UA77402C2 - Use of saratin for inhibition platelet adhesion - Google Patents

Description

Опис винаходу

Винахід відноситься до дії поліпептиду Саратину, що значно зменшує адгезію та акумулювання тромбоцитів після ушкоджень судин, таких як ендартеректомія. Крім того, винахід відноситься до інгібування залежного від

ММУЕ зв'язування тромбоцитів з колагенами стінки судини в умовах підвищеного зрушення і, більш конкретно, до нового застосування Саратину в медицині як інгібітора тромбозу, при якому згаданий поліпептид можна застосовувати місцево, у вигляді топічної речовини, або у вигляді покриття на медичних пристроях.

Адгезія клітин крові, особливо тромбоцитів, до стінок ушкоджених судин - явище, широко відоме в 70 ангіопластиці та хірургії. Такі ушкодження можуть виникати в ході різних варіантів хірургічного втручання та підшкірної терапії, що здійснюють для повторного відкриття блокованих каналів, проток та інших порожнин, щоб видалити хворі тканини та імплантувати замінні тканини або їхні компоненти.

Були розроблені різні типи методик втручання, що підсилюють або послабляють, або усувають блокування кровоносних судин, забезпечуючи кровотік через судину. Один з методів лікування стенозу або закупорки 79 кровоносних судин полягає в ангіопластиці шляхом підшкірного надування. Балонний катетер проводять через артеріальну систему пацієнта та вставляють у звужену або блоковану зону, потім у нього накачують повітря, щоб розширити звужену зону. Підшкірна транслюмінальна ангіопластика (РТСА) являє собою методику ангіопластики, яка найбільш широко використовується для розкриття закупорених атеросклеротичних артерій.

У загальному випадку, ангіопластичні методи дозволяють одержувати прекрасні результати, оскільки дозволяють обходитися без шунтивної хірургії, але приблизно в 30-4095 пацієнтів, у яких спостерігалися явні поліпшення при первинному розширенні артерії, згодом, через 3-9 місяців, виникає повторне звуження судини (рестеноз). Якщо рестеноз виявляється у важкій формі, пацієнту може знадобитися повторна ангіопластика, часто із імплантацією стента, котрий у судині виконує функцію розпірки.

В інших випадках може знадобитися реконструкція артерії за допомогою шунтивної хірургії, котра пов'язана с |з більш високим ризиком. Притім, що у світі щорічно проводиться більш 800 000 операцій РТСА, Ге) соціально-економічні наслідки цих 30-4095 випадків рестенозу стали об'єктом серйозного занепокоєння хірургів-кардіологів.

Рестеноз часто є результатом розтягання та зминання балоном стінки артерії, та існує можливість, що направляючий провід катетерів, використовуваних у таких процедурах, у процесі розгортання заподіє с ушкодження та може привести до проліферації клітин гладкої мускулатури артерії, що обумовлює повторне ав закриття артерії ("рестеноз") через декілька місяців.

Через можливі ускладнення, пов'язаних із рестенозом та погрозою переміщення ембола від виразкового М атеросклеротичного ушкодження тканини, що пов'язано з важкими наслідками, застосування повторної ї- ангіопластики в сонній артерії суворо обмежено варіантами мінімального інвазивного втручання.

Зо Раніше намагалися лікувати закупорку сонних артерій, які ведуть до мозку, шляхом втручань іншого типу. -

Ендартеректомія сонної артерії - хірургічний метод усунення закупорки сонних артерій, і у судинній хірургії США він використовується найчастіше. Результати випробувань, проведених у багатьох центрах, продемонстрували ефективність цієї методики при лікуванні позачерепної сонної хвороби як у симптоматичних « пацієнтів, так і пацієнтів, що не виявляють симптомів захворювання ШАМА 1995; 273:1421-28; М Епаї. У. Меа. З 1994; 325:445-53), крім того, методи ендартеректомії використовуються для лікування захворювань закупорки с судин, розташованих в інших місцях (Мазе. Зи!игоу. 1999; 33:461-70).

Із» При ендартеректомії сонну артерію розрізають та атеросклеротичне ушкодження тканини видаляють із судини через розріз. У хірургії здійснюють роздвоєння сонної артерії через розріз у шиї пацієнта та поміщають затиски по обидва боки місця закупорки, щоб ізолювати його, потім роблять розріз, щоб розкрити артерію.

Видаляють закупорку, ізольовану область промивають та видаляють з порожнини рідину, потім артерію 7 закривають за допомогою накладення шва. Затиски видаляють, щоб відновити кровотік через артерію. -і Інвагінація та можливі забруднення затисків можуть послужити причиною серйозних проблем, що виникають після відкриття сонної артерії та поновлення кровотоку в ізольованій раніше області. т- Хоча ендартеректомія є ефективним методом терапії, після неї часто залишається адвентиція, та значні ав! 20 області незахищеного тромбогенного субендотелію. Незважаючи на ефективність ендартеректомії сонної артерії, ця операція може приводити до ускладнень, включаючи тромбоз та розвиток гіперплазії інтими, які о обумовлюють ускладнення, що зводять нанівець ефект від втручання, або створюють нові проблеми.

Клінічні дослідження свідчать, що після ендартеректомії сонної артерії, безпосередньо в післяопераційний період у 1-1095 пацієнтів виникають інсульти, обумовлені, головним чином, утворенням тромбів у зоні 29 ендартеректомії з наступною церебральною емболізацією |ЗігоКе 1984; 15; 950-55). Акумулювання тромбоцитів

ГФ) може також приводити до рестенозу, пов'язаного з розвитком гіперплазії інтими, який може виникати протягом двох років після операції. Були повідомлення, що через 2-5 років після ендартеректомії в 10-20905 пацієнтів о виникає рестеноз, обумовлений гіперплазією інтими, потовщенням інтими та зменшенням діаметра судин - про це свідчить дуплексне ультразвукове сканування сонної артерії (У. Мазе. З!ига. 1986; 3; 10-23). 60 На клітинному і молекулярному рівні, реакцією стінки судини на механічні травми, хірургічне втручання, уведення стента, уведення трансплантованої судини (артеріального або артеріально-венозного трансплантата, тобто діалізного трансплантата) є складна комбінація запалення, міграції клітин гладкої мускулатури, проліферації та трансформації міофібробластів; ці явища виникають безпосередньо після травми (Ешига 1997; р.289-317). Якщо в результаті захворювання артерія сильно ушкоджена, що може збільшуватися відкладенням бо кальцію, втручання може також, у деякій мірі, обумовлювати додаткове ушкодження з осередковою ендотеліалізацією та уразливість основних компонентів позаклітинного матриксу, таких як колаген та еластин. У деяких пацієнтів поява надлишку тромбоцитів та фібриногену може приводити до гострої тромботичної закупорки.

Дослідження, проведені на моделях пацюків після ендартеректомії сонної артерії (Мешгозигу 1985; 16: 773-179), а також на моделях емболектомії балонних ушкоджень Цар. Іпмеві 1983; 49: 327-33) показали, що при ушкодженні судини обдираються клітини ендотелію та починається адгезія тромбоцитів до незахищеного субендотелію. Методом скануючої електронної мікроскопії Зрайопе та ін. |Мецгозигу 1985; 16: 773-79) установили, що через п'ять хвилин після ендартеректомії сонної артерії в пацюка, в ушкодженій зоні формується 7/0 Моношар тромбоцитів. Через п'ятнадцять хвилин після травми спостерігається агрегація тромбоцитів та формування тромбів. Через тридцять хвилин після ендартеректомії ця область виявляється покритою активованими тромбоцитами, фібрином та червоними кров'яними клітинами. Утворення тромбів досягає піка через три години після травми, та спостерігається товстий фібрино-тромбоцитний шар. Тромбоцити є найважливішими учасниками цього процесу утворення тромбів, а отже невід'ємними компонентами тромбозу, /5 але, крім того, вони також відіграють важливу роль у розвитку гіперплазії інтими.

Дослідження з використанням тромбопенічних пацюків свідчать, крім того, що в них спостерігається значно менша товщина інтими після ушкодження сонної артерії в порівнянні з контрольними пацюками (Ргос. Маї! Асаа.

ЗСІ, ОА 1989; 86: 8412-16). Коли тромбоцити прилипають до незахищеного субендотелію ушкодженої судини, вони активуються та вивільняють свої гранули. Ці гранули містять вазоактивні та тромботичні фактори (серотонін, АОР, фібриноген, фактор Моп УУШебгапаз, тромбоксан А2) , а також фактори росту (породжений тромбоцитом фактор росту, трансформуючий ріст фактор-бета та фактор епідермального росту) |Сігсшайоп 1985; 72: 735-40). Точні механізми, за якими тромбоцити прискорюють розвиток гіперплазії інтими, цілком поки неясні. Результати досліджень дозволяють припустити, що тромбоцити, у першу чергу, поставляють фактор, що викликає хемотаксис для міграції серединних клітин гладкої мускулатури в напрямку до інтими в другій фазі сч ов розвитку гіперплазії інтими |Мазе. Зиго, 1991; 13: 885-91). Інші дослідження, з використанням антитіл анти-РОСЕ, продемонстрували найважливішу роль, яку РОСЕ грають в акумулюванні неоінтимальних клітин і) гладкої мускулатури після ушкодження судини |Зсіепсе 1991; 253: 1129-32). Інший механізм, за яким тромбоцити можуть підсилювати розвиток гіперплазії інтими, полягає в активації каскаду коагуляції та наступного акумулювання тромбіну в зоні ушкодження. Результати деяких досліджень свідчать про мітогеничний вплив с зо тромбіну на клітини гладкої мускулатури |У. Сііп. Іпмеві. 1993; 91: 94-98, 9). Мазе. Бигоа. 1990; 11: 307-131.

