NL1017250C1

NL1017250C1 - Werkwijze voor de bereiding van enantiomeer verrijkte aminozuren.

Info

Publication number: NL1017250C1
Application number: NL1017250A
Authority: NL
Inventors: Joannes Gerardus Theo Kierkels; Wilhelmus Hubertus Jos Boesten
Original assignee: Dsm Nv
Priority date: 2001-01-31
Filing date: 2001-01-31
Publication date: 2002-08-01
Also published as: HUP0302864A2; EP1404854A2; WO2002061107A2; CZ20032077A3; CN1520460A; JP2004521623A; WO2002061107A3; AU2002230274A1; KR20030071868A

Description

-1 -

WERKWIJZE VOOR DE BEREIDING VAN ENANTIOMEER VERRIJKTE 5 AMINOZUREN

De uitvinding betreft een werkwijze voor de bereiding van een in het D-enantiomeer verrijkt aminozuur, waarin een mengsel van de enantiomeren 10 van het overeenkomstige N-carbamoylaminozuur in contact wordt gebracht met een D-carbamoylase waarbij ammoniak vrijkomt.

D-aminozuren zijn belangrijke bouwstenen voor biologisch actieve preparaten zoals li-lactamantibiotica, peptide-hormonen en pesticiden. Een veel gebruikte bereidingswijze voor deze “onnatuurlijke” aminozuren is een 15 methode waarbij het overeenkomstige DL-5-gesubstitueerde hydantoine enantioseiectief wordt gehydrolyseerd door een hydantoinase tot het overeenkomstige N-carbamoylaminozuur. Dit N-carbamoylaminozuur kan enzymatisch worden omgezet naar het overeenkomstige D-aminozuur.

Een nadeel van de bekende werkwijze is dat er, voor het 20 realiseren van een bepaalde reactietijd, relatief grote hoeveelheden biokatalysator nodig zijn omdat algemeen bekend is dat het enzym dat verantwoordelijk is voor de hydrolyse van carbamoylaminozuren (het carbamoylase ook wel N-carbamoyl-D-aminozuuramidohydrolase genoemd) sterk wordt geremd door het reactieproduct ammoniak. Beschreven is (Olivieri et. al.(1981) Biotechnology and 25 Bioengineering, vol. 23, 2173-2183; Runser (1990) Applied Microbiology and Biotechnology, 33, 382-388; 1 Π ) i \ - 2 -

Louwrier (1996) Enzyme and Microbial Technology, 19, 562-571) dat de concentratie waarbij inhibitie, door ammoniak, optreedt zeer laag is (~ 10 mM). Voor de bekende processen betekent dit dat bij een concentratie van 10 mM ammoniak het carbamoylase werkzaam is met de helft van de maximale snelheid.

5 Bij een concentratie van 20 mM ammoniak is snelheid van het carbamoylase nog maar 1/3 van de maximale snelheid. Het zal duidelijk zijn dat onder industrieel relevante condities waarbij hoge productconcentraties, bijvoorbeeld > 500 mM, wenselijk zijn de snelheid van het carbamoylase zeer sterk geremd zal zijn.

Lagere productconcentraties waarbij de activiteit van het carbamoylase nagenoeg 10 maximaal is, zijn vanwege de lage productiecapaciteit economisch onaantrekkelijk.

In de literatuur zijn diverse methoden beschreven om de ammoniakconcentratie tijdens de enzymatische conversie laag te houden. Een voorbeeld van in-situ verwijdering van ammoniak is beschreven door Kim & Kim, 15 (1995) Enzyme and Microbial Technology, 17, 63-67 waarbij tijdens de bereiding van D-p-hydroxyfenylglycine met behulp van hydantoïnase en carbamoylase gebruik wordt gemaakt van een adsorbent (AD300NS, een silicaatcomplex van Tomita Pharmaceutical Co. (Japan)) voor de verwijdering van ammoniak. Een nadeel van deze methode is dat het adsorbent duur is en dus gerecycled moet 20 worden.

Volgens een andere methode, beschreven in J6 1285-996-A (1986) wordt de ontstane ammoniak destillatief verwijderd. Deze methode voor de verwijdering van ammoniak is echter alleen effectief bij hoge pH van het reactiemengsel. Bij een dergelijke hoge pH is het enzym echter niet actief.

