KR20030071868A

KR20030071868A - 거울상이성질체-풍부 아미노산의 제조 방법

Info

Publication number: KR20030071868A
Application number: KR10-2003-7009948A
Authority: KR
Inventors: 보에스텐빌헬무스후베르투스죠셉; 키에르컬스조안네스게라르두스테오도루스
Original assignee: 디에스엠 아이피 어셋츠 비.브이.
Priority date: 2001-01-31
Filing date: 2002-01-31
Publication date: 2003-09-06
Also published as: HUP0302864A2; CN1520460A; NL1017250C1; AU2002230274A1; WO2002061107A2; EP1404854A2; WO2002061107A3; CZ20032077A3; JP2004521623A

Abstract

D-거울상이성질체가 풍부한 키랄 아미노산의 제조 방법에 관한 것으로서,

대응하는 N-카르바모일아미노산의 거울상이성질체의 혼합물을 인산, 인산일수소 또는 인산이수소 이온의 2가 금속 염을 첨가하여 제거된, 유리 상태로 존재하는 암모니아와 D-카르바모일화효소와 접촉시켜 생성시키는 것을 특징으로 하며, 하나의 구체예에서 효소적 탈카르바모일화는 인산 이온, 인산일수소 이온 또는 인산이수소 이온의 2가 금속 염의 존재하에 실행하며, 또 다른 구체예에서 반응 혼합물은 존재하는 고체의 분리 후에 인산 이온, 인산일수소 이온 또는 인산이수소가 금속 염으로 외부 루프를 경유해서 접촉되어 생성되며, D-거울상이성질체가 풍부한 키랄 아미노산은 또한 그 다음에 D-거울상이성질체가 풍부한 아미노산으로 본 발명에 의해 전환되는 대응하는 N-카르바모일아미노산으로 히단토인화효소를 첨가하여 대응하는 히단토인을 효소적으로 전환시켜 수득할 수 있는 것을 특징으로 한다.

Description

거울상이성질체-풍부 아미노산의 제조 방법{PROCESS FOR THE PREPARATION OF ENANTIOMER-ENRICHED AMINO ACIDS}

본 발명은 대응하는 N-카르바모일아미노산의 거울상이성질체 혼합물이 유리되어 존재하는 암모니아와 D-카르바모일화효소를 접촉시켜 생성되는, D-거울상이성질체가 풍부한 아미노산의 제조 방법에 관한 것이다.

D-아미노산은 β-락탐 항생제, 펩타이드 호르몬 및 살충제와 같은 생물학적 활성 제조를 위한 중요한 구성단위이다. 상기 "비천연" 아미노산을 위해 주로 사용되는 제조 방법은 대응하는 DL-5-치환 히단토인을 대응하는 N-카르바모일아미노산을 형성시키기 위해 히단토인화효소로 거울상이성질선택적으로 가수분해 시키는 방법이다. 상기 N-카르바모일아미노산은 대응하는 D-아미노산으로 효소학적으로 전환될 수 있다.

공지된 방법의 단점은 카르바모일아미노산의 가수분해를 초래하는 효소(N-카르바모일-D-아미노산 아미도가수분해효소라고도 하는 카르바모일화효소)는 반응 생성물 암모니아에 의해 강하게 저해받는 것으로 일반적으로 공지되었으므로 비교적 대량의 생촉매가 필요하다는 것이다. 암모니아-원인 억제가 발생되는 농도는 매우 낮게(~10mM) 기록되어 있다(Olivieri et. al.(1981) Biotechnology and Bioengineering, vol. 23, 2173-2183; Runser(1990) Applied Microbiology andBiotechnology, 33, 382-388; Louwrier(1996) Enzyme and Microbial Technology, 19, 562-571). 공지된 방법에 있어서, 상기는 10mM의 암모니아 농도에서 카르바모일화효소는 최대 속도의 반에서 활성이 있다는 것을 의미한다. 20mM의 암모니아 농도에서 카르바모일화효소의 속도는 최대 속도의 단지 1/3이다. 산업적으로 적절한 조건하에서, 예를 들어 500mM 이상의 높은 생성물 농도가 바람직하며, 카르바모일화효소의 속도는 매우 강하게 억제될 것임이 명백할 것이다. 카르바모일화효소의 활성이 거의 최대일 때 낮은 생성물 농도(크기 10mM과 유사)는 그것의 저 생산능력 때문에 경제적으로 바람직하지 않다.

