CZ2003720A3

CZ2003720A3 - Nový specifický mechanismus k inhibici ulpívání destiček na kolagenu

Info

Publication number: CZ2003720A3
Application number: CZ2003720A
Authority: CZ
Inventors: Christopher Barnes; Matthias Frech; Uwe Hofmann; Johannes Gleitz; Wolfgang Strittmatter
Original assignee: Merck Patent Gmbh
Priority date: 2000-08-25
Filing date: 2001-08-23
Publication date: 2003-06-18
Also published as: US20050143305A1; ECSP034485A; ES2234896T3; HK1059736A1; JP2004506690A; SK287829B6; HUP0303747A3; SK3132003A3; US6881722B2; WO2002015919A3; US20030190342A1; MXPA03001604A; DE60107962T2; NO20030841D0; CN1224421C; NO20030841L; NO331326B1; CA2419385C; HU229367B1; AU2001295506B2

Description

Oblast techniky

Vynález se týká účinku polypeptidu, nazývaného Saratin, který významně potlačuje ulpívání destiček a jejich hromadění po vaskulárních poraněních, jako je endarterektomie. Dále se vynález týká inhibice ulpívání destiček na kolagenech vaskulárních stěn podmíněného vWF za podmínek zvýšeného smyku a zvláště se vynález týká lékařského použití Saratinu jako inhibitoru trombózy, řičeraž se mohou lokálně používat uvedené polypeptidy jako topická činidla nebo jako povlak pro medicínská zařízení.

Dosavadní stav techniky

Ulpívání krevních buněk, obzvláště destiček, na stěnách poraněných cév je dobře známým jevem v angioplastice a v chirurgických zákrocích. K takovým poraněním mflže docházet při různých chirurgických a perkutánních terapiích, které byly vyvinuty k opětnému uvolnění blokovaných kanálků, vedení a ostatních lumen k odstranění nemocné tkáně a k implantaci náhradní tkáně nebo jejích částí.

Byly vyvinuty různé typy intervenčních technik, které usnadnují zmírnění nebo odstranění blokády v krevní cévě k umožnění zvýšeného průtoku krve cévou. Jedním způsobem léčení stenózy nebo okluze krevní cévy je perkutánní balónková angioplastika. Balónkový katétr se zavede arteriovým systémem pacienta a zasune se do zúžené nebo blokované oblasti a balónek se nafoukne k rozšíření zúžené oblasti. Perkutánní transluminární angioplastika CPTCA) je nejrozšířenější cévní plastikou použí2

vanou k otvírání blokovaných aterosklerotických arterií.

Obecně dosahují angioplastické postupy výtečných výsledků nahrazujících nutnost bypasové chirurgie, avšak u přibližně 30 až 40 % pacientů domělá počáteční dilatace arterie může být následována novým zúžením cévy (restenózou) po 3 až 9 měsících. J-li tato restenóza závažná, mohou pacienti potřebovat druhý angioplastický zákrok, často s implantací stentu působícího jako lešení v cévě.

V ostatních případech může být nutná arteriální rekonstrukce bypasovýn chiurgickým zákrokem, který představuje vyšší riziko- I když se ročně provádí ve světě více než 800 000 zákroků PTCA, stává se socioálně-ekonomická implikace těchto 30 až 40 % restenóz předmětem vážného zájmu zasahujících kardiologů.

Restenóza je často výsledkem balónkového rozšiřování a poranění arteriální stěny a možnost, že zaváděcí dráty katétrů, používané v takových případech, během vyjímání způsobí poranění a mohou vést k proliferaci buněk hladkého svalstva arterií, které způsobí nové uzavření arterie Crestenózu'') v následujících měsících.

Vzhledem k možným komplikacím, přičítaným restenóze, a vzhledem k obavám přenesení krevní sraženiny z vředovitého strupu a závažných výsledných následků, aplikace opakované angioplaslky v krčních arteriích výrazně omezují volbu pro minimálně invazivní zákrok.

Dosud byly konány pokusy s ošetřováním okluzí v krčních arteriích vedoucích do mozku jinými typy zákroků.

Karotidová endarterektomie je chirurgická metoda k odstraňování blokád z krčních arterií a je jednou z nejznámnějších • ···· · · · · · • · ···· · ·· · ······· ·· ·· ·· ·· vaskulárních chirurgických postupů prováděných ve Spojených státech amerických. Výsledky pokusů z četných středisek doložily účinnost tohoto postupu při léčení extrakraniální choroby karotidy jak u symptomatických tak u nesymptomatických pacientů (JAM A 273, STR. 1421 až 1428, 1995; N- Engl. J. Med. 325, str. 445 až 453, 1991) a endarterektomických postupů se používá k léčení okluzivního cévního onemocnění v ostatních vaskulárních oborech (Vasc. Surg. 33, str. 461 až 470, 1999).

V případě endarterektomie se karotidová arterie rozřízne a plak se odstraní z cévy v rozříznuté oblasti. Při chirurgickém zákroku je karotidová bifurkace exponována řezem v krku pacienta a svorky se umístí po obou stranách okluze k její izolaci a provede se řez k otevření arterie. Okluse se odstraní, izolovaná oblast se vypláchne a vyfouká a arterie se uzavře sešitím- Svorky se odstraní k obnovení průtoku krve arterií. Embolie a zbytek zničených buněk nebo tkání, obsažený ve svorkách, mohou způsobovat vážné problémy po otevření karot-idové arterie umožňující proudění do dříve izolované oblasti.

I když je endarterektomie účinnou terapií, často zanechává nežádoucí jevy a exponovanou významnou plochu thrombogenického subendothelia. Přes účinnost karotidové endarterektomie, může operace vést ke komplikacím včetně trombózy a vyvinutí vnitřní hyperplazie způsobující komplikace, které znehodnotí příznivý účinek zákroku, nebo vytvoří nové problémy.

Klinické studie ukázaly 1¾ až 10% výskyt mrtvice po karotidové endarterektomii bezprostředně po operaci, přičemž téměř každý byl způsoben vytvořením thrombu v místě endarterektomie s následnou mozkovou embolizací (Stroke 15, str. 950 až 955 1984). Hromadění destiček může také vést k restenóze vlivem vývoje vnitřní hyperplazie, která se může vyskytnout během dvou let po operaci. Uvádí se restenóza v 10 % až ve 20 % u všech endarterektomických pacientů dva až pět let po operaci, z nichž většina je způsobena vnitrní hyperplazií, vnitřním zbytněním a zmenšením průměru cévy, jak je to doloženo karotidovým duplexním ultrazvukovým snímáním (J. Vasc. Surg. 3, str. 10 až 23, 1986).

Buněčná a molekulární odezva cévní stěny na mechanicky vyvolané poranění, chirurgický zákrok, umístění stentu umístění cévního štěpu (tepenného nebo arteriovenosního štěpu, například dialysového štěpu) je komplexní interakce zánětu, migrace buněk hladkého svalstva, proliterace a myofibroblastová transformace, ke kterým dochází jakmile dojde k poranění (Futura, str. 289 až 317, 1997). Jestliže je arterie silně poškozena nemocí, a případně zkornatělá ukládáním vápnmíku, může zákrok způsobit dodatečné poranění určitého stupně s místní deendothelialisací a expozicí spodních extracelulárních složek matrice, jako je kolagen a elastin. U některých pacientů může nadměrný nárůst destiček a fibrinogenu vésk k akutní thrombotické okluzi.

Studie s použitím modelu endarterektomizovaných krysích karotidových arterií (Neurosur 16, str. 773 až 779, 1985) a modelů s poškozením balónkovou embolektomií (Lab. Invet 49, str. 327 až 333, 1983) ukázaly, že jestliže se během vaskulárního poškození vytrhnou endotheliální buňky, začnou na exponovaném subendotheliu ulpívat destičky. Spallone a kol. (Neurosurg 16, str. 773 až 779, 1985) s použitím řádkovacího elektronového mikroskopu ukázal, že pět minut po karotidové endarterektomii u krysy se vytváří monovrstva destiček na poraněné oblasti. Patnáct minut po poranění je pozorována agregace destiček a vytváření thrombu. Třicet minut po endarterektorai i je místo pokryto aktivovanými destičkami a povlečeno fibrinem a červenými krvinkami. Vytváření thrombu dosahuje vrcholu tři hodiny po poranění s pozorovanou tlustou vrstvou systému fibrin-destičky. Destičky jsou integrální součástí vytvářeného thrombu a tedy trombózy, zdá se však, že mají význam při vývoφ Φ· ·« ··*· ♦· ··*· •φ φ · « · · · · · • φ φ · · φ · · φ φ φ · · · · · · · • φ · · · · ···· φφφ ···· ·· ·· ·· ·· ji vnitřní hyperplazie.

Studie s použitím thrombocytopenických krys dále ukázaly významný pokles vnitřního zbytnění následujícího po poranění karotidu arterie v porovnání s kontrolními krysami. (Proč. Nati. Acad. SCI USA 86, str. 8412 až 16, 1989). Jakmile destičky ulpí na exponovaném subendotheliu poraněné cévy, jsou aktivovány a uvolňují své granule. Tyto granule obsahují vasoaktivní a thrombotické faktory (serotonin, ADP, fibrinogen, Von Villebrandův faktor·, thrombosan A2) i rfistové faktory (od destiček odvozený růstový faktor, transformující růstový faktor-beta a epidermální růstový faktor) (Circulation 72, str. 735 až 740, 1985). Přesný mechanizmus, kterým destičky podporují vývoj vnitřní hyperplazie, není dosud plně objasněn. Studie naznačují, že destičky poskytují primárně chemotaktický stimul pro migraci mediálních buněk hladkého svalstva směrem dovnitř během druhé fáze vývoje vnitřní hyperplazie (Vas. Surg. 13, str. 885 až 891, 1991). Jiné studie doložily za po použití anti-PDGF protilátek vitální úlohu, kterou má PDGF při hromadění neointimálních buněk hladkého svalstva po cévním poranění (Sciemnce 253, str. 1129 až 32, 1991). Jiným mechanizmem, kterým mohou destičky usnaňoovat vývoj vnitřní hyperplazie, je aktivace koagulační kaskády a následné nahromadění thrombinu v místě poranění. Četné studie ukázaly, mitogenické působení thrombinu na buňky hladkého svalstva (J. Clin. Invest 91, str. 94 až 98, 1993; J. Vasc. Surg. 11, str. 307 až 713, 1990). Kromě toho se ukázalo, že thrombin je stimulátorem aktivace destiček. Bez ohledu na přesný mechanizmus, má ulpívání destiček a aktivace v místě vaskulárního poranění významnou úlohu ve vývoji trombózy a vnitřní hyperplazie a tudíž inhibice ulpívání destiček a aktivace může napomáhat k prevenci nebo zmírnění výskytu trombózy a vývoje vnitřní hyperplazie.

