KR20030028466A - 새로운 수상 세포 상호자극 분자 - Google Patents

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Abstract

신규한 상호자극 단백질 분자인, B7-DC는, B7 패밀리의 멤버로서, 이에 관한 코드화 DNA 및 이 DNA를 포함하는 발현 벡터로 기술된다. B7-DC 단백질, 프레그먼트, 혼합 폴리펩타이드들/단백질들 및 다른 기능적 유도체 및 B7-DC를 발현하는 변환된 셀들은 백신 조성물들 및 조성 방법들에 있어서 유용하다. 조성물들 및 조성 방법은, 항-종양 및 항 바이럴 면역에 반영될 수 있는 반응들을 매개하는 잠재 T 셀을 유도하는 것에 관하여 발견된 것이다.

Description

새로운 수상 세포 상호자극 분자{NEW DENDRITIC CELL CO-STIMULATORY MOLECULES}
T 림프구 반응의 발생은, 세포-세포 상호작용과 가용성 조정자(사이토카인 또는 림포카인)의 생성을 포함하는 복잡한 과정이다. 상기 반응은, T 세포 리셉터(TCR) 집합체를 포함하는 "리셉터(receptors)" 로서 작용하는 다수의 T 세포 표면 분자와 그 외 "부속물(accessory)" 표면 분자에 의해 조절되고, 다수의 세포 표면 "분화 항원(differentiation antigens)"은 단클론 항체("CD 분자")에 의해 최초로 포착된다.
모든 림프구의 선택적인 활성은 두개의 신호; 항원 특이 신호 또는 클론 신호 뿐만 아니라 제 2의 항원 비특이 신호를 요구하는 것으로 여겨진다(문헌 「Janeway, C., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 54:1-14(1989)」). 림프구가 이하 설명되는 B7 등의 소위 동시-자극 분자에 의해 동시-자극없이 단독으로 항원을 포착한 경우, 림프구는 또한 "아네르기(anergy)"라 칭하는 클론의 불활성(Schwartz, R. Science 248:1349(1990)) 또는 "세포자살(apoptosis, programed cell death)"의 반응을 하고; 동시-신호 자극이 제공되는 경우, 림프구는 자극하는 항원에 대해 특이한 클론 증식 반응을 할 것이다. 동시-자극이 없으면 주어진 항원에 대한 면역 반응의 어떤 신호의 증폭도 발생하지 않는다(June 씨 외. 문헌「Immunology Today 15:321-331, 1994」; Chen 씨 외. 문헌 「Immunology Today 14:483-486」; Townsend, SE 와 Allison 문헌 「JP(1993) Science 259:368-370」).
면역 반응의 질과 효과는 T 세포에 대한 항원을 처리하고 나타내는 항원 표출 세포(APC: antigen presenting cells)의 종류에 크게 의존한다. T 세포 리셉터와 결합할 수 있는 펩티드 항원/주요 조직적합 복합체(MHC, major histocampatibility complex) 리간드의 밀도와, 가용성 물질 및/또는 T 세포 결합과 활성 시에 항원 표출 세포에 의한 막 결합 동시-자극 신호의 제공이 중요하다. 상기 이유들에 의해 면역학적 치료의 전술은 (a)적절한 항원 표출 세포의 종류에 대한 타겟 항원과 (b)T 세포 활성을 향상하는 적절한 동시-자극 분자를 제공하는 데에 주안점을 두기 시작하였다.
T 세포의 활성화를 위해 요구되는 신호를 제공하는 항원 표출 세포는 단핵백혈구/대식세포와, B 림프구와, 가장 중요한 수지상 세포(DC)를 포함한다. 종래에는, 활성화된 대식세포가 생체 내에서 T 세포 반응을 개시하는 중요한 항원 표출세포 라고 여겨졌다. 이러한 관념은 항원을 효과적으로 제거하고 표면 전시와 표출을 위한 처리 능력에 의거한 것이다. 보다 최근에는, 생체 내에서 항원 특히 T 세포 반응의 주요 개시제로서 수지상 세포에 관심이 옮겨졌다. 수지상 세포는 활성화된 대식세포와는 구분되는 외형을 가지고, 뚜렷한 면역 반응을 개시할 수 있는 다른 특수형으로 구분되었다. 수지상 세포의 작용의 특징은 생체 외에서 천연의 T 세포를 활성화 하는데 대식세포에 비해 거의 100배 큰 효과를 가진다는 것이다. 오늘날에는, 이 효과에 대한 설명은 항원 표출에 대해 중요한 것으로 공지된 분자에서의 양적 차이에 기반을 둔다. 본 발명은 중요한 양적 차이의 발견에 의거한다.
항원 표출에서의 제 1 신호는 항원 퓨출 세포 상의 그룹 Ⅱ 주요 조직적합 복합체 (class Ⅱ MHC) 분자의 내용이 표출된 항원과 T 세포 리셉터의 상호작용에 의해 개시된다(문헌 「Allen, Immunol. Today 8:270(1987)」). 동시-자극 신호는 항원 표출 세포 상에 또한 표출되는 B7 계열로 특징지워진 다른 분자, 즉, B7.1, B7.2 그리고 아마도 B7.3로부터 도착한다.
T 세포의 표면 상에서 발현되는 두 개의 단백질은 B7 등의 동시-신호 분자에 대한 리간드 또는 대응-리셉터로 가장 특징지워진다. CD28은 T 세포 활성에 작용하는 가장 성숙한 인간 T 세포에서 발견되는 면역글로불린(Ig) 상과(superfamily)(문헌 「Aruffo and Seed, Proc. Natl. Acad. Sco. 84:8573-8577(1987)」)의 호모다이머(homodimer) 단백질이다. CD28은 휴면 T 세포 상에서 구조적으로 발현되고, 활성 이후에 증가한다. T 세포 리셉터를 통한 신호발생 이후에, CD28의 리간드는T 세포의 증식과 IL-2의 분비를 유도한다(문헌 「Linsley, PS, et al.(1991)J. Exp. Med. 173, 721-731」; 「Gimmi, CD, et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88, 6575-6579」; 「Thompson, C. B., et al. (1989)Proc. Natl. Acd. Sci. USA. 86, 1333-1337」; 「June, C. H., et al. (1990) Immunol. Today. 11, 211-6」; 「Harding, F. A., et al.(1992) Nature. 356, 607-609」). CD28은 세포-세포 접촉("세포간 접합(intercellural adhesion)")과, 면역반응에 필수적인 항원-독립적인 세포간 상호작용의 형성을 중재한다(문헌 「Springer et al. Ann. Rev. Immunol. 5:223-252(1987」).
CTLA4는, CD28과 상동인 T 셀 분자이나, 나머지 T 셀들 상에 표현되지 않고, 이하의 T 셀 활성화를 나타낸다(Brunet, J.F. et al., (1987) Nature 328, 267-270). CTLA-4는, 원래 뮤린 용해 T 셀 cDNA 라이브러리의 차동적 스크리닝에 의해 식별된다(Brunet et al. supra). B7에 대한 제2 수용체로서의 CTLA-4의 역할은 린슬리(Linsley et al. (1991) J Exp. Med. 174:561-569) 등에 의해 개시되었는데, 여기서, B7이 CD28보다 CTLA4에 대한 높은 친화력을 가지고 있음이 나타나있다. 프리맨 등(Freeman et al. (1993) Science 262:907-909)에는 B7가 결여된 쥐들에 있어서 CTLA-4에 관한 바가 개시되어 있다. CTLA-4의 리간드들은 렌쇼우 등(Lenschow et al.(1993) Proc. Nat'l. Acad. Sci. 90:11054-11058)에 의해 개시되어 있다.
Th 셀들은 성장을 시크리트하고, Th-B 셀의 영역에서는, 목표된 방법으로 IL-2, IL-4 및 IL-6과 같은 차동성-유발 사이토킨들이 접촉되는데, 이는 오직 Th 셀들의 항체로서 존재하는 B 셀들의 활성화를 확정하도록 돕고, 바이스탠더 B 셀들의 활성화를 막는다.
CD28 및 CTLA-4는, 일반적으로 B7으로 알려진 상호-자극 분자와 상호반응한다. B7은 일반적으로 B 셀 활성화 항체로 기술되었는데, 이는 이것이 B 셀 상에서 발견되고, B7/BB-1로 칭해졌기 때문이다(Linsley et al. Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 87:5031-5035(1990), 이하, 이 분자를 B7, B7-1 또는 B7.1로 칭할 것이다). B7 및 더욱 최근에 기술된 B7 상동체는 또한, Ig 수퍼패밀리의 맴버이다. CD28 및 CTLA-4에 비하여, B7은 두 개의 외부셀룰러 Ig 도메인들을 포함하는데, 이는 상수형 도메인에 앞서는 N-터미널 변수형 도메인이다.
B-7 패밀리 맴버들은 일반적으로 APCs 상에 표현되고, 알려진 바와 같이, 원 T 셀들의 활성화에 있어서 결정적인 중요성을 갖는다. 이들 패밀리 맴버들은, B7-1(=B7, 또는 CD80) 및 B7(또는 CD86)을 포함한다. B7-1을 기술하는 참조 문헌들은 (Schwartz, R. H. Cell 71:1065-1068, 1992; Chen, L. et al. Cell 71: 1093-1102; Freeman, G. J. et al. J. Immunol 143:2714-2722, 1989; 및 Freeman, G. J. et al. J. Exp. Med. 174:625-631, 1991)이다. B7-2를 기술하는 참조 문헌들은 (Freeman, G. J. et al. Science 262:909-911 813-960,1993)이다. 또한, 쥐과의 B7-1 및 B7-2, 및 인간의 B7-1 및 B7-1 모두 기술되었다(Freeman, G. J. et al.,1989,supra; 1991,,supra; 및 1993, supra). 활성화된 인간의 림프구는, B7-2 및 B7-3의 억제-수용체들에 묶인 CTLA4/CD28을 표현하고, 이들 양쪽 모두 상호자극 신호들을 CD28 또는 CTLA4를 통하여 T 셀들에게 전달할 수 있다.
B7-2는, B 셀들에 의해 항-Ig 또는 항- MHC 클래스 II mAbs와의 자극에 이은약 24 시간 후에 표현된다. B7-2는 감지할 수 있는 IL-2 시크리션 및 T 셀 증식을 유도한다. 활성화 후 약 48시간에서 72시간까지는, B 셀들은 B7-1 및 mAb BB-1(Yokochi, T, et al.(1982)J. Immunol. 128, 823-827)에 의해 식별되는 제3 CTLA4 억제-수용체 모두를 발현시키는데, 이를 B7-3이라 칭한다. B7-3은 또한, B7-네거티브 활성화된 B 셀들 상에 발현되고, 감지가능한 IL-2 생산 없이, T 셀 증식을 상호자극할 수 있는데, 이는 B7-1 및 B7-3 분자들이 분리되었음을 표시한다. B7-3은, 활성화된 B셀들, 활성화된 백혈구, 수상 세포들, 랑거한스 셀들 및 케라티노사이트들을 포함하는 셀들의 넓은 변종 상에 발현된다. B 셀 활성화 72 시간 후에는, B7-1 및 B7-3의 발현이 둔화되기 시작한다. 활성화된 B 림프구의 표면 상에서 억제-수용체들에 묶인 이들 CTLA4/CD28의 존재는, T 셀 상호자극이 부분적으로, B 셀 활성화에 따른 이들 분자들의 주기적인 발현에 의해 조정됨을 표시한다.
B7:CD28/CTLA4 상호자극 패스웨이의 중요성은 전후에 의해 자명하다. 증가된 T 셀 활성화 및 증가된 B7 발현 사이에 직접 관계가 존재한다(Razi-wolf et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4210-4214(1992)). T 셀들은 면역성이 결여되는데, 이때, 이들은 상호자극 패스웨이의 CD28 블록케이드가 묶인 상호자극 리간드가 부족한 셀들 상에서 펩타이드 항체를 만나고, 그 결과, 쥐과 및 인간의 시스템에 특히 수용가능한 항체를 발전시키게 된다(Harding et al., supra; Lenschow, D.J. et al. (1992) Science. 257, 789-792; Turka, LA et al.(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89. 11102-11105; Gimmi, CD et al.(1993)Proc. Natl. Acad. Sci USA 90, 6586-6590;Boussiotis, V. et al.(1993) J. Exp. Med. 178, 1753-1763).반대로, B7-네거티브 쥐과의 종양 셀들에 의한 B7의 발현은, 종양 제거에 의해 수반된 T-셀 매개 특이 면역을 유도하고, 종양 챌린지에 대한 보호가 오래 지속된다(Chen, L, et al.(1992)Cell 71:1093-1102; Yownsend et al.,supra;Baskar,S, et al.(1993)Proc. Natl. Acad. Sci. 90,5687-5690.). 그러므로, B7:CD28/CTLA4 패스웨이의 조작은, 큰 잠재성을 제공하여 인간 내의 면역 반응을 자극하거나 억제한다.
CD28과 B7 사이의 상호활성화는, Ig Cγ1 체인을 갖는 B7 또는 CD28의 외부셀룰러 부분의 유전적 혼합을 사용하여 특정되었다(Linsley et al. (1991) J Exp. Med. 173:721-730(1991)). B7Ig 혼합 단백질들이 고정되면, 혹은, B7이 감염된 CHO 세포와 같은 세포의 표면 상에 발현되면, 그들은 T 셀 증식을 상호자극한다. B7+CHO 셀과의 T 셀 자극은 또한 특이적으로 IL-2에 대한 전사 레벨들을 자극한다.
미국 특허 제 5521288호는 CD28 양성 T 셀을 B7을 코드화한 DNA의 부분에 의해 코드화된 프레그먼트들과 접촉함에 의해 면역 반응을 조정하는 방법을 기술하는데, 특히, B7의 외부 셀룰러 도메인(ECD)에 관한 것이다. 면역 반응들은 또한, 적어도 B7 ECD 및 다른 단백질의 부분을 포함하는 혼합 단백질 구조인 B7의 유도체에 의해 조정되었는데, 이러한 단백질은 가용성이 변하는 인간의 IgCγ1 도메인과 같은 것으로, B7의 원자가 및/또는 친화력으로 묶는다. 예를 들면, B7-ECD의 1-215부터 아미노산 잔류물을 코드화하는 DNA는, 인간의 IgCγ1의 힌지, CH2 및 CH3 영역에 관련된 시퀀스의 아미노산 잔여물을 코드화하는 DNA에 합쳐지고, B7Ig 혼합 단백질에 코드화된 DNA 혼합물을 형성한다. 또한, B7 또는 B7Ig 혼합 단백질을 처리하여 CD28 수용체와 묶음으로써 T 셀들과 반응시키는 방식의 T 셀들에 의해 매개되는 면역 시스템 질환을 다루는 방법이 개시된다. 이식 대 호스트 질환에 있어서 T 셀 증식은, CD28+T 셀들과, B7 항체 또는 면역억제제와 결합한 B7Ig 혼합 단백질을 반응시킴으로써 회피된다.
미국특허 제5861310호는, B7-2 및 B7-3을 포함하는 하나 이상의 T 셀 상호자극 분자를 발현하도록 조정된 종양 세포들을 개시한다. 일 실시예는 B7의 발현을 부가적으로 포함한다. 조정은 B7-2, B7-3 또는 B7 단백질들을 코드화하는 핵산과의 감염에 의해 이루어진다. 종양 셀들 또한, 유전적으로 유사한 방법으로 조정된다. 상술한 바와 같이 조정된 종양 셀들은 종양 환자를 치료하는 데에 유용하고, 메타스테틱 확산을 막거나, 종양의 재발을 막는다. 이 기록은, 종양에 대하여 CD4+ T 셀 반응을 특이적으로 유도하는 방법을 개시하였다.
미국 특허 제5942607호는, T 셀 활성화를 자극하는 신규한 CTLA4/CD28 리간드들을 코드화하는 분리된 핵산들을 개시한다. 일 실시예에 있어서, 분리된 핵산이 B7-2로 코드화된다. 또한, 적어도 개시된 총 길이의 B7-2 시퀀스의 일부를 포함하는 핵산이 개시된다. 이 기술에 의하면, 핵산 시퀀스는 가변 발현 벡터 내에 집적되는데, 이는 포유류 및 곤충 세포를 포함하는 다양한 호스트 셀들 내의 관련 단백질들 또는 펩타이드들의 합성을 검출할 수 있다. 또한, 이들 핵산 시퀀스들에 의해 코드화되고, B7-2 시퀀스의 적어도 일부를 포함하도록 분리된 단백질들 또는 펩타이드들을 생성하도록 감염된 호스트 셀들이 개시된다.