문헌에 효소적 전환 중에 암모니아 농도를 낮게 유지하는 다양한 방법이 기재되어 있다. 암모니아를 원래의 농도로 만들기 위한 제거의 실시예는 히단토인화효소와 카르바모일화효소를 첨가해서 D-p-히드록시페닐글리신의 제조 중 암모니아의 제거를 위한 흡착제로 구성된 것의 사용이 Kim and kim,(1995), Enzyme and Microbial Technology, 17, 63-67에 기재되어 있다. 상기 방법의 단점은 흡착제가 고가이어서 재사용해야 한다는 것이다.

J 61.285.996-A(1986)에 기재된 또 다른 방법에 의하면, 형성된 암모니아는 증류법에 의해 제거된다. 그러나, 암모니아의 제거를 위한 상기 방법은 반응 혼합물이 높은 pH를 갖을 때만 효과적이다. 그러나, 상기와 같은 높은 pH에서 카르바모일화효소는 활성이 없다. pH 7-7.5인 중성 pH에서 증류법으로 암모니아를 제거할 때 반응 부피의 90% 이상이 제거될 때라도 반응 혼합물에는 90%의 형성된 암모니아가 남아 있다. 따라서, 중성 pH에서 효과적인 제거는 불가능하다.

본 발명은 현재 소량의 생촉매가 사용되거나 또는 짧은 반응시간을 현실화하는 간단하고 경제적으로 유용한 방법을 제공하는 것이다.

상기는 인산염으로 간단하게 도안된 추가의 설명에서 인산 이온, 인산일수소 이온 또는 인산이수소 이온의 2가의 금속 염의 첨가로 암모니아를 제거하는 본 발명에 의해 수득된다. 상기의 결과에서 예를 들어 효소학적 반응은 인산 염의 존재시에 (예를 들어) 실행될 수 있다. 놀랍게도, 반응 혼합물은 높은 슬러리 농도에서 쉽게 교반가능하게 남아있다는 것이 추가로 발견되었다.

또 다른 구체예는 예를 들어 인산 염이 존재하는 이차 반응기 또는 컬럼 또는 필터를 통해 불용해된 반응 성분의 분리 후에 예를 들어 루프를 경유해서 주요한 반응 혼합물에 의해 형성된다. 그 다음에 반응 혼합물에 존재하는 암모니아는 예를 들어 효소를 여전히 포함하는 잔류 액체를 효소적 탈카르바모일화 반응 용기에 넣은 후 대응하는 인산 암모늄 염을 획득하기 위해 인산 염과 결합한다.

없거나 또는 아주 적은 효소 억제가 일어나는 것이 발견되었다. 이가 금속은 심지어 낮은 농도(1-10μ몰)에서 카르바모일화효소-촉매 반응를 방해할 수 있다는 것이 알려져 있기 때문에 더 놀라운 것이다.

적합한 2가 금속 이온의 예는 마그네슘, 코발트, 칼슘, 망간(manganese), 지르코늄 또는 루테늄 이온이다. 경제적인 이유로 인산수소 마그네슘이라고도 불리는 인산일수소 마그네슘(MgHPO₄)으로 구성된 것을 사용하는 것이 바람직하다. MgHPO₄는 최종 pH에 따른 최적의 방법 조건에 잘 맞으며, 저렴한 원료로부터의 제조가 쉽다. 상기 인산 염은 또한 제 자리에서 형성될 수 있다.