25 Wanneer ammoniak destillatief wordt verwijderd bij neutrale pH, tussen pH 7 -7,5, blijft zelfs wanneer meer dan 90% van het reactievolume verwijderd wordt, nog 60 tot 90% van de gevormde ammoniak in het reactiemengsel. Een efficiënte verwijdering bij neutrale pH is dus niet mogelijk.

De uitvinding vóórziet nu in een eenvoudige en economisch 3 0 aantrekkelijke werkwijze waarin minder biokatalysator hoeft te worden toegepast danwel een kortere reactietijd wordt gerealiseerd.

Dit wordt volgens de uitvinding bereikt door de ammoniak te verwijderen met behulp van een tweewaardig metaalzout van een fosfaat-, een monowaterstoffostaat- of een diwaterstoffosfaation; in de verdere beschrijving 35 kortweg aangeduid als fosfaatzout. Daartoe kan bijvoorbeeld de enzymatische - 3 - reactie worden uitgevoerd in aanwezigheid van een fosfaatzout. Verrassenderwijze is bovendien gebleken dat het reactiemengsel ook bij hoge slurryconcentraties goed roerbaar bleef.

Een andere uitvoeringsvorm wordt bijvoorbeeld gevormd door 5 het reactiemengsel via bijvoorbeeld een loop na afscheiding van de onopgeloste reactiecomponenten, door bijvoorbeeld een tweede reactor, of een kolom of een filter te leiden waarin zich het fosfaatzout bevindt. De in het reactiemengsel aanwezige ammoniak wordt dan gebonden aan het fosfaatzout waarbij het overeenkomstige ammoniumfosfaatzout wordt gevormd, waarna de resterende 10 vloeistof, die bijvoorbeeld nog enzym bevat, teruggevoerd wordt naar de enzymatische decarbamoyleringsreactie.

Gebleken is namelijk dat er geen of veel minder enzym inhibitie optreedt. Dit is des te verrassender omdat bekend is dat divalente metalen al bij geringe concentraties (1 a 10 μ molair) carbamoylase gekatalyseerde reacties 15 kunnen verstoren.

Geschikte tweewaardige metaalionen zijn bijvoorbeeld magnesium-, cobalt-, calcium-, mangaan-, zirconium- of rutheniumionen. Om economische redenen wordt bij voorkeur magnesiummonowaterstoffosfaat (MgHP04.), ook wel magnesiumhydrofosfaat genoemd, toegepast. MgHP04 past 2 0 wat pH betreft bij de optimale procescondities en is eenvoudig te bereiden uit goedkope grondstoffen. Het fosfaatzout kan ook in situ worden gevormd.

Het fosfaatzout, bijvoorbeeld MgHP04, kan op eenvoudige wijze bereid worden door toevoeging van fosforzuur aan het overeenkomstige oxide of hydroxide, bijvoorbeeld magnesiumoxide of -hydroxide, waarbij fosfaatzout wordt 2 5 gevormd. Het verkregen fosfaatzout kan vervolgens worden toegevoegd (eventueel na filtreren en wassen).

De hoeveelheid toe te passen fosfaatzout ligt bij voorkeur tussen 0,5 en 3 equivalenten fosfaatzout, in het bijzonder tussen 0,8 en 1,2 equivalenten, gerelateerd aan de hoeveelheid ammoniak die tijdens de reactie 3 0 wordt gevormd.

Geschikte enzymen die kunnen worden toegepast zijn bijvoorbeeld de enzymen die gewoonlijk in hydantoïnase-carbamoylase processen worden toegepast, bijvoorbeeld enzymen afkomstig van het genus Pseudomonas, in het bijzonder Pseudomonas fluorescens, putida of desmolytica, 35 Achromobacter, Corynebacterium, Bacillus, in het bijzonder Bacillus brevis of - 4 -

Bacillus stearothermophilus, Brevibacterium, Microbacterium, Artrobacter, Agrobacterium, in het bijzonder Agrobacterium tumefaciens of radiobacter, Acrobacter, Klebsiella, Sarcina, Protaminobacter, Streptomyces, Actinomyces, Candida, Rhodotorula, Pichia of Paecilomyces.

5 De enzymatisch reactie kan worden uitgevoerd bij een pH die ligt tussen pH 5 en pH 9 en wordt bij.voorkeur uitgevoerd bij een pH die ligt tussen pH 6 en 8. De temperatuur waarbij de enzymatische reactie wordt uitgevoerd ligt bij voorkeur tussen 0 en 50°C, in het bijzonder tussen 20 en 40°C.