B7 패밀리의 제3 멤버를 기술하는, 동 등(Dong H et al., Nat Med 19995:1365-1399)은, B7-H1이 CD28, CTLA4 또는 ICOS(Inducible CO-Stimulator) 중 하나와 묶이지 않음을 나타낸다. B7-H1 결찰은, 폴리클로널 자극체 및 동종 항원에 T 셀 반응에 상호자극되고, 바람직하게는, 인터레우킨-10의 생성에 자극된다. IL-2는, 소량이 생성되는데, B7-H1 상호-자극의 효과에 대해 요구되었다.
이 연구는 이전에 알려지지 않은, 세포에 전달되는 면역 반응의 부정적인 규칙과 관련될 수 있는, 상호-자극적인 분자를 정의했다. 같은 연구(Wang Set al., Blood. 2000;96:2808-2813)는, 단핵에서 유래된 미완성의 DCs의 표면에서 인지한 표현인, B7-H2로 지정된 새로운 인간의 B7과 같은 유전자를 설명했다. 용해가능한 B7-H2와 Ig가 융해된 단백질인 B7-H2Ig는 유휴상태가 아닌, 활성화된 T 세포에 결합되어 있다. 이 결합은 CTLA4Ig가 아닌 ICOS(ICOSIg)의 용해가능한 형태에 의해 억제되어 있다. ICOCIg는 B7-H2 유전자로 감염된 CHO 세포를 착색한다. 자극제로서 CD3의 차선적인 상호 연결을 사용함으로써, B7-H2Ig에 의한 T 세포의 증식의 상호자극은 IL-2의 분비와 용량-의존적이며, 상호 관계가 있다는 것이 확인되었다. 반면, 최적의 CD3 결찰은 우선적으로 IL-10 생산물을 자극하는 것이 확인되었다. 저자는 B7-H2는 ICOS T셀 분자에 대한 추정 리간드라고 결론지었다.
Swallow MMet al., Immunity, 1999, 11:423-432는, 새로운 유전자 b7h의 복제는 APCs로 표현되는 B7 분자와 유사한 동족체라고 발표하였다. B7h는 CD28이나 CTLA-4와는 다른 수용체로 동작함으로써 정화된 T 세포의 증식을 상호 자극한다. 놀랍게도, B7h가 자극되지 않은 B 세포로 표현됨에도 불구하고, 그 표현은 TNFα로처리되는 비림프조직 세포(3T3 세포; 미발달된 섬유아 세포)에서 유도되었으며, TNFα의 유력한 활성체인 LPS로 처리되는 쥐의 비림프조직으로 규칙화되었다. 이러한 연구는 T 세포의 새로운 상호 자극 리간드를 정의하였고, TNFα에 의한 B7h의 유도가 염증시에 자기 인식을 직접적으로 증가시킬 수도 있음을 제시하였다.
Yoshinaga SKet al., Nature, 1999, 402:827-832는, 쥐가 매개하는 상호 자극적인 새로운 수용체 리간드 쌍을 서술하였다. CD28과 관련된 수용체는, 인간 단백질 ICOS의 쥐의 동족체이며, 활성화된 T 세포와 휴지 기억의 T 세포로 표현된다. 이 리간드는 B7-관련 단백질-1(B7RP-1)로 명시된 B7 분자의 동족체이다. B7RP-1은 쥐의 B7.1(CD80)과 B7.2(CD86)와 각각 20%, 19% 아미노산과 동일한, 일종의 트랜스멤브런스 단백질이다. 이 동족체는 B7.1과 B7.2와 27% 동일한 단백질을 공유하는 것으로써 의미가 있다(Frreeman, GJet al., J. Exp. Med. 178:2185-2192(1993)). 이 동족체는 보존된 장소(초기 메티오닌으로부터 62, 138, 185 및 242에 잔류하는)에서 Ig 루프 형성에 있어 중요한 시스테인을 포함한다. 총체적인 길이는 B7RP-1의 트랜스멤브란스 영역의 상대적인 위치는 B7 분자의 그것과 유사하다(Greenfield, EA et al., Crit. Rev. Immunol. 18:389-418(1998)). B7RP-1은 B 세포와 마크로페이지로 표현되는 것으로 보여진다. ICOS와 B7RP-1은 CD28-B7 경로에서 단백질과 상호작용하지 않았으며, B7RP-1은 CD28과 독립적으로 T 세포를 상호 자극했다. B7RP-1과 Ig의 Fc 부분("B7-RP1-Fc")의 용해 단백질을 나타내는 이식유전자 쥐는 비장, 림프 노드와 Peyer 패치에서 림프 증식이 있었다. 생체 안에서의 B7RP-1의 상호 자극 활동은, 항원의 도전이 있을때 B7RP-1-Fc로 처리된 항원에 미리 민감해진, 강화된 지연-형태의 과민증을 설명함으로써 발견되었다. 저자는 ICOS와 B7RP-1은 구조적으로 CD28-B7과 관계되고, 적응적 면역 응답과 관계된 새로운 수용체 리간드 쌍을 정의하는 것으로 결론지었다.
Yoshinaga SKet al., Int Immunol, 2000 Oct, 12:1439-1447은, 인간의 B7RP-1과 ICOS의 상호작용을 통한 인간 T 세포의 상호 자극을 발표하였다. 이 리간드 수용체 쌍은 약 33nM와 10분보다 큰 t(1/2)를 가지는 오프 레이트의 KD와 상호작용하였다. TNFα는 B 세포, 모노사이트와 DC에 대한 인간의 B7RP-1의 표현을 차별적으로 규제하였다. TNFα는 B 세포와 모노사이트에 대한 B7RP-1 표현을 강화하고, DC에 대한 표현은 제한하였다. 인간 B7RP-1-Fc 단백질은, 즉 멤브란스-바운드 B7RP-1로 표현되는 세포는, 생체 내에서의 T 세포의 증식을 상호 자극하였다. IFNγ와 IL-10과 같은 특별한 사이토킨은 B7RP-1 상호 자극제에 의해 유도되었다. IL-2 레벨이 상당하게 증가하지 않아도, B7RP-1은 IL-2에 의존적인 상호 자극제를 유도하였다. 이러한 연구는 쥐의 B7RP-1에 대한 인간의 오르톨로그를 정의하였고, 인간의 ICOS와의 상호작용을 특성화하였다.
PD-1은 활성화된 T, B 및 골수성 세포에 의해 표현되는 면역-제한 수용체이다. 쥐의 PD-1 결핍은 말초부의 내성의 손실로 인한 다중적인 자동 면역의 형태를 보여주었다. Freeman, GJet al., J. Exp. Med. 192:1027-1034(2000)은 PL-1(PL-L1)의 리간드가 B7 유전자과의 멤버임을 보고하였다. PD-L1에 의한 PD-1의 결합은 TCR-전달된 림프구 증식의 제한을 가져왔다. 게다가, PD-1 시그널링은 CD28-전달된상호자극의 차선적인 레벨을 제한하였다. PD-L1은 APCs(INFγ에 의해 자극되고, DCs에 의해 활성화된 인간의 모노사이트)에 의해 표현된다. 더욱이, PD-L1은 심장과 폐에서 나타나는 것이 보여졌다. 저자는 APCs에서의 제한적인 PD-L1 신호와 상호자극의 B7-1/B7-2 신호의 상대적인 크기가 T 세포의 증식과 내성과 자동면역의 역치의 범위를 결정한다고 서술하였다. 비림프조직에서의 PD-L1의 존재는 염증이 일어난 부위의 면역 응답에 기여할 수 있다.
상기 문서의 언급은 어드미션으로 의도된 것이며, 따라서 앞서 말한 것 중 어느 것도 적절한 선행 기술이 될 수 없다.
생화학과 의학 분야의 본 발명은 수지상 세포(dendritic cell)의 표면 상에서 선택적으로 발현되고, 면역 반응을 자극하는 백신 조성물 내의 세포 표면 분자 또는 가용성 물질로 사용될 수 있는 신규의 단백질에 관한 것이다.
도 1은 인간 염색체 9p24에 위치한 hB7-DC의 지도를 도시한 다이어그램이다.hB7-DC maps to BAC clone RPCI-11.2.
도 2는 DCs 와 매크로페이지 사이에서 달리 표현된 B7-DC를 보이고 있다. 골수 DCs, 비장DCs, 매크로페이지, 매크로페이지 라인과 조직에 있는 B7-DC mRNA 분포는 1% 아가로우스(agarose) 젤 상태에서 0.5㎍/lane 정화된 DNA를 사용한 사실적인 northern blot 분석을 통하여 평가되었다. G3PDH가 조정물로 사용되었다.J774A1, Raw264.7, Pu5-1.8 and WEHI 세포는 매크로페이지 세포줄기이다.
도 3은 사람 DCs의 virtual Northern blot B7-DC 표현을 도시하고 있다. 1번 레인은 GM-CSF + Flt-3L 로 배양된 인간 DCs를 도시하며, 2번 레인은 인간태반을 도시하며, 3번 레인은 GM-CSF + IL4 로 배양된 인간 DCs를 도시한다. 인간 B7-DC의 5'과 3' UTR 로 부터의 올리고 핵산은, 인간 DCs의 총 RNA를 분석하는 virtual Northern 분석에 사용되는 PCR-DNA 프로브를 제작하기 위해 사용되었다. β-액틴은 mRNA의 품질을 확보하기 위한 조정물로 사용되었다.
도 4는 성숙된 BM-DCs에서 B7-DC의 표면 단백질 합성을 보이고 있는 세포학적 분석흐름을 나타낸다. Day 9에 쥐과동물의 BM-DCs는 Fc-블록되었거나 조정항체또는 B7-DC 항혈청에 오염되었다.
DCs의 표면과 anti-B7-CD의 결합과 경쟁하기 위해 B7-DC-Ig 를 첨가함으로써 결합의 특이성을 증명하였다.
도 5는 CTLA-4나 CD28이 아닌 PD-1으로 B7-DC이 결합한 것을 나타낸다.
293T 셀들은 pCAGGS-B7.1opCAGGS-B7-DC에 의해 일시적으로 세포로 감염되었다. 감염된 것들은 PE로 표식된 2차 항체에 따른 PD-1이나 PD-1과 CTLA-4-Ig의 결합 분자들에 의해 착색된다(Stained).
도 6(왼쪽과 오른쪽 패널)은 Anti-CD3와 B7-DC-Ig에 의해 증식된 T셀의 상호 자극을 나타낸다.
왼쪽 그래프 : 정제된 T셀(CD4+CD8)들은 그 농도가 점차 증가하는 Anti-CD3(mAb 2C11)와 고정된 농도(0.1㎍/ml)를 갖는 B7.1-Ig(◆), B7-DC-Ig(●) 또는 동기준 표본(Isotype) 제어(▲)에 의해 미리 코팅된 우물(Wells)에서 배양되었다. 결과는 셋 중에 대표적인 하나의 실험을 나타낸다. 셀들은 72시간 동안 배양되고 H-티미딘(Thymidine)에 의해 표식되며 분당 카운트된다(CPM; Count per minutes).
오른쪽 그래프 : 정제된 CD8 T셀들은 그 농도가 점차 증가하는 Anti-CD3와 고정된 농도(0.1㎍/ml)를 갖는 고정된 B7.1-Ig(◆), B7-DC-Ig(●) 또는 동기준 표본(Isotype) 제어(▲)에 의해 미리 코팅된 우물(Wells)에서 배양되었다. 결과는 둘 중에 대표적인 하나의 실험을 나타낸다. 셀들은 72시간 동안 배양되고 H-티미딘(Thymidine)에 의해 표식되며 분당 카운트된다(CPM; Count per minutes).
도 7은 항원 특성을 갖는 T셀의 증식 반응의 상호 자극을 나타낸다. RENCA 셀들은 MHC 클래스-2 합성을 유도하기 위해 72시간 동안 IFN처리되었으며, 12.5 ㎍/ml의 HA110-120 펩타이드에서 배양되었다.
정제된 HA + I-Ed특성의 이식유전자에 의한(Transgenic) T셀들은 가용성인 B7.1-Ig(◆), B7-DC-Ig(●) 또는 동기준표본 제어(▲) 중 어느 하나의 농도가 점차증가하도록 서로 첨가되었다. 셀들은 48시간 동안 배양되었고 H-싸이미딘(Thymidine)에 의해 표식되며 분당 카운트되며, 결과는 셋 중에 대표적인 하나의 실험을 나타낸다.
도 8은 B7-DC에 의해 상호자극된 T셀들의 세포질분열 분비물(액)을 나타낸다.
상위 패널 : 정제된 T셀들은 도 6의 왼쪽에 도시된 바와 같이 0.12㎍/ml 농도의 Anti-CD3와 0.1㎍/ml의 고정된 농도를 갖는 고정된 B7.1-Ig(◆), B7-DC-Ig(●) 또는 동기준 표본(Isotype) 제어(▲)에 의해 미리 코팅된 우물(Wells)에서 배양되었다. 결과는 셋 중에 대표적인 하나의 실험을 나타낸다.
하위 패널 : ν-IFN 처리된 RENCA 셀들은 12.5㎍/ml의 HA(110-120) 펩타이드에 적재된다. HA(110-120) 펩타이드는 정제된 HA + I-Ed특성의 이식유전자에 의한 T셀들과 2㎍/ml의 상기한 심볼을 갖으며 가용성인 B7.1-Ig, B7-DC-Ig 또는 동기준표본 제어 들이 서로 결합되어 배양되었다. 결과는 둘 중 하나의 대표적인 실험을 나타내며, 상청액들(Supernatants)은 24시간과 48시간의 배양후에 모아져서 ELICA를 사용해서 지시된 림포카인(Lymphokines)에 대한 효력 검사가 실시되었다.
도 9는 생체에서의 상호자극 후 B7-DC-Ig의 항체 특성이 크게 증식되었음을 나타낸다.
2.5*106개의 TCR 이식유전자에 의한 셀들의 HA에 대한 특성의 어답티브 트랜스퍼(Adoptive transfer) 후, 세 그룹의 쥐들은 면역성이 주어졌으며(Immunizeds.c), 쥐들의 뒷다리는 HA 펩타이드(110-120) 또는 불완전한 IFA(Freund's adjuvant)의 따로 또는 그들이 혼합된 B7-DC-Ig + IFA 또는 IFA와 동기준표본 제어 항체들이 처방되었다.
림프절의 배출(Draining lymph nodes)은 정확히 7일에 수확되었다. 1.5 ×105LN 셀들은 48시간 동안 HA 펩타이드에서 배양되었으며, 12시간의 한정된 시간 동안 1μCi[3H] 티미딘과 방사능 처리되었다.
T세포 활성화를 위한 새로운 수지상 세포(dendritic cell)(DC)의 특정 상호자극 분자(costimulatory molecules)를 암호화하는 유전자를 규정하기 위하여, 본 발명의 발명자는 DC와 활성화된 마크로파지(macrophage) 간의 공제된(subtracted) cDNA 라이브러리(library)를 가려내었다(screened). 상기 cDNA의 공제를 통한 접근은 DC에 의해서는 발현되지만, 활성화된 마크로 파지에 의해서는 발현되지 않는 유전자를 정의한다. 이러한 접근법의 사용은 T세포의 활성화에 의존하는 백신의 잠재력을 강화시키는데 유용한 새로운 DC의 특정 유전자(DC-specific genes)를 발견할 수 있게 하였다. 본 출원은 그러한 유전자에 관한 것이다.
