NO331326B1 - Anvendelse av saratin til fremstilling av et medikament for inhibering av blodplateadhesjon til kollagen - Google Patents

Abstract

Anvendelse av polypeptidet saratin til fremstilling av et medikament som har evne til signifikant å redusere blodplateadhesjon og blodplateakkumulering etter vaskulære skader eller endarterektomi. Oppfinnelsen vedrører dessuten en ny medisinsk anvendelse av saratin som en inhibitor for trombose og intimal hyper-plasi, hvor polypeptidet kan anvendes lokalt som et topisk middel eller som et belegg på, eller på annen måte inkorporert i eller forbundet med, medisinske anordninger.

Description

OPPSUMMERING AV OPPFINNELSEN

Oppfinnelsen vedrører virkningen av et polypeptid kalt saratin som signifikant reduserer blodplateadhesjon og -akkumulering etter slike karskader som endarterektomi. Oppfinnelsen vedrører dessuten inhiberingen av vWF-avhengig binding av blodplater til karveggkollagener under betingelser med forhøyet skjærkraft, og nærmere bestemt en ny medisinsk anvendelse av saratin som en inhibitor for trombose, hvor polypeptidet kan anvendes lokalt som et topisk middel, eller som et belegg for medisinske anordninger.

OPPFINNELSENS OMRÅDE

Adhesjonen av blodceller, spesielt blodplater, til veggen i skadde blodkar er et velkjent fenomen ved angioplastikk og kirurgiske prosedyrer. Slike skader kan oppstå under forskjellige kirurgiske og perkutane terapiformer som er blitt utviklet for å gjenåpne blokkerte kanaler, forbindelser og andre hulrom, for å fjerne sykt vev og for å implantere substituttvev eller komponenter derav.

Det er blitt utviklet forskjellige typer av intervensjonsteknikker som letter reduksjonen eller fjerningen av blokkeringen i blodkaret, noe som muliggjør forøkt blodstrømning gjennom karet. En teknikk for behandling av stenose eller okklusjon i et blodkar er perkutan ballongangioplastikk. Et ballongkateter tres igjennom pasientens arteriesystem og innføres i det innsnevrede eller blokkerte område, og ballongen blåses opp for å utvide det sammen-snevrede område. Perkutan transluminal angioplastikk (PTCA) er den mest utbredte anvendte angioplastikkmetode for å åpne blokkerte arteriosklerotiske arterier.

Generelt gir angioplastikkprosedyrer utmerkede resultater ved at man unngår behovet for by-pass-kirurgi, men hos ca. 30-40 % av pasientene kan en tilsynelatende vellykket initial utvidelse av arterier etterfølges av en ny innsnevring av karet (restenose) omtrent 3 til 9 måneder senere. Dersom denne restenosen er alvorlig, kan pasientene trenge en andre angioplastikkprosedyre, ofte med implantasjon av et stent som skal virke som en avstivning i karet.

I andre tilfeller kan det være påkrevd med arteriell rekonstruksjon under by-pass-kirurgi, som er en høyrisikoprosedyre. Med mer enn 800 000 PTCA-prosedyrer som nå utføres årlig over hele verden er den sosialøkonomiske implikasjon med denne 30-40 % store stenosegrad blitt gjenstand for alvorlig bekymring hos kardiologer som gjør inngrep.

Restenose er ofte resultatet av den ballongformidlede strekk- og knuseskade på arterieveggen, og muligheten for at ledestrengen til kateterne som anvendes ved slike prosedyrer under utplassering forårsaker skader, kan føre til proliferasjon av glatt- muskelcellene i arterien, noe som resulterer i en ny lukning av arterien ("restenose") i løpet av de påfølgende måneder.

På grunn av de potensielle komplikasjoner i forbindelse med restenose og frykten for å forflytte en embolus fra en ulcerøs plakk og de alvorlige følgene av dette, begrenser anvendelsen av gjentatt angioplastikk i halspulsårene i stor grad valgmulighetene for minimal invasiv intervensjon.

Hittil har det vært gjort forsøk på å behandle tilstopninger i halsarteriene som fører til hjernen, ved hjelp av andre typer inngrep.

Halspulsåreendarterektomi er en kirurgisk metode for fjerning av blokkeringer fra halsarterier, og er en av de vanligste karkirurgiske prosedyrer som utføres i USA. Resultater fra flersenterforsøk har vist effekten av denne prosedyren ved behandlingen av hals-pulsåresykdom utenfor hodeskallen både hos symptomatiske og asymptomatiske pasienter (JAMA 1995; 273:1421-28; N Engl. J. Med. 1991; 325: 445-53) og endarterektomiprose-dyrer brukes ved behandlingen av karsykdom med tilstopning i andre karleier (Vase. Surg. 1999; 33: 461-70).

Ved endarterektomi snittes halspulsåren opp og plakk fjernes fra karet i det opp-snittede område. Ved kirurgi eksponeres halspulsåregaffeldelingen igjennom et snitt i halsen til pasienten og klammer plasseres på hver side av tilstopningen for å isolere den, og det gjøres et snitt for å åpne arterien. Tilstopningen fjernes, det isolerte område overrisles og luftes, og arterien lukkes med sutur. Klammene fjernes for å gjenopprette blodstrømning gjennom arterien. Blodproppene og restene som finnes mellom klammene kan forårsake betydelige problemer etter at halspulsåren er åpnet, slik at blod får lov til å strømme inn i tidligere isolerte områder.

Selv om endarterektomi er en effektiv terapi, etterlater den ofte det ytre lag av bindevevet rundt karet og et betydelig område med trombogenisk subendotel eksponert. Til tross for effekten av halspulsåreendarterektomi, kan operasjonen føre til komplikasjoner, inkludert trombose og utviklingen av intimal hyperplasi, som forårsaker komplikasjoner som opphever den gunstige effekten av intervensjonen, eller skaper nye problemer.

Kliniske studier har vist en slagprosent på 1-10 % etter halspulsåreendarterektomi i den første periode etter operasjonen, hvor nesten alle skyldes trombedannelse på endarterektomistedet med etterfølgende cerebral embolisering (Stroke 1984;15:950-55). Blodplate-akkumulasjonen kan også resultere i restenose på grunn av den intimale hyperplasiutvikling, noe som kan opptre innen to år etter operasjonen. Restenose er blitt rapportert å inntre hos 10-20 % av alle endarterektomiserte pasienter 2-5 år etter operasjonen, hvor mesteparten skyltes intimal hyperplasi, intimal fortykning og kardiameter-reduksjon som dokumentert ved hjelp av dobbeltultralydskanning av halspulsåren (J. Vase. Surg. 1986; 3:10-23).

Den cellulære og molekylære respons hos karveggen på mekanisk indusert traume, kirurgisk intervensjon, stent-plassering, plassering av et karimplantat (arterielt eller arterio-venøst implantat, for eksempel dialyseimplantater) er en kompleks interaksjon med betennelse, glattmuskelcellemigrasjon, proliferasjon og myofibroblasttransformasjon som opptrer så snart traumen inntrer (Futura; 1997 side 289-317). Dersom arterien er alvorlig skadet av sykdom, og muligens blitt hard på grunn av kalsiumavsetning, kan intervensjon også forårsake noen grad av ytterligere skade med lokal deendotelialisering og eksponering av underliggende ekstracellulære matrikskomponenter, slik som kollagen og elastin. Hos noen pasienter kan så den for store rekruttering av blodplater og fibrinogen resultere i en akutt trombotisk tilstopning.

Studier hvor det anvendes modeller med endarterektomiserte rottehalspulsårer (Neurosurg 1985;16:773-79), samt modeller med embolektomiballongskader (Lab. Invest 1983;49:327-33), har vist at etter hvert som endotelcellene strimles bort under karskade, begynner blodplater å feste seg til det eksponerte subendotel. Spallone et al. (Neurosurg. 1985;16:773-79) som anvender skanning-elektronmikroskopi, har vist at 5 minutter etter en halspulsåreendarterektomi hos en rotte dannes et monolag av blodplater over det skadde område. 15 minutter etter skaden observeres blodplateaggregasjon og trombedannelse. 30 minutter etter endarterektomi dekkes stedet med aktiverte blodplater og belegges med fibrin og røde blodlegemer. Trombedannelsen når sin topp 3 timer etter skade, idet det observeres et tykt fibrin-blodplate-lag. Blodplater er en integrert komponent i denne trombedannelsen og følgelig trombose, men de synes også å spille en rolle ved utviklingen av intimal hyperplasi.