Ulpívání destiček na poraněných stěnách arterií je zprostředkováno v první řadě von Wi1lebrandovým faktorem CvWF) «* ··’· mult interního glykoprot-einu, který se uvolňuje z endotheliálních buněk a cirkuluje v plasmě, kde funguje jako nosič proteinu pro faktor VIII (Annu. Tev. Biochem. 67, str. 395 až 424, 1998). Vysoce znásobený (vVF) také cirkuluje obsažený uvnitř «-granulí destiček, odkud se uvolňuje po aktivaci destiček (Annu. Tev. Biochem. 67, str 395 až 424, 1998). Za podmínek zvýšeného smyku, jako jsou shledávány v tepnách v místech atheromatového plaku nebo mechanického zásahu, mfiže se vVF vázat, cestou své domény A3, na exponovaném povrchu vláken kolagenu (Biochemistry 25(26), str. 8357 až 8361, 1986; Blood 70 (5), str. 1577 až 1583, 1987; J. Biol. Chem- 262(28), str. 13835 až 13841, 1987). Na kolagen vázaný vVF pak natírá destičky cestou na smyku závislým vystavením epitopu v oblasti vWF-Al, který je v interakci s destičkami GPlb/IX/V (Blood 65(1), str. 85 až 90, 1985: Blood 65(4), str. 823 až 831, 1985; Br. J. Haematol 63 (4), str. 681 až 691, 1986). Pfisobí tedy vVF jako most mezi kolagenem a destičkami a je předpokladem pro ulpívání destiček na kolagenu za prfitoku (J. Lab. Clin. Med. 83, str. 296 až 300, 1974). Destičky, které převalí vVF, vedou ke slabému ulpění, avšak dodatečné přímé interakce mezi kolagenem a ostatními receptory na povrchu destiček jsou potřebné k usnadnění trvalého ulpění, aktivace a agregace destiček (Throrab. Haemost. 78(1), str. 434 až 438, 1997; Thromb. Haemost. 78(1), str. 439 až 444, 1997). Přímé receptory kolagenu na destičkách zahrnují 6P VI (Blood 69(6), str.1712 až 1720, 1989; Thromb. Haemost 81(5), str. 782 až 792, 1999; J. Clin. Invest. 84(5) str. 1440 až 1445, 1989), GP Ia/IIa («2/ βι) (J. Clin. Invest. 84(5), str. 1440 až 1445, 1989; Nátuře 318(6045), str. 470 až 472, 1985) a v menší míře GPIV (CD36) (J. Biol. Chem. 264(13), str. 7576 až 7583, 1989) a možná i p65 (J. Clin. Invest. 100(3) str. 514 až 521, 1997). Při chybějící vazbě destiček s podporou vWF se ukázalo, že jsou tyto receptory příliš slabé ke zprostředkování náboru destiček na kolagenu v prfitoku. (Br. J. Haematol. 63(4), str. 681 až 691, 1986). Konečně vWF usnadňuje v kombinaci s fibrinogenem zesí7 tění a další aktivaci destiček cestou vazby na destičky GP Ilb/IIIa (J. Clin. Invest. 105, str. 783 až 791, 2000) poskytující stabilitu a pevnost vyvíjejícího se thrombu.

S příchodem destiček GP Ilb/IIIa a ADP receptorových antagonist.fi došlo v antiagregační terapii v poslední době k velkým pokrokům (Coronary Art Dis 10(8), str. 553 až 560, 1999; J. Am. Coll. Surg. 191(1), str. 76 až 92, 2000). Tyto strategie však nejsou určeny k inhibici počátečního ulpívání destiček na exponovaná kolagenová vlákna a přes účinnost antagonistů GP Ilb/IIIa ve zmírňování interakcí destička-destička, destičky stále uplpívají na poraněných stěnách cév (Blood 81(5), str. 1263 až 1276, 1993; Circulation 91(5), str. 1354 až 1362, 1995). Kromě toho aktivace destiček téměř určitě rozšiřuje agregaci a akutní trombózu, přičemž progrese subakutní a chronické vnitřní hyperplazie je alespoň zčásti ovlivněna mitogenickými mediátory, jako je od destiček odvozený růstový faktor (PDGF), uvolněný aktivací destiček. Sktečně se ukázalo, že inhibice PDGF snižuje vnitřní hyperplazii u četných živočišných druhů (Science 253(5024), str. 1129 až 1132, 1991; Circulation 99(25), str. 3292 až 3299, 1999). Má se zato, že pathofyziologický význam vWF je zřejmý z nárůstu obíhajícího vVF v pacientech s akutním infaiEktem mypkardu (Thromb Haemost 84, str. 204 až 209, 2000; Circulation 98(4), str. 294 až 299, 1998), kdy hladiny vWF byly v pozitivním vztahu se špatnou následnou prognózou (Circulation 98(4),str. 294 až 299, 1998). Studie in vivo dále ukázaly, že neutralizace anti vWF protilátek inhibují experimentální trombózu, což potvrzuje esenciální úlohu vVF Při vytváření thrombu (Thromb. Haemost 79, str. 202 až 210, 1998). Kromě toho se stále více se rozšiřujícím používáním angioplastických technik při akutních koronárních syndromech, které nevyhnutelně vedou k poškozování cévní stěny a k expozici kolagenu, narůstá potřeba strategií, které zasahují farmakologicky co nejdříve během kaskády ulpívání, aktivace a agregace destiček8

Dvěma hlavními směry léčení, kterých se běžně používá ve snaze ovládat ulpívání destiček, aktivace a následné trombózy a vnitřní hyperplazie, jsou protidestičková Činidla a podávání ant i trombot. ik. Ačkoli drogy, jako aspirin, účinně blokují syntesu Thromboxanu A2 inhibici cyklooxygenázové dráhy, nepůsobí preventivně na kolagenem vyvolané ulpívání a shlukování destiček, což stimuluje vývoj vnitřní hyperplazie. Použití heparinu jako antithrombotického činidla je spojeno s komplikacemi a omezením včetně nepředvídatelné odezvy na dávku potřebnou k výlučně laboratornímu sledování, omezené aktivity proti thrombinu vázanému na shluk, četných inhibičních míst, závislosti na antithrombinu III, riziku hlavního krvácení stejně jako nutnosti trvalé infuse. Ideální terapeutické činidlo by bylo zřejmě takové, které by produkovalo místně specifické a lokalizované účinky bez systemické distribuce nebo zobecněné koagulopatie.

Je zřejmé, že včasné kroky, které předejdou kaskádě dějů vedoucích k trombóze a k pozdější vnitřní hyperplazii vycházejí z interakce mezi exponovaným subendotheliálním kolagenem v místě poranění cévy a monovrstvy destiček, které ulpí na exponovaném kolagenu. Specifický inhibitor ulpívání destiček na subendotheliálním kolagenu může tedy sloužit k prevenci nebo alespoň ke zmírnění vývoje thrombu a vnitřní hyperplazie.

Uvádějí se četné látky získané z pijavic k inhibici interakce mezi kolagenem a destičkami (Blood 85(3), str. 705 až 711, 1995; Platelets 11(2), str.83 až 86, 2000; J. Biol. Chem. 267(10), str. 6893 až 6898, 1992; J. Biol. Chem.267(10), str. 6899 až 6904, 1992; Blood Coagul Fibrinolysis 2(1), str. 179 až 184, 1991). Uvádí se, že destabiláza, kterou je isopeptldáza, s fibrin depolymerizační aktivitou izolovaná z Hirudo médie i nalis inhibuje agregaci detiček vyvolanou různými agonisty, včetně kolagenu s domněnkou, že se váže přímo na membránu destiček (Platelet 11(2),str. 83 až 86, 2000). Pijavicový pro9 tidestičkový protein (LAPP), protein přibližně 13 kDa ze slin Haementeria officinalis, inhibuje ulpívání destiček na kolagenu za statických podmínek (J. Biol. Chem. 267(10), str.6899 až 6904, 1992; Thromb. Haemost 82(3), str. 1160 až 1163, 1999) a zvýšeného průtoku (Arterioseler Thromb- Vasc. Biol 15(9), str. 1424 až 1431, 1995) a ovlivňuje vazbu jak vWF tak destiček GP Ia/IIa zprostředkovanou na kolagen (Throm. Haemost 82(3), str. 1160 až 1163 1999). Calin je přibližně 65 kDa protein z Hirudo médieinalis pro který se objevil podobný profil. Calin inhibuje také interakce kolagen-destičky jak za statických tak za průtokových podmínek (Blood 85(3) str. 705 až 711, 1995; Blood Coagul Fibrinolysis 2(1), str. 179 až 184 1991; Throm. Haemost 82(3), str. 1160 až 1163 1999). Kromě toho jsou LAPP a Calin mocnými inhibitory agregace destiček vyvolané kolagenem, inhibují agregaci a koncentraci podobně jako látky, které blokují vWF vazbu na kolagen (J. Biol. Chem. 267(10), str.6893 až 6898, 1992; Blood Coagul Fibrinolysis 2(1), str. 179 až 184, 1991; Blood 85(3) str. 712 až 719, 1995).

