상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 천연 백자인 생약에 유기용매를 혼합하여 가열추출한 후 감압농축함으로써, 특히 5알파-환원효소를 저해하는 효과가 있는 백자인 추출물을 획득하고, 이러한 백자인 추출물을 유효성분으로 함유함으로써 탈모예방 및 발모촉진효과가 있는 발모촉진용 화장료 조성물을 제조함에 그 특징이 있다.
본 발명 백자인 추출물 함유 발모촉진용 화장료 조성물은 탈모를 유도하는 디하이드로테스토스테론의 생성 및 활성을 촉진하는 5알파-환원효소의 작용을 억제하는 뛰어난 효과가 있다.
즉, 본 발명의 백자인 추출물은 5알파-환원효소에 특이적인 효과를 나타냄으로써 치료상 또는 미용상 목적을 위한 선택적 처방에 유리하다. 따라서, 본 발명은 5알파-환원효소 저해효과가 있는 백자인 추출물을 제조하고 이를 함유한 발모촉진용 화장료 조성물을 제조하여 탈모예방 및 발모촉진용으로 사용하는 것이 목적이나, 과다한 피지의 분비로 인한 여드름, 지루성 피부염 또는 비듬 등의 치료용 제제 또는 화장료 조성물로도 제조하여 이용할 수 있다. 또한, 5알파-환원효소 저해효과가 있는 것으로 밝혀진 본 발명 백자인 추출물을 남성형 탈모증 이외에도 전립선 암, 전립선 비대증 등 5알파-환원효소가 관여되는 각종 질환의 치료 및 예방을 위한 제제에 첨가하여 이용할 수 있다.
이하, 본 발명의 구성을 상세히 설명한다.
5알파-환원효소 저해효과가 있어 탈모방지 및 발모촉진 효과가 있는 본 발명백자인 추출물은;
(1) 백자인에 유기용매를 백자인 생약 건조중량에 대하여 단독으로 2∼5배의 용량으로 첨가 혼합하여 백자인 추출물을 제조하는 단계;
`(2) 냉각콘덴서가 장착된 추출기에서 상기 백자인-유기용매 혼합물을 가열하여 백자인 추출액을 제조하는 단계;
(3) 상기 백자인 추출액을 냉각콘덴서가 달린 감압 증발기에서 감압농축하고 완전히 건조시키는 단계;
를 포함하여 구성되느 방법에 의하여 제조됨을 특징으로 한다.
상기 백자인은 생약제로 판매되고 있는 것을 이용할 수 있다.
상기 유기용매로는 탄소수 1∼4개의 무수 또는 함수 저급 알코올(alcohol), 헥산(hexane), 에틸에테르(ethylether) 또는 에틸아세테이트(ethylacetate) 등을 이용할 수 있다. 이 때, 상기 유기용매 중 한가지 용매만을 사용하여 단순 추출할 수 있으며, 상기 유기용매와 물을 사용하여 단계적으로 분획추출할 수도 있다.
상기 (2)의 가열시 50∼100℃로 1∼10시간 동안 가열하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기와 같은 가열 추출 방법 이외에도 백자인을 상기 유기용매에 0∼40℃에서 1∼30일간 침적하는 방법으로도 백자인 유효성분을 추출할 수 있다.
본 발명에서 이용한 백자인(柏子仁,Thujae semenLinne)은 길이 3~5㎜, 지름 2~3㎜로 그 모양은 난원형~긴 타원형이거나 또는 긴 원주형인 측백나무(Thuja orientalis)의 종자이다. 바깥 면은 엷은 황백색 또는 담황갈색이고, 오래되면 점차 변하여 황갈색이 되며, 기름이 스며 나온다. 종자의 바깥 면은 흔히 얇은 막질의 내종피로 싸여있고, 끝은 대개 뾰족하며, 원삼능형으로 진한 갈색의 점이 있다. 아래쪽은 둔한 원형으로 색이 엷다. 횡단면을 현미경으로 살펴보면 백색 또는 황백색이고 배유가 많으며 풍부한 지방질이 함유되어 있다(대한약전외 한약 규격집). 달고 평하며 독이 없고 향기로우며, 심장에 작용하여 혈액을 보충하고 정신을 안정시켜 땀을 멎게 하는 작용을 한다. 간장과 신장을 윤택하게 하고, 허리 또는 뼈마디가 무겁고 아픈 증상을 치료하며, 양심안신(養心安神), 윤장통편(潤腸通便)의 효능이 있는 것으로 알려져 있다(동양학 개론;서경출판사).
