Opis wynalazku Dziedzina techniki Wynalazek dotyczy polipeptydu o nazwie Saratyna, który w istotny sposób obni za adhezj e oraz gromadzenie si e p lytek krwi po uszkodzeniach naczy n takich jak endarterektomia. Ponadto wynalazek dotyczy inhibicji, zale znego od vWF wi azania p lytek do kolagenów scianek naczy n w warunkach pod- wy zszonego scinania, a dok ladniej jego przedmiotem jest nowe medyczne zastosowanie Saratyny jako inhibitora zakrzepicy, przy czym rzeczony polipeptyd mo ze by c stosowany lokalnie jako srodek miejscowy lub jako pow loka urz adze n medycznych. Stan techniki Adhezja komórek krwi, w szczególno sci p lytek krwi do scianek uszkodzonych naczy n jest zna- nym zjawiskiem w angioplastyce oraz zabiegach chirurgicznych. Uszkodzenia takie mog a wyst epowa c podczas ró znych interwencji chirurgicznych lub terapii przezskórnych, które opracowano z my sla o ponownym otwieraniu zablokowanych kana lów, przewodów oraz innych elementów prze switowych, w celu usuwania tkanek oraz implantowania zast epczych tkanek lub ich komponentów. Opracowano ró zne typy technik inwazyjnych, które umo zliwiaj a redukcj e lub usuni ecie blokady naczynia krwiono snego, zwi ekszaj ac w konsekwencji przep lyw krwi przez naczynie. Jedn a z technik leczenia stenozy (zw ezenia) lub zamkni ecia naczynia krwiono snego jest przezskórna angioplastyka balonikowa. Balonikowy cewnik przepycha si e przez uk lad t etnic pacjenta i wprowadza si e go do ob- szaru przewezenia lub blokady. Nast epnie balonik nadmuchuje si e w celu rozszerzenia zaw ezonego obszaru. Przezskórna angioplastyka sródnaczyniowa (percutaneous transluminal angioplasty-PTCA) jest najcz esciej stosowan a metod a angioplastyki u zywan a do otwierania zablokowanych t etnic w mia zd zycy t etnic. Zwykle zabiegi angioplastyczne daj a swietne rezultaty, umo zliwiaj ac unikni ecie chirurgii by-passowej, jednak ze u oko lo 30-40% pacjentów po pocz atkowym pozornym poszerzeniu t etnicy mo ze wyst api c ponowne zw ezenie naczynia (restenoza), które wyst epuje po 3 do 9 miesi acach. W przypadku powa znej restenozy pacjent mo ze wymaga c ponownego zabiegu angioplastyki, któremu cz esto towarzyszy c musi implantacja stentu pe lni acego w naczyniu rol e rusztowania. W innych wypadkach konieczna mo ze by c rekonstrukcja t etnic metodami chirurgii by-passów, które s a zabiegami wy zszego ryzyka. Poniewa z obecnie na swiecie wykonuje si e rocznie ponad 800 tysi ecy zabiegów PTCA, socjoekonomiczne implikacje poziomu restenozy na poziomie 30-40% sta- nowi a powa zny problem kardiologii inwazyjnej. Restenoza jest cz esto wywo lana uszkodzeniem scianki naczynia w wyniku nadmiernego roz- ciagni ecia przez balonik oraz mo zliwo sci uszkodze n wywo lywanych przez przewody cewników. W kolejnych miesi acach prowadzi c to mo ze do przerostu miesniówki g ladkiej t etnicy a w konsekwencji do ponownego zamykania t etnicy (restenozy). Ze wzgl edu na mo zliwe komplikacje, zwi azane z restenoza i obawy przed rozszerzaniem si e wrzodziej acego czopu zatorowego oraz zwi azanych z tym powa znych komplikacji, zastosowanie po- nownej angioplastyki w t etnicy szyjnej powa znie ogranicza mo zliwo sci interwencji minimalnie inwazyjnej. W zwi azku z powy zszym czyni si e powa zne wysi lki w kierunku opracowania leczenia blokady, prowadz acej do mózgu t etnicy szyjnej, na drodze interwencji innych typów. Endarterektomia szyjna jest chirurgiczn a metod a usuwania blokady z t etnic szyjnych. Stanowi ona jeden z najpopularniejszych zabiegów chirurgii naczyniowej wykonywanej w USA. Wyniki wielu o srodków wykaza ly jego skutecznosc w leczeniu zewn atrz czaszkowej choroby t etnicy szyjnej zarów- no u pacjentów, u których obserwuje si e symptomy choroby oraz u tych bez zadnych jej objawów (JAMA 1995; 273: 1421-28; N. Engl. J. Med. 1981/1991; 325: 445-53). Zabiegów endarterektomii u zy- wa si e tak ze w przypadku innych chorób naczyniowych o charakterze blokady w innych z lo zach na- czyniowych (Vasc. Surg. 1999; 33: 461-70). Podczas endarterektomii, t etnic e szyjn a rozcina si e, a p lytk e usuwa si e z naczynia w obszarze naci ecia. Podczas zabiegu chirurgicznego rozga lezienie t etnicy szyjnej eksponuje si e przez naci ecie w szyi pacjenta, umieszcza si e zaciski na ka zdej stronie blokady w celu jej odizolowania i wykonuje sie naci ecie w celu otwarcia t etnicy. Usuwa si e blokad e, wyizolowany obszar przep lukuje si e, poddaje wysysaniu (aspiration), a t etnic e zaszywa si e. Usuwa si e zaciski oraz przywraca cyrkulacj e krwi w t etnicy. Czop zatorowy (emboli) oraz szcz atki (debris), które wyst epuj a w obr ebie zacisków mog a by c przyczyn a istotnych problemów po otwarciu t etnicy szyjnej w celu przywrócenia przep lywu w ob- szarze, który by l poprzednio odizolowany.PL 203 469 B1 3 Chocia z endarterektomia jest skuteczn a terapi a, cz esto pozostawia wyeksponowane warstwy zewn etrzne (przydanki, fibroblasty) naczynia oraz du ze obszary podatnej na zakrzepy warstwy pod- sródb lonkowej (subendotelium). Pomimo skuteczno sci endarterektomii t etnicy szyjnej operacja ta prowadzi c mo ze do komplikacji, w tym zakrzepów oraz rozrostu b lony wewn etrznej (intimal hyperpla- sia), które s a przyczyn a komplikacji znosz acych pozytywne efekty wykonanego zabiegu lub te z sta- nowi a zród lo nowych problemów. Badania kliniczne wykaza ly wyst epowanie, w okresie nast epuj acym bezpo srednio po operacji, udaru na poziomie 1-10%, przy czym prawie we wszystkich przypadkach przypisano go tworzeniu skrzepów w miejscu endarterektomii, a nast epnie tworzeniu si e mózgowego czopu zatorowego (Stro- ke 1984; 15: 950-55). Akumulacja p lytek krwi mo ze tak ze by c przyczyn a restenozy wywo lanej rozro- stem warstwy wewn etrznej, który wyst epowa c mo ze w okresie dwóch lat po operacji. Stwierdzono, ze w okresie 2-5 lat po operacji restenoza wyst epowa c mo ze u 10-20% populacji wszystkich pacjentów, u których wykonano endarterektomi e. Wi ekszosc tych przypadków zwi azana jest z rozrostem warstwy wewn etrznej, pogrubieniem warstwy wewn etrznej oraz zmniejszeniem przekroju naczynia. Efekty takie udokumentowano metod a dupleksowego skaningu ultrasonograficznego (J.Vasc.Surg. 1986; 3: 10-23). Komórkowa oraz molekularna odpowied z scianki naczynia na urazy indukowane mechanicznie, inwazj e chirurgiczn a, umieszczenie stentu, umieszczenie przeszczepu naczyniowego (przeszczep t etniczy lub sztuczne po laczenie t etniczo- zylne na przyk lad przeszczep dialityczny) jest skomplikowa- n a interakcj a zapalenia, migracji komórki mi esniówki g ladkiej, proliferacji oraz transformacji miofifbro- blastu, pojawiaj acych si e wraz z wyst apieniem urazu (Futura; 1997. str. 289-317). W przypadku kiedy t etnica jest w powa znym stopniu uszkodzona przez chorob e oraz prawdopodobnie uleg la stwardnieniu na skutek odk ladania si e wapnia, interwencja mo ze tak ze spowodowa c dodatkowe uszkodzenie, któ- remu towarzyszy lokalna deendotelializacja oraz wyeksponowanie lezacych poni zej komponentów macierzy zewn atrzkomórkowej takich jak kolagen oraz elastyna. U niektórych pacjentów nadmierny przyrost p lytek krwi oraz fibrynogenu mo ze w nast epstwie wywo lywa c ostr a blokad e zakrzepow a. Badania, w których u zywano modeli endarterektomizowanych t etnic szczura (Neurosurg 1985; 16: 773-79) oraz modeli uszkodze n embolektomii balonikowej (Lab. Invest 1983; 49: 327-33) wykaza- ly, ze w czasie gdy komórki warstwy sródb lonkowej s a odkrywane podczas uszkodzenia naczynia, p lytki krwi zaczynaj a przywiera c do ods loni etej warstwy pod sródb lonkowej. Spallone et al. (Neurosurg 1985; 16: 773-79) stosuj ac skaningow a mikroskopi e elektronow a wykazali, ze piec minut po endarte- rektomii t etnicy szyjnej u szczura, w obszarze uszkodzenia tworzy si e pojedyncza warstwa p lytek krwi. Pi etna scie minut po uszkodzeniu obserwuje si e agregacj e p lytek krwi oraz tworzenie skrzepu. Trzy- dzie sci minut po endarterektomii miejsce to pokryte jest aktywowanymi p lytkami krwi oraz powleczone fibryn a i czerwonymi cia lkami krwi. Tworzenie skrzepu osi aga swoje maksimum w trzy godziny po uszkodzeniu. Obserwuje si e wówczas grub a warstw e fibryny i p lytek krwi. P lytki krwi s a integralnym komponentem procesu tworzenia skrzepu, a w konsekwencji zakrzepicy, jednak zdaj a si e tak ze od- grywa c wa zn a rol e przy rozro scie warstwy wewn etrznej. Badania szczurów z trombocytopeni a wykaza ly tak ze znacz ace, w porównaniu do szczurów kontrolnych, obni zenie pogrubienia warstwy wewn etrznej, nast epuj ace po uszkodzeniu t etnicy szyjnej. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1989; 86: 8412-16). Z chwil a kiedy p lytki krwi przywr a do wyeksponowanej warstwy pod sródb lonkowej uszkodzonego naczynia aktywuj a si e i uwalniaj a swoje granule. Granule te zawieraj a czynniki naczyniowo aktywne oraz zakrzepowe (serotonin e, ADP, fibrynogen, czynnik Von Willebranda, tromboksan A2) oraz czynniki wzrostu (czynnik wzrostu pochodz acy z p lytek krwi, trans- formuj acy czynnik wzrostu beta oraz epidermalny czynnik wzrostu) (Circulation 1985; 72: 735-40). Dok ladne mechanizmy wzrostu, w wyniku których p lytki wspomagaj a rozrost warstwy wewn etrznej nie s a jeszcze ca lkowicie zrozumia le. Badania sugeruja, ze p lytki krwi dostarczaj a bodziec chemotaktycz- ny dla po sredniej migracji komórek miesniówki g ladkiej do warstwy wewn etrznej, w drugiej fazie rozro- stu warstwy wewn etrznej (Vasc. Surg. 1991; 13: 885-91). Inne badania z zastosowaniem przeciwcia l anty-PDGF wykaza ly istotn a rol e jak a odgrywa PDGF w narastaniu komórek mi esniówki g ladkiej no- wej warstwy wewn etrznej (neointimal) po uszkodzeniu naczynia (Science 1991; 253: 1129-32). Innym mechanizmem, w wyniku którego p lytki krwi mog a wzmaga c rozrost warstwy wewn etrznej jest akty- wacja kaskady koagulacyjnej, a w konsekwencji akumulacja trombiny w miejscu uszkodzenia. Pewne badania wykaza ly dzia lanie mitogeniczne trombiny na komórkach mi esniówki g ladkiej (J. Clin. Invest. 