Jak LAPP, tak Calin byly vyhodnocovány na modelech thrombózy in vivo se smíšeným úspěchem. LAPP selhal ve snižování tvorby thrombu na kolagenem vyvolané agregaci destiček (Arterioscler Thromb 13(1), str.1593 až 1601, 1993), zatímco Calin inhiboval v závislosti na dávce tvoření thrombu na modelu cévní trombózy křečka (Blood 85(3), str. 712 až 719, 1995).

V oboru jsou známy netrombogenické a antitrombogenické povlaky pro stenty a katétry. Netrombogenické povlaky a produkty jsou založeny na modifikovaných a pokrokových polymerech a jejich příklady jsou uvedeny ve světových patentových spisech číslo W0 93/01221 a W0 98/30615.

Ant i trombot ické a antirest-enózní povlaky jsou obecně biologicky snášenlivé povlaky, které mohou sloužit také jako zásobníky pro místní uvolňování drog. Povlaky jsou hlavně žalo10 • ·· ·· ···· ·· ···· ···· · · · ·· · • · · · · · · · · · • · ···· »··· ··· ···· ·· ·· ·· ·· ženy na hydrogelech a v patentové literatuře jsou popsány způsoby přípravy hydrogelů různých typů a povlakových léčiv se týkají světové patentové spisy číslo ¥0 92/11896, W0 98/11828, W0 01/47572,evropský patentový spis číslo EP 0887369 a světový patentový spis Číslo W0 01/39811.

Profil uvolňování léčebných látek, obsažených v povlacích, může být nastaven například měněním tloušťky vrstev polymerů nebo volbou specifických polymerních povlaků, které přispívají vybranými fyzikocheroickými vlastnostmi (jako je šarže, hydrofobicita, hydrofi 1icita) a/nebo přípravou povlaku jako různé vrstvy. Kriteria pro volbu polymeru a optimalizaci rychlosti jeho uvolňování jsou pracovníkům v oboru známá. Jiné povlaky jsou popsány v literatuře (Físchell Circulation 94, str- 1494 až 95, 1996; Topol a kol., Circulation 98, str. 1802 až 1820, 1998; a McNair a kol., Device Technology str. 16 až 22, 1996).

Používání stentů, drátů a katétrů v kardiovaskulárním systému je běžnou praxí a poranění cévních stěn, embolizace a následná restenóza jsou hlavním problémem, kterým se kardiologové zabývají během chirurgického zákroku a po něm nebo po katétrizaci. Alternativní způsoby, jako endaterektomie, vyvolávají stejné problémy. U každého procesu, při němž se manipuluje s tepnami, tedy vaskulární chirurgie a angioplastika, existuje podezření na rozvoj vnitřní hyperplazie. Užitečnost metod k prevenci a potlačení vývoje vnitřní hyperlas ie nemůže být více zdůrazňována a přednosti metody schopné provádění bez vytvoření systémických účinků je stále více věnována pozornost

Proto je zřejmá potřeba nových a zlepšených léčiv a způsobů zabraňujících původním jevům ve pathofysiologii (například ulpívání destiček) a od příspěvků v této oblasti se očekává snížení potíží a úmrtnosti spojených s angioplastikou a s chirurgickými postupy.

• · ···» • · · ♦ · · · · .· ···· · · · · · • · · · · · ···· ······· · · ·· · · · ·

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu je použití polypeptidu Saratin k výrobě léčiv pro zabránění hromadění destiček po cévním poranění a endartektomii, při kterém se dodává do cévní tkáně terapeuticky účinné množství Saratinu, které předchází ulpívání destiček a tím brání thrombóze a restenóze.

Obecně se vynález týká zavádění nedávno popsaného inhibitoru ulpívání destiček Seratinu do vybraných míst nebo na ně uvnitř nebo na lumenu v tkáni, například v cévním systému nebo orgánu, za podmínek kdy může být Saratinu použito lokálně jako povrchového činidla nebo jako ulpělého povlaku na povrchu k prevenci a k inhibici nežádoucí thrombotické a/nebo restenotické odezvy na poranění cévních stěn, včetně poranění spojeného s angioplastikou, se stenty, s dialyzačními a s jinými cévními štěpy a k léčeni benigních hypertrofických jizev, stejně jako k léčení a k pasivaci nestabilních aterosklerotických destiček.

Saratin je nedávno popsaný (světový patentový spis číslo WO 00/56885) rekombinantní protein 12kD původně izolovaný z pijavic. Protein inhibuje vazbu destiček, závislou na vVF, na kolageny cévní stěny za podmínek zvýšeného smyku a pro tuto charakteristiku je Saratin vhodný k inhibici arteriální trombózy. Další nově objevenou vlastností Saratinu je možnost jeho použití zevně v místě poranění za výhodného snížení trombózy nebo vnitřní hyperplazie bez jakýchkoli systemických účinků. To představuje působení se specifickými a lokalizovanými účinky dobře se hodícími pro aplikaci jak například chirurgy, tak intervenčními radiology.

Saratin je možno kombinovat s řadou terapeutických činidel pro uvolňování v místě. Příklady pro použití v koronárně-arteriálních aplikacích jsou antithrombotické činidla, napři- 12 ·· ···· 00 0000 •••0 00« 0 »000 0 0 0 0 0·· 0000 0 < 0000 0000 0000· 00 <0 00 00 klad prostacyklin, a salicyláty, thrombolytická činidla, například streptokináza, urokináza, tkáňový plasminogenní aktivátor (TPA) a anisoylovaný plasminogen-streptokinázový aktivát-orový komplex (APSAC), vasodi latační činidla, například nitráty, drogy blokující vápníkové kanálky, anti-proliferativní činidla, například kolchicin a alkylační činidla, vmezeřená činidla, faktory modulující růst, jako jsou interleukiny, transformační růstový faktor-beta a kongenery růstového faktoru odvozeného z destiček, monoklonální protilátky zaměřené proti růstovým faktorům, protizánětlivá činidla steroidní a nesteroidní a jiná činidla, která mohou upravovat cévní tonus, funkci, artheriosklerózu a léčivou odezvu na poranění cév nebo orgánů po zákroku. Uvádějí se také antibiotika v kombinaci s povlaky podle vynálezu. Kromě toho mflže být povlaku použito k ovlivnění farmaceutického uvolňování cíleně uvnitř cévní stěny. Začleněním účinné látky v bobtnáte1néra polymeru, se účinná látka uvolní při nabobtnání polymeru.

V jednom provedení je povlak zhotoven z hydro-gelu, jako jsou polyethylenoxid, hydrofilní polymethakryláty a hydrofilní polyuretany.

Vynález se dále týká použití Saratinu a derivátů cestou zařízení/katétrfl k lokálnímu uvolňování nebo stentfl a stentových povlaků a cévních štěpů a například pro technologie povlékání stepů. Vynález se týká také podávání Saratinu v prostředcích, které uvolňují regulovaná množství Saratinu během času v lokalizované oblasti.

Zejména se jedno provedení vynálezu týká použití zařízení na bázi katétrfl k dodávání Saratinu lokálně. Saratinu mflže být také použito k uvolňování bez dalších terapeutických činidel nebo s nimi z polymerní matrice do tělesných tkání pomocí katétrfl. Základním požadavkem pro použití polymerního materiálu v tomto způsobu jsou biologická snášenlivost a vlastnosti u13 • * • · · · · · • · · · · ··· • · * · · ··«· · • · « · · · ···· ··· ···· ·· ·· ·· volňování drogy, které múze být přizpůsobeno specifické aplikaci .

Lokální řízené uvolňování Saratinu lze dosáhnout pouze permeačně, pouze iontoforézou, pouze elektroporací nebo kombinované iontoforézy a elektroporace může být použito k uvolňování začleněného Saratinu účinně uvnitř cévního lumenu. S výhodou je katétr schopen vykonávat postupy určené k uchování vysoké koncentrace drogy ve vybraném prostoru cévy tak, že výsledky dávají zlepšený povlak samotného Saratinu nebo s přídavnými léčebnými činidly.

Vynález je obzvláště použitelný k lokálnímu uvolňování Saratinu během intervenčních kardiologických postupů a po nich, jako je angioplastika a implantace stentu a endarterektomie.

Vynález blíže objasňuje následující podrobný popis a připojené obrázky.

Seznam obrázků na výkresech

Na obr. 1 je znázorněn vliv Saratinu na vazbu vyčištěného lidského vWF na lidský kolagen typu I (kroužky) a II (čtverečky) a kolagen telecí kůže (trojúhelníčky). IC50 u typu I = 0,23+0,004 yg ml^-1, typu III = 0,81+0,04 yg ml¹ a kolagenu telecí kůže = 0,44+0,008 yg ml^-1. Na ose X je koncentrace Saratinu (yg ml^-1), na ose Y je zbytkové ulpění (^ kontroly).

Na obr. 2 je znázorněn vliv smyku na tvoření agregátu destiček inhibici Saratinem u lidského kolagenu typu III v průtokové komůrce in vitro. Kroužky znamenají rychlost smyku 2700 s^-1(IC50 = 0,96+0,25 yg ml^-1), zatímco čtverečky ukazují rychlost smyku 1300 s^-1 (IC50 = 5,2±1,4 yg ml^-1). Na ose X je koncentrace Saratinu (yg ml^-1), na ose Y je pokrytí povrchu (% kontro1y).

» · · · · · »· ··♦·

Na obr. 3 je Scatchardova analýza vazby Saratinu na imobllizovaný lidský kolagen zjištěný plasmonovou povrchovou resonancí, ukazující existenci vysoké afinity CKa = 5xlO^-8M, plná čára) a nízké afinity CKu = 2xlO~⁶M, přerušovaná čára) vazebního místa pro Saratin na kolagen III. Na ose X jsou jednotky resonance, na ose Y ReqtSaratinu]x 10⁷ (RU/M^-1).

