B형 간염 바이러스(HBV)의 지놈 DNA를 사용하였다. 포착용 및 표식용 핵산 프로브에는 합성한 올리고 누클레오티드(염기길이 50bp) 각종을 사용하였다. 하이브리다이제이션 반응은 마이크로어레이플레이트를 밀봉하여 약 45℃에서 가온한 인큐베이터 안에 정치하여 약 5시간 행하였다.

측정대상인 핵산사슬을 샌드위치 엇세이에서 2종류의 프로브를 사용하여 포착·계측하였다. 측정대상인 타겟 핵산사슬의 포착 프로브 미결합 부위와 반응하는 표식 핵산 프로브에는 상법으로 미리 서양 고추냉이 펠옥시다아제를 결합시켜 두었다. 하이브리다이제이션 후, 미결합의 표식 핵산 프로브액을 마이크로피펫으로 빨아 올리고, 다음에 세정액 4O㎕를 수회로 나누어 주입과 배출을 반복하였다. 다음에 표식 프로브결합 핵산 프로브를 첨가하고, 다시 5시간 인큐베이션을 행하였다. 하이브리다이제이션 후, 미결합의 핵산 프로브액을 마이크로피펫으로 빨아 올리고, 다음에 세정액 4O㎕를 수회로 나누어 마이크로피펫으로 주입과 배출을 반복하였다.

도 7은 표식 프로브, 시료핵산사슬, 포착 프로브의 상호관계를 나타내는 반응 모식도이다.

미소 웰(12)에 설치된 반응분자 고정화구역의 표면(71)에는, SH기가 노출된 프로브 고정부(72)가 있어 그곳에 포착용 핵산 프로브(73)가 고정된다. 시료 중의 타겟 핵산(74)은, 하이브리다이제이션 반응에 의해 핵산 프로브(73)와 하이브리다이즈한다. 타겟 핵산(74)의 포착 프로브와의 미결합 부위에는 발광표식물질(76)이 결합한 표식 핵산 프로브(75)가 결합되어 있다.

제일 마지막의 세정액을 빨아 올린 후, 마이크로어레이플레이트(10)를 도 3에 나타낸 발광검출장치의 마이크로어레이플레이트 고정대(31)상에 놓았다. 발광검지유닛(32)을 마이크로어레이플레이트(10)의 미소 웰(직경 150㎛)에 위치 결정하고, 발광검지유닛 이동아암(33)을 구동하여 발광검지유닛(32)를 하강시켰다. 도시한 예의 발광검지유닛(32) 중에는 16개의 광전도 가이드(41)가 조립되어 있다. 발광검지유닛(32) 중의 높이 제어용 막대형상부재(62)의 선단이 마이크로어레이플레이트(10)의 표면에 접촉한 곳에서 발광검지유닛(32)의 움직임을 정지하였다. 이 상태에서 발광검지유닛(32)의 광전도 가이드(41) 및 기질 주입 캐필러리 (51)는 미소 웰(12) 내에 삽입되고, 그 선단이 미소 웰(12)의 바닥면으로부터 20㎛의 높이인 곳에서 정지하고 있다. 다음에 각 광전도 가이드(41)의 하면과 미소 웰 (12)의 반응분자 고정화구역(61) 사이의 간극에 주입 캐필러리(5)를 사용하여 효소반응기질 루미놀과 과산화수소를 함유하는 반응액을 약 1 nl 첨가하고 발광반응을 개시하여 반응액 주입시점으로부터 10초 경과 후까지의 발광강도를 16채널 광전자 증배관(하 마마쯔호토닉스사)을 내장한 포토 카운팅장치(40)로 측정하였다.

그 결과, 타겟 핵산사슬을 농도 1Opmol/l로 함유하는 시료용액을 반응시킨 스폿에서는 함유하지 않은 시료에 비교하여 약 60배의 상대 발광강도를 얻었다. 또 인접하는 미소 구역에서 반응시킨 타겟 핵산사슬을 1Opmol/l 함유하는 시료용액의 발광강도의 영향은 5% 이하로서, 무시할 수 있었다. 마이크로어레이플레이트 전체의 발광강도 분포는, 각 광전도 가이드로부터의 출력을 플롯함으로써 볼 수 있다.

