WO2022019573A1 - 당근의 지상부 추출물을 포함하는 탈모 방지 또는 발모 촉진용 조성물 - Google Patents

당근의 지상부 추출물을 포함하는 탈모 방지 또는 발모 촉진용 조성물 Download PDF

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WO2022019573A1
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carrots
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염현숙
김지혜
오원보
이혜자
박진오
문지영
김정미
박병권
이지원
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대봉엘에스 주식회사
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    • A61K2800/782—Enzyme inhibitors; Enzyme antagonists

Definitions

  • the present invention relates to a composition capable of preventing hair loss and promoting hair growth, including an extract of an above-ground part of carrots.
  • Hair loss refers to an increase in abnormally falling hair due to a higher proportion of hair growing in the follicle in the degenerative or resting phase than in the hair growing in the follicle in the growth phase during the hair follicle growth cycle.
  • the causes of such hair loss include a decrease in or inhibition of proliferation of dermal papilla cells and geminal matrix cells related to hair cycle control, an excessive action of male hormones, a decrease in blood flow to the hair follicles, excess sebum secretion, and peroxide It is known that various causes act singly or in combination, such as deterioration of scalp function caused by bacteria, etc., genetic factors, aging, and neurosis due to stress.
  • Patent Document 1 Korean Patent No. 10-2065395
  • the present inventors have researched and tried to develop a composition that exhibits an excellent effect in preventing hair loss or promoting hair growth.
  • the present invention was achieved by confirming that the above-ground extract of carrot contains a natural substance and has excellent effects of preventing hair loss and promoting hair growth while having few side effects. has been completed
  • composition for preventing hair loss or promoting hair growth comprising an extract of an above-ground part of carrots.
  • the present invention provides a composition for preventing hair loss or promoting hair growth, comprising an above-ground part extract of carrots.
  • the above-ground part of the carrot may be a leaf, flower, stem, bud, or a mixture thereof.
  • the extract of the above-ground part of carrots may be obtained by extracting the above-ground part of carrots using water, C 1 to C 4 alcohol, or a mixture thereof as a solvent.
  • the above-ground part extract of carrots may be included in a concentration of 0.001 to 0.02% by weight.
  • composition for preventing hair loss or promoting hair growth may inhibit 5 ⁇ -reductase.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for external use on the skin comprising an extract of the above-ground part of carrots extracted at room temperature in a mixed solvent in which water and ethanol are mixed in a weight ratio of 1: 9 to 5: 5.
  • the present invention provides a cosmetic composition
  • a cosmetic composition comprising an extract of the above-ground part of carrots extracted at room temperature in a mixed solvent in which water and ethanol are mixed in a weight ratio of 1: 9 to 5: 5.
  • composition comprising the above-ground part extract of carrots of the present invention can significantly increase the viability of dermal papilla cells and inhibit the expression of 5 ⁇ -reductase, thereby exhibiting excellent effects in preventing hair loss and promoting hair growth. indicates.
  • composition for preventing hair loss or promoting hair growth of the present invention includes an above-ground extract of carrots (carrot, Daucus carota).
  • the above-ground part of the carrot may be leaves, flowers, stems, buds, or mixtures thereof, but preferably leaf and stem extracts may be included.
  • extracts of the above-ground parts of carrots using water, C 1 to C 4 alcohol or a mixture thereof as a solvent may be used, but a mixture of water and ethanol may be preferably used, more preferably It is recommended to use a mixed solvent in which water and ethanol are mixed in a weight ratio of 1: 9 to 5: 5.
  • the above-ground part of the carrot may be extracted at room temperature, preferably at 10 to 30°C, more preferably at 15 to 25°C.
  • the above-ground part extract of carrots may be included in a concentration of 0.001 to 1% by weight in the composition, preferably 0.005 to 0.05% by weight, and most preferably 0.01 to 0.02% by weight.
  • composition of the present invention can significantly increase the viability of dermal papilla cells and inhibit the expression of 5 ⁇ -reductase (5 ⁇ -reductase).