Na afloop van de enzymatische reactie kan het reactiemengsel 10 op diverse wijzen worden opgewerkt.

Een geschikte opwerking is bijvoorbeeld via aanzuren van het reactiemengsel tot een pH tussen 0 en 3, bij voorkeur tussen 0,5 en 1,5, gevolgd door verwijdering van de biomassa. Na pH verhogen tot bijvoorbeeld een waarde tussen 3 en 5, bij voorkeur tussen 3,5 en 4,5, kan het D-aminozuur worden 15 afgescheiden, bijvoorbeeld door filtratie of centrifugatie. Na verhogen van de pH tot een waarde tussen 5 en 11, bij voorkeur tussen 7 en 10, kan bijvoorbeeld via centrifugatie of filtratie het uit het fosfaatzout gevormde overeenkomstige ammoniumfosfaatzout worden afgescheiden.

Een andere geschikte opwerking verloopt bijvoorbeeld via pH 20 verhoging tot een waarde tussen 9 en 11, bij voorkeur tussen 9,5 en 10,5, waarna het uit fosfaatzout gevormde overeenkomstige vaste ammoniumfosfaatzout kan worden afgefiltreerd. Uit de verkregen moederloog wordt vervolgens de biomassa verwijderd, bijvoorbeeld met behulp van micro- of ultrafiltratie. Na aanzuren tot een pH bijvoorbeeld tussen 3 en 6, bij voorkeur tussen 4,5 en 5,5 kan vervolgen 2 5 vast D-aminozuur worden geïsoleerd, bijvoorbeeld met behulp van filtratie.

Het verkregen ammoniumfosfaatzout kan vervolgens op bekende wijze eenvoudig worden omgezet in het fosfaatzout door droge verhitting van het ammoniumfosfaatzout waarbij ammoniak ontwijkt. Een andere methode is om een slurry van het ammoniumfosfaatzout bij een pH > 8,5, in het bijzonder 3 0 tussen 9 en 11, te verhitten waarbij ammoniak ontwijkt.

In US-A-4460555 en US-A-4650857 uit 1984 en 1985 zijn specifieke magnesiumhydrofosfaatdeeltjes beschreven als ammoniakvangers. Deze octrooipublicaties zijn met name gericht op dergelijke deeltjes voor toepassing in enzymatische dialyse systemen voor de verwijdering van ureum met 3 5 behulp van urease door middel van het wegvangen van ammoniak dat uit het - 5 - ureum vrijkomt. De totale hoeveelheid ammoniak die hier vrijkomt is echter relatief laag. De toepassing van dergelijke deeltjes in hydantoïnase/carbamoylase processen ter voorkoming van enzyminhibitie is in de sindsdien verstreken tijd echter nooit gesuggereerd.

5 De uitvinding kan bijzonder goed worden toegepast in de bereiding van enantiomeer verrijkte aminozuren via de zogenaamde hydantoïne route waarbij uit het overeenkomstige hydantoine in het D-enantiomeer verrijkt N-carbamoyl-aminozuur wordt bereid met behulp van een hydantoïnase, eventueel in combinatie met een racemase, gevolgd door de decarbamoylering met behulp 10 van D-carbamoylase. Gebleken is dat de aanwezigheid van fosfaatzouten en/of ammoniumfosfaatzouten geen remmende of denaturerende werking hebben op hydantoïnase, carbamoylase en/of racemase. De pH waarbij deze omzettingen plaatsvinden ligt in de bekende processen veelal tussen 7 en 8, aangezien bij hogere pH's enzyminhibitie optreedt door de aanwezigheid van NH3. Een nadeel 15 van het uitvoeren van de reacties bij ongeveer neutrale pH is dat er in de bereiding van vrijwel alle aminozuren, in het bijzonder van alifatische aminozuren, geen of onvoldoende racemisatie van het achterblijvende hydantoïne enantiomeer plaatsvindt.

Gebleken is nu dat wanneer de reacties volgens.de uitvinding 2 O worden uitgevoerd bij hogere pH, bijvoorbeeld bij een pH tussen 7,0 en 9,0 bij voorkeur tussen 7,5 en 8,5 er nagenoeg geen enzyminhibitie optreedt terwijl er wel racemisatie van het ongewenste enantiomeer optreedt. Bijgevolg kan een opbrengst worden gerealiseerd die veel hoger is dan de 50% die zonder racemisatie theoretisch maximaal mogelijk is.