Na obr. 4 je vyznačen počet destiček ulpělých na exponovaném subendotheliálním povrchu tři hodiny po karodidové endarterektomii, ve srovnání aplikace Saratinu (n=7) a kontrolní skupiny (n=10). Údaje jsou prflměry ± SE. Saratinová skupina dostala povrchově 5 μΐ roztoku Saratinu na exponovaný subsendotheliální povrch. Hvězdička znamená hodnotu P 0,05. Na ose X je kontrola a Saratin, na ose Y je počet destiček na mřížce tři hodiny po CEA.

Na obr. 5 je vyznačen počet destiček ulpělých na exponovaném subendotheliálním povrchu 24 hodin po karodidové endarterektomii, ve srovnání aplikace Saratinu (n=9) a kontrolní skupiny (n=10). Údaje jsou prflměry ±SE. Počet destiček je zjištěn pomocí řádkovacího elektronového mikroskopu. Saratinová skupina dostala povrchově 5 μΐ roztoku Saratinu na exponovaný subendothel iá lni povrch. Hvězdička znamená hodnotu P 0,01. Na ose X je kontrola a Saratin, na ose Y je počet destiček na mřížce 24 hodin po CEA.

Na obr. 6 je snímek z elektronového mikroskopu při zvětšení 2000 x endarterektomizované krysí krční arterie tři hodiny po karotidové endarterektomii. A je kontrolní povrch, B je povrch s povrchově aplikovaným Saratinem (5 μΐ). Kontrolní povrch vykazuje hojné buněčné elementy včetně fibrinových pruhfl, červených krvinek a destiček. Povrch ošetřený Saratinem vykazuje výrazně méně buněčných elementů.

Na obr. 7 je snímek z elektronového mikroskopu při zvětšení * ·* ·· ···· 9» ···· ··*· ·· · · · · • · · · · ··>

• · · · · · · « · « • · ···· · · · · ·*· ···· ·· «· «y ··

2000 x endarterektomizované krysí krční arterie 24 hodiny po karotidové endarterektomii. A je kontrolní povrch, B je povrch s povrchově aplikovaným Saratinem <5 pl). Kontrolní povrch vykazuje četné červeně krvinky a destičky. Povrch ošetřený Saratinem vykazuje výrazně méně buněčných elementů.

Na obr. 8 je procento lumenální stenózy sekundárně vůči vnitřní hyperplazii dva týdny po karotidové endarterektomii. Je vyznačena Saratinová (n=15) a kontrolní <n=10) skupina. Saratinová skupina dostala povrchově 5 pl roztoku Saratinu na exponovaný subendothelíální povrch. Na ose X je kontrola a Saratln, na ose Y je vnitřní hyperplazie (procento lumenální stenózy ) .

Na obr. 9 jsou příčné řezy krčních arterií ukazující nížení vnitřní hyperplazie v Saratinem ošetřených arteriích (B) ve srovnání s neošetřenou kontrolou (A) u krys. IH = intimal hyperplazie.

Vhodný rekombinantní Saratin pro použití podle vynálezu byl expresován a izolován z Hansenula polymorpha a zjistilo se, že působí blokováním vVF vazby na kolagen a účinně preventivně působí na ulpívání destiček na kolagen za zvýšeného smyku. V závislostí na dávce inhibuje Saratin vazbu vyčištěného lidského vWF na lidské kolageny typu I a III IC50 ~ 0,23±0,004 a 0,81±0,04 pg ml^-1) a na kolagen telecí kůže (IC5O=0,44±0,008 pg ml^-1). Kromě toho vykazuje Saratin podobnou inhibiční schopnost proti vazbě lidské, hlodavci a vepřové plasmové vVF na tyto kolageny. V průtokové komůrce za podmínek zvýšeného smyku <2700 s^-1), inhibuje Saratin závisle na dávce a mocně vytváření shluků destiček na kolagenem povlečeném povrchu <1050= 0,96±0,25 pg ml^-1), avšak při sníženém smyku (1300 s^-1 ) se pozoruje posun křivky závislosti na dávce doprava (IC50 = 5,2 ±1,4 pg ml^-1). Povrchové analýzy plasmonové resonance ukázaly vazební místa pro Saratin jak s vysokou tak s nízkou a16 • * · · 4 9 9 · 9 9 · 9 9·· • · · * · · 9 99 9

999« 999

9999 9999 9

9 9999 9999

9 9 999 99 94 99 ·· finitou na lidský kolagen typu III (Kd 5xlO^_8M a 2xlO~⁶M) a ačkoli nízké koncentrace Saratinu, které inhibují ulpívání destiček za zvýšeného smyku Cnapříklad nasycení vazebních míst s vysokou afinitou), neměly žádný účinek na kolagenem vyvolanou agregaci destiček nezávislou na vWF, zjistilo se, že vysoké koncentrace (například nasycení vazebních míst s nízkou afinitou) inhibují shlukování destiček. Tyto údaje dokládají, že Saratin je mocným inhibitorem ulpívání destiček na kolagenu závislé na vWF, což je základ pro terapeutický potenciál jako antithrombického činidla.

Studie dále ukázaly, že Saratin mocně a závisle na dávce inhibuje vazbu vWF nejenom na kolagen telecí kůže, ale na lidský kolagen typu I a III, z nichž oba jsou v hojné míře v sub-endotheliálních vrstvách stěn arterií a má se zato, že jsou významné pro interakce destiček se stěnami cév. (Thromb. Haemost 78(1), str. 434 až 438, 1997). Jelikož k interakcím kolagen-vWF-GP Ib/IX/V dochází při dostatečně velkém smyku, je významným význakem tohoto vynálezu předvedení účinnosti Saratinu nejenom za statických podmínek, ale také v prostředí, které blíže napodobuje situaci, k níž dochází in vivo. V průtokové komůrce, kde mohou být smykové síly měněny k simulaci takového prostředí, Saratin zřetelně inhibuje shlukování destiček na kolagenu, obzvláště při vyšším smyku. Posunutí křivky dávka-odezva doprava jako výsledku snižování smyku je pozoruhodné v tom, že účinnost Saratinu in vivo může být lokalizována na místa s vysokým smykem, kde dochází k přerušování laminárního proudění krve, pocházejícího ze změn na endotheliálním povrchu vůči krvi, například v přítomnosti aterosklerotického plaku nebo po mechanickém zásahu.

Studie povrchové plasmonové resonance se Saratinem ukázaly, že kolagen může mít dvě nezávislá vazební místa pro Saratin, jedno s vysokou afinitou a druhé s nízkou afinitou. Inhibice vazby vWF na kolagen způsobovaná Saratinem je vysvětle- 17 · 99 ···· ·· 9 99·

9 9 9 9 9 9 ·

9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9

9 999 9 9 99 · · 99 na nasycením vazebního místa s vysokou afinitou s hodnotami IC50 přibližně 5xlO^_8M, tedy rovnou disociační konstantě pro toto místo. Jelikož na vVF nezávislé, kolagenem vyvolané agregace destiček bylo zabráněno pouze při velmi vysokých dávkách Saratinu, (nad 100 μΜ), jeví se, že nasycení vazebního místa kolagenu s nízkou afinitou souvisí s inhibicí přímých interakcí receptor kolagenu-kolagen.

Vynález se dále týká účinku Saratinu na ovlivnění místního okolí endarterektomizované cévy bez potřeby systemické distribuce a bez měnění funkce destiček nebo měnění koagulace, čímž je ideální modalitou pro topickou aplikaci v průběhu vaskulárních chirurgických a intervenčních radiologických procedur.

Z tohoto hlediska vynálezu terapeutické působení Saratinu se zkoumalo za použití krysího karotidového endarterektomického (CEA) modelu popsaného v literatuře (J. Vasc. Surg.28, str. 909 až 918, 1998). PLT aktivace se považuje za iniciační stupeň v post CEA trombóze a restenóze v důsledku IH. Pozorovalo se, že topická aplikace Saratinu na lumenální povrch snižuje míru ulpívání destiček na endarterektomizovanou arterií a tak snižuje pooperační trombózu a IH.

Jakožto souhrn experimentálních výsledků působení Saratinu proti ulpívání destiček po dvou odlišných pooperačních dobách se naznačuje, že počet ulpělých destiček po třech hodinách (obr.4) a po 24 hodinách (obr. 5) po endarterektomii krční arterie je významně nižší u krys ošetřených Saratinem ve srovnání s kontrolními krysami.

Ulpívání destiček se sníží o 59 % po třech hodinách (64 + 17,2 proti 155 ± 33,4 PLT na mřížku P=0,05) a o 72 % po 24 hodinách (35+11,3 oproti 149 +36,6 PLT na mřížku P=0110). Ulpění destiček je podobné po třech hodinách a 24 hodinách • · · · · * « · 9 9 9 99 9

9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9

9 99‘9 99 ·· ·· 99 u kontrolních skupin, nevykazuje však pokles u Saratinem ošetřené skupiny ze 64 na 35 destiček na mřížku.

Obr. 6 a 7 ukazují typické představitele endarterektomizovaného povrchu s topickým Saratinem a bez něho v rádkovacím elektronovém mikroskopu ve 2000-násobném zvětšení. Obr. 6A ukazuje kontrolní povrch tři hodiny po karotidové endarterektomii s výrazným nadměrným buněčným materiálem, fibrinovými pruhy, četnými krvinkami a četnými destičkami, které jsou zřejmé. Obr. 6B ukazuje Saratinem ošetřený povrch tři hodiny po karotidové endarterektomi i. Patrná je nepřítomnost buněčných prvků a téměř nebráněný povrch kolagenu. Obr. 7A ukazuje kontrolní povrch 24 hodiny po karotidové endarterektomi i, kde jsou destičky patrné jako malé bílé tečky. Obr.7Et je Saratinem ošetřený povrch 24 hodiny po karotidové endarterektomi i. Zřetelné je snížení ulpělých destiček pří ošetření Saratinem.

