KR20030034141A

KR20030034141A - 콜라겐에 대한 혈소판 부착을 저해하는 신규한 특이적메카니즘

Info

Publication number: KR20030034141A
Application number: KR10-2003-7002188A
Authority: KR
Inventors: 크리스토퍼 바르네스; 마티아스 프레히; 우베 호프만; 요하네스 글라이츠; 볼프강 슈트리트마테르
Original assignee: 메르크 파텐트 게엠베하
Priority date: 2000-08-25
Filing date: 2001-08-23
Publication date: 2003-05-01
Also published as: BR0113478A; JP2004506690A; US6881722B2; HK1059736A1; EP1311284A2; ECSP034485A; WO2002015919A2; SK3132003A3; US20030190342A1; PL359246A1; DK1311284T3; AR030492A1; ATE285246T1; SI1311284T1; DE60107962D1; HUP0303747A3; US7459438B2; CN1449291A; CN1224421C; WO2002015919A3

Abstract

본 발명은 혈관 손상 또는 동맥 내막 절제 후의 혈소판 부착 및 혈소판 축적을 크게 감소시키는 능력을 갖는 약제를 제조하기 위한 폴리펩티드 사라틴의 용도에 관한 것이다. 또한 본 발명은 혈전증 및 혈관 내막 증식 저해제로서의 사라틴의 신규한 의학적 용도에 관한 것으로, 상기 폴리펩티드는 국부제로서 또는 의료 기구 상의 코팅으로서 국부적으로 사용되거나, 의료 기구와 결합 또는 연계될 수 있다.

Description

콜라겐에 대한 혈소판 부착을 저해하는 신규한 특이적 메카니즘{A NEW SPECIFIC MECHANISM FOR INHIBITING PLATELET ADHESION TO COLLAGEN}

혈관 성형 및 외과적 처리에서 혈액 세포, 특히 혈소판이 손상된 혈관벽에 부착되는 것은 주지되어 있는 현상이다. 차단된 통로, 도관 및 다른 내강을 재개방하기 위하여, 병에 걸린 조직을 제거하기 위하여, 및 대체 조직 또는 이의 성분을 이식하기 위하여 개발된 다양한 외과적인 경피 치료동안에 이러한 손상이 일어날 수 있다.

혈관 차단저해물(blockage)의 감소 또는 제거를 용이하게 하는 다양한 형태의 개입(intervention) 기술이 개발되어, 혈관을 통한 혈류가 증가되도록 하였다. 혈관의 협착증 또는 폐색을 치료하는 기술 중 하나는 경피 벌룬 혈관성형술(ballonangioplasty)이다. 벌룬 카테터를 환자의 동맥 계에 넣어 좁아지거나 차단된 영역에 삽입하고, 벌룬을 부풀려 조여진 영역을 팽창시킨다. 경피 트란스루미날(transluminal) 혈관성형(PTCA)은 막힌 아테로마성 동맥경화 동맥을 개방하기 위하여 사용되는 가장 보편적인 혈관성형법이다.

일반적으로, 혈관성형법은 바이패스 수술이 불필요한 우수한 결과를 나타내지만, 약 30-40%의 환자에게서는, 동맥이 명백히 성공적으로 초기 확장된 약 3 내지 9 개월 후에 혈관의 재협착(재발협착증)이 일어날 수 있다. 이러한 재발협착증이 위중하다면, 대개 혈관에서 스캐폴드로 작용하는 스텐트의 이식과 함께 2차 혈관성형법이 환자에게 필요할 수 있다.

다른 경우, 매우 위험한 방법인 바이-패스 수술 하의 동맥 재구성이 필요할 수 있다. PTCA 법은 세계적으로 현재 매년 800,000회 이상 실시되면서, 이 30-40%에 달하는 재발협착증 비율이 사회-경제적으로 암시하는 바가 개입 심장학자에게 중대한 관심사가 되고 있다.

재발협착증은 대개 동맥벽에 대한 벌룬-매개 신장 및 압좌(crush) 손상에 따른 결과로, 배치하는 동안 이러한 방법에 사용되는 카테터의 가이드 와이어가 손상을 일으키고 동맥의 평활근 세포를 증식시킬 수 있어, 이후 몇 달에 걸쳐 동맥이 재폐쇄("재발협착증")될 가능성이 있다.

재발협착증과 관련된 잠재적 합병증 및 궤양성 플라크로부터의 색전 제거에 대한 두려움 및 심각한 결과 때문에, 경동맥의 반복적인 혈관성형은 최소 침습성 개입의 선택을 크게 제한한다.

따라서, 다른 형태의 개입을 통해 뇌로 가는 경동맥의 폐색을 치료하고자 시도되었다.

경동맥 내막 절제는 경동맥으로부터의 차단저해물을 제거하는 외과적인 방법이며, 미국에서 행해지는 가장 일반적인 혈관 수술 방법 중 하나이다. 다중심성 시험(multicenter trials) 결과를 통해, 두개외의 경동맥 질환 치료시, 증상이 있는 환자 및 증상이 없는 환자 모두에게서 이 방법의 효과가 증명되었고(JAMA 1995;273:1421-28; N Engl. J. Med. 1991;325:445-53), 다른 혈관 상(beds)의 폐색 혈관 질환 치료에도 동맥 내막 절제 방법이 사용된다(Vasc. Surg. 1999;33:461-70).

동맥 내막 절제시, 경동맥을 열고, 열린 영역의 혈관으로부터 플라크를 제거한다. 수술시, 환자의 목을 절개하여 경동맥 분기를 노출하고, 폐색의 어느 한쪽에 클램프를 두어 이를 고립시키고, 절개하여 동맥을 개방하였다. 폐색을 제거하고, 고립된 영역을 세척 및 흡인하고, 동맥을 봉합 폐쇄하였다. 클램프를 제거하여 동맥에 다시 혈액이 흐르도록 한다. 경동맥이 개방된 후, 클램프 내에 고인 색전 및 파편으로 인해 미리 고립시킨 영역으로 혈액이 흘러, 큰 문제가 야기될 수 있다.

동맥 내막 절제는 효과적인 치료법이지만, 이로 인해 외막 및 응괴형성 내피하층의 상당한 영역이 노출되는 경우가 많다. 경동맥 내막 절제의 효과에도 불구하고, 수술시 혈전증을 포함하는 합병증 및 합병증을 일으키는 혈관 내막 증식 발생이 일어나, 개입의 잇점이 상쇄되거나 새로운 문제가 발생할 수 있다.

임상적인 연구를 통해, 후 경동맥 내막 절제 발작률은 수술 후 단기간 내에 1-10%에 달했고, 이의 거의 대부분은 동맥 내막 절제 부위에서의 혈전 형성 및 이에 따른 뇌전색 때문이다(Stroke 1984; 15;950-55). 혈소판 축적은 또한 혈관 내막 증식 발생으로 인한 재발협착증을 일으킬 수 있는데, 이는 수술 후 2년 이내에 발생할 수 있다. 재발협착증은 수술 2-5년 후에 모든 동맥 내막 절제된 환자 중 10-20%에서 발생하는 것으로 보고되었고, 이중 대부분은 혈관 내막 증식, 혈관 내막 비후화 및 혈관 직경 감소 때문이라는 것이, 경동맥 이중 초음파 스캐닝에 의해 증명되었다(J. Vasc. Surg. 1986;3:10-23).

기계적으로 유도된 외상, 외과적 개입, 스텐트 설치, 혈관 이식편(예를 들어 투석 이식편과 같은 동맥 또는 동정맥 이식편) 설치에 대한 혈관벽의 세포 및 분자 반응은, 외상이 일어나자마자 발생하는 염증, 평활근 세포 이동, 증식 및 근섬유아세포 변형의 복합적인 상호작용이다(Futura; 1997. p.289-317). 동맥이 질병으로 인해 심하게 손상되고, 아마도 칼슘 퇴적으로 인해 경화되면, 개입은 콜라겐 및 엘라스틴과 같은 원(underlying) 세포외 매트릭스 성분의 노출 및 국부적인 비-동맥 내막 절제(de-endothelialisation)와 함께 어느 정도의 부가적인 손상을 일으킬 수도 있다. 이 때, 일부 환자에게서는 혈소판 및 피브리노겐이 과도하게 보충되어 급성 혈전형성 폐색이 일어날 수 있다.

동맥 내막 절제 래트의 경동맥 모델(Neurosurg 1985; 16:773-79) 및 색전전출 벌룬 손상 모델(Lab. Invest 1983; 49:327-33)을 사용한 연구를 통해, 혈관 손상동안 내피 세포가 벗겨짐에 따라, 노출된 내피하에 혈소판이 부착되기 시작하는것으로 밝혀졌다. 주사 전자 현미경을 사용하는 문헌{Spallone et al.(Neurosurg 1985; 16:773-79)}에 따르면, 래트에서 경동맥 내막 절제의 5분 후에 손상된 영역 상에 혈소판의 단일층이 형성되는 것으로 밝혀졌다. 손상 15분 후에는 혈소판 응집 및 혈전 형성이 관찰된다. 동맥 내막 절제의 30분 후에는 이 부위가 활성화된 혈소판으로 덮이고 피브린 및 적혈구 세포로 코팅된다. 손상 3 시간 후에는 혈전 형성이 최고조에 다다르고, 두꺼운 피브린-혈소판층이 관찰된다. 혈소판은 이러한 혈전 형성 및 이에 따른 혈전증의 필수 성분이지만, 혈관 내막 증식을 발생시키는 역할도 하는 것으로 보인다.