Крім того, встановлено, що тромбін є чинником, який стимулює активацію тромбоцитів. Безвідносно до точного о механізму, адгезія та активація тромбоцитів у зоні ушкодження судини відіграють важливу роль у розвитку «г тромбозу та гіперплазії інтими, а отже, інгібування адгезії та активації тромбоцитів може сприяти запобіганню або зменшенню швидкості розвитку тромбозу та гіперплазії інтими. ї-

Медіатором прилипання тромбоцитів до ушкодженої стінки артерії є, у першу чергу, фактор моп У/Шебргапа ї- (МУР), мультимерний глікопротеїн, що вивільняється з клітин ендотелію та циркулює в плазмі, де функціонує як переносник протеїну для фактора МІ (Аппи. Тем. Віоспет. 1998; 67: 395-424). Високомультимеризований УМГ теж циркулює, замкнений усередині альфа-гранул тромбоцитів, з яких він вивільняється після активації тромбоциту (Аппи. Тему. Віоспет. 1998; 67: 395-424). В умовах підвищеного зрушення, котрі зустрічаються в зоні « атероматичного запалення або механічного ушкодження, УМУЕ може, через свій домен АЗ, утворювати зв'язки з з с вихідними на поверхню волокнами колагену |Віоспетівігу 1986; 25 (26): 8357-8361, Віоса 1987; 70О(5); . 1577-1583, 9. Віої. Спет. 1987; 262(28): 13835-13841). Потім зв'язаний з колагеном уУМуУР, у свою чергу, зв'язує и?» тромбоцити через антигенну детермінанту, що з'являється в залежності від зрушення в домені АТ УМУ/Е, що взаємодіє з тромбоцитом СРІМХЛ/ |Віоса 1985; 65(1): 85-90, Віоса 1985; 65(4): 823-831, Вг. 9. Наетаїйо! 1986; 53(4): 681-691). Таким чином, УУуЕ відіграє роль містка між колагеном та тромбоцитами, і це є необхідною -І умовою для здійснення адгезії тромбоцитів до колагену в потоці МУ. ар. Сі. Мед, 1974; 83 (2): 2 96-3001.

Проте, прокатування тромбоциту по мУУЕ приводить до слабкої адгезії, та для здійснення міцної адгезії,

Ш- активації та агрегації тромбоцитів вимагаються, крім того, прямі взаємодії між колагеном та іншими їх рецепторами на поверхні тромбоциту |Гпготр. Наетові 1997; 78(1): 434-438, Тпготр. Наетові 1997; 78(1): 5о 239-444). У число прямих рецепторів колагену на тромбоцитах входять ОР МІ ІВіоса 1987; 69(6):1712-1720, о Тиготр. Наетові 1999; 81(5): 782-792, 9 Сііп. Іпмеві 1989; 84(5): 1440-1445), ОР Іа/Ліа (А5/В4) |У. Сіїп. Іпмеві.

Ге 1989; 84(5): 1440-1445, Майте 1985; 318(6045): 470-472), ії, у меншому ступені, ОР ІМ (СОЗ6) |У. ВіоЇ. Спет. 1989; 264(13): 7576-7583) і, можливо, навіть рб5 |). Сііп. Іпмеві. 1997; 100 (3): 514-521). Встановлено, що під час відсутності зв'язування тромбоцитів при участі УМУЕ, ці рецептори є занадто слабкими медіаторами, щоб в осаджувати тромбоцити на колагені з потоку ІВг. У. Наетаїй! 1986; 63(4): 681-691). Нарешті, УМУУ у комбінації з фібриногеном сприяє структуруванню та подальшій активації тромбоцитів через зв'язування з Р Пр/Ша

Ф) тромбоциту |У. Сіїп. Іпмеві. 2000; 105(6): 783-791), що забезпечує стабільність та міцність, необхідні для ка розвитку тромбу.

В останні роки, після відкриття СР Пр/Па тромбоциту та антагоністів рецептора АОР, у протиагрегаційній бо терапії з'явився великий прогрес |Согопагу Агі Оіз 1999; 10(8): 553-560, 9. Ат, Со. З!игу. 2000; 191 ((1): 76-92). Проте, розроблені методи не призначені для інгібування початкової адгезії тромбоцитів до схильних до цього волокнах колагену, і, незважаючи на ефективність антагоністів СР Пр/Па в ослабленні взаємодій тромбоцит-тромбоцит, тромбоцити по колишньому налипають на ушкоджені ділянки стінки судини |ІВіоса 1993; 81(5): 1263-1276, Сігсшайоп 1995; 91(5): 1354-1362). Далі, активація тромбоцитів майже завжди спричиняє 65 більш широкі наслідки, чим агрегація та гострий тромбоз, прогресування підгострої та хронічної гіперплазії інтими повинно бути, принаймні, частково, піддане впливу мітогеничних медіаторів, таких як продукований тромбоцитом фактор росту (РОСЕ), який вивільняється активацією тромбоцитів. Справді, було встановлено, що інгібування РОСЕ зменшує гіперплазію інтими в різних видів тварин |Зсіепсе 1991; 253(5024):. 1129-1102,

Сігсцайноп 1999; 99(25): 3292-3299).

Припустити, що УМ/Е має велике патофізіологічне значення, можна виходячи з факту підвищення кількості циркулюючих УМ/Е у пацієнтів з гострим інфарктом міокарда | йготь Наетові 2000; 84: 204-209, Сігсшайоп 1998; 98(4): 294-299), причому рівні мММУ/Б позитивно корелюють з поганим прогнозом (Сігсціайоп 1998; 98(4): 294-299). Крім того, дослідження іп мімо свідчать, що нейтралізація антитіл анти-мМУуг приводить до інгібування експериментального тромбозу, що підтверджує важливу роль УМ/Е у формуванні тромбів | пготь. Наетозі 1998; 7/0 79(1у: 202-210). Далі, У міру ще більшого поширення в лікуванні гострих коронарних синдромів методів ангіопластики, які неминуче приводять до ушкодження стінки судини та уразливості колагену, стає ще більш актуальною розробка способів як можна більш раннього фармакологічного втручання в каскад адгезія-активація-агрегація тромбоцитів.

Два основних напрямки в сучасній терапії, котра має метою обмеження адгезії та активації тромбоцитів, а /5 також наступного тромбозу та гіперплазії інтими, полягають у використанні антитромбоцитних агентів та антитромботичних призначень. Хоча такі лікарські препарати, як аспірин, ефективно блокують синтез

Тромбоксану А2 за рахунок інгібування містків циклооксигенази, вони не запобігають індукованій колагеном адгезії та активації тромбоцитів, які стимулюють розвиток гіперплазії інтими. Застосування гепарину як антитромботичного агента сполучено з ускладненнями та обмеженнями, включаючи непередбачену реакцію на 2о дозу, необхідну для надійного лабораторного моніторингу, обмежену активність проти зв'язаного з тромбом тромбіну, множинні зони інгібування, залежність від антитромбіну І, ризик сильної кровотечі, так само, як і необхідність у безупинному уливанні. Очевидно, що ідеальний терапевтичний агент повинний робити специфічну до зони та локалізовану дію, без системного розподілу або загальної коагулопатії.

Виявилося, що найважливіші ефекти, які ініціюють каскад подій, що приводять до тромбозу та наступної сч об Піперплазії інтими, виникають у результаті взаємодій між незахищеним колагеном субендотелію в зоні ушкодження судини та моношаром тромбоцитів, які налипнули на незахищений колаген. Отже, специфічний і) інгібітор адгезії тромбоциту до колагену субендотелію може запобігати, або принаймні, гальмувати розвиток тромбозу та гіперплазії інтими.

У літературі описано, що деякі видобуті з п'явки речовини здатні інгібувати взаємодії колаген-тромбоцит с зо ІВіоой 1995; 85(3): 705-711, Ріаїеієїв 2000; 11(2): 83-86, 3. Віої. Спет. 1992; 267(10): 6893-6898, 3. Віо).

Спет. 1992; 267(10): 6899-6904, Віоод Соади! Ріргіпоїувіз 1991, 2(1): 179-184). Відомо, що дестабілаза, о ізопептидаза, що виявляє активність у плані деполімерізації фібрину, виділена з Нігидо тедісіпаїїв5, інгібує «г агрегацію тромбоцитів, викликувану різними агоністами, включаючи колаген, але вважається, що вона утворює зв'язки безпосередньо з мембраною тромбоциту (Ріаїеїеів 2000; 11(2): 83-86). Антитромбоцитний протеїн п'явки ї- (ГАРР), протеїн з масою -13ЗкДа зі слини Наетепіегіа ойісіпайїї5, інгібує адгезію тромбоцитів до колагену при ї- статичних умовах |У. Віої. Спет. 1992; 267(10): 6899-6904, Тиготр. Наетові 1999, 82(3):1160-1163| та при прискореній протоці (Агпегіозсіег Тпготр. Мазе. Віо! 1995, 15(9): 1424-1431), і робить вплив як на УМУЕ, так і на зв'язування тромбоциту з колагеном, медіатором якого є ОР Іа/Ліа |Тпготь. Наетозвзі 1999, 82(3): 1160-1163).