Aplikace povrchového Saratinu po karotidové endarterektomi i výrazně snižuje vývoj vnitrní hyperplazie ve srovnání s kontrolní skupinou. Procento lumenální stenózy jako míra IH je významně snížena při Saratinové aplikaci ve srovnání s kontrolou. Tento pokles vytváření IH je v korelaci s inhibici ulpívání PLT. Vyjádřeno lumenální stenózou vykazují kontrolní krysy 29,8±6,8 %, p=0,0Q42 lumenální stenózy oproti 10,9 ±1,8 % průměru lumenální stenózy ve skupině ošetřené Saratinem (obr. 6). Saratinem ošetřené krysy mají o 18,9 % větší lumenální průměr než kontrolní krysy. Dva týdny po karotidové endarterektomii se u 5 z 15 krys (15 vyvinul úplný trombus karotidové arterie při histologické analýze, zatímco u O z 15 krys ošetrených Saratinem (O se nevyvinula karotidová trombóza. Pravděpodobnostní poměr Chi Square analýzy vykazuje rozdíl poměru 16,238, což znamená, že rozdíly kontrolní skupiny s vývojem okluzivní trombózy je 16 x větší než u krys ošetřených Saratinem P=0,0156.

• 0 00 000« 0« 0000 0 0 · 0 «00 0 • 0 0 0 0 0 0 • 00« 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0000 00000 0« 0« 0« «0

U Saratinové skupiny se nevyskytlo zvýšené krvácení podél linie arteriálního švu. Ukázalo se, že doby krvácení a systemický počet destiček u Saratinera ošetřených krys se příliš neliší od kontrolních krys 3 a 24 hodin po endarterektomii.

Model CEA se těsně podobá lidské operaci CEA a výsledky tedy navrhují mechanismus pro snižování škodlivých účinků ulpívání destiček a jejich shlukování v místě endarterektomie, aniž ovlivňují systemicky funkci destiček nebo pokles hemostáze. Jednoduchá zevní aplikace Saratinu během krysí CEA snižuje ulpívání destiček, jejich shlukování a následnou restenózu v karotidovém lůžku díky vnitřní hyperplazie.

Tabulka I uvádí výsledky doby krvácení a počtu destiček. Není patrný velký rozdíl mezi dobami krvácení před operací a po ní. Nezjistují se významné rozdíly počtu destiček mezi krysami ošetřenými Saratinem a kontrolními krysami.

Tabulka I

Doby krvácení před a po operaci a počty destiček.

Čas	Stav	Počet destiček	Doba krvácení
Před operac í	kontrola	752+36,05xl0³	11,9+0,91 minut
Před operac í	Saratin	829±33,85xl0³	8,6+0,62 minut
3 hod i ny	kontrola	604±34,20xl0³	10,8+0,90 minut
3 hodiny	Saratin	590+76,OOxlO³	9,1+0,50 minut
24 hodin	kontrola	694+117 x 10³	12,9+1,10 minut
24 hod i n	Saratin	729+19 x 10³	11,5+1,30 minut

Ukázal se významný pokles ulpívání destiček a jejich akumulace po cévním poranění podobném endarterektomii. Snížené • * • 4 « ·

4444

4444 444

4444 44«· 4

4 4444 4444

444 4444 44 ·· ·4 44 ulpívání destiček je patrné jak okamžitě po endarterektomii (tri hodiny), tak po 24 hodinách. Účinek po 24 hodinách je významný a má se zato, že tento jev není způsoben přímým inhibičním účinkem Saratinu na kolagen (poločas Saratinu je 90 minut), spíše je způsoben počáteční inhibicí agregací destiček a následným přerušením aktivační kaskády destiček. Pokud je zpočátku zabráněno, aby destičky dosáhly exponovaného kolagenu, nemůže destičková kaskáda pokračovat. Obr. 4 a 5 ukazují, že zevní aplikace Saratinu na dříve poraněnou cévu může bránit ulpívání destiček významnou měrou. Saratin zabránil ulpívání destiček ze 60 % po třech hodinách a ze 75 % po 24 hodinách. Tato inhibice je patrná z viditelného rozdílu ukládání buněčných elementů mezi kontrolou a Saratinem ošetřenými arteriemi jak po třech, tak po 24 hodinách (obr. 7 a 8). Chybějící buněčná odezva je pravděpodobně způsobena inhibicí ulpívání destiček. To představuje jedinečný způsob léčby inhibicí ulpívání destiček na poškozenou arterii. Kontrolní krysy měly významně zmenšený 1uměnálni průměr dva týdny po karotidové endarterektomi i, ve srovnání s krysami ošetřenými Saratinem (obr. 9). U krys, ošetřených Saratinem, byla podstatně snížena míra vývoje vnitřní hyperplazie, což je v souladu se zmenšeným ulpíváním a hromaděním destiček. Poznatek snížené vnitřní hyperplazie a trombózy, které jsou v souvislosti se sníženným ulpíváním destiček, vedou ke klinicky významným závěrům a důsledkům sníženého ulpívání destiček. To dokládá, že pro místo specifická nesystemická inhibice agregace destiček a ulpívání vede ke snížené trombóze a rychlosti okluze a tudíž snižuje výskyt cerebrovaskulárních příhod podmíněných post. karot-idovou endarterektomií. Míra zlepšení vnitřní hyperplazie a 1uměnálni stenózy je dále doložena významným poznatkem klesající rychlosti trombózy u krys ošetřených Saratinem. Plných 33 % kontrolních krys vykázalo trombózu, zatímco žádná ze Saratinem ošetřených karotidových arterii nebyla zasažena trombózou. Mimořádný klinický význam má chybějící systemický jev doložený tímto činidlem. Lokální aplikace Saratinu neměla žádný účinek na syste21 • * φφφφ ** φφφφ • ΦΦΦΦΦ φφφ φ • · φ » · φφφφ φ • · φφφφ φφφφ • ΦΦ φφφφ φφ φφ ·· mické doby krvácení nebo na počet destiček- To znamená, že snížené ulpívání destiček a následný pokles trombózy a vnitrní hyperplazie jsou výsledkem lokálních účinků. Tyto nové poznatky, týkající se Saratinu, jsou určitě významné v tom, že je široké spektrum klinických aplikací pro modalitu, která je schopna lokálně zabraňovat škodlivým účinkům ulpívání destiček a aktivace bez narušení systémického hemostatického mechanismu.

Bylo již dříve zdůrazňováno, že různé léčebné zásahy vyvolávají místní poranění, které by bylo možno ideálně bezprostředně a místně ošetřit. Neošetřené ponechané poraněné buňky zahájí řadu procesů zakrnujících srážení, dodatečnou aktivaci a buněčnou odezvu k uvolnění cytokinů, k indukci proliferace a jiné biologicky aktivní procesy. Je obtížné tyto komplexní, navzájem propojené procesy zastavit, jakmile jednou začaly.

Podle vynálezu je tedy významné, že Saratin je umístěn přímo v manipulované tkáni. Jiným význakem lokální aplikace je minimalizace potenciálních problémů týkajících se systemických účinků drog použitých k zásahu.

Ideálně může být Saratinové ošetření podáno souběžně s příslušným terapeutickým zákrokem, kterého lze dosáhnout začleněním Saratinu do povrchu chirurgického zařízení, jako je balónkový katétr nebo jiné zařízení nebo jeho část. Jiným význakem by mohlo také být přímé povlečení poraněných cév Saratinem.

Kromě toho může být Saratinových uvolňovacích způsobů rovněž využito ve vynálezu ve formě volné tekutiny, včetně kombinací s ostatními léčivými prostředky. Určitý význam má však použití matric polymer/hydrogel oproti uvolňování z volné tekutiny. Uvolňování činidla, které bylo začleněno do polymerové matrice nevyžaduje dodatečné 1uměny k podpoře katétru k zavádění volného kapalinového roztoku drogy do ošetřovného místa a k jeho odvádění22 ♦ 4 *· ·* ···« • · 9 9 9 9 • ··*· • · 9 9 « · · • · · 9 9 9 9 9

99 99 99

Kromě toho eliminují polymerové matrice riziko dopředného unikání roztoku drogy vlivem vadného utěsnění cévních úseků balónkem, čímž zabraňují riziku vystavení necílené tkáně vysokým koncentracím drogy.

Obecným technickým řešením místní aplikace Saratinu at jako léčiva nebo jako povlaku poraněné cévy, je například začlenění Saratinu do polymerového nebo hydrogelového povlaku.

Pokud jde o polymerní prostředek, znamená zde použitý pojem hydrogel syntetické polymery s póry nebo dutinami různých velikostí a kapacit a proměnlivých fyzikochemických vlastností obzvláště s ohledem na náplň nebo hydrofi 1ní/hydrofóbní povahu gelové matrice, která může být zavedena během výroby povlaku nebo povlečeného zařízení. Pracovníkům v oboru je známa řada syntetických elastomerů a v přírodě se vyskytujících polymerních materiálů. Saratin může být začleněn do matrice buď při výrobě polymeru, nebo může být přidán po povlečení nebo formování polymeru do požadovaného tvaru. Kromě toho může být použito mnoho z řady různých polymerních materiálů a způsobů výroby k vytvoření polymerních matric použitých podle vynálezu, jaakožto příklady vhodných polymerních materiálů nebo kombinací se bez záměru na jakémkoliv omezení uvádějí biologicky snášenlivé a/nebo biologicky odbouratelné polymery.

Některé alkylakryláty a alkylkyanoakryláty byly zkoumány se zřetelem na chirurgické využití a jako obzvláště vhodné byly zjištěny některé isobutylkyanoakryláty.

Typický hydrogelový polymer je možno připravit ze směsi monomerů obsahující hmotnostně 40 až 60 dílů vyčištěného monoesteru hydroxya1kylakry1átu majícího jedinou olefickou dvojnou vazbu, 40 až 60 dílů metakrylového monomeru obsahujícího jednu olefinickou dvojnou vazbu a 0,001 až 5 dílů iniciátoru polymerace. Polymerace může být provedena běžnými způsoby polymerace ··♦· · · ···« • 9 9 9 · · 9 • · • ·*♦· • · « · · · • · · · 9 9 9

99 99 ve hmotě, v roztoku, v suspensi nebo v emulsi. Použitá polyraerační technika závisí na objemu požadovaného polymeru a na povaze vyráběného konečného produktu. Typický hydrogelový produkt se popisuje molovým poměrem monoesteru k metakrylovemu monomeru v rozmezí 1 = 1 až 2,3=1, s výhodou 1,5=1, přičemž průměr pórů polymeru je větší než 9 nM.

