CN1520460A - 富含对映体的氨基酸的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及制备富含D－对映体的手性氨基酸的方法，在该方法中，使相应N－氨甲酰氨基酸的对映体混合物与D－氨甲酰酶接触，同时释放出氨，然后以磷酸根、磷酸氢根或磷酸二氢根离子的二价金属盐除去氨。在一个实施方案中，酶催脱氨甲酰化反应在磷酸根离子、磷酸氢根离子、磷酸二氢根离子的二价金属盐的存在下进行。在另一个实施方案中，在分离出存在的固体之后，使反应混合物经由外部回路与磷酸根离子、磷酸氢根离子、磷酸二氢根离子的二价金属盐实现接触。富含D－对映体的手性氨基酸的制备方法也可以是，利用乙内酰脲酶将相应的乙内酰脲酶催转化成相应的N－氨甲酰氨基酸，然后按照本发明方法将其转化成富含D－对映体的氨基酸。
Description
本发明涉及富含D-对映体的氨基酸的制备方法，在该方法中，使相应N-氨甲酰基氨基酸的对映体混合物与D-氨甲酰酶接触，同时释放出氨。
D-氨基酸是生物活性制剂例如β-内酰胺抗体、肽激素和农药的重要结构单元。这些“非天然”氨基酸的常用制备方法是，利用乙内酰脲酶使相应的DL-5-取代乙内酰脲发生对映选择性水解而形成相应的N-氨甲酰氨基酸。该N-氨甲酰氨基酸可以酶催转化成相应的D-氨基酸。
该已知方法的缺点是，为了获得某一反应时间，需要相当大量的生物催化剂，因为众所周知的是，使氨甲酰氨基酸发生水解的酶(氨甲酰酶，也称为N-氨甲酰基-D-氨基酸酰胺水解酶)能被反应产物氨所强烈抑制。据报道，产生抑制效果的氨浓度(Olivieria等人(1981)Biotechnology and Bioengineering，第23卷，2173-2183；Runser(1990)Applied Microbiology and Biotechnology，33，382-388；Louwrier(1996)Enzyme and Microbial Technology，19，562-571)非常低(～10mM)。就该已知的方法而言，这意味着当氨的浓度为10mM时，氨甲酰酶的活性为最高速率的一半。而当氨的浓度为20mM时，氨甲酰酶的速率仅为最高速率的1/3。很明显，由于在工业生产条件下需要高的产物浓度，例如＞500mM，因此氨甲酰酶的速率就会遭到非常强烈的抑制。当产物浓度较低(数量级10mM)时，虽然此时氨甲酰酶的活性近似达到最高，但这在经济上是不利的，因为这样会降低生产能力。
文献中公开了各种方法，旨在使氨的浓度在酶催转化反应过程中保持低的水平。原位除氨法的实例参见Kim & Kim的(1995)，Enzymeand Microbial Technology，17，63-67，该方法在经乙内酰脲酶和氨甲酰酶制备D-p-羟基苯基甘氨酸的反应过程中利用吸附剂(AD300NS，Tomita Pharmaceutical Co.(Japan)制造的硅酸盐配合物)来除去氨。该方法的缺点是，吸附剂很昂贵，因此必须加以循环利用。
根据J61.285.996-A(1986)所述的另一个方法，所生成的氨是通过蒸馏除去的。但是，该除氨方法仅在反应混合物pH值很高的情况下才有效。但是，氨甲酰酶在这么高的pH值下是没有活性的。如果通过蒸馏法在pH值为7-7.5的中性pH值下除氨，所形成的氨会有60～90％残留在反应混合物中，即使除去90％以上的反应混合物容量时也是如此。因此，在中性pH值下实现有效去除效果是不可能的。
本发明在此提供了简单而又经济的方法，该方法只需使用较少的生物催化剂或者花费较短的反应时间。
本发明是这样实现的，除氨时采用的是磷酸根离子、磷酸一氢根离子或磷酸二氢根离子的二价金属盐；在下文中统简称为磷酸盐。为此，例如酶催反应可以在磷酸盐存在下进行(举例而言)。令人惊奇的是，进一步发现即使浆液浓度很高，反应混合物也很容易搅拌。
另一个实施方案例如是这样形成的，在分离出未溶解的反应组分之后，将反应混合物经由例如回路引导通过例如存在有磷酸盐的第二反应器、塔或者滤器。反应混合物中所含的氨由此与磷酸盐结合，生成相应的磷酸铵盐，然后将仍含有例如酶的剩余液体输送回酶催脱氨甲酰化反应容器。