Калін являє собою протеїн - б5кДа з Нігидо тедаісіпа! із, що має аналогічну дію. Калін теж інгібує взаємодії « колаген-тромбоцит як у статичних, так і в динамічних умовах |Віоо4 1995; 85(3): 705-711, Віоо4 Соади! з с Рібгіпоїувіз 1991, 2(1): 179-184, Тиготр. Наетові 1999, 82(3): 1160-1163). Крім того, як ГАРР, так і Калін є . потенційними інгібіторами ініційованої колагеном агрегації тромбоцитів, які інгібують агрегацію при и?» концентраціях, близьких до тих, що блокують утворення зв'язків УМУЕ з колагеном |У. Віої. Спет. 1992; 267(10): 6893-6898, Віосй Соади! Рібгіпоїузіз 1991, 2(1): 179-184, Віоса 1995, 85(8):712-719).

Оцінка ефективності як ГАРР, так і Каліна при тестуванні в моделях тромбозу іп мімо, мала перемінний -І успіх. Виявлено, що (АРР не може гальмувати формування тромбу на покритих колагеном трансплантатах артеріально-венозної розвилки в бабуїна, незважаючи на застосування доз, що інгібують ініційовану колагеном

Ш- агрегацію (Апегіозсіег Тпготр 1993, 13(11): 1593-1601), тоді як Калін чинив залежну від дози інгібуючу дію їх на формування тромбів у моделі венозного тромбозу хом'яка ІВіоса 1995, 85(3): 712-719).

У цій галузі знань відомі нетромбогенні та антитромбогенні покриття для стентів та катетерів. о Нетромбогенні покриття та продукти засновані на модифікованих та вищих полімерах, приклади описані |в

Ге заявках М/О9301221 та УУ09830615).

Антитромботичні та антирестенозні покриття являють собою, у загальному випадку, біосумісні покриття, що можуть також служити джерелами місцевого постачання лікарських препаратів.

Покриття засновані, головним чином, на гідрогелях, їхні приклади описані в патентній літературі, присвяченій методикам виготовлення різних типів гідрогелів та покрить для медичних пристроїв, у тому числі, (Ф) такі приклади наведені Ів заявках У/09211896, МУО9811828, МУО0147572, ЕРО887369 та М/О01398111. ка Профіль виходу терапевтичних речовин, що містяться в покритті, можна регулювати, наприклад, за допомогою варіювання товщини полімерних шарів, або шляхом вибору специфічних полімерних покрить, що бо Володіють підібраними фізико-хімічними властивостями (такими, як заряд, гідрофобність, гідрофільність) та/або шляхом готування покрить у виді різних шарів. Фахівцям відомі критерії вибору полімеру та оптимізації швидкості виходу. Інші покриття |описані в роботі Різспеї! (Сігсціайоп, 1996, 94: 1494-95), Торо! та ін. (Сігсшайоп, 1998, 98: 1802-20) та МеМаїг та ін. у методиці Тесппоіоду, 1996, 16-22.

Застосування стентів, проводів та катетерів у серцево-судинній системі є загальноприйнятою практикою, б5 тому ушкодження судин, емболізація та наступний рестеноз є головним об'єктом занепокоєння кардіологів у процесі катетеризації або хірургічного втручання, а також у післяопераційний період. Альтернативні методи,

такі як ендартеректомія, сполучені з виникненням порівнянних проблем. Кожна процедура, пов'язана з маніпулюванням артеріями, тобто - судинна хірургія та ангіопластика, допускає розвиток гіперплазії інтими.

Користь, яку можуть принести способи запобігання або гальмування розвитку гіперплазії інтими неможливо переоцінити, а переваги способу, що дозволяє досягати цих ефектів без побіжного створення системних ефектів, є ще більш очевидними.

Таким чином, очевидна необхідність розробки поліпшених фармацевтичних препаратів та способів інгібування самих ранніх подій у патофізіології (тобто адгезії тромбоцитів) та очікується, що досягнення в цій сфері дозволять значно знизити рівні захворюваності та смертності, пов'язаних з такими процедурами, як /о ангіопластика та хірургічне втручання.

У загальному випадку, даний винахід включає введення недавно описаного інгібітора адгезії тромбоцитів

Саратину усередину або на обрану зону усередині або на порожнині тканин, тобто, у судинну систему або органи, за таких умов, щоб Саратин можна було застосовувати місцево, як топічний агент або єднальне покриття на поверхні, для запобігання та інгібування небажаної тромботичної та/або рестенозної реакції на ушкодження 7/5 Стінки судини, включаючи ушкодження, обумовлені стентами, діалізними трансплантатами, іншими судинними трансплантатами, та для лікування рубців, що формуються при легких травмах, а також для лікування та пасивації нестабільних атеросклеротичних осередків.

Саратин являє собою недавно описаний (МУО 0056885) рекомбінантний протеїн 12кД, спершу виділений з п'явки. Протеїн інгібує залежне від УМУЕ утворення зв'язків тромбоцитів з колагенами стінки артерії при умовах підвищеного зрушення, та саме цей аспект винаходу робить Саратин придатним для інгібування артеріального тромбозу. Інший новий аспект полягає в тому, що Саратин можна застосовувати як топічний агент в зоні ушкодження, що приводить до гальмування тромбозу та/або гіперплазії інтими без яких би то ні було системних ефектів. Це представляє методику зі специфічними ефектами, що цілком підходить для застосування рівною мірою як хірургами, так і кардіологами. сч

Саратин можна комбінувати з безліччю різноманітних терапевтичних агентів для постачання на місці.

Прикладами речовин, застосовуваних у коронарних артеріях, є антитромботичні агенти, такі як простациклін та і) саліцилати, тромболітичні агенти, такі як стрептокіназа, урокіназа, активатор плазміногену тканин (ТРА) та анісоїльований комплекс, що активує, плазміноген-стрептокіназа (АРЗАС), судинорозширювальні агенти, такі як нітрати, лікию, що блокують кальцій у каналах, антипроліфераційні агенти, такі як колхіцин, та алкілувальні с зо агенти, інтеркаляційні агенти, фактори модулювання росту, такі як інтерлейкіни, трансформуючий ріст фактор-бета та аналоги виділеного з тромбоциту фактора росту, моноклонні антитіла, орієнтовані проти о факторів росту, протизапальні агенти, як стероїдні, так і нестероїдні, та інші агенти, що можуть модулювати «г тони судин, їхні функції, артеріосклероз, і реакцію загоєння ушкодження судини або органа, що виникло у результаті втручання. У комбінації або покриття за даним винаходом можна також включати антибіотики. Більш ї- зв того, покриття можна застосовувати для доставки фармацевтичних препаратів орієнтовно, усередину стінки ча судини. За допомогою введення діючої речовини в здатний розбухати полімер, цей активний агент можна вивільняти при розбуханні полімеру.

В одному з втілень даного винаходу, покриття виготовляють з гідрогелю, такого як оксид поліетилену, альбумін, гідрофільні поліметакрилати та гідрофільні поліуретани. «

Даний винахід відноситься, крім того, до застосування Саратину та його похідних, наприклад, через з с пристрої для доставки ліків у потрібне місце/катетери або через стенти та покриття стентів, а також через судинні трансплантати та покриття трансплантатів. Винахід відноситься також до способів призначення ;» Саратину в композиціях, з яких із часом вимивається регульована кількість Саратину в локалізованій зоні.

Зокрема, одне з втілень даного винаходу відноситься до застосувань катетерних пристроїв для доставки

Саратину до потрібної зони; за допомогою катетерів Саратин можна також застосовувати усередині тканин -І самостійно або разом з іншими терапевтичними агентами поза полімерною матрицею. Основні вимоги до застосовуваного полімерного матеріалу за даним способом полягають у його біосумісності та здатності ш- вивільняти лікарські речовини, яку можна пристосувати для специфічного застосування. ї5» Контрольованого місцевого вивільнення Саратину можна досягти шляхом одного тільки просочування, 5р одного тільки іонтофорезу та однієї тільки електропорації, або для ефективного вивільнення та введення о Саратину усередину порожнини судини можна використовувати комбінацію іонтофорезу та електропорації.

Ге Переважно, якщо катетер придатний для виконання процедури, спрямованої на підтримку високої концентрації лікарського препарату в обраній ділянці простору судини, так, що це приводить до поліпшеного покриття судини одним Саратином або його комбінацією з додатковими лікарськими речовинами. 5Б Даний винахід особливо корисний для місцевого постачання Саратину протягом або після процедур кардіологічного втручання, таких як ангіопластика, імплантація стента та ендартеректомія. (Ф, Рекомбінантний Саратин, що підходить для застосування за даним винаходом, експресували та виділили. з ка Напзепша роїутогрпа; було виявлено, що він діє Через блокування утворення зв'язків МУУГ з колагеном та ефективно запобігає адгезії тромбоцитів до колагену при підвищеному зрушенні. Саратин робив залежне від бо дози інгібування зв'язування очищеного людського уУМУБ з людськими колагенами типу І та типу ПП (ІСьо-0,23-0,004 та 0,81-0,04 мкг мл"! відповідно) та з колагеном шкіри теляти (ІС 50-0,44--0,008мкг мл". Крім того, Саратин виявив аналогічну інгібуючу здатність проти зв'язування з цими колагенами УУУЕє плазми людини, гризунів та свиней. У проточній камері, при умовах підвищеного зрушення (2700сек") , Саратин виявляв залежну від дози та сильну інгібуючу дію на формування агрегатів тромбоцитів на покритій колагеном поверхні бо (ІСво-0,96-40,25мкг мл) , але при зниженому зрушенні (1300 сек") на кривій залежності від дози спостерігалося зрушення вправо (ІС 50-5,2--1,4Ммкг мл"). Резонансним аналізом поверхневих плазмонів на людському колагені типу ЇЇ виявлені єднальні Саратин сайти як з високою, так і з низькою спорідненістю (Ка-5х103М та 2х10-9М відповідно), та хоча низькі концентрації Саратину, що інгібували адгезію тромбоцитів при підвищеному зрушенні (тобто насичення єднальних сайтів з високою спорідненістю), не чинили дії на залежну від УМУЕ агрегацію тромбоцитів, індуковану колагеном, було виявлено, що високі концентрації (тобто, насичення єднальних сайтів з низькою спорідненістю) інгібують агрегацію тромбоцитів. Ці дані свідчать, що

Саратин є сильним інгібітором залежної від УМУЕ адгезії тромбоцитів до колагену, що створює основу для його терапевтичного потенціалу як антитромботичного агента.