1993; 91: 94-98, J. Vasc. Surg. 1990; 11: 307-13). Dodatkowo wykazano, ze trombina stanowi stymu- lator aktywacji p lytek krwi. Nie wchodz ac w szczegó ly tego precyzyjnego mechanizmu, adhezja oraz aktywacja p lytek krwi w miejscu uszkodzenia naczyniowego odgrywa istotn a rol e w rozwoju zakrzepicyPL 203 469 B1 4 oraz rozro scie warstwy wewn etrznej, a co za tym idzie hamowanie adhezji oraz aktywacji plytek krwi mog a by c pomocne w zapobieganiu lub obni zaniu tempa zakrzepicy oraz rozrostu warstwy wewn etrznej. W przywieraniu p lytek krwi do uszkodzonej scianki t etnicy po sredniczy w pierwszej kolejno sci czynnik Willebranda (von Willebrand factor-vWF), multimerowa glikoproteina, która uwalniana jest przez komórki warstwy sródb lonkowej i cyrkuluje w osoczu krwi, gdzie pe lni rol e no snika bia lka dla czynnika VIII (Annu. Tev. Biochem. 1998; 67: 395-424). Czynnik vWF o wysokim stopniu multimeryza- cji cyrkuluje równie z jako sk ladnik alfa granuli p lytek krwi, sk ad uwalniany jest po aktywacji p lytek krwi (Annu. Tev. Biochem. 1998; 67: 395-424). W warunkach podwy zszonego scinania, jakie spotyka si e w t etnicach w miejscach p lytek mia zd zycowych lub inwazji mechanicznych, vWF mo ze wi aza c si e poprzez swoj a domen e A3 z w lóknami kolagenu, które eksponowane s a na powierzchni (Biochemistry 1986; 25(26): 8357-8361, Blood 1987; 70(5): 1577-1583, J. Biol. Chem. 1987; 262(28): 13835-13841). Czynnik vWF zwi azany z kolagenem "wi ezi" z kolei p lytki poprzez zale zna od scinania ekspozycj e epitopu w domenie vWF-A1, która oddzia luje z p lytkami krwi GPIb/IX/V (Blood 1985; 65(1): 85-90, Blood 1985; 65(4): 823-831, Br. J. Haematol 1986; 63(4): 681-691). Tak wi ec, vWF dzia la jak pomost mi edzy kolagenem a p lytkami krwi i jest wst epnym i koniecznym warunkiem adhezji p lytek krwi do kolagenu w warunkach przep lywu (J. Lab. Clin. Med. 1974; 83(2): 296-300). Wynikiem przetaczania sie p lytek krwi nad vWF jest s laba adhezja. Dla u latwienia trwa lej adhezji, aktywacji i agregacji p lytek krwi, konieczne s a jednak dodatkowe bezpo srednie interakcje mi edzy kolagenem a innymi receptora- mi na powierzchni p lytek krwi (Thromb. Haemost 1997; 78(1): 434-438, Thromb. Haemost 1997; 78(1): 439-444). Bezpo srednie receptory kolagenu na p lytkach krwi obejmuj a GP VI (Blood 1987; 69(6): 1712-1720, Thromb. Haemost 1999; 81(5): 782-792, J. Clin. Irwest. 1989; 84(5): 1440-1445), GP la/lla ( a 2 / ß 1 ) (J.Clin. Irwest. 1989; 84(5): 1440-1445, Nature 1985; 318(6045): 470-472) i w mniej- szym stopniu GP IV (CD36) (J.Biol. Chem. 1989; 264(13): 7576-7538/7583) i prawdopodobnie p65 (J.Clin. Invest. 1997; 100(3): 514-521). W warunkach, kiedy nie wyst epuje wi azanie p lytek, w którym uczestniczy vWF receptory te, jak wykaza ly badania, s a zbyt s labe by po sredniczy c w narastaniu p lytek na kolagenie podczas przep lywu (Br. J. Haematol 1986; 63(4): 681-691). W ko ncu vWF w po laczeniu z fibrynogenem umo zliwia sieciowanie i dalsz a aktywacj e p lytek krwi poprzez wi azanie z p lytkami GP llb/llla (J. Clin. Invest. 2000; 105(6): 783-791), co zapewnia stabilno sc oraz wytrzyma lo sc tworz acego sie skrzepu. Wraz z pojawieniem si e w ostatnich latach antagonistów p lytek krwi GP llb/llla oraz receptorów ADP dokonano wielkiego post epu w terapii przeciwagregacyjnej (Coronary Art. Dis 1999; 10(8): 553-560, J. Am. Coll. Surg. 2000; 191(1): 76-92). Strategie te nie s a jednak ze opracowane z my sl a o hamowa- niu pierwotnej adhezji p lytek krwi do ods loni etych w lókien kolagenu i pomimo skuteczno sci antagoni- stów GP llb/llla w t lumieniu oddzia lywa n: p lytka krwi-p lytka krwi, zjawisko przywierania p lytek krwi do uszkodzonej scianki naczynia jest ci agle istotnym problemem (Blood 1993; 81(5): 1263-1276, Circula- tion 1995; 91(5): 1354-1362). Ponadto aktywacja p lytki krwi prawie na pewno wykracza poza agrega- cje oraz ostr a zakrzepic e, przy czym progresja stanów przed ostrym rozrostem warstwy wewn etrznej oraz chronicznym rozrostem warstwy wewn etrznej, przynajmniej czesciowo zale zy od mediatorów mitogenicznych, takich jak czynnik wzrostu pochodz acy od p lytek krwi (platelet derived growth factor- PDGF), uwalniany poprzez aktywacj e p lytek krwi. W rzeczy samej dowiedziono, ze hamowanie PDGF redukuje rozrost warstwy wewn etrznej u ró znych gatunków zwierz ecych (Science 1991; 253(5024): 1129-1132, Circulation 1999; 99(25): 3292-3299). Patofizjologiczne znaczenie vWF sugerowane jest wzrostem poziomu vWF w uk ladzie kr azenia pacjentów z ostrym zawa lem mi esnia sercowego (Thromb Haemost 2000; 84: 204-209, Circulation 1998; 98(4): 294-299), przy czym poziom ten wykazywa l dodatni a korelacje z przypadkami o z lych rokowaniach (Circulation 1998; 98(4): 294-299). Badania in-vivo wykaza ly ponadto, ze neutralizacja przeciwcia l anty-vWF hamuje eksperymentaln a zakrzepic e, potwierdzaj ac istotn a rol e vWF w tworze- niu skrzepu (Thromb Haemost 1998; 79(1): 202-210). Ponadto wobec coraz szerszego stosowania technik angioplastyki w ostrych zespo lach wie ncowych, których rezultatem jest niezmiennie uszko- dzenie scianek naczynia i ekspozycja kolagenu, istnieje koniecznosc opracowania strategii interwencji farmakologicznej na mo zliwie wczesnym etapie kaskady adhezji-aktywacji-agregacji p lytek krwi. Dwa podstawowe kierunki terapii, które s a obecnie stosowane w celu kontrolowania adhezji p ly- tek krwi, ich aktywacji i nast epuj acej po tym zakrzepicy oraz rozrostu warstwy wewn etrznej, polegaj a na u zyciu srodków o dzia laniu skierowanym przeciw p lytkom krwi oraz srodków przeciwzakrzepowym. Chocia z leki takie jak aspiryna skutecznie blokuj a syntez e tromboksanu A2 poprzez hamowanie szla- ków cyklooksygenazy, nie zapobiegaj a one adhezji i aktywacji p lytek krwi indukowanej kolagenem,PL 203 469 B1 5 co stymuluje rozrost warstwy wewn etrznej. Zastosowanie heparyny jako srodka przeciwzakrzepowego wiaze si e z komplikacjami i ograniczeniami, w tym mi edzy innymi brakiem mo zliwo sci przewidywania odpowiedzi, jaka towarzyszy okre slonej dawce, konieczno scia monitoringu laboratoryjnego, ograni- czon a aktywno scia wzgl edem trombiny zwi azanej w skrzepie, wyst epowaniem wielokrotnych miejsc inhibitorowych, zale zno sci a od przeciwtrombiny III, ryzykiem powa znych krwawie n oraz konieczno sci a ciag lych infuzji. Oczywistym jest, ze idealny srodek terapeutyczny powinien dzia la c specyficznie wo- bec miejsca wi azania oraz wywo lywa c zlokalizowane efekty, bez dzia lania ogólnoustrojowego lub ogólnej koagulopatii. Wydaje si e, ze istotne etapy, które przyspieszaj a kaskad e efektów prowadz acych do zakrzepicy a nast epnie rozrostu warstwy wewn etrznej, rozpoczynaj a si e od interakcji pomi edzy wyeksponowa- nym kolagenem warstwy pod sródb lonkowej w miejscu uszkodzenia naczynia oraz pojedynczej war- stwy p lytek krwi, które przywieraj a do ods loni etego kolagenu. St ad te z specyficzny inhibitor adhezji p lytek krwi do kolagenu warstwy pod sródb lonkowej mo ze s luzy c do zapobiegania lub co najmniej obni zenia rozwoju skrzepimy oraz rozrostu warstwy wewn etrznej. W literaturze tematu mo zna znale zc informacje, ze kilka substancji wyodr ebnionych z pijawek hamuje interakcje mi edzy kolagenem a p lytkami krwi (Blood, 1995; 85(3): 705-711, Platelets 2000; 11(2): 83-86, J. Biol. Chem. 1992; 267(10): 6893-6898, J. Biol. Chem. 1992; 267(10): 6899-6904, Blood Coagul Fibrynolysis 1991, 2(1): 179-184). Doniesiono, ze destabilaza wyizolowana z Hirudo medicinalis, która jest izopeptydaz a o dzia laniu depolimeryzacyjnym, hamuje agregacj e indukowan a przez ró znych antagonistów, w tym kolagen, przy czym s adzi si e, ze wiaze si e ona bezpo srednio do b lony p lytek krwi (Platelets 2000; 11(2): 83-86). Bia lko pijawek przeciw p lytkom krwi (leech antiplatelet protein-LAPP) jest bia lkiem o masie oko lo 13 kDA, wyizolowanym ze sliny Haementeria officinalis. Hamuje ono adhezj e p lytek krwi do kolagenu w warunkach statycznych (J. Biol. Chem. 1992; 267(10): 6899-6904, Thromb Haemost 1999; 82(3): 1160-1163) 267(10): 6899-6904), Thromb. Haemost 1999,82(3): 1160-1163) oraz warunkach podwy zszonego przep lywu (Arterioscler Thromb. Vasc. Biol. 1995, 15(9): 1424-1431), przy czym dzia la na wi azanie kolagenu, w którym po srednicz a zarówno vWF jaki i p lytki krwi GP la/lla (Thromb. Haemost 1999, 82(3): 1160-1163). Kalina (calin) jest bia lkiem o masie oko lo 65 kDA, wyodr ebniona z Hirudo medicinalis jest bia lkiem o podobnej charakterystyce. Kalina równie z hamuje interakcje mi edzy kolagenem a p lytkami krwi, zarówno w warunkach statycz- nych jak i warunkach przep lywu (Blood, 1995; 85(3): 705-711, Blood Coagul Fibrynolysis 1991, 2(1): 179-184, Thromb. Haemost 1999, 82(3): 1160-1163). Ponadto zarówno LAPP jak i kalina s a silnymi inhibitorami, indukowanej kolagenem agregacji p lytek krwi, przy czym hamuj a one agregacj e przy st ezeniach bardzo podobnych do tych, które blokuj a wi azanie vWF z kolagenem (J. Biol. Chem. 1992; 267(10): 6893-6898, Blood