已发现未发生酶抑制现象或者抑制程度很低。这就更令人惊奇了，因为已知即使是低浓度(1-10μmol)的二价金属也会干扰氨甲酰酶催化反应。
适宜的二价金属离子的实例是镁、钴、钙、锰、锆或钌离子。从经济的角度而言，优选采用磷酸一氢镁(MgHPO4)，也称为磷酸氢镁。就最终的pH值而言，磷酸氢镁很适合优化的工艺条件，而且很容易从廉价原材料进行制备。磷酸盐也可以原位生成。
制备磷酸盐例如磷酸氢镁的简便方法是，将磷酸加入到相应的氧化物或氢氧化物中，例如氧化镁或氢氧化镁，由此生成磷酸盐。在此之后，即可添加所获得的磷酸盐(任选经过过滤和洗涤)了。
磷酸盐的用量优选0.5～3磷酸盐当量，特别是0.8～1.2当量，基于反应过程中生成的氨量。
合适的酶的实例是乙内酰脲酶-氨甲酰酶法中常用的那些酶，例如来自以下酶属的酶：假单胞菌属，特别是荧光假单胞菌、恶臭假单胞菌或解韧带假单胞菌，无色杆菌属，棒杆菌属，芽孢杆菌属，特别是短芽孢杆菌或嗜热脂肪芽孢杆菌，短杆菌属，微杆菌属，节杆菌属，土壤杆菌属，特别是根癌土壤杆菌或放射形土壤杆菌，Acrobacter，克雷伯氏菌属，叠球菌属，精朊杆菌属，链霉菌属，放线菌属，念珠菌属，红酵母属，毕赤酵母属或拟青霉菌属。
酶催反应可以在pH值5～9下进行，优选在pH值6-8下进行。酶催反应的温度优选0～50℃，特别是20～40℃。
酶催反应结束时，反应混合物可以经任何方式回收。
适宜的回收方法例如是，将反应混合物酸化至pH值0～3，优选0.5～1.5，然后除去生物量。将pH值提高到例如3～5，优选3.5～4.5后，通过例如过滤法或离心分离法分离出D-氨基酸。将pH值提高到5～11，优选7～10后，通过例如离心分离法或过滤法分离出由磷酸盐形成的相应的磷酸铵盐。
另一种适宜的回收方法例如是，将pH值提高到9～11，优选9.5～10.5，然后过滤出由磷酸盐形成的相应的固体磷酸铵盐。然后通过例如微过滤法或超滤法从所得到的母液中除去生物量。在将pH值酸化到例如3～6，优选4.5～5.5之后，通过例如过滤法分离出固体D-氨基酸。
所得到的磷酸铵盐随后可以简单地按照已知的方式转化成磷酸盐，方法是将磷酸铵盐干燥加热，同时释放出氨。另一种方法是加热pH值＞8.5的磷酸铵盐浆液，特别是9～11，同时释放出氨。还一种方法是以无机酸例如硫酸洗涤磷酸镁铵盐，使pH值维持4.5～6.5，优选5.5～6。由此获得氨与无机酸的盐，且回收磷酸氢镁。
在1984和1985年的US-A-4,460,555和US-A-4,650,857中，公开了特定的磷酸氢镁颗粒作为氨清除剂。这些专利文献主要关注的是这些颗粒在酶催渗析系统中的用途，以便在经由脲酶除脲的过程中清除由脲所释放的氨。但是，此处所释放的氨的总量是很低的。但是，自从那时起尚未有人提及这类颗粒在乙内酰脲酶/氨甲酰酶法中防止酶抑制作用的用途。
本发明特别适用于通过所谓的乙内酰脲途径来制备富含对映体的氨基酸，该途径涉及借助乙内酰脲酶由相应的乙内酰脲制备富含D-对映体的N-氨甲酰氨基酸，其中乙内酰脲酶任选与外消旋酶共用，然后利用D-氨甲酰酶进行脱氨甲酰化反应，其中脱氨甲酰化反应是总反应速率的决定步骤。已发现磷酸盐和/或磷酸铵盐的存在对乙内酰脲酶、氨甲酰酶和/或外消旋酶没有抑制或变性作用。在这些已知的方法中，进行转化反应时pH值大多数处于7～8，因为在更高的pH值下，由于NH3的存在，实际上会完全抑制酶的活性。在近似中性pH值条件下进行这些反应的缺点是，在制备几乎所有的氨基酸时，特别是在制备脂肪族氨基酸时，遗后的乙内酰脲对映体会发生缓慢的外消旋化反应。
目前已发现，这些反应可按照本发明方法在较高的pH值下进行时，例如pH值为7.0～9.0，优选7.5～8.5，而几乎不会产生任何酶抑制现象，但会发生所不希望的对映体外消旋化。其结果是，所获得的产率远远大于50％，这是在不发生外消旋化反应的情况下理论上最大可能的产率。
