ES2234896T3 - Saratin para inhibir la adhesion de plaquetas a colageno. - Google Patents
Saratin para inhibir la adhesion de plaquetas a colageno.Info
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Abstract
Uso del polipéptido Saratin en la preparación de un medicamento para inhibir la acumulación de plaquetas después de daños vasculares o de una endarterectomía, que comprende administrar al tejido vascular una cantidad terapéuticamente eficaz de Saratin que previene la adhesión de plaquetas, inhibiendo con ello la trombosis y la restenosis.
Description
Saratin para inhibir la adhesión de plaquetas a
colágeno.
La invención se refiere al efecto de un
polipéptido llamado Saratin que disminuye de manera importante la
adhesión y acumulación de plaquetas después de daños vasculares, tal
como endarterectomía. La invención se refiere además a la inhibición
de la unión dependiente de vWF de plaquetas a colágenos de la pared
vascular bajo condiciones de alto esfuerzo cortante y, de forma más
detallada, a un nuevo uso médico de Saratin como inhibidor de
trombosis en donde dicho polipéptido se puede emplear localmente
como un agente de uso tópico o como un revestimiento para
dispositivos médicos.
La adhesión de células sanguíneas, especialmente
plaquetas, a la pared de vasos sanguíneos dañados es un fenómeno
bien conocido en angioplastia y procedimientos quirúrgicos. Dichos
daños pueden presentarse durante diversas terapias quirúrgicas y
percutáneas que han sido desarrolladas para reabrir los canales,
conductos y otros lúmenes bloqueados, para separar tejido enfermo y
para implantar tejido sustituto, o componentes del mismo.
Se han desarrollado varios tipos de técnicas de
intervención que facilitan la reducción o eliminación del bloqueo
del vaso sanguíneo, permitiendo un mayor flujo de sangre a través
del vaso. Una técnica para tratar la estenosis u oclusión de un
vaso sanguíneo es la angioplastia de balón percutánea. Se hace pasar
un catéter de balón a través del sistema arterial del paciente y se
introduce en la zona estrechada o bloqueada y luego se infla el
balón para expandir la zona constreñida. La angioplastia
transluminal percutánea (PTCA) es el método de angioplastia más
ampliamente utilizado para abrir arterias ateroscleróticas
obstruidas.
En general, los procedimientos de angioplastia
producen excelentes resultados, evitando la necesidad de cirugía de
by-pass, pero en aproximadamente el
30-40% de los pacientes, una dilatación inicial de
la arteria con ostensible éxito puede venir seguida por un nuevo
estrechamiento del vaso (restenosis) transcurrido un periodo de
alrededor de 3 a 9 meses. Si esta restenosis es severa, los
pacientes pueden requerir un segundo procedimiento de angioplastia,
frecuentemente con implantación de un dilatador para que actúe como
un andamio en el vaso.
En otros casos, se puede requerir reconstrucción
arterial bajo cirugía de by-pass, lo cual es un
procedimiento de mayor riesgo. Con más de 800.000 procedimientos de
PTCA practicados ahora anualmente a escala mundial, la implicación
socio-económica de esta proporción de
30-40% de restenosis ha llegado a constituir una
seria preocupación para los cardiólogos intervinientes.
La restenosis suele ser el resultado del daño por
estiramiento y aplastamiento, mediado por el balón, de la pared
arterial y de la posibilidad de que los alambres de guía de los
catéteres usados en dichos procedimientos durante el despliegue
causen daños, pudiendo conducir ello a la proliferación de células
del músculo liso de la arteria, dando lugar a que la arteria se
cierre de nuevo ("restenosis") durante los siguientes
meses.
Debido a las complicaciones potenciales,
relacionadas con la restenosis y al temor de que se desprenda un
émbolo de una placa ulcerativa con las severas consecuencias
resultantes, la aplicación de angioplastia repetitiva en las
arterias carotídeas está limitando severamente las opciones para una
intervención mínimamente invasiva.
Hasta ahora, se han realizado intentos para
tratar oclusiones en las arterias carotídeas que conducen al cerebro
mediante otros tipos de intervenciones.
La endarterectomía carotídea es un método
quirúrgico para eliminar bloqueos de las arterias carotídeas y es
uno de los procedimientos quirúrgicos vasculares más comunes
realizados en los Estados Unidos. Los resultados de pruebas
realizadas en múltiples centros han demostrado la eficacia de este
procedimiento en el tratamiento de la enfermedad carotídea
extracraneal en pacientes tanto sintomáticos como asintomáticos
(JAMA 1995; 273:1421-28; N. Engl. J. Med. 1991;
325:445-53) y los procedimientos de endarterectomía
se emplean en el tratamiento de enfermedad vascular oclusiva en
otros lechos vasculares (Vasc. Surg. 1999;
33:461-70).
En la endarterectomía, se corta la arteria
carotídea y se retira la placa del vaso en la zona cortada. Por
medio de cirugía, se expone la bifurcación carotídea a través de una
incisión en el cuello del paciente y se colocan grapas en cualquier
lado de la oclusión para aislarla, realizándose entonces una
incisión para abrir la arteria. Se retira la oclusión, se riega y
aspira la zona aislada y se sutura para cerrar la arteria. Se
retiran las grapas para restablecer el flujo de sangre a través de
la arteria. Los émbolos y restos contenidos dentro de las grapas
pueden causar problemas considerables después de abrir la arteria
carotídea, permitiendo que la sangre fluya al interior de la zona
previamente aislada.
Si bien la endarterectomía es una terapia eficaz,
suele dejar expuestas la adventicia y una zona importante de
subendotelio trombogénico. A pesar de la eficacia de la
endarterectomía carotídea, la operación puede conducir a
complicaciones, incluyendo trombosis y el desarrollo de hiperplasia
de la íntima, causantes de complicaciones que anulan el efecto
beneficioso de la intervención o que crean nuevos problemas.
Estudios clínicos han demostrado una tasa de
ataques isquémicos después de la endarterectomía carotídea del
1-10% en el periodo inmediato después de la
operación, cuya casi totalidad se debe a la formación de trombo en
el punto de la endarterectomía con posterior embolización cerebral
(Stroke 1984; 15:950-55). La acumulación de
plaquetas puede dar lugar también a restenosis debido al desarrollo
de hiperplasia de la íntima, lo cual puede ocurrir en el plazo de 2
años después de la operación. Se ha informado que la restenosis se
presenta en el 10-20% de todos los pacientes
endarterectomizados a los 2-5 años después de la
operación, la mayor parte de la cual se debe a hiperplasia de la
íntima, espesamiento de la íntima y reducción del diámetro del vaso,
tal como ha quedado documentado por la exploración ultrasónica
dúplex de la carótida (J. Vasc. Surg. 1986;
3:10-23).
La respuesta celular y molecular de la pared del
vaso a trauma mecánicamente inducido, intervención quirúrgica,
colocación del dilatador, colocación de un injerto vascular (injerto
arterial o arteriovenoso, por ejemplo, injerto de diálisis) es una
interacción compleja de inflamación, migración de células del
músculo liso, proliferación y transformación de miofibroblastos que
ocurre tan pronto como se presenta el trauma (Futura; 1997. p.
289-317). Si la arteria resulta dañada seriamente
por enfermedad y quizá endurecida por deposición de calcio, la
intervención puede también causar cierto grado de daño adicional con
D-endotelialización local y exposición de los
componentes de la matriz extracelular subyacente, tales como
colágeno y elastina. En algunos pacientes, el excesivo reclutamiento
de plaquetas y fibrinógeno puede dar lugar entonces a una oclusión
trombótica aguda.
Los estudios realizados empleando modelos de
arteria carotídea de la rata endarterectomizada (Neurosurg 1985;
16:773-79), así como modelos de daños de la
embolectomía con balón (Lab. Invest. 1983;
49:327-33) ha demostrado que a medida que las
células endoteliales se disgregan durante el daño vascular, las
plaquetas comienzan a adherirse al subendotelio expuesto. Spallone
et al., (Neurosurg 1985; 16:773-79) empleando
microscopía electrónica de barrido han demostrado que, cinco minutos
después de una endarterectomía carotídea en una rata, se forma una
monocapa de plaquetas sobre la zona dañada. Quince minutos después
del daño, se observan agregación de plaquetas y formación de trombo.
Treinta minutos después de la endarterectomía, el sitio se cubre con
plaquetas activas y se reviste con fibrina y células rojas de la
sangre. La formación de trombo alcanza su pico a las tres horas
después del daño, observándose una capa espesa de
fibrina-plaquetas. Las plaquetas son un componente
integral de esta formación de trombo y por tanto de trombosis, pero
también parecen jugar un papel en el desarrollo de hiperplasia de la
íntima.
Estudios realizados empleando ratas
trombocitopénicas han demostrado además un descenso importante en el
espesamiento de la íntima después del daño en la arteria carotídea
en comparación con ratas de control (Proc. Natl. Acad. SCI USA
1989; 86:8412-16). Una vez que las plaquetas se
adhieren al subendotelio expuesto de un vaso dañado, las mismas se
hacen activas y liberan sus gránulos. Estos gránulos contienen
factores vasoactivos y trombóticos (serotonina, ADP, fibrinógeno,
factor de Von Willebrand, tromboxano A2), así como factores de
crecimiento (factor de crecimiento derivado de plaquetas, factor de
crecimiento de transformación beta y factor de crecimiento
epidérmico) (Circulation 1985; 72:735-40). No se
entienden todavía del todo los mecanismos exactos por los cuales
las plaquetas realzan el desarrollo de hiperplasia de la íntima.