Studier hvor det anvendes trombocytopeniske rotter, har videre demonstrert en betydelig reduksjon i intimal fortykning etter halsarterieskade sammenliknet med kontrollrotter (Proe. Nati. Acat. SCI USA 1989; 86: 8412-16). Så snart blodplater fester seg til det eksponerte subendotel i et skadd kar blir de aktivert og frigjør sine granuler. Disse granulene inneholder vasoaktive og trombotiske faktorer (serotonin, ADP, fibrinogen, Von Willebrands faktor, tromboxane A2), samt vekstfaktorer (blodplateavledet vekstfaktor, transformerende vekstfaktor-fJ, og epidermal vekstfaktor) (Circulation 1985; 72: 735-40). De nøyaktige mekanismer hvorved blodplater øker utviklingen av intimal hyperplasi, er ikke fullstendig forstått enda. Studier tyder på at blodplater gir primært en kjemotaktisk stimulus for medial glattmuskelcellemigrasjon mot intimaen under den andre fasen av intimal hyperplasiutvikling (Vase. Surg. 1991; 13: 885-91). Andre studier, hvor det anvendes anti-PDGF-antistoffer, har vist den livsviktige rolle som PDGF spiller ved neointimal glattmuskelcelleakkumulasjon etter en karskade (Science 1991; 253: 1129-32). En annen mekanisme hvorved blodplater kan øke utviklingen av intimal hyperplasi, er via aktiveringen av koagulasjonskaskaden og den etterfølgende akkumulasjon av trombin på skadestedet. Flere studier har vist de mitogeniske effektene av trombin på glattmuskelceller (J. Clin. Invest. 1993; 91: 94-98, J. Vase. Surg. 1990; 11: 307-13). I tillegg er trombin blitt påvist å være en stimulus for blodplateaktivering. Uansett den nøyaktige mekanisme, spiller blodplateadhesjon og -aktivering på stedet for en karskade en signifikant rolle ved utviklingen av trombose og intimal hyperplasi, og følgelig kan inhibering av blodplateadhesjon og -aktivering hjelpe til å forhindre eller redusere trombosehyppigheter og intimal hyperplasiutvikling.

Festingen av blodplater til den skadde arterievegg formidles i første rekke av von Willebrand faktor (vWF), et multimert glykoprotein som frigjøres fra endotelceller og er i omløp i plasmaet hvor det virker som et bærerprotein for faktor VIII (Annu. Tev. Biochem. 1998; 67: 395-424). Svært multimerisert vWF er også i omløp inneholdt i ct-granuler av blodplater, hvorfra den frigjøres etter blodplateaktivering (Annu. Tev. Biochem. 1998; 67: 395-424). Under forhøyede skjærbetingelser, slik som de som man støter på i arterier på steder for arteromatøs plakk eller ved mekanisk intervensjon, kan vWF via dens A3-domene binde seg til overflateeksponerte kollagenfibrer (Biochemistry 1986; 25(26): 8357-8361, Blood 1987; 70(5): 1577-1583, J. Biol. Chem. 1987; 262(28): 13835-13841). Kollagen-bundet vWF "tjorer" så igjen blodplater via skjæravhengig eksponering av en epitop i vWF-Al-domenet, som reagerer med blodplate-GPIb/IX/V (Blood 1985; 65(1): 85-90, Blood 1985; 65(4): 823-831, Br. J. Haematol 1986; 63(4): 681-691). vWF virker således som en bru mellom kollagen og blodplater, og er en forutsetning for adhesjonen av blodplater til kollagen under strømning (J. Lab. Clin. Med. 1974; 83(2): 296-300). Blodplater som ruller over vWF resulterer imidlertid i svak adhesjon og i tillegg er det nødvendig med direkte interaksjoner mellom kollagen og andre reseptorer på blodplateoverflaten for å lette permanent blodplateadhesjon, -aktivering og -aggregasjon (Thromb. Haemost. 1997; 78(1);: 434-438), Thromb. Haemost. 1997; 78(1): 439-444). Direkte kollagenreseptorer på blodplater omfatter GP VI (Blood 1987; 69(6): 1712-1720, Thromb. Haemost. 1999; 81(5): 782-792, J. Clin. Invest. 1989; 84(5): 1440-1445). GP Ia/Ila (a2/Pi) (J. Clin. Invest. 1989;

84(5): 1440-1445, Nature 1985; 318(6045): 470-472), og i et mindre omfang GP IV (CD36)

(J. Biol. Chem. 1989; 264(13): 7576-7583) og muligens til og medp65 (J. Clin. Invest. 1997; 100(3): 514-521). I fravær av vWF-assistert blodplatebinding har disse reseptorene vist seg å være for svake ved formidling av blodplaterekruttering til kollagen under strømning (Br. J. Haematol 1986; 63(4): 681-691). Endelig letter vWF i kombinasjon med fibrinogen kryssbindingen og den videre aktivering av blodplater via binding til blodplater GP Ilb/IIIa ( J. Clin. Invest. 2000; 105(6): 783-791), noe som gir stabilitet og styrke til tromben under dannelse.

Etter at blodplate-GP Ilb/IIIa- og ADP-reseptorantagonister kom på markedet, er det gjort store fremskritt innen anti-aggregatorisk terapi i de senere år (Coronary Art Dis 1999; 10(8): 553-560. J. Am. Coll. Surg. 2000; 191(1): 76-92). Disse strategiene er imidlertid ikke utformet for å inhibere den initielle adhesjon av blodplater til eksponerte kollagenfibrer, og til tross for effekten av GP Ilb/IIIa-antagonister ved svekking av blodplate-blodplate-interaksjoner, fester blodplater seg fortsatt til den skadde karvegg (Blood 1993; 81(5): 1263-1276, Circulation 1995; 91(5): 1354-1362). Blodplateaktiveringen fortsetter dessuten nesten sikkert utover aggregasjon og akutt trombose, idet progresjonen av subakutt og kronisk intimal hyperplasi i det minste delvis påvirkes av mitogene mediatorer slik som blodplateavledet vekstfaktor (PDGF), frigjort ved hjelp av aktivering av blodplater. Inhiberingen av PDGF er riktignok blitt demonstrert og er riktignok demonstrert å redusere intimal hyperplasi hos forskjellig dyrearter (Science 1991; 253(5024): 1129-1132, Circulation 1999; 99(25): 3292-3299).

Den patofysiologiske betydning av vWF antydes ved økningen i vWF i omløp hos pasienter med akutt hjerteinfarkt (Thromb Haemost 2000; 84: 204-209, Circulation 1998; 98(4): 294-299), idet vWF-nivåer korreleres positivt med dårlig senere prognose (Circulation 1998; 98(4): 294-299). In v/vo-studier har videre vist at nøytralisering av anti-vWf-antistoffer inhiberer eksperimentell trombose, noe som bekrefter den viktige rolle til vWF ved trombedannelse (Thromb. Haemost 1998; 79(1): 202-210). Med den stadig mer utbredte anvendelse av angioplastikkteknikker ved akutt koronar-syndromer, som alltid resulterer i skade på karveggen og eksponering av kollagen, er det dessuten et økende behov for strategier som farmakologisk griper inn så tidlig som mulig under blodplateadhesjons-aktiverings-aggregasjons-kaskaden.

De to hovedlinjene ved terapi som for tiden anvendes i forsøk på å kontrollere blodplateadhesjon, -aktivering og etterfølgende trombose og intimal hyperplasi, er anti-blodplatemidler og anti-trombotisk administrering. Selv om slike legemidler som aspirin, effektivt blokkerer syntesen av tromboxan A2 gjennom inhibering av syklooksygenase-reaksjonssporet, forhindrer de ikke den kollageninduserte blodplateadhesjon og aktivering, som stimulerer utviklingen av intimal hyperplasi. Bruken av heparin som et antitrombotisk middel er forbundet med komplikasjoner og begrensninger, inkludert en ikke-forutsigbar doserespons, behov for nøye laboratorieovervåkning, begrenset aktivitet mot blodpropp-bundet trombin, multiple inhibitorseter, antitrombin III-avhengighet, risiko for stor blødning, samt et behov for kontinuerlig innsprøyting. Et ideelt terapeutisk middel vil klart være ett som gir stedsspesifikke og lokaliserte effekter uten systemisk fordeling eller en generalisert koagulopati.

Det synes som om de avgjørende trinn som utfeller kaskaden av hendelser som fører til trombose og senere intimal hyperplasi, stammer fra interaksjonen mellom det eksponerte subendotelkollagen på stedet for karskade, og et monolag av blodplater som fester seg til det eksponerte kollagen. En spesifikk inhibitor for blodplate-til-subendotelkollagen-adhesj onen kan følgelig tjene til å forhindre eller i det minste redusere utviklingen av trombe og intimal hyperplasi.

Flere stoffer utvunnet fra igle er blitt rapportert å inhibere kollagen-blodplate-interaksjoner (Blood 1995; 85(3): 705-711, Platelets 2000; 11(2): 83-86, j. Biol. Chem. 1992; 267(10): 6893-6898, J. Biol. Chem. 1992; 267(10): 6899-6904, Blood Coagul Fibrinolysis 1991, 2(1); 179-184). Destabilase, en isopeptidase med fibrin-depolymeriserende aktivitet isolert fra Hirudo medicinalis, er blitt rapportert å inhibere blodplateaggregasjon indusert av forskjellige agonister, inkludert kollagen, men antas å binde seg direkte til blodplatemembranen (Platelets 2000; 11(2): 83-86). Igle-antiblodplate-protein (LAPP), et ca. 13 kDa stort protein fra spyttet til Haementeria officinalis, inhiberer blodplateadhesjonen til kollagen under statiske betingelser (J. Biol. Chem. 1992; 267(10): 6899-6904, Thromb. Haemost 1999, 82(3): 1160-1163) og forhøyet strømning (Arteriocler Thromb. Vase. Biol. 1995, 15(9): 1424-1431, med virkninger på både vWF- og blodplate-GPIa/IIa-mediert binding til kollagen (Thromb. Haemost 1999, 82(3): 1160-1163). Kalin er et ca. 65 kDa stort protein fra Hirudo medisinalis som det har fremkommet en lignende profil for. Kalin inhiberer også kollagen-blodplate-interaksjoner under både statiske og strømningsbetingelser (Blood 1995; 85(3): 705-711, Blood Coagul Fibrinolysis 1991, 2(1): 179-184, Thromb. Haemost 1999, 82(3): 1160-1163). Dessuten er både LAPP og kalin sterke inhibitorer for kollagenindusert blodplateaggregasjon, idet de inhiberer aggregasjon ved liknende konsentrasjoner som de som blokkerer ved vWF-binding til kollagen (J. Biol. Chem. 1992; 267(10): 6893-6898, Blood Coagul Fibrinolysis 1991,2(1): 179-184, Blood 1995, 85(3): 712-719).