또, 마이크로어레이플레이트로서 도 2에 나타낸 것을 사용한 이외, 상기와 동일한 시약 반응조건으로 발광을 계측하였다. 그 결과, 타겟 핵산사슬을 1OpM 함유하는 시료용액을 반응시킨 스폿에서는 함유하지 않은 시료에서의 발광강도에 비교하여 약 50배의 상대 발광강도를 얻었다.

상기와 동일한 실험을 표식효소로서 알카리성 포스파타아제를 서양 고추냉이·펠옥시다아제의 대신으로 사용하여 행할 수 있었다. 기질로서는 예를 들면 디옥세탄화합물의 Lumigen APS-5(Lumigen 사)를 사용하면 긴 수명의 발광계측을 실현할 수 있어 동일시간으로 종래 기질의 약 10배의 광량이 얻어졌다.

본 발명에 의한 마이크로어레이플레이트 및 발광계측장치를 사용한 다른 실험예에 대하여 설명한다.

입자 직경이 평균 4.0㎛인 0.01%(W/W) 실리카입자 현탁액에, 1%γ-아미노프로필트리에톡시실란의 에탄올용액을 1/10량 첨가하여 60℃에서 3시간 가온하고, 표면에 아미노기를 도입하였다. 아비딘 단백질용액을 아미노화처리를 실시한 실리카 입자에 가하여 1% 글루타르알데히드를 첨가하여 고정하였다. 다음에 말단을 비오틴수식한 포착용 프로브 핵산사슬을 각종 준비하여 분할한 아비딘고정 실리카미립자 현탁액과 반응시켜 포착 프로브 핵산사슬 고정 실리카입자를 제작하였다.

도 2에 나타낸 마이크로어레이플레이트(20)를 사용하여 도 8에 나타내는 바와 같이 다른 핵산사슬 고정화 실리카입자(81)를 1nl씩, 미소 웰(22)에 분주하였다. 본 예의 마이크로어레이플레이트(20)는 각 미소 웰(22)의 바닥면에는 아무것도 고정되어 있지 않다. 실리카미립자 현탁액을 공기 건조시킨 후, 마이크로어레이플레이트의 시료도입구역(21)에 측정대상 핵산을 함유하는 시료를 40㎕ 주입하고, 각 미소 웰(22)에 분주하여 측정대상 핵산사슬을 이것을 포착하는 실리카미립자에 결합시켰다. 40℃, 12시간의 하이브리다이제이션 후, 충분히 세정을 행하였다.

다음에 마이크로어레이플레이트를 도 3에 나타낸 발광검출장치에 설치하여, 발광표식효소 알카리성 포스파타아제를 결합시킨 발광표식 프로브 핵산사슬을 각 미소 웰에 가하고, 상기와 동일하게 하여 각 미소 웰로부터의 발광을 검출하였다. 그 결과, 측정대상인 DNA 사슬을 1nM의 농도로 함유하는 시료로부터는 대상으로 하는 DNA 사슬을 함유하지 않은 시료에 비교하여 약 30배의 발광강도가 얻어졌다. 이 예의 경우 실리카입자를 두는 반응분자고정화 구역의 장소는 복수의 미소 웰에 자유롭게 설정, 변경할 수 있다. 또 주입 실리카입자량을 변화시켜 포착용량을 바꾸는 것도 용이하다. 또한 실리카미립자를 씻어 내면 마이크로어레이플레이트를 재이용하는 것도 가능하다.

본 발명에 의하면 복수의 반응분자고정화 구역을 가지는 마이크로어레이의 발광검출에 있어서, 반응구역을 둘러 싸는 격벽을 각 반응분자 고정화 구역의 주위에 설치함으로써, 개개의 미소 구역으로부터의 발광강도를 감도 및 정밀도 좋게 저시약 비용으로 검출하는 것이 가능하게 된다.