예를 들어 MgHPO₄인 인산 염은 인산 염을 획득하기 위해 예를 들어 마그네슘 산화물 또는 수산화물인 대응하는 산화물 또는 수산화물에 인산을 첨가하는 간단한 방법으로 제조될 수 있다. 수득된 상기 인산 염은 (여과 또는 세척후에 선택적으로) 그 후에 첨가될 수 있다.

사용되는 인산 염의 양은 반응중에 형성되는 암모니아의 양과 비교해서 0.5 내지 3 인산 염 당량, 특히 0.8 내지 1.2 당량 사이인 것이 바람직하다.

사용할 수 있는 적합한 효소의 예는 예를 들어Pseudomonas, 특히Pseudomonas fluorescens, putida또는desmolytica, Achromobacter,Corynebacterium, Bacillus,특히Bacillus brevis또는Bacillus stearothermophilus, Brevibacterium, Microbacterium, Artrobacter, Agrobacterium,특히Agrobacterium tumefaciens또는radiobacter, Acrobacter, Klebsiella, Sarcina, Protaminobacter, Streptomyces, Actinomyces, Candida, Rhodotorula, Pichia또는Paecilomyces속으로부터 유도된 효소인 히단토인화요소-카르바모일화효소 방법에 일반적으로 사용되는 효소이다.

효소적 반응은 pH 5 내지 pH 9 사이의 pH에서 실행시킬 수 있으며, pH 6 내지 8 사이의 pH에서 실행시키는 것이 바람직하다. 실행시키는 효소 반응의 온도는 0 내지 50℃, 특히 20 내지 40℃사이가 바람직하다.

효소 반응이 완료되면, 반응 혼합물은 다양한 방법으로 회수될 수 있다.

적당한 회수는 예를 들어 바이오매스(biomass) 제거후에 0 내지 3, 바람직하게는 0.5 내지 1.5 의 pH로 반응 혼합물을 산성화함으로 실행된다. 예를 들어 3 내지 5, 바람직하게는 3.5 내지 4.5로의 pH 증가후에 D-아미노산을 예를 들어 여과 또는 원심분리에 의해 분리시킬 수 있다. 5 내지 11, 바람직하게는 7 내지 10 정도로 pH를 증가시킨 후 인산 염으로부터 형성된 대응하는 인산 암모늄 염은 예를 들어 원심분리 또는 여과를 경유해서 분리시킬 수 있다.

또 다른 적합한 회수는 예를 들어 인산 염으로부터 형성된 대응하는 고체 인산 암모늄 염을 여과시킨 후 9 내지 11, 바람직하게는 9.5 내지 10.5 정도로 pH를 증가시켜 실행된다. 최종 모액으로부터 그 이후에 바이오매스가 예를 들어 미세여과 또는 초원심분리 방법에 의해 제거된다. 예를 들어 3 내지 6, 바람직하게는 4.5 내지 5.5의 pH로 산성화 후에 고체 D-아미노산은 예를 들어 여과에 의해 그 이후에 분리시킬 수 있다.

최종 인산 암모늄 염은 그 이후에 유리 되어 존재하는 암모니아와 인산 암모늄 염의 건조 가열에 의해 인산 염으로, 공지된 방법에서 간단하게 전환 시킬수 있다. 또 다른 방법은 유리 상태로 존재하는 암모니아와 pH 8.5 이상, 특히 9 내지 11에서 인산 암모늄 염의 슬러리를 가열시키는 것이다. 또 다른 방법은 pH를 4.5 내지 6.5, 바람직하게는 5.5 내지 6으로 유지시키면서 예를 들어 황산인 무기산(mineral acid)으로 인산 마그네슘 암모늄 염을 세척하는 것이다. 따라서 암모늄 염과 무기산이 수득되며 Mg 인산수소가 회수될 수 있다.