  • Human dermal papilla cells are cells that exist at the base of the hair follicle, and are responsible for hair growth and hair follicle cycle regulation by supplying oxygen and nutrients to the cells constituting the hair follicle. Therefore, when the proliferation of dermal papilla cells is promoted, hair becomes healthy, hair growth is promoted, and hair loss can be prevented. Because hair growth proceeds as the epithelial cells surrounding the dermal papilla divide to form a hair shaft, the dermal papilla cells play an important role in regulating the division of epithelial cells. In addition, in androgenetic alopecia, the site where male hormones act on hair follicles is also the dermal papilla, and dermal papilla cells play a very important role in hair growth.
  • 5 ⁇ -reductase is known to have type 1 and type 2 isoenzymes
  • type 1 5 ⁇ -reductase (5 ⁇ -reductase-1) is a dermal papilla cell, sebaceous gland, epidermal and It is mainly distributed in keratinocytes of hair follicles
  • type 2 5 ⁇ -reductase-2 (5 ⁇ -reductase-2) is mainly distributed in the prostate, genital skin, seminal vesicles, and epididymis.
  • 5 ⁇ -reductase is an enzyme that works with testosterone to produce DHT (Dihydrotestosterone), which is the main cause of hair loss. .
  • the composition is a pharmaceutical composition for external use on the skin, and may be in the form of a cream, gel, patch, spray, ointment, warning agent, lotion, liniment agent, pasta agent, or cataplasma formulation, but is not limited thereto.
  • the composition is a cosmetic composition, hair tonic, hair conditioner, hair essence, hair lotion, hair nutrition lotion, hair shampoo, hair conditioner, hair treatment, hair cream, hair nutrition cream, hair moisture cream, hair massage cream, Hair wax, hair aerosol, hair pack, hair nutrition pack, hair soap, hair cleansing foam, hair oil, hair dryer, hair preservative, hair dye, hair wave agent, hair bleach, hair gel, hair glaze, hair dresser, hair lacquer , but may be in the form of a hair moisturizer, hair mousse or hair spray, but is not limited thereto.
  • the composition may include ingredients commonly used in cosmetic compositions in addition to the above-ground part extract of carrots.
  • ingredients commonly used in cosmetic compositions for example, fatty substances, organic solvents, solubilizers, thickeners, gelling agents, emollients, antioxidants, suspending agents, stabilizers, foaming agents, fragrances, surfactants, water, ionic or nonionic emulsifiers, Cosmetics or skin, such as fillers, sequestering agents, chelating agents, preservatives, vitamins, blocking agents, wetting agents, essential oils, dyes, pigments, hydrophilic or lipophilic actives, lipid vesicles or any other ingredient commonly used in cosmetics. It may contain adjuvants commonly used in the scientific field. The adjuvant is introduced in an amount generally used in the field of cosmetology or dermatology.
  • Carrot leaves were washed with distilled water, dried and pulverized with a blender to obtain a fine powder sample.
  • a solvent in which ethanol and purified water were mixed at a weight ratio of 7: 3 was added in an amount of about 20 times the volume of the fine powder sample, and then extracted once at 25°C.
  • the resultant filtrate was filtered through a 400 mesh filter cloth, and the resulting filtrate was concentrated using a reduced pressure concentrator, and the concentrated solution was dissolved in purified water to a concentration of 5 mg/mL to prepare a stock solution. Then, the stock solution was diluted with purified water, and a working solution adjusted to an individual concentration was used for the following test.
  • Human Follicle Dermal Papilla Cells were purchased from PromoCell and used in Human Follicle Dermal Papilla Cell Growth Medium medium containing Fetal Calf Serum, Bovine Pituitary Extract, Basic Fibroblast Growth Factor and Insulin at 37°C, 5% CO 2 Incubated in an incubator.
  • MCTT HCE TM is a human corneal model (tissue) that reproduces the corneal epithelium using human corneal epithelial cells.
  • the tissue placed on the agarose gel was transferred to a 24-well plate and pre-cultured at 37° C., 5% CO 2 incubator.
  • MTT assay uses the principle that MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl-2,5-diphenyltetrazolium bromide) reacts with dehydrogenase of living cells to produce purple formazan to determine the cell viability. A typical way to measure.