25 De werkwijze volgens de uitvinding kan eveneens worden toegepast in resolutieprocessen waarbij een DL-N-carbamoylaminozuur met behulp van een microorganisme dat een D-selectief hydantoinehydrolyserend en N-carbamoylaminozuur hydrolyserend enzym bevat, wordt omgezet tot het overeenkomstige in het D-enantiomeer verrijkte aminozuur en de niet omgezette 30 in het enantiomeer verrijkte L-N-carbamoylaminozuur. Doordat de reactie bij verhoogde pH (bijvoorbeeld tussen 7,5 en 9) kan worden uitgevoerd, treedt er minder verlies aan L-N-carbamoyl aminozuur op, aangezien bij hogere pH de hydantoïnase reactie niet verloopt.

35 'I ύΊ ?.

. ... % - 6 -

Voorbeelden Voorbeeld I

5 Aan 200 ml water werd 34 g DL-p-hydroxyfenylglycine hydantoine en 34 g MgHP04-3H20 toegevoegd. Nadat de pH van het reactiemengsel op pH = 7,2 werd gebracht met behulp van 5N NaOH werd de reactie gestart door toevoeging van 34 ml Agrobacterium radiobacter celsuspensie. De reactie werd onder een stikstof atmosfeer uitgevoerd bij 40°C.

10 De pH van het reactiemengsel werd constant gehouden op pH 7,2 door toevoeging van 5 N NaOH. Door middel van HPLC analyse werd vastgesteld dat reeds na 10 uur hydrolyse een conversie van >99% werd bereikt.

Vergelijkend experiment 1 15 Onder vergelijkbare condities zoals beschreven in Voorbeeld 1 werd 34 g DL-p-hydroxyfenylglycine hydantoine gehydrolyseerd, echter, in afwezigheid van het fosfaatzout. De reactie werd gestart door toevoeging van 34 ml van dezelfde Agrobacterium radiobacter celsuspensie. De reactie werd onder een stikstof atmosfeer uitgevoerd bij 40°C. De pH van het reactiemengsel werd 20 door middel van een automatische titratie met 1,3 M H3P04 constant gehouden op pH = 7,2. Op regelmatige tijdstippen werd de voortgang van de reactie gecontroleerd door middel van een HPLC-analyse. Geconstateerd werd dat na ca. 10 uur hydrolyse een conversie van ca. 57% werd verkregen. De conversie gemeten na 30 uur bedroeg >99%.

25

Voorbeeld II

Een hydrolyse van DL-p-hydroxyfenylglycine hydantoine werd uitgevoerd door 122 g van deze verbinding met 122 g MgHP04-3H20 toe te voegen aan 575 ml water. De pH van dit mengsel werd met 5N NaOH op pH = 7,2 30 gebracht waarna gedurende 1 uur stikstof gas werd doorgeleid. De enzymatische conversie werd gestart door toevoeging van 8 ml Agrobacterium radiobacter celsuspensie. De pH van het reactiemengsel werd constant gehouden op pH = 7,2 door toevoeging van NaOH (25 gew. %). In totaal werd een NaOH-verbruik van 19 g geregistreerd. Na 95 uur hydrolyse werd een conversie gemeten van 35 99,3%.

- 7 -

Vergelijkend experiment 2

Onder vergelijkbare condities zoals beschreven in voorbeeld II werd aan 575 ml water bij 40°C p-hydroxyfenylglycine hydantoine (122 g) 5 toegevoegd. Nadat de pH op 7,2 werd gebracht met 5N NaOH werd gedurende 1 uur stikstof gas doorgeleid. De reactie werd gestart door toevoeging van 30 ml van eenzelfde Agrobacterium radiobacter celsuspensie. De pH werd constant gehouden op pH 7,2 met een 33 gew. % H3P04 oplossing. Na 95 uur hydrolyse werd een conversie van 98,7% gemeten. De conversie, gemeten na 97,5 uur 10 hydrolyse bedroeg 99,3%.

Voorbeeld III

Aan 510 ml water werd bij 40°C 176 gram DL-p-hydroxyfenylglycine hydantoine en 176 g MgHP04-3H20 toegevoegd. Dit 15 reactiemengesel werd geduurende 1 uur geïnertiseerd met behulp van stikstof. De enzymatisch conversie werd gestart door toevoeging van 15 ml van een Agrobacterium radiobacter celsuspensie. De pH van het reactiemengsel werd door middel van een automatische titratie met 5N NaOH constant op pH = 7,2 gehouden. Door middel van HPLC-analyse kon worden vastgesteld dat de 20 conversie na 120 uur hydrolyse 99,8% bedroeg.