Coagul Fibrynolysis 1991, 2(1): 179-184, Blood 1995, 85(3): 712-719). Zarówno LAPP jak i kalina zosta ly z ró znym rezultatem przetestowane w modelach zakrzepicy in vivo. LAPP nie wykazywa lo aktywno sci w kierunku ograniczania tworzenia skrzeplin na przeszcze- pach pokrytych kolagenem w sztucznej przetoce t etniczo- zylnej u pawiana, pomimo zastosowania dawek, które inhibitowa ly kolagenow a indukcj e agregacji p lytek krwi (Arterioscler Thromb 1993, 13(11): 1593-1601), podczas gdy kalina w sposób zale zny od dawki inhibitowa la tworzenie skrzepliny w modelu zakrzepicy zylnej chomika (Blood 1995, 85(3): 712-719). W znanym stanie techniki opisane s a nie tworz ace skrzepliby (nietrombogeniczne) oraz prze- ciwzakrzepowe (przeciwtrombogeniczne) pow loki stentów oraz cewników. Nietrombogeniczne Pow loki oraz produkty nie tworz ace skrzepliny oparte s a na technologicznie zaawansowanych polimerach. Przyk lady podane s a w opisach patentowych WO 93/01221 oraz WO 98/30615. Pow loki przeciwzakrzepowe oraz przeciwdzia laj ace restenozie s a g lównie pow lokami biokom- patybilnymi, które mog a tak ze s lu zy c jako zasobniki do miejscowego dostarczania leków. Pow loki te oparte s a g lównie na hydro zelach, a ich przyk lady znale zc mo zna w literaturze patentowej opisuj acej ró zne metody przygotowywania hydro zeli oraz powlekania urz adze n medycznych, obejmuj acej opisu patentowe WO 92/11896, WO 98/11828, WO 01/47572, EP 0887369 oraz WO 01/39811. Krzywa uwalniania substancji terapeutycznych, które zawarte s a w pow loce mo ze by c regulo- wana poprzez, na przyk lad zmian e grubo sci warstw polimeru lub przez wybór specyficznego pokrycia polimerowego, które wp lywa na wybrane w la sciwo sci fizykochemiczne (takie jak ladunek, hydrofobo- wo sc, hydrofilowo sc) i/lub przez preparowanie pow loki w postaci ró znych warstw. Kryteria wyboru polimeru oraz optymalizacji szybko sci uwalniania s a znane ze stanu techniki. Inne pow loki opisano w Fischell Circulation, 1986, 94: 1494-95), Topol et al. (Circulation, 1998, 98: 1802-20) oraz McNair et al. w Device Technology, 1996, 16-22.PL 203 469 B1 6 Zastosowanie stentów, drutów oraz cewników w uk ladzie sercowo-naczyniowym stanowi po- wszechn a praktyk e. Uszkodzenie scianki naczynia, embolizacja oraz nast epuj aca restenoza to g lówne problemy kardiologii podczas i po interwencji chirurgicznej lub cewnikowaniu. Alternatywne metody, takie jak endarterektomia s a przyczyn a podobnych problemów. Wszystkie zabiegi, w których t etnice podlegaj a manipulacji, to znaczy chirurgia naczy n i angioplastyka, s a podatne na wyst epowanie roz- rostu warstwy wewn etrznej. U zyteczno sci metod zapobiegania lub minimalizacji rozrostu warstwy wewn etrznej nie mo zna przeceni c, a korzy sci zastosowania metody, która by laby zdolna dawa c takie efekty bez wywo lywania równoczesnych efektów ogólnoustrojowych by lyby jeszcze bardziej znacz ace. St ad te z oczywista staje si e konieczno sc prac nad nowymi ulepszonymi lekami oraz sposobami inhibicji najwcze sniejszych procesów patofizjologicznych (na przyk lad adhezji p lytek krwi). S adzi si e, ze osi agni ecia w tym zakresie w istotny sposób obniza zachorowalno sc i smiertelno sc zwi azan a z zabiegami chirurgicznymi oraz angioplastyka. Opis wynalazku Ogólnie, wynalazek dotyczy wprowadzania ostatnio opisanego inhibitora adhezji p lytek krwi- Saratyny, do lub na wybrane miejsce w obszarze prze switu lub na prze swicie w tkance, to znaczy uk ladu naczyniowego lub organu, w takich warunkach, ze Saratyna mo ze by c zastosowana w postaci srodka o dzia laniu miejscowym lub w postaci pokrycia przywieraj acego do powierzchni, w celu zapo- biegania oraz hamowania niepo zadanej odpowiedzi zakrzepowej i/lub restenozy w nast epstwie uszkodzenia scianki naczynia, w tym uszkodzenia zwi azanego z angioplastyka, aplikacj a stentu, prze- szczepami dialitycznymi, innymi przeszczepami naczyniowymi oraz leczenia tworz acych si e lagod- nych hipertroficznych blizn, jak równie z leczenia i pasywacji niestabilnych p lytek mia zd zycowych. Saratyna zosta la ostatnio przedstawiona w opisie patentowym WO 00/56885 jako rekombino- wane bia lko o masie 12 kD, które wyodr ebniono z pijawki. Bia lko to hamuje zale zne od vWF wi azanie p lytek krwi do kolagenu scianek naczy n w warunkach podwy zszonego scinania, st ad odmian a wyna- lazku jest zastosowanie Saratyny do inhibicji zakrzepicy t etnic. Inn a now a odmian a wynalazku jest zastosowanie Saratyny jako czynnika lokalnego w miejscu uszkodzenia, korzystnie redukuj ace za- krzepic e i/lub rozrost warstwy wewn etrznej, bez jakichkolwiek efektów ogólnoustrojowych. Saratyna jest wi ec srodkiem o dzia laniu specyficznym jak i miejscowym, dlatego te z jest odpowiednia do zasto- sowania zarówno w chirurgii jak i w radiologii inwazyjnej. Saratyna laczona mo ze by c z ró znymi srodkami terapeutycznymi w celu jej transportu do miej- sca przeznaczenia. Przyk ladami w zastosowaniach t etniczo-wie ncowych s a srodki przeciwzakrzepo- we, na przyk lad prostacykliny i salicylany, srodki rozpuszczaj ace skrzepy, na przyk lad streptokinaza, urokinaza, tkankowy aktywator plazminogenu (TPA) oraz anizoilowany aktywatorowi kompleks strep- tokinazy z plazminogenem (anisoylated plasminogen streptokinase complex-APSAC), srodki rozsze- rzaj ace naczynia, to znaczy azotany, leki blokuj ace kana ly wapniowe, srodki przeciwproliferacyjne, takie jak kolchicyna oraz srodki alkiluj ace, srodki interkaluj ace, czynniki modulacji wzrostu, takie jak interleukiny, transformuj acy czynnik wzrostu beta oraz kongenery czynnika wzrostu pochodz acego z p lytek krwi, przeciwcia la monoklonalne przeciw czynnikom wzrostu, steroidowe i niesteroidowe srodki przeciwzapalne oraz inne srodki, które mog a modulowa c napi ecie, funkcj e i mia zd zyc e naczy n oraz ich odpowied z na leczenie poinwazyjnych uszkodze n naczy n lub organu. W kombinacjach lub pokryciach mo zna tak ze u zywa c antybiotyków. Ponadto dla zogniskowania transportowanego leku w obszarze scianki naczy n mo zna zastosowa c pow loki. Poprzez wprowadzenie srodka aktywnego do polimeru, który posiada zdolno sc p ecznienia, srodek aktywny mo ze by c uwalniany podczas p ecznie- nia polimeru. Pokrycie mo zna te z wykona c z hydro zelu, takiego jak tlenek polietylenu, albumina, hy- drofilowe polimetakrylany oraz hydrofilowe poliuretany. Istot a wynalazku jest zatem zastosowanie polipeptydowej Saratyny do wytwarzania leku do inhibicji akumulacji p lytek krwi po uszkodzeniach naczy n lub endarterektomii, obejmuj ace podawanie do tkanki naczynia terapeutycznie skutecznej ilo sci Saratyny, inhibituj acej adhezj e p lytek krwi, przez co inhibituje zakrzepic e i restenoz e. W zastosowaniu wed lug wynalazku uszkodzenie naczynia zwi azane jest z mia zd zyc a t etnic, pa- tologi a naczyniow a (waskulopati a) przeszczepu serca, restenoza wie ncow a po interwencji wie ncowej, angioplastyka balonikow a, umieszczeniem stentu, rotablacj a, endarterektomi a, w tym endarterektomi a t etnicy szyjnej, zespoleniem obocznym przeszczepu dialitycznego, innymi zespoleniami przeszczepo- wymi, niestabiln a angin a, ostrym zawa lem mi esnia sercowego, udarem, lagodn a hipertrofi a lub lagod- n a hipertrofi a prostaty.PL 203 469 B1 7 Saratyn e podaje si e korzystnie miejscowo przez cewnik lub wprowadza si e j a do pow loki endo- luminalnej cewnika, który skierowany jest miejscowo do tkanki. Korzystne jest tak ze wprowadzanie Saratyny do polimeru zastosowanego miejscowo, dla miej- scowego podtrzymywanego uwalniania Saratyny, a szczególnie korzystne jest podawanie takiego preparatu polimeru z Saratyna miejscowo przez cewnik. Saratyna mo ze by c tak ze aplikowana do tkanek organizmu samoistnie lub w polaczeniu z innymi srodkami terapeutycznymi poza macierz a polimerow a z zastosowaniem cewników. Podstawowym wymogiem dotycz acym materia lu polimerowego, który mo ze by c zastosowany w tej metodzie jest biokompatybilno sc oraz w lasno sci pozwalaj ace na uwalnianie leku, które mog a by c odpowiednio do- stosowane do specyficznego zastosowania. Podawanie Saratyny w kompozycjach, pozwala na wymywanie sci sle okre slonych ilo sci Saraty- ny w okre slonym czasie i obszarze. Lokalnie kontrolowane uwalnianie Saratyny mo zna uzyska c wy- lacznie na drodze przepuszczalno sci, wy lacznie jontoforezy, wy lacznie elektroporacji lub te z w celu efektywnego uwalniania i w laczania Saratyny w obszarze prze switu naczynia mo zna zastosowa c po- laczenie techniki jontoforezy oraz elektroporacji. W celu przeprowadzenia opisanych zabiegów zapro- jektowanych z my sl a o uzyskaniu wysokiego st ezenia leku w wybranej przestrzeni naczynia w taki sposób, ze uzyskuje si e lepsze pokrycie naczynia sam a Saratyna lub dodatkowymi srodkami leczni- czymi, korzystnie zastosowa c mo zna cewnik. Saratyn e mo zna te z korzystnie wprowadza c do stentu lub jego pow loki b ad z do endonaczynio- wego przeszczepu lub jego pow loki, które umieszcza si e miejscowo na lub w tkance. Wynalazek nadaje si e w szczególno sci do transportu Saratyny do okre slonej lokalizacji podczas oraz w okresie nast epuj acym po zabiegach kardiologii inwazyjnej takich jak angioplastyka oraz implantacja stentu oraz endarterektomia. Szczegó lowy opis wynalazku Rekombinowan a Saratyn e odpowiedni a do zastosowania wed lug wynalazku poddaje si e eks- presji i izoluje si e z Hansenula polymorpha. Stwierdzono, ze dzia la ona przez blokowanie wi azania vWF do kolagenu oraz efektywnie zapobiega adhezji