  • human hair papilla cells were dispensed in a 48 well plate at 1 ⁇ 10 4 cells/mL and when the concentration reached 80% or more, the extract of the above example was treated at the concentration shown in Table 1 below, and then cultured for 24 hours. did Then, 200 ⁇ L of a 0.5 mg/mL solution of MTT diluted in the medium was added and incubated at 37° C. for 4 hours. After removing the solution, adding 200 ⁇ L of DMSO, and transferring 100 ⁇ L to a 96 well plate, absorbance was measured at 585 nm using a microplate reader. The average absorbance value for each sample group was obtained, and the cell viability was evaluated by comparing it with the absorbance value of the control group.
  • cytotoxicity does not appear when the extract of the above example is treated at 0.02 wt% or less, and when the concentration exceeds 0.05 wt%, cytotoxicity is very strong, and it can be confirmed that the cell viability drops sharply.
  • Test Example 3 Cell viability of dermal papilla cells
  • the extracts of Examples were treated at the concentrations shown in Table 2 below.
  • the positive control group was treated with minoxidil at concentrations of 10 and 50 ⁇ M.
  • 200 ⁇ L of a 0.5 mg/mL solution of MTT diluted in the medium was added and incubated at 37 °C for 4 hours.
  • absorbance was measured at 585 nm using a microplate reader. The average absorbance value for each sample group was obtained, and the cell viability was evaluated by comparing it with the absorbance value of the control group.
  • the ratio (%) of Comparative Example 1 / Example of the 9 cells of Table 4 is about 78.5% on average, which is more significant when extracting with 70% by weight of ethanol than when extracting the above-ground part extract of carrots with a water solvent. It was confirmed that it exhibited a very high human dermal papilla cell viability.
  • the ratio (%) of Comparative Example 2/Example of the 9 cells of Table 6 was about 81.2% on average, when extracting with 70% by weight of ethanol rather than extracting the above-ground extract of carrot with 30% by weight of ethanol. It was confirmed that it exhibited a remarkably high human dermal papilla cell viability.
  • the extract of the above example can exhibit the effect of preventing hair loss and promoting hair growth by improving the viability of dermal papilla cells.
  • This test is a method to confirm the gene expression level of 5 ⁇ -reductase-1 using real-time polymerase chain reaction.
  • RNA extracted from cells is used to make cDNA by reverse transcriptase and amplified through polymerase chain reaction, so that the expression level of the corresponding gene can be compared in real time and relatively.
  • the extract of Example was treated in each well and cultured for 24 hours. Thereafter, cells were suspended by treatment with 0.05% Trypsin-EDTA (Gibco), and total RNA in the cells was extracted using an RNA extraction kit (RNeasy mini kit, Qiagen). Oligo dT) (Clontech) was used to synthesize cDNA.
  • the synthesized cDNA, Taqman Fast Advanced Master Mix (Applied Biosystems) and Taqman primer (5 ⁇ -reductase-1: Hs00971645_g1, Applied Biosystems) of each target were used for real-time polymerase chain reaction, and the relative quantitative analysis of each gene was A housekeeping gene, GAPDH (Hs02786624_g1, Applied Biosystems) was used.
  • the threshold cycle (C T ) value which is the intersection point between the amplification curve and the threshold line, was obtained, and the relative quantitative value (RQ) was obtained based on this value, thereby confirming the relative mRNA expression level of the target gene.
  • the RQ was calculated by the following formula.
  • control negative control

Abstract

본 발명은 당근의 지상부 추출물을 포함하여, 탈모를 방지하고 발모를 촉진할 수 있는 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 당근의 지상부 추출물을 포함하는 조성물은 모유두 세포의 생존 능력을 현저하게 증가시키고, 5α-리덕타아제(5α-reductase)의 발현을 억제할 수 있어, 탈모 방지 및 발모 촉진에 우수한 효과를 나타낸다.

Description

당근의 지상부 추출물을 포함하는 탈모 방지 또는 발모 촉진용 조성물
본 발명은 당근의 지상부 추출물을 포함하여, 탈모를 방지하고 발모를 촉진할 수 있는 조성물에 관한 것이다. 본 출원은 2020년 7월 20일에 출원된 한국특허출원 제10-2020-0089738호에 기초한 우선권을 주장하며, 해당 출원의 명세서 및 도면에 기재된 모든 내용은 본 출원에 원용된다.
탈모란 모낭의 성장주기 중 성장기의 모낭에서 자라는 모발보다 퇴행기 또는 휴지기의 모낭에서 자라는 모발의 비율이 높아져 비정상적으로 빠지는 모발이 증가하는 것을 말한다.