본 발명에 의하면, DC라이브러리에는 있고, 활성화된 마크로파지 라이브러리에는 없는, "B7-DC"라 불리는, 새로운 암호(code) 서열가 규명되었다. 상기 B7-DC유전자는 상호자극 분자를 암호화하는 유전자의 B7군의 한 구성요소이다. B7-DC은 DC-특성 발현(DC-specific expression)과 다른 수용체 특성을 갖는 B7군의 첫번째 구성요소이다. 본 유전자의 산물은 T세포를 자극하기 위한 DC들의 독특한 특성을 조정하는 중요한 역할을 한다. 기능적 분석에 의하면, B7-DC는 T세포에 의해 IFNγ산물을 자극하는데 B7-1보다 더욱 활성화된다. 따라서, B7-DC DNA와 폴리펩디드(polypeptides)는, 항원 특성(antigene-specific)을 갖는 경우나 갖지 않는 경우에 모두, 세포단위 및 분자단위의 백신 합성의 효능을 강화시키는 합성 또는 방법에 유용하다.
본 발명은 일실시예로서, 활성화된 마크로파지와 비교할 때 수지상 세포에서 선택적으로 발현되는 B7-DC라 불리는 포유동물의 단백질을 암호화하는 고립 핵산 분자(isolated nucleic acid molecule)를 제공한다. 상기 핵산 분자는 서열 SEQ ID NO : 1 (인류) 또는 SEQ ID NO : 5(설치류) 중에서 선택된 뉴클레오다이드(nucleotide) 서열을 포함하는 것이 바람직하다. 본 발명은 또한 엄중한 교잡 조건하에서 상기 핵산분자를 교잡하는 고립 핵산을 감독한다. 바람직한 엄중한 조건은 약 50°C의 0.2X 나트륨 클로라이드/나트륨 시트레이트(sodium chloride/sodium citrate)(SSC)의 세정(wash)을 뒤따르는 약 45°C의 6X 나트륨 클로라이드/나트륨 시트레이트(sodium chloride/sodium citrate)(SSC)에서의 잠복기를 포함한다. 상기 핵산 분자는 뉴클레오타이드 서열 SEQ ID NO : 1을 포함하는 것이 바람직하다. 상기와 같은 바람직한 핵산 분자는 SEQ ID NO : 2와 SEQ ID NO4로부터 선택된 아미노산을 갖는 단백질을 암호화하거나, 생물학적으로 능동 프래그먼트(active fragment), 동족체(homologue) 또는 다른 기능을 갖는 SEQ ID NO : 2의 유도체를 암호화한다.
바람직한 실시예에서, 상기 핵산 분자는, 상호 자극(co-stimulatory) 동족체, 프래그먼트 또는 그들의 다른기능을 갖는 유도체를 암호화하는 상기 B7-DC 단백질의 세포외(extracellular) 범위를 암호화한다.
다른 실시예에서, 상기 B7-DC 융합 단백질의 암호화하는 핵산 분자는
(a) B7-CD 단백질(바람직하게는 SEQ ID NO : 2 또는 SEQ ID NO : 4)의 전체 또는 일부인 제1폴리펩티드를 암호화하는 제1핵산 서열
(b) 선택적으로, 상기 제1핵산서열의 구조에 융합되고, 상기 링커(linker)펩티드(peptide)를 암호화하는 링커 핵산 서열; 및
(c) 상기 제1핵산 서열 또는 링커 핵산 서열 구조에 연결(link)되고, 제2폴리펩티드를 암호화하는 제2핵산 서열.
을 포함한다.
상기 제2폴리펩티드는 하나 또는 그 이상의 Ig 중연쇄(heavy chain) 상수 영역의 범위와, 바람직하게는 두개의 C 범위 인류의 IgG, 더욱이 IgG1으로 구성한다.
또한,
(a) 프로모터(promoter) 및
(b) 선택적으로, 진핵세포의 핵산의 발현을 조절하는 추가적인 조절 서열(regulatory sequence)과 효과적으로 연결된 상기 핵산 분자의 어떤 것도 포함하는 발현 병원를 제공한다.
상기 발현 병원는 플라스미드(plasmid) 또는 바이러스성의(viral) 병원일 수 있다. 상기 병원들은 패키지화된 세포라인에서 배양되는 자기복제 RNA 레플리콘(replicon)(DNA-전사 또는 RNA), 자살 RNA 병원 DNA 바이러스(아데노 바이러스(adenovirus), 백시나 바이러스(vaccina virus) 등) 및 RNA 비리온(virion)을 포함한다.
상기 병원 DNA 또는 RNA는 숙주로 분무조절되어(gun-mediated) 유입되는 골드 파티클(gold particles)로 중합되거나, 다른 폴리머(polymer)로 중합되는데, 예를 들면, 세포 및 조직의 원하는 부분으로의 방출을 강화하는 제어된 방출 공식에 의한다.
또한, 병원 결합물은
(a)면역 반응이 유도되는 항원을 암호화하는 핵산을 구성하는 서열이 그 항원의 서열속에 중합되는 제1재조합 발현 방응
(b)B7-DC 폴리펩티드 또는 생물학적으로 능동적인 프래그먼트, 동족체, 다른 기능성 유도체 중의 적어도 하나에 폴리펩티드 상호자극체를 암호화하는 핵산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열을 더욱 구성하는 서열속에 합쳐진 제2재조합 발현 병원.
을 포함하며, 상기 발연 병원체들은 단백질 및 상호자극 폴리펩티드, 프레크먼트, 동족체나 유도체의 상호 발현의 결과로, 숙주 세포을 상호 전염시키거나 세포로 감열시킬 수 있다.
상기 실시예의 변형예에서, (i) 발현시킨(expressed) 제품(항원(antigen))의퍼짐(spread)을 촉진시키고, (ii) 핵산(nucleic acid)이 발현되는 상태에서 APCs 상의 항원의 디스플레이(display)를 증가시키며, (iii) 리-프리젠테이션(re-presentation)(크로스-프리밍(cross-priming)) 및 병원(vector)이 유입되는 숙주(host)의 APCs에서 항원의 디스플레이를 촉진시키는 타킷 단백질을 암호화(encoding)하는 제3 핵 연속(uncleic sequence)을 제공한다. 상기 타킷 단백질 핵산 암호화는 항원 또는 상호 자극체(co-stimulator) 또는 둘 모두를 암호화하는 핵산으로 용화될 수 있다. 제1 및 제2 병원의 산은 핵산을 포함한다. 일 실시예에서, 상기 병원 합성은 3개의 항원 암호화 핵산과, 상기 상호 자극체 암호화 핵산(바람직하게 B7-DC) 및 "타킷" 단백질 암호화 핵산을 단일 융합 구성으로 결합시킨다.
본 발명은 상기한 어떠한 핵산 분자 또는 발현 병원으로 변화되거나 감염된 세포를 포함한다. 바람직하게, 상기 세포는 진핵(eukaryotic) 세포, 바람직하게는 포유류의 세포, 보다 바람직하게는 인간 세포이다. 상기 세포는 수지상 결정 세포 또는 그의 원본(progenitor)으로 될 수 있다. 다른 실시예에서, 상기 세포는 종양 세포, 바람직하게 면역성의 응답을 요구에 대하여 숙주에서의 종양에 대한 항원과 같은 항원, 또는 미 반응하는 항원을 견디는 악성 종양 세포이다.
바람직한 실시예는, 포유류의 B7-DC 단백질(바람직하게는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO:4)을 암호화한 외인성 핵산 분자 또는 생물학적으로 활동적인 프레그먼트(fragment), 동족체(homoloque)나 다른 기능성 유도체(derivative)로 감염된 격리된 포유류 종양 세포로 되어, 상기 단백질, 프레그먼트, 동족체나 유도체가 종양세포에 의하여 표현될 경우, 상기 종양 세포는 다음의 T 세포들과 접촉된다.
(i) T 세포들에 결합된 B7-DC 단백질, 프레그먼트, 동족체나 유도체; 및
(ii) 세포질 분열을 제공 및 숨기거나, 증식시키기 위하여 T 세포들을 상호 자극하는 종양 세포.
또한, 본 발명은 활동적인 마이크로퍼지스(macrpphages)에 대하여 수지상 결정 세포들로 선택적으로 표현되고, 다음의 기능 특성을 갖는 폴리펩티드(polypetide)에 관한 것이다.
(i) T 세포들상에서 결합 파트너로 결합된 것
(ii) 세포질 분열을 제공 및 숨기거나 증식시키기 위하여 상호 자극하는 것.
또한, 본 발명은 생물학적으로 활동적인 프레그먼트, 동족체나 폴리펩티드의 다른 기능의 유도체를 포함한다.
상기 폴리펩티드, 프레그먼트, 동족체 또는 기능 유도체는, 바람직하게 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO: 5의 서열을 갖는 핵산 분자나, 프레크먼트, 동족체나 핵산 분자의 동등물에 의하여 암호화된다. 바람직하게, 상기 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO: 4의 아미노산 서열을 갖는다.
상기 폴리펩티드 또는 생물학적으로 활동적인 프레크먼트, 동족체나 다른 기능성 유도체의 펠리펩티드는 상기한 핵산중의 하나의 제조합형 표현에 의하여 제공될 수 있다.
바람직하게, 폴리펩티드는 다음과 같이 B7-DC 단백질의 세포질외의 범위를 포함한다.
(a) SEQ ID NO:2(인간)의 아미노산 잔유물 26-221 또는
(b) SEQ ID NO:4(쥐)의 아미노산 잔유물 26-221.
상기한 폴리펩티드는 B7-DC의 세포질외 범위를 본질적으로 구성할 수 있다.
또한, 본 발명은
(i) 제2 폴리펩티드에 직접적으로 융합되거나,
(ii) 선택적으로, 제2 폴립텝티드에 용합될 수 있는 링커 펩티드 서열에 융합되는
모든 또는 일부분의 B7-DC 단백질을 포함하는 제1 융합을 갖는 B7-DC 핵융합 폴리펩티드이다.
또한, 상기한 B7-DC 융합 단백질은, 바람직하게 인간 면역글로블린 Cｒ1 연쇄의 범위 CH2 및 CH3 힌지에 대응하는 아미노산 서열을 갖는 하나 이상범위의 Ig 중연쇄 일정 영역에서 제2 폴리펩티드에 융합된다.
상기한 융합 단백질의 일실시예에서, 상기 제1 융합 파트너는 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:4인 총 길이 서열의 세포질외 범위의 B7-DC 단백질이다.
바람직하게, 상기 융합 단백질은 T 세포들상에서 결합 파트너로 결합되고, T 세포 수용체로 충분한 자극을 주는 상태에서 T 세포들을 상호 자극한다.
또한, 본 발명은 상기한 융합 단백질의 2분자체 또는 3분자체인 2분자 또는 3분자 융합 단백질이다. 바람직하게, 상기 연쇄(chains)는 2황화물 결속(bond) 또는 다른 내부연쇄(interchain) 공유 결속을 통해 세로로 나란히 연결된다.
바람직한 2분자체 융합 단백질에 있어, 상기 2분자체는, 2분자체화된 IgH 연쇄에서 연결된 2황화물인 동일 Cys 잔유물인 2개의 Ig 중연쇄의 CH영역에서 Cys 잔유물의 공유 결속으로부터 이루어진다.
본 발명의 융압 단백질은 하나 이상의 단량체(monomers) 사이에 링커(linker) 서열에 직접적으로 끝과 끝을 세로로 연결하는 제2 융합 파트너의 둘 이상의 연속적인 반복의 다중 결합을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 B7-DC 단백질의 에피토프(epitope)에 대하여 특정한 항체를 제공하며, 상기 에피토프는 B7 일족 단백질의 공지의 일원에서 현존하지 않는 것이다. 상기 에피토프는 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:4의 폴리펩티드의 선형 또는 정합(conformational) 에포토프일 수 있다. 바람직하게, 상기 항체는 단일세포로부터 유래하는 세포인(monoclonal) 항체이고, 보다 바람직하게는 인간 또는 인간화된(엔진니어링을 통하여) 단일세포로부터 유래하는 항체이다.
또한, 세포집단의 표면 위에 B7-DC 폴리펩티드라고 표현되는 세포들을 정형화, 혹은 정량화 하기 위해 상기와 같은 항체를 사용한 방법을 제공한다. 구성은 다음과 같다.
(a)항체들은 에피톱(항원결정기)라고 하는 세포들에 결합되어 있고, 상기한 항체와 함께 집단의 세포들을 접촉한다;
(b)항체가 연결되어 있는 많은 세포들을 정량화하거나, 그 앞에서 산정한다.
다른 방법은 세포집단으로부터 그 표면 위에 B7-DC 폴리펩티드라고 불리는세포들을 고립시키는 것에 대해 제공한다. 다음과 같이 구성된다.
(a)항체들은 에피톱(항원결정기)라고 하는 세포들에 결합되어 있고, 상기한 항체와 함께 집단의 세포들을 접촉한다;
(b)항체에 연결된 폴리펩티드나 프래그먼트를 정량화하거나, 그 앞에서 감지한다.
또한, 샘플 속에 B7-DC 폴리펩티드나 프래그먼트나 동족체를 정량화하거나 그 앞에서 감지하는 방법을 제공한다. 다음 단계와 같이 구성된다.
(a)항체는 에피톱을 견디는 어던 폴리펩티드나 프래그먼트와 연결되고, 청구항 43의 항체와 함께 샘플에 접촉한다.
(b)항체에 연결된 폴리펩티드나 프래그먼트를 정량화하거나, 그 앞에서 감지한다.
본 발명은 또한, T 세포 수용체에 적절한 자극체의 앞에서 vitro나 in vivo속에 T 세포들을 자극하기 위한 세포들의 능력을 증가시키는 항원 존재 세포나 전조 세포 속에 B7-DC 폴리펩티드를 증가시키거나, 유도하는 방법을 나타낸다. 이 수용체는 상기에서 표현한 매개체와 함께 항원 존재 세포나 전조세포를 옮기거나 전염시키는 것으로 구성되고, B7-DC 폴리펩티드는 세포들 위에서 유도되거나, 증가된다. 항원 존재 세포들은 오히려, 돌기형(dendritic) 세포이고, 전조 세포는 돌기형 세포 전조체이다.
본 발명은 세포의 자극 보조 요소뿐 아니라, 폴리펩티드 자극 보조체를 사용하여 면역 반응들을 자극에 대한 방법들을 제공한다. 항원자극에 대한 포유류 환자의 T 세포 반응을 증가시키기 위한 한가지 방법은, 세포들이 항원 자극에 대한 T 세포의 반응을 증가시키기에 유효한 곳에서, 항원 자극제와 함께, 오히려 암세포들, 앞에서 언급한 유효한 양의 세포들을 투여하는 것으로 구성된다. 상기한 것은 오히려 항원과 자극 보조 요소들의 주입에 의해 실현된다.
암 관련 항원과 함께 항원 자극에 대한 포유류의 T 세포 반응을 증가시키기 위한 방법은, 암세포들이 항원으로 나타나는 곳에서, 앞에서 설명한 바와 같이 암 항원 자극에 대한 T 세포 반응을 증가시키기에 유효한 암세포들의 투여하여, 암 세포들의 유효한 양을 구성하는 것이다.
항원 자극에 대한 포유류 환자의 T 세포 반응을 증가시키기 위한 방법은, 폴리펩티드의 투여가 항원 자극에 대한 T 세포 반응을 증가시키기에 유효한 곳에서, 항원 자극제와 함께 상기한 융합 폴리펩티드나 단백질, 혹은 상기한 폴리펩티드, 프래그먼트(fragment), 동족체(homologue)이나 기능성 유도체(functional derivative)의 유효한 양의 투여이다.
본 발명은, 또한, 항체의 투여가 T 세포들의 자극을 막거나, T 세포들의 항체 반응을 소멸시키거나 하여, 결국 T 세포들의 반응을 억제하는 것이 유효한 곳에서, 전술한 항체의 유효한 양의 투여로 항체 자극에 대한 포유류의 T 세포 반응을 억제하는 방법을 제공한다. 이들 방법들은 특별히, 이식을 촉진하거나 이식 거부반응을 억제하기 위해, 조직 이식에 대한 환자를 다루는데 유용하다. 자동항체(autoantibody)에 대한 경우에, 이 방법은 자동면역 반응들과 그것의 병리상의 후유증을 막거나 소멸시킨다.