Jakožto monoester hydroxyalkylakrylátu majícího jedinou olefinickou dvojnou vazbu zahrnují přijatelné sloučeniny příkladně, tedy bez záměru na jakémkoliv omezení, 2-hydroxyethy1methakrylát, glycerylmethakrylát, 2-hydroxypropylmethakrylát, glycidylmethakrylát, 2-hydroxyet.hy 1 akry lát a 2-hydroxypropy1akrylát. Přijatelnými metakrylátovými monomery jsou kyselina methakrylová, methakrylamid 5 a methakrylonitri 1.

Iniciátor polymerace může záviset na způsobu polymerace nebo na konečném záměrném použití polymeru. Má-li být například polymer formován jako pevný předmět, může být použito volných radikálových iniciátorů.

Mezi výhodné iniciátory tohoto typu patří difunkční polyestery jako je 2,5-dimethyl-2,5-bis(2-ethylhexoylperoxy)hexan, nebo terciární butylperoxypivi lát. Jinak, pokud je konečným použitím polymeru povlak nanášený ve formě směsi monomerů a je polymerován in šitu, může být iniciátor radiačně aktivovaný, jako UV katalyzátor 2,2-azobis-(2-methylpropionitri 1) nebo azobisbutyronitri 1 CAIBN). Použití iniciátorů není v příslušných metodách polymerace omezeno nebo pro příslušný konečný produkt. Například v povlacích může být použito volných radikálových iniciátorů a k formování pevných předmětů může být použito radiačně aktivovaných iniciátorů.

Vedle v podstatě podobných frakcí monoesterových a methakrylových monomerů, může být směs monomerů podpořena stopovým množstvím alkylakrylátu s dlouhým řetězcem nebo monoakrylátes24

♦ · «·φ· ·* ·*·· terového komonomeru, jako je cyklohexylmethakrylát, trimethylolpropantrimethakrylát nebo ethylenglykoldimethakrylát. Takové přídavné komonomery podporují zesítění polymeru v situacích, kdy je požadována přídavná pevnost polymeru. Stopová množství těchto monomerů jsou obvykle menší než 0,1 % hmotnosti směsi monomerů jako celku.

Hydrogelové polymery, použité podle vynálezu, mohou být formovány k produkci výrobku, který je dostatečně zesítěn vnitřním působením, takže výsledný výrobek nevyžaduje žádné další zesítovací monomery.

Dalšími příklady bilogicky odbourátelných polymerů jsou poly(laktidy), polyglykolidy, polyanhydridy, polyorthoestery, polyaktaly, polydihydropyrany, polykyanoakryláty a jejich kopolymery s polyethylenglýkolem. Mohou být ve formě kopolymerních hydrogelů nebo zesítěných polymerních sítoví, do kterých mohou být začleněny drogy k usnadnění lokálního uvolňování buď během polymerace nebo v případě některých hydrogelů dodatečným plněním. Vhodné matrice se upravují podle molekulárních charakteristik činidla, které má řídit volnou difúzi směrem ven.

Je možno konstruovat řadu typů katét-rů a jiných lékařských pomůcek povlečených Saratinem k použití podle individuálních terapeutických potřeb, pro které byly zkonstruovány, nebo víceúčelové použití k lokálnímu uvolňování Saratinem plněného polymeru. Vynález byl testován s balónkovým katétrem (obchodní produkt Blue medical Devices BV G0 společnosti Blue raedical), není však omezen na tento t.yp katét-ru.

Vynález objasňují, nijak však neomezují následující příklady praktického provedení25 • t »9 • « » * * · · • 4 » « *#♦· ·· • · ♦ « • 9 9 9

9 9 9 « • 9 9 9 9 • ·· 99

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Vyčištěný vWF a vazba destiček na kolagen za statických podmínek

Na mikrotitračních destičkách se zkoumá vazba vWF na kolagen, v podstatě jak je popsáno v literatuře (Blood 85(3), str. 705 až 711, 1995). Různě kolageny, jak lidský kolagen typu I a typu III tak kolagen telecí kůže (Sigma) se povléknou přes noc pipetou 50 μΐ kolagenu, rozpuštěného v 50 mM kyseliny octové a 125 pg ml^-1 do 96-důlkových destiček v přítomnosti 200 pl PBS k podpoře renaturace. Po zablokování nepovléčených míst BSA se do důlků přidá v přítomnosti Saratlnu vyčištěný lidský vVF (1,25 pg ml^-1 na destičky povlečené kolagenem telecí kůže a destičky povlečené kolagenem I; 0,625 pg ml^-1 na destičky povlečené kolagenem III) nebo se zředí normální plasma (lidská plasma: 1/80 na kolagen I a III; 1/20 na kolagen I a kolagen telecí kůže) a inkubuje se dvě hodiny (zředěná plasma) nebo jednu hodinu (vyčištěný vWF). Vazba zbytkového vWF na kolagen se stanoví po dalším promývacxm stupni pomocí králičího anti-vWF antiséra (Dako, Copenhagen, Dánsko) konjugovaných s křenovou peroxidázou, které se vyvinuly a měří se výsledná absorbance světla při 492 nm.

Když byly mikrotitrační destičky preinkubovány jak lidským kolagenem I, lidským kolagenem III tak kolagenem telecí kůže, je následná inkubace vyčištěného vWF v přítomnosti Saratinu spojována s inhibici na dávce závislé vazby vWF na kolagen, s hodnotami IC50 0,23+0,004, 0.81 + 0,04 a 0,44+0,008 pg ml'¹(obr. 1). Když se vyčištěný vWF nahradí zředěnou normální lidskou plasmou, zůstane inhlbiční potence Saratinu zachována (tabulka II).

·· • « • · « ···· ·· ··>(» • · • · · ·· • · · • * ♦ • · · · • · · · ·· ··

Tabulka II

IC50 koncentrace Saratinu potřebné k inhibicí ulpívání destiček v PRP z různých druhů vazby na lidský kolagen typu I & III a kolagen telecí kůže.

Saratin IC50 (pg/ml)

Zdroj plasmy	Typ kolagenu I	Typ kolagenu III	Kollagen telecí kůže
1 i dský	0,2	0,9	0,3
vepřový	0,2	0,5	0,5
křečka	0,4	nezj iStěno	7,0
myší	0,1	0,8	0,3

Saratin také inhibuje vazbu vWF ve zředěné vepřové, křečkové a myší plasmě k různým testovaným kolagenům, s konsistentně nejvyšší účinností vůči kolagenu I (tabulka I)

Příklad 2

Ulpívání destiček při zvýšeném smyku

Se zřetelem na význam smykových sil v ovládání na vWF závislém ulpívání destiček na kolagenu (J. Lab- Clin. Med83(2), str. 296 až 300, 1974) se provádí perfuzní studie v průtokové komůrce k vyzkoušení inhibičního působení Saratinu za podobných průtokových podmínek panujících v poraněných nebo ochorelých cévách. Kolagen telecí kůže se povleče na plastové dříve popsané krycí proužky (Blood 85(3), str. 705 až 711, 1995). Perfuze se provedou v perfuzní komůrce s rovnoběžnými deskami se dvěma překrytými držáky s výškou komůrky 0,4, 0,6 a 1,0 mm a se šířkou 10 mm za pulzujícího proudění (válečkovým ·· ···· čerpadlem, Vatson Marlov 603S VEL, Leuven, Belgie) za přibližných rychlostí smyku 2700, 1300 a 300 s“¹. Protisrážlivá plná krev (0,2 IU ml^-1 heparinu, Clexane s nízkou molekulovou hmotností) se nechá proudit 5 minut pres kolagenem pokryté krycí proužky, načež se opláchnuté krycí proužky vybarví činidlem Grunwald-Giemsa a pozorují se z hlediska ulpění destiček světelným mikroskopem analýzou obrazu popsanou v (Blood 85(3), str. 705 až 711, 1995) pomocí povrchového krytí jako kvantitativního parametru.

Při rychlosti smyku 2700 s^-1 inhibuje Saratin závisle na dávce ulpívání destiček s ICso=0,96±0,25 yg ml^-1 (obr. 2). avšak při mírnější rychlosti smyku 1300 s^-1 se pozoruje výrazné posunutí křivky závislosti na dávce doprava, s IC5O=5,2±1,4 yg (obr.2). Při žilných rychlostech smyku 300 s^-1 , nebyl Saratin schopen inhibovat ulpívání perf lisovaných destiček do 10 yg ml^-1.

Příklad 3

Proteinové interakce se identifikují a charakterizují SPR za použití zařízení BIAcore 3000 (BIAcore, Freiburg, Německo). Kopulační činidla se použijí podle protokolu dodávaného výrobcem. Kopulace na CMS čidlový čip se provádí prostřednictvím aktivoaných karboxylátových skupin na volné aminoskupiny lidského kolagenu typu III (Sigma). Průzkum hodnoty pH a kopulační chemie se provádějí za standardních podmínek (Anal Biochem. 198(2), str. 268 až 277, 1991; JAI Press Ltd., 1992). Pro kopulaci se kolagen zředí na 0,125 yl ml^-1 do 1O mM acetátového pufru (o hodnotě pH 4,5) řezu1tujícího do 331 rezonančních jednotek (RU) imobi1izovaného materiálu. Tato matrice se používá ke studiu vázání vyčištěného rekombinantního saratinu, který je zředěn do 20 mM Hepes (hodnota pH 7,4), 150 mM chloridu sodného, 5 mM EDTA, 0,005 % Tweenu 20. Všechny pokusy vázání se provádějí při teplotě 25 C. Titrace Saratinem se pro28 ·· vádí při koncentraci v rozmezí 7,8 nM až 10 μΜ. Výsledné experimentální hodnoty RU desek se vynesou podle rovnice

Rekv/koncentrace Saratinu = (-KaxRekv) ·*- (KftxRmax)·

Výsledkem titrace Saratinu na imobi1izovaném kolagenovém povrchu je vazba závislá na dávce. Maximální množství Saratinu, vázaného na kolagen na povrchu čidla, vede k signálu většímu než vypočtený maximální signál pro model vazby i^:l. To poukazuje na existenci více než jednoho vazebního místa pro Saratin na kolagen typu III, dále podpořenou pozorováním, že při datech modelu 1=1 podle Langmuira nebyly výsledky uspokoj ivé.