1984과 1985에 US-A-4,460,555와 US-A-4,650,857에 특정한 인산수소 마그네슘 입자가 암모니아 스캐빈져로써 기재되었다. 상기 특허 출원은 유레아로부터 유리된 청소 암모니아에 의해 유레아효소의 첨가로 유레아를 제거하는 효소적 여과 시스템에 사용하는 상기 입자에 관한 것이다. 그러나, 여기서 유리된 암모니아 전체 양은 비교적 적다. 그러나 효소 억제 예방을 위한 히단토인화효소/카르바모일화효소 방법에 상기 입자의 사용은 그때 이후에 경과된 시간내에 실행될 수 없다.

본 발명은 탈카르바모일화가 전체적인 반응 속도 결정 단계이며, D-카르바모일화효소의 첨가로 탈카르바모일화 이후에 선택적으로 라세미화효소와 조합된 히단토인화효소를 첨가하여 대응하는 히단토인으로부터 D-거울상이성질체가 풍부한 N-카르바모일아미노산의 제조와 관련된, 히단토인 루트를 경유해서 거울상이성질체계 풍부 아미노산의 제조에 사용하기에 특히 적합하다. 인산 염 및/또는 인산 암모늄 염의 존재는 히단토인화효소, 카르바모일화효소 및/또는 라세미화효소에 억제 또는 변성 효과가 없다. 공지된 방법에서, 상기 전환이 실행되는 pH는 NH₃가 존재하기 때문에 높은 pH 값에서는 실제적으로 완벽한 효소 억제가 일어나기 때문에 주로 7 내지 8 사이이다. 대략 중성 pH에서 실행되는 반응의 단점은 거의 모든 아미노산, 특히 지방족 아미노산의 제조에서 실행된 후에 잔존하는 히단토인 거울상이성질체의 라세미화가 느리다.

본 발명에 의한 반응은 원하지 않은 거울상이성질체의 라세미화가 발생되는 동안에 효소 억제가 거의 일어나지 않는, 예를 들어 7.0 내지 9.0, 특히 7.5 내지 8.5의 pH인 높은 pH에서 실행되는 것이 발견되었다. 결과로써 이론적으로 라세미화가 없이 최대로 가능하게 50% 이상의 수율이 수득될 수 있다.

본 발명에 의한 방법은 DL-N-카르바모일아미노산이 D-선택 히단토인-가수분해 및 N-카르바모일아미노산-가스분해 효소를 함유하는 미세조직을 첨가하여 거울상이성질체가 풍부한 비-변환 L-N-카르바모일아미노산과 D-거울상이성질체가 풍부한 대응하는 아미노산으로 전환되는 분석 방법에 또한 사용될 수 있다. 반응은 증가된 pH(예를 들어 7.5 내지 9)에서 실행될 수 있기 때문에, 증가된 pH에서 히단토인화효소 반응이 진행되지 않도록 하기 위해 L-N-카르바모일아미노산의 손실이 적다.

실시예 I

34g DL-p-히드록시페닐글리신 히단토인과 34g MgHPO₄·3H₂O를 200㎖ 물에 첨가하였다. 반응 혼합물의 pH를 5N NaOH를 첨가하여 pH=7.2로 적정시킨 후에 34㎖Agrobacterium radiobacter세포 현탁액을 첨가하여 반응을 개시하였다. 상기 반응은 40℃에서 질소 환경 하에서 실행하였다. 반응 혼합물의 pH는 5N NaOH을 첨가하여 pH 7.2로 일정하게 유지시켰다. HPLC 분석으로 10 시간 가수분해 후에 99% 이상이 전환되도록 설정하였다.