상기의 방법으로 제조한 발모촉진효과가 있는 백자인 추출물은 마우스의 전립선에서 추출한 5알파-환원효소를 이용한 시험 및 디하이드로테스토스테론의 작용으로 피지가 과다 발생되어 피부색이 누렇게 변하는 퍼지렛드를 이용한 시험을 통하여 탁월한 5알파-환원효소 억제효과가 있는 것으로 나타났다. 또한, 마우스를 이용한 모발 생장 효과 시험에서도 유의적인 모발 생장 촉진효과가 있는 것으로 나타났다.
이 때, 첨가하는 백자인 추출물의 양은 화장료 조성물의 건조 중량에 대하여 0.0001∼5중량%(w/w), 바람직하게는 0.001∼1중량%(w/w)의 양으로 배합할 수 있다. 본 발명의 발모촉진용 화장료 조성물은 두발 또는 피부에 적용할 수 있는 유연화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 팩, 헤어토닉, 헤어로션, 샴푸 및 토닉등의 제형으로 제조하여 사용할 수 있다.
이하, 본 발명의 구성을 제조예 및 시험예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위가 이들에만 한정되는 것은 아니다.
제조예 1. 백자인 추출물 Ⅰ의 제조
백자인 100g에 70% 에탄올(ethanol)을 250㎖ 가하고 냉각콘덴서가 달려있는 추출기에서 약 2시간동안 끓여서 추출한 후 여과하여 찌꺼기를 제거하고 백자인 추출액을 제조하였다. 상기 제조한 백자인 추출액을 냉각콘덴서가 달린 증류장치를 이용하여 60oC에서 감압 농축하여 건조된 백자인 추출물 Ⅰ을 8g 획득하였다.
제조예 2. 백자인 추출물 Ⅱ의 제조
백자인 100g에 헥산(hexane)을 250㎖ 가하고 냉각콘덴서가 달려있는 추출기에서 약 2시간동안 끓여서 추출한 후 여과하여 찌꺼기를 제거하고 백자인 추출액을 제조하였다. 상기 제조한 백자인 추출액을 냉각콘덴서가 달린 증류장치를 이용하여 60oC에서 감압 농축하여 건조된 백자인 추출물 Ⅱ을 6g 획득하였다.
제조예 3. 백자인 추출물 Ⅲ의 제조
백자인 100g에 에틸아세테이트(ethylacetate)를 200㎖ 가하고 냉각콘덴가 달려있는 추출기에서 약 2시간동안 끓여서 추출한 후 여과하여 찌꺼기를 제거하고 백자인 추출액을 제조하였다. 상기 제조한 백자인 추출액을 냉각콘덴서가 달린 증류장치를 이용하여 50oC에서 감압 농축하여 건조된 백자인 추출물 Ⅲ을 4g 획득하였다.
제조예 4. 백자인 추출물 Ⅳ의 제조
백자인 100g에 함수 혹은 무수 에탄올(ethylacohol)을 200㎖ 가하고, 냉각콘덴서가 달려있는 추출기에서 약 2시간동안 끓여서 추출한 후 헥산(hexane)과 물을 각각 200㎖씩 첨가하여 헥산층을 분리하고 위의 추출과정을 반복한다. 여기에 다시 에틸에테르(ethylether)로 용출시킨 후 에틸아세테이트(ethylacetate)와 물을 각각 각각 200㎖씩 첨가하여 에틸아세테이트(ethylacetate)층을 분리하고 냉각콘덴서가 달린 증류장치를 이용하여 50oC에서 감압 농축하여 건조된 백자인 추출물 Ⅳ을 5g 획득하였다.