이러한 탈모의 원인으로는 모발 주기 조절과 관련된 모유두세포(dermal papilla cell)와 모모세포(geminal matrixcell)의 기능저하 또는 증식억제, 남성호르몬의 과잉작용, 모포에의 혈류량의 저하, 피지분비 과잉, 과산화물과 세균 등에 의한 두피기능 저하, 유전적 요인, 노화, 스트레스에 따른 신경증 등이 있으며, 다양한 원인들이 단독 혹은 복합적으로 작용하는 것으로 알려져 있다.
최근 현대인들에게 대기오염과 같은 환경적 요인과 정신적인 스트레스 등으로 인하여 탈모증의 발생이 증가하고 있으며 발생 연령도 점차 낮아지고 있다. 이와 같은 탈모증은 당사자들에게 심각한 스트레스를 유발시키고 대인관계에 지장을 초래할 수 있어 탈모치료 및 예방에 대한 관심은 증대되고 있다.
탈모 치료에는 다양한 외용제가 사용되고 있는데 현재 가장 널리 사용되는 것은 미국 FDA의 승인을 받은 업존사의 미녹시딜 함유제제이며 최근에는 머크사에서 Type 2의 5 알파-환원효소 억제효과가 있는 피나스테라이드(finasteride)가 주성분인 프로페시아(Propecia)가 발매되어 사용되고 있다. 그러나 미녹시딜의 경우 가려움증, 자극 등의 부작용이 나타나는 문제점이 있고, 피나스테라이드의 경우에도 사용을 중단하면 2개월 안에 원상태로 돌아가는 문제점과 성욕감퇴, 발기부전 등의 성기능 감퇴 등의 부작용이 발생하며, 여성은 기형아 출산 위험이 있기 때문에 복용할 수 없다는 단점이 존재한다.
또한, 부작용이 적은 천연물질로 천궁, 상황버섯, 금은화, 케모마일 등의 추출물, 하수오, 창포, 석류, 은행잎 추출물 등 천연추출물에 기초한 연구들이 진행되고 있으나 이러한 발모제를 실제 임상에서 사용하는 경우 두피에 작용하는 효과가 그다지 탁월하지 못하다.
한국등록특허 제10-2065395호에서는 동백꽃, 고추씨, 가지, 알로에, 구절초, 당근, 시금치, 보골지, 상백피, 생강, 연근, 민들레, 문주란, 홍화, 녹차, 어성초, 강황, 은행잎, 석장포 등 천연추출물을 포함하는 발모제 조성물을 개시하고 있으며, 이와 같이 우수한 효과를 보이면서 부작용이 적은 천연물질로 이루어진 탈모제 또는 발모제를 탐색하는 연구가 계속하여 요구되고 있는 실정이다(특허문헌 1).
[선행기술문헌]
[특허문헌]
(특허문헌 1) 한국등록특허 제10-2065395호
이에 본 발명자들은 탈모 방지 또는 발모 촉진에 우수한 효과를 나타내는 조성물을 개발하고자 연구 노력한 결과, 당근의 지상부 추출물이 천연 물질을 함유하여 부작용이 적으면서도 탈모 방지 및 발모 촉진 효과가 우수한 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명은 당근의 지상부 추출물을 포함하는 탈모 방지 또는 발모 촉진용 조성물을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
본 발명은 당근의 지상부 추출물을 포함하는 탈모 방지 또는 발모 촉진용 조성물을 제공한다.
상기 당근의 지상부는 잎, 꽃, 줄기, 새싹 또는 이들의 혼합물일 수 있다.
상기 당근의 지상부 추출물은 당근의 지상부를 물, C1 ~ C4의 알코올 또는 이들의 혼합물을 용매로 사용하여 추출한 것일 수 있다.
상기 당근의 지상부 추출물은 0.001 ~ 0.02 중량%의 농도로 포함될 수 있다.
상기 탈모 방지 또는 발모 촉진용 조성물은 5α-리덕타아제(5α-reductase)를 저해할 수 있다.