본 발명은 이 발명의 요소들과 함께 ex vivo 자극을 수행하는 T 세포들을 이용한 치료법을 제공한다. 항체 자극에 대한 포유류 환자의 면역 반응을 증가시키는 한가지 방법은 다음과 같이 구성된다:
(a)환자로부터, 환자에 대한 면역학적으로 양립하는 기증자로부터, 혹은 면역학적으로 수용 가능한 배양된 세포 라인으로부터 T 세포들을 얻는다;
(b)접촉이 항원 자극에 T 세포들의 반응을 증가시키기에 유효한 곳에서, 상기한 유효한 양의 세포들과 함께 T 세포들 ex vivo를 접촉한다; 그리고,
(c)환자에 (b)단계의 T 세포들의 투여, 결과 환자의 면역 반응을 증가시킨다.
다른 항체속에서, 항원 자극에 대한 포유류 환자의 면역 반응을 증가시키는 방법은 다음과 같이 구성된다.
(a)환자로부터 T 세포들을 얻음으로, 환자에 대한 면역학적으로 양립하는 기증자로부터, 혹은 면역학적으로 수용 가능한 배양된 세포 라인으로부터 T 세포들을 얻는다;
(b)(i)상기한 폴리펩티드, 프래그먼트, 동족체, 혹은 기능성 유도체, 혹은 (ii)접촉이 항체 자극에 T 세포들의 반응을 증가시키기에 유효한 곳에서, 상기한 융합 폴리펩티드의 요효한 양과 함께 T 세포들 ex vivo를 접촉한다; 그리고,
(c)환자에 (b)단계의 T 세포들의 투여, 결과 환자의 면역 반응을 증가시킨다.
또한 제공된 문서에 백신 요소는 다음과 같이 구성되어 있다.
(a)(i)B7-DC생성체로 표현된, (ii)B7-DC 폴리펩티드, 프래그먼트, 동족체, 혹은 기능성 유도체로 표현된, (iii) B7-DC 융합 폴리펩티드 혹은 단백질로 표현된 상기한 세포들;
(b)일반적으로, 세포들 스스로 항원(암항원에 견디는 암세포인 경우에)이라고 표현하는 곳에서, 세포 기본 백신인 경우에 요구되지 않을 수도 있음에도 불구하고, 면역반응이 요구되는 항원의 추가적인 소스(source);
(c)선택적으로, 일반적인 면역자극체나 면역보조체; 그리고
(d)(a),(b), 그리고 (C)에 대해 약학적으로 혹은 면역학적으로 받아들인만한 excipient 혹은 운반체.
포유류 환자속에 항원에 면역 반응을 유도하거나 고양하는 방법은 상기한 백신 요소들의 유효한 양을 환자들에게 투여하는 것이다.
또한, 항원 또는 백신으로 이용되는 공통-자극 합성물은 다음을 포함하여 구성된다.
(a) B7-DC 폴리펩티드(적절하게는 SEQ ID NO:2 or SEQ ID NO:4), 단편, 동족체 또는 그들의 기능성 유도체, 또는 B7-DC 혼합 폴리펩티드와
(b) 약학적이며 면역적으로 적절한 excipient 또는 운반체.
항원 또는 백신의 조합과 전술한 공통자극 합성물을 개체에 투약하는 방법으로 구성된, 포유류 개체에 있어서 항원 또는 백신에 대한 면역반응을 증가시키는 방법.
유전적으로 변형된 종양세포를 개체에 투약함으로써, 개체에 있는 종양에 대한 시스템적인 면역반응을 자극시키는 방법에서, 상기 종양세포는
(a) 개체의 종양으로부터 유도되며, 또한
(b) 전술한 B7-DC 핵산의 생체외의 유도작용에 의해 유전적으로 변형되며,
시스템적인 면역반응에 대한 자극에 있어, 투약결과가 종양에 대해 직접적으로 작용하는 개체에서 공통자극 신호를 발생시키는 단백질 합성.
투약된 이후의 성장을 막기 위하여, 적절하게 처리되거나 또는 적절히 방사선 처리된 종양.
전술한 치료상의 합성물을 투약하기 전에, 종양을 감소시키는 화학치료를 받았거나 또는 방사선 치료 또는 외과 절제치료를 받은 개체.
종양에 대한 양성-항원을 갖는 포유류에서 반 종양 반응을 유도하는 방법은 다음을 포함하여 이루어진다.
(a) 다음과 같은 종양세포 또는 종양세포줄기를 준비하는 단계
(i) 포유류의 종양과 공유하는 항원을 단백질 합성하는 종양세포;
(ii) 단백질합성 되었을때 B7-DC 분자가 종양의 항원에 대한 T-세포반응을 유도하는, 전술한 B7-DC 엔코딩 핵산 벡터에 감염되는 종양세포;
(iii) (b)단계에 앞서서 조건적으로 방사선 조사되는 종양세포;
(b) 항원과 B7-DC 분자를 단백질합성하는 세포를 개체에 충분히 투약하는 단계;
전술한 방법에서, 반종양 반응은 다음과 같이 특징지워진다.
(A) 모든 측정가능한 손상의 최대 수직배율의 합산에서 최소한 50% 감소;
(B) 새로운 손상이 없음에 대한 증거와 그리고,
(C) 전존하던 손상이 더 이상 발전하지 않음.
또한, 종양을 간직하고 있던 포유류에서 기본적인 종양의 성장 또는 종양의 재성장을 감퇴시키는 방법은,
(a) 다음과 같은 종양세포 또는 종양세포줄기를 준비하는 단계
(i) 포유류의 종양과 공유하는 항원을 단백질 합성하는 종양세포;
(ii) 단백질합성 되었을때 B7-DC 분자가 종양의 항원에 대한 T-세포반응을 유도하는, 전술한 B7-DC 엔코딩 핵산 벡터에 감염되는 종양세포;
(iii) (b)단계에 앞서서 조건적으로 방사선 조사되는 종양세포;
(b) 항원과 B7-DC 분자를 단백질합성하는 세포를 개체에 충분히 투약하는 단계;
을 포함하여 이루어지며, 이 같은 방법을 통해 특정한 흑색종 종양항원에 대해 시스템 면역반응을 유도한다.
포유류에 있어, 양성-항원 종양의 재발적인 성장을 방지하는 방법은,
(a) 다음과 같은 종양세포 또는 종양세포줄기를 준비하는 단계
(i) 포유류의 종양과 공유하는 항원을 단백질 합성하는 종양세포;
(ii) 단백질합성 되었을때, 종양의 항원에 대한 T-세포반응이 공통-자극되도록 세포를 유도하며, 전술한 B7-DC 엔코딩 핵산 벡터에 감염되는 종양세포;
(iii) (b)단계에 앞서서 조건적으로 방사선 조사되는 종양세포;
(b) 항원과 B7-DC 분자를 단백질합성하는 세포를 개체에 충분히 투약하는 단계;
를 포함하여 이루어지며, 이 같은 방법을 통해 포유류의 특정 종양항원에 대한 시스템 면역반응을 유도하는데, 상기 면역반응은 종양의 재성장을 방지한다.
본 발명의 다른 실시예는 항원에 대한 시스템 면역상태를 가져오는 염증의 국부적인 발생이나 면역반응을 증가시키기 위하여 포유류 개체에 국부적으로 투입된 항원 부근에 공통-자극 신호를 제공하는 방법에 대한 것이며, 그 방법은 다음과 같은 것을 개체의 국부에 투약하는 방법으로 이루어진다.
(a) B7-DC 폴리펩티드, 단편, 동족체 또는 전술한 그들의 기능성 유도체에 대한 충분한 양의 공통자극물을 단백질 합성하는 세포들과
(b) 항원
항원과 물리적으로 근접한 이러한 공통자극은 면역반응의 국부적인 발생을 증가시키며 시스템 면역상태를 가져온다.
전술한 방법에서, 항원은 적절하게는 종양항원이며, 종양세포의 형태 또는 세포질 억제의 항원물질 형태로 (b)에서 투약되는 종양항원이다.
종양세포는 또한 B7-DC 폴리펩티드, 단편, 동족체 또는 (a)의 유도체를 단백질 합성하는 세포 일 수도 있다.
실시예
발명자는 지금 식별되는 새로운 단백질과 핵산을 가지며, 이들은 향상된 면역제치료 합성물과 방법의 기초로 제공된다. 사람과 쥐(Murine)은 색다른 상호자극 형태의 단백질 즉, 여기에서 발견되고 기술되는 B7-DC를 형성한다.
인간의 BC-DC에 대한 DNA 인코딩은 뉴클레오터이드(Nucleotide) 서열 SEQ NO:1로서 아래와 같다.
인간의 BC-DC에 대한 DNA 인코딩은 아미노산 서열 SEQ ID NO:2로서 아래와 같다.(선행되는 서열로서, 변형 세포막 영역과 세포질 꼬리로 주석됨.)
이 단백질의 세포 밖 영역은 잔류물 P26로부터 잔류물 W221까지 이다.
DNA 복제는 아래의 뉴클리오타이드 서열 SEQ ID NO:3을 갖는 쥐의 B7-DC 인토딩 코딩 순서를 포함한다.
코딩 순서(밑줄친 것은 트리플릿(Triplets))는 메티오닌 코돈인 굵게 표시된atg로 시작된 뉴클리오타이드210로부터시작하여 코돈의 멈춤을 나타내는 굵게 표시된tag에서 완료된다(뉴클리오타이드 951-953).
SEQ ID NO:5는 SEQ ID NO:3의 코딩 순서 부분이다. SEQ ID NO:3(즉, SEQ ID NO:5)의 코딩 영역에서 코딩된 쥐의 B7-DC 단백질은 아래에 표시된 SEQ ID NO:4의 아미노산 서열을 갖는다. .(선행되는 서열로서, 변형 세포막 영역과 세포질 꼬리로 주석됨.)
이 단백질의 세포 밖 영역은 잔류물 P26로부터 잔류물 W221까지 이다. 쥐 B7-DC(원래 이름은 "butyrophilin-like protein"또는 "Btdc"의 완전한 DNA 서열은 유전자은행(Genbank)의 취득 번호 AF142780.2이다.
기본 분자 연구
이 연구는 실례로 자세히 설명한다. 발명자는 두 개의 중요한 특성을 혼합하는 PCR 선택(select) 연구를 이용한다. 첫 번째로 초기 교배 단계에 우선 PCR 반응은 단지 RNA의 소량을 요구한다. 이 기술은 오염된 마이크로파지나 어버이 세포 또는 다른 가능성있는 오염된 세포의 실제 자유를 주어왔던 고 정제된 열매 DCs의 사용이 따른다. 그러한 고 정제된 열며 DCs는 많은 수를 획득하기가 어렵다고 알려져 왔다. 두 번째로 PCR 선택 과정은 매우 적은 수로, 특이하게(미세?) 표현된 유전자의 복제가 가능했다.
세포질의 부본, 활성화된 마이크로 파지,에 관련있는 DCs에 의해 미세하게 표현된 유전자를 감정하기 위해서는, 그리고 DC-특정한 기능과 관련된 유전자를 감정하기 위해서는, 현재의 발명자는 cDNA 감산 연구를 적용했다. 그들은 억압 PCR(PCR SelectTM)과 결합되어 수정된 PCR-기본의 대표 차별적인분석(representative differential analysis(RDA)를 사용한다.
일반적인 재결합(recombination) DNA 방법.
기본 텍스터는 분자 생물학의 일반적인 방법을 알져주는데, 다음의 참조서적을 포함한다.
Sambrook,J 등. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2번째 판 Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY,1989;Ausubel, FM et al. Current Protocols in Moelcular Biology, Vol.2, Wiley-Interscience, New York,(현재판);Kriegler, Gene Transfer and Expression:A Laboratory Manual(1990);Glover, DM,dd,DNA Cloning: A Practical Approach,Vol.Ⅰ&Ⅱ, IRL press, 1985;Albers,B,et al., Molecular Biology of the Cell,2판, Garland Publishing, Inc.,New York, NY(1989);Watson,JD et al., Recombinant DNA, 2판, Scientific American Books, New York,1992, and Old,RW et al., Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering,2판, University of California Press, Berkeley,CA(1981).
다르게 않는한, 특별한 핵산 서열은 보존적인 대체 변형과 보완적인 서열을 포위한다. (예를 들어 코돈 대체를 감소시킴) 핵산이라는 용어는 폴리 뉴클레오티드와, 동의어이고 유전자, cDNA 분자, mRNA 분자, 소수뉴클레오티드(oligonucleotide), 및 다음의 등가물(이하에 표현된)로 의도된다. 핵산의 크기는 킬로베이스(kb) 또는 베이스 페어(pairs)(bp)로 언급된다. 이판단은 사용자나 출판물에 의한 정해진 핵산서열로부터 아가로우스(agarose) 또는 폴리애크리라미드(polyacrylamide) 젤 전기 이동법(PAGE)에서 파생된다. 단백질 크기는 킬로 돌턴(kilodaltons,kDa)으로 분자량 또는 길이(아미노 잔류물의 수)로서 진술 된다 단백질 크기는 PAGE로 부터, 서열로부터 코딩된 핵산 서열 또는 알려진 아미노 산 서열에 기초를 둔 가정의 아미노산 서열로부터 측정된다.
특히, B7-DC or 조각 또는 파생물에 일치하는 아미로산 서열을 앤코딩한 cDNA 분자는 여기서 밝혀진 단백질 서열로부터 이끌어낸 프라이머를 사용한 폴리머라제 체인 반응(PCR)(참조 U.S. 4,683,202)에 의해 합성되어질 수 있다. 이 cDNA 서열은 진핵(성숙해) 또는 원핵 합성(expression) 벡터로 조립될 수 있다. 그리고 결과 백터는 직접 B7-DC 또는 적절한 호스트세포 예를들어 COS 또는 CHO 세포,에 의한 조각 또는 파생물의 합성에 직접 사용할 수 있다.
이 발명은 새로운 B7-DC, 파편 또는 그의 등가물을 앤코딩한 뉴클레오티드 서열을 가지는 고립시킨 핵 산을 포함한다. 여기서 사용된 핵산이라는 용어는 그의 조각 또는 등가물을 포함하는 것으로 의도된다. 본 발명의 핵산 서열은 DNA 또는 RAN가 될 수 있다. 적절한 핵산은 서열 SEQ ID NO:1 또는 그의 등가물을 가지는 인간 B7-DC를 앤모딩 cDNA 이다.
바람직하게는 본 발명의 핵산은 적어도 B7-DC의 한부분을 앤코딩한 cDNA 분자이다. 이 cDNA는 성숙된 DCs 또는 천연적으로 이 단백질로 합성된 다른 세포로부터 축출된 mRNA로부터 만들 수 있다. B7-DC를 앤코딩한 핵산서열은 DC 게놈 DNA로부터 얻을 수 있다. 따라서 B7-DC를 앤코딩한 DNA는 cDNA로부터 복제될 수 있거나알려진 프로토콜과 조화된 게놈 도서관에서 복제될 수 있다.
B7-DC를 앤코딩한 cDNA 뉴클레오이키티드 서열은 적절한 세포라인으로부터 전체 mRNA를 분리시키면서 얻을 수 있다. 더블 스탠다드 cDNA는 전체 mRNA로부터 준비된다. cDNA는 적절한 플라스미드, 박테리오 파지, 또는 널리 알려진 기술중하나를 사용하는 바이러스 벡터로 삽입될 수 있다.
뉴클레오티드 서열에 참조함에 있어, 등가물(equivalent)이라는 용어는 구조적으로 동형(homologous) 및/또는 기능적인 등가 단백질을 앤코딩한 서열 를 포함하는 것으로 의도된다. 예를 들어, B7-DC 뉴클레이오티드 서열의 천연 다형상(polymorphism)(특히 코돈의 세 번째 베이스)은 아미노산 서열의 변화 없이 침묵 배음(silent mutation)로 요약된다. 그러나, B7-DC안에 아미노 산 서열 변화에 포함된 다형상은 인류(또는 다른 포유류)에 존재한다.
하나나 더 많은 뉴클레오티드(전체 코딩서열중에서 약 3~4%보다 더많은)를 변화시킨 이 allelic 이체는 천연적인 allelic 변화에 기일이 될 인류안에 발견될 것을 이분야의 기술에 평가할 것이다. B7-DC를 앤코딩하는 DNA 내에서 어떤, 모든 allelic 이체 및 결과물인 핵산 및 폴리펩티드 다형상이 본 발명의 범위 내이다.