비교 실험 1

실시예 1에 기재된 동일한 조건하에서, 그러나 인산 염이 존재하지 않는 조건에서 34g DL-p-히드록시페닐글리신 히단토인을 가수분해 시켰다. 상기 반응을34㎖의 동일한Agrobacterium radiobacter세포 현탁액을 첨가하여 개시하였다. 상기 반응은 40℃에서 질소 환경 하에서 실행하였다. 반응 혼합물의 pH는 1.3M H₃PO₄로 자동 적정 방법으로 pH=7.2로 일정하게 유지시켰다. 일정한 시간에 반응 진행 과정을 HPLC 분석 방법으로 체크하였다. 대략 10 시간의 가수분해 후에 대략 57%의 전환이 수득되었는지 기록하였다. 30 시간 후에 기록된 전환은 99% 이상이다.

실시예 II

DL-p-히드록시페닐글리신 히단토인의 가수분해는 575ml 물에 122g MgHPO₄·3H₂O와 상기 화합물 122g를 첨가하여 실행하였다. 상기 혼합물의 pH는 질소 가스를 1시간 동안 통과시킨 후에 5N NaOH로 pH=7.2로 적정하였다. 효소적 전환은 8㎖의Agrobacterium radiobacter세포 현탁액을 첨가하여 개시하였다. 반응 혼합물의 pH는 NaOH(25wt.%)를 첨가하여 pH=7.2로 일정하게 유지시켰다. 전체에서 19g의 NaOH 소비가 기록되었다. 95 시간의 가수분해 후에 99.3%의 전환이 측정되었다.

비교 실험 2

실시예 II에 기재된 동일한 조건하에서 p-히드록시페닐글리신 히단토인(122g)을 40℃에서 575ml의 물에 첨가하였다. pH를 5N NaOH로 7.2로 적정시킨 후에 질소 가스를 1 시간 동안 통과시켰다. 상기 반응을 30㎖의 동일한Agrobacterium radiobacter세포 현탁액을 첨가하여 개시하였다. pH는 33wt.%H₃PO₄용액으로 pH 7.2로 일정하게 유지시켰다. 가수분해 95 시간 후에 98.7%의 전환이 측정되었다. 97.5 시간의 가수분해 후에 측정된 전환은 99.3% 이다.

실시예 III

40℃에서 176g DL-p-히드록시페닐글리신 히단토인과 176g MgHPO₄·3H₂O를 510ml의 물에 첨가하였다. 상기 반응 혼합물에 질소를 첨가하여 1 시간 동안 화학작용이 일어나지 않도록 하였다. 효소적 전환은 15㎖의Agrobacterium radiobacter세포 현탁액을 첨가하여 개시하였다. 반응 혼합물의 pH는 5N NaOH로 자동 적정하는 방법으로 pH=7.2로 일정하게 유지시켰다. HPLC 분석 방법으로 120 시간 가수분해 후에 전환이 99.8%이 되도록 하였다.

비교 실험 3

40℃에서 176g DL-p-히드록시페닐글리신 히단토인을 557ml의 물에 첨가하였고 5N NaOH로 pH를 7.2로 적정하였다. 상기 반응 혼합물에 질소를 첨가하여 1 시간 동안 화학작용이 일어나지 않도록 하였다. 그 다음에 56㎖의 동일한Agrobacterium radiobacter세포 현탁액을 첨가하였다. 반응 혼합물의 pH는 33wt.% H₃PO₄로 자동 적정하는 방법으로 pH=7.2로 일정하게 유지시켰다. HPLC 분석 방법으로 146.5 시간 가수분해 후에 전환이 96.5%이고 180 시간 후에는 99.8%가 되도록 하였다.

실시예 IV

실시예 II에 기재된 것과 같이 수득된 반응 혼합물을 미세여과 방법으로 세포 잔류물을 제거한 후에 130g 정도의 H₂SO₄(98wt.%)로 pH=1로 산성화시켰다. 투석물(retentate)를 100g 물로 투석하였다. 수집된 수성층을 대략 600ml로 부분적으로 증발시켰다. 약 63g NaOH(50wt.%)를 pH가 3.5가 될때까지 생성 잔류물에 첨가하고 형성된 D-p-히드록시페닐글리신을 분리하고 몇 번 세척하였다. 상기 단계의 여과를 위해서 형성된 MgNH₄PO₄를 분리시킨 후에 대략 53g NaOH(50wt.%)를 pH가 8.5가 되도록 첨가하였다.