p lytek krwi do kolagenu w warunkach podwy z- szonego scinania. Saratyna w sposób zale zny od dawki hamuje wi azanie oczyszczonego ludzkiego vWF do kolagenu ludzkiego typu I oraz III (odpowiednio IC 50 = 0.23 ± 0.004 oraz 0.81 ± 0.04 µg ml -1 ) oraz do kolagenu skóry ciel ecej (IC 50 = 0.44 ± 0.008 µg ml -1 ). Ponadto Saratyna wykazuje podobn a aktywnosc inhibicji wi azania vWF do odpowiednich kolagenów osocza ludzkiego, swini oraz gryzoni. W komorze przep lywowej w warunkach podwy zszonego scinania (2700 s -1 ) Saratyna, w sposób za- le zny od dawki silnie hamuje tworzenie agregatów plytek krwi na powierzchniach pokrytych kolage- nem (IC 50 = 0.96 ± 0.25 µg ml -1 ), przy czym w warunkach obni zonego scinania (1300 cm s -1 ) w krzy- wej zale zno sci od dawki obserwuje si e przesuni ecie w prawo (IC 50 = 5.2 ± 1.4 µg ml -1 ). Analiza meto- d a powierzchniowego rezonansu plazmonowego (surface plasmon resonance-SPR) ujawnia zarówno wysokie jak i niskie powinowactwo miejsc wi az acych seratyn e na ludzkim kolagenie typu III (odpo- wiednio Kd = 5 x 10 -8 M oraz 2 x 10 -6 M) i chocia z niskie st ezenie Saratyny, które hamuje adhezje p lytek krwi w warunkach podwy zszonego scinania (to znaczy nasycenie miejsc wiaz acych o wysokim powinowactwie) nie wykazuje wp lywu na indukowan a kolagenem agregacj e p lytek krwi, która jest niezale zna od vWF, to stwierdzono, ze wysokie st ezenia (nasycenie miejsc wi azacych o niskim powi- nowactwie) hamuj a agregacj e p lytek krwi. Dane te dowodz a, ze Saratyna jest silnym inhibitorem za- le znej od vWF adhezji p lytek krwi do kolagenu, co stanowi podstaw e jej zastosowa n terapeutycznych jako srodka przeciwzakrzepowego. Ponadto badania dowiod ly, ze Saratyna w sposób zale zny od dawki silnie hamuje wi azanie vWF nie tylko do kolagenu skóry ciel ecej, lecz tak ze ludzkiego kolagenu typu I i III, z których oba wy- st epuj a w du zych ilo sciach w warstwach pod sródb lonkowych scianek t etnic i, jak si e s adzi s a one istotne dla oddzia lywa n mi edzy p lytkami krwi a sciankami naczynia (Throm Haemost 1997, 78(1): 434-438). Poniewa z interakcje kolagen-vWF-GP lb/IX/V maj a miejsce jedynie w warunkach wystarczaj aco pod- wy zszonego scinania, wa znym aspektem niniejszego wynalazku by lo udowodnienie skuteczno sci Saratyny nie tylko w warunkach statycznych lecz tak ze w otoczeniu, które lepiej na sladuje sytuacje spotykane w warunkach in vivo. W komorze przep lywowej, gdzie si ly scinania mog a by c zmieniane tak by, symulowa c takie otoczenie, Saratyna w oczywisty sposób hamuje wi azanie p lytek krwi do kolage- nu, szczególnie w warunkach wy zszego scinania. Godny zauwa zenia jest efekt przesuni ecia na prawo obserwowany na krzywej zale zno sci od dawki jako wynik obni zania scinania, poniewa z mo zna st ad wnioskowa c, ze dzia lanie Saratyny (jej skuteczno sc) in vivo mo ze by c zlokalizowane w obszarachPL 203 469 B1 8 wy zszego scinania, gdzie w wyniku zmian powierzchni warstwy sródb lonkowej (endotelium) ekspono- wanego na dzia lanie krwi, na przyk lad w obecno sci p lytek mia zd zycowych lub po interwencji mecha- nicznej, nast epuj a zaburzenia laminarnego przep lywu krwi. Badania Saratyny metod a SPR wykaza ly, ze kolagen mo ze posiada c dwa niezale zne miejsca wiaz ace Saratyny, jedno o wysokim powinowactwie i drugie niskim powinowactwie. Inhibicj e wi azania vWF do kolagenu przez Saratyn e wyja snia si e nasyceniem miejsca wi azania o wysokim powinowac- twie o warto sciach IC 50 oko lo 5 x 10 -8 M, to znaczy równych sta lej dysocjacji tego miejsca. Poniewa z niezale zne od vWF indukowana kolagenem agregacja p lytek krwi ulega inhibicji jedynie przy bardzo wysokich dawkach Saratyny (powy zej 100 µM), wydaje si e, ze nasycenie miejsc wi azacych kolagenu o niskim powinowactwie, zwi azane jest z inhibicj a bezpo srednich oddzia lywa n kolagen-receptor kolagenu. Innym celem wynalazku jest zdolno sc Saratyny do wywierania efektu na lokalne otoczenie endarterektomizowanego naczynia, przy czym nie wyst epuje konieczno sc ogólnoustrojowej dystrybucji oraz zmiany funkcji p lytek krwi lub zmiany koagulacji, co czyni ten srodek idealnym do zastosowa n miej- scowych podczas chirurgicznych zabiegów naczyniowych oraz inwazyjnych zabiegów radiologicznych. W tym aspekcie wynalazku efekt terapeutyczny Saratyny badano, stosuj ac model endarterek- tomii t etnicy szyi u szczura (carotid endarterectomy-CEA) opisany uprzednio w (J. Vasc. Surg. 1998, 28: 909-918). S adzi si e, ze aktywacja PLT jest etapem inicjuj acym w zakrzepicy i restenozie po CEA, ze wzgledu na IH. Obserwowano, ze miejscowe u zycie Saratyny na powierzchni prze switu zmniejsza stopie n adhezji p lytek krwi do endarterektomizowanej t etnicy, a w nast epstwie obni za stopie n poope- racyjnej zakrzepicy i IH. Jako podsumowanie wyników eksperymentalnych, dzia lanie Saratyny skierowane przeciw przywieraniu p lytek krwi poddano badaniu dla dwóch ró znych czasów pooperacyjnych, co pozwoli lo na stwierdzenie, ze liczba przywieraj acych p lytek krwi w przeci agu 3 godzin (fig. 4) oraz 24 godzin (fig. 5) po endarterektomii t etnicy szyjnej u szczurów, którym podawano Saratyn e, ulega la w istotny sposób obni zeniu w porównaniu do kontrolnej grupy szczurów. Adhezja p lytek krwi obni zona zosta la o 59% po 3 godzinach (64 ± 17.2 w porównaniu do 155 ± 33.4 PLT na siatk e, P = 0.05) oraz o 77% po 24 godzinach (35 ± 11.3 w porównaniu do 149 ± 36.6 PLT na siatk e, P = 0.110). Adhezja p lytek krwi po 3 godzinach oraz po 24 godzinach by la podobna w grupach kontrolnych, a w grupie, której podawano Saratyn e obserwowano jej obni zenie z 64 do 35 p lytek krwi na siatk e. Rysunek fig. 6 i fig. 7 ilustruj a otrzymany technik a skaningowej mikroskopii elektronowej, typowy obraz powierzchni endarterektomizowanej przy miejscowej obecno sci oraz pod nieobecno sc Saratyny (pow. 2000 razy). Rysunek fig. 6A pokazuje powierzchni e kontroln a po 3 godzinach po endarterekto- mii. Zauwa zy c mo zna du za ilosc materia lu komórkowego, nici fibrynowe, liczne czerwone cia lka krwi oraz wyra znie widoczne liczne p lytki krwi. Rysunek fig. 6B pokazuje powierzchnie, na któr a dzia lano Saratyna po 3 godzinach od endarterektomii. Mo zna zauwa zy c brak elementów komórkowych oraz prawie ja low a powierzchni e kolagenu. Rysunek fig. 7A pokazuje powierzchni e kontroln a po 24 godzi- nach po endarterektomii t etnicy szyjnej. P lytki krwi s a wyra znie widoczne w postaci ma lych bia lych kropek. Rysunek fig. 7B pokazuje powierzchni e, na któr a dzia lano Saratyna po 24 godzinach od endarterektomii t etnicy szyjnej. Wyra znie obserwuje sie obni zenie stopnia adhezji p lytek krwi po dzia- laniu Saratyny. W porównaniu do grupy kontrolnej, miejscowe zastosowanie Saratyny po endarterektomii t etni- cy szyjnej w istotny sposób obni za rozrost warstwy wewn etrznej. W porównaniu do grupy kontrolnej stenoza prze switu w procentach jako miara IH uleg la istotnemu obni zeniu wraz z zastosowaniem Saratyny. Obserwowane obni zenie stopnia IH koreluje z inhibicj a przywierania PLT. W kategoriach stenozy prze switu, szczury kontroli wykazuj a 29.8 ± 6.8%, p = 0.0042 stenozy prze switu w porówna- niu z 10.9 ± 1.8% stenozy prze switu w grupie, której podawano Saratyn e (Rysunek fig. 6). W grupie szczurów, której podawano Saratyn e obserwuje si e 18.9% wi eksz a srednic e prze switu w porównaniu do grupy kontrolnej szczurów. Po dwóch tygodniach po endarterektomii t etnicy szyjnej, metod a anali- zy histologicznej, u 5 na 15 szczurów kontrolnych (15%) obserwuje si e pe lny skrzep t etnicy szyjnej, podczas gdy u 0 na 15 szczurów, którym podawano Saratyn e (0%) rozwin ela sie zakrzepica t etnicy szyi. Wspó lczynnik prawdopodobie nstwa w analizie Chi Kwadrat daje warto sc ilorazu szans 16.238, co sugeruje, ze szansa, by w grupie kontrolnej rozwin ela si e blokada zakrzepicy przyjmowa la wartosc 16-krotnie wi eksz a ni z u szczurów, którym podawano Saratyn e P = 0.0156. W grupie, której podawano Saratyn e nie obserwowano tak ze zwi ekszonego krwawienia wzd lu z linii szwu na t etnicy. Stwierdzono, ze po 3 godzinach oraz po 24 godzinach po endarterektomii czasPL 203 469 B1 9 krwawienia oraz wynik ogólnoustrojowego zliczania p lytek krwi nie odbiegaj a w istotny sposób w gru- pie, której podawano Saratyn e w porównaniu do grupy kontrolnej. Model CEA blisko przypomina ludzkie CEA i st ad wyniki sugerowa c mog a mechanizm obni za- nia szkodliwych efektów przywierania oraz agregacji p lytek krwi w miejscu endarterektomii bez zabu- rzania ogólnoustrojowych funkcji p lytek krwi lub obni zania stopnia homeostazy. Proste miejscowe zastosowanie Saratyny podczas CEA u szczura prowadzi do obni zenia przywierania oraz agregacji p lytek krwi, a w nast epstwie restenozy, które maj a miejsce w t etnicy szyjnej wskutek rozrostu warstwy wewn etrznej. Tabela 3 pokazuje wyniki pomiaru czasów krwawienia oraz zlicze n p lytek krwi. Nie obserwowa- no statystycznie istotnych ró znic mi edzy czasami krwawienia przed i po operacji. Nie obserwowano statystycznie istotnych ró znic mi edzy zliczeniami p lytek krwi u szczurów kontrolnych oraz u szczurów, którym podawano Saratyn e. Wykazano istotne obni zenie stopnia adhezji oraz akumulacji p lytek krwi po zbli zonym do endar- terektomii uszkodzeniu t etnicy. Obni zony stopie n adhezji p lytek krwi obserwowano zarówno bezpo- srednio po endarterektomii (3 godziny) jak i 24 godziny pó zniej. Efekt ten po 24 godzinach jest wa zny dlatego, ze zdaniem twórców jest wynikiem