Крім того, дослідженнями встановлено, що Саратин виявляє сильну та залежну від дози інгібуючу дію на зв'язування ММУЕ не тільки з колагеном шкіри теляти, але і з людським колагеном типів І! та ІЇЇ, кожний з який у достатку присутній в субендотеліальних шарах стінки артерії, і, як вважається, відіграє важливу роль у взаємодіях тромбоцитів зі стінкою судини (Пйготор Наетові 1997, 78(1): 434-438)|. Оскільки взаємодії колаген-мМу/Б-СР ІБЛХЛ/ відбуваються тільки при досить підвищеному зрушенні, важливим аспектом даного 72 винаходу була демонстрація факту, що Саратин ефективний не тільки при статичних умовах, але також і в середовищі, яке найбільш наближене до ситуації, що зустрічається іп мімо. У проточній камері, яка дозволяє змінювати сили, зрушення для моделювання такого середовища, Саратин чітко інгібував акумулювання тромбоцитів до колагену, особливо при більш високих зрушеннях. Зсув вправо кривої залежності від дози в результаті зменшення зрушення є істотним, тому з цього можна зробити висновок, що ефективність Саратину іп 20 мімо може бути локалізована в зонах високого зрушення, де в результаті змін зверненої до крові ендотеліальної поверхні, наприклад, у зв'язаних з атеросклеротичними осередками або механічним втручанням, відбувається порушення ламінарності кров'яного потоку.

Дослідженням резонансу поверхневих плазмонів із Саратином встановлено, що колаген може захоплювати

Саратин двома незалежними єднальними сайтами, один з високою спорідненістю, а другий - з низькою СМ 25 спорідненістю. Здатність Саратину інгібувати зв'язування УМУЕ з колагеном пояснюється насиченням єднального о сайта з високою спорідненістю, в якого значення ІС 5о складають близько 5Х108М, тобто, дорівнюють константі дисоціації для цього сайта. Оскільки незалежна від уУУУБ індукована колагеном агрегація тромбоцитів інгібувалася тільки великими дозами Саратину, (більше 100мкм), можна припустити, що насичення єднальних колаген сайтів з низькою спорідненістю асоційоване з інгібуванням прямих взаємодій колаген-рецептор колагену. с 30 Іншим предметом даного винаходу є ефект, що складається у тому впливі, що Саратин чинить на локальне су оточення ендартеректомізованої судини без необхідності системного розподілу та без зміни функції тромбоциту або зміни коагуляції, що робить його ідеальною методикою для топічного застосування під час процедур - судинної хірургії та радіологічного втручання. ч-

У цьому аспекті даного винаходу, дію терапевтичного Саратину досліджували на моделі ендартеректомії 32 сонної артерії пацюків (СЕА), описаної раніше |). Мазе. бий. 1998, 28: 909-918). Передбачається, що - активація РІ Т є першим етапом розвитку тромбозу та рестенозу після СЕА, обумовлених ІН. Було виявлено, що місцеве застосування Саратину на поверхні з боку порожнини зменшує кількість тромбоцитів, що налипають на ендартеректомізовану артерію і, таким чином, гальмує розвиток післяопераційного тромбозу та ІН. «

Результати експериментів по антиадгезійній дії Саратину на тромбоцити, які оцінювали після проходження 40 двох різних післяопераційних періодів, свідчать, що кількість тромбоцитів, які налипнули на стінку судини З с через З години (Фіг.4) та через 24 години (Фіг.5) після ендартеректомії сонної артерії, у пацюків, оброблених "з Саратином, було значно меншим, чим у пацюків з контрольної групи. " Адгезія тромбоцитів через З години була зменшена на 5995 (64 --17,2 у порівнянні з 155--33,4 РІ Т на решітку,

Р-0,05) та на 7795 через 24 години (35--11,3 у порівнянні з 149--36,6 РІ Т на решітку, Р-0,0110). У контрольній групі адгезія тромбоцитів була аналогічною через З години та через 34 години, однак у групі, обробленій - Саратином, адгезія зменшилася від 64 до 35 тромбоцитів на решітку. -І На Фіг.б та 7 представлені типові картини ендартеректомізованої поверхні, обробленої та неопрацьованої топічним Саратином, отримані за допомогою скануючої електронної мікроскопії при 2000-кратному збільшенні. т На Фіг.бА показана контрольна поверхня через З години після ендартеректомії сонної артерії, яка свідчить про (ав) 50 достаток клітинного матеріалу, фібринових ниток, численних червоних кров'яних клітин та численних тромбоцитів, помітних зовсім чітко. На Фіг.6В показана оброблена Саратином поверхня через З години після їз ендартеректомії сонної артерії. Відзначено недолік клітинних елементів та майже вільна поверхня колагену. На

Фіг.7А показана контрольна поверхня через 24 години після ендартеректомії сонної артерії, тромбоцити видні як маленькі білі точки. На Фіг.7В показана оброблена Саратином поверхня Через 24 години після ендартеректомії 22 сонної артерії. У випадку обробки Саратином спостерігається виразне зменшення адгезії тромбоцитів.

ГФ) Застосування топічного Саратину після ендартеректомії сонної артерії значно гальмує розвиток гіперплазії т інтими в порівнянні з контрольною групою. Відсоток порожнинного стенозу, що використовується як міра ІН, був значно меншим у випадку застосування Саратину, чим у контрольній групі. Це зниження формування ІН корелювало з інгібуванням адгезії РТ. У вирахуванні порожнинного стенозу, у контрольних пацюків 60 спостерігалося 29,8 --6,8905, р-0,0042 порожнинного стенозу проти 10,9--4,895 порожнинного стенозу в обробленої

Саратином групи (Фіг.6). В обробленого Саратином пацюка діаметр порожнини був на 18,995 більше, ніж у контрольних пацюків. Результати гістологічного аналізу свідчать, що через два тижні після ендартеректомії сонної артерії в 5 з 15 контрольних пацюків (1595) розвився повноцінний тромбоз сонної артерії при тім, що тромбоз сонної артерії спостерігався в 0 пацюків з 15 особин, оброблених Саратином (095). Вірогідний аналіз бо хі-квадрат дає імовірність успішного результату 16,238, це означає, що імовірність розвитку тромбозу з закупоркою в контрольної групи в 16 разів більше, ніж у пацюків, оброблених Саратином Р-0,0156.

В обробленої Саратином групи не спостерігалося підвищеної кровотечі уздовж лінії накладеного на артерію шва. В оброблених Саратином пацюків не виявлено значних змін у тривалості кровотечі та числі системних тромбоцитів у порівнянні з контрольними пацюками через З та 24 години після ендартеректомії.

Модель СЕА знаходиться в близькій відповідності з операцією СЕА людини, й отже, на підставі отриманих результатів можна запропонувати спосіб зменшення шкідливого впливу адгезії та агрегації тромбоцитів у зоні ендартеректомії без системного впливу на функцію тромбоцитів або зниження гемостазу. Просте, топічне застосування Саратину в процесі СЕА пацюків, зменшує адгезію та агрегацію тромбоцитів, а також - наступний /о рестоноз у порожнині сонної артерії, обумовлений гіперплазією інтими.

У Таблиці З приведені результати по тривалості кровотечі та кількості тромбоцитів. Статистично значимого розходження між довгочасностями кровотечі до та після операції не спостерігалося. Крім того, не спостерігалося статистично значимого розходження між числом тромбоцитів в оброблених Саратином та контрольних пацюків.

Ми довели значне зменшення адгезії та акумулювання тромбоцитів після ушкодження судини, аналогічного ендартеректомії. Зменшення адгезії тромбоцитів спостерігалося як відразу після ендартеректомії (З години), так і через 24 години. Через 24 години ефект був більш значним, чим ми очікували, та цей ефект обумовлений не прямим інгібуючим впливом Саратину на колаген (період напіврозпаду Саратину в сироватці складає 90 хвилин), а пов'язаний, скоріше, з вихідним інгібуванням агрегації тромбоцитів та наступним порушенням каскаду 2о активації тромбоцитів. Якщо інгібується вихідне прилипання тромбоцитів до незахищеного колагену, то не може початися і каскад активації тромбоцитів. Дані, представлені на Фіг4 та 5, демонструють, що місцеве застосування Саратину на свіхеушкодженій судині може в значній мірі інгібувати адгезію тромбоцитів. Саратин інгібував адгезію тромбоцитів на 6095 та 7595 через З та 24 години відповідно. Це інгібування визначається по видимих розходженнях в осадженні клітинних елементів, що спостерігаються між контрольними та обробленими с ов Саратином артеріями через З години та 24 години (Фіг.7 та 8). Ми припускаємо, що це зменшення клітинної реакції обумовлено інгібуванням адгезії тромбоцитів. Це представляє унікальний варіант терапії для і) інгібування адгезії тромбоцитів до ушкодженої судини. Через два тижні після ендартеректомії сонної артерії у контрольних пацюків був значно менший діаметр порожнини, чим в особин, оброблених Саратином (Фіг.9).