Både LAPP og kalin er blitt evaluert i modeller for trombose in vivo, med blandet hell. LAPP reduserte ikke trombedannelse på kollagenbelagte implantater i en arterio-venøs shunt hos bavian, til tross for anvendelsen av doser som inhiberte kollagenindusert blodplateaggregasjon (Arterioscler Thromb 1993, 13(11): 1593-1601), mens kalin på doseavhengig måte inhiberte trombedannelse i en hamstermodell med venøs trombose (Blood 1995, 85(3): 712-719).

Ikke-trombogeniske og anti-trombogeniske belegg for stenter og katetere er kjent innenfor teknikken. De ikke-trombogeniske belegg og produkter er basert på modifiserte og avanserte polymerer, og eksempler er gitt i WO9301221 og WO9830615.

Anti-trombotiske og anti-restenosebelegg er generelt bioforenlige belegg som også kan tjene som reservoarer for lokal legemiddelavlevering. Beleggene er hovedsakelig basert på hydrogeler, og eksempler i patentlitteraturen på fremgangsmåter for fremstilling av forskjellige typer av hydrogeler og medisinske belegganordninger omfatter W09211896, W09811828, WO0147572, EP0887369 og WO0139811.

Frigjørelsesprofilen til de terapeutiske stoffene som finnes i belegget, kan reguleres for eksempel ved å variere tykkelsen til polymerlagene, eller ved å velge ut bestemte polymerbelegg som bidrar med utvalgte fysikalsk-kjemiske egenskaper (slik som ladning, hydrofobisitet, hydrofilisitet), og/eller ved å fremstille belegget som forskjellige lag. Kriteriene for utvelgelse av polymeren og optimaliseringen av frigjørelseshastighet forstås av fagfolkene innen teknikken. Andre belegg er beskrevet av Fischell Circulation, 1996, 94: 1494-95), Topol et al (Circulation, 1998, 98: 1802-20), og McNair et al. i Device Technology, 1996, 16-22.

Anvendelsen av stenter, strenger og katetere i det kardiovaskulære system er vanlig praksis og karveggskader, embolisering og den påfølgende restenose er en stor bekymring for kardiologer under og etter kirurgisk intervensjon eller kateteriseringer. Slike alternative metoder som endarterektomi forårsaker liknende problemer. Enhver fremgangsmåte hvor arterier manipuleres, det vil si karkirurgi og angioplastikk, er ømfintlig for utvikling av intimal hyperplasi. Utnyttbarheten av en fremgangsmåte for forhindring eller reduksjon av utviklingen av intimal hyperplasi, kan ikke overvurderes, og fordelene ved en fremgangsmåte som er i stand til å gjøre dette uten å gi systemiske virkninger, er enda mer oppmuntrende.

Behovet for nye og forbedrede farmasøytika og fremgangsmåter for inhibering av de tidligste hendelsene ved patofysiologi (for eksempel blodplateadhesjon) er derfor åpenbare, og bidrag på dette området forventes i vesentlig grad å redusere sykelighet og dødelighet forbundet med angioplastiske eller kirurgiske fremgangsmåter.

BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN

Generelt omfatter foreliggende oppfinnelse innføringen av den nylig beskrevne blodplateadhesjonsinhibitor saratin i eller på et utvalgt sted i eller på et hulrom i et vev, det vil si vaskulaturen eller et organ, under slike betingelser at saratin kan anvendes lokalt som et topisk middel, eller som et adherent belegg på overflaten for å forhindre og inhibere en uønsket trombotisk og/eller restenotisk respons på karveggskade, inkludert skade forbundet med angioplastikk, stenter, dialyseimplantater og andre karimplantater, og behandlingen av benign trofisk arrdannelse samt behandlingen og passiviseringen av ustabile aterosklerotiske plakker.

Saratin er et nylig beskrevet (WO0056885) rekombinant 12 kDa stort protein, som opprinnelig ble isolert fra en igle. Proteinet inhiberer vWF-avhengig binding av blodplater til arterieveggkollagenet under betingelser med forhøyet skjærkraft, og det er dette aspektet av oppfinnelsen som gjør saratin egnet til å inhibere arteriell trombose. Et annet nytt aspekt er at saratin kan anvendes som et topisk middel på skadestedet med den fordel å redusere trombose og/eller intimal hyperplasi uten noen systemiske effekter. Dette utgjør en modalitet med spesifikke og lokaliserte effekter vel egnet for applikasjon både av kirurger så vel som radiologer som gjør inngrep.

Saratin kan kombineres med mange forskjellige terapeutiske midler for avlevering på stedet. Eksempler for anvendelse ved koronararterieapplikasjoner er anti-trombotiske midler, for eksempel prostacyclin og salisylater, trombolytiske midler, for eksempel streptokinase, urokinase, vevsplasminogenaktivator (TPA) og anisoylert plasminogen-streptokinase-aktivatorkompleks (APSAC), vasodilaterende midler, det vil si nitrater, kalsiumkanalblokkerende legemidler, anti-proliferative midler, det vil si colchicin, og alkyleringsmidler, interkalerende midler, vekstmodulerende faktorer, slik som interleukiner, transformasjonsvekstfaktor-P og blodplateavledet vekstfaktor av samme familie, monoklonale antistoffer rettet mot vekstfaktorer, antiinflammatoriske midler, både steroidale og ikke-steroidale, og andre midler som kan modulere kartonus, -funksjon, arteriosklerose og den helende respons på kar- eller organskade etter intervensjon. Antibiotika kan også inkluderes i kombinasjoner eller belegg omfattet av oppfinnelsen. Dessuten kan et belegg anvendes til å bevirke farmasøytisk avlevering fokalt innenfor karveggen. Ved inkorporering av det aktive middel i en svellbar polymer vil det aktive middel frigjøres etter svelling av polymeren.

Belegget kan lages fra en hydrogel, slik som polyetylenoksid, albumin, hydrofile polymetakrylater og polyfile polyuretaner.

Nærmere bestemt angår oppfinnelsen anvendelse av polypeptidet saratin til fremstilling av et medikament for inhibering av blodplateakkumulering etter vaskulære skader eller endarterektomi, som omfatter administrering til blodkarvevet av en terapeutisk effektiv mengde av saratin som forhindrer blodplateadhesjon, for derved å inhibere trombose og restenose.

Én utførelsesform av foreliggende oppfinnelse angår anvendelse ifølge krav 1, hvor den vaskulære skade er forbundet med aterosklerose, hjertetransplantasjonsvaskulopati, koronar stenose etter koronar intervensjon, ballongangioplastikk, stentplassering, rotablasjon, endarterektomi, inkludert halspulsåreendarterektomi, dialysetransplantatshunter og andre transplantatanastomoser, ustabil angina, akutt hjerteinfarkt, slag, godartet hypertrofi eller godartet prostatahypertrofi.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer videre anvendelse av saratin ifølge krav 1, hvor saratinet administreres lokalt via legemiddelavleveringsanordninger/-katetere eller via stenter og stentbelegg, og via karimplantater og ved implantatbelegningsteknikker. Oppfinnelsen tilveiebringer også anvendelse av saratin for fremstilling av medikament ifølge krav 1, hvor saratin er inkorporert i preparater som eluerer ut regulerte mengder av saratinet over tid i et lokalisert område.

Én utførelsesform av foreliggende oppfinnelse vedrører særlig anvendelser av kateterbaserte anordninger for å avlevere saratin lokalt.

Saratin kan også godt anvendes med eller uten andre terapeutiske midler fra en polymermatriks i kroppsvev ved å anvende katetere. Grunnbehovene for polymermaterialet som skal anvendes ved foreliggende fremgangsmåte, er biokompatibilitet og legemiddel-frigjørelsesegenskaper som kan tilpasses den bestemte applikasjon.

Den lokalt kontrollerte saratinfrigjørelse kan oppnås ved hjelp av permeasjon alene, iontoforese alene, eller kombinert iontoforese og elektroporasjon kan anvendes for å frigjøre og inkorporere saratin effektivt inne i karhulrommet. Kateteret er fortrinnsvis i stand til å utføre fremgangsmåter utformet for å opprettholde en høy konsentrasjon av legemiddel i det utvalgte karrom slik at resultatene gir et forbedret karbelegg med saratin alene eller med ytterligere behandlingsmidler.

Foreliggende oppfinnelse er særlig anvendbar til den lokale avlevering av saratin under og etter kardiologiske fremgangsmåter med inngrep, slik som angioplastikk og stentimplantasjon og endarterektomi.