Estudios realizados sugieren que las plaquetas proporcionan
principalmente un estímulo quimiotáctico para la migración de
células del músculo liso medial hacia la íntima durante la segunda
fase del desarrollo de hiperplasia de la íntima (Vasc. Surg. 1991;
13:885-91). Otros estudios, empleando anticuerpos
anti-PDGF, han demostrado el papel vital que PDGF
juega en la acumulación de células del músculo liso de la neoíntima
después de un daño vascular (Science 1991;
253:1129-32). Otro mecanismo por el cual las
plaquetas pueden realzar el desarrollo de hiperplasia de la íntima
es por vía de la activación de la cascada de coagulación y de la
posterior acumulación de trombina en el sitio del daño. Varios
estudios han demostrado los efectos mitógenos de la trombina sobre
células del músculo liso (J. Clin. Invest. 1993;
91:94-98, J. Vasc. Surg. 1990;
11:307-13). Además, se ha demostrado que la trombina
es un estímulo para la activación de plaquetas. Independientemente
del mecanismo exacto, la adhesión y activación de plaquetas en el
sitio de un daño vascular juegan un papel importante en el
desarrollo de trombosis e hiperplasia de la íntima y, por tanto, la
inhibición de la adhesión y activación de plaquetas puede ayudar a
prevenir o reducir las tasas de trombosis y el desarrollo de
hiperplasia de la íntima.
La adherencia de plaquetas a la pared arterial
dañada es mediada en primera instancia por el factor de von
Willebrand (vWF), una glicoproteína multímera que es liberada de
las células endoteliales y circula en el plasma, en donde funciona
como una proteína portadora para el factor VIII (Annu. Tev. Biochem.
1998; 67:395-424). El vWF altamente multimerizado
circula también contenido dentro de gránulos alfa de plaquetas,
desde donde se libera después de la activación de las plaquetas
(Annu. Tev. Biochem. 1998; 67:395-424). Bajo
condiciones de alto esfuerzo cortante, tales como aquellas
encontradas en las arterias en sitios de placa ateromatosa o
intervención mecánica, el vWF puede unirse, por vía de su dominio
A3, a fibras de colágeno expuestas en la superficie (Biochemistry
1986; 25(26):8357-8361, Blood 1987;
70(5):1577-1583, J. Biol. Chem. 1987;
262(28):13835-13841). A su vez, el vWF unido
a colágeno "traba" entonces a las plaquetas por vía de la
exposición, dependiente del esfuerzo cortante, de un epitopo en el
dominio vWF-A1 que interacciona con la plaqueta
GPIb/IX/V (Blood 1985; 65(1):85-90, Blood
1985; 65(4):823-831, Br. J. Haematol 1986;
63(4):681-691). De este modo, el vWF actúa
como un puente entre el colágeno y las plaquetas y constituye un
requisito previo para la adhesión de las plaquetas a colágeno en
flujo (J. Lab. Clin. Med. 1974;
83(2):296-300). Sin embargo, el envolvimiento
de las plaquetas o del vWF se traduce en una adhesión débil y se
requieren interacciones directas adicionales entre colágeno y otros
receptores sobre la superficie de las plaquetas, con el fin de
facilitar la adhesión, activación y agregación permanentes de las
plaquetas (Thromb. Haemost 1997;
78(1):434-438, Thromb. Haemost 1997;
78(1):439-444). Los receptores de colágeno
directos sobre las plaquetas incluyen GP VI (Blood 1987;
69(6):1712-1720, Thromb. Haemost 1999;
81(5):782-792, J. Clin. Invest. 1989;
84(5):1440-1445), GP Ia/IIa
(\alpha_{2}/\beta_{1}) (J. Clin. Invest. 1989;
84(5):1440-1445, Nature 1985;
318(6045):470-472), y en un menor grado GP IV
(CD36) (J. Biol. Chem. 1989;
264(13):7576-7583) y quizá incluso p65 (J.
Clin. Invest. 1997; 100(3):514-521). En
ausencia de la unión a plaquetas asistida por vWF, dichos receptores
han demostrado ser demasiado débiles en la mediación del
reclutamiento de plaquetas a colágeno en flujo (Br. J. Haematol
1986; 63(4):681-691). Por último, el vWF, en
combinación con fibrinógeno, facilita la reticulación y activación
adicional de plaquetas por vía de la unión a la plaqueta GP
IIb/IIIa (J. Clin. Invest. 2000;
105(6):783-791), proporcionando así
estabilidad y resistencia al trombo en desarrollo.
Con la llegada de antagonistas de la plaqueta GP
IIb/IIIa y del receptor de ADP se han dado en los últimos años
grandes pasos hacia la terapia anti-agregatoria
(Coronary Art Dis 1999; 10(8):553-560, J. Am.
Coll. Surg. 2000; 191(1):76-92). Sin embargo,
dichas estrategias no están diseñadas para inhibir la adhesión
inicial de plaquetas a fibras expuestas de colágeno y, a pesar de
la eficacia de los antagonistas de GP IIb/IIIa a la hora de atenuar
las interacciones plaqueta-plaqueta, las plaquetas
se adhieren todavía a la pared del vaso dañado (Blood 1993;
81(5):1263-1276, Circulation 1995;
91(5):1354-1362). Por otro lado, la
activación de las plaquetas se extiende casi con seguridad más allá
de la agregación y trombosis aguda, siendo parcialmente afectada la
progresión de hiperplasia sub-aguda y crónica de la
íntima por mediadores mitógenos, tal como factor de crecimiento
derivado de plaquetas (PDGF), liberados por la activación de
plaquetas. En realidad, se ha demostrado que la inhibición de PDGF
reduce la hiperplasia de la íntima en varias especies animales
(Science 1991; 253(5024):1129-1132,
Circulation 1999; 99(25):3292-
3299).
3299).
La importancia patofisiológica del vWF es
sugerida por el incremento de vWF en circulación en pacientes con
infarto de miocardio agudo (Thromb Haemost 2000;
84:204-209, Circulation 1998;
98(4):294-299), estando correlacionados
positivamente los niveles de vWF con la pobre prognosis ulterior
(Circulation 1998; 98(4):294-299). Estudios
in vivo han demostrado además que la neutralización de
anticuerpos anti-vWF inhibe la trombosis
experimental, confirmando el papel esencial de vWF en la formación
del trombo (Thromb. Haemost 1998;
79(1):202-210). Además, con el uso cada vez
más extendido de las técnicas de angioplastia en síndromes
coronarios agudos, que invariablemente dan lugar a daños en la
pared del vaso y a una exposición de colágeno, existe la necesidad
cada vez mayor de disponer de estrategias que intervengan
farmacológicamente tan pronto como sea posible durante la cascada
de adhesión-activación-agregación de
plaquetas.
Las dos principales líneas de terapia, que están
siendo empleadas actualmente en un intento de controlar la adhesión,
activación de plaquetas y posterior trombosis e hiperplasia de la
íntima, son los agentes anti-plaquetas y la
administración anti-trombótica. Aunque los fármacos
tal como aspirina bloquean de un modo eficaz la síntesis de
tromboxano A2 a través de la inhibición de la vía de ciclooxigenasa,
los mismos no previenen la adhesión y activación de plaquetas,
inducidas por colágeno, las cuales estimulan el desarrollo de
hiperplasia de la íntima. El uso de heparina como agente
antitrombótico está asociado con complicaciones y limitaciones,
incluyendo una respuesta a la dosis no predecible, la necesidad de
un control estrecho en el laboratorio, la actividad limitada contra
trombina unida a coágulos, múltiples sitios inhibidores,
dependencia de antitrombina III, riesgo de una importante sangría,
así como la necesidad de una infusión continua. Evidentemente, un
agente terapéutico ideal será aquel que produzca efectos
específicos y localizados en el sitio sin distribución sistémica o
una coagulopatía generalizada.
Parece ser que las etapas vitales que precipitan
la cascada de acontecimientos que conducen a trombosis y posterior
hiperplasia de la íntima se derivan de la interacción entre el
colágeno subendotelial expuesto en el sitio de daño en el vaso y una
monocapa de plaquetas que se adhieren al colágeno expuesto. Por
tanto, un inhibidor específico de la adhesión de plaquetas a
colágeno subendotelial puede servir para prevenir o al menos
disminuir el desarrollo de trombo e hiperplasia de la íntima.
Se ha informado que varias sustancias derivadas
de sanguijuelas inhiben las interacciones
colágeno-plaquetas (Blood 1995;
85(3):705-711, Platelets 2000;
11(2)83-86, J. Biol. Chem. 1992;
267(10):6893-6898, J. Biol. Chem. 1992;
267(10):6899-6904, Blood Coagul.
Fibrinolysis 1991; 2(1):179-184). Se ha
indicado que la destabilasa, una isopeptidasa con actividad
despolimerizante de fibrina, aislada de Hirudo medicinalis,
inhibe la agregación de plaquetas inducida por varios agonistas,
incluyendo colágeno, pero se cree que se une de forma directa a la
membrana de las plaquetas (Platelets 2000;
11(2):83-86). La proteína antiplaquetas de
sanguijuela (LAPP), una proteína de \sim13 kDa de la saliva de
Haementeria officinalis, inhibe la adhesión de plaquetas a
colágeno bajo condiciones estáticas (J. Biol. Chem. 1992;
267(10):6899-6904, Thromb. Haemost 1999;
82(3):1160-1163) y flujo elevado
(Arterioscler Thromb. Vasc. Biol. 1995;
15(9):1424-1431), con efectos sobre la unión
a colágeno mediada por vWF y plaqueta GP Ia/IIa (Thromb. Haemost
1999; 82(3):1160-1163). Calin es una proteína
de \sim65 kDa de Hirudo medicinalis para la cual ha
emergido un perfil similar. Calin inhibe también las interacciones
colágeno-plaquetas bajo condiciones tanto estáticas
como de flujo (Blood 1995; 85(3):705-711,
Blood Coagul Fibrinolysis 1991; 2(1):179-184,
Thromb. Haemost 1999; 82(3):1160-1163).