Кількість осередків розвитку гіперплазії інтими в оброблених Саратином пацюків був значно знижений, що с зо Корелює зі зменшеними адгезією та акумулюванням тромбоцитів. Виявлення зменшення числа осередків гіперплазії інтими та тромбозу, що пов'язане зі зниженням адгезії тромбоцитів, забезпечує клінічно важливі о границі та наслідки зменшеної адгезії тромбоцитів. Це свідчить, що специфічне до осередків несистемне «г інгібування адгезії та агрегації тромбоцитів приводить до зменшення швидкості розвитку тромбозу та закупорки, а отже, зменшує відсоток післяопераційних черепномозкових подій та інсультів після ендартеректомії сонної ї- артерії. Поліпшення рівня гіперплазії інтими та порожнинний стеноз демонструється, крім того, важливим фактом ї- зменшення відсотка тромбозу в пацюків, оброблених Саратином. У 3395 контрольних пацюків виявлявся тромбоз, тоді як у жодній з оброблених Саратином сонних артерій тромбозу не спостерігалося. Особливо важливе клінічне значення має характерну для цього агента відсутність системних ефектів. Місцеве застосування Саратину не робить впливу на випадки системної кровотечі або кількості тромбоцитів. На цій « підставі можна зробити висновок, що зменшення адгезії тромбоцитів та наступне зниження тромбозу та в с гіперплазії інтими є результатом місцевого впливу. Виявлення цих нових, пов'язаних із Саратином, фактів має

Й важливе значення в тому відношенні, що спектр клінічних застосувань для методик, що можуть здійснювати и?» місцеве інгібування шкідливих ефектів адгезії та активації тромбоцитів без порушення механізму системного гемостазу дуже широкий.

Раніше було зазначено, що різні терапевтичні втручання індукують локальні. ушкодження, які можна ідеально -І обробляти негайно й місцево. Залишені без обробки, ушкоджені клітини ініціюють серію процесів, втягнутих у згортання, додаткову активацію та клітинну реакцію вивільнення цитокінів, індукування проліферації та інші

Ш- біологічно активні процеси. Ці складні, взаємозалежні процеси важко зупинити, якщо вони вже почалися. ї5» Важливий аспект даного винаходу полягає в тому, що Саратин розташовано безпосередньо на оброблюваних тканинах. Іншим аспектом місцевого застосування є мінімізація потенційних проблем, пов'язаних о із системними ефектами лікарських препаратів, застосовуваних для втручання.

Із В ідеалі, лікування Саратином можна призначати одночасно з придатним терапевтичним втручанням, яке можна здійснювати шляхом уведення Саратину в покриття на хірургічних пристроях, таких як балонний катетер, або інші пристрої або їхні деталі. Інший аспект може також включати безпосереднє покриття Саратином Ушкоджених судин.

Крім того, за даним винаходом можна застосовувати і звичайні способи постачання Саратину, такі як тип

Ф) вільної рідини., що включає комбінації з іншими терапевтичними агентами. Проте, застосування матриці ка полімер/гідрогель має визначені переваги перед постачаннями вільною рідиною. Постачання агенту, що був введений у полімерну матрицю, не вимагає додаткових порожнин у допоміжному катетері для транспортування бо Вільної рідини з лікарським розчином до місця обробки та назад.

Крім того, полімерна матриця виключає ризик витоку лікарського розчину зі струмом крові, що може відбуватися при нещільному заповненні балоном сегментів судини, що обумовлює ризик піддання нецільових тканин впливу високих концентрацій лікарського препарату.

Загальним технічним рішенням щодо місцевого застосування Саратину або на медичному пристрої, або у 65 Вигляді покриття на ушкодженій судині, є, наприклад, уведення Саратину в полімерне або гідрогелеве покриття.

Щодо полімерних композицій, використовуваний тут термін "гідрогель" охоплює синтетичні полімери з порами або порожнинами різних розмірів та ємкостей, та змінними фізико-хімічними властивостями, особливо - зарядом або гідрофільною/гідрофобною природою гелевої матриці, які можна варіювати в процесі виготовлення покриття або пристрою з покриттям. Фахівцям відома безліч синтетичних еластомерів та полімерних матеріалів, що

Зустрічаються в природі. Саратин можна вводити в матрицю в процесі одержання полімеру, або додавати після покриття або формування полімеру в бажану форму. Крім того, для формування полімерних матриць, застосовуваних за даним винаходом, можна використовувати багато з відомих, численних, різних полімерних матеріалів та способів виготовлення. Приклади придатних полімерних матеріалів або комбінацій включають, але не обмежуються цим, біосумісні та/або полімери, що розкладаються мікроорганізмами. 70 Були вивчені деякі алкілалкіл- та ціаноакрилати в аспекті їхнього хірургічного застосування, та виявилося, що особливо придатними є деякі ізобутилціаноакрилати.

Типовий гідрогелевий полімер можна одержати із суміші мономерів, що містить 40-60 вагових часток очищеного моноефіру гідроксіалкілалкілакрилату, що має єдиний олефіновий подвійний зв'язок, 40-60 вагових часток метакрилатного мономеру, що містить один олефіновий подвійний зв'язок та 0,001-5 вагових часток 7/5 ініціатора полімеризації. Полімеризацію можна робити за стандартними методиками полімеризації в маєсі, полімеризації в розчині, полімеризації в суспензії або полімеризації в емульсії. Вибір методики полімеризації залежить від необхідного обсягу полімеру та природи кінцевого продукту, який потрібно одержати. Типовий гідрогелевий продукт може бути описаний молярним відношенням моноефіру до метакрилатного мономеру в діапазоні від 1:1 до 2,3:1, переважно 1,5:1, в якому діаметр пір полімеру перевищує 90 ангстрем.

Оскільки моноефір гідроксіалкілакрилату має єдиний олефіновий подвійний зв'язок, перелік придатних сполук включає, але не обмежується ними, 2-гідроксіетилметакрилат, гліцерилметакрилат, 2-гідроксипропілметакрилат, гліцидилметакрилат, 2-гідроксіетилакрилат; та 2-гідроксипропілакрилат. Придатними метакриловими мономерами є метакрилова кислота, метакриламид 5 та метакрилонітрил.

Вибір ініціатора полімеризації може залежати від методики полімеризації або кінцевого призначення сч об полімеру. Наприклад, якщо полімер передбачається сформувати у вигляді твердого об'єкта, можна о використовувати ініціатори типу вільних радикалів.

У число кращих ініціаторів цього типу входять біфункціональні поліефіри, такі як 2,5-диметил-2,5-біс(2-етилгексоїлперокси)гексан або третинного бутилу пероксипівілат. Альтернативно, якщо остаточним призначенням полімеру є його застосування у вигляді покриття, що наносять у вигляді суміші с зр Мономерів та полімеризують іп зйм, ініціатором можуть бути активовані опроміненням типу УФ каталізатори 2,2-азобіс(2-метилпропілнітрил) або азобісбутіронітрил (АІВМ). Застосування цих ініціаторів не обмежено о конкретною методикою полімеризації або конкретним кінцевим продуктом. Наприклад, ініціатори типу вільних «г радикалів можна застосовувати в покриттях, та активовані опроміненням ініціатори можна використовувати при формуванні твердих об'єктів. ї-

На додаток до у великій мірі схожим фракціям моноефіру та метакрилатного мономеру, суміш мономерів ї- можна зміцнити слідовими кількостями алкілакрилату з більш довгими ланцюгами або сомономеру метакрилатного ефіру, такого як циклогексилметакрилат, триметилоллропантриметакрилат або етиленгліколю диметакрилат. Такі додаткові сомономери зміцнюють сітчасту структуру у випадках, коли бажано зміцнити доданий полімер. Слідові кількості цих сомономерів, у загальному випадку, складають менш 0,1ваг.95 усієї « буміші мономерів. з с Гідрогелеві полімери, що застосовуються за даним винаходом, можна формувати таким чином, щоб . одержувати об'єкти, що зшиті внутрішніми впливами в достатній мірі, щоб остаточний об'єкт не вимагав а додаткових мономерів, що зшивають.

Додатковими прикладами полімерів, що розкладаються мікроорганізмами, є полі(лактиди), полігліколіди, поліангідриди, поліортоефіри, поліактали, полідигідропірани, поліціаноакрилати та їхні сополімери, а також -І поліетиленгліколь. Вони можуть приймати форму сополімерних гідрогелів або структурованих полімерних мереж, у які ліки, призначені для концентрованого постачання в потрібну зону, можна або вводити в процесі

Ш- полімеризації, або, у випадку визначених гідрогелів, завантажувати згодом. Кращими матрицями можуть бути ті, їх котрі створені відповідно до молекулярних характеристик агента, щоб контролювати його дифузію назовні.