NÆRMERE BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN

Egnet rekombinant saratin for anvendelse ved oppfinnelsen ble uttrykt og isolert fra Hansenula polymorpha og ble funnet å virke ved å blokkere vWF-binding til kollagen, og forhindrer effektivt adhesjonen av blodplater til kollagen under forhøyet skjærkraft. Saratin inhiberte på doseavhengig måte bindingen av renset human-vWF til human type I- og III-kollagener (henholdsvis IC50= 0,23 ± 0,004 og 0,81 ± 0,04 ug ml"<1>) og til kalvehudkollagen (IC50= 0,44 ± 0,008 ug ml"<1>). Dessuten oppviste saratin en lignende inhibitorstyrke mot bindingen av menneske-, gnager- og svine-plasma ved vWF til disse kollagene. I et strømningskammer under betingelser med forhøyet skjærkraft (2700 s"<1>) inhiberte saratin på doseavhengig måte og sterkt blodplateaggregatdannelse på en kollagenbelagt overflate (IC50= 0,96 ± 0,25 ml"<1>), men ved redusert skjærkraft (1300 s"<1>) ble en høyreskifting i dose-responskurven lagt merke til (IC50= 5,2 ± 1,4 ug ml"<1>). Overflateplasmonresponsanalyse avslørte både steder med høy og lav affinitetsbinding for saratin på humant kollagen type III

(henholdsvis IQ = 5 x 10" M og 2 x 10") og selv om lave konsentrasjoner av saratin som inhiberte blodplateadhesjon under forøkt skjærkraft (det vil si metning av høyaffinitets-bindingsseter) ikke hadde noen effekt på vWF-uavhengig kollagenindusert blodplateaggregasjon, ble høye konsentrasjoner (dvs. metning av lavaffinitetsbindingsseter) funnet å inhibere blodplateaggregasjon. Disse dataene viser at saratin er en sterk inhibitor for vWF-avhengig blodplateadhesjon til kollagen, og dette danner grunnlaget for det terapeutiske potensial som et anti-trombotisk middel.

Studiene viste videre at saratin sterkt og doseavhengig inhiberer bindingen av vWF ikke bare til kalvehudkollagen, men til menneskekollagen av typene I og III, som begge finnes rikelig i arterieveggsubendotellag og antas å være viktige i blodplate-karveggs-interaksjoner (Thromb Haemost 1997, 78(1): 434-438). Ettersom kollagen-vWF-GP Ib/IX/V-interaksjoner bare finner sted ved tilstrekkelig forhøyet skjærkraft, var det et viktig aspekt ved denne oppfinnelsen å vise effekten av saratin ikke bare under statiske betingelser, men også i et miljø som nærmere etterligner situasjonen man står overfor in vivo. I et strømnings-kammer hvor skjærkrefter kan varieres til å simulere et slikt miljø, inhiberte saratin klart blodplateakkumulasjon til kollagen, særlig ved høyere skjærkraft. Høyreskiftingen i dose-responskurven som et resultat av å redusere skjærkraft, er verdt å legge merke til ettersom implikasjonen er at effektiviteten av saratin in vivo kan være lokalisert til områder med høy skjærkraft, hvor oppbrytning av laminær blodstrømning skriver seg fra endringer i endotel-overflaten presentert for blodet, for eksempel i nærvær av arterosklerotisk plakk eller etter mekanisk intervensjon.

Overflateplasmonresonansstudier med saratin avslørte at kollagen kan ha to uav-hengige bindingsseter for saratin, én med høy affinitet og én med lav affinitet. Inhibering ved hjelp av saratin av vWF-binding til kollagen forklares ved metning av høyaffinitetsbindings-setet, med IC50-verdier rund 5 x IO"<8>M, det vil si likt med dissosiasjonskonstanten til dette stedet. Ettersom vWF-uavhengig kollagenindusert blodplateaggregasjon bare ble inhibert ved svært høye doser av saratin (over 100 um), synes det som om metning av lavaffinitets-kollagenbindingssetet er forbundet med inhibering av direkte kollagen-kollagen-reseptor-interaksjoner.

Et annet formål med denne oppfinnelsen er effekten av saratin når det gjelder å påvirke det lokale miljø i et endarterektomisert blodkar uten at det kreves systemisk fordeling, og uten å endre blodplatefunksjoner eller endre koagulasjon, gjør dette den til en ideell modalitet for topisk applikasjon under vaskulære kirurgiske og intervenerende radiologiske fremgangsmåter.

Ved dette aspektet av oppfinnelsen ble den terapeutiske saratin-effekt undersøkt ved å anvende en rottemodell med halspulsåreendarterektomi (CEA) beskrevet tidligere (J. Vase. Surg. 1998, 28:909-918). PLT-aktivering er ment å være det innledende trinn i etter-CEA-trombose og restenose på grunn av IH. Det er blitt observert at den topiske applikasjon av saratin på den luminale overflate vil redusere mengden av blodplateadhesjon til den endarterektomiserte arterie og således redusere post-operativ trombose og IH.

Som en oppsummering av de eksperimentelle resultatene, indikerte anti-blodplate-adherenseffekten av saratin evaluert etter to forskjellige post-operative tidspunkter at antallet av adherente blodplater 3 timer (figur 4) og 24 timer (figur 5) etter halspulsåreendarterektomi ble redusert signifikant hos rottene behandlet med saratin sammenliknet med kontrollrottene.

Blodplateadhesjon ble redusert med 59 % etter 3 timer (64 ± 17,2 vs. 155 ± 33,4 PLT pr. grid P=0,05) og 77 % etter 24 timer (35 ± 11,3 vs. 149 ± 36,6 PLT pr. grid P = 0,0110). Blodplateadhesjon var lik etter 3 timer og 24 timer i kontrollgruppene, men det var en reduksjon i den saratin-behandlede gruppe fra 64 til 35 blodplater pr. grid.

Figurene 6 og 7 viser en typisk fremstilling av den endarterektomiserte overflate med og uten topisk saratin under anvendelse av skanningelektronmikroskopi ved 2000 x forstørrelse. Figur 6 A viser kontrolloverflaten 3 timer etter halspulsåreendarterektomi, legg merke til den markerte overflod av cellulært materiale, fibrintråder, det store antall røde blodlegemer og det store antall blodplater som tydelig fremgår. Figur 6 B viser en saratin-behandlet overflate 3 timer etter halspulsåreendarterektomi. Legg merke til mangelen på cellulære elementer og den tilnærmet tomme kollagenoverflate. Figur 7 A viser en kontrolloverflate 24 timer etter halspulsåreendarterektomi, blodplater fremvises som små hvite flekker. Figur 7 B er en saratin-behandlet overflate 24 timer etter halspulsåreendarterektomi. Det er en klar reduksjon i blodplateadhesjonen med saratin-behandling.

Anvendelsen av topisk saratin etter en halspulsåreendarterektomi reduserte signifikant utviklingen av intimal hyperplasi sammenliknet med kontrollgruppen. Prosent luminalstenose som et mål for IH ble betydelig redusert med saratin-anvendelse sammenliknet med kontroller. Denne reduksjonen i IH-dannelse korrelerte med inhiberingen av PLT-festing. Når det gjelder luminalstenose oppviste kontrollrotter en 29,8 ± 6,8 %, p=0,042 lumenalstenose vs. en 10,9 ± 1,8 % lumenalstenose i den saratin-behandlede gruppe (figur 6). Saratin-behandlede rotter hadde 18,9 % større lumenaldiameter enn kontrollrotter. To uker etter halspulsåreendarterektomi utviklet 5 av de 15 kontrollrottene (15 %) fullstendig blodpropp i halsarterien etter histologisk analyse, mens 0-15 saratin-behandlede rotter (0 %) utviklet halspulsåretrombose. En sannsynlighetsforholds-Chi- kvadratanalyse avslørte et sannsynlighetsforhold på 16,238, noe som tyder på at sannsynligheten for at kontrollgruppen utvikler okklusiv trombose, var 16 ganger større enn for rottene behandlet med saratin, P = 0,0156.

Man støtte ikke på noen forøkt blødning langs arteriesuturlinjen i saratin-gruppen. Blødningstider og systemiske blodplatetellinger ble ikke funnet å endre seg signifikant hos de saratin-behandlede rotter sammenliknet med kontrollrotter 3 og 24 timer etter endarterektomi.

CEA-modellen stemmer nært overens med den humane CEA-operasjon og resultatene foreslår følgelig mekanismer for å redusere skadelige effekter av blodplatefesting og -aggregasjon på endarterektomistedet uten å påvirke blodplatefunksjonen systemisk eller redusere hemostase. Den enkle, topiske applikasjon av saratin under en rotte-CEA reduserer blodplatefesting, -aggregasjon og etterfølgende restenose i halspulsåren på grunn av intimal hyperplasi.

Tabell 3 viser resultatene av blødningstidene og blodplatetellingene. Ingen statistisk signifikante forskjeller ble observert mellom pre-op- og post-op-blødningstider. Ingen statistisk signifikant forskjell ble identifisert i blodplatetellingsforskjellene mellom saratin-og kontrollrottene.