MgNH₄PO₄를 물에 현탁시킨 후에 50ml 물로 두번 세척하였다. 다음에, 물과 암모니아 혼합물을 낮은 압력하에서 증발시켰다.

결국, 101.7g D-p-히드록시페닐글리신과 118g MgHPO₄·3H₃O가 수득되었다.

실시예 V

실시예 II에 기재된 것과 같이 수득된 반응 혼합물의 pH는 대략 70g NaOH(50wt.%)로 pH=10으로 적정시켰다. 반응 혼합물을 잔류물을 100ml 물로 두번 세척한 후에 여과하였다. 상기 단계의 여과는 모든 세포 잔류물을 제거하기 위해 미세 여과 장치를 통해 실행하였다. 투석물을 몇 번 세척하였다. 그 다음에 투과물을 D-p-히드록시페닐글리신이 결정화 되도록 pH 3.5가 되도록 약 40g H₂SO₄로 산성화 시켰다. 분리, 세척 및 건조 후에 102g의 수율로 D-p-히드록시페닐글리신이 수득되었다.

실시예 VI

DL-p-히드록시페닐글리신 히단토인의 D-(-)-p-히드록시페닐글리신으로의 전환은 다양한 pH 값에서 실행시켰다. 세포 현탁액을 첨가하여 반응을 개시시킨 후에 5N NaOH를 첨가하여 목적하는 pH로 만들었다. 상기 반응은 40℃에서 질소 환경하에서 실행시켰다. 반응 혼합물의 pH는 5N NaOH로 자동 적정 방법으로 목적하는 pH로 유지시켰다. 상기 실험의 결과를 표 1에 나타내었다. 상기 표는 99% 이상의 전환이 수득된 반응 시간이 나타나 있다.

PH	99% 이상의 전환을 위한 반응시간(시간)
7.2	80
7.4	68
7.6	75
7.7	72
7.8	88

실시예 VII

40℃에서 30g DL-N-카르바모일-p-히드록시페닐글리신과 34g MgHPO₄·3H₂O를 200ml 물에 첨가하였다. 상기 반응 혼합물의 pH를 15g 42% KOH로 pH 8.0으로 적정하였다. 다음에, 질소 대기하에서 13㎖의Agrobacterium radiobacter세포 현탁액을 첨가하였다. 반응 혼합물의 pH를 pH 8.0으로 일정하게 유지하였다. 반응 혼합물의 조성물을 HPLC 분석으로 기록하였다. 반응 27 시간 후에 4.3wt.%의 D-p-히드록시페닐글리신 농도가 측정되었고 5.4wt.%의 L-N-카르바모일-p-히드록시페닐글리신 농도가 측정되었다. 상기 반응 혼합물의 조성물은 그 이후에 일정하게 남아있다.

실시예 VIII

15g DL-발린 히단토인과 20g MgHPO₄·3H₂O를 200ml 물에 첨가하였다. 5N NaOH를 첨가하여 pH를 8로 적정한 후에 15㎖의Agrobacterium radiobacter세포 현탁액을 첨가하여 반응을 개시하였다. 상기 반응은 질소 대기하에서 40℃에서 실행하였다. 상기 반응의 pH는 5N NaOH를 첨가하여 pH=8로 일정하게 유지시켰다. 16 시간의 가수분해 후에 DL-발린 히단토인을 기본으로 99% 이상 전환에 대응하는 농도인 52g/l의 D-발린 농도가 측정되었다.