nie bezpo sredniej inhibicji wskutek dzia lania przez Sara- tyn e na kolagen (czas po lowicznego rozpadu Saratyny w surowicy wynosi 90 minut), lecz jest raczej rezultatem wst epnej inhibicji agregacji p lytek krwi i nast epuj acego po tym zaburzenia kaskady aktywa- cji p lytek krwi. Z chwil a, kiedy proces wi azania p lytek krwi z wystawionym na ich dzia lanie kolagenem ulega wst epnej inhibicji, kaskada p lytek krwi nie mo ze dalej zachodzi c. Rysunki fig. 4 i fig. 5 ilustruj a fakt, ze miejscowe zastosowanie Saratyny w punkcie, w którym w ostatnim czasie nast api lo uszko- dzenie naczynia, prowadzi c mo ze do inhibicji w istotnym stopniu adhezji p lytek krwi. Saratyna inhibi- towa la adhezj e p lytek krwi o 60 i 75% odpowiednio po 3 i 24 godzinach. Hamowanie to uwidacznia lo sie poprzez widoczne ró znice w wytr acaniu elementów strukturalnych w t etnicach kontrolnych oraz t etnicach, które poddano dzia laniu Saratyny, zarówno po 3 godzinach jak i po 24 godzinach (rysunki fig. 7 i fig. 8). Ten brak odpowiedzi komórkowej jest zdaniem twórców, wynikiem inhibicji adhezji p lytek krwi. Tak wi ec opisana terapia stanowi unikalny typ leczenia poprzez inhibicj e adhezji p lytek krwi do uszkodzonego naczynia. W porównaniu do grupy szczurów, którym podawano Saratyn e, u szczurów grupy kontrolnej obserwowano w istotnym stopniu zmniejszon a srednic e przekroju po dwóch tygo- dniach od endarterektomii t etnicy szyjnej (rysunek fig. 9). Stopie n rozrostu warstwy wewn etrznej ule- ga l istotnemu obni zeniu u szczurów, którym podawano Saratyn e, co korelowa lo z obni zon a adhezj a oraz akumulacj a p lytek krwi. Stwierdzenie obni zonego poziomu rozrostu warstwy wewn etrznej oraz zakrzepicy, które zwi azane s a z obni zon a adhezj a p lytek krwi, okre slaj a klinicznie im odpowiadaj ace punkty ko ncowe oraz nast epstwa obni zonej adhezji p lytek krwi. Dowodzi to, ze specyficzna wzgledem miejsca, nieogólnoustrojowa inhibicja agregacji i adhezji p lytek krwi prowadzi do obni zenia szybko sci zamykania t etnic i zakrzepicy a w nast epstwie obni za zakres komplikacji mózgowo-naczyniowych, które lacz a si e z endarterektomi a t etnicy szyjnej. Korekta stopnia rozrostu warstwy wewn etrznej oraz stenozy prze switu zosta la tak ze wykazana przez stwierdzenie obni zonego stopnia zakrzepicy u szczu- rów, którym podawano Saratyn e. W grupie kontrolnej pe lne 33% szczurów wykazywa lo zakrzepic e, podczas gdy u zadnego ze szczurów, którym podawano Saratyn e nie stwierdzono w t etnicach zmian zwi azanych z zakrzepic a. Z klinicznego punktu widzenia szczególnie wa zny jest brak efektów ogólno- ustrojowych wykazywanych przez ten srodek. Miejscowe zastosowanie Saratyny nie wywiera wp lywu na ogólnoustrojowy czas krwawienia lub wyniki zliczania p lytek krwi. Dowodzi to, ze obni zona adhezja p lytek krwi, a w nast epstwie obni zenie stopnia zakrzepicy oraz rozrostu warstwy wewn etrznej jest wynikiem oddzia lywa n lokalnych. Te nowe odkrycia zwi azane z Saratyna s a na pewno wa zne w aspekcie zakresu klinicznych zastosowa n srodka, który zdolny jest do lokalnej inhibicji szkodliwych efektów adhezji i aktywacji p lytek krwi bez zaburzania ogólnoustrojowych mechanizmów hemosta- tycznych. Jak podkre slono wcze sniej, ró zne interwencje terapeutyczne powoduj a lokalne uszkodzenia, które w idealnych warunkach powinny podlega c natychmiastowej terapii przeprowadzanej w sposób miejscowy. W wypadku kiedy pozostawia si e je nie leczone, uszkodzone komórki inicjuj a szereg pro- cesów zwi azanych z tworzeniem skrzeplin, aktywacj a oraz odpowiedzi a komórkow a na uwalnianie cytokin, zapocz atkowaniem procesów proliferacji oraz innymi procesami aktywno sci biologicznej. Z chwil a zapocz atkowania tych z lozonych, wzajemnie powi azanych procesów ich zatrzymanie jest rzecz a trudn a.PL 203 469 B1 10 Wa znym aspektem wynalazku jest zatem fakt, ze Saratyn e umieszcza si e bezpo srednio w tkankach, które podlegaj a manipulacji. Innym aspektem zastosowania miejscowego jest minimaliza- cja potencjalnych problemów zwi azanych z ogólnoustrojowymi efektami stosowania opisanych leków. W idealnym przypadku Saratyna mo ze by c podawana równocze snie z odpowiedni a terapeu- tyczna procedur a interwencyjn a, co osi aga si e przez w laczenie Saratyny do pow loki urz adzenia chi- rurgicznego, takiego jak cewnik balonikowy lub innego urz adzenia lub jego cz esci. W innym aspekcie wynalazek mo ze tak ze polega c na bezpo srednim pokryciu Saratyna uszkodzonego naczynia. Ponadto wed lug wynalazku u zywa c mo zna standardowych sposobów podawania Saratyny, mo zna tak ze stosowa c takie postacie jak wolna forma p lynna, w tym kombinacje z innymi srodkami terapeutycznymi. Jednak ze w porównaniu do zastosowania wolnej formy p lynnej zastosowanie macie- rzy polimerowych/hydro zelowych posiada istotne zalety. Podawanie srodka w postaci zwi azanej w macierzy polimerowej nie wymaga dodatkowych kanalów w cewniku, których zadaniem jest dostar- czenie roztworu p lynnego leku do miejsca leczenia oraz usuni ecia leku z miejsca leczenia. Dodatkowo macierze polimerowe eliminuj a ryzyko przecieków roztworu leku w kierunku zgod- nym z przep lywem krwi, spowodowanych niew la sciwym uszczelnieniem przez balonik segmentów naczy n, przez co unika si e ryzyka wystawienia tkanek, które w zamierzeniu nie stanowi a celu terapii, na dzia lanie wysokich st eze n leku. Ogólnym rozwi azaniem technicznym pozwalaj acym na miejscowe zastosowanie Saratyny, za- równo na powierzchni urz adzenia medycznego jak i przez pokrycie powierzchni uszkodzonego naczy- nia, jest na przyk lad wprowadzenie Saratyny do pokrycia polimerowego lub hydro zelowego. W znaczeniu u zytym w niniejszym opisie, w odniesieniu do sk ladu polimeru termin hydro zel obejmuje syntetyczne polimery, zawieraj ace pory lub szczeliny o ró znych wymiarach oraz pojemno- sciach, ró zni ace si e pod wzgl edem w la sciwo sci fizykochemicznych w szczególno sci w odniesieniu do hydro zelowej/hydrofobowej natury macierzy zelu, który mo ze by c wprowadzany podczas wytwarzania pokrycia lub urz adzenia powlekanego. Znany stan techniki opisuje ró znorodne elastomery syntetycz- ne oraz naturalnie wyst epuj ace materia ly polimerowe. Saratyna mo ze by c wprowadzana do macierzy zarówno podczas wytwarzania polimeru jak i dodawana po operacji powlekania polimerem lub topie- nia polimeru w celu nadania mu okre slonego kszta ltu. Ponadto, wed lug wynalazku, w celu wytworze- nia macierzy polimerowych u zywa c mo zna wielu ró znych materia lów polimerowych oraz metod ich wytwarzania. Przyk ladami odpowiednich materia lów polimerowych lub ich kombinacji mog a by c, lecz nie s a nimi wylacznie, polimery biokompatybilne lub biodegradowalne. W badaniach nad chirurgicznymi zastosowaniami kilku alkilo i cyjanoakrylanów alkilu stwierdzo- no, ze szczególnie przydatne s a niektóre cyjanoakrylany izobutylu. Typowy polimer hydro zelowy, mo ze by c otrzymany z mieszaniny monomeru zawieraj acej 40-60 cz esci wagowych oczyszczonego monoestru alkiloakrylanu hydroksyalkilu, posiadaj acego jedno olefi- nowe wi azanie podwójne, 40-60 cz esci wagowych monomeru metakrylowego, zawieraj acego jedno olefinowe wi azanie podwójne oraz 0.001-5 cz esci wagowych inicjatora polimeryzacji. Polimeryzacj e przeprowadza c mo zna konwencjonaln a technik a polimeryzacji w masie, polimeryzacji w roztworze, polimeryzacji w zawiesinie lub polimeryzacji w emulsji. Stosowana technika polimeryzacji zale zy od zadanej obj eto sci polimeru oraz charakteru ko ncowego produktu, który jest wytwarzany. Typowy pro- dukt hydro zelowy opisany jest przez stosunek molowy monomeru monestrowego do monomeru meta- krylowego, który zawiera si e w granicach 1:1 do 2.3:1, korzystnie 1.5:1, przy czym srednica porów polimeru jest wi eksza ni z 90 Angstremów. Poniewa z monoester akrylanu hydroksyalkilu posiada jedno olefinowe wi azanie podwójne, poni zsze zwi azki mog a stanowi c rzeczony komponent, lecz nie s a nimi wy lacznie: metakrylan 2-hydroksyetylu, matakrylan gliceryny, metakrylan 2-hydroksypropylu, metakrylan glicydylu (metakry- lan 2,3-epoksypropylu), akrylan 2-hydroksyetylu, oraz akrylan 2-hydroksypropylu. Przyk ladami ko- rzystnych monomerów metakrylowych, s a kwas metakrylowy, amid kwasu metakrylowego oraz meta- krylonitryl. Rodzaj zastosowanego inicjatora polimeryzacji zale ze c mo ze od metody polimeryzacji lub od zamierzonego zastosowania polimeru. Na przyk lad w przypadku, kiedy polimer ma by c formowany jako obiekt w postaci cia la sta lego, mo zna u zywa c inicjatora wolnorodnikowego. Preferowanymi inicjatorami tego typu mog a by c na przyk lad dwufunkcyjne poliestry takie jak 2,5-dimetylo-2,5-bis(2-etyloheksoiloperoksy)heksan lub peroksypiwalany tert-butylu. Alternatywnie, w wypadku kiedy ostatecznym przeznaczeniem polimeru jest pow loka w formie mieszaniny monome- ru, który polimeryzowany jest in situ, inicjator mo ze wyst epowa c w postaci uaktywnianej radiacyjnie,PL 203 469 B1 11 jak na przyk lad katalizator UV 2,2-azobis(2-metylopropionitryl) lub azobisbutyronitryl (AIBN). Zastoso- wanie inicjatorów nie ogranicza si e do okre slonej metody polimeryzacji lub do okre slonego produktu finalnego. Na przyk lad inicjatory wolnorodnikowe stosowane mog a by c w technice pow lok, podczas gdy inicjatory aktywowane radiacyjnie mog a by c stosowane w technice formowania produktów w po- staci cia l sta lych. Dodatkowo, obok generalnie zbli zonych zawarto sci monomeru monoestrowego oraz metakry- lowego, mieszanina