Vi har påvist en signifikant reduksjon i blodplatefesting og -akkumulering etter en blodkarskade som likner på endarterektomi. Den reduserte blodplateadhesjon ses både umiddelbart etter endarterektomi (3 timer) og 24 timer etter. Effekten etter 24 timer er signifikant ved at vi tror at den effekten ikke skyldes den direkte inhibitoreffekten av saratin på kollagenet (serumhalveringstiden for saratin er 90 minutter), men at den skyldes den initielle inhibering av blodplateaggregasjon og den etterfølgende oppbrytning av blodplate-aktiveringskaskaden. Når blodplater først er blitt hindret fra å feste seg til eksponert kollagen, kan blodplatekaskaden ikke fortsette. Figurene 4 og 5 viser at den topiske applikasjon av saratin på det nylig skadde blodkar kan hindre blodplateadhesjon i en betydelig grad. Saratin inhiberte blodplateadhesjon med 60 % og 75 % etter henholdsvis 3 og 24 timer. Denne inhiberingen ses i de synlige forskjellene i cellulær elementavsetning mellom kontroll- og saratin-behandlede arterier både etter 3 timer og 24 timer (figurene 7 og 8). Denne mangelen på cellulær respons foreslår vi skyldes inhiberingen av blodplateadhesjon. Dette utgjør en unik terapimåte for inhiberingen av blodplateadhesjon til et skadd blodkar. Kontrollrotter hadde en signifikant redusert luminal diameter to uker etter halspulsåreendarterektomi sammenliknet med saratin-behandlede rotter (figur 9). Omfanget av intimal hyperplasiutvikling ble redusert signifikant hos saratin-behandlede rotter, noe som korrelerte med redusert blodplateadhesjon og -akkumulering. Funnet av redusert intimal hyperplasi og trombose som er forbundet med redusert blodplateadhesjon, sørger for klinisk relevante sluttpunkter og følgelidelser av redusert blodplateadhesjon. Dette viste at den setespesifikke, ikke-systemiske inhibering av blodplateaggregasjon og -adhesjon fører til en redusert trombose- og okklusjonsgrad, og følgelig reduserer hyppigheten av post-halspulsåreendarte rektomi-relaterte cerebrovaskulære hendelser. Nivået av intimal hyperplasi- og luminalstenoseforbedring er ytterligere demonstrert av det signifikante funn av en redusert trombosegrad hos rotter behandlet med saratin. Hele 33 % av kontrollrotter oppviste trombose, mens ingen av de saratin-behandlede halsarterier hadde trombosedannelser. Av særlig klinisk viktighet er mangelen på systemiske effekter demonstrert av dette midlet. Den lokale applikasjon av saratin påvirket ikke systemiske blødnigstider eller blodplatetellinger. Dette innebærer at den reduserte blodplateadhesjon og den etterfølgende reduksjon i trombose og intimal hyperplasi er resultatet av lokale effekter. Disse nye funnene relatert til saratin er ganske viktige ved at spektret for kliniske applikasjoner for en modalitet som er i stand til lokalt å inhibere de skadelige effektene av blodplateadhesjon og -aktivering uten forstyrrelse av den systemiske hemostatiske mekanisme, er bredt.

Det er tidligere blitt påpekt at forskjellige terapeutiske intervensjoner induserer lokale skader som ideelt ville bli behandlet umiddelbart og lokalt. Når de skadde celler ikke behandles, initieres en serie av prosesser involvert i blodlevring, komplementaktivering og cellulær respons for frigjørelse av cytokiner, induksjon av proliferasjon, og andre biologisk aktive prosesser. Det er vanskelig å stanse disse komplekse, gjensidig beslektede prosesser når de først har begynt.

Ved foreliggende oppfinnelse er det derfor et viktig aspekt at saratin lokaliseres direkte til de manipulerte vev. Et annet aspekt av den lokale applikasjon er minimaliseringen av potensielle problemer relatert til de systemiske effekter av legemidlene som anvendes for intervensjon.

Ideelt sett kan saratin-behandling administreres samtidig med den passende terapeutiske intervensjon som kan oppnås ved å inkorporere saratin i belegget til en kirurgisk anordning, slik som et ballongkateter, eller en annen anordning eller del derav. Et annet aspekt kunne også involvere den direkte belegning av de skadde kar med saratin.

I tillegg vil normale saratin-avleveringsmidler også kunne anvendes ved oppfinnelsen, slik som fri væskeform, inkludert kombinasjoner med andre terapeutiske midler. Anvendelse av polymer-/hydrogel-matrikser har imidlertid visse fordeler sammenliknet med fri væske-avlevering. Avlevering av et middel som er blitt inkorporert i en polymermatriks, krever ikke tilleggshulrom i tilførselskateteret for å føre den frie væske-legemiddel-oppløsning inn i og ut av det behandlede sted.

I tillegg eliminerer polymermatriksene risikoen for nedstrømslekkasje av lege-middeloppløsningen på grunn av defekt ballonglukking av karsegmenter, for derved å unngå risikoen for eksponeringen av ikke-målvev for høyere konsentrasjoner av legemidlet. En generell teknisk løsning på den lokale applikasjon av saratin enten på en medisinsk anordning eller som et belegg på det skadde blodkar er for eksempel inkorporeringen av saratin i et polymer- eller hydrogelbelegg.

Når det gjelder polymerpreparatet omfatter uttrykket "hydrogel" slik det her er brukt, syntetiske polymerer med porer eller sprekker med forskjellige størrelser og kapasiteter, av varierende fysikalskkjemiske egenskaper, spesielt når det gjelder ladningen eller den hydrofile/hydrofobe natur til gelmatriksen som kan være innført under fremstilling av belegget eller den belagte anordning. Mange forskjellige syntetiske elastomerer og naturlig fore-kommende polymermaterialer er kjent for fagfolk innen teknikken. Saratin kan inkorporeres i matriksen enten under polymerfremstillingen eller tilsettes etter belegningen eller støpingen av polymeren i den ønskede form. I tillegg kan mange av en rekke forskjellige polymermaterialer og fremstillingsmetoder anvendes til å danne polymermatriksene som brukes ved den foreliggende oppfinnelse. Eksempler på egnede polymermaterialer eller kombinasjoner omfatter, men er ikke begrenset til, biokompatible og/eller bionedbrytbare polymerer.

Flere alkyl-alkyl- og cyanakrylater er blitt undersøkt med hensyn på kirurgiske anvendelser, og noen isobutylcyanakrylater er blitt funnet spesielt egnet.

En typisk hydrogenpolymer kan fremstilles fra en monomerblanding som omfatter 40-60 vektdeler av en renset monoester av et hydroksyalkylalkylakrylat med én eneste olefindobbeltbinding, 40-60 vektdeler av en metakrylsyremonomer som inneholder én olefindobbeltbinding, og 0,001-5 vektdeler av en polymeriseringsinitiator. Polymerisering kan utføres ved hjelp av de vanlige teknikkene med bulkpolymerisering, oppløsnings-polymerisering, suspensjonspolymerisering eller emulsjonspolymerisering. Polymeriserings-teknikken som anvendes er avhengig av polymervolumet som trengs, og av typen sluttprodukt som fremstilles. Et typisk hydrogelprodukt vil bli beskrevet ved hjelp av et molart forhold mellom monoester og metakrylmonomer innen for området 1:1 til 2,3:1, fortrinnsvis 1,5:1, hvor porediameteren til polymeren er større enn 90 Å.

Som monoesteren av et hydroksyalkylakrylat med én eneste olefindobbeltbinding, omfatter akseptable forbindelser, men er ikke begrenset til, 2-hydroksyetylmetakrylat, glycerylmetakrylat, 2-hydroksypropylmetakrylat, glycidylmetakrylat, 2-hydroksyetylaktrylat og 2-hydroksypropylakrylat. Akseptable metakrylsyremonomerer er metakrylsyre, matakrylamid 5 og metakrylnitril.

Polymeriseringsinitiatoren kan avhenge av polymeriseringsmetoden eller den endelige, påtenkte anvendelse av polymeren. Når polymeren skal dannes som en fast gjenstand, kan det for eksempel anvendes initiatorer med fritt radikal.

Foretrukne initiatorer av den typen omfatter slike tofunksjonelle polyestere som 2,5-dimetyl-2,5-bis(2-etylheksoylperoksy)heksan eller tertiært butylperoksypivalat. Alternativt kan, når den endelige anvendelse av polymeren er som et belegg påført i form av monomer blandingen og polymerisert på stedet, initiatoren strålingsaktiveres slik som med UV-katalysatorer 2,2-azobis(2-metylpropionnitril) eller azobis(2-metylpropionnitril) eller azobis-butyronitril (AIBN). Initiatoren er ikke begrenset til anvendelse av en bestemt polymeri-seringsmetode eller for et bestemt sluttprodukt. Initiatorene med fritt radikal kan for eksempel anvendes i belegg og de strålingsaktiverte initiatorer kan anvendes ved dannelsen av faste artikler.

I tillegg til de i det vesentlige like fraksjoner av monoesteren og metakrylsyremono-mereren, kan monomerblandingen forsterkes med spormengder av en mer langkjedet alkyl-akrylat- eller -metakrylatesterkomonomer, slik som sykloheksylmetakrylat, trimetylolpropan-trimetakrylat eller etylenglykoldimetakrylat. Slike ytterligere komonomerer øker polymer-kryssbindingen for situasjoner hvor tilført polymerstyrke er ønsket. Spormengdene av disse komonomerene er generelt mindre enn 0,1 vekt% av den totale monomerblanding.

Hydrogelpolymerene som anvendes ved foreliggende oppfinnelse, kan dannes slik at de gir en artikkel som er tilstrekkelig kryssbundet ved hjelp av intrinsisk virkning til at den resulterende artikkel ikke krever noen kryssbindende monomerer i tillegg.