더우기, 하나 이상의 자연적으로 발생하는 이소폼 혹은 여기서 서술된 관계되고 면역학적으로 상호관련된 B7-DC 단백질의 패밀리 멤버일 수 있다. 그러한 이소폼이나 패밀리 멤버들은 심지어 그들이 다른 자리에서 유전자에 의해 코딩되다라도 B7-DC와 유사한 아미노산 서열의 기능을 공유하는 단백질로 정의된다.
핵산의 단편
핵산서열의 단편은 B7-DC 단백질의 전체 길이를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열보다 더 적은 뉴클레오타이드들을 갖는 하나의 뉴클레오타이드 서열로서 정의된다. 이 발명은 핵산 단편을 포함하는데, 핵산단편은 폴리펩타이드를 코딩하며, 폴리펩타이드는 (1) T 세포에서 B7-DC이 그것의 자연적 리간드에 결합할 수 있는 능력을 보유하고, (2) (사이토킨 프로덕션 및/혹은 제1 활성 신호를 받은 T세포에 의한 T세포 증식에 의해 측정된) 활성화된 면역 응답이 조정된 활성화된 T 세포을 (그들이 합성된 방식에 의존하여) 증가나 금지시키는 능력을 보유한다.
예를 들면, 여기서 의도된 핵산 단편은 B7-DC 폴리펩타이드를 코딩하는데, B7-DC 폴리펩타이드는 아직 확인되지 않은 (그러나 CD28 혹은 CTLA-4로 나타나지 않은)리셉터에 T세포의 표면을 묶고, T림포사이트에 동시자극신호를 배달하는 능력을 보유한다. 다른 영역에 의해서, 제시되는 핵산 단편은 다른 동물 종의 핵산과 교배하는 것이고, 그러므로 B7-DC과 "상호관련"된 새로운 단백질을 검출하는 분석물을 스크린하는데 유용하다.
일반적으로, B7-DC 폴리펩타이드의 단편을 코딩하는 핵산 서열은 성숙한 단백질을 코딩한 서열로부터의 뉴클레오타이드들로 구성된다. 그러나, 어떤 예에서는 핵산의 선두 서열 부분의 모두 혹은 일부를 포함하는 것이 바람직스럽다. 또한, 이 발명의 핵산 서열들은 링커 서열, 자연적 혹은 개량된 제한 엔도뉴클레아제 사이트와 코딩화된 단백질 또는 단편들의 복제, 합성 혹은 정화에 관계된 조작에 유용한 다른 서열을 포함할 수 있다. 이들과 다른 핵산 서열의 개량은 여기서 서술되거나 종래에 잘 알려져 있다.
일실시예에서, B7-DC의 ECD에 대응하는 아미노산 서열을 코딩하고 대략 위치 26-221의 아미노산을 포함하는 DNA는 인간 Ig Cr1의와인 힌지에 대응하는 아미노산 서열을 코딩하고 B7-DC-Ig 혼합 단백질로 합성되는 구조물을 형성하는 PCR을 사용하는 DNA에 결합된다. B7-Ig 혼합 단백질을 코딩하는 유사 DNA 분자는 US5,521,288에 공지되어 있고, American Type Culture Collection in Rockville, Md.에 접근번호 68627고 기탁되어 있다.
B7-DC를 코딩하는 DNA와 가용성 B7-DC 혼합 단백질을 결합하고 합성하는 기술과 올리고뉴클레오타이드의 합성, PCR, 세포의변형, 벡터의 구성, 시스템의 합성 등과 같은 기술들은 종래에 잘 구축되어 있다. 그러한 일반적인 기술들은 특별한 조건과 절차를 위한 표준 리소스 자료에 잘 소개되어 있다.
다른 실시예들에서, B7-DC의 도메인 혹은 단편을 코딩한 DNA는 B7.1, B7.2 혹은 B7.3와 같은 다른 B7 패밀리 단백질의 여분의 대부분 혹은 전부를 코딩한 핵산과 혼합된다. 인간 B7.1(CD80)의 완전한 DNA 서열은 겐뱅크 접근번호 X60958을 갖고, 쥐(마우스) 서열을 위한 접근번호는 X60958이며, 쥐(랫) 서열을 위한 접근 번호는 U05593이다. 인간 B72(CD86)의 전체 cDNA 서열은 겐뱅크 접근 번호 L25259이고, 쥐(마우스) 서열을 위한 접근번호는 L25606이다.
합성 벡터와 호스트 세포
이 발명은 적어도 하나의 규칙적 서열에 작동가능하게 링크된 B7-DC 폴리펩타이드를 코딩한 핵산 서열을 포함하는 합성 벡터를 포함한다. "동작적으로 링크된"이라 함은 코딩 서열이 코딩 서열의 합성을 허용하는 방식으로 규칙적 서열에링크되어 있음을 의미한다. 알려진 규칙적 서열들은 적절한 호스트 세포에서 소망되는 단백질의 합성을 지적하도록 선택된다. 따라서, 용어 "규칙적 서열"은 프로모우터, 인핸서 그리고 다른 합성의 제어 요소를 포함한다. 그러한 규칙적 서열들은 예들들어 Goeddel, Gene Expression Technology. Methods in Enzymology, vol. 185, Academic Press, San Diego, Calif.(1990)에 나타나 있다.
통상의 지식을 가진 자들은 이 발명의 합성 벡터의 특별한 디자인이 트랜스펙트된 호스트 세포 및/혹은 합성되는 단백질의 형태와 같은 고려에 의존함을 이해한다.
제시된 합성 벡터는 B7-DC의 다향한 예들을 코딩한 핵산 분자의 전체 범위를 포함한다: (여기서 제한된) 폴리펩타이드 단편들, 배리언트, 혼합 단백질 등을 포함하는 전체 길이의 단백질과 그의 기능적 파생물. 그러므로, 일 실시예에서 벡터 합성은 ECD 그 자체 혹은 다른 단백질에 혼합된 ECD와 같은 B7-DC의 적어도 부분을 코딩한 핵산을 포함한다.
그러한 합성 벡터는 DNA의 합성과 혼합 단백질 혹은 펩타이드를 포함하는 코딩된 단백질의 배양을 위한 호스트 세포의 트랜스펙트에 사용된다. B7-DC 폴리펩타이드를 합성하는 유전적으로 개선된 세포는 명시적인 목적을 위해 유용한 세포를 위하여 충분한 시간동안 일시적으로 외인성 DNA를 합성할 수 있음이 이해될 것이다. 그러므로, 만일 세포가 생체내 혹은 생체외에서 증진된 상호자극적인 능력을 갖는 면역원으로서 행동한다면, 합성이 요구되거나 세포가 살아 남는 시간의 길이는 세포가 그의 면역원으로서의 및/혹은 상호자극적인 기능을 수행하기에 필요한시간이다. 예를들어, 본 발명의 B7-DC를 합성하는 형질도입된 종양 세포의 경우에, B7-DC의 합성은 6시간 정도로 적을 수 있고, 소망스럽게는 24시간, 더욱 소망스럽게는 적어도 2-4일 일 수 있다. 물론 합성은 안정적일 수 있다(즉, 세포의 생존동안). 아래에서 언급되는 적절한 합성 벡터와 규칙적 요소들(예를들어, 유도가능하거나 구성적인 프로모터들)은 합성의 요구되는 안정성과 일치하도록 선택된다.
본 발명은 B7-DC 단백질, 단편들과 파생물을 배양하기 위한 방법을 제공한다. 예를 들어, 적어도 B7-DC 단백질의 부분에 코딩하는 핵산 벡터에 트랜스펙트된 호스트 세포는 B7-DC 폴리펩타이드의 합성하기 위한 적절한 조건하에서 배양된다.
호스트 세포들은 또한 하나로 혹은 결합하여 적어도 B7-DC 단백질 부분을 코딩하는 DNA와 적어도 두번째 단백질을 코딩하는 DNA를 포함하는 하나이상의 합성 벡터에 트랜스펙트될 수 있고, 그리하여 그 호스트 세포들은 두 단백질을 포함하는 혼합 폴리펩타이드를 생성한다.
재결합자 합성 벡터가 B7-DC의 부분을 코딩하는 DNA와 인간 IgCr1과 같은 다른 단백질을 코딩하는 DNA를 포함할 때, 결과하는 혼합 단백질은 가용능력, 결합 유연성 및/혹은 결합가가 변경될 수 있다.
B7-DC 또는 동족 또는 기능적인 유도체를 표현하기 위해 변형되거나 감염된 프로카오틱(Prokaryotic) 또는 에카오틱(eukaryotic) 호스트 세포는 발명의 범위 안에 있다. 예를들면, B7-DC은 E. coli, 곤충 세포(baculovirus), 효모 또는 중국 햄스터 난소 세포(CHO)과 같은 포유동물 세포 또는 호스트 세포과 같은 세균성 세포로 발현될 것이다. 그밖에 적당한 호스트 세포는 Goeddel, (1990) supra에서 찾을 수 있을 것이고, 당업자에게 잘 알여져 있다.
에카오틱 세포에서의 합성은 재조합형 단백질의 부분적 혹은 완전한 글리코실레이션 그리고/또는 관계된 체인 내부 또는 체인간 아황산 결합을 이끈다.
효모 S. cerevisiae에서 합성을 위한 벡터의 예는 pYepSecl(Baldari etall.,(1987) EMBO J. 6:229-234), pMFa(Kurjan et al.(1982) cell 30:933-943), pJRY88(Schultz et al., (1987) Gene 54:113-123), 및 pYES2(Invitrogen Corporation, San Diego, Calif)를 포함한다. 배양된 곤충 세포(SF 9 세포)에서의 단백질 합성을 위한 유용한 Baculovirus vectors는 pAc series(Smith et al., (1983) Mol.Cell Biol. 3:2156-2165) 및 pVL series(Lucklow, V.A., and Summers, M.D., (1989) Virology 170:31-39)를 포함한다. 일반적으로 COS 세포(Gluzman, Y., (1981) Cell 23:175-182)은 포유동물 세포에서 일시적인 증폭/합성을 위해 pCDM 8(Aruffo A. and B., supra)와 같은 벡터에 결합되어 사용된다. 더욱이 CHO(dhfr-negative VHO) 세포은 포유동물 세포에서 안정된 증폭/합성을 위한 pMT2PC(Kaufman et al. (1987), EMBO J. 6; 187-195)와 같은 벡터와 함께 사용되어 진다. NSO 골수종 세포 라인(글루타민 종합 합성 시스템)은 Celltech Ltd.로부터 유용하다.
융해 단백질의 정화를 위해 보고자 그룹에서 연속 표적 단백질의 분리를 가능성을 주기 위하여 수시로, 융해 합성 벡터에서, 단백질 분해의 분열 위치는 보고자 그룹 및 표적 단백질의 정션(junction)에 도입된다. 분열 및 그들의 승인 순서를 위한 단백질 분해의 효소는 팩터 Xa, 트롬빈 및 엔트로키나아제를 포함한다.
전형적인 융해 합성 벡터는 글루타티온 S-전이효소, 맥아당 E 바인딩 단백질, 또는 단백질 A 각각이 표적 재조합형 단백질로 융해하는 pGEX(Amrad Corp., 멜버른, 호주 ), pMAL(뉴잉글란드 Biolabs, Beverly, Mass.) 그리고 pRIT5(Pharmacia, Piscataway, N.J.)를 포함한다.
유도할수 있는 비합성 벡터는 pTrc(Amann et al.,(1988) Gene 69:301-315) 및 pET 11d(Studier et al., Gene Expression Technlolgy: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 60-89)를 포함한다. 타겟 유전자 합성은 pTrc에서 하이브리드 trp-lac 혼합 촉매로부터 호스트 PNA 폴리메라아제 전사에 의존하는 한편, pET 11d으로 주입된 타겟 유전자의 합성은 상호 합성된 바이러스의 PNA 폴리메라제(T7 gn1)에 의해 조정된 T7 gn10-lacO 혼합 촉매로부터의 전사에 의존한다. 이 바이러스의 폴리메라제는 lacUV 5 촉매의 전사적 조절하에서 레지던트 λ 프로파지 은신처로부터 호스트 균주 BL21(DE3) 또는 HMS174(DE3)에 의해 제공된다.
이 발명의 일실시예는 드 노보(de novo) 신규의 B7-DC 를 합성하는 트랜스펙트된 세포이다. 성숙된 DC와 같은 이미 합성된 B7-DC의 세포의 경우에 트랜스펙트된 세포는 세포 표면에서 B7-DC 단백질 혹은 거기의 단편의 증가된 양으로 합성된다.
예컨대, 육종증(sarcoma), 흑색종증(melanoma), 백혈병(leukemia), 림프종(lymphoma), 악성종양(carcinoma) 또는 신경아세포종(neuroblastoma) 등과 같은 종양 세포는 종양 세포 표면 상의 B7-DC의 유전자 단백질 합성을 지휘하는 유전자 단백질 합성 벡터(expression vector)로 트랜스펙션(transfection, 분리된 핵산의 세포에의 감염) 된다. 이러한 감염된 종양 세포들은 이하에서 언급하는 바와 같이 치료용 항종양성 면역(therapeutic antitumor immunity)을 촉진하기 위하여 면역원(immunogens)으로 사용될 수 있다.
벡터 생성
원하는 코딩 및 제어 순서를 포함하는 적합한 벡터의 생성은 본 기술분야에서 널리 공지된 표준 결찰 및 제한 기술을 사용한다.
분리된 플라스미드(plasmid), DNA 서열, 또는 합성된 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide)는 원하는 형태로 분리되고, 재단되고, 그리고 재결찰된다.
상기 벡터를 형성하는 DNA 서열은 다수의 소스로 이용가능하다. 척추 벡터(backbone vector) 및 제어 시스템은 통상적으로 생성시 DNA 서열의 벌크(bulk)에 사용되는 이용가능한 '호스트' 벡터 상에서 발견된다. 적절한 코딩 순서를 위해, 초기 생성은 아마도, 그리고 통상적으로 cDNA 또는 게놈 DNA 라이브러리로부터 적합한 서열을 구하는 것의 문제이다. 그러나, 일단 DNA 서열이 밝혀지면 개별적인 뉴클레오타이드 유도체에서 시작하여 시험관 내에 완전한 유전자 서열을 합성하는 것이 가능하다. 꽤 큰 길이(예컨대, 500-1000 bp)의 유전체를 위한 완전한 유전체 서열은 개별적인 오버래핑 상보적 올리고뉴클레오타이드를 합성하고, 디옥시리보뉴클레오타이드 3인산염(deoxyribonucleotide triphosphate)의 존재하에 DNA 폴리메라제를 이용하는 싱글 스트랜디드(single stranded) 난오버래핑 부분에축적함으로써 준비될 것이다. 이러한 접근은 서열이 알려진 몇몇의 유전자의 생성에 성공적으로 이용되어 왔다. 예컨대, [Edge, M. D., Nature(1981)292:756;Nambair, K. P.,et al., Science(1984)223:1299;and Jay, E.,JBiol Chem(1984)259:6311.]을 참조하라.