혈소판 감소 래트를 사용한 연구를 통해, 대조구 래트와 비교하여 경동맥 손상 후 혈관 내막의 비후화된 부분이 크게 줄어드는 것이 또한 증명되었다(Proc. Natl. Acad. SCI USA 1989; 86:8412-16). 혈소판이 일단 손상된 혈관의 노출된 내피하에 부착되면, 이들은 활성화되어 과립을 방출한다. 이들 과립은 혈관작용 및 혈전형성 인자(세로토닌, ADP, 피브리노겐, 폰 빌레브란트 인자, 트롬복산 A2) 및 성장 인자(혈소판 유래 성장 인자, 형질전환 성장 인자-β, 및 표피 성장 인자)를 함유한다(Circulation 1985;72:735-40). 혈소판이 혈관 내막 증식 발생을 높이는 정확한 메카니즘은 아직 완전히 알려지지 않았다. 연구를 통해, 혈관 내막 증식이 발생하는 제 2 단계동안 혈소판은 내측 평활근 세포가 혈관 내막 쪽으로 이동하도록 화학주성 자극을 제공하는 것으로 제시된다(Vasc. Surg. 1991;13:885-91). 항-PDGF 항체를 사용한 다른 연구에서, 혈관 손상 후의 신혈관내막(neointimal) 평활근 세포 축적에 PDGF가 필수적 역할을 하는 것으로 증명되었다(Science1991;253:1129-32). 혈소판이 혈관 내막 증식 발생을 높일 수 있는 다른 메카니즘은 손상 부위에서의 응고 캐스케이드의 활성화 및 연이은 트롬빈 축적을 통한 것이다. 몇몇 연구를 통해 트롬빈이 평활근 세포에 미치는 유사분열촉진 효과가 증명되었다(J. Clin. Invest. 1993; 91:94-98, J. Vasc. Surg. 1990; 11:307-13). 또한, 트롬빈은 혈소판 활성화에 대한 자극이 되는 것으로 나타났다. 정확한 메카니즘과 상관없이, 혈관 손상 부위에서의 혈소판 부착 및 활성화는 혈전증 및 혈관 내막 증식 발생에 중요한 역할을 하며, 이에 따라 혈소판 부착 및 활성화를 저해하면 혈전증률 및 혈관 내막 증식 발생을 방해 또는 감소시킬 수 있다.

손상된 동맥 벽에 대한 혈소판 부착은 우선 먼저 내피 세포로부터 방출되어 혈장에서 순환하는 다량체 당단백질인 폰 빌레브란트 인자(vWF)에 의해 매개되는데, 이는 인자 VIII의 담체 단백질 역할을 한다(Annu. Tev. Biochem. 1998;67:395-424). 고도로 다량체화된 vWF는 또한 혈소판 α-과립 내에 함유되어 순환하고, 혈소판이 활성화된 후에 이로부터 방출된다(Annu. Tev. Biochem. 1998;67:395-424). 아테로마성 플라크 또는 기계적 개입 부위의 동맥에서와 같은 상승된 전단 조건 하에서, vWF는 이의 A3 도메인을 통해 표면-노출된 콜라겐 섬유에 결합할 수 있다(Biochemistry 1986;25(26):8357-8361, Blood 1987;70(5):1577-1583, J. Biol. Chem. 1987;262(28):13835-13841 ). 이어서 콜라겐-결합된 vWF는 차례로 vWF-A1 도메인에서 에피토프의 전단-의존성 노출을 통해 "사슬(tethers)" 혈소판에 결합하고, 혈소판 GPIb/IX/V와 상호작용한다(Blood 1985;65(1):85-90, Blood 1985;65(4): 823-831, Br. J. Haematol 1986;63(4):681-691). 따라서, vWF는 콜라겐 및 혈소판간의 다리로 작용하고, 흐름 중인 콜라겐에 혈소판이 부착하는데 꼭 필요하다(J. Lab. Clin. Med. 1974;83(2):296-300). 그러나, vWF 상에서의 혈소판 회전으로 인해 부착이 약하고, 영구적인 혈소판 부착, 활성화 및 응집을 위해서는 혈소판 표면 상의 다른 수용체 및 콜라겐 간의 부가적이고 직접적인 상호작용이 필요하다(Thromb. Haemost 1997;78(1):434-438, Thromb. Haemost 1997;78(1):439-444). 혈소판 상의 직접적인 콜라겐 수용체에는 GP VI(Blood 1987;69(6):1712-1720, Thromb. Haemost 1999;81(5):782-792, J. Clin. Invest. 1989;84(5):1440-1445), GP Ia/IIa(α₂/β₁)(J. Clin. Invest. 1989;84(5):1440-1445, Nature 1989;264(13):7576-7583), 다소 덜 중요하게는 GP IV(CD36)(J. Biol. Chem. 1989;264(13):7576-7583) 및 p65(J. Clin. Invest. 1997;100(3):514-521)까지도 포함된다. vWF-보조(assisted) 혈소판 결합이 없는 경우, 이들 수용체는 흐름 중인 콜라겐에 대한 혈소판 보충을 너무 약하게 매개하는 것으로 판명되었다(Br. J. Haematol 1986;63(4):681-691). 마지막으로, 피브리노겐과 결합된 vWF는 혈소판 GP IIb/IIIa에 대한 결합을 통해 혈소판의 가교결합 및 추가적으로 활성화를 도와((J. Clin. Invest. 2000;105(6):783-791), 생성된 혈전에 대한 강도 및 안정성을 제공한다.

최근 혈소판 GP IIb/IIIa 및 ADP 수용체 길항제가 나타나면서, 항-응집 치료법에 큰 진보가 있었다(Coronary Art dis 1999;10(8):553-560, J. Am. Coll. Surg. 2000;191(1):76-92). 그러나, 이들 방법은 노출된 콜라겐 섬유에 대한 혈소판의초기 부착을 저해하고자 고안된 것이 아니며, 혈소판-혈소판 상호작용을 약화시키는 GP IIb/IIIa 길항제의 효능에도 불구하고, 혈소판은 여전히 손상된 혈관 벽에 부착된다(Blood 1993;81(5):1263-1276, Circulation 1995;91(5):1354-1362). 또한, 혈소판 활성화는 거의 확실히 응집 및 급성 혈전증을 지나 계속되어, 혈소판 활성화에 의해 방출되는 혈소판-유도된 성장 인자(PDGF)와 같은 유사분열촉진 매개체에 의해 적어도 부분적으로 영향을 받아 아급성 및 만성 혈관 내막 증식으로 진행한다. 실제, PDGF 저해는 다양한 동물 종에서 혈관 내막 증식을 감소시키는 것으로 증명되었다(Science 1991;253(5024):1129-1132, Circulation 1999:99(25):3292-3299).

급성 심근경색 환자에게서 순환하는 vWF가 증가하고(Thromb Haemost 2000:84:204-209, Circulation 1998;98(4):294-299), vWF 수준이 나쁜 연이은 예후와 관련됨에 따라(Circulation, 1998;98(4):294-299), vWF의 병태생리학적 중요성이 제안되고 있다. 생체 내 연구를 통해 또한, 항-vWF 항체를 무력화하면 실험적 혈전증이 저해되어, vWF가 혈전 형성에서 필수적인 역할을 하는 것으로 확인되었다(Thromb. Haemost 1998;79(1):202-210). 또한, 급성 관상동맥 증후군에서 혈관성형술을 훨씬 더 광범위하게 사용하면서(이를 통해 예외없이 혈관벽 손상 및 콜라겐 노출이 발생한다), 혈소판 부착-활성화-응집 캐스케이드동안 가능한 한 빨리 약리학적으로 개입하는 방법에 대한 필요성이 증대되고 있다.

혈소판 부착, 활성화 및 연이은 혈전증 및 혈관 내막 증식을 조절하기 위하여 현재 사용되고 있는 두가지 주된 치료 방법은 항-혈소판제 및 항-혈전제를 투여하는 것이다. 아스피린과 같은 약제가 사이클로옥시제나제 경로를 저해함으로써 트롬복산 A2의 합성을 효과적으로 차단할지라도, 콜라겐-유도된 혈소판 부착 및 활성화를 방해하지는 않으며, 혈관 내막 증식 발생을 자극한다. 항혈전제로서 헤파린을 사용하면 합병증, 및 예상할 수 없는 투여량 반응, 근접한 실험실 모니터링, 응괴 결합된 트롬빈에 대한 제한된 활성, 다중 저해 부위, 항트롬빈 III 의존성, 위중한 출혈의 위험성 및 연속적인 주입의 필요성을 포함하는 제약이 있다. 명백히, 부위 특이적이며 국부화된 효과를 갖고, 전신에 분배되거나 전신화된 응고장애가 없는 치료제가 이상적인 치료제이다.

혈전증 및 이후의 혈관내막 증식을 일으키는 사건의 캐스케이드를 촉진시키는 필수 단계는, 혈관 손상 부위에 노출된 내피하 콜라겐 및 노출된 콜라겐에 부착하는 혈소판 단일층 간의 상호작용으로부터 유래하는 것이 명백하다. 따라서, 내피하 콜라겐 부착에 대한 혈소판의 특이적 저해제는 혈전 생성 및 혈관내막 증식을 방해하거나 적어도 감소시킬 수 있다.

몇가지 거머리-유래 물질이 콜라겐-혈소판 상호작용을 저해하는 것으로 보고되었다(Blood 1995; 85(3):705-711, Platelets 2000; 11(2):83-86, J. Biol. Chem. 1992;267(10):6893-6898, J. Biol. Chem. 1992; 267(10):6899-6904, Blood Coagul Fibrinolysis 1991, 2(1):179-184). 히루도 메디시날리스(Hirudo medicinalis)로부터 분리된, 피브린 해중합(depolymerising) 활성을 갖는 이소펩티다제인 데스터빌라제(destabilase)는, 콜라겐을 포함하는 다양한 작용물질에 의해 유도되는 혈소판 응집을 저해하는 것으로 보고되었지만, 혈소판 막에 직접 결합하는 것으로 생각된다(Platelets 2000; 11(2): 83-86). 해멘테리아 오피시날리스(Haementeria officinalis)의 침에서 유래하는 ~13kDa 단백질인 거머리 항혈소판 단백질(LAPP)은 정지 상태(J. Biol. Chem. 1992;267(10):6899-6904, Thromb. Haemost 1999, 82(3):1160-1163) 및 상승된 흐름(Arterioscler Thromb. Vasc. Biol. 1995, 15(9):1424-1431)하에서 콜라겐에 대한 혈소판의 부착을 저해하고, 콜라겐에 대한 vWF- 및 혈소판 GP Ia/IIa-매개된 결합에 모두 작용한다(Thromb. Haemost 1999, 82(3):1160-1163). 칼린은 유사한 프로파일이 나타나는 히루도 메디시날리스 유래의 ~65kDa 단백질이다. 칼린은 또한 정지 및 흐름 조건 모두에서 콜라겐-혈소판 상호작용을 저해한다(Blood 1995; 85(3):705-711, Blood Coagul Fibrinolysis 1991, 2(1):179-184, Thromb. Haemost 1999, 82(3):1160-1163). 또한, LAPP 및 칼린은 모두 콜라겐-유도된 혈소판 응집의 강력한 저해제로, 콜라겐에 대한 vWF의 결합을 차단하는 농도와 유사한 농도에서 응집을 저해한다(J. Biol. Chem. 1992; 267(10):6893-6898, Blood Coagul Fibrinolysis 1991, 2(1)L 179-184, Blood 1995, 85(3):712-719).