Найрізноманітніші типи катетерів та інших медичних пристроїв, покритих Саратином, можна сконструювати та о застосовувати відповідно до індивідуальних терапевтичних потреб, для задоволення яких вони були

Ге сконструйовані, або для вирішення більш специфічної задачі доставки завантаженого Саратином полімеру в потрібне місце. Даний винахід пройшов тестування на балонному катетері, що продається за назвою Віце теадіса! Оемісез ВМ БО, що поставляється компанією Віце теадіса!, але сфера його застосування не обмежується даним типом катетера.

Інші приклади (Ф) Приклад 1 ка Зв'язування очищеного УМУЕ та тромбоциту з колагеном у статичних умовах

Утворення зв'язків УМУЕ з колагеном досліджували на мікротитрувальних пластинках, відповідно до відомих бо методик |Вісоа 1995, 85 (3): 705-711). Різні колагени - людський колаген типів | та ПШ та колаген шкіри теляти (Зідта) - покрили сполукою з 50мкл колагену, розчиненого в 50мл оцтової кислоти, що нанесли по 125мМкг мл"! на 96-ямкові мікротитрувальні пластинки, та витримували протягом ночі в присутності 200мкл РВ5, щоб підштовхнути ренатурацію. Після блокування непокритих ділянок за допомогою ВЗА, очищений людський УМ/Е (1,25мкг мл"! для пластинок, покритих колагеном типу | та колагеном шкіри теляти; 0,625Ммкг мл"! для пластинок, 65 покритих колагеном ІІ) або розведену звичайну плазму (людська плазма: 1/80 на колаген | та ПШ, 1/40 на колаген шкіри теляти; плазма хом'яка, миші та свині: 1/80 на колаген І; 1/20 на колаген | та колаген шкіри теляти) додали в ямки в присутності Саратину та інкубували протягом 2 годин (розведена плазма) або 1 години (очищений УМУ/Г). Зв'язування залишкового УМУЕ з колагеном визначали після наступного етапу промивання за допомогою антисироватки кролика анти-уМуУє (Оако, Сореппадеп, ОептагК), транспонованої пероксидазою Хрону, що проробили та вимірили поглинання світла при 492нм.

Якщо мікротитрувальні пластинки піддавали попередньому інкубуванню з людським колагеном І, людським колагеном ІІ та колагеном шкіри теляти, наступне інкубування очищеного МУ у присутності Саратину було сполучено з залежним від дози інгібуванням утворення зв'язків УУУг-колаген, та значення ІС 50 складали 0,23-0,004, 0,81-0,04 та 0,44--0,008мкг мл" відповідно (Фіг.1). Якщо очищений УМ/Е був замінений розведеною 70 звичайною людською плазмою, інгібуюча здатність Саратину зберігалася (Таблиця 1). Саратин інгібував також зв'язування уМУЕ з різними колагенами, що тестували в розведеній плазмі свині, хом'яка та миші, та виявив відчутну найвищу ефективність проти колагену І (Таблиця 1).

Приклад 2

Адгезія тромбоцитів при підвищеному зрушенні

З урахуванням важливості сил зрушення для контролю залежної від УМ/Е адгезії тромбоцитів до колагену |У.

І ар. Сііп. Мед. 1974, 83(2): 296-3001, у проточній камері були проведені перфузійні дослідження для вивчення інгібуючої дії Саратину в умовах потоку, аналогічних тим, що зустрічаються в ушкоджених або уражених хворобою артеріях. Колаген шкіри теляти нанесли на пластикові покривні стекла за описаною раніше методикою

ІВіоса 1995, 85(3); 705-711). Перфузії здійснювали у перфузійній камері з рівнобіжними пластинками з двома тримачами покривних стекол, висота камери складала 0,4, 0,6 або 1,0мм, а ширина - 1,0см, у пульсуючому потоці (роликовий насос, МУаїзоп Магіом/ 603 5, МЕЇ, І еймеп, Веїїдійт) при приблизних швидкостях зрушення 2700, 1300 та З300с відповідно. Збережену від згортання здорову кров (0,2 І мл гепарину з низькою молекулярною вагою, Сіехапе) розприскали по покритим колагеном покривним стеклам на 5хв., після чого промиті покривні стекла підфарбували Сгипжа(їд-СТетвза та оцінили осадження тромбоцитів за допомогою Ге оптичної мікроскопії та аналізу зображень за відомою методикою (|Віоса 1995, 85 (3): 705-711), з використанням о покриття поверхні як кількісного параметру.

При швидкості зрушення 27О0Осек 7, спостерігалося залежне від дози Саратину інгібування адгезії тромбоцитів зі значеннями ІС 50-0,96-0,25мкг мл! (Фіг.2). Проте, при більш помірній швидкості зрушення зо 1300сек-7, спостерігалося виразне зрушення вправо на кривій залежності від дози, зі значеннями с

ІСво-9,231,4Мкг мл"! (Фіг.2). При швидкості венозного зрушення ЗООсек 7, Саратин виявився нездатним о інгібувати адгезію розбризканих тромбоцитів аж до 1Омкг мл" (дані не приводяться). Й

Приклад З

Аналіз зв'язування за допомогою резонансу поверхневих плазмонів (ЗРК) -

У Д р У р

Взаємодії протеїнів ідентифікували та охарактеризували за допомогою 5РЕК на установці ВіІАсоге 3000 (ВіІАсоге, Егеіригу, Септапу). Відповідно до інструкції постачальника апаратури, були використані паруючі агенти. Зв'язування із сенсором СМ 5 було зроблено через активовані карбоксилатні групи, щоб вивільнити амінові групи людського колагену типу ПП (Зідта). Підганяння рН та хімічні реакції спарювання провели при « стандартних умовах (Апа! Віоспет. 1991, 198(2): 268-277, ЗА! Ргезз ЦЯ. 1992). Для спарювання колаген розбавили до 0,125мкг мл"! у 10ММ ацетатного буфера (рН4,5), що привело до появи 331 резонансної одиниці т с (КО) іммобілізованого матеріалу. Цю матрицю використовували для вивчення зв'язування очищеного ч рекомбінантного Саратину, що був розчинений у 20мМ Нерез (рН7,4), 150мМ Масі, мМ ЕОТА, 0,005956 Тжееп » 20. Всі експерименти по зв'язуванню проводили при 252С. Титрування із Саратином робили при варіюванні концентрацій від 7,8нм до 1О0мкм. Одержані експериментальні значення плато КИ були нанесені за рівнянням:

Кед/концентрація Саратину «(-КдхКад) К(Кдх пах). - Титрування Саратину на іммобілізованому на поверхні колагені привело до залежного від концентрації -і зв'язування. Далі, максимальна кількість Саратину, зв'язаного з колагеном на поверхні датчика, обумовила появу більш високого сигналу, чим максимальний сигнал, розрахована для моделі зв'язування 1:1. Це вказує на о існування більш, ніж одного єднального сайту для Саратину на колагені типу І, далі цей висновок був о 20 підтверджений фактом, що підганяння даних по Ленгмюру до моделі зв'язування 1:11 не дають позитивних результатів. г» Аналіз Скетчарда даних ЗРК свідчить про існування двох різних єднальних сайтів, що мають значно відмінну спорідненість до Саратину (Фіг.3). Розрахунок констант рівноваги привів до одержання константи дисоціації 5.10 8М для сайта з високою спорідненістю та 2Х10-9М для єднального сайта з низькою спорідненістю.

Приклад 4 (Ф) Агрегація тромбоцитів г Специфічність Саратину до функції тромбоциту оцінили шляхом дослідження агрегації у збагаченій тромбоцитами плазмі з використанням як агоністів колагену, АОР, ристоцетину, арахідонової кислоти або во аналогів тромбоксану Ш46619. Цитратовану кров (3,1390) здорових донорів, що не приймали ліків центрифугували (15хв., 100г), щоб одержати збагачену тромбоцитами плазму, до якої додали Саратин (кінцева концентрація 0-200мкг мл 7) за їхв. до індукування агрегації тромбоцитів колагеном (0,5мкг мл ), АОР (2,5мкМ), ристоцетином (0,9мг мл"), арахідоновою кислотою (1,0ММ) або 046619 (1,3МкМ). Для кожного агоніста спостерігався максимум агрегації (амплітуда) після проходження 5-хвилинного періоду. 65 Саратин виявився нездатним інгібувати максимальну агрегацію по всім тестованим агоністам, включаючи колаген, при кінцевій концентрації аж до 4Омкг мл" (Таблиця 2). Проте, Саратин міг частково інгібувати індуковану колагеном агрегацію тромбоцитів при 10Омкг мл" (не показано) , та цілком інгібувати при 200мкг мл", хоча на агрегацію до АОР Саратин не оказував впливу навіть при концентрації 200мкг мл".

Приклад 5

Модель СЕА пацюка

У моделі СЕА пацюка, в якій використовується відкрита методика з артеріотомією, використовували пряме видалення інтими, частин середовища та шва артерії. Одна група пацюків одержувала Саратин, у той час, як інша група використовувалася для контролю. Виміри кінцевої точки включали 1) адгезію РІТ, 2) швидкість тромбозу, 3) розвиток гіперплазії інтими. Саратин застосовували безпосередньо до поверхні 70 ендартеректомізованої поверхні сонної артерії перед закриттям артерії. Електронні мікрознімки (2000 Х) препарованих сонних артерій використовували для кількісного аналізу агрегації РІ Т. Загальні кількості РІ Т розраховували с використанням стандартизованої палетки. ІН та тромбоз аналізували за допомогою комп'ютеризованого морфометричного аналізу підфарбованих еластином сегментів сонної артерії з прямим виміром площі ІН.