합성 올리고뉴클레오타이드는 위에서 언급된 레퍼런스에 기술된 포스포트리에스터(phosphotriester)법이나 [Beaucage, S. L., and Caruthers, M. H., Tet Lett(1981)22:1859; and Matteucci, M. D., and Caruthers, M. H., J Am Chem Soc(1981)103:3185]에 기술된 포스포라미다이트(phosphoramidite)법에 의해 준비되며, 그리고 상업적으로 이용가능한 자동화된 올리고뉴클레오타이드 합성기를 이용하여 준비될 수 있다. 열처리에 앞선 또는 레이블링(labeling)을 위한 싱글 스트랜드의 키나아제(Kinase) 처리는 초과분을 이용하여 획득한다(예컨대, 50mM Tris, pH7.6, 10mM MgCl2, 5mM 디티오트레이톨(dithiothreitol), 1-2 mM ATP, 1.7 pmole γ-32P-ATP(2.9 mCi/mmole), 0.1 mM 스퍼미다인(spermidine), 0.1 mM EDTA의 존재하에 1 nmole 기질에 대해 약 10 유니트의 폴리뉴클레오타이드 키나제)
일단 원하는 벡터의 성분들이 이렇게 이용가능하면, 그들은 표준 제한 및 결찰 과정을 이용하여 도려내어지고 결찰된 수 있다. 사이트-스페시픽(site-specipic) DNA 클리비지(cleavage)는 본 기술분야에서 일반적으로 알려지고 이들 상업적으로 이용가능한 제한 효소들의 제조자에 의해 설명된 명세서에 알려진 조건 하에서 적합한 제한 효소(또는 효소들)와 함께 처리함으로써 수행된다(예컨대, NewEngland Biolabs, Product Catalog.을 보라). 통상적으로 약 1mg의 플라스미드 또는 DNA 서열은 약 20ml의 버퍼 용액 내에서 하나의 단위 효소로 분리된다. 그리고 여기의 예에서 통상적으로 제한 효소의 잉여분은 DNA 기질의 완전한 소화를 보증하는데 사용된다. 비록 변화가 묵인될 수 있다 하지만, 약 37℃에서의 약 한 시간 내지 두 시간 정도의 인큐베이션 시간이면 실행 가능하다. 매 인큐베이션 후에는 페놀/클로로포름을 사용한 추출에 의해 단백질이 제거되며, 에테르 추출이 뒤따를 것이며, 에탄올을 사용한 침전에 의해 수성 단편(aqueous fraction)으로부터 핵산이 회복될 것이다. 원한다면 분리된 단편의 크기 분리는 표준 기술을 이용하여 폴리아크릴아마이드 겔 또는 아가로제 겔 일렉트로포레시스에 의해 수행될 것이다. 크기 분리의 일반적인 설명은 [Methods in enzymology(1980)65:499-560.]에서 발견된다.
제한 분리된 단편은 50mM Tris pH7.6, 50mM NaCl, 6mM MgCl2, 6mM DTT 및 0.1-1.0 mM DTT dNTP 내에서 20℃ 내지 25℃에서의 약 15 내지 25분의 인큐베이션 시간을 이용하여 4개의 디옥시뉴클레오타이드 3인산염(dNTPs)의 존재하에 E.coil DNA 폴리머라제 I(Klenow)의 큰 단편과 함께 처리됨으로써 끝이 무디어질 것이다. Klenow 단편은 5′싱글-스트랜디드 오버행에서 채워지나, 4개의 dNTP가 존재함에도 불구하고 프로트루딩(protruding) 3′싱글 스트랜드를 츄우 백(chew back)한다. 원한다면 오버행의 본성에 의해 지시된 제한 내에서 단 하나의 또는 선택된 dNTP를 공급함으로써 선택된 리페어가 수행될 수 있다. Klenow와 함께 처리한 후에, 혼합물은 페놀/클로로포름 및 침전된 에탄올과 함께 추출된다. Si 뉴클레아제 또는BAL-31을 사용한 적절한 조건하에서의 처리는 어떠한 싱글-스트랜디드 부분의 가수분해로 귀결된다.
결찰은 전형적으로 다음의 표준 조건 및 온도하에서 15-50 ml 부피 내에서 수행된다: 예컨대, 20mM Tris-HCl pH7.5, 10mM MgCl2, 10mM DTT, 33㎍/ml BSA, 10-15mM NaCl, 그리고 40μM ATP, 0℃의 0.01-0.02(Weiss) 유니트 T4 DNA 리가제('점성의 엔드' 결찰을 위해). 분자간 '점성의 엔드' 결절은 통상적으로 33-100㎍/ml 토탈 DNA 농도(5-100nM 토탈 엔드 농도)에서 수행된다. 분자간 무딘 엔드 결절은 1mM 토탈 엔드 농도에서 수행된다.
벡터 단편을 이용하는 벡터합성방법에서 단편은 통상적으로 5′인산염을 제거하고 셀프 리게이션을 방지하기 위하여 박테리아 알칼리 인산염(BAT) 또는 송아지 창자 알칼리 인산염(CIAP)을 이용하여 처리된다. 소화작용은 대략적으로 10mM Tris-HCI, 1 unit/mg 벡터에서 60℃에서 한시간 동안 BAT 또는 CIAP를 이용한 1 mM EDTA, pH 8에서 수행된다. 조제물은 페놀/클로로폼과 에탄올 침전물에서 추출된다. 택일적으로, 재-리게이션은 추가적인 제한효소와 원하지 않은 단편의 분리를 통해 2번 소화된 벡터에서 방지될 수 있다.
많은 방법 중 어떤 것은 이 발명의 이체를 생성하기는 코딩 서열로 돌연변이를 소개하는 데 이용된다. 이 돌연변이는 단순 제거 또는 삽입, 조직적인 제거, 삽입 또는 베이스의 클러스터의 대체 또는 싱글베이스의 대체를 포함한다.
예를들면, B7-DC DNA 서열(cDNA 또는 유전자 DNA)의 변형들은 영역-한정된 돌연변이에 의해 생성되며,. 잘 알려진 프로토콜과 반응물들은 상업적으로 이용가능하다.(Zoller, MJ et al., Nucleic Acids Res(1982) 10:6487-6500 and Adelman, JP et al., DNA(1983)2:183-193)). 플라스미드 형성을 위한 보정 리게이션은 예를 들면, 첫 번째 변형 E.coli 사슬 MC1061(Casadaban, M., etal., J Mol Biol(1980)138:179-207) 또는 다른 적절한 리게이션 혼합물을 호스트로 하여 확정된다. 통상적인 방법을 사용하면 트랜스포맨트들은 플라스미드 합성모드에 의존하는 앰피실린-테트라사이클린 또는 다른 항생성의 저항유전자(혹은 다른 선택가능한 마커) 들의 존재에 기초하여 선택된다. 그리고 나서 플라스미드는 광 클로람 페니클(chloramphenicol) 증폭에 따르는 클로람 페니클 증폭과 함께 트랜스포먼트(transformants)으로 부터 준비되어 진다.(Clewll, DB et at. ,Proc Natl Acad Sci USA(1969)62:1159;Clewell,D.B.,J Bacteriol(1972)110:667). 몇몇의 미니 DNA 준비는 일반적인 방법으로 사용된다. 참조, e.g.,, Holmes, Ds,et al., Anal Biochem(1981)114:193-197;Birnboim,HC etal., Nucleic Acids Res(1979)7:1513-1523. 분리된 DNA는 게다가 메싱(Messing)에 의해 서술된 생거(Sanger)의다이디옥시(dideoxy) 뉴클레오티드 방법에 의해 서열화되거나 및/또는 제한에 의해 분석된다.
상술한 목적, 특징들 및 장점은 첨부된 도면과 관련한 다음의 상세한 설명을 통하여 보다 분명해 질 것이다. 이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명에 따른 바람직한 일실시예를 상세히 설명한다.
DNA 벡터는, 인산 칼슘, 염화 칼슘 co-침전물, DEAE-덱스트란-전달 유전자주입, 리포팩션 또는 electropolation 과 같은 발명적인 테크닉에 의해, 포유동물의 세포로 삽입되어 질수 있다. 호스트 세포의 전환을 위한 적당한 방법들은 "Sambrook et al. supra" 와 그 밖의 표준 텍스트들에서 찾을 수 있다.
종종, 용해 익스프레션 벡터들에서, 가수분해 분열 위치는, 용해 단백질의 정제를 수반하는 리포터 그룹으로부터의 목적 단백질에 대한 분리를 가능하도록, 리포터 그룹과 목적 단백질의 결합에 채용되어진다. 그러한 분열과 결합을 위한 가수분해 효소는 팩터 Xa, 트롬빈 및 엔테로키나아제를 포함한다.
전형적인 용해 익스프레션 벡터들은 pGEX, pMAL 그리고 pRIT5를 목적 제조합형의 단백질에 포함하는데 이러한 것들은 글루타티온 S-트랜스퍼라아제, 말토스 E 결합 단백질 또는 단백질 A 를 제각각 녹인다.
유도된 불용해 익스프레션 벡터들은 pTrc 과 pET 11d를 포함한다. 목적 유전인자 익스프레션은, pTrc내의 하이브리드 trp-lac 용해 프로모터로부터의 호스트 RNA 폴리머라아제 전사에 의존하는 반면에, pET 11d에 삽입되는 목적 유전인자들의 익스프레션은 공동 표현된 바이러스성의 RNA 폴리머라아제(T7gn1)에 의해서 중개된 T7 gn10-lacO 용해 프로모터에 의존한다.
이 바이러스성 폴리머라아제는 lacUV 5 프로모터의 전사적인 제어 아래의 T7gn1을 품고 있는 내재적인프로파지로부터의 호스트 스트레인 BL21(DE3) 또는 HMS174(DE3)에 의해 제공된다.
프로모터 와 인핸서
DNA 또는 RNA분자의 프로모터 영역은 RNA 폴리머라아제를 묶고, "실시가능한 연계된" 핵산 배열의 전사를 촉진한다. 여기에 사용된 것처럼, "프로모터 배열(promotor sequence)"는 RNA 폴리머라아제에 의해서 전사된 DNA또는 RNA의 가닥에서 발견되는 프로모터의 뉴클레오티드 배열이다. 프로모터와 코딩 배열이 같은, 핵산 분자의 2 배열은, 그들이 두 배열이 같은 RNA 트랜스크립트에 전사되어지도록 하거나 하나의 배열에서 시작된 RNA 트랜스크립트가 두번째 배열로 확장되어지도록 하는 방식으로 서로에 각각 링크되어질 때, "실시가능한 연계된" 것이다.
이처럼, 프로모터 배열과 DNA 또는 RNA의 코딩 배열과 같은 두 배열은, 만약 프로모터 배열에서 시작된 전사가 실시가능하도록 연계된 코딩 배열의 RNA 트랜스크립트를 생성한다면, 실시가능하도록 연계되어진 것이다. "실시가능한 연계된"이 되도록 하기 위하여, 두 배열이 선형 배열에서 서로 다른 배열에 바로 인접할 필요는 없다.
본 발명에서 선호되는 프로모터 배열은 반드시 포유동물의 세포에서 실시가능하여야 하며, 유카리오틱(eukaryotic) 또는 바이러스성 프로모터에서 실시가 가능할 수 있다. 적당한 프로모터가 유도되어지거나 제지되거나 구조적일 수 있다.
구성적인 프로모터의 일실시예로 바이러스성 프로모터인 MSV-LTR이 있다. 이것은 다양한 세포의 타입에 효과적(efficient)이고 활동적(Active)이며, 대부분의 다른 프로모터들과는 달리, 포획된(arrested) 또는 자라는(growing) 세포에서 같은 인핸싱 활동력을 가진다. 다른 선호되는 바이러스성 프로모터는 CMV-LTR(cytomegalovirus로부터) 또는 RSV-LTR(Rous sarcoma virus로부터)에서 실재된 것을 포함한다. 또한, 쥐 metallothionein 1 분자의 프로모터, 헤르페스 바이러스의 TK 프로모터, SV 40 초기 프로모터 및 효모 gal4 분자 프로모터 등이 유용하다.
프로모터 영역과 연계된 전사적인 요소와 분리된 활동성과 전사 요소의 DNA결합의 다른 예가 되는 설명은 다음 "Keegan et al., nature231:699;Fields et al., Nature(1989)340:245; Jones, Cell(1990)61:9;Lewin,Cell(1990)61:1161;Ptashne et al.,Nature(1990)346:329;Adams et al.,Cell(1990)72:306." 을 포함한다. 이와 같은 상기의 리스트된 참조들의 모든 적절한 발표된 내용은 이로써 참조에 의해서 편입된다.
프로모터 영역은 특정 조직에서 발견되는 어떤 단백질과의 상호작용을 통해 조직의 특정 인핸서로써의 역할을 수행할 수 있는 옥타머(octamer) 영역을 포함할 수도 있다. 본 발명의 DNA구조의 인핸서 도메인은 트랜스팩티드(transfected)된 목적 세포에 특화되거나 또는 그러한 목적 세포의 세포적 요소에 의해 높게 활성화되어진다.
벡터들(플라스미드 또는 레트로바이러스)의 예는 U.S. 특허 5,112,767에서 발표되었다. 인핸서에 대한 일반적인 설명과 전사에서의 그들의 동작은 Lewin,B.M.,Genes IV, Oxford University Press, Oxford,(1990),pp.555-576.에서 볼 수 있다. 레트로 바이러스 인핸서(e.g., 바이러스의 LTR)에서 특히 유용하다.
인핸서는, 세포의 익스프레션을 집중하기 위해 상호작용하는 프로모터로부터거슬러올라 자리잡는 것을 선호한다. 레트로바이러스 벡터의 이용을 위하여, 내생의 바이러스(endogenous viral)의 LTR은 인핸서를 적게(enhancer-less)하고, 조직 특이성 또는 B7-DC인코딩 DNA 분자 위의 전사적인 효율성과 같은, 다른 바람직한 성질을 주는 다른 희망하는 인핸서 배열을 대신 사용할 수도 있다.
발명의 핵산 배열은 표준의 테크닉을 통해 화학적으로 합성되어 질 수 있다. 펩티드 합성과 같이, 상업적으로 유용한 DNA 합성기들에 완전히 자동화 되어지는 쏠리드 페이즈 합성을 포함하는, 폴리테옥시뉴클레오티드(polydeoxynucleotides)의 화학적 합성을 위한 다양한 방법이 알려져 있다.
단백질과 폴리펩티드
본 발명은 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:4의 배열을 가지는 "격리된(isolated)"B7-DC 단백질을 포함한다. 제시된 내용은 전체 길이의 사람과 쥐과의 B7-DC단백질(그리고 DNA)를 예시하지만, 이것은 다른 포유류와 본 발명의 관점에서 의도되어진 지금까지 제시된 특징들을 포함하는 변형물들로부터의 B7-DC의 상동물에서도 이해되어질 수 있을 것이다.
또한, 아미노산 치환 변형을 의미하는 B7-DC의 "기능적인 파생물"을 포함한다. 그리고, B7-DC의 "프래그먼트(flagment)" 또는 "화학적 파생물"을 포함하는데 이에 대한 설명은 추후에 하기로 한다. 기능적인 파생물은 중요한 B7-DC의 활동성(바람직하게는, T세포의 수용기에 바인딩하고 T세포의 활동성을코스티뮬레이팅하는(costimulating) 것)을 보유한다. "기능적인 파생물"은 여기에서 그 용어를 결합하여 사용하거나 선택적으로 사용하거나에 관계없이 "변형(variants)" 과 "프래그멘트(fragments)"를 포함한다.
기능적 상동물은 상기의 생화학적, 생물학적 활동성을 포함한다. 이 기능적 특징화의 관점에서 다른 종(아직 발견되지 않은 단백질을 포함하는)으로부터의 상동 단백질 B7-DC의 이용은 만약 이러한 단백질들이 배열적 유사성과 고무된 생화학적, 생물학적 활동성을 가진다면 본 발명의 관점으로 된다.
두 아미노산 배열 또는 두 핵산 배열의 퍼센트(percent) 동일성(identity)을 정의하기 위하여, 그 배열은 최적의 유사 용도를 위하여 정렬되어진다.(e.g, 간극은 최적의 정렬을 위한 첫번째와 두번째 아미노산 배열 또는 핵산 배열의 하나 혹은 그 둘 모두에 있을 수 있고, 비교의 목적을 위하여 비 상동적 배열은 고려되지 않는다)
우선의 정렬 방법에서, Cys 잔류물(residues)들이 배열된다.
우선의 구현에서, 비교되어지는 배열의 길이는 적어도 레퍼런스 배열의 길이의 30%이며, 바람직하게는 적어도 40%, 더 바람직하게는 50%, 더 바람직하게는 60%, 70%, 80% 및 90%이다.
예컨대, 두번째 시퀀스를 인간의 B7-DC 단백질에 배열할 때 276 아미노산을 잔여들을 가진 아미노산 시퀀스(SEQ ID NO:2), 적어도 83, 바람직하게는 적어도 110, 더욱 바람직하게는 적어도 138, 더욱 바람직하게는 적어도 166, 그리고 더욱더 바람직하게는 적어도 193, 221 또는 248 아미노산 잔여들이 배열된다. 그러면대응하는 아미노산 위치에 있는 아미노산 잔여들 또는 뉴클레오티드들의 위치와 비교된다. 첫 시퀀스에 있어서, 어떤 위치가 같은 아미노산 잔여들 또는 뉴클레오티드에 의해 점령되었을때, 두번째 시퀀스에 있어서 대응하는 위치로써, 분자들이 그 위치에 동일하게 차지하게 된다(여기서 아미노산 또는 핵산 "동일성(identity)"이 아미노산 또는 핵산의 "상동관계(homology)" 와 등가적으로 사용된 것 처럼). 두 시퀀스 간의 퍼센트 동일성은 갭의 시퀀스에 의해 나누어지는 동일한 위치 개수의 기능인데, 이는 두 시퀀스의 최적배열을 위해 안내되는데 필요한 갭의 숫자, 각각의 갭의 길이등이 고려된다.