제형예 1. 백자인 추출물을 함유한 탈모 방지 영양 화장수의 제형예
성분 |
중량비 (%) |
백자인 추출물 |
0.5 |
밀납 |
4.0 |
폴리솔베이트 60 |
1.5 |
솔비탄세스퀴올레이트 |
0.7 |
유동파라핀 |
5.0 |
스쿠알란 |
5.0 |
카프릴릭/카프릭트리글리세라이드 |
5.0 |
글리세린 |
3.0 |
부틸렌글리콜 |
3.0 |
프로필렌글리콜 |
3.0 |
카르복시비닐폴리머 |
0.1 |
트리에탄올아민 |
0.2 |
방부제 |
적량 |
색소 |
적량 |
향료 |
적량 |
정제수 |
잔액 |
계 |
100.0 |
제형예 2. 백자인 추출물을 함유한 탈모 방지 헤어 토닉의 제형예
성분 |
중량비 (%) |
에탄올 |
55.0 |
피마자유 |
5.0 |
글리세린 |
3.0 |
피록톤아민 |
0.1 |
백자인 추출물 |
1.0 |
향료, 색소 |
적량 |
정제수 |
잔액 |
계 |
100.0 |
제형예 3. 백자인 추출물을 함유한 탈모 방지 헤어 로션의 제형예
성분 |
중량비 (%) |
세토스테아릴알코올 |
2.0 |
염화스테아릴트리에틸암모늄 |
2.0 |
히드록시에틸셀룰로오즈 |
0.5 |
피록톤올아민 |
0.1 |
백자인추출물 |
1.0 |
향료, 색소 |
0.5 |
정제수 |
잔액 |
계 |
100.0 |
제형예 4. 백자인 추출물을 함유한 탈모 방지 헤어 비누의 제형예
성분 |
중량비 (%) |
백자인추출물 |
0.1 |
이산화티탄 |
0.2 |
폴리에틸렌글리콜 |
0.8 |
글리세린 |
0.5 |
에틸렌디아민테트라아세트산 |
0.05 |
나트륨 |
1.0 |
색소 |
적량 |
비누향 |
적량 |
화장비누베이스(수분 13%, 중량부) |
to 100 |
계 |
100.0 |
상기 제조예 1∼4에서 제조한 본 발명 백자인 추출물Ⅰ∼Ⅳ의 5 알파-환원효소 저해 효과를 알아 보기 위하여 다음의 방법에 따라 시험예를 실시하였다.
시험예 1. 스프라그 다우리 전립선을 이용한 5알파-환원효소 저해 효과 시험
생후 7∼8주의 성숙한 수컷 스프라그-다우리(Sprague-Dawley)를 디에틸에테르(diethylether)로 치사시킨 후 복부 전립선을 떼내어 결합조직을 제거하였다. 여기에 완충액[0.32M 수크로스(sucrose), 0.1mM 디티오트레이톨(dithiothreitol), 20mM 아세트산나트륨염(sodium acetate)]을 첨가하고 분쇄기로 잘게 자른 후 현탁하였다. 상기 현탁액을 거즈로 여과한 여과액을 1500 ×g에서 원심분리한 후 펠렛(pellet)을 취해 상기 완충액을 혼합하여 20~30㎎/㎖ 농도로 현탁하였다.
상기 현탁액의 일부를 취하여 0.02M 인산 완충액에 넣은 후, 동위 원소인3H 가 붙어있는 기질 테스토스테론과 함께 반응시켜 생성물인 디하이드로테스토스테론의 생성량을 측정하였다. 이 때, 반응 용액은 1mM의 디티오트레이톨, 20mM의 인산염 완충액(pH 6.5), 50μM의 NADPH, [1,2,6,7-3H] 테스토스테론 0.1μCi/테스토스테론(1×10-7M)과 36㎍ 효소 현탁액을 첨가하여 전체 반응액을 565㎕가 되도록 조제하였다.
상기 제조한 본 발명 백자인 추출물 Ⅰ일정량을 10% 디메틸설폭사이드(DMSO)에 녹여 한 반응당 10㎕로 가하고, 대조군으로는 같은 부피의 용매를, 양성 대조군으로는 리놀렌산(linolenic acid)을 이용하였다.
또한, 반응은 상기 준비한 효소 현탁액을 가하여 37℃에서 30분간 진행시킨 후,600㎕의 에틸아세테이트를 가하여 반응을 정지시키고 생성물을 질소 가스를 통해 건조시켰다. 이를 50㎕의 에틸아세테이트로 녹인 후 전량을 실리카 플라스틱 시트 카이젤겔 60 F254(Silica plastic sheet kieselgel 60 F254)상에 점적한 후 전개 용매인 에틸아세테이트:사이클로헥산(cyclohexane)(1:1)을 사용하여 전개하였다.
실리카 플라스틱 시트를 자연상태에서 건조시킨 후, 동위원소의 양을 측정하기 위해 바스(Bas, 후지필름, 일본) 시스템을 사용하였으며, 건조된 플라스틱 시트와 노출 필름을 함께 바스 카셋트에 넣어 1주일 동안 보관한 후에 필름에 노출된 테스토스테론과 생성된 디하이드로테스토스테론의 동위원소 양을 노출된 강도를 이용해 정량하였다.