Приклад 6

Операція ендартеректомії сонної артерії.

Тварин присипляли ізофлюраном у скляному ковпачку, зважували, та потім анестезували комбінацією кетаміну (10Омг/кг)у та ацепромазину малеату (мг/кг) внутрішньоочеревинно. Після того, як адекватність анестезії підтверджувалася відсутністю реакції на роздратування задньої лапи, підшкірно в області верхньої частини середини спини вводили 4см? звичайного саліну, що служив джерелом рідини (1смЗ/кг) для компенсації втрати крові в ході операції. Потім область шиї виголювали та обробляли 7905-м ізопропіловим спиртом. Із застосуванням стерильної методики та препараційного мікроскопу ( х40, 5240 ОІутрив, ОІутриз

Атегіса Іпс., МеїмШе, МУ) робили цервікальний розріз. Відокремлювали зовнішні мускули та робили розсічення до рівня правої сонної артерії. Потиличні нерви в області артерії довільним чином відтинали для збереження с фарингеальної функції та запобігання післяопераційного респіраторного ризику. Ге)

Після адекватного впливу на сонну артерію, ближній та далекий контроль розвилки, приблизно на 1,5-см відстані, здійснили за допомогою накладення 3-0 турнікетів із шовного шовку. За допомогою корнеального леза зробили артеріотомію та розтягли до довжини бмм за допомогою мікроножиць. За допомогою голки Мо27, інтиму процарапали поперечно по судині по двох рівнобіжних лініях, що відстоять одна від одної приблизно на 2мм. с |нтиму та серединний шар видалили мікропінцетом. Саратинова група пацюків одержувала по Бмкл розчину о

Саратину, застосованого безпосередньо на ендартеректомізовану поверхню. Артеріотомію закрили бігучим 10-0 швом з моноволоконного нейлону (М5/9, Е(йоп, Е(ісоп Іпс., ЗотегмШе, Му), починаючи від далекого кінця. -

Далекий турнікет видалили першим, щоб оцінити гемостаз лінії шва після видалення ближнього турнікета. їм-

Тривалість застосування Саратину складала 5 хвилин, що відповідає часу, що потрібно для закриття артерії.

Зо Будь-яку кровотечу лінії шва обережно тампонували стерильним кінчиком бавовняного аплікатора до досягнення в. гемостазу. Ендартеректомізовану сонну артерію оцінювали ручним Юорріег, щоб підсилити наочність. Потім зовнішній шар мускулів та шкіру зашивали бігучим 3-0 швом, що розсмоктується.

Приклад 7 «

Адгезія тромбоцитів

У підгрупах адгезії тромбоцитів, пацюків повторно анестезували, збирали ендартеректомізовані сонні о) с артерії та фіксували їх у 495 розчині глютальдегіду через З години або через 24 години після ендартеректомії "» сонної артерії. Протягом процедури збору, сегменти сонної артерії були тривалий час відкритими уздовж області " шва, таким чином, залишаючи незахищеною ендартеректомізовану область. Потім артерії постфіксували тетроксидом осмію, дегідратували в серії градаційних спиртів, важливі точки висушували за допомогою СО» (1072 рві та 31,13), покривали золото-паладієм та поміщали у скануючий електронний мікроскоп ШЕОЇ 5М - 5410, ХЕОЇ, БА Реароду, МА). Ендартеректомізовані області сканували при 2000-кратному збільшенні, та -і одержали фотографії зображень. Фотографічні зображення були погоджені та упорядковані в комбінацію, що дозволяє візуалізацію більшої зони, чим це можна було зробити за допомогою єдиного поля монітору скануючого о електронного мікроскопа. Після монтажу комбінації фотографій, її накрили прозорою палеткою. Такі ж палетки о 20 були використані для фотографій усіх зразків. Для підрахунку загальної кількості тромбоцитів використовували 116 квадратів на кожній фотографії. Число 116 - це максимальне число квадратів, які можна було напевно знайти г» на всіх комбінаціях фотографій. Підрахунок тромбоцитів робили наосліп два спостерігачі.

Приклад 8

Гіперплазія інтими

Через два тижні після ендартеректомії сонної артерії, пацюків із групи гіперплазії інтими анестезували та

ГФ) оголювали ендартеректомізовану сонну артерію. Черевну порожнину розкрили по середній лінії, та розкрили периферичну аорту та внутрішню порожню вену. Зробили поперечний надріз порожньої вени, та периферичну ді аорту канюлювали катетером Мо20 для уливання нормального саліну при 100мм На доти, поки вихідний з порожньої вени потік не ставав чистим. Наступним етапом було уливання в рівному об'ємі 1095 формаліну, що 60 містить буферний розчин, при 100мм На, для завершення методу перфузії-фіксації. Односантиметровий сегмент оперованої сонної артерії відітнули та помістили в 1095 формалін до наступної обробки для гістології. Артерії блокували парафіном, секціонували та підфарбували еластином за допомогою барвника Метоеїї та Мап Сіезоп.

Для стандартизації області секціонування, відбирали кратні сегменти через інтервали Змкм, кожний з який розташовувався уздовж лінії безупинного 10-0 нейлонового шва, що закриває артеріотомію. Підфарбовані бо еластином стекла сфотографували за допомогою цифрового фотоапарата КОСАК ОС 120 7о0от (Еавітап

КОВАК Сотрапу, Коспезіег, МУ). На цей момент повинні вже були бути помітні будь-які тромбозні сегменти.

Нетромбозні зображення завантажили в комп'ютер, області порожнин сонних артерій проаналізували за допомогою програми Маїйопа! Іпзійшевз ої Неаййт (Веїйпезаа, МО), Ітаде Зоймаге, Мегзіоп 0.99ї. Цей пакет програм дозволив нам окреслити внутрішню область гіперплазії інтими і, таким чином, одержати точну оцінку площі поперечного переріза порожнини судини. Крім того, була визначена зовнішня область гіперплазії інтими.

Різницю між двома областями (зовнішня площа гіперплазії інтими мінус дана порожнина) визначили як абсолютну площу гіперплазії інтими. Оскільки артеріальний поперечний переріз мав індивідуальні варіації форми, значення були виражені як відношення абсолютної площі гіперплазії інтими до зовнішньої границі 7/0 Піперплазії інтими, та про їх згадується як про відсоток порожнинного стенозу. Це відношення представляє частку площі порожнини, зайняту гіперплазією інтими, та дозволяє робити порівняння поперечних перерізів артерій різних розмірів (4). Між вимірами, що наосліп робили два спостерігачі, виявлялися мінімальні розбіжності.

Приклад 9 15 Тривалість кровотеч та кількість тромбоцитів

Щоб оцінити вплив Саратину на кількість системних тромбоцитів та тривалість кровотеч, була обмірювана кількість системних тромбоцитів та тривалість кровотеч у 12 пацюків. При необхідності одержати зразки доопераційної крові кожного пацюка, у них приходилося відбирати по 1-1,5см З крові, що представляє значну частку загального обсягу крові тварини. З урахуванням цього факту, логічно було очікувати . зменшення 20 Кількості тромбоцитів після операції як у контрольних, так і в оброблених Саратином пацюків. Тому, щоб оцінити вплив Саратину на кількість тромбоцитів, ми визначали різницю між кількостями тромбоцитів для кожного пацюка шляхом вирахування доопераційної кількості тромбоцитів з післяопераційної кількості тромбоцитів, та визначали розходження. Розходження кількості тромбоцитів проаналізували з використанням 2х2 конфігурації точок плану факторного експерименту, оброблених по моделі АМОМА, та продемонстрували «С 25 Відсутність статистично значимих розходжень кількостей тромбоцитів між контрольними та обробленими о

Саратином пацюками. У всіх пацюків перед операцією були визначені кількості тромбоцитів та тривалості кровотеч. Шість пацюків піддали ендартеректомії сонної артерії, та через три години після операції приспали та вимірили тривалості кровотеч та кількість тромбоцитів, а інші б пацюків приспали через 24 години після операції та вимірили тривалості кровотеч та кількість тромбоцитів. Три пацюки з кожної тимчасової групи Се 30 одержували топічний Саратин, а інші три пацюки використовувалися для контролю. о

Тривалості кровотеч визначали за допомогою поперечного надрізу дистальних 2мм хвоста пацюків та занурення приблизно 4см хвоста в розчин фосфатного буферного розчину при 372С. Вимірювали час, що «Ж пройшов від моменту надрізу до зупинки кровотечі, та визначали його як тривалість кровотечі. Кількість їм тромбоцитів визначали шляхом добору 1-1,5см З зразків крові з яремної вени, аналізували зразки в 3о аналізаторі крові Соцег ЗТКЗ та виражали результати у вигляді даних х103, в

Приклад 10

Статистичні методи

Представлено значення - стандартна похибка. Для порівняння кількості налиплих тромбоцитів, відсотка « порожнинного стенозу та тривалості кровотеч в оброблених Саратином та контрольних пацюків, зробили З непарний аналіз і-тест із використанням програми Зіа( Міему (ЗА Іпзійше Іпс. Сагу, МС 27513) версія 5.0. с Відношення правдоподібності в аналізі хі-квадратів використовували для оцінки імовірності успішного "з результату для розвитку тромбозу через два тижні після ендартеректомії сонної артерії. Для оцінки розходжень доопераційної та післяопераційної кількостей тромбоцитів використовували 2 х2 конфігурацію точок плану факторного експерименту, оброблених по моделі АМОМА. - 75 Приклад 11

Експериментальні тварини -і Пацюків Зргадое-Оаулеу (350-400г) об'єднали в групи для ендартеректомії сонної артерії, призначені для 1» двох головних цілей. 1) Оцінка адгезії тромбоцитів та 2) Оцінка швидкості порожнинного стенозу, обумовленого гіперплазією інтими, та швидкості тромбозу. В плані досягнення цих двох головних цілей, пацюків розділили на (ав) 50 контрольних та оброблених Саратином тварин. Усіх пацюків піддали ендартеректомії сонної артерії (див. нижче), "з оброблені Саратином пацюки одержали місцеве призначення 5мкл розчину Саратину на поверхню порожнини сонної артерії відразу після видалення інтими/шару середовища. Група адгезії тромбоцитів складалася з електронномікроскопічної оцінки через З години після ендартеректомії сонної артерії (п-17) та через 24 години після ендартеректомії сонної артерії (п-19). Групу гіперплазії інтими (п-25) присипляли через два тижні після ендартеректомії сонної артерії.