LAPP 및 칼린은 모두 생체내 혈전증 모델 중에서 평가되었고, 성공적인 면과 실패한 면이 있었다. LAPP는 콜라겐-유도된 혈소판 응집을 저해하는 투여량을 사용했음에도 불구하고, 비비 동정맥 션트의 콜라겐-코팅된 이식편 상의 혈전 형성을 감소시키지 못한 반면(Arterioscler Thromb 1993, 13(11): 1593-1601), 칼린은 정맥 혈전증 햄스터 모델에서 투여량-의존적으로 혈전 형성을 저해하였다(Blood 1995, 85(3):712-719).

스텐트 및 카테터의 비 응고형성 및 항 응괴형성 코팅은 본 기술분야에 공지되어 있다. 비 응고형성 코팅 및 생성물은 변형 및 고급 중합체를 기본으로 하며 WO9301221 및 WO9830615에 예시되어 있다.

항 혈전형성 및 항 재발협착증 코팅은 일반적으로, 국부적 약제 전달용 저장소 역할도 할 수 있는 생체적합성 코팅이다. 이 코팅은 주로 하이드로겔을 기본으로 하며, 다양한 형태의 하이드로겔을 제조하고 의료 기구를 코팅하는 방법이 WO9211896, WO9811828, WO0147572, EP0887369 및 WO0139811을 포함하는 특허문헌에 예시되어 있다.

코팅에 함유되어 있는 치료 물질의 방출 프로파일은, 예를 들어 중합체 층의 두께를 변화시키거나, 선택된 물리화학적 특성(전하, 소수성, 친수성 등)을 부여하는 특이적 중합체 코팅을 선택하거나, 및/또는 코팅을 다른 층으로 제조함으로써 조절할 수 있다. 중합체의 선택 기준 및 방출 속도의 최적화는 당업자에게 알려져 있다. 다른 코팅이 문헌{Fischell (Circulation, 1996, 94:1494-95), Topol et al(Circulation, 1998, 98:1802-20) 및 McNair et al in device Technology, 1996, 16-22}에 기재되어 있다.

스텐트, 와이어 및 카테터를 심장혈관계에 사용하는 것은 관행이며, 외과적 개입 또는 카테터 삽입 중 및 후에 심장학자의 주된 관심사는 혈관벽 손상, 색전형성 및 연이은 재발협착증이다. 동맥 내막 절제와 같은 다른 방법은 유사한 문제를 일으킨다. 동맥을 조작하는 모든 방법, 즉 관상동맥 수술 및 혈관성형은 혈관 내막 증식이 발생하기 쉽다. 혈관 내막 증식의 발생을 예방하거나 줄이는 방법의 유용성을 지나치게 강조할 수는 없으며, 전신성 효과 없이 이를 행할 수 있는 방법의 이점을 보다 더 인정한다.

따라서, 병태생리 상의 최초 사건(예를 들어 혈소판 부착)을 저해하는 신규하고 개선된 약제 및 방법이 명백히 요구되며, 혈관성형 또는 외과적 방법과 관련있는 이환율 및 사망율을 실질적으로 감소시키는데 이 분야에서 기여할 것으로 기대된다.

본 발명은 동맥 내막 절제와 같은 혈관 손상 후의 혈소판 부착 및 축적을 크게 감소시키는 사라틴이라는 폴리펩티드의 효과에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상승된 전단 조건 하에서의 혈소판의 혈관벽 콜라겐에 대한 vWF-의존성 결합 저해에 관한 것이며, 더 구체적으로는, 혈전증 저해제로서의 사라틴의 신규한 의학적 용도에 관한 것으로, 상기 폴리펩티드는 국부제 또는 의료 기구용 코팅으로서 국부적으로 사용될 수 있다.

도 1은 인간 콜라겐 타입 I (○) 및 III(□), 및 송아지 피부 콜라겐(△)에대한 정제된 인간 vWF의 결합에 미치는 사라틴의 효과. IC₅₀은 타입 I=0.23±0.004㎍㎖^-1, 타입 III=0.81±0.04㎍㎖^-1및 송아지 피부 콜라겐=0.44±0.008㎍㎖^-1.

도 2는 생체외 흐름 챔버에서 인간 콜라겐 타입 III 상의 혈소판 응집 형성의 사라틴에 의한 저해에 미치는 전단의 효과. ○는 전단 속도 2700s^-1(IC₅₀=0.96±0.25㎍㎖^-1)을 나타내고, □는 전단 속도 1300s^-1(IC₅₀=5.2±1.4㎍㎖^-1)을 나타낸다.

도 3은 표면 플라스몬 공명으로 검출된, 고정화된 인간 콜라겐에 대한 사라틴 결합의 스캐차드(Scatchard) 분석으로, 콜라겐 III 상에 사라틴에 대한 고친화(K_d=5×10^-8M, 실선) 및 저친화(K_d=2×10^-6M, 점선) 결합 부위가 존재함을 나타낸다.

도 4는 사라틴 적용(n=7) 및 대조구(n=10)를 비교한 경동맥 내막 절제 3시간 후 노출된 내피하 표면에 부착되는 혈소판의 수. 데이타는 평균±SE이다. 사라틴 그룹은 5㎕의 사라틴 용액을 투여하였고, 노출된 내피하 표면에 국부적으로 적용하였다. 별표는 0.05의 P 값을 나타낸다.

도 5는 사라틴 적용(n=9) 및 대조구(n=10)를 비교한 경동맥 내막 절제 24시간 후 노출된 내피하 표면에 부착되는 혈소판의 수. 데이타는 평균±SE이다. 주사 전자 현미경을 사용하여 혈소판을 계수하였다. 사라틴 그룹은 5㎕의 사라틴 용액을 투여하였고, 노출된 내피하 표면에 국부적으로 적용하였다. 별표는 0.01의 P 값을 나타낸다.

도 6은 경동맥 내막 절제 3시간 후의 동맥 내막 절제된 래트의 경동맥의 전자 현미경 사진(2000 ×). A:대조구 표면, B:국부적 사라틴 투여 표면(5㎕). 대조구 표면에는 피브린 가닥, 적혈구 세포 및 혈소판을 포함하는 많은 세포 구성요소가 보인다. 사라틴 처리된 표면은 세포 구성요소가 크게 감소하는 것으로 나타난다.

도 7은 경동맥 내막 절제 24시간 후의 동맥 내막 절제된 래트의 경동맥의 전자 현미경 사진(2000 ×). A:대조구 표면, B:국부적 사라틴 투여 표면(5㎕). 대조구 표면에는 다수의 적혈구 세포 및 혈소판이 보인다. 사라틴 처리된 표면은 혈소판 부착이 크게 감소하는 것으로 나타난다.

도 8은 경동맥 내막 절제 2주 후의 혈관 내막 증식에 파생되는 % 내강 협착증. 사라틴(n=15) 및 대조구(n=10)를 도시한다. 사라틴 그룹은, 노출된 내피하 표면에 5㎕의 사라틴 용액을 국부적으로 적용하였다. 별표는 0.004의 P 값을 나타낸다.

도 9는 래트의 미처리 대조구(A)와 비교하여 사라틴 처리 동맥(B)에서의 혈관 내막 증식 감소를 보여주는 경동맥의 횡단면. IH=혈관 내막 증식.

인간 콜라겐 타입 I 및 III, 및 송아지 피부 콜라겐에 부착하는 다양한 종으로부터 PRP의 혈소판 부착을 저해하기 위해 필요한 사라틴의 IC₅₀의 농도.

혈장 공급원	사라틴 IC₅₀(㎍㎖^-1)
혈장 공급원	콜라겐 타입 I	콜라겐 타입 III	송아지 피부 콜라겐
인간돼지햄스터쥐	0.20.20.40.1	0.90.5n.t.0.6	0.30.57.00.3

표시된 최종 시약 농도에서 다양한 작용물질에 의해 유도된 PRP의 최대 혈소판 응집(%)에 사라틴이 미치는 효과.

작용물질	표시된 사라틴 농도(㎍㎖^-1)에서의 응집(%)
작용물질	0	10	20	40	200
콜라겐(0.5㎍㎖^-1)	62	67	63	64	0
ADP(2.5μM)	66	64	69	82	88
리스토세틴(0.9㎎㎖^-1)	61	67	75	63	n.t.
아라키돈산(1.0mM)	66	66	67	57	n.t.
U46619(1.0μM)	66	65	57	56	n.t.

수술전 및 수술후 출혈 시간 및 혈소판 수

시간	조건	혈소판 수	출혈 시간
수술 전	대조구	752±36.05×10³	11.9±.91분
수술 전	사라틴	829±33.85×10³	8.6±.62분
3시간	대조구	604±34.2×10³	10.8±.9분
3시간	사라틴	590±76×10³	9.1±.5분
24시간	대조구	694±117×10³	12.9±1.1분
24시간	사라틴	729±19×10³	11.5±1.3분

일반적으로, 본 발명은, 사라틴이 국부제로서 또는 표면 상의 부착 코팅으로서 국부적으로 사용되어, 혈관성형, 스텐트, 투석 이식편 및 다른 혈관 이식편과 관련있는 손상을 포함하는 혈관벽 손상에 대한 바람직하지 못한 혈전형성 및/또는 재발협착증 반응을 방해 및 저해할 수 있는 조건 하에서, 조직의 내강(즉, 맥관계) 또는 기관의 속 또는 위의 선택된 위치 속 또는 위에, 앞서 기재한 혈소판 부착 저해제인 사라틴을 도입하여, 양성 비대 흉터 형성을 치료하고, 불안정한 아테로마성 동맥경화 플라크를 치료 및 패시베이션(passivation)하는 것을 포함한다.