Ytterligere eksempler på de biologisk nedbrytbare polymerer er poly(laktider), poly-glykolider, polyanhydrider, polyortoestere, polyacetaler, polydihydropyraner, polycyanakryl-ater og kopolymerer av disse og polyetylenglykol. Disse kan ha form av kopolymerhydro-geler eller kryssbundne polymernettverk hvori legemidler for forsterket lokalavlevering kan være inkorporert enten under polymeriseringen eller, i tilfellet med visse hydrogeler, tilført senere. Foretrukne matrikser vil være skreddersydd etter de molekylære karakteristikaene til midlet som skal kontrollere fri diffusjon utover.

Multippeltyper av katetere og andre medisinske anordninger belagt med saratin kan konstrueres og brukes i henhold til det enkelte terapeutiske behov som det er blitt utformet for, eller for det mer spesifikke formål med avlevering av den saratin-ladede polymer lokalt. Den foreliggende oppfinnelse er testet med ballongkateteret solgt under navnet Blue Medical Devices BV GO tilgjengelig fra Blue Medical, men er ikke begrenset til denne katetertypen.

YTTERLIGERE EKSEMPLER

EKSEMPEL 1

Renset vWF- og blodplatebinding til kollagen under statiske betingelser

vWF-bindingen til kollagen ble undersøkt i mikrotiterplater, hovedsakelig som beskrevet annet sted (Blood 1995, 85(3):705-711). Forskjellige kollagener, enten humankollagen type I, type III eller kalvehudkollagen (Sigma), ble belagt over natten ved pipettering av 50 ul kollagen, oppløst i 50 nM eddiksyre ved 125 ug ml"<1>i 96-brønners

mikrotiterplater i nærvær av 200 ul PBS, for å fremme renaturering. Etter blokkering av ikke-belagte seter med BSA ble renset human-vWF (1,25 ug ml"<1>for kalvehud og kollagen I-belagte plater; 0,625 ug ml"<1>for kollagen III-belagte plater) eller fortynnet normalplasma (humanplasma: 1/80 på kollagen I og III, 1/40 på kalvehudkollagen; hamster-, muse- og porcint plasma: 1/80 på kollagen III; 1/20 på kollagen I og kalvehudkollagen) tilsatt til brønnene i nærvær av saratin, og det ble inkubert i 2 timer (fortynnet plasma) eller i 1 time (renset vWF). Binding av rest-vWF til kollagen ble bestemt etter et ytterligere vasketrinn under anvendelsen av kanin-anti-vWF-antiserum (Dako, København, Danmark) konjugert med pepperotperoksidase, som ble fremkalt og den resulterende lysabsorbans målt ved 492 nm.

Når mikrotiterplater ble forinnkubert med enten humankollagen I, humankollagen III eller kalvehudkollagen, var den etterfølgende inkubasjon av renset vWF i nærvær av saratin forbundet med en doseavhengig inhibering i vWF-kollagenbinding med IC50-verdier på henholdsvis 0,23 ± 0,004, 0,81 ± 0,04 og 0,44 ± 0,008 ug ml"<1>(figur 1). Når renset vWF ble er-stattet med fortynnet normal humanplasma, ble inhibitorstyrken til saratin opprettholdt (tabell 1). Saratin inhiberte også bindingen av vWF i fortynnet porcin-, hamster- og murinplasma til de forskjellige kollagenene som ble testet, med konsekvent høyeste effekt mot kollagen I (tabell 1).

EKSEMPEL 2

Blodplateadhesjon under forhøyet skjærkraft

På bakgrunn av viktigheten av skjærkrefter ved kontrollen av vWF-avhengig blodplateadhesjon til kollagen (J. Lab. Clin. Med. 1974, 83(2):296-300), ble strømningskammer-perfusjonsstudier utført for å undersøke inhibitorvirkningen av saratin under liknende strøm-ningsbetingelser som de som man støter på i skadde eller sykdomsrammede arterier. Kalvehudkollagen ble belagt på plastdekkglass som beskrevet tidligere. Perfusjoner ble utført i et parallellplate-perfusjonskammer med to dekkglassholdere, og kammerhøyder på 0,4, 0,6 eller 1,0 mm og en bredde på 1,0 cm under støtvis strømning (rullepumpe, Watson Marlow 603 S, VEL, Leuven, Belgia) ved omtrentlige skjærhastigheter på henholdsvis 2700, 1300 og 300 s"<1>). Antikoagulert helblod (0,2 IU ml"<1>heparin med lang molekylvekt, Clexane) ble perfundert over de kollagenbelagte dekkglass i 5 minutter, hvoretter de skyllede dekkglass ble farget med Griinwald-Giemsa og bedømt med hensyn på blodplateavsetning ved hjelp av lys-mikroskopi og bildeanalyse som beskrevet (Blood 1995, 85(3): 705-711), under anvendelse av overflatedekning som en kvantitativ parameter.

Ved en skjærhastighet på 2700 s"<1>inhiberte saratin på doseavhengig måte blodplateadhesjon, med en IC50= 0,96 ± 0,25 ug ml"<1>(figur 2). Ved en mer moderat skjær hastighet på 1300 s"<1>ble det imidlertid observert en klart høyrerettet endring i dose-responskurven, med en IC50= 5,2 ± 1,4 ug ml"<1>(figur 2). Ved vene-skjærhastigheter på 300 s"<1>var saratin ute av stand til å inhibere adhesjonen av perfunderte blodplater opp til 10 ugml"<1>(data ikke vist).

EKSEMPEL 3

Bindingsanalvse ved hjelp av overflateplasmonresonans ( SPR)

Proteininteraksjoner ble identifisert ogkarakterisert vedhjelp av SPR under anvendelse av et BIAcore 3000 instrument (BIAcore, Freiburg, Tyskland). Koblings-reagenser ble brukt i henhold til protokoller utviklet av leverandøren. Kobling til CM 5-sensorchipene ble gjort via aktiverte karboksylatgrupper til frie amingrupper i humant kollagen type III (Sigma). pH-undersøkelsen og koblingskjemien ble utført under standard-betingelser (Anal Biochem. 1991, 198(2):268-277, JAI Press Ltd., 1992). For kobling ble kollagenet fortynnet til 0,125 ug ml"<1>i 10 mM acetatbuffer (pH 4,5), noe som resulterer i 331 resonansenheter (RU) immobilisert materiale. Denne matriks ble brukt til å studere bindingen av renset rekombinant saratin som var fortynnet i 20 mM Hepes (pH 7,4), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,005 % Tween 20. Alle bindingsforsøk ble utført ved 25 °C. Titreringen med saratin ble utført ved konsentrasjoner i området fra 7,8 mM til 10 uM. De resulterende eksperimentelle RU-platåverdier ble plottet i henhold til ligningen:

Titrering av saratin på den immobiliserte kollagenoverflate resulterte i konsentra-sjonsavhengig binding. Den maksimale mengde av saratin bundet til kollagen på sensorover-flaten resulterte videre i et signal som er større enn det beregnede maksimalsignal for en 1:1-bindingsmodell. Dette peker mot eksistensen av mer enn ett bindingssete for saratin på kollagen type III, ytterligere understøttet av den observasjon at tilpasning av dataene til en l:l-bindingsmodell i henhold til Langmuir ikke ga noen tilfredsstillende resultater.

Scatchard-analyse av SPR-dataene indikerte eksistensen av to forskjellige bindingsseter med signifikant forskjell i affiniteter for saratin (figur 3). Beregning av likevekts-konstantene resulterte i en dissosiasjonskonstant på 5 x IO"8 M for høyaffinitetssetet og 2 x IO"<6>M for lavaffinitetsbindingssetet.

EKSEMPEL 4

Blodplateaggregasjon

Spesifisiteten til saratin på blodplatefunksjon ble evaluert videre via aggregasjons-studier i blodplaterikt plasma under anvendelse av kollagen, ADP, ristocetin, arakidonsyre eller tromboxan-etterlikningen U46619 som agonister. Citrert blod (3,13 %) fra ikke-medi- sinert, friske frivillige ble sentrifugert (15 min 100 g) for å oppnå blodplaterik plasma, hvortil saratin ble tilsatt (sluttkonsentrasjon 0-200 ug ml"<1>) i 1 minutt før induksjon av blodplateaggregasjon med kollagen (0,5 ug ml"<1>), ADP (2,5 uM), ristocetin (0,9 mg ml"<1>), arakidonsyre (1,0 mM) eller U46619 (1,3 uM). Den maksimale aggregasjon (amplitude) i løpet av en 5-minutters periode ble observert for hver agonist.

Saratin inhiberte ikke maksimal aggregasjon for alle testede agonister inkludert kollagen, med sluttkonsentrasjoner opp til 40 ug ml"<1>(tabell 2). Saratin var imidlertid i stand til delvis å inhibere kollagenindusert blodplateaggregasjon ved 100 ug ml"<1>(ikke vist), med fullstendig inhibering ved 200 ug ml"<1>, selv om aggregasjonen til ADP var upåvirket, selv ved 200 ug ml"<1>saratin.

EKSEMPEL 5

Rotte- CEA- modell

En rotte-CEA-modell hvor det ble anvendt en åpen teknikk med arteriotomi, med styrt fjerning av intima og deler av media, og suturlukning av arterien, ble brukt. Én gruppe rotter fikk saratin, mens den andre gruppen tjente som kontroller.