Claims

D-거울상이성질체가 풍부한(enriched) 키랄 아미노산의 제조 방법에 있어서,

대응하는 N-카르바모일아미노산의 거울상이성질체의 혼합물은 인산 이온, 인산일수소 이온 또는 인산이수소 이온의 2가 금속 염을 첨가하여 제거되는 특성을 가진 유리 상태로 존재하는 암모니아와 D-카르바모일화효소를 접촉시켜 생성되는 것을 특징으로 하는, D-거울상이성질체가 풍부한 키랄 아미노산의 제조 방법.
제 1 항에 있어서,

효소적 탈카르바모일화(decarbamoylation)는 인산 이온, 인산일수소 이온 또는 인산이수소 이온의 2가 금속 염의 존재하에서 실행되는 것을 특징으로 하는, D-거울상이성질체가 풍부한 키랄 아미노산의 제조 방법.
제 1 항에 있어서,

상기 반응 혼합물은 존재하는 고체의 분리 후 외부 루프를 통해 인산 이온, 인산일수소 이온 또는 인산이수소 이온의 2가 금속 염과 접촉하는 것을 특징으로 하는, D-거울상이성질체가 풍부한 키랄 아미노산의 제조 방법.
D-거울상이성질체가 풍부한 키랄 아미노산의 제조 방법에 있어서,

대응하는 히단토인은 히단토인화효소를 첨가하면 대응하는 N-카르바모일아미노산으로 효소학적으로 전환되며, 그 다음에 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 의한 방법을 사용하여 D-거울상이성질체가 풍부한 아미노산으로 전환되는 것을 특징으로 하는, D-거울상이성질체가 풍부한 키랄 아미노산의 제조 방법.
제 4 항에 있어서,

상기 두 단계는 히단토인화효소와 D-카르바모일화효소 둘다가 존재하는 용기에서 실행되는 것을 특징으로 하는, D-거울상이성질체가 풍부한 키랄 아미노산의 제조 방법.
제 4 항 또는 제 5 항에 있이서,

상기 반응 혼합물의 pH는 7.0 내지 9.0인 것을 특징으로 하는, D-거울상이성질체가 풍부한 키랄 아미노산의 제조 방법.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,

인산일수소마그네슘은 인산 이온의 2가 금속 염으로서 사용되는 것을 특징으로 하는, D-거울상이성질체가 풍부한 키랄 아미노산의 제조 방법.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,

수득된 반응 혼합물은 그 다음에 pH 9.5 내지 10.5로의 pH 증가, 형성된 고체 인산암모늄 염의 분리, pH 3.5 내지 4.5로의 모액의 pH 감소 및 고체 D-아미노산의 분리가 일어나는 것을 특징으로 하는, D-거울상이성질체가 풍부한 키랄 아미노산의 제조 방법.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,

수득된 반응 혼합물은 그 다음에 pH 0.5 내지 1.5로의 pH 감소, 바이오매스(biomass)의 분리, pH 3.5 내지 4.5로의 추가의 pH 증가 및 고체 D-아미노산의 분리가 일어나는 것을 특징으로 하는, D-거울상이성질체가 풍부한 키랄 아미노산의 제조 방법.
제 9 항에 있어서,

수득된 모액은 그 다음에 7 내지 10의 값으로 pH 증가가 일어나고, 형성된 고체 인산암모늄 염은 분리되는 것을 특징으로 하는, D-거울상이성질체가 풍부한 키랄 아미노산의 제조 방법.
인산일수소 마그네슘의 회수 방법에 있어서,

인산 암모늄은 pH 4.5 내지 6.5에서 무기산(mineral acid)과 접촉하고, 인산일수소 마그네슘은 암모니아 염과 무기산으로부터 분리되는 것을 특징으로 하는, 인산일수소 마그네슘의 회수 방법.
제 11 항에 있어서,

상기 pH는 5.5 내지 6으로 유지되는 것을 특징으로 하는, 인산일수소 마스네슘의 회수 방법.
제 11 항 또는 제 12 항에 있어서,

상기 무기산은 황산인 것을 특징으로 하는 인산일수소 마그네슘의 회수 방법.