사라틴은 원래 거머리로부터 분리된, 앞서 기재한(WO0056885) 재조합 12kD 단백질이다. 이 단백질은 상승된 전단 조건 하에서 혈소판의 동맥벽 콜라겐에 대한 vWF-의존성 결합을 저해하는데, 본 발명의 이러한 면은 사라틴을 동맥 혈전증을 저해하기에 적합하게 한다. 다른 신규한 면으로, 사라틴을 손상 부위에 국부제로 사용하여 전신성 효과 없이 혈전증 및 혈관 내막 증식을 감소시킬 수 있다. 이는 외과의사 및 개입 방사선과전문의사 모두가 한결같이 사용하기에 매우 적합한 특이적 및 국부적 효과를 갖는 양상을 보인다.

사라틴은 혈장 전달하기 위하여 다양한 치료제와 결합될 수 있다. 관상동맥에 사용하는 예로는, 예를 들어 프로스타사이클린 및 살리실레이트와 같은 항혈전제, 예를 들어 스트렙토키나제, 유로키나제, 조직 플라스미노겐 활성제(TPA) 및 아니솔레이트화된 플라스미노젠- 스트렙토키나제 활성화제 복합체(APSAC)와 같은 혈전용해제, 질산염, 칼슘 채널 차단 약제와 같은 혈관확장제, 콜키신 및 알킬화제와 같은 항증식제, 삽입제, 인터류킨, 형질변환 성장 인자-β 및 혈소판 유래 성장 인자류와 같은 성장 조절 인자, 성장 인자에 대한 모노클로날 항체, 항-염증제, 스테로이드 및 비-스테로이드 모두와, 혈관 건강 상태(tone), 기능, 동맥경화증, 및 개입 후의 혈관 또는 기관 손상에 대한 치유 반응을 조절할 수 있는 다른 약제를 들 수 있다. 본 발명에 포함되는 조합물 또는 코팅 중에 항생 물질이 포함될 수도 있다. 또한, 혈관벽 내 병소에 약제학적 전달을 위하여 코팅을 사용할 수 있다. 팽창성 중합체 중에 활성제를 혼합하면, 중합체가 팽창할 때 활성제가 방출될 것이다.

일실시형태에서, 코팅은 폴리-에틸렌 옥사이드, 알부민, 친수성 폴리-메타크릴레이트 및 친수성 폴리 우레탄과 같은 하이드로겔로 만든다.

본 발명은 또한, 예를 들어 국부 약제 전달 장치/카테터 또는 스텐트 및 스텐트 코팅 및 혈관 이식편 및 이식편 코팅 기술을 통한 사라틴 및 유도체의 용도를 제공한다. 본 발명은 또한 국부화된 영역에 시간 경과에 따라 조절된 양의 사라틴을 용출시키는 조성물로 사라틴을 투여하는 방법을 제공한다.

특히, 본 발명의 일실시형태는 사라틴을 국부적으로 전달하는 카테터-계 장치의 용도에 관한 것이다. 사라틴은 또한 다른 약제학적 제제와 함께 또는 단독으로 카테터를 사용하여 중합체 기질로부터 신체 조직에 적용할 수 있다. 본 발명의 방법에 사용가능한 중합체 물질의 기본적 요건은, 특이적 적용에 적합할 수 있는 약제 방출 특성 및 생체 적합성이다.

투과 단독, 이온삼투요법 단독, 일렉트로포레이션(electroporation) 단독, 또는 조합된 이온삼투요법으로 국부 조절된 사라틴 방출이 가능하며, 일렉트로포레이션을 사용하여 사라틴을 혈관 내강 속에 효과적으로 방출 및 투입할 수 있다. 바람직하게는, 고농도의 약제가 선택된 혈관의 공간에 보유되어, 결과적으로 사라틴 단독 또는 추가의 치료제를 포함하는 개선된 혈관 코팅이 얻어질 수 있도록 고안된 방법을, 카테터를 사용하여 실시할 수 있다.

본 발명은 특히 혈관성형 및 스텐트 이식 및 동맥 내막 절제와 같은 개입 심장학 방법 중 및 후에 사라틴을 국부 전달하기 위하여 사용할 수 있다.

본 발명에 사용하기 위한 적당한 재조합 사라틴은 한세뉼라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)로부터 발현 및 분리되었고, 콜라겐에 대한 vWF 결합을 차단함으로써 작용하며, 상승된 전단 하에 콜라겐에 대한 혈소판의 부착을 효과적으로 저해하는 것으로 밝혀졌다. 사라틴은 인간 타입 I 및 III 콜라겐(각각 IC₅₀=0.23±0.004 및 0.81±0.04㎍㎖^-1)과 송아지 피부 콜라겐(IC₅₀=0.44±0.008㎍㎖^-1)에 대한 정제된 인간 vWF의 결합을 투여량-의존적으로 저해하였다. 또한, 사라틴은 이들 콜라겐에 대한 인간, 설치류 및 돼지 혈장 vWF의 결합에 대하여 유사한 저해 효과를 보였다. 상승된 전단 조건(2700s^-1) 하의 흐름 챔버에서, 사라틴은 투여량-의존적 및 강력하게 콜라겐-코팅된 표면 상에서 혈소판 응집의 형성을 저해하였으나(IC₅₀=0.96±0.25㎍㎖^-1), 감소된 전단 조건(1300s^-1) 하에서는 투여량-반응 곡선 중에 오른쪽으로의 이동이 나타났다(IC₅₀=5.2±1.4㎍㎖^-1). 표면 플라스몬 공명 분석을 통해 인간 콜라겐 타입 III 상의 고친화 및 저친화 결합 부위가 모두 밝혀졌고(각각 K_d=5×10^-8M 및 2×10^-6M), 증가된 전단 하에서 혈소판 부착을 저해한 저농도의 사라틴(즉, 고친화 결합 부위의 포화)이 vWF-독립적으로 콜라겐-유도된 혈소판 응집에 작용하지 않았더라도, 고농도(즉, 저친화 결합 부위의 포화)는 혈소판 응집을 저해하는 것으로 밝혀졌다. 이들 데이터를 통해, 사라틴은 항-혈전제로서의 치료적 잠재력의 기본인, 콜라겐에 대한 vWF-의존성 혈소판 부착의 강력한 저해제임이 증명된다.

연구를 통하여 또한, 사라틴이 송아지 피부 콜라겐 뿐 아니라 인간 콜라겐 타입 I 및 III(이들은 모두 동맥 벽 내피하층에 풍부하며 혈소판-혈관벽 상호작용에 있어 중요한 것으로 생각된다)에 대한 vWF의 결합을 강력하게 투여량-의존적으로 저해한다는 것이 증명되었다(Thromb Haemost 1997, 78(1):434-438). 콜라겐-vWF-GP Ib/IX/V 상호작용은 충분히 상승된 전단에서만 일어나므로, 본 발명의 중요한 일면은 정지 상태 하에서 뿐 아니라 생체내 상태와 훨씬 더 유사한 환경에서의 사라틴의 효능을 증명하는 것이었다. 이러한 환경을 모방하기 위하여 전단력을 변화시킬 수 있는 흐름 챔버에서, 사라틴은 특히 고전단에서 콜라겐에 대한 혈소판의 축적을 확실히 저해하였다. 전단 감소 결과로서의 투여량-반응 곡선의 오른쪽 이동은, 생체내에서 사라틴의 효능이 고전단 영역에 편재될 수 있다는 것을 암시하므로 주목할 만 하고, 이 때, 판상 혈류(laminar blood flow)의 파괴는, 예를 들어 아테로마성 동맥경화 플라크의 존재시 또는 기계적 개입 후에 혈액에서 일어나는 내피 표면 변화의 결과이다.

사라틴의 표면 플라스몬 공명 연구를 통해, 콜라겐이 하나는 저친화도이고 하나는 고친화도인 두개의 독립적인 사라틴에 대한 결합 부위를 가질 수 있는 것으로 밝혀졌다. 사라틴에 의한 콜라겐에 대한 vWF 결합의 저해는 고친화 결합 부위의 포화로 설명되며, IC₅₀값은 약 5×10^-8M, 즉 이 부위의 해리 상수와 같다. vWF-독립적으로 콜라겐-유도된 혈소판 응집은 매우 높은 투여량의 사라틴(100μM 이상)으로만 저해되었으므로, 저친화 콜라겐 결합 부위의 포화는 직접적인 콜라겐-콜라겐 수용체 상호작용의 저해와 관련있는 것으로 보인다.

본 발명의 다른 목적은 또한, 전신 분배를 필요로 하지 않고 혈소판의 기능을 변화시키거나 응고를 변화시키지 않고 동맥 내막 절제된 혈관의 국부 환경에 영향을 주는 사라틴의 효과에 관한 것이다. 이를 통해, 혈관 수술 및 개입 방사선 물질 함유 절차동안 이상적인 국부 적용 양태가 가능하다.

본 발명의 이러한 실시형태에서, 앞서 기재한(J. Vasc. 1998, 28:909-918) 래트 경동맥 내막 절제(CEA) 모델을 사용하여 사라틴의 치료 효과를 조사하였다. PLT 활성화가 CEA 후 IH로 인한 혈전증 및 재발협착증의 개시 단계인 것으로 생각된다. 내강 표면 상에 사라틴을 국부 적용하면 동맥 내막 절제된 동맥에 대한 혈소판의 부착량이 감소하고, 따라서 수술후 혈전증 및 IH가 감소하는 것으로 관찰되었다.

실험 결과를 요약하고자, 수술 후 다른 두 경과시간에 사라틴 항 혈소판 부착 효과를 평가하면, 대조구 래트와 비교하여 사라틴으로 처리한 래트에서 경동맥 내막 절제 3시간 후(도 4) 및 24시간 후(도 5)에 부착 혈소판 수가 크게 감소한 것으로 나타났다.

혈소판 부착은 3시간에 59%(그리드 당 64±17.2 vs 155±33.4 PLT P=0.05) 및 24 시간에 77%(그리드 당 35±11.3 vs 149±36.6 PLT P=0.0110) 감소하였다. 혈소판 부착은 3시간 및 24시간에 대조구에서 비슷하였으나 사라틴 처리된 그룹에서는 그리드 당 64 내지 35 혈소판으로 감소되었다.