monomeru mo ze by c wzbogacona w sladowe ilo sci akrylanu o d lu zszym lancu- chu alkilowym lub komonomeru estru metakrylowego, takiego jak metakrylan cykloheksylu, trimetakry- lan trimetylolopropanu lub dimetakrylan glikolu etylenowego. Tego typu dodatkowe komonomery powoduj a wzrost sieciowania polimeru w sytuacjach kiedy dodawany polimer powinien charakteryzo- wa c si e wytrzyma lo sci a. Sladowe ilo sci wymienionych komonomerów zwykle mieszcz a si e w grani- cach 0.1% wagowego w stosunku do ca lkowitej mieszaniny monomeru. Polimery hydro zelowe stosowane wed lug wynalazku mog a by c formowane w celu wytworzenia przedmiotów, które s a w wystarczaj acym stopniu usieciowane w wyniku wewn etrznego oddzia lywania, w taki sposób, ze przedmioty te nie wymagaj a dalszego sieciowania monomerów. Dodatkowymi przyk ladami polimerów biodegradowalnych s a poli(laktydy), poliglikolidy, polimery bezwodników, poliortoestry, poliacetale, polidihydropirany, policyjanoakrylany oraz kopolimery wymie- nionych zwi azków z glikolem polietylenowym. Mog a one przybiera c posta c hydro zeli lub usieciowa- nych polimerów, do których mog a by c wprowadzane leki w celu intensyfikacji ich lokalnego transportu do okre slonego miejsca, zarówno w czasie polimeryzacji jak i w przypadku pewnych hydro zeli, przez ich wprowadzenie w nast epnym etapie. Preferowane macierze projektowane s a w oparciu o charaktery- styki molekularne okre slonego srodka, tak by mo zna by lo kontrolowa c skierowan a na zewn atrz dyfuzj e. Mo zna wykona c i zastosowa c wiele typów cewników i innych urz adze n medycznych powleka- nych Saratyna. Stosowane mog a by c one adekwatnie do indywidualnych potrzeb terapeutycznych, z my sla o których zosta ly zaprojektowane lub w celu bardziej specyficznego zastosowania miejscowe- go polimeru nasyconego Saratyna. Wynalazek zosta l przetestowany na cewniku balonikowym, który dost epny jest w handlu pod nazw a Blue medical Devices BV GO (firma Blue medical). Zastosowania nie ograniczaj a si e jednak do tego typu cewników. Dalsze przyk lady P r z y k l a d 1 Wi azanie oczyszczonego vWF oraz p lytek krwi do kolagenu w warunkach statycznych Wi azanie vWF do kolagenu badano na p lytkach mikrotitracyjnych w zasadzie wed lug procedury opisanej wcze sniej w publikacji (Blood 1995, 85(3): 705-711). Kolageny róznego typu, albo ludzki ko- lagen typu I, typu III lub kolagen skóry ciel ecej (Sigma) wykorzystywano do otrzymywania pow loki przez pipetowanie 50 µl kolagenu rozpuszczonego w 50 mM kwasu octowego w st ezeniu 125 µg ml -1 na 96 celkowej p lytce mikrotitracyjnej w obecno sci 200 µl PBS w celu stymulowania renaturacji. Po zablokowaniu miejsc niepokrytych BSA, oczyszczony ludzki vWF (1.25 µg ml -1 w wypadku p lytek pokrytych kolagenem skóry ciel ecej oraz kolagenem I; 0.625 µg ml -1 w wypadku p lytek pokrytych kola- genem III) lub normalnym rozcie nczonym osoczem (ludzkie osocze: 1/80 na kolagenie I i III, 1/40 na kolagenie skóry ciel ecej; osocze chomika, myszy lub swini: 1/80 na kolagenie III; 1/20 na kolagenie I oraz kolagenie skóry ciel ecej) dodaje si e do celek p lytki w obecno sci Saratyny i inkubuje si e przez 2 godzi- ny (rozcie nczone osocze) lub 1 godzin e (oczyszczony vWF). Wi azanie resztkowego vWF do kolagenu oznacza si e po dodatkowym etapie przemywania przy u zyciu surowicy przeciw vWF królika (Dako, Kopenhaga, Dania) sprz ezonej z peroksydaz a chrzanu, nast epnie wywo luje si e i mierzy si e absorban- cje przy 492 nm. W wypadku kiedy p lytki mikrotitracyjne by ly preinkubowane z ludzkim kolagenem I, ludzkim ko- lagenem III lub kolagenem skóry ciel ecej przeprowadzana w nast epnym etapie inkubacja oczyszcza- nego vWF w obecno sci Saratyny zwi azana by la z zale zn a od dawki inhibicj a wi azania vWF-kolagen, którego wartosc IC 50 wynosi la odpowiednio 0.23 ± 0.004, 0.81 ± 0.04 oraz 0.44 ± 0.008 µg ml -1 (rysunek fig. 1). W wypadku kiedy vWF zast apiono normalnym rozcie nczonym ludzkim osoczem, Saratyna jako inhibitor zachowywa la nie zmienion a aktywnosc inhibicji, to znaczy wymienione warto sci nie ulega ly zmianie (Tabela 1). Saratyna inhibitowa la tak ze wi azanie vWF do ro znych kolagenów w rozcie nczonym osoczu swini, chomika oraz myszy lub szczura, zachowuj ac przy tym sta la wysok a aktywnosc wzgl edem kolagenu I (Tabela 1). P r z y k l a d 2 Adhezja p lytek krwi w warunkach podwy zszonego scinaniaPL 203 469 B1 12 W swietle istotnego znaczenia si l scinaj acych dla procesów kontroluj acych zale zn a od vWF adhezj e p lytek krwi do kolagenu (J. Lab. Clin. Med. 1974, 83(2): 296-300), przeprowadzono badania perfuzyjne w komorze przep lywowej, których celem by lo przetestowanie dzia lania Saratyny jako inhibi- tora w warunkach przep lywu zbli zonych do przep lywów spotykanych w uszkodzonych lub chorych t etnicach. Z kolagenu skóry ciel ecej sporz adza si e pow lok e na plastikowym pasku nakrywkowym, wed lug opisanej wcze sniej procedury (Blood 1995, 85(3): 705-711). Perfuzj e przeprowadza si e w komorze do perfuzji z równoleg lymi p lytkami oraz z dwoma uchwytami do pasków nakrywkowych, przy czym wysoko sc komory wynosi la 0.4, 0.6 lub 1.0 mm, a szeroko sc 1.0 cm. Badania prowadzi si e w warunkach przep lywu pulsacyjnego (pompa wirnikowa, Watson Marlow roller pump 603S, VEL, Leuven, Belgia) przy warto sciach scinania odpowiednio oko lo 2700, 1300 oraz 300 s -1 . U zywaj ac pe l- nej krwi poddanej obróbce przeciwzakrzepowej (0.2 IU ml -1 heparyn a o niskim ciezarze cz asteczko- wym, Clexane) przeprowadza si e testy perfuzji nad pokrytymi kolagenem paskami nakrywkowymi w czasie 5 minut, po czym po przemyciu paski nakrywkowe wybarwia si e stosuj ac Grünwald-Giemsa oraz metod a mikroskopii optycznej oznacza si e wytr acanie si e p lytek krwi i przeprowadza analiz e obrazów wed lug techniki opisanej w (Blood 1995, 85(3): 705-711), stosuj ac jako parametr ilo sciowy stopie n pokrycia powierzchni. Przy warto sciach scinania 2700 cm -1 Saratyna wykazywa la inhibicj e adhezji p lytek krwi w spo- sób zale zny od dawki z aktywno scia IC 50 = 0.96 ± 0.25 µg ml -1 (Rysunek fig. 2). Jednak ze przy bar- dziej umiarkowanych przep lywach 1300 s -1 na krzywej zale zno sci od dawki obserwuje si e wyra zne przesuni ecie w prawo o warto sci IC 50 = 5.2 ±1.4 µg ml -1 (Rysunek fig. 2). Przy scinaniu 300 s -1 Saratyna nie wykazywa la zdolno sci inhibicji adhezji p lytek krwi poddanych perfuzji a z do 10 µg ml -1 (dane te nie zostaly przedstawione w niniejszym opisie). P r z y k l a d 3 Analiza wi azania metod a powierzchniowego rezonansu plazmonowego (SPR) Interakcje bia lek identyfikowano i charakteryzowano metod a SPR, stosuj ac do bada n aparat BIAcore 3000 Instrument (BIAcore, Freiburg, Niemcy). Reagenty sprz egaj ace u zywano zgodnie z instrukcjami dostawcy. Wi azanie z p lytk a sensorowego chipu CM 5 wykonuje si e przez reakcj e aktywowanych grup karboksylowych z wolnymi grupami aminowymi ludzkiego kolagenu typu III (Sigma). Rozpoznanie pH oraz chemi e sprz egania, prowadzi si e w warunkach standardowych (Anal. Biochem, 1991, 198(2): 268-277, JAI Press Ltd., 1992). Wedlug procedury sprz egania kolagen rozcie ncza si e do 0.125 µg ml -1 w 10 mM buforu octanowego (pH 4.5), w wyniku czego uzyskuje si e 331 jednostek rezonansowych (RU) immobilizowanego materia lu. Macierz ta u zywana jest do badania oczyszczonej, rekombinowanej Saratyny, któr a rozcie ncza si e 20 mM uk ladem buforowym Hepes (pH 7.4), 150 mM NaCI, 5 mM EDTA oraz 0.005% Tween 20. Miareczkowania z seratyn a dokonuje si e stezeniach za- wierajacych si e w granicach od 7.8 nM do 10 µM. Mierzone w eksperymencie warto sci plateau RU przedstawiono na wykresach, korzystaj ac z równania: R eq /st ezenie Saratyny = (-K A x R eq ) + (K A x R max ) Miareczkowanie Saratyny na powierzchniach immobilizowanego kolagenu wskazuje na wi aza- nie, które zale zy od st ezenia. Ponadto maksymalna ilo sc Saratyny zwi azana z kolagenem na po- wierzchni sensora daje sygna l wi ekszy ni z obliczony sygna l maksymalny dla wi azania modelowego 1: 1. Wskazuje to na wyst epowanie wi ecej ni z jednego miejsca wiaz acego Saratyn e w kolagenie typu III. Dodatkowo dowodzi tego fakt, ze dopasowanie danych do modelu wi azania 1: 1 wed lug metody Langmuira nie daje dobrych wyników. Analiza danych SPR wed lug metody Scatcharda wskazuje na istnienie dwóch ró znych miejsc wiaz acych, które istotnie ró zni a si e warto sciami powinowactwa wzgl edem Saratyny (Rysunek fig. 3). Obliczenia sta lych równowagi daj a sta la dysocjacji równ a 5 x 10 -8 M dla miejsca wi azania o wysokim powinowactwie oraz 2 x 10 -6 M dla miejsca wi azania o niskim powinowactwie. P r z y k l a d 4 Agregacja p lytek krwi Swoisto sc Saratyny wzgl edem funkcji p lytek krwi poddano dalszym badaniom w testach agre- gacji prowadzonych w osoczu bogatym w p lytki krwi, stosuj ac jako agonistów kolagen, ADP, rystoce- tyn e, kwas arachidonowy oraz mimetyk tromboksanu U46619. Krew pobierana na cytrynian (3.13%) od nie poddaj acych si e leczeniu, zdrowych ochotników odwirowuje si e (15 min, 100 g) aby otrzyma c oso- cze bogate w p lytki krwi do którego dodaje si e Saratyn e (ko ncowe st ezenie 0-200 µg ml -1 ) przez 1 minut e przed indukcj a agregacji p lytek krwi z kolagenem (0.5 µg ml -1 ), ADP (2.5 µM) rystocetyn a (0.9 mg ml -1 ),PL 203 469 B1 13 kwasem arachidonowym (1.0 mM) lub U46619 (1.3 µM). Dla ka zdego z agonistów obserwowano maksymaln a agregacj e (warto sc amplitudy) po 5 minutach oczekiwania. Przy warto sci stezenia ko