Sluttpunktsmålinger omfattet 1) PLT-adhesjon, 2) tromboseprosent, 3) intimal hyperplasiutvikling. Saratin ble tilført direkte til den endarterektomiserte overflate til halsarterien før arterielukning. Elektronmikrografier (2000 x forstørrelse) av preparerte halsarterier ble brukt for kvantitativ analyse av PLT-aggregasjon. Totale PLT-antall ble tellet ved å anvende en standardisert overliggende rist. IH og trombose ble fastlagt ved hjelp av datamaskinassistert morfometrisk analyse av elastinfargede halsarteriesnitt med direkte måling av IH-areal.

EKSEMPEL 6

Halspulsåreendarterektomioperasjon

Dyr ble dopet ned med isofluran i en glassklokke, veid og fikk så narkose med en kombinasjon av ketamin (100 mg/kg) og acepromazinemaleat (1 mg/kg) intrapeirtonealt. Etter at passende narkose var bekreftet ved mangel på respons på bakpotestimulering, ble 4 cm normal saltoppløsning injisert subkutant i området til den øvre midtrygg for å tjene som en væskebolus (10 cmVkg) for å kompensere for eventuelt intra-operativt blodtap. Hals-området ble så barbert og preparert med 7 % isopropylalkohol. Ved å anvende steril teknikk og et disseksjonsmikroskop (x 40, sz40 Olympus, Olympus America Inc., Melville, NY) ble det gjort et midtlinje-cervikalsnitt. Overflatemusklene ble delt og disseksjonen utført ned til nivået til den høyre halsarterie. Halsnervene i området til arterien ble dissekert fri for å konservere faryngealfunksjon og forhindre post-operativ åndedrettsfare.

Etter passende halsarterieeksponering ble proksimal og distal kontroll i bifurka-sjonen, ca. 1,5 cm borte, oppnådd ved å anvende 3-0 silkesuturårepresser. Ved å anvende et hornhinneknivblad ble det gjort en arteriotomi og denne ble forlenget til 6 mm med mikrosaks. Ved å anvende en nål av størrelse 27 G ble intimaen rillet på tvers over karet i to parallelle linjer, ca 2 mm fra hverandre. Intima-og mediallaget ble fjernet med mikrogafler. Saratingrupperotter fikk 5 ul saratin-oppløsning tilført direkte til den endarterektomiserte overflate. Arteriotomien ble lukket med en 10-0 monofilament nylon- sutur (MS/9, Ethilon, Ethicon Inc., Somerville, NJ) som begynte i den distale ende. Distalårepressen ble fjernet først for å bedømme suturlinjehemostase etterfulgt av fjerning av den proksimale årepresse. Tid for saratinapplikasjon var 5 minutter, noe som utgjorde tiden for arteriotomilukning. Eventuell suturlinjeblødning ble forsiktig tamponert med en steril bomullsspissapplikator inntil hemostase var oppnådd. Den endarterektomiserte halsarterie ble bedømt med en håndholdt Doppler for å bekrefte åpenhet. Overflatemuskellaget og huden ble så lukket med en uavbrutt 3-0 absorberbar sutur.

EKSEMPEL 7

Blodplateadhesi on

I blodplateadhesjonsundergruppene fikk rottene narkose og de endarterektomiserte halsarterier ble innhøstet og fiksert i en 4 % glutaldehydoppløsning 3 timer eller 24 timer etter halspulsåreendarterektomi. Under innhøstingsprosedyren ble halspulsåresegmentene åpnet longitudinelt langs siden av suturlukningen og det endarterektomiserte område derfor eksponert. Arteriene ble så etterfiksert med osmiumtetroksid, dehydratisert i en avtrappet alkoholserie, tørket ved kritisk punkt med C02(1072 psi og 31,1 °C), med gullpalladium og plassert i skanner-elektronmikroskopet (JEOL JSM 5410, JEOL, USA Peabody, MA). De endarterektomiserte områder ble skannet ved 2000 x forstørrelse og fotografisk bilde ble erholdt. Fotografiene ble matchet og arrangert i en kollasj som muliggjorde visualisering av et større område enn det som var mulig med et enkeltområde i skanner-elektronmikroskopmonitoren. Når først kollasjen av fotografier var satt sammen, ble den tildekket med en gjennomsiktig overlagsgrid. Den samme overlagsgrid ble brukt til alle prøvefotografiene, 116 kvadrater ble brukt til å telle det totale antall blodplater i hvert fotografi. Antallet 116 er det maksimale antall kvadrater som alltid kunne telles på alle fotografikollasjene. Platetellinger ble utført ved hjelp av to blindede observatører.

EKSEMPEL 8

Intimal hyperplasi

To uker etter halspulsåreendarterektomi fikk rotter i gruppen med intimal hyperplasi bedøvelse og den endarterektomiserte halspulsåre ble eksponert. Hulrommet ble åpnet i midtlinjen og den distale Aorta og nedre vena cava eksponert. Vena cava ble transektert og den distale Aorta kanylert med et kateter størrelse 20 G for å sprøyte inn normal salt-oppløsning ved 100 mmHg inntil vena cava-utstrømingen rant klart. Deretter ble 10 % bufret formalin sprøytet inn ved 100 mmHg i et likt volum for å fullføre perfusjons-fikserings-teknikken. Et 1-centimeters snitt av den opererte halsarterie ble dissekert fri og plassert i 10 % formalin inntil videre prosessering for histologi. Arteriene ble parafinblokkert, snittet opp og elastinfarget med Verhoeffs og van Giesons farge. Det ble gjort flere snitt ved intervaller på 3 mikrometer, som hver forsatte langs retningene til den kontinuerlige 10-1 nylonsutur-arteritomilukning for å standardisere området med snittinndeling. De elastinfargede objekt-glass ble fotografert ved å anvende et KODAK DC 120 Zoom digitalkamera (Eastman KODAK Company, Rochester, NY). På dette tidspunkt ble det lagt merke til eventuelle snitt med trombosedannelse. Bilder uten trombosedannelse ble lastet ned i en datamaskin og hulromsområdene i halspulsårene ble analysert ved å anvende National Institutes of Health (Bethesda, MD), ImageJ-programvare, versjon 0,99 i. Denne programvarepakken lot oss beskrive det indre område i den intimale hyperplasi og således oppnå et nøyaktig mål for tverrsnittsområdet til karhulrommet. Det ytre område av intimal hyperplasi ble også bestemt. Forskjellen mellom de to områdene (ytre område med intimal hyperplasi minus det faktiske hulrom) ble bestemt som det absolutte område for intimal hyperplasi. Ettersom arterietverr-snittet hadde individuelle variasjoner i form, ble verdiene uttrykt som et forhold mellom det absolutte område med intimal hyperplasi og den ytre grense for intimal hyperplasi, og ble rapportert som en prosent hulromsstenose. Dette forholdet utgjør andelen av hulromsområdet okkupert av intimal hyperplasi og muliggjorde sammenligning av arterietverrsnittene med varierende størrelse (4). Minimal variabilitet ble sett mellom målinger med to blindede observatører.

EKSEMPEL 9

Blødningstider og blodplatetellinger

For å evaluere effekten av saratin på systemiske blodplatetellinger og blødningstider, ble blodplatetellingene og blødningstidene for 12 rotter bestemt. Om nødvendig ble det erholdt en preoperativ blodprøve fra hver rotte på ca. 1-1,5 cm<3>, som utgjør en signifikant andel av en rottes totale blodvolum. På bakgrunn av dette er det rimelig å forvente en reduksjon i de post-operative blodplatetellinger fra både kontroll- og saratin-rotter. For å fast- legge effektene av saratin på blodplatetellinger, bestemte vi forskjellen i blodplatetellingen for hver rotte ved å trekke den preoperative blodplatetelling fra den post-operative blodplatetelling for å få et differanseresultat. Forskjellene i blodplatetellingene ble analysert ved å anvende en 2 x 2 faktoriell ordning av behandlinger etter ANOVA-modell, som ikke viste noen statistisk signifikans i blodplateantall-forskjellen mellom kontroll- og saratin-behandlede rotter. Alle rottene fikk bestemt sine blodplatetellinger og blødningstider preoperativt. Seks rotter gjennomgikk en halspulsåreendarterektomi og ble undersøkt 3 timer etter operasjon ved måling av blødningstider og blodplatetellinger, og de gjenværende 6 rotter ble undersøkt 24 timer etter operasjonen med måling av blødningstider og blodplatetellinger. Tre av rottene i hver tidsgruppe fikk topisk saratin og gjenværende 3 rotter tjente som kontroller.

Blødningstider ble bestemt ved å transektere de distale 2 mm av rottens hale og senke ned ca. 4 cm av halen i en oppløsning av fosfatbufret oppløsning ved 37 °C. Tiden som gikk fra haletranseksjon til avslutning av blødning, ble målt og ble betegnet blødningstiden. Blodplatetellinger ble bestemt ved å ta en 1-1,5 cm3 prøve av blod fra den indre halsvene som ble analysert i et Coulter STKS-blodanalyseapparat, og resultatene ble uttrykt x IO<3>.