Además, tanto LAPP como Calin son inhibidores potentes de la
agregación de plaquetas inducida por colágeno, inhibiendo la
agregación a concentraciones similares a aquellas que bloquean la
unión de vWF a colágeno (J. Biol. Chem. 1992;
276(10):6893-6898, Blood Coagul Fibrinolysis
1991; 2(1):179-184, Blood 1995;
85(3):712-719).
Tanto LAPP como Calin se han evaluado en modelos
de trombosis in vivo, con un éxito diverso. La LAPP falló a
la hora de reducir la formación de trombos en injertos revestidos
con colágeno en una derivación arterio-venosa de
babuino, a pesar del uso de dosis que inhibían la agregación de
plaquetas inducida por colágeno (Arterioscler Thromb 1993;
13(11):1593-1601), mientras que Calin
inhibía, de un modo dependiente de la dosis, la formación de trombo
en un modelo de trombosis venosa en hámster (Blood 1995;
85(3):712-719).
Se conocen ya en la técnica revestimientos no
trombogénicos y anti-trombogénicos para dilatadores
y catéteres. Los revestimientos y productos no trombogénicos están
basados en polímeros modificados y avanzados y ejemplos de los
mismos se ofrecen en WO9301221 y WO9830615.
Los revestimientos
anti-trombóticos y anti-restenosis
son en general revestimientos biocompatibles que pueden servir
también como depósitos para la administración local de fármacos. Los
revestimientos están basados principalmente en hidrogeles y ejemplos
de la bibliografía de patentes sobre métodos para preparar varios
tipos de hidrogeles y dispositivos médicos de revestimiento,
incluyen WO9211896, WO9811828, WO0147572, EP0887369 y
WO0139811.
El perfil de liberación de las sustancias
terapéuticas que están contenidas dentro del revestimiento se pueden
ajustar, por ejemplo, variando el espesor de las capas de polímero o
seleccionando revestimientos poliméricos específicos que contribuyen
a propiedades físico-químicas seleccionadas (tales
como carga, hidrofobicidad, hidrofilicidad) y/o preparando el
revestimiento como diferentes capas. Los criterios para la selección
del polímero y optimización de la velocidad de liberación resultan
evidentes para el experto en la materia. Otros revestimientos son
descritos en Fischell Circulation, 1996,
94:1494-95), Topol et al (Circulation, 1998,
98:1802-20) y por McNair et al en device
Technology, 1996, 16-22.
El uso de dilatadores, mallas y catéteres en el
sistema cardiovascular es una práctica común y el daño en la pared
del vaso, embolización y posterior restenosis constituye la
principal preocupación de los cardiólogos durante y después de la
intervención quirúrgica o cateterizaciones. Los métodos
alternativos, tal como endarterectomía, causan problemas
comparables. Cualquier procedimiento en donde las arterias son
manipuladas, es decir, cirugía vascular y angioplastia, es
susceptible al desarrollo de hiperplasia de la íntima. La utilidad
de un método para prevenir o disminuir el desarrollo de hiperplasia
de la íntima no puede ser sobrevalorado, y las ventajas de un método
capaz de realizar esto sin producir efectos sistémicos son incluso
más alentadores.
Por tanto, resulta evidente la necesidad de
disponer de nuevos y mejorados productos farmacéuticos y métodos
para inhibir los acontecimientos iniciales en patofisiología (por
ejemplo, adhesión de plaquetas) y cabe esperar que las
contribuciones en este campo hagan descender sustancialmente la
morbidez y mortalidad asociadas con procedimientos angioplasíticos o
quirúrgicos.
En general, la presente invención implica la
introducción del inhibidor de la adhesión de plaquetas recientemente
descrito Saratin en o sobre una localización seleccionada dentro o
sobre un lumen de un tejido, es decir, la vasculatura o un órgano,
bajo condiciones tales que Saratin se puede emplear localmente como
un agente tópico o como un revestimiento adherente sobre la
superficie, para prevenir e inhibir una respuesta trombótica y/o
restenótica indeseable al daño de la pared del vaso, incluyendo el
daño asociado con angioplastia, dilatadores, graftsand en diálisis
distintos de los injertos vasculares, y el tratamiento de formación
hipertrófica benigna de cicatrices, así como el tratamiento y
pasivación de placas ateroscleróticas inestables.
Saratin es una proteína recombinante de 12 kD
recientemente descrita (WO0056885), originalmente aislada de una
sanguijuela. La proteína inhibe la unión dependiente de vWF de
plaquetas a colágenos de la pared arterial bajo condiciones de alto
esfuerzo cortante y este aspecto de la invención es el que hace que
Saratin sea adecuado para inhibir la trombosis arterial. Otro nuevo
aspecto es que Saratin se puede emplear como un agente tópico en el
sitio del daño con la ventaja de disminuir la trombosis y/o
hiperplasia de la íntima sin ningún efecto sistémico. Esto
representa una modalidad con efectos específicos y localizados bien
adecuados para su aplicación por cirujanos y también por radiólogos
intervinientes.
Saratin se puede combinar con una variedad de
agentes terapéuticos para su administración in situ. Ejemplos
de usos en aplicaciones en arterias coronarias son agentes
anti-trombóticos, por ejemplo, prostaciclina y
salicilatos, agentes trombolíticos, por ejemplo, estreptoquinasa,
uroquinasa, activador de plasminógeno de tejido (TPA) y complejo
activador de plasminógeno-estreptoquinasa anisoilado
(APSAC), agentes vasodilatadores, es decir, nitratos, fármacos
bloqueadores de los canales de calcio, agentes
anti-proliferativos, es decir, colchicina y agentes
alquilantes, agentes intercalantes, factores moduladores del
crecimiento tales como interleuquinas, factor de crecimiento de
transformación beta y congéneres de factor de crecimiento derivado
de plaquetas, anticuerpos monoclonales dirigidos contra factores de
crecimiento, agentes anti-inflamatorios,
esteroidales y no esteroidales, y otros agentes que pueden modular
el tono, la función, la arteriosclerosis de los vasos, y la
respuesta de curación al daño del vaso u órgano después de la
intervención. También se pueden incluir antibióticos en
combinaciones o revestimientos de acuerdo con la invención. Además,
se puede emplear un revestimiento para efectuar la administración
farmacéutica de manera focal dentro de la pared del vaso. Mediante
la incorporación del agente activo en un polímero hinchable, el
agente activo se liberará tras el hinchamiento del polímero.
En una modalidad, el revestimiento está
constituido por un hidrogel, tal como óxido de polietileno,
albúmina, polimetacrilatos hidrófilos y poliuretanos hidrófilos.
La presente invención proporciona además el uso
de Saratin y derivados por vía de dispositivos/catéteres para la
administración local de fármacos o por vía de las técnicas de
dilatadores y revestimientos de dilatadores y de injertos vasculares
y revestimientos de injertos, por ejemplo. La invención proporciona
también métodos para administrar Saratin en composiciones que eluyen
las cantidades reguladas del Saratin en el transcurso del tiempo en
una zona localizada.
En particular, se pueden emplear dispositivos a
base de catéteres para administrar Saratin localmente. El Saratin se
puede aplicar también con o sin otros agentes terapéuticos desde una
matriz polimérica a tejidos corporales empleando catéteres. Los
requisitos básicos del material polimérico a utilizar en el presente
método son los de biocompatibilidad y propiedades de liberación del
fármaco que puedan adaptarse a la aplicación específica
contemplada.
La liberación local controlada de Saratin se
puede conseguir solo por permeación, solo por iontofóresis, solo por
electroporación, o bien se puede emplear una combinación de
iontofóresis y electroporación, para liberar e incorporar Saratin de
un modo eficiente dentro del lumen del vaso. Preferentemente, el
catéter es capaz de ejecutar procedimientos diseñados para mantener
una alta concentración de fármaco en el espacio del vaso
seleccionado, de manera que los resultados proporcionen un
revestimiento del vaso mejorado con Saratin solo o con otros
agentes de trata-
miento.
miento.
La presente invención es particularmente
aplicable a la administración local de Saratin durante y después de
procedimientos de cardiología intervencional, tal como angioplastia
e implantación de dilatadores y endarterectomía.
El Saratin recombinante adecuado para utilizarse
en la invención fue expresado y aislado a partir de Hansenula
polymorpha y se comprobó que actúa bloqueando la unión de vWF a
colágeno y previene de manera eficaz la adhesión de plaquetas a
colágeno bajo alto esfuerzo cortante. El Saratin inhibe, de un modo
dependiente de la dosis, la unión de vWF humano purificado a
colágenos humanos de tipos I y III (IC_{50} = 0,23 \pm 0,004 y
0,81 \pm 0,04 \mug ml^{-1}, respectivamente) y a colágeno de
piel de ternero (IC_{50} = 0,44 \pm 0,008 \mug ml^{-1}).