Schatchardova analýza dat SPR naznačuje existenci dvou různých vazebních míst s významně rozdílnými afinitami pro Saratin (obr.3). Výsledkem výpočtu rovnovážných konstant je disociační konstanta 5xl0^-8 M pro místo s vysokou afinitou a 2xl0^-6 M pro místo s nízkou afinitou.

Příklad 4

Agregace destiček

Specifické působení Saratinu na fungování destiček se dále vyhodnocuje studiemi agregace v plasmě bohaté na destičky s použitím kolagenu, ADP, ristocetinu, kyseliny arašidonové nebo thromboxan mimetického U46619 jako agonistů. Citrátovaná krev (3,13¾) od neléčených, zdravých dobrovolníků se odstředí (15 min, 100 g) k získání plasmy bohaté na destičky, do které se přidá Saratin (konečná koncentrace 0 až 200 ng/ml) jednu minutu před zavedením agregace destiček kolagenem (0,5 pg ml^-1ADP (2,5 μΜ) ristocetinem (0,9 mg ml^-1, kyselinou arašidonovou (1,0 mM) nebo IJ46619 (1,3 μΜ). Maximální agregace (amplituda) během 5 minut se pozoruje pro každý agonist.

• ·

Saratín selhává v inhibici maximální agregace na všech testovaných agonistech včetně kolagenu a konečných koncentracích do 40 yg ml^-1 (tabulka III).

Tabulka III

Účinek Saratinu na maximální agregaci destiček (%) v PRP vyvolanou různými agonisty s vyznačenými konečnými koncentracemi reagencii

Agonist Agregace (¾) při koncentraci Saratinu (yg ml *)
	0	10	20	40	200
Kollagen (0,5 yg/ml)	62	67	63	64	0
ADP (2,5 yM)	66	64	69	82	88
Ristocetin (0,9mg/ml)	61	67	75	63	n.t.
Kys.arašdonová (1,0 mM)	66	66	67	57	n.t.
U46619 (1,0 yM)	66	65	57	56	n.t.
n.t. = netestováno
Saratin je však schopen	částečně inhibovat	kolagenem vyvolá-
nou agregaci destiček při	100	yg/m 1	(neznázorněno)	s úplnou
inhibici při 200 yg ml^-1,	ačkoli	. agregace na	ADP je	neovlivně-

na dokonce až při 200 yg Saratinu.

Příklad 5

Krysí model CEA

Použije se krysího modelu CEA, což je otvírací technika s arteriotomií při úplném odstranwění vnitřku a části středmí a suturové uzávěry tepny. Jedna skupina dostává Saratin, zatímco druhá skupina slouží jako kontrola. Konečná měření se ·· · · ···· • · · · • · · · • · · · · • · · · · ··· *· ··

týkají 1) ulpívání PLT, 2) míry trombózy, 3) vývoje vnitřní hyperplazie. Saratin se aplikuje přímo na endarterektomizovaný povrch krční arterie před tepennou uzávěrou- Ke kvantitativní analýze se použije elektronového mikroskopu se zvětšením (2000 x mag) připravených krčních arterí. Pomocí standardizované přikládané mřížky se zjistí počet PLT. IH a trombóza se hodnotí morfometrickou analýzou za použití počítače elastinem

vybarvených řezfi	arterie	s přímým měřením	plochy	IH.
Příklad 6
Endarterektoraová	operace	arterie
Zvířata se	uklidní	isof 1uranem ve	zvonové	1ahv i, zvaž í
se a pak se uspí intraperitoneálně kombinací	ketaminu (100

mg/kg) a acepromazinmaleátu (1 mg/kg). Po přiměřené anestesií potvrzené chybějící odzvou na stimulaci zadní packy, se injektují 4 ml normální solanky subkutánně do horní střední zádové oblasti jako kapalný bolus 10 ml/kg ke kompenzování jakékoli intraoperativní ztráty krve. Krční oblast se pak oholí a připraví se 7¾ isopropy1alkoholem. S použitím sterilní techniky a dissekčního mikroskopu (x40, sz 40 Olympus, Olympus America lne. Melville, NY) se provede středový moskový řez. Povrchové svaly se rozdělí a disekce se provede až do úrovně pravé krční arterie. Mozkové nervy v oblasti tepny se uvolní k zachování faryngeální funkce a k zabránění pooperačních dýchacích potíží

Po přiměřeném obnažení krční arterie se docílí proxlmální a distální kontroly na bifurkaci, vzdálených přibliže 15 mm pomocí 3-0 hedvábných šicích turniketfi. Pomocí kornereální čepele se provede arteriotomie a rozšíří se na 6 mm délku mikronfižkami. Pomocí jehly číslo 27 se vnitřek příčně rozdělí do dvou rovnoběžných linií, vzdálených přibližně 2 mm. Vnitřek a středová vrstva se vyjmou mikropinsetou. Skupina krys se Saratinem dostane 5 μΐ saratinového roztoku naneseného přímo na • · · · • · · · • ·

endarterektomizovaný povrch. Řez arterie se uzavře zašitím běžnou nylonovou monofilamentní nití 10-0 (MS/9, Ethilon, Ethicon lne. Somerville, NJ) se započetím na distálním konci. Distální turniket se odstraní první k zajištění hemostáze pro nit, následované odstraněním proxiraálního turniketu. Doba saratinové aplikace je pět minut, což představuje dobu uzavření řezu. Veškeré krvácení se pečlivě odebírá tamponem sterilní vaty dokud se nedosáhne hemostáze. Endarterekzomizovaná krční arterie se posuzuje v ruce drženým Dopplerem k potvrzení průchodnosti. Povrchová vrstva svalů a kůže se pak zašijí běžnou absorbovatelnou nití 3-0.

Příklad 7

Ulpívání destiček

V podskupinách pro ulpívání destiček se krysy znova uspí a endart-erektomizované krční arter i e se odeberou a uloží se do 4¾ roztoku glutaldehydu tři hodiny nebo 24 hodiny po karotidové endarterektomii. V průběhu odebírání se segmenty arterie podélně otevřou podél švu a obnaží se endarterektomová oblast. Arterie se pak dodatečně fixují oxidem osmičelým, odvodní se v odstupňovaných alkoholových sériích, kritické místo se vysuo ší oxidem uhličitým (7396,8 kPa a 31,1 C) , povleče se zlatém palladiem a umístí se do řádkovacího elektronového mikroskopu (JEOL JSM 5410, JEDL, USA Peabody, MA). Endarterektomizované plochy se snímají při zvětšení 2000 x a pořídí se fotogrfické snímky. Snímky se sestaví do koláže umožňující pozorovat větší plochu, než jaká odpovídá jednomu zornému poli monitoru řádkovacího elektronového mikroskopu. Jakmile se sestaví koláž snímků, překryje se průhlednou mřížkou. Téže mřížky se použije u všech snímků vzorků a ke spočítání celkového počtu destiček se použije 116 čtverečků- Číslo 116 je maximální počet čtverečků, které mohou být konsistentně sečteny na včech kolážích snímků. Sečítání destiček provedou dva nezávislí pozorovatelé.

• · · ···»

«

Příklad 8

Vnitřní hyperplazie

Dva týdny po karotidové endarterektomii se skupina krys s vnitřní hyperplazií uspí a exponuje se endarterektomizovaná krční arterie. Břicho se otevře uprostřed a exponuje se distální aorta a vnější véna cava. Véna cava se příčně přeřízne a distalní aorta se kanyluje katétrem číslo 20 k infuzi normální solanky při tlaku 13,3 kPa, dokud z véna cava nevytéká čirý výtok. Nato se provede infuse 10% pufrovaným formalinem za tlaku 13,3 kPa ve stejném objemu k ukončení perfusně-fixační techniky. Z operované srdeční arterie se vyřízne ÍO mm dlouhý vzorek a uloží se do 10% formalinu do dalšího postupu k histologii. Tepny se uzavřou parafinem, rozříznou se a elastln se obarví Verhoeffovým a Van Giesonovým barvivém. Mikrotomem se provede několik řezů po 3 mikrometrech podél délky souvislého arteriotomového švu zašitého nylonovým vláknem 10-0 ke standardizování oblasti řezu- Elastinové vybarvené řezy se fotografují digitální kameiOU KODAK DC 120 Zoom (Eastman KODAK Company, Rochest-er, NY). Současně se zaznamenají veškeré thromobované řezy. Nethrombované obrázky se přenesou do počítače a lumenální plochy karotidfl se analýzují podle programu národního zdravotního ústavu National Institutes of Health (Bethesda, MD) image J Software, verse 0,99i. Tento softwarový soubor umožňuje rozložit vnitřní plochu vnitřní hyperplazie a tudíž získat přesné měřítko plochy příčného průřezu lumenu cévy. Zjistí se také vnější plocha vnitřní hyperplazie. Stanoví se rozdíl obou ploch (vnější plocha vnitřní hyperplsie minus skutečný lumen) jako absolutní plocha vnitřní hyperplazie. Jelikož příčný rez arterie má individuální proměnlivý tvar, jsou hodnoty vyjádřeny jako podíl absolutní plochy vnitřní hyperplazie k vnější mezi vnitřní hyperplazie a udává se jako procento lumenové stenózy. Poměr' představuje podíl plochy lumenu zaujímaný vnitřní hyperplazií a umožňuje porovnání průřezů te33 • · • · · · • · · ·

pen různých velikostí ¢4). Při pozorování dvěma nezávislými pozorovateli je minimální variabilita.