또한, 본 발명은 당근의 지상부를 물과 에탄올이 1 : 9 ~ 5 : 5의 중량비로 혼합된 혼합 용매에 넣고 상온에서 추출한 당근의 지상부 추출물을 포함하는 피부외용 약학조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 당근의 지상부를 물과 에탄올이 1 : 9 ~ 5 : 5의 중량비로 혼합된 혼합 용매에 넣고 상온에서 추출한 당근의 지상부 추출물을 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 당근의 지상부 추출물을 포함하는 조성물은 모유두 세포의 생존 능력을 현저하게 증가시키고, 5α-리덕타아제(5α-reductase)의 발현을 억제할 수 있어, 탈모 방지 및 발모 촉진에 우수한 효과를 나타낸다.
이하, 본 발명에 대하여 상세히 설명하기로 한다. 이에 앞서, 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다. 따라서, 본 명세서에 기재된 실시예에 기재된 구성은 본 발명의 가장 바람직한 일 실시예에 불과할 뿐이고 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.
본 발명의 탈모 방지 또는 발모 촉진용 조성물은 당근(carrot, Daucus carota )의 지상부 추출물을 포함한다.
상기 당근의 지상부는 잎, 꽃, 줄기, 새싹 또는 이들의 혼합물일 수 있으나, 바람직하게는 잎, 줄기 추출물을 포함할 수 있다.
상기 당근의 지상부 추출물은 당근의 지상부를 물, C1 ~ C4의 알코올 또는 이들의 혼합물을 용매로 사용하여 추출한 것을 사용할 수 있으나, 바람직하게는 물, 에탄올의 혼합물을 사용할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 물과 에탄올이 1 : 9 ~ 5 : 5의 중량비로 혼합된 혼합 용매를 사용하는 것이 좋다.
상기 당근의 지상부 추출물은 당근의 지상부를 상온에서 추출한 것을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 10 ~ 30℃, 더욱 바람직하게는 15 ~ 25℃ 온도 범위에서 추출한 것을 사용하는 것이 좋다.
상기 당근의 지상부 추출물은 조성물 내 0.001 ~ 1 중량%의 농도로 포함될 수 있으며, 바람직하게는 0.005 ~ 0.05 중량%, 가장 바람직하게는 0.01 ~ 0.02 중량%의 농도로 포함될 수 있다.
본 발명의 조성물은 모유두 세포의 생존 능력을 현저하게 증가시키고, 5α-리덕타아제(5α-reductase)의 발현을 억제할 수 있다.
인간의 모유두세포는 모낭의 기저부에 존재하는 세포로, 모낭을 구성하는 세포들에게 산소와 영양을 공급하여 모발의 성장과 모낭 주기 조절을 담당한다. 따라서 모유두세포의 증식이 촉진되면 모발이 건강해지고 모발 성장이 촉진되며 탈모를 막을 수 있다. 모발의 성장은 모유두(dermal papilla)를 둘러싸고 있는 상피세포(epithelial cell)가 분열하여 모간(hair shaft)을 만들면서 진행되기 때문에 모유두세포는 상피세포의 분열을 조절하는 중요한 역할을 한다. 또한, 남성형 탈모증에서 남성호르몬이 모낭에 작용하는 부위 역시 모유두로서 모유두세포는 발모에 있어 매우 중요한 역할을 하고 있다.
또한 5α-리덕타아제(5α-reductase)는 제 1형, 제 2형의 동종효소가 있다고 알려져 있는데, 제1형 5α-리덕타아제(5α-reductase-1)는 모유두세포, 피지선, 표피 및 모낭의 각질형성세포 등에 주로 분포하며 제 2형 5α-리덕타아제(5α-reductase-2)는 전립선, 생식기피부, 저정낭, 부고환 등에 주로 분포한다. 5α-리덕타아제는 테스토스테론과 작용하여 탈모를 일으키는 주요원인인 DHT (Dihydrotestosterone)를 생성하는 역할을 하는 효소로, 인간 모유두세포에서 5α-reductase-1 유전자 발현의 감소는 탈모방지에 관여한다고 알려져 있다.