두 시퀀스간의 시퀀스의 비교와 퍼센트 동일성의 판별은 수학적인 알고리즘을 사용하여 이루어진다. 바람직한 구체화에 있어서, 두 아미노산 시퀀스간의 퍼센트 동일성은 Needleman 과 Wunsch 알고리즘에 의해 이루어지는데 (J.Mol.Biol.48:444-453(1970)) 그 알고리즘은 NWSgapdna CMP matrix 와 40, 50, 60, 70 또는 80의 갭 가중치와 1, 2, 3, 4, 5, 6의 길이 가중치를 사용하여 GCG 소프트웨어 패키지(available at http://www.gcg.com)에 있어서 GAP 프로그램으로 합체되었다. 또 다른 구체화에 있어서, 두 아미노산 또는 뉴클레오티드 시퀀스간의 퍼센트 동일성은 E.Meyers 와 W.Miller(CABIOS, 4:11-17(1989))의 알고리즘을 사용하여 판별되는데, 이 알고리즘은 12의 갭 길이 벌점과 4의 갭 길이 벌점을 적용하는 PAM120 잔여가중치 표를 사용하여 ALIGN(버전 2.0)프로그램으로 합체되었다.
현재 발명의 핵산과 단백질 시퀀스는 공공 데이터베이스에 반하여 검색을 수행하고자, 예컨대, 다른 족 구성원 또는 관련된 시퀀스를 확인하기 위해, "query시퀀스"로서 더욱 이용된다. 이런 검색작업들은 NBLAST 와 Altschul et al.(1990) J. Mol.Biol. 215:403-10 의 XBLAST 프로그램(버전 2.0) 을 통해 수행된다. BLAST 뉴클레오티드 검색은 인간에 대하여 또는 쥐과의 B7-DC 핵산 분자들에 대한 뉴클레오티드 시퀀스 동족을 얻기위해 뉴클레오티드 시퀀스 스코어 = 100, 단어길이 = 12 인 NBLAST 프로그램으로 수행된다.
BLAST 단백질 조사는 인간이나 쥐의 B7-DC 단백질 분자와 일치하는 아미노산 배열을 얻기위해 XBLAST 프로그램, score=50, wordlength=3과 함께 수행된다. 비교 목적을 위한 떨어진 정렬(gapped alignments)을 얻기위해 Gapped BLASTrk Altschul et al.(1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402에서 보여지는 바와 같이 사용될 수 있다. BLAST와 Gapped BLAST 프로그램을 사용할 때 각각의 프로그램(예를들어 XBLAST 와 NBLAST)의 디폴트 값이 사용될 수 있다. http//:www.ncbi.nlm.nib.gov를 보라.
그러므로 위에서 설명된 B7-DC 단백질과의 일치물은 (a)자연상태의 B7-DC의 기능적인 활동, 그리고 (b) 위에서와 같이 결정될 때 적어도 30%(아미노산 레벨에서), 바람직하게는 적어도 약50%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 70%, 더욱더 바람직하게는 적어도 약 90%의 자연상태의 B7-DC(SEQ ID NO:4와 같은)로 특징지워진다.
이것은 B7-DC의 열린 배열(disclosed sequences)에 기초를 둔 DNA 조사를 이용한 단백질을 표현하고 얻기 위한 영역의 기술안에 있다. 그러므로 단백질 생화학과 생물학 활동은 여기에서 설명되어지는 것과 같은 알려진 기술, 예를 들어 기본 T 세포 급증식 또는 시토카인 시크리션(secretion) 분석법을 사용하여 시험될 수있다. T 세포 동시반응 생물학 분석법은 동일체가 활동 동일체로 권한을 부여하는데 필요한 활동을 갖는지 여부에 대해 알려준다.
앞의 분석은 합동-자극 신호뿐만 아니라 TCR(주요 활성화 신호)의 고정 또는 교차연결에 의존한 세포질분열 합성 T 세포의 자극과 같은 기능적 특성을 측정한다. B7-DC를 그것의 T 세포의 자연적인 리간드에 고정하는 것은 기계적으로 측정할 수 있는 분열증식을 차례로 자극하는 IL-2처럼 증가된 세포질 분열 생산을 유발시키는 신호를 전한다.
B6-DC의 변형은 실질상 동일한 전체 단백질 또는 하나 또는 그 이상의 아미노산이 잔유물이 치환되거나 빼지거나 더해진 파편의 분자를 지시한다. B6-DC 파편은 어떠한 분자의 부분집합, 가급적이면 ECD를 포함하는 전체 폴리펩티드 길이보다 더 짧은 폴리펩티드 중 하나를 지시한다.
프로세스들의 수는 격리된 DNA 배열의 파편들, 돌연변이 그리고 변환물들을 생성하는데 이용되어질 수 있다. B7-DC 단백질을 인코딩하는 핵산의 작은 하부 영역과 파편들(예컨데, 길이상의 1-30베이스)은 표준의 화학적 합성에 의해 준비되어질 수 있다.
RNA 혹은 상보적 DNA에서 파생하는 올리고 뉴클레오티드와 플라이머는 더 큰 합성 파편의 생성에 사용된다.
선택된 기능의 데리베이티브(derivative)는 혼합된 단백질, 즉, 폴리펩타이드(polypeptide)로써, B7-DC의 기능적인 조각을 가진다.
예를 들어, B7의 유용한 데리베이티브(derivative)는 B7-DC-Ig 혼합 단백질로써, B7-DC의 ECD와 Ig C 영역에 대응하는 폴리펩타이드(polypeptide)를 이룬다.
혼합 파트너의 존재는 B7-DC 단백질의 솔루빌리티(solubility), 어피니티(affinity)와/또는 밸런시(valency)(여기서는 분자(molecule) 당 가능한 연결 사이트(site)의 개수로 정의)를 바꿀 수 있다.
가용성의 B7-DC 혼합 단백질은, 비록 아직까지 T 세포들 상의 리셉터(receptor)로 묶여 있다해도, APC, 즉, 코스트뮬레이션(costimulation)보다는 길항적인(competitive) 묶임에 의한 T 세포 자극의 금지, 상에 표현된 본래의 단백질에 비해 구별되는 생물학적인 효과를 가질 수 있다.
B7-DC의 초과셀 도메인(ECD)은 단백질의 전체 초과셀 부분 또는 그것의 어떤 조각으로 여기서 설명되고 있기 때문에, PD-1 또는 CD28이나 CTLA-4가 아닌 T 세포들 상의 다른 리셉터(receptor)를 인지하거나 묶게 된다.
가급적, B7-DC의 ECD는 아미노산에 의해 암호화된 부분이 대략적으로 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:4의 포지션 26으로부터 포지션 221까지를 잔류물로 갖는 것이 된다.
"용해성 B7-DC"은 만들어진(producing) 세포들로부터 발산되거나 숨겨지거나 그렇지 않으면 추출되는 B7-DC의 셀-프리 형태로써 의도되었다. 그러므로, 용해성 B7-DC는 생물학적인 활성 분자에 이르기까지 (유적학적으로 또는 화학적으로) 혼합된 BC-DC-Ig, B7-DC의 프리(free) ECD 이나 B7-DC ECD와 같은 가용성 혼합 단백질들을 포함한다(그러나, 이런 방식으로 제한되는 것은 아니다).
앞에서 지적했던 바와 같이, 본 발명은 또한 B7-DC 도메인과 코스티뮬레이토리(costimulatory) 형태의 세포 표면에 나타나는 다른 B7 가족(family) 단백질 사이의 변형 혼합 단백질들을 포함한다.
B7-DC 변이들 중에 선택된 그룹은 적어도 하나의 아미노산 잔유물(residue) 또는 단지 하나의 잔유물이 다른 잔유물들에 의해 치환되어져 왔다. 단백질 화학 성분 및 구조의 상세한 설명을 보기 위해서는 본 발명의 참조인 "Schulz, Ge et al., Principles of Protein Structure, pringerVerlag, New York, 1978", "Creighton, T.E., ProteinsL Stru8cture and Molecular Properties" 와 "W.H. Freeman & Co. San Francisco, 1983"를 보면 된다.
단백질 분자에서 만들어지는 치환의 형태는 'Schulz et al. (supra)'의 테이블 1-2와 'Creighton (supra)'의 도 3-9에 나타난 바와 같은 다른 종의 상동의 단백질 사이에 이미노산 변형의 빈도에 대한 분석에 근거한다. 이런 분석에 근거하여, 보존적인 치환은 아래의 다섯 개 그룹들 중에 하나의 속하는 교환에 해당하는 바와 같이 정의되었다.
1 적은 지방질, 무극성이나 적은 극성분 Ala,Ser,Thr(Pro,Gly)
2 극, 음성적으로 충전된 성분과 그들의 아미드 Asp,Asn,Glu,Gln
3 극, 양성적으로 충전된 성분 His,Arg,Lys
4 큰 지방질, 무극성 성분 Met,Leu,Ile,Val(Cys)
5 큰 지방성분 Phe,Tyr,Trp
덧붙여 말하면 단백질 구조에서 세개의 아미노산 성분은 특벽한 역할이 있다. 당은 사슬면이 없는 유일한 성분이고 따라서 체인에 유연성을 준다.
일반적이지 않은 구조때문에 pro는 단단하게 체인을 구속하다.
cys는 단백질층에 있어서 중요한 이황화물 띠 구조에 관여할 수 있다.
생화학에서 더 실질적인 변화는 기능적 가치는 다섯개 그룹에 선택한 덜 보수적인 치환에 의해 만들어진다.
그러한 변화들은 a), b), c),를 유지하는 효과에 있어서 더 명확하게 다를 것이다.
a) 예를 들어 얇은 판 혹은 나선형의 구조로서 치환영역에서 단백질 백본의 구조
b) 목표 사이트에서 전하 또는 분자의 소수성
c) 또는 사슬면의 크기 그런 치환들은
i) 또다른 아미노산에 의한 당 (그리고, 또는) pro 또는 당이나 pro의 삭제 또는 삽입
ii) 친수성 성분의 치환 예를 들어, ser or thr, 소수성 성분, (을 위한, 에 의한) 예를들어 Leu, Lie, Phe,Val,Ala
iii) 다른 성분 (을 위한, 에 의한) cys 성분의 치환
iv) 성분의 치환은 양전기적 사슬면을 가지고 있다. ,예를 들어 Lya, Arg, His, 성분( 을 위한, 에 의한) 음전기적 전하를 가지고 있다. 예를 들어 Glu 또는 Asp 또는
v) 성분의 치환은 부피가 커진 사슬면을 가지고 있다. 예를들어 Phe
성분( 을 위한, 에 의한) 그러한 사슬면을 가지고 있다. 예를 들어 당
가장 수용적 삭제, 현재 발명에 의한 삽입과 치환은 T셀 costimulatory 행동에 기인한 B7-DC 단백질의 성격에 있어서 근본적인 변화를 생산하지 않는다.
그러나 치환의 정확한 효과를 기대하는 것은 어려울때, 그렇게 하는 진보에 있어서 삭제나 삽입, art에서 숙련된 하나는 여기에 묘사된 것처럼, 어울리지 않는 실험 요구 없이 보통의 screening 분석에 의해 평가될 수 있는 것에 감사할 것이다.
반면 짧은 사슬 변이체는 화학적 합성에 의해 만들어질 수 있다. 현재 발명을 위해, 우선의 긴 사슬 변이체는 전형적으로 핵산의 site-specific 돌연변이에 의해 만들어 진다. 입력되는 B7-DC 폴리펩타이드, 세포 문화에서 변이체 핵산의 표현 그리고 부가적으로 셀 문화로부터의 폴리펩타이드의 세정, 예를 들어 immunoaffinity chromatography는 고정된 특별한 항체를 column에 이용한다.(묶여 있는 적어도 하나의 epitope에 의해 변이체를 흡수하기 위해)
B7-DC의 화학적 유도체
B7-DC의 화학적 유도체는 단백질부분의 일반적이지 않은 부가적인 화학적 일부분을 포함한다. 폴리펩타이드의 공유적 수정은 이 발명의내에 포함된다.
그런 유도된 일부분은 용해도, 흡수, 생물학적 하프 라이프그리고 그와 같은 향상을 가져 올른지 모른다.
그러한 효과를 중재하는 용량의 일부분은 드러내진다. 예를 들어
레밍톤의 제약학의 과학 16판 마크 출판사 이스턴 피메이(1980)
그러한 일시적인 변이는 선택된 사슬면이나 터미널 성분을 가지고 재반응 용량인 조직적 유도체 폴리펩타이드의 목표된 아미노산 성분의 재반응에 의해 분자속에 소개될 수 있다. 또 다른 일시적인 변이는 단백질의순환이다.
아래 폴리펩타이드의 화학적으로 이끌어낸 예이다.
Lysinyl과 아미노 터미널 성분은 숙신이나 다른 카복실릭 산 부수물에서 이끌어졌다.
순환적 카복실릭 부수물을 가진 유도물은 리신적 성분의 전하를 반전하는 효과를 가진다. 아미노를 포함하는 성분을 유도하기 위한 다른 적절한 반응물은 메틸 피콜리니미데이트, 피러독신적 포스페이트, 피러독신적 콜로보로하이드리드, 트리니트로벤제니설포닉 산, 오-메틸리소레아, 2,4 펜타니디온 그리고 글리오실레이트 를 가지고 트랜사미나스-바탈라이즈 된 반응과 같은 이미도에스터들을 포함한다.
카복실 사이드 그룹은 ,아스팔타일 또는 글루타마일, 1-사이클로핵살-3-(2-모포일닐-(4-에틸) 카본디이미드 또는 1-에틸-3-(4-마조니아-4, 4-디메틸펜타일) 카보디이미드과 같은 카보디이미즈(R-N=C=N-R)을 가지고 재반응에 의해 선택적으로 수정된다.
더우기 아스파타일 과 글루타마일성분은 암모니아를 가지고 재반응에 의해 아스파라기닐과 글루타미닐 성분으로 반전될 수 있다.
다른 일시적인 변이들은 프롤린과 리신의 하이드록실레이션서릴의 하이드로실 그룹의 포스포릴레이션 또는 threonyl 성분, 리신 아미노 그룹의 메틸레이션(Creighton, supra, pp. 79-86), N-터미널 아민의 아세틸레이션, 그리고 C-터미널 카복실 그룹의 마이데이션을 포함한다.
또한 하나 또는 더 많은 D-아미노산에 포함된 것은 하나 또는 그 이상의 L-아미노산을 위해 치환된다.
다중결합 펩티드들
또한 최근의 발명은 더 긴 폴리펩티드를 포함하는데, 그중 B7-DC의 시퀀스로부터 얻어진 기본적인 폴리펩티드 시퀀스는 공백들 또는 연결자들(linkers)을 포함해서 또는 그것들 없이 약 2번 내지 100번정도 반복된다. 그런 다중결합들은 여기에 정의된 어떤 펩티드 변형체로 부터 만들어질수 있다고 생각된다. 더우기, 펩티드 다중결합은 서로다른 펩티드 단량체의 결합과 그로부터 드러난 치환 변형물로 구성될 수 있다. 그러한 올리고머 또는 다중결합 펩티드들은 여기에서 언급한 화학적 합성 또는 DNA재조합 기술에 의해서 만들어질 수 있다. 재조합적으로 제조될 때, 다중체들은 표현 시스템이 허용하는 한 최대한 많은 반복을 가질수 있는데, 예를들면, 약 2번 내지 100번이다.
B7-DC의 펩티드 또는 폴리펩티트의 직렬로 배열된 다중체, 바람직하게는 이중체 또는 삼합체들 있어서, 인터체인 이황화물 결합 또는 기타 사슬들간의 "인공적인" 공유결합들 결합에 의해 속박되에 있는 사슬들은 끝에서 끝으로(end-to-end) 묶여 있다기 보다는 옆으로 옆으로(side-by-side) 묶여있다.