Claims (8)

1. 복수의 미소 웰이 소정의 간격으로 정렬한 마이크로어레이 플레이트의 상기 미소 웰 중에 포착된 발광반응물질을 검출하는 발광검출장치에 있어서,

   상기 마이크로어레이플레이트를 유지하는 유지수단과,

   상기 마이크로어레이플레이트에 형성된 미소 웰의 간격과 동일한 간격으로 선단을 상기 미소 웰에 삽입 가능한 복수의 광전도 가이드와,

   상기 광전도 가이드와 조합되어 개개의 미소 웰에 발광반응의 기질용액을 도입하기 위한 기질용액 주입수단을 가지고, 상기 유지수단의 위쪽에 위치하여 상기유지수단에 대하여 상하이동 가능한 발광검지유닛과,

   상기 발광검지유닛을 상기 유지수단에 대하여 상하방향으로 구동하는 구동수단과,

   상기 구동수단에 의해 아래쪽으로 구동되는 발광검지유닛을, 상기 광전도 가이드의 선단이 상기 마이크로어레이플레이트의 미소 웰에 삽입되고, 또한 상기 미소 웰의 바닥면에 접촉하지 않은 소정위치에 정지시키는 수단과,

   상기 발광검지유닛으로 수광된 상기 미소 웰로부터의 발광을 개별로 검출 가능한 광 검출수단을 구비하는 것을 특징으로 하는 발광검출장치.
2. 제 1항에 있어서,

   인접하는 상기 광전도 가이드 사이의 중심간격은 40 내지 2000㎛의 범위인 것을 특징으로 하는 발광검출장치.
3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,

   상기 광전도 가이드의 선단이 상기 마이크로어레이플레이트의 미소 웰에 삽입되고, 또한 상기 미소 웰의 바닥면에 접촉하지 않은 소정위치에 정지시킨 후, 기질용액 주입수단에 의해 상기 미소 웰에 발광기질용액을 첨가하여 발광강도를 계측하는 제어수단을 구비하는 것을 특징으로 하는 발광검출장치.
4. 평탄한 표면을 가지는 기판이고,

   상기 표면에 용액을 유지할 수 있는 오목부를 가지고,

   상기 오목부의 바닥면에는, 용액 또는 미립자 등의 고체성분을 유지하기 위한 복수의 웰을 가지고,

   상기 복수의 웰은 상기 오목부의 바닥면 내에서 소정의 간격으로 정렬되고,

   상기 오목부의 바닥면 및 상기 복수의 웰의 측면은 불투명하고,

   상기 웰의 바닥부는 반응성 물질 고정구역인 것을 특징으로 하는 마이크로어레이 플레이트.
5. 제 4항에 있어서,

   상기 웰을 가지는 부분은, 소정의 간격으로 정렬된 복수의 관통구멍을 가지는 불투명시트를 오목부의 바닥부에 접착하여 형성되어 있는 것을 특징으로 하는 마이크로어레이 플레이트.
6. 제 4항 또는 제 5항에 있어서,

   상기 복수의 웰은 발수성을 가지는 것을 특징으로 하는 마이크로어레이 플레이트.
7. 제 4항 또는 제 5항에 있어서,

   상기 복수의 웰의 지름은, 0.01mm 내지 1mm의 범위인 것을 특징으로 하는 마이크로어레이 플레이트.
8. 평탄한 표면을 가지는 기판이고, 상기 표면에 용액을 유지할 수 있는 오목부를 가지고, 상기 오목부의 바닥면에는, 용액 또는 미립자 등의 고체성분을 유지하기 위한 복수의 웰을 가지고, 상기 복수의 웰은 상기 오목부의 바닥면 내에서 소정의 간격으로 정렬되고, 상기 오목부의 바닥면 및 상기 복수의 웰의 측면은 불투명하고, 상기 웰의 바닥부는 반응성 물질 고정구역인 것을 특징으로 하는 마이크로어레이 플레이트를 사용한 타겟생체 고분자의 검출방법에 있어서,

   상기 복수의 웰에 타겟생체 고분자를 포착하는 반응성 물질을 고정한 미립자군을 침강시켜, 시료용액을 상기 오목부에 분주하고,

   상기 시료는 분주된 마이크르어레이 플레이크를 소정시간, 소정온도로 유지하고,

   상기 타겟생체 고분자와 결합하는 발광표식 프로브 핵산사슬을 상기 웰에 첨가하고,

   상기 웰에 발광반응의 기질용액을 첨가하여 발광을 검출하는 것을 특징으로 하는 타겟생체 고분자의 검출방법.

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