Además, el Saratin mostró una potencia inhibidora similar contra la
unión de vWF de plasma humano, de roedores y porcino a dichos
colágenos. En una cámara de flujo bajo condiciones de alto esfuerzo
cortante (2.700 s^{-1}), el Saratin inhibió potentemente, de un
modo dependiente de la dosis, la formación de agregados de
plaquetas sobre una superficie revestida de colágeno (IC_{50} =
0,96 \pm 0,25 \mug ml^{-1}), pero a un esfuerzo cortante
reducido (1.300 s^{-1}) se observó un cambio hacia la derecha de
la curva dosis-respuesta (IC_{50} = 5,2 \pm 1,4
\mug ml^{-1}). El análisis por resonancia de plasmón superficial
reveló sitios para la unión de alta y baja afinidad de Saratin sobre
colágeno humano de tipo III (K_{d} = 5 x 10^{-8} M y 2 x
10^{-6} M, respectivamente), y aunque a bajas concentraciones de
Saratin, que inhibían la adhesión de las plaquetas bajo un mayor
esfuerzo cortante (es decir, saturación de sitios de unión de alta
afinidad), no tenían efectos sobre la agregación de plaquetas
inducida por colágeno e independiente de vWF, se encontraron altas
concentraciones (es decir, saturación de sitios de unión de baja
afinidad) que inhibían la agregación de plaquetas. Estos datos
demuestran que Saratin es un potente inhibidor de la adhesión de
plaquetas a colágeno, dependiente de vWF, lo cual constituye la base
de su potencial terapéutico como agente
anti-trombótico.
Los estudios demostraron además que Saratin
inhibe de forma potente y dependiente de la dosis la unión de vWF
no solo a colágeno de piel de ternero, sino también a colágeno
humano de los tipos I y III, los cuales son ambos abundantes en las
capas sub-endoteliales de la pared arterial y que
se cree que son importantes en las interacciones
plaquetas-pared del vaso (Thromb Haemost 1997,
78(1):434-438). Puesto que las interacciones
colágeno-vWF-GP Ib/IX/V solo tienen
lugar a un esfuerzo cortante suficientemente elevado, un aspecto
importante de esta invención consistió en demostrar la eficacia de
Saratin no solo bajo condiciones estáticas, sino también en un
entorno que imita más estrechamente la situación encontrada in
vivo. En una cámara de flujo, en donde los esfuerzos cortantes
se pueden variar para simular dicho entorno, el Saratin inhibió
claramente la acumulación de plaquetas en colágeno, particularmente
a un esfuerzo cortante más alto. El cambio hacia la derecha de la
curva dosis-respuesta como resultado de reducir el
esfuerzo cortante resulta notorio puesto que la implicación de ello
es que la eficacia de Saratin in vivo puede localizarse en
zonas de alto esfuerzo cortante, en donde la ruptura del flujo
sanguíneo laminar surge como consecuencia de cambios en la
superficie endotelial presentada a la sangre, por ejemplo en
presencia de placa aterosclerótica o después de intervención
mecánica.
Los estudios de resonancia de plasmón superficial
realizados con Saratin revelaron que el colágeno puede poseer dos
sitios de unión independientes para Saratin, uno de alta afinidad y
otro de baja afinidad. La inhibición por Saratin de la unión de vWF
a colágeno se explica por la saturación del sitio de unión de alta
afinidad, con valores IC_{50} de alrededor de 5 x 10^{-8} M, es
decir, iguales a la constante de disociación para dicho sitio.
Debido a que la agregación de plaquetas inducida por colágeno de
forma independiente de vWF únicamente se inhibió a dosis muy altas
de Saratin (por encima de 100 \muM), se desprende que la
saturación del sitio de unión de colágeno de baja afinidad está
asociada con la inhibición de las interacciones directas
colágeno-receptor de colágeno.
Otro objetivo de esta invención reside en el
efecto del Saratin para afectar el entorno local de un vaso
endarterectomizado sin requerir distribución sistémica y sin alterar
la función de las plaquetas o alterando la coagulación, siendo así
un medio ideal para su aplicación tópica durante procedimientos
quirúrgicos vasculares y radiológicos intervencionales.
En este aspecto de la invención, el efecto
terapéutico de Saratin fue investigado empleando un modelo de
endarterectomía carotídea en la rata (CEA) ya descrito (J. Vasc.
Surg. 1998; 28:909-918). Se pensó que la activación
de PLT constituía la etapa de inicio en trombosis y restenosis
posterior a CEA debido a IH. Se ha observado que la aplicación
tópica de Saratin sobre la superficie luminal disminuirá la cantidad
de adhesión de plaquetas a la arteria endarterectomizada y de este
modo disminuirá la trombosis post-op e IH.
Como un resumen de los resultados experimentales,
el efecto anti-adherencia de plaquetas de Saratin,
evaluado después de dos tiempos post-operativos
diferentes, indicó que el número de plaquetas adheridas a las 3
horas (figura 4) y 24 horas (figura 5) después de la
endarterectomía carotídea, se redujo de manera importante en las
ratas tratadas con Saratin en comparación con las ratas de
control.
La adhesión de las plaquetas se redujo en un 59%
a las 3 horas (64\pm17,2 vs 155\pm33,4 PLT por cuadrícula
P=0,05) y en 77% a las 24 horas (35\pm11,3 vs 149\pm36,6 PLT por
cuadrícula P=0,0110). La adhesión de plaquetas fue similar a las 3
horas y 24 horas en los grupos de control, pero mostró de hecho un
descenso en el grupo tratado con Saratin desde 64 a 35 plaquetas por
cuadrícula.
Las figuras 6 y 7 muestran una representación
típica de la superficie endarterectomizada con y sin aplicación
tópica de Saratin, empleando microscopía de barrido electrónico a
un aumento de 2.000 X. La figura 6A muestra la superficie de control
a las 3 horas después de la endarterectomía carotídea, pudiéndose
apreciar la marcada abundancia de material celular, hebras de
fibrina, numerosas células rojas sanguíneas y numerosas plaquetas.
La figura 6B muestra una superficie tratada con Saratin 3 horas
después de la endarterectomía carotídea. Puede apreciarse la
ausencia de elementos celulares y la superficie de colágeno casi
vacía. La figura 7A muestra una superficie de control a las 24 horas
después de la endarterectomía carotídea, evidenciándose las
plaquetas como pequeños puntos blancos. La figura 7B es una
superficie tratada con Saratin a las 24 horas después de la
endarterectomía carotídea. Existe una clara reducción en la adhesión
de plaquetas con el tratamiento con Saratin.
La aplicación tópica de Saratin después de una
endarterectomía carotídea disminuyó de manera importante el
desarrollo de hiperplasia de la íntima en comparación con el grupo
de control. El porcentaje de estenosis luminal, como una medida de
IH, disminuyó de manera importante con la aplicación de Saratin en
comparación con los controles. Este descenso en la formación de IH
estaba correlacionado con la inhibición de la adherencia de PLT. En
términos de estenosis luminal, las ratas de control mostraron una
estenosis luminal de 29,8\pm6,8%, p=0,0042 vs una estenosis
luminal de 10,9\pm1,8% en el grupo tratado con Saratin (figura 6).
Las ratas tratadas con Saratin tenían un diámetro luminal 18,9% más
grande que las ratas de control. A las dos semanas después de la
endarterectomía carotídea, 5 de las 15 ratas de control (15%)
desarrollaron un trombo completo de la arteria carotídea tras el
análisis histológico, mientras que 0 de 15 ratas tratadas con
Saratin (0%) desarrollaron trombosis carotídea. Un análisis Chi
Cuadrado de la razón de verosimilitud reveló una razón de disparidad
de 16.238 lo cual sugiere que la diferencia del grupo de control que
desarrolla trombosis oclusiva fue 16 veces mayor que aquella de las
ratas tratadas con Saratin P=0,0156.
No se encontró incremento de sangría a lo largo
de la línea de sutura arterial en el grupo de Saratin. Se comprobó
que los tiempos de sangría y los recuentos sistémicos de plaquetas
no cambiaron de manera importante en las ratas tratadas con Saratin
en comparación con las ratas de control a las 3 y 24 horas después
de la endarterectomía.
El modelo CEA se asemeja estrechamente a la
operación CEA en seres humanos y, por tanto, los resultados proponen
un mecanismo para disminuir los efectos perjudiciales de la
adherencia y agregación de plaquetas en el sitio de la
endarterectomía sin afectar sistémicamente a la función de las
plaquetas o sin descender la hemostasis. La simple aplicación
tópica de Saratin durante una CEA en rata disminuye la adherencia y
agregación de plaquetas y la posterior restenosis en el lecho de la
carótida debido a hiperplasia de la íntima.
La tabla 3 muestra los resultados de los tipos de
sangría y recuentos de plaquetas. No se observaron diferencias
estadísticamente importantes entre los tiempos de sangría
pre-op y post-op. No se identificó
una diferencia estadísticamente importante en las diferencias de
recuentos de plaquetas entre las ratas de Saratin y de control.