EKSEMPEL 10

Statistiske metoder

Gjennomsnitt ± standardfeil er rapportert. Uparret t-test-analyse ble utført ved å anvende Stat View-programmet (SAS Institute Inc. Cary, NC 27513) version 5.0 for å sammenlikne saratin-behandlede og kontrollgrupper med hensyn på antall av festede blodplater, prosent hulromsstenose og blødningstider. En sannsynlighets- "Chi Square"-analyse ble brukt for å evaluere sannsynlighetsforholdet for utvikling av trombose to uker etter halspulsåreendarterektomi. En 2 x 2 faktoriell ordning av behandlinger etter ANOVA-modellen ble brukt til å evaluere forskjellen mellom preoperative og postoperative blodplatetellinger.

EKSEMPEL 11

Forsøksdyr

Sprague-Dawley-rotter (350-400 g) ble organisert i halspulsåreendarterektomi-grupper basert på to hovedformål. 1) Evaluering av blodplateadhesjon og 2) Evaluering av hulromsstenose på grunn av intimal hyperplasi, og tromboseforhold. Innenfor disse to for-målene ble rotter inndelt i kontroll- og saratin-behandlede dyr. Alle rotter gjennomgikk en halspulsåreendarterektomi (se nedenunder), saratin-behandlede rotter fikk en topisk applikasjon av 5 ul oppløsning av saratin på hulromsoverflaten til halsarterien umiddelbart etter fjerning av intima-/media-laget. Blodplateadhesjonsgruppen bestod av elektron-mikroskopievaluering 3 timer etter halspulsåreendarterektomi (n = 17) og 24 timer etter halspulsåreendarterektomi (n = 19). Den intimale hyperplasigruppe (n = 25) ble undersøkt to uker etter halspulsåreendarterektomi.

EKSEMPEL 12

Fremstilling av saratinbelagte hvdrogelkatetere

Overflater av PA-12-baserte materialer er blitt aktivert ved å senke anordningen ned i en oppløsning av 2 mol% makroinitiator (poly(oktadecen-alt-malein-eddiksyreanhydrid) med en perester (11-16 mol%) oppløst i isopropanol og 0,5 mol etylenglykol-dimetakrylat (EGDMA) /l mol makroinitiator. Etter tørking av makro-initiator-/EGDMA-belegget har belegget blitt annelert ytterligere 5 til 10 minutter ved 120 °C, noe som hjelper til å forbedre fikseringen av makroinitiatoren til overflaten og derved forbedre kryssbinding.

For optimalisering av beleggbetingelser er det blitt brukt hydrogelbelegg generert på et PA-12-bærerark. Før belegning er arkene blitt vasket med isopropanol eller aceton og tørket.

Ballongkatetertyper Blue Medical Devises GO (RX PTCA-kateter) bestående av Vestamid (PA-12) er blitt brukt til belegning med hydrogel. Vandig oppløsning av 5 mol% akrylsyre, 100 ml og 0,2 til 0,8 mol% metylen-bis-akrylsyre er blitt blandet og brukt til å belegge ark og katetere. Etter polymerisering er den belagte anordning blitt vasket med vann og i ytterligere 24 timer i PB S-buffer.

Etter dette anneleres polymeren i ovnen ved 60-80 °C i 0,5 til 3 timer.

Tykkelse av tørket hydrogelbelegg var i et område fra 1 til 4 um, og svellingen av hydrogel i vandig oppløsning varierte fra 10 til 50 g våt hydrogel / lg tørr hydrogel.

Ved nedsenking (30 minutter) i en bufret PBS-buffer pH 7,4-oppløsning av saratin, er det blitt brukt en konsentrasjon på 50 ug/ml.

Organiske oppløsningsmidler er blitt brukt til å fremstille beleggoppløsningene når de er blitt sprøytet på et ballongkateter under anvendelse av standard småskala spray-belegningsutstyr som det som er tilgjengelig fra EFD.

FIGURTEKSTER

Figur 1. Effekt av saratin på renset human-vWF-binding til humankollagentypene I (ringer) og III (firkanter), og kalvehudkollagen (trekanter). IC50med type I = 0,23 0,004 ug ml"<1>, type III = 0,81 ± 0,04 ug ml"<1>og kalvehudkollagen = 0,44 ± 0,008 ug ml"<1>. Figur 2. Effekt av skjærkraft på inhiberingen av blodplateaggregatdannelse ved hjelp av saratin på humant kollagen type III i et strømningskammer in vitro. Ringer angir en skjærhastighet på 2700 s"<1>(IC50= 0,96 ± 0,25 ug ml"<1>), mens firkanter angir en skjærhastighet på 1300 s"<1>(IC505,2 ± 1,4 ug ml"<1>). Figur 3. Schatchard-analyse av saratinbinding til immobilisert humankollagen som påvist ved hjelp av overflateplasmonresonans, som indikerer tilstedeværelsen av et bindingssete med høy affinitet (IQ = 5x10" M, heltrukket linje) og med lav affinitet Kd= 2 x IO"<6>M, brutt linje) for saratin på kollagen III. Figur 4. Antall blodplater festet til den eksponerte subendoteloverflate 3 etter halspulsåreendarterektomi, som sammenlikner saratin-applikasjon (n = 7) og kontrollgrupper (n = 10). Data er gjennomsnitt ± SE. Saratingruppen fikk 5 ul saratin-oppløsning tilført topisk til den eksponerte subendoteloverflate. Stjerne angir en P-verdi på 0,05. Figur 5. Antall blodplater festet til den eksponerte subendoteloverflate 24 timer etter halspulsåreendarterektomi som sammenlikner saratin-applikasjon (n = 9) og kontrollgrupper (n = 10). Data er gjennomsnitt ± SE. Blodplater ble tellet ved å anvende skanner-elektronmikroskop. Saratin-gruppen fikk 5 ul saratin-oppløsning tilført topisk til den eksponerte subendoteloverflate. Stjerne angir en P-verdi på 0,01. Figur 6. Elektronmikrografi (2000 x) av en endarterektomisert rottehalsarterie 3 timer etter halspulsåreendarterektomi. A, kontrolloverflate. B, overflate som fikk topisk saratin (5 ul). Kontrolloverflaten oppviser rikelig med cellulære elementer inkludert fibrintråder, røde blodlegemer og blodplater. Den saratin-behandlede overflate oppviser en markert reduksjon i cellulære elementer. Figur 7. Elektronmikrografi (2000 x) av en endarterektomisert rottehalsarterie 24 timer etter halspulsåreendarterektomi. A, kontrolloverflate. B, overflate som fikk topisk saratin (5 ul). Kontrolloverflaten oppviser et stort antall røde blodlegemer og blodplater. Den saratin-behandlede overflate oppviser en markert reduksjon i blodplateadhesjon. Figur 8. Prosent hulromsstenose etter intimal hyperplasi 2 uker etter halspulsåreendarterektomi. Saratin (n = 15) og en kontrollgruppe (n = 10) er vist. Saratin-gruppen fikk 5 ul saratin tilført topisk til den eksponerte subendoteloverflate. Stjerne angir en P-verdi på 0,004. Figur 9. Tverrsnitt gjennom halsarterier som viser reduksjon av intimal hyperplasi i saratin-behandlede arterier (B) sammenliknet med den ubehandlede kontroll (A) hos rotten. IH = intimal hyperplasi.

Tabell 1. IC50-konsentrasjoner av saratin som er nødvendig for å inhibere blodplateadhesjon i PRP fra forskjellige arter som bindes til humankollagentypene I og III, og kalvehudkollagen.

Tabell 2. Effekt av saratin på den maksimale blodplateaggregasjon (%) i PRP indusert ved hjelp av forskjellige agonister, med sluttkonsentrasjoner av reagenser som angitt.

Tabell 3 Preoperative og postoperative blødningstider og blodplatetellinger.

Claims (7)

1. Anvendelse av polypeptidet saratin til fremstilling av et medikament for inhibering av blodplateakkumulering etter vaskulære skader eller endarterektomi, som omfatter administrering til blodkarvevet av en terapeutisk effektiv mengde av saratin som forhindrer blodplateadhesjon, for derved å inhibere trombose og restenose.

2. Anvendelse ifølge krav 1, hvor den vaskulære skade er forbundet med aterosklerose, hjertetransplantasjonsvaskulopati, koronar stenose etter koronar intervensjon, ballongangioplastikk, stentplassering, rotablasjon, endarterektomi, inkludert halspulsåreendarterektomi, dialysetransplantatshunter og andre transplantatanastomoser, ustabil angina, akutt hjerteinfarkt, slag, godartet hypertrofi eller godartet prostatahypertrofi.

3. Anvendelse ifølge krav 1, hvor saratinet administreres lokalt via et kateter, eller hvor saratin er inkorporert i endoluminal belegning av et kateter som er rettet lokalt mot vevet.

4. Anvendelse ifølge krav 1, hvor saratin er inkorporert i en lokalt administrert polymer som muliggjør lokal forsinket frigjørelse av saratin.

5. Anvendelse ifølge krav 4, hvor det polymerformulerte saratin administreres lokalt via et kateter.

6. Anvendelse ifølge krav 1, hvor saratin er inkorporert i stent eller et stentbelegg som er plassert lokalt på eller i vevet.

7. Anvendelse ifølge krav 1, hvor saratin er inkorporert i et endovaskulært implantat eller et endovaskulært implantatbelegg som er plassert lokalt på eller i vevet.