도 6 및 7에 2000×배율의 주사 전자 현미경을 사용하여 국부 사라틴이 있거나 없는 경우의 동맥 내막 절제된 표면의 일반적인 상태를 도시한다. 도 6A는 경동맥 내막 절제 3시간 후의 대조구 표면을 도시한 것으로, 명확히 나타나는 매우 풍부한 세포 물질, 피브린 가닥, 다수의 적혈구 세포 및 다수의 혈소판을 나타낸다. 도 6B는 경동맥 내막 절제 3시간 후의 사라틴 처리된 표면을 도시한 것이다. 거의 아무것도 없는 콜라겐 표면 및 세포 요소의 결핍이 나타난다. 도 7A는 경동맥 내막 절제 24시간 후의 대조구 표면을 도시한 것으로, 혈소판은 작은 백색 점이다. 도 7B는 경동맥 내막 절제 24시간 후의 사라틴 처리 표면을 도시한 것이다. 사라틴 처리를 통해 혈소판 부착이 확실히 감소한다.

경동맥 내막 절제 후 국부적으로 사라틴을 적용하면 혈관 내막 증식 발생이 대조구와 비교하여 크게 감소하였다. 사라틴을 적용하면 대조구에 비해 IH 척도로서의 % 내강 협착이 크게 감소하였다. 이러한 IH 형성의 감소는 PLT 부착 저해와 관계되었다. 내강 협착의 견지에서, 대조구 래트는 29.8±6.8%, p=0.0042 내강 협착을 보였으며, 사라틴 처리구는 10.9±1.8% 내강 협착을 보였다(도 6). 사라틴 처리 래트는 대조구 래트보다 내강 직경이 18.9% 컸다. 경동맥 내막 절제 2주 후, 15마리의 대조구 래트 중 5마리(15%)에서 조직학 분석시 경동맥의 완전한 혈전이 발생하였고, 15마리의 사라틴 처리 래트 중 0마리(0%)에서 경동맥 혈전증이 발생하였다. 가능성비 카이 스퀘어 분석(likelihood ratio Chi Square analysis)을 통해 승산비는 16.238로 나타났으며, 이는 대조구의 폐색 혈전증 가능성이 사라틴 처리 래트보다 16배 더 높다는 것을 보여준다, P=0.0156.

사라틴 그룹의 동맥 봉합선을 따라 출혈 증가는 없었다. 출혈 시간 및 전신 혈소판 수는 동맥 내막 절제 3시간 및 24시간 후에 대조구 래트에 비해 사라틴 처리 래트에서 크게 변화되지 않았다.

CEA 모델은 인간 CEA 수술과 매우 유사하므로, 그 결과를 통해 혈소판 기능에 전신적으로 영향을 주거나 지혈을 감소시키지 않고, 동맥 내막 절제 부위에서의 혈소판 부착 및 응집의 유해 효과를 감소시키는 메카니즘이 제시된다. 래트 CEA동안 사라틴을 간단히 국부적으로 적용하면 혈관내막 증식으로 인한 경동맥 상에서의 혈소판 부착, 응집 및 연이은 재발협착증이 감소한다.

표 3에 출혈 시간 및 혈소판 수의 결과를 나타낸다. 수술 전 및 수술 후의 출혈 시간 간에는 통계적으로 유의성있는 차이가 없었다. 사라틴 및 대조구 래트 간의 혈소판 수는 통계적으로 유의성 있는 차이가 없었다.

동맥 내막 절제와 유사한 혈관 손상 후에 혈소판 부착 및 축적이 크게 감소하는 것으로 나타났다. 동맥 내막 절제 직후(3시간) 및 24시간에 모두 혈소판 부착이 감소된다. 24시간에서의 효과가, 콜라겐에 대한 사라틴의 직접적인 저해 효과에 기인하는 것이 아니라(사라틴의 혈청 반감기는 90분), 초기의 혈소판 응집 저해 및 이후의 혈소판 활성화 캐스케이드의 붕괴에 기인하는 것으로 생각된다는 점에서, 이러한 효과는 상당한 것이다. 일단 초기에 혈소판의 노출된 콜라겐 대한 부착이 저해되면, 혈소판 캐스케이드가 진행될 수 없다. 도 4 및 5는 최근 손상된 혈관 상에 사라틴을 국부 적용하면 혈소판 부착이 상당히 저해될 수 있음을 증명한다. 사라틴은 3 및 24시간에 각각 혈소판 부착을 60% 및 75% 저해하였다. 3시간 및 24시간(도 7 및 8)에서 모두, 대조구 및 사라틴 처리된 동맥 간의 세포 요소 침착의 가시적인 차이에서 이러한 저해가 나타난다. 혈소판 부착 저해로 인해, 이와 같이 세포 반응이 없게 된다. 이는 손상된 혈관에 대한 혈소판 부착을 저해하기 위하여 독특한 치료 모드를 보여준다. 대조구 래트는 사라틴 치료 래트와 비교하여 경동맥 내막 절제 2주 후에 내강 직경이 크게 감소되었다(도 9). 사라틴 처리 래트에서는 혈관 내막 증식 발생량이 크게 감소하였고, 이는 혈소판 부착 및 축적감소와 관련이 있다. 혈소판 부착 감소와 관련 있는 혈관 내막 증식 및 혈전증 감소의 발견은, 감소된 혈소판 부착과 임상적으로 관련있는 종말점 및 세쿠알라(sequala)를 제공한다. 이로써, 혈소판 응집 및 부착의 부위특이적이고 비전신적인 저해를 통해 혈전증 및 폐색률이 감소되고, 따라서 경동맥 내막 절제 후 이와 관련있는 뇌혈관 질환 발생이 감소됨이 증명되었다. 또한, 사라틴으로 처리된 래트에서 혈전증률이 감소된다는 중요한 발견은, 혈관 내막 증식 및 내강 협착 개선 수준을 증명한다. 대조구 래트 중 33% 전부에서 혈전증이 나타났으나, 사라틴 처리된 경동맥에서는 혈전증이 전혀 없었다. 이 약제를 사용하여 전신성 효과가 증명된 바 없다는 것은 특히 임상적으로 중요하다. 사라틴의 국부 적용은 전신 출혈 시간 또는 혈소판 수에 영향을 주지 않았다. 이는, 혈소판 부착 감소 및 이에 따른 혈전증 및 혈관내막 증식 감소가 국부적 효과에 따른 결과임을 의미한다. 이러한 사라틴과 관련된 신규한 결과는, 전신 지혈 메카니즘을 방해하지 않고 혈소판 부착 및 활성화의 유해 효과를 국부적으로 저해할 수 있는 양태의 임상적 적용 범위가 넓다는 점에서, 틀림없이 중요하다.

이전에 지적된 바에 따르면, 다양한 치료적 개입은 즉각적이고 국부적으로 치료되는 것이 이상적인 국부 손상을 유도한다. 치료되지 않은 채로 남겨지는 경우, 손상된 세포는 응고, 보체 활성화, 및 사이토카인 방출에 대한 세포 반응을 포함하는 일련 과정, 증식 유도, 및 다른 생물학적 활성 과정을 개시한다. 이러한 복합적이고 상호관련된 과정은, 일단 시작되면 중단시키기 어렵다.

따라서, 본 발명에서, 사라틴이 조작된 조직에 직접 위치하는 것은 중요하다. 국부 적용은 또한, 개입에 사용되는 약제의 전신 효과와 관련있는 잠재적인 문제점을 최소화한다.

이상적으로, 벌룬 카테터와 같은 외과 기구 또는 다른 기구 또는 이의 일부의 코팅에 사라틴을 혼합함으로써 실시가능한 적당한 치료적 개입과 동시에, 사라틴 치료를 실시할 수 있다. 손상된 혈관을 사라틴으로 직접 코팅하는 것도 포함될 수 있다.

또한, 다른 치료제와의 조합물을 포함하여, 자유 유체 형태와 같은 일반적인 사라틴 전달 수단을 본 발명에 사용할 수 있다. 그러나, 자유 유체 전달보다 중합체/하이드로겔 매트릭스를 사용하는 것이 유리하다. 중합체 매트릭스 중에 혼합된 약제를 전달하는 경우, 지지 카테터 중에 내강을 추가하여 처리 부위 안밖으로 자유 유체 약제 용액을 수송할 필요가 없다.

또한, 중합체 매트릭스는, 혈관 단편의 불완전한 벌룬 밀봉으로 인해 약제 용액이 하방으로 새어나갈 위험이 없으므로, 비-표적 조직이 고농도의 약제에 노출될 위험이 없다.

의료 기구 상에 또는 손상 혈관에 대한 코팅으로서 사라틴을 국부 적용하기 위한 일반적인 기술적 해결책은, 예를 들어 중합체 또는 하이드로겔 코팅에 사라틴을 혼합하는 것이다.

중합체 조성물과 관련하여, 본 명세서에서 사용되는 "하이드로겔"이라는 용어는, 상이한 크기 및 용량의 구멍 또는 틈을 가지고, 특히 코팅 또는 코팅된 장치의 제조 동안 도입될 수 있는 겔 기질의 전하 또는 친수성/소수성 성질과 관련된다양한 물리화학적 특성을 갖는 합성 중합체를 포함한다. 다양한 합성 엘라스토머 및 자연 발생 중합 물질이 당업자에게 알려져 있다. 사라틴은 중합체 제조 중에 매트릭스 중에 혼합하거나, 중합체를 원하는 형태로 코팅하거나 몰딩한 후에 첨가할 수 있다. 또한, 다수의 다른 중합 재료 및 가공 방법을 다수 사용하여, 본 발명에 사용되는 중합체 매트릭스를 형성할 수 있다. 적당한 중합체 재료 또는 조합물의 예로는 생체적합성 및/또는 생체분해성 중합체가 포함되며, 이에 제한되지 않는다.

몇가지 알킬 알킬- 및 시아노아크릴레이트를 외과적 용도로 조사하였으며, 이소부틸 시아노아크릴레이트 중 일부가 특히 적당한 것으로 밝혀졌다.