La entidad solicitante ha demostrado un descenso
importante en la adhesión y acumulación de plaquetas después de un
daño vascular similar a una endarterectomía. La menor adhesión de
plaquetas se aprecia tanto inmediatamente después de la
endarterectomía (3 horas) así como a las 24 horas. El efecto a las
24 horas es importante ya que esta entidad solicitante piensa que
dicho efecto no se debe al efecto inhibidor directo de Saratin
sobre el colágeno (la vida media de Saratin en suero es de 90
minutos), sino que más bien se debe a la inhibición inicial de la
agregación de plaquetas y a la posterior ruptura de la cascada de
activación de las plaquetas. Una vez que las plaquetas resultan
inhibidas inicialmente de su adherencia al colágeno expuesto, la
cascada de plaquetas no puede proceder. Las figuras 4 y 5
demuestran que la aplicación tópica de Saratin en el vaso
recientemente dañado puede inhibir la adhesión de plaquetas en un
grado importante. Saratin inhibió la adhesión de plaquetas en un
60% y un 75% a las 3 y 24 horas respectivamente. Esta inhibición se
aprecia en las diferencias visibles en la deposición de elementos
celulares entre las arterias de control y las tratadas con Saratin
tanto a las 3 horas como a las 24 horas (figuras 7 y 8). Esta
ausencia de respuesta celular que propone esta entidad solicitante
se debe a la inhibición de la adhesión de las plaquetas. Ello
representa un modo único de terapia para la inhibición de la
adhesión de plaquetas a un vaso dañado. Las ratas de control tenían
un diámetro luminal significativamente reducido a las dos semanas
después de la endarterectomía carotídea en comparación con las ratas
tratadas con Saratin (figura 9). El grado de desarrollo de
hiperplasia de la íntima se redujo de manera importante en las
ratas tratadas con Saratin, lo cual se correlaciona con una menor
adhesión y acumulación de las plaquetas. El hallazgo de un grado
menor de hiperplasia de la íntima y trombosis, que están asociadas
con una menor adhesión de las plaquetas, revela puntos finales
clínicamente relevantes y resultados de una menor adhesión de las
plaquetas. Ello demostró que la inhibición no sistémica y específica
al sitio de la agregación y adhesión de plaquetas conduce a una
menor trombosis y a una menor tasa de oclusión y, por tanto, reduce
la incidencia de posteriores eventos cerebrovasculares relacionados
con la endarterectomía carotídea. El nivel de mejora de hiperplasia
de la íntima y de estenosis luminal queda demostrado además por el
hallazgo importante de una menor tasa de trombosis en ratas tratadas
con Saratin. Un total de 33% de ratas de control mostraron
trombosis mientras que ninguna de las arterias carotídeas tratadas
con Saratin resultaron trombosadas. De particular importancia
clínica es la ausencia de efectos sistémicos demostrados por este
agente. La aplicación local de Saratin no afectó a los tiempos de
sangría o recuentos sistémicos de plaquetas. Ello implica que la
menor adhesión de plaquetas y el posterior descenso de trombosis e
hiperplasia de la íntima son el resultado de efectos locales. Estos
nuevos hallazgos relacionados con Saratin son ciertamente
importantes ya que es muy amplio el espectro de aplicaciones
clínicas para una modalidad que es capaz de inhibir localmente los
efectos perjudiciales de adhesión y activación de plaquetas sin
perturbar el mecanismo hemostático sistémico.
Ya se ha indicado con anterioridad que varias
intervenciones terapéuticas inducen daños locales que idealmente
deberían ser tratados de forma inmediata y local. El hecho de que
las células dañadas no sean tratadas inicia una serie de procesos
implicados en la coagulación, activación de complemento y respuesta
celular para la liberación de citoquinas, inducción de proliferación
y otros procesos biológicamente activos. Es difícil detener dichos
procesos complejos, interrelacionados, una vez que los mismos han
comenzado.
Por tanto, en la presente invención, un aspecto
importante es que Saratin queda localizado directamente en los
tejidos manipulados. Otro aspecto de la aplicación local es la
reducción al mínimo de problemas potenciales relacionados con los
efectos sistémicos de los fármacos usados en la intervención.
Idealmente, el tratamiento con Saratin se puede
administrar de forma simultánea con la intervención terapéutica
adecuada, lo cual se puede conseguir incorporando Saratin en el
revestimiento de un dispositivo quirúrgico, tal como un catéter de
balón, u otro dispositivo o parte del mismo. Otro aspecto podría
implicar también el revestimiento directo de los vasos dañados con
Saratin.
Además, en la invención se pueden emplear también
medios normales para la administración de Saratin, tal como en forma
fluida libre, incluyendo combinaciones con otros agentes
terapéuticos. Sin embargo, el uso de matrices de polímero/hidrogel
presenta ciertas ventajas con respecto al suministro de fluido
libre. El suministro de un agente que ha sido incorporado en una
matriz polimérica no requiere lúmenes adicionales en el catéter de
soporte para conducir la solución medicamentosa fluida libre dentro
y fuera del sitio de tratamiento.
Por otro lado, las matrices poliméricas eliminan
el riesgo de fugas aguas debajo de la solución medicamentosa como
consecuencia de un defectuoso sellado por el balón de los segmentos
de los vasos, evitando con ello el riesgo de exposición de tejido no
diana a elevadas concentraciones del fármaco.
Una solución técnica general para la aplicación
local de Saratin, bien en un dispositivo médico o bien como un
revestimiento, en el baño dañado, consiste, por ejemplo, en la
incorporación de Saratin en un revestimiento de polímero o
hidrogel.
Con respecto a la composición polimérica, el
término "hidrogel" tal como aquí se emplea incluye polímeros
sintéticos con poros o intersticios de diferentes tamaños y
capacidades y propiedades físico-químicas variables,
especialmente con respecto a la carga o la naturaleza
hidrófila/hidrófoba de la matriz de gel que puede ser introducida
durante la preparación del revestimiento o del dispositivo
revestido. Los expertos en la materia son conocedores de diversos
elastómeros sintéticos y materiales poliméricos de origen natural.
El Saratin se puede incorporar en la matriz bien durante la
producción del polímero o bien se puede añadir después del
revestimiento o moldeo del polímero a la configuración deseada.
Además, se pueden emplear muchos de un número de diferentes
materiales poliméricos y métodos de fabricación, para formar las
matrices poliméricas empleadas en la presente invención. Ejemplos
de materiales poliméricos adecuados o combinaciones de los mismos,
incluyen, pero no de forma limitativa, polímeros biocompatibles y/o
biodegradables.
Se han investigado varios alquil alquil- y
cianoacrilatos para uso quirúrgico y algunos cianoacrilatos de
isobutilo han resultado ser especialmente adecuados.
Se puede producir un polímero de hidrogel típico
a partir de una mezcla monómera que comprende 40-60
partes en peso de un monoéster purificado de un alquilacrilato de
hidroxialquilo que tiene un solo doble enlace olefínico,
40-60 partes en peso de un monómero metacrílico que
contiene un doble enlace olefínico y 0,001-5 partes
en peso de un iniciador de la polimerización. La polimerización se
puede efectuar por técnicas convencionales de polimerización en
masa, polimerización en solución, polimerización en suspensión o
polimerización en emulsión. La técnica de polimerización usada
depende del volumen de polímero requerido y de la naturaleza del
producto final a obtener. Un producto de hidrogel típico será aquel
descrito por una relación molar de monoéster a monómero metacrílico
del orden de 1:1 a 2,3:1, con preferencia 1,5:1, en donde el
diámetro de los poros del polímero es mayor de 90 Angstroms.
Como el monoéster de un acrilato de
hidroxialquilo que tiene un solo doble enlace olefínico, los
compuestos aceptables incluyen, pero no de forma limitativa,
metacrilato de 2-hidroxietilo, metacrilato de
glicerilo, metacrilato de 2-hidroxipropilo,
metacrilato de glicidilo, acrilato de 2-hidroxietilo
y acrilato de 2-hidroxipropilo. Los monómeros
metacrílicos aceptables son ácido metacrílico, metacrilamida y
metacrilonitrilo.
El iniciador de la polimerización puede depender
del método de polimerización o del uso al que se destine el
polímero. Por ejemplo, cuando el polímero ha de formarse como un
objeto sólido, se pueden emplear iniciadores de radicales
libres.
Los iniciadores preferidos de ese tipo incluyen
poliésteres difuncionales tal como
2,5-dimetil-2,5-bis(2-etilhexoilperoxi)hexano,
o peroxipivalato de terc-butilo. Alternativamente,
cuando el uso final del polímero es como un revestimiento aplicado
en forma de la mezcla monómera y polimerizado in situ, el
iniciador puede ser activado por radiación, tal como los
catalizadores UV
2,2-azobis(2-metilpropionitrilo)
o azobisbutironitrilo (AIBN). Los iniciadores no quedan restringidos
a su uso en un método de polimerización particular o para un
producto final también particular. Por ejemplo, los iniciadores de
radicales libres se pueden emplear en revestimientos y los
iniciadores activados por radiación se pueden emplear en la
formación de artículos sólidos.
Además de las fracciones sustancialmente
similares del monoéster y monómero metacrílico, la mezcla monómera
se puede mejorar con cantidades de traza de un comonómero de éster
acrilato o metacrilato de alquilo de cadena más larga, tal como
metacrilato de ciclohexilo, trimetacrilato de trimetilolpropano o
dimetacrilato de etilenglicol. Dichos comonómeros adicionales
mejoran la reticulación del polímero en situaciones en donde se
desee una mayor resistencia del polímero. Las cantidades de traza
de dichos comonómeros son en general menores de 0,1% en peso del
total de mezcla monómera.
Los polímeros de hidrogel empleados en la
presente invención se pueden conformar para producir un artículo que
está suficientemente reticulado por acción intrínseca, de manera
que el artículo resultante no requiere monómeros reticulantes
adicionales.
Otros ejemplos de polímeros biodegradables son
poli(lactidas), poliglicólidos, polianhídridos,
poliortoésteres, poliacetales, polidihidropiranos,
policianoacrilatos y copolímeros de los mismos y polietilenglicol.
Estos pueden asumir la forma de hidrogeles
co-poliméricos o estructuras poliméricas reticuladas
en donde se pueden incorporar fármacos para una mejor
administración local, bien durante la polimerización o bien, en el
caso de ciertos hidrogeles, se pueden cargar posteriormente. Las
matrices preferidas se adaptarán a medida de acuerdo con las
características moleculares del agente para controlar la libre
difusión hacia el exterior.