ncowego 40 µg ml -1 Saratyna nie wykazywa la efektu inhibicji maksy- malnej agregacji w stosunku do wszystkich badanych agonistów w tym tak ze kolagenu. (Tabela 2) Saratyna wykazywa la jednak zdolnosc do cz esciowej inhibicji indukowanej kolagenem agregacji p lytek krwi przy 100 µg ml -1 (nie zosta lo to pokazane). Pe lny stopie n inhibicji obserwowano przy 200 µg ml -1 , przy czym nie wyst epowa l wp lyw na agregacj e do ADP, nawet przy st ezeniu Saratyny 200 µg ml -1 . P r z y k l a d 5 Szczurzy model CEA U zywa si e szczurzego modelu CEA, który stosuje technik e otwart a z arteriotomi a, bezpo srednie usuni ecie rozrostu warstwy wewn etrznej, cz esci o srodka oraz zamkni ecie przez zszycie t etnicy. Jedna z grup szczurów otrzymywa la Saratyn e, podczas gdy druga grupa s lu zy la jako kontrola. Punkty po- miarowe wyznaczone by ly przez 1/adhezj e PLT 2/stopie n zakrzepicy 3/zapocz atkowanie rozrostu warstwy wewn etrznej. Saratyna aplikowana by la bezpo srednio na endarterektomizowan a powierzch- ni e t etnicy szyjnej przed zamkni eciem t etnicy. Do ilo sciowej analizy agregacji PLT u zywano mikrofoto- grafii elektronowych (powi ekszenie 2000 x) preparowanych t etnic szyjnych. Ca lkowit a liczb e PLT zli- czano stosuj ac standaryzowane siatki nakrywkowe. Zakrzepic e oraz IH oznaczano przez wspomaga- n a komputerowo analiz e morfometryczn a fragmentów t etnic wybarwianych elastyn a, na drodze bez- po srednich pomiarów powierzchni IH. P r z y k l a d 6 Operacja endarterektomii t etnicy szyjnej Zwierz etom podano srodek uspokajaj acy w postaci izofluranu w s loju w kszta lcie dzwonu, zwa- zono je a nast epnie poddano anestezji przez dootrzewnowe podanie wspólnie ketaminy (100 mg/kg) oraz maleinianu acepromazyny (1 mg/kg). Po potwierdzeniu prawid lowo sci anestezji przez brak od- powiedzi na stymulacj e lapy, wstrzykuje si e podskórnie w regionie srodka górnego grzbietu 4 cm 3 normalnej solanki, która s luzy c ma jako zbiornik (bolus) p lynu (10 cm 3 /kg), którego zadaniem jest kompensacja mo zliwej wewn atrzoperacyjnej utraty krwi. Obszar szyi goli si e i nast epnie przygotowuje przez przemycie 7% alkoholem izopropylowym. U zywaj ac techniki sterylnej oraz mikroskopu opera- cyjnego (x40 sz40 Olympus, Olympus America Inc., Melville, NY), wykonuje si e naci ecie wzd luz szyi. Mi esnie powierzchniowe dzieli si e i naci ecie pog lebia si e dalej a z do poziomu prawej t etnicy szyjnej. Nerwy szyjne w rejonie t etnicy rozcina si e tak by zachowa c funkcj e gard la i unikn ac poperacyjnego upo sledzenia oddechowego. Po odpowiednim wyeksponowaniu t etnicy szyjnej proksymaln a i dystaln a kontrol e rozgalezie- nia, w odleg lo sci oko lo 1.5 cm, uzyskuje si e przez u zycie zaciskowych opasek szwu jedwabnego 3-0. U zywaj ac ostrza rogówkowego, przeprowadza si e arteriotomi e, a nast epnie ci ecie rozszerza si e do 6 mm d lugo sci, u zywaj ac mikrono zyczek. Stosuj ac igle 27, nacina si e rozrost warstwy wewn etrznej po- przecznie wzd luz naczynia wzd lu z dwóch linii równoleg lych oddalonych o oko lo 2 mm. Pincet a usuwa sie rozrost warstwy wewn etrznej oraz warstwy po srednie. Grupa szczurów, którym podaje sie Saraty- n e otrzymuje 5 µl roztworu Saratyny aplikowanej bezpo srednio na endarterektomizowan a powierzch- ni e. Arteriotomi e zamyka si e szwem biegn acym z pojedynczej nici nylonowej 10-0 (MS/9, Ethilon, Ethicon Inc., Somerville, NJ), poczynaj ac od ko nca dystalnego. Zaciski dystalne usuwa si e najpierw by uzyska c hemostazy linii szwu, a nast epnie usuwa si e zacisk proksymalny. Czas zastosowania Saraty- ny wynosi l 5 minut, co odpowiada czasowi zamkni ecia arteriotomii. W wypadku krwawienia ran e lekko tamponuje si e aplikatorem z ko ncówk a ze sterylnej bawe lny a z do uzyskania hemostazy. Endarterek- tomizowan a t etnic e szyjn a poddaje si e badaniu przy zastosowaniu r ecznego Dopplera w celu potwier- dzenia jej dro zno sci. Warstw e mi esni powierzchniowych oraz skór e zamyka si e nast epnie absorbo- walnym szwem biegn acym 3-0. P r z y k l a d 7 Adhezja p lytek krwi W podgrupach szczurów z adhezj a p lytek krwi szczury poddaje si e ponownej anestezji, pobiera sie endarterektomizowane t etnice szyjne (po 3 godzinach lub po 24 godzinach po endarterektomii t etnicy szyjnej) i stabilizuje sie je w 4% roztworze aldehydu glutaminowego. Podczas procedury pobie- rania, segmenty t etnicy szyjnej otwiera si e pod lu znie wzd lu z miejsca zamkni ecia szwem, przez co eksponuje si e endarterektomizowan a przestrze n. Nast epnie t etnice poddaje si e dzia laniu cztero- tlenku osmu, odwadnia si e w szeregu alkoholi, suszy si e w warunkach krytycznych CO 2 (1072 psi, 31.1°C) pokrywa si e z lotym palladem i umieszcza sie w skaningowym mikroskopie elektronowymPL 203 469 B1 14 (JEOL JSM 5410, JEOL, USA Peabody, MA). Obszary endarterektomizowane skanuje si e przy po- wi ekszeniu 2000 x i przygotowuje si e odpowiednie obrazy fotograficzne. Obrazy fotograficzne dopa- sowuje si e oraz porz adkuje si e w kola ze, pozwalaj ace na wizualizacj e wi ekszych obszarów ni z jest to mo zliwe dla pojedynczych pól monitora elektronowego mikroskopu skaningowego. Z chwil a kiedy zmontuje si e kola z fotograficzny pokrywa si e go przezroczyst a foli a z naniesion a siatk a. T e sam a foli e u zywa si e do wszystkich fotografii wzorców, u zywaj ac do obliczania ca lkowitej liczby p lytek krwi na ka zdej fotografii 116 kwadratów. Liczba 116 jest maksymaln a liczb a kwadratów, która mo ze by c obli- czana w spójny sposób na wszystkich kola zach fotograficznych. Zliczenia p lytek krwi wykonuje si e w procedurze testu slepego, przeprowadzanego przez dwóch niezale znych eksperymentatorów. P r z y k l a d 8 Rozrost warstwy wewn etrznej Po dwóch tygodniach po endarterektomii t etnicy szyjnej szczury w grupie z rozrostem warstwy wewn etrznej poddaje si e anestezji i eksponuje si e endarterektomizowan a t etnic e szyjn a. Otwiera si e jam e brzuszn a wzd lu z linii srodkowej i eksponuje si e aort e dystaln a oraz wewn etrzn a zy le g lówn a. Zy le g lówn a transfektuje si e, a do aorty dystalnej wprowadza si e kaniul e w postaci cewnika 20 w celu infuzji normalnej solanki pod ci snieniem 100 mm Hg, a z do chwili, kiedy wyciek z zy ly g lównej b edzie czysty. Nast epnie w celu przeprowadzenia perfuzji i stabilizacji, prowadzi si e infuzj e 10% buforowanej formaliny pod ci snieniem 100 mm Hg w równej obj eto sci. Jednocentymetrowy wycinek operowanej t etnicy szyjnej preparuje si e, umieszcza w 10% formalinie i poddaje dalszym badaniom histologicz- nym. T etnice blokuje si e parafin a, sporz adza si e z nich wycinki i barwi si e elastyn a, stosuj ac barwniki Verhoeff’a i Van Giesona. W celu standaryzacji regionu preparowania wycinków, preparuje si e wiele wycinków, ka zdy w odst epach 3 mikrometrów wzd lu z biegn acego szwu nylonowego 10-0, który zamy- ka arteriotomi e. Preparaty wybarwione elastyn a fotografuje si e, u zywaj ac cyfrowego aparatu fotogra- ficznego KODAK DC 120 Zoom (Eastman KODAK Company, Rochester, NY). Rejestruje si e wszyst- kie wycinki z zakrzepami. Obrazy bez zakrzepów wprowadza si e do komputera i analizuje si e obszar przekrojów t etnic szyjnych, stosuj ac program ImageJ Software Version 0.99i (National Institute of He- alth, Bethesda, MD). Program ten umo zliwi l rozdzielenie obszaru wewn etrznego oraz obszaru rozrostu warstwy wewn etrznej, a w konsekwencji uzyskania dok ladnej miary obszaru przekroju prze switu na- czynia. Oznaczono tak ze obszar zewn etrzny rozrostu warstwy wewn etrznej. Ró znic e pomi edzy tymi dwoma obszarami (obszar zewn etrzny rozrostu warstwy wewn etrznej minus rzeczywisty prze swit) okre sla rzeczywist a bezwzgl edn a przestrze n rozrostu warstwy wewn etrznej. Ze wzgl edu na fakt, ze przekroje t etnic wykazuj a indywidualn a zmienno sc kszta ltu, warto sci wyra za si e jako stosunek bez- wzgl ednej przestrzeni rozrostu warstwy wewn etrznej do zewn etrznej granicy rozrostu warstwy we- wn etrznej i wyra za si e w procentach stenozy prze switu. Stosunek ten wyra za proporcj e przestrzeni prze switu zajmowanej przez rozrost warstwy wewn etrznej i pozwala na porównanie przekrojów t etnic ró zni acych si e pod wzgl edem rozmiaru (4). Pomiary dwóch eksperymentatorów przeprowadzone w slepym te scie jedynie minimalnie ró zni ly si e miedzy sob a. P r z y k l a d 9 Czasy krwawienia oraz zliczenia p lytek krwi W celu oszacowania wp lywu Saratyny na ogólnoustrojow a liczb e p lytek krwi (zliczenia p lytek krwi) oraz czasy krwawienia, wykonano oznaczenie zliczania p lytek krwi oraz czasu krwawienia 12 szczurów. Konieczne by lo posiadanie próbki krwi z okresu przedoperacyjnego w ilo sci oko lo 1-1.5 cm 3 , co u szczura stanowi du za czes c ca lkowitej obj eto sci krwi. W swietle tego faktu sensowne wydaje si e oczekiwanie spadku liczby p lytek krwi w okresie pooperacyjnym zarówno u szczurów kontrolnych jak i szczurów, którym podawano Saratyn e. W celu okre slenia wp lywu Saratyny na liczb e p lytek krwi oznaczono ró znic e w liczbie p lytek krwi dla ka zdego szczura przez odj ecie wyników przedoperacyjne- go zliczania p lytek krwi od pooperacyjnego zliczania p lytek krwi, uzyskuj ac wynik porównania. Ró znice w zliczeniach p lytek krwi analizowano u zywaj ac 2 czynnikowego modelu ANOVA 2 x 2. Analiza ta nie wykaza la statystycznie istotnych ró znic w zliczeniach p lytek krwi mi edzy szczurami grupy kontrolnej oraz grupy, której podawano Saratyn e. U wszystkich szczurów oznaczono liczb e p lytek krwi oraz czas