단일 올레핀 이중 결합을 갖는 하이드록시알킬 알킬 아크릴레이트의 정제된 모노에스테르 40-60 중량부, 하나의 올레핀 이중 결합을 포함하는 메타크릴 단량체 40-60 중량부 및 중합 개시제 0.001-5 중량부를 포함하여 이루어지는 단량체 혼합물로부터 일반적인 하이드로겔 중합체를 제조할 수 있다. 벌크 중합, 용액 중합, 현탁액 중합 또는 에멀젼 중합의 통상적인 기술을 사용하여 중합할 수 있다. 사용된 중합 기술은 원하는 중합체 부피 및 생성되는 최종 생성물의 성질에 따라 결정된다. 일반적인 하이드로겔 생성물은 모노에스테르 대 메타크릴 단량체의 몰비가 1:1 내지 2.3:1, 바람직하게는 1.5:1이며, 중합체 구멍 직경은 90 옹스트롬 이상이다.

단일 올레핀 이중 결합을 갖는 하이드록시알킬 아크릴레이트의 모노에스테르로서, 허용가능한 화합물에는 2-하이드록시에틸 메타크릴레이트, 글리세릴 메타크릴레이트, 2-하이드록시프로필 메타크릴레이트, 글리시딜 메타크릴레이트, 2-하이드록시에틸 아크릴레이트 및 2-하이드록시프로필 아크릴레이트가 포함되며, 이에 제한되지 않는다. 허용가능한 메타크릴 단량체는 메타크릴산, 메타크릴아미드 5 및 메타크릴로니트릴이다.

중합 개시제는 중합 방법 또는 중합체의 최종적으로 원하는 용도에 따라 결정될 수 있다. 예를 들어, 중합체를 고체 물체로 형성하려는 경우, 유리 라디칼 개시제를 사용할 수 있다.

이런 타입의 바람직한 개시제로는 2,5-디메틸-2,5-비스(2에틸헥소일페록시)헥산 또는 테르티아릴부틸 페록시피빌레이트와 같은 이작용성 폴리에스테르가 포함된다. 이와 달리, 중합체가 단량체 혼합물 형태로 적용되어 원위치에서 중합되는 코팅으로서 최종적으로 사용되는 경우, UV 촉매 2,2아조비스(2-메틸프로피오니트릴) 또는 아조비스부티로니트릴(AIBN)과 같은 개시제는 방사선 활성화될 수 있다. 개시제는 특정 중합 방법에 사용하기 위하여 또는 특정 최종 생성물에 대하여 제한되지 않는다. 예를 들어, 유리 라디칼 개시제는 코팅에 사용될 수 있으며, 방사선 활성화된 개시제는 고체 물품 형성에 사용될 수 있다.

실질적으로 유사한 비율의 모노에스테르 및 메타크릴 단량체 외에도, 사이클로헥실 메타크릴레이트, 트리메틸올프로판 트리메타크릴레이트 또는 에틸렌글리콜 디메타크릴레이트와 같은 흔적량의 장쇄 알킬 아크릴레이트 또는 메타크릴레이트 에스테르 공단량체를 사용하여 단량체 혼합물을 강화시킬 수 있다. 이러한 추가적인 공단량체는 중합체 강도를 늘일 필요가 있는 상황에서 중합체의 가교결합을강화한다. 이들 공단량체의 흔적량은 일반적으로 총 단량체 혼합물 중 0.1 중량% 이하이다.

본 발명에서 사용된 하이드로겔 중합체를 형성하여, 얻어지는 물품이 부가적인 가교결합 단량체를 필요로 하지 않는 내인성 작용에 의해 충분히 가교결합되는 물품을 제조할 수 있다.

생분해성 중합체의 예로는 또한 폴리(락타이드), 폴리글리콜라이드, 폴리안하이드라이드, 폴리오르도에스테르, 폴리아세탈, 폴리디하이드로피란, 폴리시아노아크릴레이트 및 이들과 폴리에틸렌 글리콜의 공중합체가 있다. 이들은, 강화된 국부 전달용 약제가 중합 동안 혼합되거나, 특정 하이드로겔의 경우에는 이후에 혼합될 수 있는, 공중합체 하이드로겔 또는 가교결합된 중합체 네트워트의 형태가 될 수 있다. 외부로의 자유 확산을 조절하기 위하여 약제의 분자 특성에 따라 바람직한 매트릭스를 만든다.

이들을 고안한 개별적인 치료적 필요성에 따라, 또는 사라틴 혼합된 중합체를 국부적으로 전달하는 보다 구체적인 목적을 위해, 사라틴으로 코팅된 다양한 형태의 카테터 또는 다른 의료 기구를 구성 및 사용할 수 있다. 본 발명은 블루 메디칼 사제 상표명 블루 메디칼 디바이스 BV GO의 벌룬 카테터로 시험하였으나, 이러한 타입의 카테터로 제한되는 것은 아니다.

실시예 1

정지 조건에서의 콜라겐에 대한 정제 vWF 및 혈소판의 결합

필수적으로 문헌(Blood 1995, 85(3): 705-711)에 기재된 바와 같이 미량역가 플레이트에서 콜라겐에 대한 vWF 결합을 조사하였다. 다양한 콜라겐, 인간 콜라겐 타입 I, 타입 III 또는 송아지 피부 콜라겐(시그마제)을, 5㎕의 콜라겐을 피펫팅함으로써 밤새 코팅하고, 200㎕ PBS 존재 하에 96-웰 미량역가 플레이트에서 125㎍㎖^-1로 50mM 아세트산 중에 용해시켜 탈변성하였다. 비-코팅 부위를 BSA로 차단한 후, 정제된 인간 vWF(송아지 피부 및 콜라겐 I 코팅 플레이트의 경우 1.25㎍㎖^-1; 콜라겐 III 코팅 플레이트의 경우 0.625㎍㎖^-1) 또는 희석된 정상 혈장(인간 혈장: 콜라겐 I 및 III 상에 1/80, 송아지 피부 콜라겐 상에 1/40; 햄스터, 마우스 및 돼지 혈장: 콜라겐 III 상에 1/80; 콜라겐 I 및 송아지 피부 콜라겐 상에 1/20)을 사라틴 존재 하에 웰에 첨가하고, 2시간(희석된 혈장) 또는 1시간(정제된 vWF)동안 배양하였다. 서양 고추냉이(horseradish) 퍼옥시다제와 결합된 래빗 항-vWF 항혈청(Dako, Copenhagen, Denmark)을 사용하여 세척 단계를 추가 실시한 후, 발생된 콜라겐에 대한 잔류 vWF의 결합을 492nm에서의 흡광도로 측정하였다.

미량역가 플레이트를 인간 콜라겐 I, 인간 콜라겐 III 또는 송아지 피부 콜라겐으로 전-배양하는 경우, 이후의 사라틴 존재하에서의 정제된 vWF의 배양은 vWF-콜라겐 결합의 투여량-의존성 저해와 관련되었고, IC₅₀값이 각각 0.23±0.004, 0.81±0.04 및 0.44±0.008㎍㎖^-1였다(도 1). 정제된 vWF 를 희석된 정상 인간 혈장으로 대체하는 경우, 사라틴의 저해 능력이 유지되었다(표 1). 사라틴은 희석된 돼지, 햄스터 및 쥐의 혈장의 vWF의 다른 시험된 콜라겐에 대한 결합도 저해하였으며, 일관되게 콜라겐 I에 대한 효능이 가장 우수하였다(표 1).

실시예 2

상승된 전단 하의 혈소판 부착

콜라겐에 대한 vWF-의존성 혈소판 부착 조절에서의 전단력의 중요성의 견지에서(J. Lab. Clin. Med. 1974, 83(2):296-300) 흐름 챔버 관류 연구를 실시하여, 손상 또는 병든 동맥에서와 유사한 흐름 조건 하에서 사라틴의 저해 작용을 조사하였다. 송아지 피부 콜라겐을 이전에 설명한 것과 같이 플라스틱 커버슬립 상에 코팅하였다(Blood 1995, 85(3): 705-711). 두개의 커버슬립 홀더를 가지며 챔버 높이 0.4, 0.6 또는 1.0mm이고 폭 1.0cm인 평행-플레이트 관류 챔버에서, 전단 속도 약 2700, 1300 및 300s^-1로 각각 박동성 흐름(롤러 펌프, Watson Marlow 603S, VEL, Seuven, Belgium) 하에 관류를 실시하였다. 항응고된 전혈(0.2 IU㎖^-1저분자량 헤파린, 클렉산)을 콜라겐-코팅된 커버슬립 상에 5분동안 관류시킨 후, 세정된 커버슬립을 그룬왈드-지엠사(Grunwald-Giemsa)로 염색하고, 표면 도포를 정량적 파라미터로 사용하여, 설명된 바와 같이(Blood 1995, 85(3): 705-711) 광 현미경 및 이미지 분석으로 혈소판 침착에 대해 평가하였다.

2700s^-1의 전단 속도에서, 사라틴은 투여량-의존적으로 혈소판의 부착을 저해하였으며, IC₅₀=0.96±0.25㎍㎖^-1이었다(도 2). 그러나, 1300s^-1의 보다 완화된 전단 속도에서는, 투여량 반응 곡선에서 명백한 우측 이동이 관찰되었고, IC₅₀=5.2±1.4㎍㎖^-1이었다(도 2). 300s^-1의 정맥 전단 속도에서, 사라틴은 관류된 혈소판의 부착을 10㎍㎖^-1이하로 저해할 수 없었다(데이터 도시 않음).

실시예 3

표면 플라스몬 공명(SPR)에 의한 결합 분석

BlAcore 3000 장치(BlAcore, Freiburg, Germany)를 사용한 SPR로 단백질 상호작용을 확인 및 특징화하였다. 공급자가 만든 프로토콜에 따라 커플링제를 사용하였다. 활성화된 카르복실레이트 기를 통하여 CM 5 센서 칩을 인간 콜라겐 타입 III(Sigma)의 유리 아미노기에 커플링시켰다. 표준 조건(Anal Biochem. 1991, 198(2): 268-277, JAI Press Ltd., 1992) 하에 pH-측정 및 커플링 화학을 실시하였다. 커플링을 위하여, 10mM 아세테이트 완충액(pH 4.5) 중에 콜라겐을 0.125㎍㎖^-1로 희석하여, 331 공명 유닛(RU)의 고정화된 물질을 얻었다. 이 매트릭스를 사용하여, 20mM Hepes(pH 7.4), 150mM NaCl, 5mM EDTA, 0.005% Tween 20으로 희석시킨 정제된 재조합 사라틴의 결합을 연구하였다. 모든 결합 실험은 25℃에서 실시하였다. 7.8 nM 내지 10μM의 농도에서 사라틴 적정을 실시하였다. 얻어진 실험 RU 플라토값을 다음 식에 따라 계산하였다.