Se pueden construir y utilizar múltiples tipos de
catéteres y otros dispositivos médicos revestidos con Saratin,
dependiendo de la necesidad terapéutica individual para la cual
hayan sido diseñados, o bien para la finalidad más específica de
suministrar localmente el polímero cargado con Saratin. La presente
invención ha sido ensayada con el catéter de balón comercializado
con el nombre Blue medical Devices BV GO de Blue medical, pero no
queda limitada a este tipo de catéter.
La unión de vWF a colágeno fue investigada en
placas de microvaloración, esencialmente como ya es conocido (Blood
1995; 85(3):705-711). Diversos colágenos,
bien colágeno humano de tipo I, tipo III, o bien colágeno de piel de
ternero (Sigma), fueron revestidos durante la noche mediante
pipeteado de 50 \mul de colágeno, disuelto en ácido acético 50
mM, a 125 \mug ml^{-1}, en placas de microvaloración de 96
pocillos en presencia de 200 \mul de PBS, para promover la
renaturalización. Después del bloqueo de los sitios no revestidos
con BSA, se añadió a los pocillos, en presencia de Saratin, vWF
humano purificado (1,25 \mug ml^{-1} para placas revestidas con
piel de ternero y colágeno I; 0,625 \mug ml^{-1} para placas
revestidas con colágeno III) o plasma normal diluido (plasma
humano: 1/80 sobre colágeno I y III, 1/40 sobre colágeno de piel de
ternero; plasma de hámster, ratón y porcino: 1/80 sobre colágeno
III; 1/20 sobre colágeno I y colágeno de piel de ternero) y se
incubó durante 2 horas (plasma diluido) o durante 1 hora (vWF
purificado). La unión de vWF residual a colágeno se determinó
después de una etapa de lavado adicional empleando antisuero de
conejo anti-vWF (Dako, Copenhagen, Dinamarca)
conjugado con peroxidasa de rábano picante, el cual se desarrolló
midiéndose entonces la absorbancia de luz resultante a 492 nm.
Cuando las placas de microvaloración fueron
incubadas previamente con colágeno humano I, colágeno humano III o
colágeno de piel de ternero, la posterior incubación de vWF
purificado en presencia de Saratin se asoció con una inhibición,
dependiente de la dosis, de la unión vWF-colágeno,
con valores IC_{50} de 0,23\pm0,004, 0,81\pm0,04 y
0,44\pm0,008 \mug ml^{-1} respectivamente (figura 1). Cuando
el vWF purificado fue sustituido por plasma humano normal diluido,
se mantuvo la potencia inhibidora del Saratin (tabla 1). El Saratin
inhibió también la unión de vWF en plasma diluido porcino, de
hámster y múrico a los diferentes colágenos ensayados, con una
eficacia consistentemente más elevada contra colágeno I (tabla
1).
A la vista de la importancia de los esfuerzos
cortantes en el control de la adhesión de plaquetas a colágeno,
dependiente de vWF (J. Lab. Clin. Med. 1974;
83(2):296-300), se llevaron a cabo estudios
de perfusión en cámara de flujo para examinar la actividad
inhibidora de Saratin bajo condiciones de flujo similares a las
encontradas en arterias dañadas o enfermas. Se revistió colágeno de
piel de ternero sobre cubreobjetos de material plástico como ya es
conocido (Blood 1995; 85(3):705-711). Se
realizaron perfusiones en una cámara de perfusión de placas
paralelas con dos soportes de cubreobjetos y con alturas de la
cámara de 0,4, 0,6 o 1,0 mm y un ancho de 1,0 cm, bajo flujo
pulsante (bomba de rodillos, Watson Marlon 603S, VEL, Leuven,
Bélgica) a velocidades de esfuerzo cortante aproximadas de 2.700,
1.300 y 300 s^{-1}, respectivamente. Se perfusionó sangre entera
anticoagulada (0,2 IU ml^{-1} de heparina de bajo peso molecular,
Clexane) sobre los cubreobjetos revestidos con colágeno durante 5
minutos, tras lo cual los cubreobjetos enjuagados fueron teñidos
con Grünwald-Giemsa y evaluados respecto a la
deposición de plaquetas mediante microscopía de luz y análisis de
imágenes como ya es conocido (Blood 1995;
85(3):705-711), empleando cobertura de
superficie como un parámetro cuantitativo.
A una velocidad de esfuerzo cortante de 2.700
s^{-1}, Saratin inhibió, de forma dependiente de la dosis, la
adhesión de las plaquetas, con un valor IC_{50} = 0,96\pm0,25
\mug ml^{-1} (figura 2). Sin embargo, a una velocidad de
esfuerzo cortante más moderada de 1.300 s^{-1}, se observó un
cambio distintivo hacia la derecha en la curva de
dosis-respuesta, con un valor IC_{50} =
5,2\pm1,4 \mug ml^{-1} (figura 2). A velocidades de esfuerzo
cortante venoso de 300 s^{-1}, Saratin fue incapaz de inhibir la
adhesión de plaquetas perfusionadas hasta 10 \mug ml^{-1}
(datos no mostrados).
Las interacciones de la proteína fueron
identificadas y caracterizadas por SPR empleando un instrumento
BIAcore 3000 (BIAcore, Freiburg, Alemania). Los reactivos del
acoplamiento se emplearon de acuerdo con los protocolos
desarrollados por el proveedor. El acoplamiento al chip sensor CM 5
se realizó por vía de grupos carboxilato activados a grupos amina
libres de colágeno humano tipo III (Sigma). El reconocimiento del
pH y la química del acoplamiento se llevaron a cabo bajo condiciones
estándar (Anal. Biochem. 1991;
198(2):268-277, JAI Press Ltd., 1992). Para
el acoplamiento, el colágeno fue diluido a 0,125 \mug ml^{-1}
en tampón 10 mM acetato (pH 4,5), dando lugar a 331 unidades de
resonancia (RU) de material inmovilizado. Esta matriz se utilizó
para estudiar la unión de Saratin recombinante purificado que fue
diluido en 20 mM Hepes (pH 7,4), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,005%
Tween 20. Todos los experimentos de unión se realizaron a 25ºC. Las
valoraciones con Saratin se llevaron a cabo a concentraciones que
van desde 7,8 nM a 10 \muM. Los valores de meseta RU
experimentales resultantes fueron trazados gráficamente de acuerdo
con la ecuación:
R_{eq}/\text{concentración de
Saratin} = (-K_{A} \ x \ R_{eq}) + (K_{A} \ x \
R_{max}).
La valoración de Saratin sobre la superficie de
colágeno inmovilizada dio lugar a la unión dependiente de la
concentración. Además, la cantidad máxima de Saratin unido a
colágeno sobre la superficie sensora se tradujo en una señal mayor
que la señal máxima calculada para un modelo de unión 1:1. Esto
apunta hacia la existencia de más de un sitio de unión para Saratin
sobre colágeno de tipo III, confirmado además por la observación de
que la adaptación de los datos a un modelo de unión 1:1 de acuerdo
con Langmuir no proporcionó resultados satisfactorios.
El análisis Scatchard de los datos de SPR indicó
la existencia de dos sitios de unión diferentes con afinidades
significativamente diferentes por Saratin (figura 3). El cálculo de
las constantes de equilibrio se tradujo en una constante de
disociación de 5 x 10^{-8} M para el sitio de unión de alta
afinidad y de 2 x 10^{-6} M para el sitio de unión de baja
afinidad.
La especificidad de Saratin sobre la función de
las plaquetas fue evaluada adicionalmente por medio de estudios de
agregación en plasma rico en plaquetas empleando colágeno, ADP,
ristocetina, ácido araquidónico o el imitador de tromboxano U46619
como agonistas. Sangre citrada (3,13%) de voluntarios sanos no
medicados fue centrifugada (15 min, 100 g) para obtener plasma rico
en plaquetas, al cual se añadió Saratin (concentración final
0-200 \mug ml^{-1}) durante 1 minuto antes de
la inducción de la agregación de plaquetas con colágeno (0,5 \mug
ml^{-1}), ADP (2,5 \muM), ristocetina (0,9 mg ml^{-1}), ácido
araquidónico (1,0 mM) o U46619 (1,3 \muM). Para cada agonista se
observó la agregación máxima (amplitud) durante un periodo de 5
minutos.
Saratin falló a la hora de inhibir la agregación
máxima a todos los agonistas ensayados, incluyendo colágeno, en
concentraciones finales de hasta 40 \mug ml^{-1} (tabla 2). Sin
embargo, Saratin fue capaz de inhibir parcialmente la agregación de
plaquetas inducida por colágeno a 100 \mug ml^{-1} (no
mostrado), con una inhibición completa a 200 \mug ml^{-1},
aunque la agregación a ADP resultó inafectada, incluso a 200 \mug
ml^{-1} de Saratin.
Se utilizó un modelo de CEA en la rata que
empleaba una técnica abierta con arteriotomía, separación directa de
la íntima y porciones de la media y cierre con sutura de la
arteria. Uno de los grupos de ratas recibió Saratin mientras que el
otro grupo sirvió como controles. Las mediciones de punto final
incluyeron: 1) adhesión de PLT, 2) tasa de trombosis, 3) desarrollo
de hiperplasia de la íntima. Se aplicó Saratin directamente a la
superficie endarterectomizada de la arteria carotídea antes del
cierre arterial. Para el análisis cuantitativo de la agregación de
PLT se emplearon micrografías electrónicas (aumento 2.000 X) de
arterias carotídeas preparadas. Los números totales de PLT fueron
contados empleando una cuadrícula superpuesta transparente
normalizada. IH y trombosis se evaluaron mediante análisis
morfométrico asistido por ordenador de secciones de la arteria
carotídea manchadas con elastina, con medición directa del área de
IH.