실험은 2차에 걸쳐 반복적으로 사용하였으며, 그 측정 결과를 바탕으로 각각의 5알파-환원효소 저해율을 하기 계산법으로 산출하였다. 본 발명 백자인 추출물의 5 알파-환원효소 저해 실험 결과를 표 5에 나타내었다.
|
항목 |
농도 |
생성호르몬 |
밀도 |
전환율(%) |
평균 전환율 |
저해율(%) |
1 |
대조군 1 |
- |
테스토스테론 |
1.9 |
26.36 |
25.27 |
0.00 |
DHT |
0.68 |
2 |
대조군 2 |
- |
테스토스테론 |
1.96 |
28.73 |
- |
- |
DHT |
0.79 |
3 |
양성 대조군(리놀레닉산) |
10ppm |
테스토스테론 |
1.61 |
12.97 |
- |
48.67 |
DHT |
0.24 |
4 |
제조예 1 |
10ppm |
테스토스테론 |
1.66 |
9.28 |
- |
63.27 |
DHT |
0.17 |
5 |
제조예 2 |
10ppm |
테스토스테론 |
2.67 |
2.20 |
- |
91.29 |
DHT |
0.06 |
6 |
제조예 3 |
10ppm |
테스토스테론 |
2.58 |
1.90 |
- |
92.48 |
DHT |
0.25 |
7 |
제조예 4 |
10ppm |
테스토스테론 |
2.67 |
7.93 |
- |
68.61 |
DHT |
0.25 |
[주]* 밀도: 테스토스테론과 디하이드로테스토스테론 영역에서 나타난3H 방사능양* 전환율 : DHT 영역의 방사능 양/전체 방사능 양* 저해율 : 100 ×(대조군의 전환율-시료의 전환율)/대조군의 전환율 |
이상의 결과에서 살펴본 바와 같이, 본 발명 백자인 추출물 함유제의 경우 5 알파-환원효소 저해 효과가 있음을 알 수 있다.
시험예 2. 퍼지랫트(Fuzzy rat)를 이용한 5알파-환원효소 저해 효과 시험
미국의 찰스리버(Charles & River Lab.)에서 판매하는 퍼지랫트(fuzzy rat) 수컷은 자연적으로 성장함에 따라 남성호르몬의 지배를 받아 상기한 바와 같이 테스토스테론이 디하이드로테스토론으로 변환됨에 따라 피지(sebum)가 과다 발생되어 표면이 누렇게 변하는 특징이 있다(Skin Pharmacol. 1997;10(5-6):288-297). 이러한 퍼지렛트를 이용하여 본 발명 백자인 추출물 함유제의 5알파-환원효소 억제효과를 확인하였다.
남성 호르몬 대사에 관여하는 5알파-환원효소를 저해하는 활성을 지니는 것으로 알려진 피나스테라이드(머크사, 미국) 약물을 퍼지렛드에 투여한 경우, 쥐의 표면이 누렇게 변하지 않았음을 확인하였으며, 백자인을 에틸아세테이트로 추출한 본 발명 백자인 추출물Ⅲ을 프로필렌글리콜:무수에탄올(7:3) 용액에 1.0%의 농도로 희석하여 하루에 두번씩 6주간 도포하여 관찰한 결과, 퍼지랫트의 표면색깔이 변하지 않았음을 확인할 수 있었다(도 5). 따라서, 본 발명 백자인 추출물이 알파-환원효소 저해효과가 있음을 알 수 있다.
시험예 3. 마우스를 통한 백자인 추출물의 모발 생장 효과 시험
상기 제조된 본 발명 백자인 추출물의 건조 엑기스를 2%를 함유하는 30% 함수 에탄올(ethanol) 용액을 제조하여 본 발명 백자인 추출물의 모발 생장 효과를 테스트하였다.
생후 47∼53일된 마우스(C57BL/6)의 등 부위 털을 제거하고, 등 부위 피부가 깨끗한 것을 골라 물질군마다 10마리씩을 선정하여 매일 상기 본 발명 백자인 추출물 시험물질을 개체당 100㎕씩 도포하였다.
시간 경과에 따른 모발의 길이 및 모발 생장 정도를 모 제거 후 복원 정도에 따라 점수를 0에서 3까지 부가하여 각각 비교하였다. 모발 생장 정도를 비교하기 위하여, 대조군에는 30% 알코올 용액을 각 개체에 도포하여 모발의 생장 상태를 관찰하였다. 그 결과를 표 6에 나타내었다.
시험물질 |
경과 일수 |
7일 |
10일 |
15일 |
20일 |
제조예 Ⅰ∼Ⅳ |
0.42±0.2 |
1.25±0.31 |
2.64±0.65 |
2.95±0.52 |
대조군 |
0.10±0.1 |
0.41±0.15 |
1.53±0.45 |
1.95±0.40 |
[주] 점수범위 : 0∼3점 |
이상의 결과에서, 상기 제조예에 따른 본 발명 백자인 추출물 함유제의 경우 유의적인 모발 생장 촉진 효과가 있음을 확인할 수 있었다.