R_eq/사라틴 농도=(-K_a×R_eq)+(K_A×R_max).

고정화된 콜라겐 표면 상에 사라틴을 적정하면 농도-의존성 결합이 일어났다. 또한, 센서 표면 상의 콜라겐에 결합된 사라틴의 최대량은, 1:1 결합 모델에서 계산된 최대 신호보다 더 큰 신호로 나타났다. 랑뮈르(Langmuir)에 따른 1:1 결합 모델로 데이터를 피팅하면 만족할만한 결과를 얻지 못함에 따라, 콜라겐 타입 III 상에 사라틴 결합 부위가 하나 이상 존재한다는 이러한 관점이 보다 확증되었다.

SPR 데이터의 스캐차드 분석을 통해, 사라틴에 대한 친화도가 크게 다른 두개의 다른 결합 부위가 존재하는 것으로 나타났다(도 3). 평형 상수 계산을 통해 고친화 부위의 해리 상수는 5 × 10^-8M이고 저친화 결합 부위의 해리 상수는 2 × 10^-6M로 나타났다.

실시예 4

혈소판 응집

작용물질로서 콜라겐, ADP, 리스토세틴, 아라키돈산 또는 트롬복산 유사체 U46619를 사용하여 혈소판-풍부 혈장 중에서의 응집 연구를 통해 혈소판 작용에 대한 사라틴의 특이성도 평가하였다. 약물처리를 하지 않은 건강한 지원자의 시트레이트화된 혈액(3.13%)을 원심분리하여(15분, 100g) 혈소판-풍부 혈장을 얻고, 여기에 사라틴을 1분동안 첨가한 후(최종 농도 0-200㎍㎖^-1), 콜라겐(0.5㎍㎖^-1),ADP(2.5μM), 리스토세틴(0.9㎍㎖^-1), 아라키돈산(1.0mM) 또는 U46619(1.3μM)을 사용하여 혈소판 응집을 유도하였다. 각 작용물질에 대하여 5분에 걸친 최대 응집(크기)을 관찰하였다.

사라틴은 최종 농도 40㎍㎖^-1이하에서 콜라겐을 포함하는 모든 시험 작용물질에 대하여 최대 응집을 저해하지 못하였다(표 2). 그러나, 사라틴 200㎍㎖^-1에서도 ADP에 대한 응집은 영향을 받지 않았을지라도, 사라틴 100㎍㎖^-1에서 콜라겐-유도된 혈소판 응집을 일부 저해할 수 있었고(데이터 도시 않음), 200㎍㎖^-1에서 완전히 저해할 수 있었다.

실시예 5

래트 CEA 모델

동맥절개술을 이용한 개방 기술, 혈관 내막 및 중막 일부의 직접적인 제거 및 동맥의 봉합 폐쇄를 사용한 래트 CEA 모델을 사용하였다. 한 그룹의 래트에 사라틴을 투여하고, 다른 그룹은 대조구로 하였다. 종말점 측정은 1) PLT 부착, 2) 혈전증률, 3) 혈관 내막 증식 발생을 포함하였다. 사라틴을 경동맥의 동맥 내막 절제된 표면에 직접 적용한 후 동맥을 폐쇄하였다. 준비된 경동맥의 전자 현미경사진(2000×mag)을 PLT 응집의 정량 분석에 사용하였다. 총 PLT 수는 표준화된 오버레이 그리드를 사용하여 계수하였다. IH 및 혈전증은 IH 영역을 직접적으로 측정한 엘라스틴 염색된 경동맥 절개부를 컴퓨터 보조 생물형태계측 분석에 의해 평가하였다.

실시예 6

경동맥 동맥 내막 절제 수술

동물을 종형 유리병 속의 이소플루란을 사용하여 진정시키고, 칭량한 후, 케타민(100mg/kg) 및 아세프로마진 말레이트(1mg/kg) 조합물로 복강내 마취시켰다. 뒷발의 자극에 반응이 없도록 적당히 마취시킨 후, 유체 농축괴(10cc/kg)로 작용하여 외과수술 중 혈액 손실을 보충하도록 4cc의 정상 식염수를 등의 상부 중앙 영역에 피하 주입하였다. 이어서, 목 부분을 면도하고 7% 이소프로필 알콜을 준비하였다. 살균 기술 및 해부 현미경(×40, sz40 Olympus, Olympus America Inc., Melville, NY)을 사용하여, 중앙선 경부 절개를 실시하였다. 표재성 근육을 가르고, 우측 경동맥 수준으로 해부하였다. 동맥 영역의 경부 신경을 해부하여, 자유롭게 인두 기능을 보존하고 수술-후 호흡이 어렵게 되는 것을 방해하였다.

경동맥을 적당히 노출 후, 실크 봉합 압박대를 사용하여 분기에 약 1.5-cm 떨어지게 근위 및 원위를 조절하였다. 각막 블레이드(corneal blade)를 사용하여 동맥 절개를 실시하고, 미세- 가위를 사용하여 6mm 길이로 연장하였다. 27-게이지 바늘을 사용하여, 혈관을 가로질러 약 2mm 떨어진 두개의 평행선으로 혈관 내막에 칼금을 내었다. 혈관 내막 및 중간층을 미세-겸자로 제거하였다. 사라틴 그룹의 래트에 5㎕의 사라틴 용액을 투여하되 동맥 내막 절제된 표면에 직접 적용하였다. 당기면 움직이는 10-0 모노필라멘트 나일론 봉합사(MS/9, Ethilon, Ethicon Inc., Somerville, NJ)를 사용하여 말단 끝에서 시작하여 동맥절개를 봉합하였다. 원위압박대를 먼저 제거하여 봉합선 지혈을 평가한 후, 근위 압박대를 제거하였다. 사라틴 적용 시간은 5분이었고, 이는 동맥절개 봉합 시간을 나타내었다. 지혈이 될 때까지, 봉합선 출혈에 살균 면 팁 어플리케이터(cotton tip applicator)를 사용하여 탐폰을 부드럽게 삽입하였다. 손에 드는 도플러를 사용하여 동맥 내막 절제된 경동맥을 평가하여, 개존(patency)을 확인하였다. 이어서 당기면 움직이는 3-0 흡수성 봉합사를 사용하여 표면 근육층 및 피부를 봉합하였다.

실시예 7

혈소판 부착

혈소판 부착 서브그룹의 래트를 다시 마취시키고, 3시간 또는 24시간 후 경동맥 내막 절제술을 통해, 동맥 내막 절제된 경동맥을 채취하여 4% 글루트알데하이드 용액 중에 고정시켰다. 채취 처리 동안, 경동맥 분절을 봉합 폐쇄 부위를 따라 길이방향으로 개방하여 동맥 내막 절제된 영역을 노출시켰다. 이어서, 동맥에 오스뮴 테트록사이드를 덧붙이고, 등급 매긴 알코류 중에서 탈수하고, CO2로 임계점 건조하고(1072 psi 및 31.1℃), 금 팔라듐으로 코팅하고, 주사 전자 현미경(JEOL 5410, JEOL, USA Peabody, MA)에 놓았다. 동맥 내막 절제된 영역을 2000×배율로 스캐닝하여 사진 이미지를 얻었다. 사진 이미지를 맞추어 콜라주 형식으로 배치하여, 주사 전자 현미경 모니터의 단일면으로 가능한 것보다 큰 영역을 가시화하였다. 일단 사진의 콜라주가 수집되면, 이를 투명한 오버레이 그리드로 도포하였다. 모든 표본 사진에 동일한 오버레이 그리드를 사용하였고, 116 스퀘어를 사용하여 각 사진에서의 혈소판 총수를 계수하였다. 116이라는 숫자는, 모든 사진 콜라주를 조화롭게 계수할 수 있는 최대 스퀘어이다. 두명의 맹검자가 혈소판을 계수하였다.

실시예 8

혈관 내막 증식

경동맥 내막 절제 2주 후에, 혈관 내막 증식 그룹을 마취시켜 동맥 내막 절제된 경동맥을 노출시켰다. 복부를 중앙선 개방하고, 원위 대동맥 및 하부 대정맥을 노출시켰다. 대정맥을 절개하고, 원위 대동맥에 20-게이지 카테터를 사용하여 캐뉼라 삽입하여, 대정맥 유출물이 맑아질 때까지 100mmHg에서 정상 식염수를 주입하였다. 이어서, 10% 완충된 포르말린을 100mmHg에서 동일 부피 주입하여 관류-고정법을 완성하였다. 수술한 경동맥 1cm 절편을 잘라내어 조직학용 추가 가공할 때까지 10% 포르말린에 넣었다. 동맥을 파라핀 차단하고, 절단하고, 베르회프(Vefhoeff's) 및 반 기슨(Van Gieson's)법 염색으로 엘라스틴 염색하였다. 절단 영역을 표준화하기 위하여, 연속적인 10-0 나일론 봉합 동맥절개 봉합의 거리를 따라 3 마이크로미터 간격으로 연속하여 각각 다수의 절편을 취하였다. 엘라스틴-염색된 슬라이드를 KODAK DC 120 줌 디지탈 카메라(Eastman KODAK Company, Rochester, NY)를 사용하여 촬영하였다. 이 때 혈전형성 절편이 나타났다. 비혈전형성 이미지를 컴퓨터에 다운로드하여 국립 위생 연구소(the National Institutes of Health)(Bethesda, MD)(ImageJ Software program, Version 0.99i)를 이용하여 경동맥의 내강 면적을 분석하였다. 이 소프트웨어 패키지를 사용하면 혈관 내막 증식의 내부 면적을 정확히 나타낼 수 있으므로 혈관 내강 횡단면 면적의정확한 크기를 얻을 수 있다. 또한, 혈관 내막 증식의 외부 면적을 측정하였다. 두 면적 간 차이(혈관 내막 증식의 외부 면적-실제 내강)를 혈관 내막 증식의 절대 면적으로 결정하였다. 동맥 횡단면의 형태는 개별적인 편차가 있으므로, 그 값을 혈관 내막 증식의 절대 면적 대 혈관 내막 증식의 외부 한계의 비율로 표현하고, % 내강 협착이라 하였다. 이 비율은 혈관 내막 증식이 차지하는 내강 면적의 비율을 나타내며, 이를 통해 다양한 크기(4)의 동맥 횡단면의 비교가 가능하였다. 두명의 맹검자의 측정값 간에는 차이가 거의 없었다.