Los animales fueron sedados con isoflurano en una
campana de vidrio, pesados y luego anestesiados con una combinación
de cetamina (100 mg/kg) y maleato de acepromazina (1 mg/kg) por vía
intraperitoneal. Una vez que la anestesia adecuada fue confirmada
por la ausencia de respuesta a una estimulación en la pata trasera,
se inyectaron subcutáneamente 4 cc de salina normal en la región del
espinazo medio superior para servir como un bolo de fluido (10
cc/kg) para compensar cualquier pérdida de sangre
intra-operativa. La zona del cuello fue entonces
rasurada e impregnada con alcohol isopropílico al 7%. Empleando una
técnica estéril y un microscopio de disección (x40, sz40 Olympus,
Olympus America Inc., Melvilla, NY) se practicó una incisión
cervical central. Los músculos superficiales fueron divididos y se
realizó la disección hasta el nivel de la arteria carotídea
derecha. Los nervios cervicales en la región de la arteria fueron
liberados por disección para preservar la función de la faringe y
evitar un compromiso respiratorio
post-operatorio.
Después de la adecuada exposición de la arteria
carotídea, se obtuvo un control proximal y distal en la bifurcación,
con una separación de aproximadamente 1,5 cm, empleando torniquetes
de sutura de seda 3-0. Empleando una cuchilla
corneal se realizó una arteriotomía que se extendió en una longitud
de 6 mm con micro-tijeras. Empleando una aguja del
calibre 27, la íntima fue marcada transversalmente de un lado a
otro del vaso en dos líneas paralelas, separadas aproximadamente 2
mm entre sí. Las capas de la íntima y medial fueron separadas con
micro-forceps. Las ratas del grupo de Saratin
recibieron 5 \mul de solución de Saratin aplicada directamente a
la superficie endarterectomizada. La arteriotomía se cerró con una
sutura de nylon monofilamentosa 10-0 (MS/9,
Ethilon, Ethicon Inc., Somerville, NJ) comenzando en el extremo
distal. El torniquete distal fue separado en primer lugar para
evaluar la hemostasis en la línea de sutura, seguido por la
separación del torniquete proximal. El tiempo de aplicación de
Saratin fue de 5 minutos, lo cual representó el tiempo de cierre de
la arteriotomía. Cualquier sangría en la línea de sutura fue
tamponada suavemente con un aplicador con punta de algodón estéril
hasta que se consiguió la hemostasis. La arteria carotídea
endarterectomizada fue evaluada con un Doppler manual para
confirmar la patencia. La capa del músculo superficial y la piel
fueron cerradas entonces con sutura absorbible
3-0.
En los subgrupos de adhesión de plaquetas, las
ratas fueron anestesiadas de nuevo y las arterias carotídeas
endarterectomizadas fueron recogidas y fijadas en una solución de
glutaraldehído al 4% a las 3 horas o 24 horas después de la
endarterectomía carotídea. Durante el procedimiento de recogida,
los segmentos de carótida fueron abiertos longitudinalmente a lo
largo del sitio del cierre con sutura, para exponer así la zona
endarterectomizada. Las arterias fueron fijadas después con
tetróxido de osmio, deshidratadas en una serie graduada de
alcoholes, secadas al punto crítico con CO2 (1072 psi y 31,1ºC),
revestidas con oro-paladio y colocadas en un
microscopio electrónico de barrido (JEOL JSM 5410, JEOL, USA
Peabody, MA). Las zonas endarterectomizadas fueron barridas con un
aumento de 2.000 X y se obtuvieron imágenes fotográficas. Las
imágenes fotográficas fueron emparejadas y expuestas en un collage
para permitir la visualización de una zona más grande que la que
fue posible con un solo campo del monitor del microscopio
electrónico de barrido. Una vez montado el collage de fotografías,
este se cubrió con una cuadrícula superpuesta transparente. Se
utilizó la misma cuadrícula superpuesta para todas las fotografías
de las muestras, empleándose 116 cuadrados para contar el número
total de plaquetas en cada fotografía. El número 116 es el número
máximo de cuadrados que de un modo consistente podrían contarse en
todos los collages de fotografías. Los recuentos de las plaquetas
fueron realizados por observadores de doble ciego.
A las dos semanas después de la endarterectomía
carotídea, se anestesiaron las ratas del grupo de hiperplasia de la
íntima y se expuso la arteria carotídea endarterectomizada. Se
abrió el abdomen en la zona central y se expusieron la aorta distal
y la vena cava inferior. La vena cava fue transectada y la aorta
distal canulada con un catéter de calibre 20 para infusionar salina
normal a 100 mm Hg hasta que el efluente de la vena cava corriera
claro. A continuación, se infusionó formalina tamponada al 10% a 100
mm Hg en un volumen igual para completar la técnica de
perfusión-fijación. Se liberó por disección una
sección de 1 cm de la arteria carotídea operada y se colocó en
formalina al 10% hasta su tratamiento adicional respecto a la
histología. Las arterias fueron bloqueadas con parafina,
seccionadas y manchadas con elastina con tintura de Werhoeff y Van
Gieson. Se tomaron múltiples secciones en intervalos de 3
micrómetros, continuando cada una de ellas a lo largo de la
distancia del cierre de la arteriotomía con sutura continua de nylon
10-0 para normalizar la región de seccionamiento.
Las platinas teñidas con elastina fueron fotografiadas empleando una
cámara digital KODAK DC 120 Zoom (Eastman KODAK Company, Rochester,
NY). En este momento se anotaron cualesquiera secciones trombosadas.
Las imágenes no trombosadas fueron descargadas en un ordenador y
las zonas luminales de las carótidas fueron analizadas empleando el
programa ImagJ Software, Versión 0.991, de National Institutes of
Health (Bethesda, MD). Este paquete de software permitió delinear
la zona interna de la hiperplasia de la íntima y obtener así una
medida exacta del área en sección transversal del lumen del vaso.
Igualmente, se determinó el área exterior de la hiperplasia de la
íntima. La diferencia entre las dos áreas (área exterior de
hiperplasia de la íntima menos el lumen real) se determinó como el
área absoluta de hiperplasia de la íntima. Debido a que la sección
transversal arterial presentaba variaciones de forma individuales,
los valores se expresaron como una relación del área absoluta de
hiperplasia de la íntima al límite exterior de hiperplasia de la
íntima, y se anotó como un porcentaje de estenosis del lumen. Esta
relación representa la proporción del área de lumen ocupada por
hiperplasia de la íntima y permitió la comparación de las secciones
transversales arteriales de tamaño variable (4). Se apreció una
variabilidad mínima entre dos mediciones con observadores de doble
ciego.
Con el fin de evaluar los efectos de Saratin
sobre los recuentos de plaquetas y tiempos de sangría, sistémicos,
se determinaron los recuentos de plaquetas y los tiempos de sangría
de 12 ratas. Fue necesario obtener una muestra de sangre
pre-operatoria de cada rata de aproximadamente
1-1,5 cc, lo cual representa una porción importante
del volumen de sangre total de las ratas. A la vista de esto, es
razonable esperar un descenso en los recuentos de plaquetas
post-operatorios de las ratas tanto de control como
de Saratin. Con el fin de evaluar los efectos de Saratin sobre los
recuentos de plaquetas, se determinó la diferencia de los recuentos
de plaquetas para cada rata restando el recuento de plaquetas
pre-operatorio del recuento de plaquetas
post-operatorio, para obtener una puntuación de
diferencias. Las diferencias en los recuentos de plaquetas se
analizaron empleando el modelo ANOVA de disposición factorial 2 X 2
de tratamientos, el cual no demostró ninguna significación
estadística en las diferencias de recuentos de plaquetas entre las
ratas de control y las ratas tratadas con Saratin. Antes de la
operación se habían determinado los recuentos de plaquetas y
tiempos de sangría de todas las ratas. Seis ratas experimentaron
una endarterectomía carotídea y fueron recogidas 3 horas después de
la operación con los tiempos de sangría y recuentos de plaquetas
medidos, y las seis ratas restantes se recogieron 24 horas después
de la operación con los tiempos de sangría y recuentos de plaquetas
también medidos. Tres de las ratas de cada grupo de tiempo
recibieron Saratin por vía tópica y las tres ratas restantes
sirvieron como controles.
Los tiempos de sangría se determinaron por
transección de los 2 mm distales del rabo de la rata y sumergiendo
aproximadamente 4 cm del rabo en una solución tamponada de fosfato
a 37ºC. Se midió la cantidad de tiempo transcurrido desde la
transección del rabo hasta el cese de la sangría y el valor obtenido
se asignó como el tiempo de sangría. Los recuentos de plaquetas se
determinaron extrayendo una muestra de 1-1,5 cc de
sangre de la vena yugular interna, la cual fue analizada en un
analizador de sangre Coulter STKS, y los resultados fueron
expresados x 10^{3}.