ГФ) Приклад 12 7 Готування покритих Саратином гідрогелевих катетерів

Поверхні матеріалів на основі РА-12 активували шляхом занурення пристроїв у розчин 2 мольних 90 макроініці«атора полі(октадецен-алт-малеїноцтової кислоти ангідрид) з перефіром (11-48 мольних 905) , 60 розчиненим у ізопропанолі, та О,5моля етиленгліколю або диметакрилату (ЕСОМА)/Імоль макроініціатора. Потім висушували покриття макроініціатор/ЕСОМА. Покриття відпалювали ще 5 разів по 1Охв. при 1202С, що сприяло поліпшенню фіксації макроініціатора на поверхні і, таким чином, поліпшувало структурування.

Для оптимізації умов нанесення покриття, застосовували вирощування гідрогелевих покрить на пластинках носія РА-12. Перед нанесенням покриття, пластинки промивали ізопропанолом або ацетоном та висушували. б5 Для покриття гідрогелем використовували балонний катетер типу Вісе Медіса! Оемізез СО (катетер ЕХ РТС

А), що складається з Мевіатійд (РА-12). Водяні розчини 5 мольних 95 акрилової кислоти 100мл та 0,2 біс 0,8 мольних 95 метилен-біс-акрилової змішали та використовували для покриття пластинок або катетерів. Після полімеризації, пристрій з покриттям промивали водою та ще 24 години в буфері РВ5.

Після цього полімер відпалювали в печі при 60-802С від 0,5 до З годин.

Товщина висушених гідрогелевих покрить знаходилася в інтервалі від 1 до 4мкм, розбухання гідрогелю у водяному розчині варіювалося від 10 до 50г гідрогелю вологого/1г гідрогелю сухого.

При зануренні (ЗОхв.) у буферований буфером РВЗ рН7 4 розчин Саратину, використовували концентрації

БОмМкг мл". 70 Для готування розчинів для покрить використовували органічні розчинники, а при напилюванні на балонний катетер використовували стандартне маломасштабне устаткування для нанесення покрить, що поставляє ЕБО.

Фіг.1. Вплив Саратину на зв'язування очищеного людського МУУЕ з людським колагеном типу І (кружки), колагеном типу Ії (квадратики), колагеном шкіри теляти (трикутники). Для колагену типу І ІС 5050,23-0,004мкг мл, для колагену типу ЇЇ - 0,81--0,04 мкг мл" та для колагену шкіри теляти - 0,44--0,008мкг мл,

Фіг.2. Вплив зрушення на інгібування Саратином формування агрегатів тромбоцитів на людському колагені типу І у проточній камері іп міго. Кружки означають швидкість зрушення 2700сек 7 (ІСьо-0,96-3-0,25МмМкг мл", квадратики означають швидкість зрушення 1300сек" (ІСво-5,2--1,4Ммкг мл").

Фіг.3. Аналіз Скетчарда даних по зв'язуванню Саратину з іммобілізованим людським колагеном, отриманих

Методом резонансу поверхневих плазмонів, свідчить про наявність на колагені Ії єднальних Саратин сайтів з високою спорідненістю (Ка-5х10М, суцільна лінія) та низькою спорідненістю (10-2х10М, пунктирна лінія).

Фіг4. Число тромбоцитів, що прилипли до незахищеної поверхні субендотелію Через З години після ендартеректомії сонної артерії, зіставлення даних по групі із застосуванням Саратину (п-7) та контрольній групі (п-10). Дані означають «ЗЕ. Тварини Саратинової групи одержували по 5мкл розчину Саратину місцево,на су незахищену поверхню субендотелію. Зірочка вказує, що значення Р складає 0,05.

Фіг.5. Число тромбоцитів, що прилипли до незахищеної поверхні субендотелію через 24 години після о ендартеректомії сонної артерії, зіставлення даних по групі із застосуванням Саратину (п-9) та контрольній групі (п-10). Дані означають 45Е. Тромбоцити підраховували за допомогою скануючого електронного мікроскопа.

Тварини Саратиновой групи одержували по бмкл розчину Саратину місцево, на незахищену поверхню СМ субендотелію. Зірочка вказує, що значення Р складає 0,01.

Фіг.6б. Електронна мікрофотографія (2000 х) ендартеректомізованої сонної артерії пацюка через З години о після ендартеректомії сонної артерії. А, контрольна поверхня. В, поверхня, до якої місцево застосовували «І

Саратин (5мкл). На контрольній поверхні видні численні елементи клітин, включаючи волокна фібрину, червоні їм кров'яні клітини та тромбоцити. На обробленій Саратином поверхні видне значне зменшення кількості клітинних елементів. -

Фіг.7. Електронна мікрофотографія (2000 х) ендартеректомізованої сонної артерії пацюка через З години після ендартеректомії сонної артерії. А, контрольна поверхня. В, поверхня, до якої місцево застосовували

Саратин (5мкл). На контрольній поверхні видні численні червоні кров'яні клітини та тромбоцити. На обробленій «

Саратином поверхні видне значне зменшення адгезії тромбоцитів.

Фіг.8. Відсоток порожнинного стенозу, вторинного стосовно гіперплазії інтими, через 2 тижні після З с ендартеректомії сонної артерії. Показані оброблена Саратином (п-15), та контрольна групи (п-10). Тварини "» Саратинової групи одержували по 5мкл розчину Саратину місцево, на незахищену поверхню субендотелію. " Зірочка вказує, що значення Р складає 0,004.

Фіг.9. Поперечний переріз сонної артерії свідчить про зменшення гіперплазії інтими в оброблених Саратином артеріях (В) у порівнянні з неопрацьованими артеріями (А) контрольних пацюків, ІН- гіперплазія інтими. і Таблиця 1. Концентрації ІС 50 Саратину, необхідні для інгібування адгезії тромбоцитів у РКР з різних -1 видів, що утворюють зв'язки з людським колагеном типів | та Ії, а також колагеном шкіри теляти.

Таблиця 2. Вплив Саратину на максимальну агрегацію тромбоцитів (95) у РЕР, індуковану різними агоністами, ве кінцева концентрація реагентів відповідає зазначеній. о 50 Таблиця 3. Доопераційні та післяопераційні тривалості кровотечі та кількості тромбоцитів. їз

Людина 11102109 1113 о з Миша 17 1о611о3 60

Атоніст 9 | ю | ю» | ю | юю

Колагн(оємт ми? 0010062001006701006300000 бо АОР (2,БМКМ) во 64 во во 88 авт. (ОМКМ) ве 16515 | вп

Таблиця З

Claims (7)

Формула винаходу й й с.

1. Застосування поліпептиду Саратину для виробництва медичних препаратів, для інгібування акумулювання тромбоцитів після ушкодження судини або ендартеректомії.

2. Застосування за п. 1, коли ушкодження судини пов'язане з атеросклерозом, васкулопатією серцевого трансплантата, коронарним рестенозом після коронарного втручання, балонною ангіопластикою, уведенням сч стента, ротаблацією, ендартеректомією, включаючи ендартеректомію сонної артерії, шунтуванням за допомогою діалізного трансплантата та інших трансплантованих анастомозів, нестабільною ангіною, гострим інфарктом Ге) міокарда, інсультом, легсою формою гіпертрофії або легсою формою простатичної гіпертрофії.

3. Спосіб інгібування адгезії тромбоцитів, при якому Саратин призначають місцево через катетер або при якому Саратин вводять у ендолюмінальну оболонку катетера, повернену місцево до тканини. сч зо

4. Спосіб за п. З, при якому Саратин вводять у полімер, який застосовують місцево і який забезпечує тривалий місцевий вихід Саратину. і «в)

5. Спосіб за п. 4, при якому полімер, що містить Саратин, призначають місцево через катетер. «

6. Спосіб за п. 3, при якому Саратин вводять у стент або покриття стента, що поміщають місцево на/або усередину тканини. ч-

7. Спосіб за п. З, при якому Саратин уводять у внутрішньосудинний трансплантат або у покриття м внутрішньосудинного трансплантата, що поміщають місцево на/або усередину тканини.

- . и? -і -і щ» («в) Ко) іме) 60 б5