상기 조성물은 피부외용 약학조성물로서, 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제 제형일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 조성물은 화장료 조성물로서, 헤어토닉, 헤어컨디셔너, 헤어에센스, 헤어로션, 헤어영양로션, 헤어샴푸, 헤어린스, 헤어트리트먼트, 헤어크림, 헤어영양크림, 헤어모이스처크림, 헤어맛사지크림, 헤어왁스, 헤어 에어로졸, 헤어팩, 헤어영양팩, 헤어비누, 헤어클렌징폼, 머릿기름, 모발건조제, 모발보존처리제, 모발염색제, 모발용 웨이브제, 모발탈색제, 헤어겔, 헤어글레이즈, 헤어드레싱어, 헤어래커, 헤어모이스처라이저, 헤어무스 또는 헤어스프레이의 제형일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 조성물은 상기 당근의 지상부 추출물 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있다. 예를 들어, 지방 물질, 유기용매, 용해제, 농축제, 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제, 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 상기 보조제는 화장품학 또는 피부과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입된다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예 및 실험예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 아래에서 상술하는 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해서 제공되는 것이다.
실시예 : 당근 지상부 추출물 제조
당근의 잎을 증류수로 수세한 후, 건조하고 믹서기로 분쇄하여 미세 분말 시료를 얻었다. 다음, 에탄올과 정제수를 중량비 7 : 3으로 혼합한 용매를 상기 미세 분말 시료 대비 약 20배 부피량으로 가한 후, 25℃에서 1회 추출을 수행하였다. 상기 추출을 수행한 후, 400 메쉬 여과포로 여과한 다음, 수득한 여액을 감압농축기를 이용하여 농축하고, 농축액을 5 mg/mL의 농도가 되도록 정제수에 녹여 저장 용액을 제조하였다. 그리고 상기 저장 용액을 정제수로 희석하여 개별 농도로 조절한 작업 용액으로 하기 시험에 사용하였다.
시험예 1 : 세포 배양
인간모유두세포 배양
인간모유두세포(Human Follicle Dermal Papilla Cell)는 PromoCell로부터 분양 받아 Fetal Calf Serum, Bovine Pituitary Extract, Basic Fibroblast Growth Factor 및 Insulin이 함유된 Human Follicle Dermal Papilla Cell Growth Medium 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 항온기에서 배양하였다.
MCTT HCE TM 배양
MCTT HCETM은 사람의 각막상피세포를 이용하여 각막의 상피를 재현한 인체각막모델(조직)로서, 한국 바이오솔루션에서 제작된 조직을 분양 받아 사용하였다. 아가로스 겔 위에 올려져 있는 조직을 24 well plate에 옮겨 37℃, 5% CO2 항온기에서 전배양하였다.
시험예 2 : 세포 독성 평가
MTT assay
MTT assay는 MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl-2,5-diphenyltetrazolium bromide)가 살아있는 세포의 탈수소효소(Dehydrogenase)와 반응하여 보라색의 formazan을 생성하는 원리를 이용하여 세포생존율을 측정하는 대표적인 방법이다.
세포 독성을 확인하기 위하여 인간모유두세포를 1×104 cells/mL로 48 well plate에 분주하여 80% 이상이 되었을 때, 상기 실시예의 추출물을 하기 표 1의 농도로 처리한 후, 24시간 동안 배양하였다. 이후 배지에 희석한 MTT 0.5 mg/mL 용액을 200 μL씩 넣고 37℃에서 4시간 동안 배양하였다. 용액을 제거하고 DMSO 200 μL를 넣어 96 well plate에 100 μL를 옮긴 후, 마이크로플레이트 리더를 이용하여 585 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료 군에 대한 평균 흡광도 값을 구하였으며, 대조군의 흡광도 값과 비교하여 세포생존율을 평가하였다.
구분 세포독성
처리농도(중량%) 세포생존율(%)
무처리군 - 100.000
실시예 0.00005 100.496
0.0005 104.311
0.005 105.798
0.01 110.631
0.02 115.396
0.05 14.222
상기 표 1에서 보는 바와 같이 0.02 중량% 이하로 상기 실시예의 추출물을 처리하는 경우 세포 독성이 나타나지 않고, 농도가 0.05 중량%를 초과하는 경우 세포 독성이 매우 강해져 세포 생존율이 급격히 떨어지는 것을 확인할 수 있었다.