Se anotaron los valores medios \pm errores
estándar. Se realizaron análisis de ensayo t sin aparear empleando
el programa Stat View (SAS Institute Inc. Cary, NC 27513) versión
5.0 para comparar los grupos tratados con Saratin y los grupos de
control respecto a los números de plaquetas adherentes, porcentaje
de estenosis luminal y tiempos de sangría. Se utilizó un análisis
Chi-Cuadrado de la razón de verosimilitud para
evaluar la razón de disparidad respecto al desarrollo de trombosis
dos semanas después de la endarterectomía carotídea. Se utilizó un
modelo ANOVA de disposición factorial 2 X 2 de tratamientos, para
evaluar las diferencias entre los recuentos de plaquetas
pre-operatorios y
post-operatorios.
Se organizaron ratas
Sprague-Dawleyu (350-400 g) en
grupos de endarterectomía carotídea en base a dos objetos
principales. 1) Evaluación de la adhesión de plaquetas y 2)
Evaluación de la estenosis luminal como consecuencia de hiperplasia
de la íntima, y tasa de trombosis. Dentro de estos dos objetivos,
las ratas de dividieron en animales de control y animales tratados
con Saratin. Todas las ratas experimentaron una endarterectomía
carotídea (véase más adelante), las ratas tratadas con Saratin
recibieron una aplicación tópica de 5 \mul de solución de Saratin
en la superficie luminal de la arteria carotídea inmediatamente
después de la separación de la capa de íntima/media. El grupo de
adhesión de plaquetas consistió en la evaluación por microscopía
electrónica a las 3 horas después de la endarterectomía carotídea
(n = 17) y a las 24 horas después de la endarterectomía carotídea
(n = 19). El grupo de hiperplasia de la íntima (n = 25) se recogió
dos semanas después de la endarterectomía carotídea.
Se activaron las superficies de materiales a base
de PA-12 por inmersión de los dispositivos en una
solución de 2 moles% de macro-iniciador
(poli(anhídrido de ácido
octadecen-alt-maleinacético) con un
per-éster (11-16 moles%) disuelto en isopropanol y
0,5 moles de dimetacrilato de etilenglicol (EGDMA)/1 mol de
macro-iniciador. Después de secar el revestimiento
de macro-iniciador/EGDMA, el revestimiento se
recoció durante otros 5-10 minutos a 120ºC, lo cual
ayudó a mejorar la fijación del macro-iniciador en
la superficie, mejorando así la reticulación.
Para optimizar las condiciones de revestimiento,
se utilizaron revestimientos de hidrogel generados en una lámina de
soporte de PA-12. Antes del revestimiento, las
láminas se habían lavado con isopropanol o acetona y secado.
Para el revestimiento con hidrogel, se habían
utilizado Blue Medical Devises GO del tipo de catéter de balón
(catéter RX PTCA) consistente en Vestamid (PA-12).
Se mezclaron soluciones acuosas de 5 moles% de ácido acrílico 100 ml
y 0,2 bis 0,8 moles% de
metilen-bis-acrílico, y se emplearon
para revestir láminas o catéteres. Después de la polimerización, el
dispositivo revestido se lavó con agua y durante otras 24 horas en
tampón de PBS.
A continuación, el polímero se recoció en el
horno a 60-80ºC durante 0,5-3
horas.
El espesor de los revestimientos de hidrogel
secos fue del orden de 1 a 4 \mum, y el hinchamiento del hidrogel
en solución acuosa fue del orden de 10 a 50 g de hidrogel húmedo/1
g de hidrogel seco.
Cuando se realizó la inmersión (30 minutos) de
una solución de Saratin tamponada con tampón de PBS pH 7,4, se
utilizó una concentración de 50 \mug ml.
Se utilizaron disolventes orgánicos para preparar
las soluciones de revestimiento a pulverizar sobre un catéter de
balón empleando un equipo de revestimiento por aspersión a pequeña
escala, estándar, similar al suministrado por EFD.
Figura 1. Efecto del Saratin sobre la unión de
vWF humano purificado a colágeno humano tipos I (círculos) y III
(cuadrados) y a colágeno de piel de ternero (triángulos). IC_{50}
con tipo I = 0,23\pm0,004 \mug ml^{-1}, tipo III =
0,81\pm0,04 \mug ml^{-1} y colágeno de piel de cordero =
0,44\pm0,008 \mug ml^{-1}.
Figura 2. Efecto del esfuerzo cortante sobre la
inhibición por Saratin de la formación de agregados de plaquetas
sobre colágeno humano de tipo III en una cámara de flujo in
vitro. Los círculos indican una velocidad de esfuerzo cortante
de 2.700 s^{-1} (IC_{50} = 0,96\pm0,25 \mug ml^{-1}),
mientras que los cuadrados indican una velocidad de esfuerzo
cortante de 1.300 s^{-1} (IC_{50} = 5,2\pm1,4 \mug
ml^{-1}).
Figura 3. Análisis Scatchard de la unión de
Saratin a colágeno humano inmovilizado tal como se detecta mediante
resonancia de plasmón superficial, indicando la presencia de un
sitio de unión de alta afinidad (K_{d} = 5 x 10^{-8} M, línea
continua) y de un sitio de unión de baja afinidad (K_{d} = 2 x
10^{-6} M, línea discontinua) para Saratin sobre colágeno
III.
Figura 4. Número de plaquetas adheridas a la
superficie subendotelial expuesta 3 horas después de la
endarterectomía carotídea, comparando grupos de aplicación de
Saratin (n = 7) y grupos de control (n = 10). Los datos son valores
medios \pmSE. El grupo de Saratin recibió 5 \mul de solución de
Saratin aplicada tópicamente a la superficie subendotelial
expuesta. Star indica un valor P de 0,05.
Figura 5. Número de plaquetas adheridas a la
superficie subendotelial expuesta 24 horas después de la
endarterectomía carotídea, comparando los grupos de aplicación de
Saratin (n = 9) y los grupos de control (n = 10). Los datos son
valores medios \pmSE. Las plaquetas se contaron empleando el
microscopio de barrido de electrones. El grupo de Saratin recibió 5
\mul de solución de Saratin aplicada tópicamente a la superficie
subendotelial expuesta. Star indica un valor P de 0,01.
Figura 6. Micrografía electrónica (2.000 X) de
una arteria carotídea de rata endarterectomizada 3 horas después de
la endarterectomía carotídea. A, superficie de control. B,
superficie que recibe Saratin tópico (5 \mul). La superficie de
control muestra abundantes elementos celulares incluyendo hebras de
fibrina, células rojas de la sangre y plaquetas. La superficie
tratada con Saratin muestra un notable descenso en elementos
celulares.
Figura 7. Micrografía electrónica (2.000 X)) de
una arteria carotídea de rata endarterectomizada 24 horas después de
la endarterectomía carotídea. A, superficie de control. B,
superficie que recibe Saratin tópico (5 \mul). La superficie de
control muestra numerosas células rojas de la sangre y plaquetas. La
superficie tratada con Saratin muestra un notable descenso en la
adhesión de plaquetas.
Figura 8. Porcentaje de estenosis luminal
secundaria con respecto a hiperplasia de la íntima dos semanas
después de la endarterectomía carotídea. Se muestran el grupo de
Saratin (n = 15) y un grupo de control (n = 10). El grupo de Saratin
recibió 5 \mul de Saratin aplicado por vía tópica a la superficie
subendotelial expuesta. Star indica un valor P de 0,004.
Figura 9. Secciones transversales a través de
arterias carotídeas que muestran la reducción de hiperplasia de la
íntima en arterias tratadas con Saratin (B) en comparación con la
rata de control sin tratar (A). IH = hiperplasia de la íntima.
Tabla 1. Concentraciones IC_{50} de Saratin
necesarias para inhibir la adhesión de plaquetas en PRP de varias
especies que se unen a colágeno humano de los tipos I y III y
colágeno de piel de ternero.
Tabla 2. Efecto de Saratin sobre la agregación
máxima de plaquetas (%) en PRP inducida por varios agonistas,
indicándose las concentraciones extremas de reactivos.
Tabla 3. Tiempos de sangría y recuentos de
plaquetas pre-operatorios y post- operatorios.
Claims (7)
1. Uso del polipéptido Saratin en la preparación
de un medicamento para inhibir la acumulación de plaquetas después
de daños vasculares o de una endarterectomía, que comprende
administrar al tejido vascular una cantidad terapéuticamente eficaz
de Saratin que previene la adhesión de plaquetas, inhibiendo con
ello la trombosis y la restenosis.
2. Uso según la reivindicación 1, en donde el
daño vascular está asociado con aterosclerosis, vasculopatía de
transplante cardiaco, restenosis de la coronaria después de una
intervención coronaria, angioplastia de balón, colocación de
dilatadores, rotablación, endarterectomía, incluyendo
endarterectomía carotídea, derivaciones de injertos de diálisis y
otras anastomosis de injertos, angina inestable, infarto de
miocardio agudo, ataque de apoplejía, hipertrofia benigna o
hipertrofia prostática benigna.
3. Uso según la reivindicación 1, en donde el
Saratin se administra localmente por vía de un catéter o en donde
el Saratin se incorpora dentro del pavimento endoluminal de un
catéter que es dirigido localmente hacia el tejido.
4. Uso según la reivindicación 1, en donde el
Saratin se incorpora en un polímero administrado por vía local que
permite la liberación sostenida local de Saratin.
5. Uso según la reivindicación 4, en donde el
Saratin formulado en polímero se administra localmente por vía de
un catéter.
6. Uso según la reivindicación 1, en donde el
Saratin se incorpora en un dilatador o en el revestimiento de un
dilatador que se coloca localmente en o sobre el tejido.
7. Uso según la reivindicación 1, en donde el
Saratin se incorpora en un injerto endovascular o en un
revestimiento de injerto endovascular que se coloca localmente en o
sobre el tejido.
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