실시예 9

출혈 시간 및 혈소판 수

전신 혈소판 수 및 출혈 시간에 대한 사라틴의 효과를 평가하기 위하여, 래트 12 마리의 혈소판 수 및 출혈 시간을 측정하였다. 수술전 혈액 시료를 각 래트로부터 약 1-1.5cc 취할 필요가 있었다면, 이는 쥐의 총 혈액 부피 중 상당한 부분을 차지한다. 이러한 견지에서, 수술 후에 대조구 및 사라틴 래트의 혈소판 수가 감소될 것으로 기대되는 것이 당연하다. 혈소판 수에 대한 사라틴의 효과를 평가하기 위하여, 수술후 혈소판 수에서 수술전 혈소판 수를 빼 수의 차이를 얻어, 각 래트의 혈소판 수 차이를 결정하였다. 처리 ANOVA 모델의 2×2 계승 배치를 사용하여 혈소판 수의 차이를 분석하였다. 대조구 및 사라틴 처리된 래트 간의 혈소판 수 차이에는 큰 통계적 유의성이 증명되지 않았다. 모든 래트는 수술 전에 결정된 혈소판 수 및 출혈 시간을 가졌다. 래트 여섯마리에게서 경동맥 내막 절제를 실시하여, 수술 3시간 후 출혈 시간을 확인하고 혈소판 수를 측정하였으며, 남은 여섯마리에 대해서는 수술 24시간 후 출혈 시간을 확인하고 혈소판 수를 측정하였다. 각 시간 그룹의 래트 중 세마리에 국부적으로 사라틴을 투여하고, 남은 3마리는 대조구로 하였다.

래트 꼬리의 원위 2mm를 절개하고 꼬리 약 4cm를 37℃의 인산염 완충 용액에 담궈 출혈 시간을 측정하였다. 꼬리 절개부터 출혈 중지까지 걸린 시간을 측정하고 출혈 시간으로 하였다. 내부 경정맥으로부터 혈액 시료 1-1.5cc를 뽑아 Coulter STKS 혈액 분석기로 분석하여 혈소판 수를 측정하고 x10³로 나타냈다.

실시예 10

통계적 방법

평균±표준 오차를 보고한다. 스태트 뷰 프로그램(Stat View program)(SAS Institute Inc. Cary, NC 27513) 5.0 버전을 사용하여 짝짓지 않은(unpaired) t-시험 분석을 실시하여, 사라틴 처리구 및 대조구의 부착 혈소판 수, % 내강 협착 및 출혈 시간을 비교하였다. 가능성비 카이 스퀘어 분석(likelihood ratio Chi Square analysis)을 통해, 경동맥 내막 절제 2주 후의 혈전증 발생에 대한 승산비를 평가하였다. 처리 ANOVA 모델의 2×2 계승 배치를 사용하여, 수술전 및 수술후 혈소판 수 간의 차이를 평가하였다.

실시예 11

실험 동물

1) 혈소판 부착 평가 및 2) 혈관 내막 증식으로 인한 내강 협착 및 혈전증률의 평가의 두가지 주된 목적에 근거하여, 스프라그-다울리(Sprague-Dawley) 래트(350-400g)를 경동맥 내막 절제 그룹으로 편성하였다. 이 두가지 목적으로, 래트를 대조구 및 사라틴 처리구로 나누었다. 모든 래트에 경동맥 내막 절제를 실시하고(하기 참조), 사라틴 처리된 래트에는 혈관 내막/중막 층을 제거한 직후 경동맥 내강 표면에 사라틴 5㎕ 용액을 국부 적용하였다. 혈소판 부착 그룹은 경동맥 내막 절제 3시간 후(n=17) 및 경동맥 내막 절제 24시간 후(n=19)에 전자 현미경 평가를 실시하였다. 혈관 내막 증식 그룹(n=25)은 경동맥 내막 절제 2주 후에 채취하였다.

실시예 12

사라틴 코팅된 하이드로겔 카테터 제조

이소프로판올 중에 용해된 퍼-에스테르(11-16몰%)를 포함하는 2몰% 마크로-개시제 폴리(옥타데센-알트-말레인 아세트산 무수물) 및 0,5 몰 에틸렌글리콜-디메타크릴레이트(EGDMA)/1몰 마크로-개시제 용액 중에 장치를 침지시켜 PA-12 계 재료의 표면을 활성화하였다. 마크로-개시제의 표면에 대한 고정이 개선되어 가교결합이 개선되도록, 마크로-개시제-/EGDMA 코팅을 건조시킨 후 코팅을 5 내지 10분 120℃에서 어닐링하였다.

코팅 조건을 최적화하기 위하여, PA-12 담체 시트 상에 생성된 하이드로겔 코팅을 사용하였다. 코팅 전에 이 시트를 이소프로판올 또는 아세톤으로 세척하여 건조시켰다.

Vestamid(PA-12)로 구성된 벌룬 카테터형 블루 메디컬 디바이스 GO(RX PTCA카테터)를 사용하여 하이드로겔로 코팅하였다. 5몰% 아크릴산 100㎖ 수용액 및 0.2 내지 0,8 몰% 메틸렌-비스-아크릴을 혼합하여 시트 또는 카테터를 코팅하기 위해 사용하였다. 중합 후, 코팅된 장치를 24시간동안 수세하고 PBS 완충액 중에 두었다.

이어서, 중합체를 오븐 중에서 60-80℃로 0,5 내지 3시간동안 어닐링하였다.

건조된 하이드로겔 코팅 두께는 1 내지 4㎛였고, 수용액 중의 하이드로겔은 10 내지 50g 습윤 하이드로겔/ 1g 건조 하이드로겔로 팽창하였다.

사라틴의 PBS 완충 pH 7,4 용액 중에 침지시키는 경우(30분), 50㎍㎖ 의 농도를 사용하였다.

유기 용매를 사용하여, EFD 제와 같은 표준 소규모 스프레이 코팅 장치를 사용하여 벌룬 카테터 상에 스프레이하는 코팅 용액을 제조하였다.

Claims

혈소판 부착을 방해하는 치료적 유효량의 사라틴을 혈관 조직에 투여함으로써 혈전증 및 재발협착증을 저해하는 것을 포함하여 이루어지는 혈관 손상 또는 동맥 내막 절제 후의 혈소판 축적을 저해하는 약제를 제조하기 위한 폴리펩타이드 사라틴의 용도.
제 1항에 있어서,

상기 혈관 손상이, 아테로마성 동맥경화증, 심장 이식 맥관장애, 혈관 개입 후의 혈관 재발협착증, 벌룬 혈관성형, 스텐트 설치, 로터블레이션(rotablation), 경동맥 내막 절제를 포함하는 동맥 내막 절제, 투석 이식편 션트 및 다른 이식편 문합, 불안정 앙기나, 급성 심근경색, 졸중, 양성 비대증 또는 양성 전립선 비대증과 관련 있는 것을 특징으로 하는 용도.
그로부터 국부 전달을 위해 생물학적 활성량의 사라틴을 혼합한 하이드로겔로 덮인 표면 및 항-응괴형성 표면을 제공하기 위한 코팅 관련 수단을 갖는 장치.
제 1항에 있어서,

상기 사라틴이 카테터를 통하여 국부 투여되거나, 조직에 국부 적용되는 카테터의 내강 내부 포장 속에 사라틴이 혼합되는 것을 특징으로 하는 용도.
제 1항에 있어서,

사라틴의 국부 지속 방출이 가능한, 국부 투여된 중합체에 사라틴이 혼합되는 것을 특징으로 하는 용도.
제 5항에 있어서,

상기 중합체 조성된 사라틴이 카테터를 통해 국부 투여되는 것을 특징으로 하는 용도.
중합체 물질이 장치의 일부이고 사라틴을 포함하는 것을 특징으로 하는 카테터 장치.
제 1항에 있어서,

조직 안 또는 위에 국부 위치되는 스텐트 또는 스텐트 코팅에 사라틴이 혼합되는 것을 특징으로 하는 용도.
제 1항에 있어서,

조직 안 또는 위에 국부 위치되는 혈관 내부 이식편 또는 혈관 내부 이식편 코팅에 사라틴이 혼합되는 것을 특징으로 하는 용도.
제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항을 포함하여 이루어지는 키트.
손상된 혈관 조직에 치료적 유효 및 혈소판 부착 저해량의 사라틴을 국부 투여함으로써 손상된 혈관 조직을 치료하는 것을 포함하여 이루어지는, 손상된 혈관 조직의 치료 방법.
제 9항에 있어서,

상기 혈관 손상이, 아테로마성 동맥경화증, 심장 이식 맥관장애, 혈관 개입 후의 혈관 재발협착증, 벌룬 혈관성형, 스텐트 설치, 로터블레이션, 경동맥 내막 절제를 포함하는 동맥 내막 절제, 투석 이식편 션트 및 다른 이식편 문합, 불안정 앙기나, 급성 심근경색, 졸중, 양성 비대증 또는 양성 전립선 비대증과 관련 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제 9항에 있어서,

상기 혈관 손상이 아테로마성 동맥경화증 또는 재발협착증과 관련있는 것을 특징으로 하는 방법.
제 9항에 있어서,

사라틴이 카테터를 통해 국부 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 14항에 있어서,

조직에 국부 적용되는 카테터의 내강 내부 포장 속에 사라틴이 혼합되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 9항에 있어서,

사라틴의 국부 지속 방출이 가능한, 국부 투여된 중합체에 사라틴이 혼합되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 9항에 있어서,

상기 중합체 조성된 사라틴이 카테터를 통해 국부 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 9항에 있어서,

조직 안 또는 위에 국부 위치되는 스텐트 또는 스텐트 코팅에 사라틴이 혼합되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서,

조직 안 또는 위에 국부 위치되는 혈관 내부 이식편 또는 혈관 내부 이식편 코팅에 사라틴이 혼합되는 것을 특징으로 하는 방법.