Vergelijkend experiment 3

Aan 557 mL water werd bij 40°C 176 gram DL-p-hydroxyfenylglycine hydantoine toegevoegd en op pH = 7,2 werd gebracht met 5 25 N NaOH. Dit reactiemengesel werd geduurende 1 uur geïnertiseerd met behulp van stikstof. Hierna werd 56 ml van eenzelfde Agrobacterium radiobacter celsuspensie toegevoegd. De pH van het reactiemengsel werd door middel van een automatische titratie met 33 gew. % H3P04 constant op pH = 7,2 gehouden. Door middel van HPLC-analyse kon worden vastgesteld dat de conversie na 30 146,5 uur 96,5% en na 180 uur hydrolyse 99,8% bedroeg.

Voorbeeld IV

Een reactiemengsel verkregen zoals beschreven in Voorbeeld II 3 5 werd aangezuurd met circa 130 g H2S04 (98 gew. %) tot pH = 1 waarna de celresten werden verwijderd door middel van een microfiltratie. Het retentaat werd • · - 8 - gediafiltreerd met 100 g water. De verzamelde waterfasen werden gedeeltelijk ingedampt tot een volume van ongeveer 600 ml. Aan het verkregen residue werd circa 63 g NaOH (50 gew. %) toegevoegd tot een pH van 3,5 en werd het gevormde D-p-hydroxyfenylglycine afgescheiden en enkele malen gewassen. Aan 5 het filtraat van deze stap werd circa 53 g NaOH (50 gew. %) toegevoegd tot een pH van 8,5 waarna het gevormde MgNH4P04 kon worden afgescheiden.

Het MgNH4P04 werd twee maal gewassen met 50 ml water waarna het werd gesuspendeerd in water. Vervolgens werd onder verlaagde druk een mengsel van water en ammoniak afgedampt.

1 o Uiteindelijk werd 101,7 g D-p-hydroxyfenylglycine verkregen en 118 gram MgHP04-3H30.

Voorbeeld V

Een reactiemengsel verkregen zoals beschreven in Voorbeeld II 15 werd met circa 70 g NaOH (50 gew.%) op pH = 10 gebracht. Het reactiemengsel werd gefiltreerd waarna het residue twee maal werd gewassen met 100 ml water. Het filtraat van deze stap werd door een microfiltratie opstelling geleid om eventueel aanwezige celresten te verwijderen. Het retentaat werd enige malen gewassen. Het permeaat werd vervolgens met circa 40 g H2S04 aangezuurd tot 20 een pH van 3,5 waarbij D-p-hydroxyfenylglycine kristalliseert. Na afscheiden, wassen een drogen werd een opbrengst van 102 g D-p-hydroxyfenylglycine verkregen.

25 Voorbeeld VI

De conversie van DL-p-hydroxyfenylglycine hydantoïne naar D-(-)-p-hydroxyfenylglycine werd uitgevoerd bij diverse pH-waarden.

Aan 200 ml water werd 34 g (177 mmol) DL-p-hydroxyfenylglycine hydantoïne en 34 g MgHP04-3H20 toegevoegd. Het 30 reactiemengsel werd op de gewenste pH gebracht met behulp van 5N NaOH waarna de reactie werd gestart door toevoeging van 3,0 ml van een Agrobacterium radiobacter celsuspensie. De reactie werd onder een stikstof atmosfeer uitgevoerd bij 40°C. De pH van het reactiemengsel werd door middel van een automatische titratie met 5N NaOH op de gewenste pH gehouden. De 3 5 resultaten van deze experimenten zijn weergegeven in tabel 1. In deze tabel is de - 9 - reactietijd weergegeven waarbij een conversie van > 99% werd bereikt.