本发明方法也可用于许多拆分方法，在这些方法中，利用含有D-选择性乙内酰脲水解酶和N-氨甲酰氨基酸水解酶的微生物将DL-N-氨甲酰氨基酸转化成富含D-对映体的相应氨基酸和富含对映体的未转化L-N-氨甲酰氨基酸。由于该反应可以在高的pH值(例如7.5～9)下进行，所以L-N-氨甲酰氨基酸的损失很小，因为在高pH值的情况下是不会发生乙内酰脲酶反应的。
实施例
实施例I
向200ml水中添加34g DL-p-羟基苯基甘氨酸乙内酰脲和34gMgHPO4·3H2O。借助于5N NaOH将反应混合物的pH值调节到pH＝7.2，然后添加34ml放射形土壤杆菌细胞悬液开始反应。反应在氮气气氛下于40℃进行。添加5N NaOH，使反应混合物的pH值保持恒定为pH值7.2。HPLC分析证实，经过10h水解反应之后，转化率已达到99％以上。
对比实验1
在与实施例I所述相当的反应条件下，使34g DL-p-羟基苯基甘氨酸乙内酰脲进行水解，但不加磷酸盐。添加34ml相同的放射形土壤杆菌细胞悬液开始反应。反应在氮气气氛下于40℃进行。利用1.3MH3PO4进行自动滴定，使反应混合物的pH值保持恒定pH＝7.2。通过HPLC分析定时监控反应进程。记录表明，水解约10h之后，转化率达到约57％。30h之后测得的转化率累计＞99％。
实施例II
向575ml水中添加122g DL-p-羟基苯基甘氨酸乙内酰脲和122gMgHPO4·3H2O，使该化合物发生水解。以5N NaOH将混合物的pH值调节到pH＝7.2，然后通氮气1h。添加8ml放射形土壤杆菌细胞悬液开始酶催转化反应。添加NaOH(25重量％)，将反应混合物的pH值保持恒定pH＝7.2。记录NaOH的总消耗量为19g。经过95h水解之后，测得其转化率为99.3％。
对比实验2
在与实施例II所述相当的反应条件下，在40℃下向575ml水中添加p-羟基苯基甘氨酸乙内酰脲(122g)。以5N NaOH将pH值调节至7.2，然后通氮气1h。添加30ml相同的放射形土壤杆菌细胞悬液开始反应。利用33重量％H3PO4溶液使pH值保持恒定pH＝7.2。经过95h水解之后，测得其转化率为98.7％。水解97.5h之后，测得的转化率累计＞99.3％。
实施例III
在40℃下向510ml水中添加176g DL-p-羟基苯基甘氨酸乙内酰脲和176g MgHPO4·3H2O。向反应混合物中充氮1h惰化。添加15ml放射形土壤杆菌细胞悬液开始酶催转化反应。利用5N NaOH进行自动滴定，使反应混合物的pH值保持恒定pH＝7.2。HPLC分析证实，水解120h之后，其转化率累计为99.8％。
对比实验3
在40℃下向557ml水中添加176g DL-p-羟基苯基甘氨酸乙内酰脲，然后以5N NaOH将pH值调节到7.2。向反应混合物中充氮1h惰化。然后添加56ml相同的放射形土壤杆菌细胞悬液。通过自动滴定33重量％磷酸使反应混合物的pH值保持恒定pH＝7.2。HPLC分析证实，水解146.5h之后的转化率为96.5％，而180h之后的转化率为99.8％。
实施例IV
将按实施例II所述获得的反应混合物以约130g硫酸(98重量％)酸化至pH＝1，然后通过微过滤法除去细胞残留物。以100g水渗滤(diafitered)余留物。将所收集的水相部分蒸发至体积约为600ml。向所得到的残留物中添加约63g NaOH(50重量％)直至pH值为3.5，然后分离出形成的D-p-羟基苯基甘氨酸，并且洗涤数次。向该步骤所得到的滤液中添加约53g NaOH(50重量％)，使pH值达到8.5，然后分离出生成的MgNH4PO4。
以50ml水洗涤MgNH4PO4两次，然后将其悬浮在水中。随后在减压下蒸发水和氨的混合物。
最后获得101.7g D-p-羟基苯基甘氨酸和118g MgHPO4·3H2O。
实施例V
将按实施例II所述获得的反应混合物以约70g NaOH(50重量％)调节至pH＝10。过滤反应混合物，然后以100ml水洗涤残留物两次。将该步骤所得到的滤液输送通过微过滤装置以除去任何细胞残留物。将余留物洗涤几分钟。然后以约40g硫酸将渗液酸化至pH为3.5，D-p-羟基苯基甘氨酸在此过程中发生结晶。分离之后，经洗涤并干燥得到产率为102g的D-p-羟基苯基甘氨酸。