시험예 3 : 모유두세포 세포생존율
상기 배양된 인간모유두세포를 1 x 104 cell/mL로 48 well plate에 분주하여 80% 이상이 되었을 때, 상기 실시예의 추출물을 하기 표 2의 농도로 처리하였다. 양성대조군은 미녹시딜을 10, 50 μM의 농도로 처리하였다. 세포는 24, 48, 72시간 배양한 이후 배지에 희석한 MTT 0.5 mg/mL 용액을 200 μL씩 넣고 37°C에서 4시간 동안 배양하였다. 용액을 제거하고 DMSO 200 μL을 넣어 96 well plate에 100 μL를 옮긴 후, 마이크로플레이트 리더를 이용하여 585 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료 군에 대한 평균 흡광도 값을 구하였으며, 대조군의 흡광도 값과 비교하여 세포생존율을 평가하였다.
구분 24h 48h 72h
양성 대조군 10 μM 104.056 107.385 115.000
50 μM 107.407 116.168 124.815
실시예 0 중량% 100.000 100.000 100.000
0.005 중량% 103.704# 109.980# 118.519#
0.01 중량% 116.931# 120.559# 128.519#
0.02 중량% 121.693# 125.749# 135.185#
상기 표 2에서 보는 바와 같이, 실시예의 추출물을 0.01 ~ 0.02 중량%로 처리하는 경우 양성대조군인 미녹시딜보다 인간모유두 세포생존율이 높아지는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 용매 조성에 따른 효과를 확인하기 위해, 물 용매(비교예 1), 물과 에탄올이 7 : 3의 중량비로 혼합된 혼합 용매(비교예 2)를 사용하여 당근 지상부 추출물을 제조한 후, 상기와 동일하게 인간모유두 세포생존율 실험을 진행하였다.
정제수 추출
(상온)		 농도(중량%) 24H 48H 72H
0.005 90.585 93.923 91.023
0.01 94.047 95.844 91.377
0.02 100.142 96.198 90.574
농도(중량%) 비교예 1/ 실시예 비율(%)
24H 48H 72H
0.005 87.3 85.4 76.8
0.01 80.4 79.5 71.1
0.02 82.3 76.5 67.0
상기 표 3에서 보는 바와 같이, 정제수로 추출하는 경우 인간 모유두 세포 생존율이 대부분 100% 이하의 결과값을 나타내는 바, 정제수를 용매로 한 당근의 지상부 추출물은 실질적으로 탈모 개선 효과가 없는 것을 확인할 수 있었다.
그리고, 상기 표 4의 9개 셀의 비교예 1/ 실시예의 비율(%)은 평균 약 78.5%로, 당근의 지상부 추출물을 물 용매로 추출하는 경우보다 70 중량%의 에탄올로 추출하는 경우에 현저하게 높은 인간 모유두 세포 생존율을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
30 중량% 에탄올 추출
(상온)		 농도(중량%) 24H 48H 72H
0.005 99.48 100.458 95.62
0.01 100.832 96.081 91.573
0.02 101.334 95.522 90.257
농도(중량%) 비교예 2/ 실시예 비율(%)
24H 48H 72H
0.005 95.9 91.3 80.7
0.01 86.2 79.7 71.3
0.02 83.3 76.0 66.8
상기 표 6의 9개 셀의 비교예 2/ 실시예의 비율(%)은 평균 약 81.2%로, 당근의 지상부 추출물을 30 중량%의 에탄올로 추출하는 경우보다 70 중량%의 에탄올로 추출하는 경우에 현저하게 높은 인간 모유두 세포 생존율을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
다음으로, 추출 온도에 따른 효과를 확인하고자, 70 중량%의 에탄올을 사용하면서 80 ℃로 가열하여 추출물을 얻은 후(비교예 3) 인간 모유두 세포의 생존 비율을 측정하였다.
70 중량% 에탄올 추출
(80℃ 가열)		 농도(중량%) 24H 48H 72H
0.005 108.195 111.45 102.377
0.01 111.175 112.723 106.796
0.02 113.063 112.265 116.618
농도(중량%) 비교예 3/ 실시예 비율(%)
24H 48H 72H
0.005 104.3 101.3 86.4
0.01 95.1 93.5 83.1
0.02 92.9 89.3 86.3
상기 표 1에서와 같은 본원발명의 경우, 시간이 경과할수록 인간 모유두 세포 생존율이 증가하는 반면, 상기 표 7의 비교예 3에서 가열하여 얻어진 추출물은 시간이 경과할수록 생존율이 감소하는 경향을 보였다. 또한, 두 결과를 비교한 표 8에서, 가열추출물은 상온추출물과 비교할 때 72시간 경과 후에 약 85% 수준의 효과만을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
따라서 상기 실시예의 추출물이 모유두세포의 생존능력을 향상시켜 탈모방지 및 모발생장 촉진의 효과를 나타낼 수 있음이 확인되었다.