krwawienia w okresie przedoperacyjnym. U sze sciu szczurów przeprowadzono endarterektomi e t etni- cy szyjnej i poddano badaniom po 3 godzinach po operacji, oznaczaj ac czas krwawienia oraz liczb e p lytek krwi, a u pozosta lych 6 szczurów badania wykonano po 24 godzinach po operacji, oznaczaj ac czas krwawienia oraz liczb e p lytek krwi. Trzy szczury w ka zdej grupie czasowej otrzymywa ly miejsco- wo Saratyn e, a pozosta le 3 s luzy ly jako kontrola.PL 203 469 B1 15 Czas krwawienia oznaczano przez 2 mm dystalne rozci ecie ogona szczura oraz zanurzeniu oko lo 4 cm ogona w roztworze buforu fosforanowego w 37°C. Czas, który up lywa od wykonania na- ciecia do przerwania krwawienia mierzy si e i okre sla jako czas krwawienia. Zliczenia p lytek krwi prze- prowadza si e przez pobranie 1-1.5 cm -13 próbki krwi z wewn etrznej zy ly jarzmowej i poddanie jej ana- lizie w analizatorze krwi Coulter STKS. Wyniki podaje si e jako warto sci x 10 3 . P r z y k l a d 10 Metody statystyczne Podano srednie warto sci ± blad standardowy. W celu przeprowadzenia porównania szczurów, którym podawano Saratyn e z grup a kontroln a oblicza si e test t dla prób niezale znych, ze wzgl edu na liczby przywieraj acych p lytek krwi, procentow a wartosc stenozy prze switu oraz czasy krwawienia, stosuj ac program Stat View (SAS Institute Inc. Cary, NC 27513) wersja 5.0. W celu oszacowania ilo- razu szans nabycia zakrzepicy w dwa tygodnie po endarterektomii t etnicy szyjnej przeprowadzona zostala analiza rozk ladu prawdopodobie nstwa Chi-Kwadrat. W celu oszacowania ró znic mi edzy zli- czeniami p lytek krwi przed operacj a i po operacji u zyto modelu czynnikowego ANOVA 2 x 2. P r z y k l a d 11 Zwierz eta eksperymentalne Szczury rasy Sprague-Dawley (350-400 g) organizowano w grupy przeznaczone do endarterek- tomii t etnicy szyjnej. Podstaw a by ly dwa podstawowe cele badawcze. 1/Oznaczanie adhezji p lytek krwi oraz 2/Szacowanie stenozy prze switu, wynikaj acej z rozrostu warstwy wewn etrznej oraz stopnia zakrzepicy. W obr ebie tych celów szczury dzielone by ly na zwierz eta kontrolne oraz zwierzeta, którym podawano Saratyn e. U wszystkich szczurów przeprowadzono endarterektomi e t etnicy szyjnej (patrz poni zej). Szczury, którym podawano Saratyn e otrzymywa ly miejscowo roztwór 5 µl Saratyny, apliko- wany na powierzchni e prze switu t etnicy szyjnej natychmiast po usuni eciu warstwy wewn etrznej lub warstwy po sredniej. W grupie, w której badano adhezj e p lytek krwi przeprowadzono oznaczenia me- tod a mikroskopii elektronowej w 3 godziny po endarterektomii t etnicy szyjnej (n = 17) oraz 24 godziny po endarterektomii t etnicy szyjnej (n = 19). W grupie, w której badano rozrost warstwy wewn etrznej (n = 25) próbki materia lu pobierano w dwa tygodnie po endarterektomii t etnicy szyjnej. P r z y k l a d 12 Preparowanie hydro zelowych cewników powlekanych Saratyn a Powierzchnie materia lów preparowanych w oparciu o PA-12 zosta ly aktywowane przez zanu- rzenie w roztworze 2% (mol.) makroinicjatora poli(bezwodnik oktadeceno-alt-maleino-octowy) z pere- strem (11-16% mol.) rozpuszczonym w izopropanolu oraz 0.5 mola dimetyloakrylanu glikolu etyleno- wego (EGDMA)/1 mol makroinicjatora. Po wysuszeniu pow loki makroinicjatora/EGDMA pow lok e wy- grzewa si e przez 5 do 10 minut w temperaturze 120°C, co polepsza zwi azanie makroinicjatora z po- wierzchni a, a w konsekwencji poprawia usieciowanie. W celu optymalizacji warunków powlekania u zywano pow lok hydro zelowych generowanych na arkuszach no snika PA-12. Przed nanoszeniem pokrycia arkusze przemywano izoproanolem lub ace- tonem i suszono. Do pokrywania hydro zelem u zywano cewnika balonikowego typu Blue Medical Devises GO (cewnik RX PTCA) wykonanego z vestamidu (PA-12). Wodne roztwory 5% (mol.) kwasu akrylowego 100 ml oraz 0.2 do 0.8% mol. kwasu metyleno-bis-akrylowego, miesza si e i u zywa do pokrywania powierzchni cewników. Po polimeryzacji powlekane urz adzenie przemywa si e wod a i przez nast epne 24 godziny buforem PBS. Po tej operacji polimer ogrzewa si e w piecu w temperaturze 60-80°C przez 0.5 do 3 godzin. Grubosc wysuszonych pow lok hydro zelu zawiera si e w granicach 1 do 4 µm, stopie n p ecznienia hydro zelu w roztworze wodnym zawiera si e w granicach 10 do 50 g mokrego hydro zelu/1 g suchego hydro zelu. Do zanurzania (30 min.) stosuje si e 50 µg ml -1 ml roztwór Saratyny w buforowanym PBS pH 7.4. W wypadku rozpylania na balonikowym cewniku w postaci aerozolu z zastosowaniem typowej aparatury do nanoszenia pow lok na mala skal e (na przyk lad dost epnych w EFD), dla otrzymywania roztworów do powlekania, u zywa si e rozpuszczalników organicznych. Opis figur rysunku i tabel Fig. 1 Wp lyw Saratyny na oczyszczony ludzki vWF wi azacy si e z ludzkim kolagenem typu I (kó l- ka) oraz III (kwadraciki) oraz kolagenem skóry ciel ecej (trójk aty). IC 50 dla typu I = 0.23 ± 0.004 µg ml -1 , typu III = 0.81 ± 0.04 µg ml -1 oraz kolagenu skóry ciel ecej = 0.44 ± 0.008 µg ml -1 .PL 203 469 B1 16 Fig. 2 Wp lyw scinania na inhibicj e przez Saratyn e tworzenia agregatów p lytek krwi na ludzkim kolagenie typu III w komorze przep lywowej in vitro. Kó lka oznaczaj a przep lyw 2700 s -1 (IC 50 = 0.96 ± 0.25 µg ml -1 ), podczas gdy kwadraciki oznaczaj a przep lyw 1300 s -1 (IC 50 = 5.2 ±1.4 µg ml -1 ). Fig. 3 Analiza Scatcharda wi azania Saratyny do immobilizowanego ludzkiego kolagenu wed lug danych okre slonych metod a powierzchniowego rezonansu plazmonowego. Uwidacznia si e obecno sc miejsc wi azania o wysokim powinowactwie (Kd = 5 x 10 -8 M, linia ci ag la) oraz o niskim powinowactwie (Kd = 2 x 10 -5 6 M, linia przerywana) wzgl edem kolagenu III. Fig. 4 Liczba plytek krwi przywieraj acych do wyeksponowanej powierzchni warstwy pod sród- b lonkowej 3 godz. po endarterektomii-porównanie grupy otrzymuj acej Saratyn e (n = 7) i grupy kontrol- nej (n = 10). Warto sci oznaczaj a srednie ± blad standardowy (SE). Grupa, której aplikowano Saratyn e otrzymywa la miejscowo 5 µl roztworu Saratyny, podawanego na eksponowan a warstw e pod sródb lon- kow a. Gwiazdki wskazuj a warto sci P = 0.05. Fig. 5 Liczba p lytek krwi przywieraj acych do wyeksponowanej warstwy pod sródb lonkowej 24 godz. po endarterektomii-porównanie grupy otrzymuj acej Saratyn e (n = 9) i grupy kontrolnej (n = 10). Warto- sci oznaczaj a srednie ± blad standardowy (SE). P lytki krwi zliczano, stosuj ac skaningow a mikroskopi e elektronow a. Grupa, której aplikowano Saratyn e otrzymywa la miejscowo 5 µl roztworu Saratyny po- dawanego na eksponowan a warstw e pod sródb lonkow a. Gwiazdki wskazuj a warto sci P = 0.01. Fig. 6 Mikrofotografie elektronowe (2000 x) endarterektomizowanej t etnicy szyjnej szczura 3 godz. po endarterektomii t etnicy szyjnej. A-powierzchnia kontrolna, B -powierzchnia, na któr a poda- wano miejscowo Saratyn e (5 µl). Na powierzchni kontrolnej wida c liczne elementy komórkowe w tym nici fibrynowe, czerwone cia lka krwi oraz p lytki krwi. Na powierzchni, któr a poddano dzia laniu Saratyny wida c wyra znie mniejsz a liczb e elementów komórkowych. Fig. 7 Mikrofotografie elektronowe (2000 x) endarterektomizowanej t etnicy szyjnej szczura 24 godz. po endarterektomii t etnicy szyjnej. A-powierzchnia kontrolna, B-powierzchnia, na któr a po- dawano miejscowo Saratyn e (5 µl). Na powierzchni kontrolnej wida c liczne czerwone cia lka krwi oraz p lytki krwi. Na powierzchni, któr a poddano dzia laniu Saratyny wida c wyra znie mniejszy stopie n adhezji p lytek krwi. Fig. 8 Stenoza prze switu w procentach jako wtórne nast epstwo rozrostu warstwy wewn etrznej 2 tygodnie po endarterektomii t etnicy szyjnej. Pokazano grup e, w której aplikowano Saratyn e (n = 15) oraz grup e kontroln a (n = 10). Grupa, której aplikowano Saratyn e otrzymywa la miejscowo 5 µl roztwo- ru Saratyny podawanego na eksponowan a warstw e pod sródb lonkow a. Gwiazdki wskazuj a warto sci P = 0.004. Fig. 9 Przekroje t etnic szyjnych u szczura, ilustruj ace stopie n obni zenia rozrostu warstwy we- wn etrznej w t etnicach gdzie aplikowano Saratyn e (B) w porównaniu do grupy kontrolnej, gdzie nie stosowano Saratyny (A). IH= rozrost warstwy wewn etrznej. Tabela 1 Warto sci IC 50 okre slaj ace stezenie Saratyny konieczne do hamowania adhezji p lytek krwi w PRP od ró znych gatunków, wiaz acej si e z ludzkim kolagenem typu I oraz III oraz kolagenem skóry ciel ecej. Tabela 2 Wp lyw Saratyny na maksymaln a agregacj e (%) w PRP indukowanej przez ró znych antagonistów przy podanych warto sciach st eze n reagentów. Tabela 3 Czasy krwawienia oraz zliczenia p lytek krwi przed i po operacji. T a b e l a 1 Saratyna IC 50 ( µg ml -1 ) Zród lo osocza kolagen typu I kolagen typu III kolagen skóry ciel ecej ludzkie 0.2 0.9 0.3 swini 0.2 0.5 0.5 chomika 0.4 nie badano 7.0 myszy lub szczura 0.1 0.6 0.3PL 203 469 B1 17 T a b e l a 2 Agregacja (%) przy podanym st ezeniu Saratyny ( µg ml -1 ) Agonista 0 10 20 40 200 kolagen (0.5 µg ml -1 ) 62 67 63 64 0 ADP (0.5 µM) 66 64 69 82 88 rysotocetyna (0.9 mg ml -1 ) 61 67 75 63 nie badano kwas arachidonowy (1.0 mM) 66 66 67 57 nie badano U46619 (1.0 mM) 66 65 57 56 nie badano T a b e l a 3 Czas Warunki Zliczenia plytek krwi Czas krwawienia przed operacj a kontrola 752 ± 36.05 x 10 3 11.9 ± 0.91 min. przed operacj a Saratyna 829 ± 33.85 x 10 3 8.6 ± 0.62 min. 3 godz. kontrola 604 ± 34.2 x 10 3 10.8 ± 0.9 min. 3 godz. Saratyna 590 ± 76 x 10 3 9.1 ±0.5 min. 24 godz. kontrola 694 ± 117 x 10 3 12.9 ± 1.1 min. 24 godz. Saratyna 729 ± 19 x 10 3 11.5 ± 1.3 min. PL