Tabel 1 pH reactietijd (uur) voor > 99% conversie __ _ __ _ __ _ 7/7 — 7β 88 5

Voorbeeld VII

30 g DL-N-carbamoyl-p-hydroxyfenylglycine en 34 g MgHP04-3H20 werd bij 40 °C toegevoegd aan 200 ml water. De pH van het reactiemengsel werd met circa 15 g 42% KOH op pH 8,0 gebracht. Vervolgens 10 werd, onder een stikstof atmosfeer, 13 ml van een Agrobacterium radiobacter celsuspensie toegevoegd. De pH van het reactiemengsel werd constant gehouden op pH 8,0. De samenstelling van het reactiemengsel werd gevolgd door middel van HPLC-analyse. Na een reactietijd van 27 uur werd een D-p-hydroxyfenylglycine concentratie gemeten van 4,3 gew. % en een L-N-carbamoyl-15 p-hydroxyfenylglycine concentratie van 5,4 gew. %. De samenstelling van het reactiemengsel bleef vervolgens constant.

Voorbeeld VIII

15 g DL-valine hydantoïne en 20 g MgHP04-3H20 werd 2 0 toegevoegd aan 200 ml water. Nadat de pH op 8 werd gebracht door toevoeging van 5 N NaOH werd de reactie gestart door toevoeging van 15 ml Agrobacterium radiobacter celsuspensie. De reactie werd uitgevoerd bij 40 °C onder een stikstof atmosfeer. De pH van de reactie werd constant gehouden op pH = 8 door toevoeging van 5 N NaOH.

25 Na 16 uur hydrolyse werd een D-valine concentratie gemeten van 52 g/l wat overeenkomt met een conversie van > 99% op basis van het DL-valine hydantoïne.

Claims

1. Werkwijze voor de bereiding van een in het D-enantiomeer verrijkt, 5 chiraal aminozuur, waarin een mengsel van de enantiomeren van het overeenkomstige N-carbamoylaminozuur in contact wordt gebracht met een D-carbamoylase waarbij ammoniak vrijkomt, met het kenmerk, dat de ammoniak wordt verwijderd met behulp van een tweewaardig metaalzout van een fosfaat-, een monowaterstoffosfaat- of een 10 diwaterstoffosfaation.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, waarbij de enzymatische decarbamoylering wordt uitgevoerd in aanwezigheid van een tweewaardig metaalzout van een fosfaat-, een monowaterstoffosfaat- of een diwaterstoffosfaation.

3. Werkwijze volgens conclusie 1, waarbij het reactiemengsel via een externe loop, na afscheiding van de aanwezige vaste stof, in contact wordt gebracht met het tweewaardige metaalzout van een fosfaat-, monowaterstoffosfaat- of diwaterstoffosfaation.

4. Werkwijze voor de bereiding van een in het D-enantiomeer verrijkt, 2. chiraal aminozuur waarbij het overeenkomstige hydantoïne met behulp van een hydantoïnase enzymatisch wordt omgezet in het overeenkomstige N-carbamoyl-aminozuur dat vervolgens met de werkwijze volgens een der conclusies 1-3 wordt omgezet in het in het D-enantiomeer verrijkte aminozuur. 2 5

5. Werkwijze volgens conclusie 4 waarbij beide stappen in een pot worden uitgevoerd in aanwezigheid van zowel een hydantoïnase als een D-carbamoylase.

6. Werkwijze volgens conclusie 4 of 5 waarbij de pH van het reactiemengsel ligt tussen 7,Oen 9,0.

7. Werkwijze volgens een der conclusies 1-6, waarbij als tweewaardig metaalzout van een fosfaation magnesiummonowaterstoffosfaat wordt toegepast.

8. Werkwijze volgens een der conclusies 1-7, waarbij het verkregen reactiemengsel vervolgens wordt onderworpen aan een pH-verhoging tot 35 een pH tussen 9,5 en 10,5, afscheiden van gevormde vaste i f) i "v' ' ·· W * Ï ' ..V . è - 11 - ammoniumfosfaatzout, pH-verlaging van de moederloog tot een pH tussen 3,5 en 4,5 en afscheiden van het vaste D-aminozuur.

9. Werkwijze volgens een der conclusies 1-7, waarbij het verkregen reactiemengsel vervolgens wordt onderworpen aan een pH-verlaging tot 5 een pH tussen 0,5 en 1,5, afscheiden van de biomassa, verdere pH- verhoging tot een pH tussen 3,5 en 4,5 en afscheiden van het vaste D-aminozuur.

10. Werkwijze volgens conclusie 9 waarbij vervolgens de verkregen moederloog wordt onderworpen aan een pH-verhoging tot een waarde 10 tussen 7 en 10 en het gevormde vaste ammoniumfosfaatzout wordt afgescheiden.