시험예 4 : 5α-reductase-1의 유전자 발현 평가
실시간 중합효소 연쇄반응 (qRT-PCR)
본 시험은 5α-reductase-1의 유전자 발현 정도를 실시간 중합효소 연쇄반응을 이용하여 확인하는 방법이다. 세포로부터 추출한 RNA를 역전사 효소에 의해 cDNA를 만들고, 이를 중합효소 연쇄반응을 통해 증폭하여 해당 유전자의 발현량을 실시간, 상대적으로 비교할 수 있다.
상기 배양된 인간 모유두세포를 2 x 105 cell/mL로 6 well plate에 분주하여 90% 이상이 되었을 때, 상기 실시예의 추출물을 각 well에 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 이후, 0.05% Trypsin-EDTA (Gibco)를 처리하여 세포를 부유시키고, 세포 내의 total RNA는 RNA extraction kit (RNeasy mini kit, Qiagen)를 이용하여 추출하였으며, 추출된 총 RNA를 RNA to cDNA EcoDryTM Premix (Oligo dT) (Clontech)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA, Taqman Fast Advanced Master Mix (Applied Biosystems) 및 각 타겟의 Taqman primer (5α-reductase-1: Hs00971645_g1, Applied Biosystems)를 이용하여 실시간 중합효소 연쇄반응을 진행하였으며, 각 유전자의 상대적인 정량 분석은 housekeeping gene인 GAPDH (Hs02786624_g1, Applied Biosystems)을 이용하였다.
cDNA 증폭 시 실시간으로 증폭량을 확인하여 증폭 곡선과 역치선 사이의 교차점인 역치 사이클 (CT) 값을 얻고 이 값을 토대로 상대 정량값 (RQ)을 구하여 타겟 유전자의 상대적인 mRNA 발현량을 확인할 수 있었다. 상기 RQ는 아래의 식에 의해 계산하였다.
[수학식 1]
Figure PCTKR2021009164-appb-img-000001
- treatment (시험군): 실시예 처리
- control (대조군): 음성대조군
- target gene: 5α-reductase-1
- housekeeping gene: GAPDH
음성대조군 실시예 추출물
(0.005 중량%)
5α-reductase-1의 유전자 발현량 (RQ) 평균 1.000 ± 0.062 0.672 ± 0.018
음성대조군에 대한 유의확률
(p-value)		 - <0.05#
상기 표 9에서 보는 바와 같이, 실시예의 당근 지상부 추출물이 음성대조군 대비 5α-reductase-1의 유전자 (mRNA) 발현을 억제시키는 것을 확인할 수 있었다.

Claims (7)

  1. 당근의 지상부 추출물을 포함하는 것을 특징으로 하는 탈모 방지 또는 발모 촉진용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 당근의 지상부는 잎, 꽃, 줄기, 새싹 또는 이들의 혼합물인 것을 특징으로 하는 탈모 방지 또는 발모 촉진용 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 당근의 지상부 추출물은 당근의 지상부를 물, C1 ~ C4의 알코올 또는 이들의 혼합물을 용매로 사용하여 추출한 것을 특징으로 하는 탈모 방지 또는 발모 촉진용 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 당근의 지상부 추출물은 0.001 ~ 0.02 중량%의 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 탈모 방지 또는 발모 촉진용 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 5α-리덕타아제(5α-reductase)를 저해하는 것을 특징으로 하는 탈모 방지 또는 발모 촉진용 조성물.
  6. 당근의 지상부 추출물을 포함하며,
    상기 당근의 지상부 추출물은 당근의 지상부를 물과 에탄올이 1 : 9 ~ 5 : 5의 중량비로 혼합된 혼합 용매에 넣고 상온에서 추출한 것을 특징으로 하는 피부외용 약학조성물.
  7. 당근의 지상부 추출물을 포함하며,
    상기 당근의 지상부 추출물은 당근의 지상부를 물과 에탄올이 1 : 9 ~ 5 : 5의 중량비로 혼합된 혼합 용매에 넣고 상온에서 추출한 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
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