实施例VI
在各种pH值下进行DL-p-羟基苯基甘氨酸乙内酰脲向D-(-)-p-羟基苯基甘氨酸的转化反应。
向200ml水中添加34g(177mmol)DL-p-羟基苯基甘氨酸乙内酰脲和34g MgHPO4·3H2O。以5N NaOH将反应混合物的pH值调节到所需水平，然后添加3.0ml放射形土壤杆菌细胞悬液开始反应。该反应在氮气气氛中于40℃进行。以5N NaOH进行自动滴定，使反应混合物的pH值保持所需的pH值水平。这些实验结果示于表1。该表给出了转化率达到99％以上时所需的反应时间。
表1
| pH | 转化率超过99％所需的反应时间(h) |
| 7.2 | 80 |
| 7.4 | 68 |
| 7.6 | 75 |
| 7.7 | 72 |
| 7.8 | 88 |
实施例VII
在40℃下向200ml水中添加30g DL-N-氨甲酰-p-羟基苯基甘氨酸和34g MgHPO4·3H2O。以约15g的42％ KOH将反应混合物的pH值调节到pH为8.0。然后在氮气气氛下添加13ml放射形土壤杆菌细胞悬液。使反应混合物的pH值保持恒定在pH＝8.0。通过HPLC分析监控反应混合物的组成。反应27h之后，测得D-p-羟基苯基甘氨酸的浓度为4.3重量％，而L-N-氨甲酰-p-羟基苯基甘氨酸的浓度为5.4重量％。反应混合物的组成此后就保持不变了。
实施例VIII
向200ml水中添加15g DL-缬氨酸乙内酰脲和20g MgHPO4·3H2O。添加5N NaOH，将混合物的pH值调节到8，然后添加15ml放射形土壤杆菌细胞悬液开始反应。该反应在氮气气氛下于40℃进行。添加5NNaOH，使反应混合物的pH值保持恒定在pH＝8。水解16h之后，测得D-缬氨酸的浓度为52g/l，如果以DL-缬氨酸乙内酰脲为计的话，这相当于转化率＞99％。
Claims (13)
1.富含D-对映体的手性氨基酸的制备方法，其中，使相应N-氨甲酰氨基酸的对映体混合物与D-氨甲酰酶接触，同时释放出氨，其特征在于氨是经由磷酸根离子、磷酸一氢根离子或磷酸二氢根离子的二价金属盐除去的。
2.权利要求1的方法，其中酶催脱氨甲酰化反应是在磷酸根离子、磷酸一氢根离子或磷酸二氢根离子的二价金属盐的存在下进行的。
3.权利要求1的方法，其中在分离出存在的固体之后，使反应混合物与磷酸根离子、磷酸一氢根离子或磷酸二氢根离子的二价金属盐经由外部回路进行接触。
4.富含D-对映体的手性氨基酸的制备方法，其中，利用乙内酰脲酶将相应的乙内酰脲经酶催转化成相应的N-氨甲酰氨基酸，然后利用权利要求1-3任意一项的方法将后者转化成富含D-对映体的氨基酸。
5.权利要求4的方法，其中两个步骤都是在容器中在乙内酰脲酶和D-氨甲酰酶的存在下进行的。
6.权利要求4或5的方法，其中反应混合物的pH值为7.0～9.0。
7.权利要求1-6任意一项的方法，其中以磷酸一氢镁作为磷酸根离子二价金属盐。
8.权利要求1-7任意一项的方法，其中随后将所获得的反应混合物的pH值提高至9.5～10.5，分离出所形成的固体磷酸铵盐，将母液的pH值降低到3.5～4.5，然后分离出固体D-氨基酸。
9.权利要求1-7任意一项的方法，其中随后将所获得的反应混合物的pH值降低至0.5～1.5，分离出生物量，然后将pH值提高到3.5～4.5，分离出固体D-氨基酸。
10.权利要求9的方法，其中随后将所获得的母液的pH值提高到7～10，然后分离出所形成的固体磷酸铵盐。
11.回收磷酸一氢镁的方法，其中使磷酸铵与pH值为4.5～6.5的无机酸接触，然后使磷酸一氢镁与氨和无机酸的盐实现分离。
12.权利要求11的方法，其中pH值保持在5.5～6。
13.权利要求11或12的方法，其中无机酸是硫酸。
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