Příklad 9

Doby krvácení a počty destiček

K vyhodnocení účinků Saratinu na systemický počet destiček a doby krvácení se zjistí počty destiček a doby krvácení u 12 krys. Pokud bylo nutno získat predoperační vzorek krve z každé krysy přibližně 1 až 1,5 ml, což představuje významný podíl celkového objemu krysí krve. Se zřetelem na to je rozumné očekávat pokles počtu destiček po operaci jak u kontrolních, tak u Saratinem ošetřených krys. K posouzení účinku Saratinu na počty destiček se zjištuje rozdíl počtu destiček u každé krysy odečtením předoperačního počtu destiček od počtu destiček po operaci k získání rozdílu. Rozdíly v počtu destiček se analyzují pomocí modelu 2x2násobného uspořádání ošetření ANOVA, což ukazuje, že rozdíly počtu destiček mezi kontrolními a Saratinem ošetřenými krysami nejsou statisticky významné. Pro každou krysu jsou známy počty destiček a doby krvácení před operací- Šest krys prodělalo karotidovou endarterektomii a byly u nich změřeny počty destiček a doby krvácení tři hodiny po operaci a u zbývajících 6 krys byly změřeny počty destiček a doby krvácení 24 hodin po operaci. Tři krysy z každé skupiny byly povrchově ošetřeny Saratinem a zbývající tři krysy sloužily jako kontroly.

Doby krvácení se měří 2 mm distálním řezem krysího ocasu a ponořením přibližně 40 mm délky ocasu do fosfátem pufrovanéo ho roztoku při teplotě 37 C- Měří se čas od řezu ocasu do konce krvácení a označuje se jako doba krvácení. Počty destiček se stanoví po odběru 1 až 1,5 ml vzorku krve z vnitřní krční žíly, který se analyzuje v analyzátoru krve Coulter STKS a výsledky se udávají x 10³.

• · · • · · ·· ·

Příklad 10

Statistické metody

Uvádějí se střední směrodatné odchylky ±. Provádějí se nepárové t-testy za pomoci programu Stát View (SAS Institute lne. Cary, NC 27513) verse 5,0 k porovnání Saratinem ošetřených a kontrolních skupin pro počet ulpělých destiček, procenta luminální stenózy a dob krvácení. K vyhodnocení náhodného poměru pro rozvoj trombózy se provede Chi Square analýza pravděpodobného poměru pro rozvinutí trombózy dva týdny po provedené karotidové endarterektomii. K vyhodnocení rozdílů mezi předoperačními a pooperačními počty destiček se použije modelu ANOVA 2x2 násobného uspořádání ošetření.

Příklad 11

Pokusná zvířata

Krysy Spraque-Dawley (350 až 400 g) se zařadí do skupin pro karotidovou endarterektomii na zádkladě dvou hlavních účelů. 1) Vyhodnocení ulpívání destiček a 2) vyhodnocení luminální stenózy způsobené vnitřní hyperplazií a mírou trombózy. V těchto dvou účelových skupinách byly krysy rozděleny na kontrolní a Saratinem ošetřená zvířata. Všem krysám byla provedena karotidová endarterektomie (viz dále), krysy ošetřené Saratinem dostaly povrchovou aplikaci 5 μΐ roztoku Saratinu na lumenální povrch karotidové arterie bezprostředně po odstranění vrstvy intima/media. Skupina pro ulpívání destiček prodělá vyhodnocení elektronovou mikroskopií tři hodiny po karotidové endarterektomii (n=17) a 24 hodin po karotidové endarterektoraii (n=19). Skupina pro vnitřní hyperplazií (n=25) byla zkoumána dva týdny po karotidové endarterektomii.

« * • · ♦ 9

Příklad 12

Příprava hydrogelem Saratinu povlečeného katétru

Povrchy materiálu na bázi PA-12 se aktivují ponořením zařízení do roztoku 2 mol% makro-iniciátoru (anhydridu polyíoktadecen-alt-maleinacetanhydridu) s per-esterera (11 až 16 mol%) rozpuštěným v isopropanolu a 0,5 mol ethylenglykoldimethakrylátu (EGDMA)/1 mol makroiniciátoru po vysušení povlaku raakroiniciátoru/EGDMA. Povlak se zahříváním po dobu 5 až 10 minut udržuje na teplotě 120 C, což napomáhá fixaci makro-iniciátoru na povrchu ke zlepšení zesítění.

K optimalizaci podmínek povlečení se použije hydrogelových povlaků, vytvořených na nosičovém listu PA-12. Před povlečením se listy omyjí isopropanolera nebo acetonem a vysuší se.

Pro povlečení hydrogelem se použije balónkový katétr typu Blue Medical Devices G0 (RX PTCA catheter) sestávajícího z Vestámidu (PA-12). Smísí se vodné roztoky 5 mol% kyseliny akrylové 100 ml a 0,2 až 0,8 mol % methylen-bis-akrylové a použiji se k povlečení listů nebo katétrů. Po polymeraci se povlečrié zařízení omyje vodou a po dalších 24 hodinách pufrem PBS.

Po této úpravě se polymer udržuje v pícce zahříváním na o

teplotě 60 až 80 C po dobu půl až tři hodiny.

Tloušťka vysušených hydrogelových povlaků je 1 až 4 nm, nabobtnání hydrogelu ve vodném roztoku dosahuje 10 až 50 g mokrého hydrogelu/1 g suchého hydrogelu.

Pro máčení (na dobu 30 minut) do pufrovaného PBS pufru, hodnota pH 7,4, se použije roztoku Saratinu o koncentraci 50 jjg/ml .

• ·« ·

K přípravě povlakových roztoků k nástřiku na balónkový ka tétr se použije organických rozpouštědel a povlékacího zaříze ní se standardním malým rozprašovačem (obchodní produkt. EFD).

Průmyslová využitelnost

Polypeptid Saratin k výrobě farmaceutických prostředků pro za bránění hromadění destiček po cévním poranění a endartektomii pro předchází ulpívání destiček a tím bránění thrombóze a res tenóze.

Claims

·· 99 99 99

1. Použití polypeptidu Saratin k výrobě léčiv pro zabránění hromadění destiček po cévním poranění a endartektomii, při kterém se dodává do cévní tkáně terapeuticky účinné množství Saratinu. které předchází ulpívání destiček a tím brání thrombóze a restenóze.
2. Použití způsobu podle nároku 1, kdy poranění cévy je spojeno s jevy jako je atheroskleróza, srdeční transplantační vaskulopatie, koronární rest-enóza následující po koronárním zásahu, po balónkové angioplastice, po zavedení stentu, po rotablataci, po endarterektomii, včetně karotidové endarterektomie, dialysových obtoků štěpů a po jiných štěpových anastomózách, dále jako je nestabilní angína, akutní infarkt myokardu, mrtvice, benigní hypertrofie nebo benigní hypertrofie prostaty.
3. Zařízení mající povrch povlečený hydrogelem se začleněným účinným množstvím biologicky aktivního Saratinu k lokálnímu z něho uvolňování a prostředky spojené s povlékáním k zajištění protithrombotického povrchu.
4. Použiti způsobu podle nároku 1 k aplikaci Saratinu do endoluminální výstelky katétru, který se zavádí lokálně do tkáně.
5 Použití způsobu podle nároku 1 k začlenění Saratinu do místně aplikovaného polymeru, který umožňuje souvislé uvolňování Saratinu.
6- Použití způsobu podle nároku 5 pro podávání lokálně katétrem polymeru formulovaného se Saratinem.
7.

Katétr vyzačující tím, že jeho sou9 ·9 · částí je polymerní materiál a obsahuje Saratin.
8. Použití způsobu podle nároku 1, přičemž Saratin je začleněn do stentu nebo do povlaku stentu, který je umistován lokálně do tkáně nebo na tkáň.
9. Použití způsobu podle nároku 1, přičemž Saratin je začleněn do endovaskulárního štěpu nebo do povlaku endovaskulárního štěpu, který je umístěn lokálně do tkáně nebo na tkáň.
10. Souprava (kit) obsahující kteroukoli pomůcku podle nároku 1 až 9.

Přídavné patentové nároky pro US
11. Způsob ošetřování poraněné cévní tkáně, vyzaču j íc i se tím, že se aplikuje lokálně na poraněnou cévní tkáň adhezi destiček inhibující množství Saratinu k léčení poraněné cévní tkáně.
12. Způsob podle nároku 9, vyzaču j ící se tím, že poranění cévní tkáně je spojeno s atherosklerózou, se srdeční transplantační vaskulopatií, s koronární restenózou následující po koronárním zákroku, jako jsou balónková angioplas tiká, umístění stentu, rotablace a endarterektomie včetně karotidové endarterektomie, s obtoky dialyzačních štěpů a ostatních štěpových anastomóz, s nestabilní angínou, s akutním infarktem myokardu, s martvici, s benigní hypertrofi i nebo s benigní hypertrofi i prostaty.
13- Způsob podle nároku 9,vyzařující se tím, že poranění cévy je spojeno s atherosklerózou nebo restenózou.
14. Způsob podle nároku 9, vyzařující že Saratin je aplikován lokálně katétrem.

tím, ··♦· • ·* · • · »· ·
15. Způsob podle nároku 14,vyzařující se tím, že Saratin je začleněn do endoluminální výstelky katétru, který se zavádí lokálně do tkáně.
16. Způsob podle nároku 9, vyzačující se tím, že Saratin je začleněn do lokálně podávaného polymeru, který umožňuje místní uvolňování Saratinu.
17. Způsob podle nároku 9,vyzačující se tím, že polymer, formulovaný se Saratinem, se podává místně katétrem.
18. Způsob podle nároku 9,vyzačující se tím, že Saratin je začleněn do stentu nebo do povlaku stentu, který se zavádí místně na tkáň nebo do tkáně.
19. Způsob podle nároku 1,vyzačující se tím, že Saratin je začleněn do endovaskulárního štěpu nebo do povlaku endovaskulárního štěpu, který se zavádí místně na tkáň nebo do tkáně.