바람직한 이중체 또는 삼중체들은 여기서 설명한것과 같이 B7-DC-Ig와 같은 B7-DC 간의 융합 단백질들이다.
B7-DC의 epitope을 위한 항체 명세(Specific)
다음 설명에서 참조문헌은 면역학, 세포생물학, 그리고 분자생물학 기술에있어서 그러한 기술들로써 알려진 다양한 계통적 분류법에 대하여 만들어질 것이다. 그 참조문헌은 계통적 분류법으로 만들어졌는데, 그러한 알려진 계통적 분류법들을 출판한 출판물들과 다른 소재들은 그들이 전체로서 출판되었다고 하더라도 여기서 그들 전체로서 합체되었다. 일반적인 면역학의 법칙들을 출판한 표준 참조 자료들은 A.K. Abbas et al., 세포적, 분자적인 면역(제 4판), W.B.Saunder Co., 필라델피아, 2000; C.A.Janeway Publishing Co., New York, 1999; Roitt, I. et al., 면역학, (현재판) C.V.Mosby Co.,St.Louis, MO(1999); Klein,j.,면역학, Blackwell sciectific Publications,Inc.,Cambridge, MA,(1990)
Monoclonal 항체(mAbs)와 이를 생산하기 위한 방법은 이하에 설명되어 있다. Kohler and Milstein, Nature 256:495-497(1975); U.S.Patent No. 4,376,110; Hartlow, E. et al.,Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1988); Monoclonal Antibodies and Hybridomas; A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, New York, NY(1980); H.Zola et al.,in Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications, CRC Press, 1982)).
면역학적 검증방법은 또한 이하에 설명되어 있다. Coligan, J.E. et al.,eds.,Current Protocols in immunology, Wiley-Interscience, New York 1991(or current edition); Butt, W. R.(ed) Practical Immunoassay: The State of the Art, Dekker, New york, 1984; Bizollon, Ch. A.,ed.,Monoclonal Antibodies and New York, 1984; Butler, J.E.,ElISA(Chapter 29), IN:van Oss, C.J. etal.,(eds),
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Anti-idiotypic 항체는 예컨대 다음과 같은 참고자료에 설명되어 있다. Idiotypy in biology and Medicine, Academic Press, NewYork, 1984; Immunological Reviews Volume 79, 1984; Immunological Reviews Volume 90, 1986; Curr. Top. Microbiol.,Immunol. Volume 119, 1985; Bona, C. et al.,CRC Crit.Rev.Immunol.,pp. 33-81(1981); Jerne,NK,Ann.Immunol.125C:379-389(1974); Jerne, NK,In:Idiotypes-Antigens on the Inside, Westen-Schnurr,I.,ed,Editiones Roche, Basel, 1982, Urbain, J et al.,Ann.Immunol. 133D:179-(1982);Rajewsky,K.et al.,Ann. Rev. Immunol. 1:569-607(1983)
최근의 발명은 polyclonal과 monoclonal, reactive 항체에 B7-DC의 새로운 epitopes을 제공하는데, 이 epitopes은 알려진 B7 족(family) 단백질로부터 없어진것이다. 항체들은 xenogeneic, allogeneic, syngeneic, 또는 humanize되거나 정체불명의 항체와 같이 그것으로 부터 변형된 형태일 수 있다. anti-B7-DC 항체의idiotype 에 대한 Antiidiotypic 항체들 또한 포함되었다. 항체라는 용어는 또한 intact 분자들 뿐 아니라 파편들을 의미하기 위하여 사용되는데 그러한 파편들은 antigen binding site를 포함하고, B7-DC epitope에 묶어놓을 수 있는 능력을 가진 다. 이러한 것들은 intact 항체의 Fc 조각을 부족하게 하고, 더욱 빠르게 순환으로 부터 청결하게 하고, intact 항체 보다 덜 non-specific tissue binding 하는 Fab 와 F(ab')2 를 포함한다.(Whal et al., J Nucl. Med 24:316-325(1983)). 또한 Fv 조각들을 포함한다.(Hochman, J. et al.(1973) Biochemistry 12:1130-1135; Sharon, J. et al(1976) Biochemistry 15:1591-1594). 이러한 여러가지 조각들은 protease cleavage 또는 화학적인 cleavage 와 같은 전통적인 기술들을 사용해서 만들어진다.(예컨대, Rousseaux et al.,Meth. Enzymol.,121:663-69(1986))
polynominal 항체는 면역된 동물, 예를 들어 토끼, 염소, 설치류 등의 혈청으로 부터 얻어지며, 더이상의 조작없이 직접 사용되어질 수 있으며, 또는 간편한 증식이나 황산 암모늄 침전, 이온 변환 크로마토그래피, 친화 크로마토그래피와 같은 순수화 방법으로 얻어질 수 있다(see Zola et al., supra).
면역세포는 완전한 B7_D6 단백질 또는 그들의 조직이나 유도체로부터 얻어질 수 있다. 이전의 면역세포는, 자연상태의 B7-DC에서 찾을 수 있는 글리코실레이션과같은 번역 후의 변형물을 포함하는 아미노산 잔류물인, 인간 B7-DC(아미노산 잔류물 26-221)의 ECD 일부 또는 전부로 부터 얻을 수 있었다. 잔여세포 영역에서 합성된 면역세포는 편리한 재조합 방법을 사용한 복제 세포의 표현, 근원세포로부터의 분리, B&-DC의 높은 레벨을 표현하는 세포 인구등의 방법으로 알려진 다양한 방법으로 만들어진다.
mAbs는 Kohler와 Milstein에 의해 고안된 방법(Nature, 256:495-97(1975))과 같은 간편한 복합체 기술을 사용하여 만들어질 수 있다(see above references). 바람직하게는 쥐와 같은 동물은 정화되어진 동물안에서 바람직하게 얻어진 항체를 얻어내 위에서와 같이 면역세포와 함께 면역에 의해 정화된다.
림프샘, 스플린스(spleens) 또는 정화된 동물의 말초 혈액으로부터의 B림프구는 일반적으로 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 촉진재와 함께 골수세포와 융합된다. 수많은 쥐의 골수세포선 중 어떤것들은 다음과 같은 용도; P3-NS1/1-Ag4-1,P3-x63-k0Ag8.653, Sp2/0-Ag14, 또는 HL1-653 골수선(ATTC, Rockville, MD에 의해 유용하게 되는)에 유용하다. 다음 과정은 오직 복합체 세포만을 살려두고 융합되지 않은 골수세포와 도너 림프세포를 완전히 죽이기 위해서선택적인 매질안에서의 증식을 포함한다. 이들은 복재되고 증식되어 그들의 표면에 원하는 특성, 예를 들면 immunoassay 기술에 의해 B&-DC-IG 합성 단백질을 사용하여 양성 복제세포가 복제되도륵 한다거나 제한된 희석에 의해 mAbs가 분리되어지게 하는 특성 등을 같는 항체가 생기도록 한다.
이러한 방법으로부터 생산된 복합체는 기존에 알려진 기술(see generally Fink et al., Prog. Clin. Pathol., 9:121-33(1984))을 사용하여 in vitro 또는 in vivo(복수의 흐름 안에서) 증식되어질 수 있다. 일반적으로 개개의 세포선은 배양물질에서 증식되어지며, 단일 mAbs의 높은 집중도를 포함하는 배양물질은 배양불질은 디캔테이션(decantation), 여과, 또는 원심분리에 의해 얻어질 수 있다.
항체는 보퉁의 멀티메릭(multimeric)구조 대신 단일 체인(chine) 항체나 scFv에 의해 얻어질 수 있다. 단일 체인 항체는 Ig의 interest로부터의 초변화가능 영역을 포함하며 가공하지 않은 Ig크기의 조각그대로 있는 자연상태의 Ig자리에 엮어서 항원를 재생성한다(Skerra,a. et al.(1988) Science,240: 1038-1041; Pluckthun,A. et al.(1989) Methods Enzymol. 178:497-515; Winter,G. et al.(1991) Nature, 349:293-299); Bird et al.,(1988) Science 242:423; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sct. USA 85:5879; Jost CT et al,. J Biol Chem. 1994 269:26267-26273; U.S.Patents No. 4,704,692, 4,853,871, 4,946,778, 5,260,203, 5,455,0Kn dms 레이블드(labled) 항체의 알려지지 않은 양을 포함하는 해법과 연관이 있다(이러한 것을 reporter molecule라 한다). 레이블드 항체가 언레이블드 항체를 통해 고체 지지대에 묶인 항원(antigen)와 함께 합성하기 위한 두번째 증식기간 후에, 고체 지지대는 반응이 없는 레이블드 항체를 제가하기 위해 두번 씻겨진다. 이러한 타입의 전향(forward) 샌드위치 분석(assay)은 간단히 항원이 있는지여부 또는 알려진 항원의 양을 포함하여 표준 샘플에 의해 얻어지는 레이블드 항체의 양을 비교하여 만들어질지도 모르는 양을 결정하는데 있어 단순히 "yes/no"로 분석할 수 있다.
"동시" 또는 "역" 이라 부는 다른 타입의 샌드위치 분석법이 사용되어진다. 동시 분석법은 고체 지지대에 묶인 항체와 레이블드 항체가 모두 동시에 시험되어지는 샘플에 추가되어 있는 단일 배양 단계를 포함한다. 배양이 완전히 된후, 고체지지대는 나머지 액체 샘플과 합성되지 않은 레이블드 항체를 제거하기 위해 씻겨진다. 고체 지지대와 관계있는 현재의 레이블드 항체는 편리한 전향 샌드위치 분석에서와 같이 결정되어진다. "역" 분석법에서, 적합한 배양 기간 후에 고체 지지대에 묶인 언레이블드 항체의 추가에 따라 액체 샘플에 레이블드 항체의 해법의 처음에 한걸음씩 추가하여 사용되어진다. 이차 배양 후에, 고체상은 편리한 방식으로 씻겨져서 시험되고 있는 나마저 샘플과 반응이 없는 레이블드 항체의 해법에 놓아진다. 고체 지지대와 관련있는 레이블드 항체의 결정은 "동시" 그리고 "전향" 분석법에 의해 결정되어진다.
앞의 항체들은 T 세포 반응을 억제하고 이식 거부반응이나 자유면역과 같은 바람직하지 않은 T 세포 활성화와 관련된 질병 치료에 유용하다. 이러한 방법은 항체,바람직하게는 mAb, 더욱 바람직하게는 B7-DC의 동시반응 epitope을 위한 인간이나 인간화된 mAb 특성 효율적인 양의 관리의 필요와 같은 주제의 관리를 포함한다. 항체의 관리는 T 세포 반응을 막거나 항원 T 세포 반응을 없애며, 따라서 표적 T 세포 반응 금지에 효과적이어야 한다. 적절한 투약양은 다음에 설명되어진다.
B7-DC 단백질로 암호화된 인산의 활용
본 발명에 있어서, 인산은 생물학적 표본 또는 B7-DC 표현식 약제 효과를 분석시험하는데 있어서 세포의 B7-DC의 표현식을 측정함으로써, 질병의 진행을 감시하는 데 진단상 유용하게 쓰인다. 이것은 오히려 세포의 mRNA 단계의 측정에 의하여 완성된다. 이와같은 진단방법에 이용함에 있어서 인산은
치료상의 구성 및 관리
B6-DC 폴리펩티드 또는 DC, 종양세포와 같은 폴리펩티드 세포는 인간과 같은 포유류에 투여되었다. 폴리펩티드의 집합 또는 고정된 형태의 세포조합은 T 림프구 반응과 그 결과로서 생기는 면역을 강화하는데 쓰인다. B6-DC-Ig 용해 단백질은 예에서 보여주는 바와 같이 2분자체로 조합되며 T 세포를 합동-자극한다. B6-DC 폴리펩티드의 용해하기 쉬운 단량체 형태는 수용체의 T 세포에 자극없이 고정시킬 수 있고, 그럼으로써 분자의 자극형태에 의한 T 세포 합동-자극의 반응억제제 또는 길항제로 간주된다. B6-DC와 같은 길항제의 고정은 T 세포 반응의 진행을 억압하거나, 그들의 내생적인 B6-DC 또는 수용기를 통하여 활동하는 다른 B7 족(예를 들어 CD28 또는 CTLA-4)의 합동-자극 신호를 나타내는 효과를 방해할지도 모른다.
여기에 기술한 B7-DC의 활동을 가진 구성은 생물학상 효과 또는 치료상의 효과 양에 있어 약학적으로 받아들일 수 있는 기제로 투여된다. B7-CD 폴리펩티드(또는 폴리펩티드로 합성된 세포)는 단독으로 또는 B7 족의 및 다른 면역억제 분자의 활동을 가지는 펩티드 화합물에 포함된 형태로 주어질 수 있다. 치료제는 인터페론과 같은 불특정한 면역성 자극 혼합물을 포함하는 넓은 의미로 사용되는 보조약의 투여를 포함할 수도 있다. 보조약은 여기에 레조르시놀, polyoxyethylene oleyl ether와 n-hexadecyl polyethylene ether와 같은 비이온 계면활성제를 신중히 포함한다.
다음의 복용량은 본 발명의 항체를 피실험자에게 투여할 때 관련이 있는 것이다. 치료상 효과적인 양은, 기대되는 면역상 또는 임상의 효과를 이룰 수 있는 효과적인 시간간격으로 주어지는 1회분 투약량이다.
치료상의 실제적인 B7-DC 효과(또는 anti-B7-DC 항체)를 가진 폴리펩티드의 양은 질병의 상태, 나이, 성별, 그리고 개인의 체중과 개인별 원하는 반응이 도출되는 펩티드의 능력등과 같은 요인에 의해서 달라질 수 있다. 1회분 투약량은 최적의 치료 반응을 제공하기 위하여 조정될 수 있다. 예를 들어 1회분 투약량을 하루동안 서너번으로 나누어 투약할 수도 있고, 치료상태의 위급한 상황에 따라 비례하여 줄일 것을 지시할 수 있다. 치료상 효과적인 단백질의 양은 세포 조합의 형태에 있어서 단백질 또는 세포 등량의 조건의 관점에서 제시될 수 있다.
이렇게, 효과적인 양은 투약자의 몸무게에 따라서 1 kg 당 약 1ng ~ 1gram, 더 가급적이면 약 1μg ~ 100 mg, 더 가급적이면 약 100μg~100mg 이다. 체내의 투약에 적합한 1회 투약량의 형태는, 가급적이면 단위당 즉효성 성분이 약 0.1mg에서 500mg을 포함한다. 즉효성 성분은 화합문의 전체무게에 근거한 무게의 0.5~95% 내에서 변경될 수 있다. 대안으로, DC's 또는 비활성의 종양세포와 같은 세포를 변환하는 B7-DC를 나타내는 세포의 효과적인 복용량은 피술자당 약 104~109개 세포, 더 가급적이면 약 106~108개 세포이며, 가급적이면 나누어서 복용한다. 이러한 면역요법에서 얻은 기술은 과도한 실험 없이 이들 복용량을 조정할 수 있도록 할 것이다.
즉효성의 화합물(예를 들어 B6-DC 폴리펩티드 또는 B6-DC DNA로 변환된 세포)은 편리한 방법으로(예를 들어 주사에 의한 편리하고 효과적인 경로로) 투여될 수 있을 것이다. 이러한 경로로는 피하주사, 피내주사, 정맥주사, 근육주사 등이포함된다. 다른 가능한 경로는 경구투여, 흡입, 경피연고, 또는 좌약 등이다. 완전히 잘래내지 않은 종양에 대한 치료를 위하여 직접 주사하는 것도 할 수 있다.
투여의 경로에 따라서, 즉효성의 화합물에 그것을 비활성화시킬수 있는 효소, 산, 그리고 다른 자연적인 조건으로부터 보호하기 위한 물질로 입힐 수 있다. 그리하여, 폴리펩티드 또는 활성화된 B7-DC를 가진 펩티드가 장을 통한 경로에 의하여 투약될 때, 그것의 비활성화를 막는 물질의 화합물로 코팅되거나 함께 투여되어야 필요성이 있을 수 있다. 일예로 펩티드는 희석액 또는 보조약과 같은 적당한 매개체로 개별적으로 투약되거나 효소 반응억제제(예를 들어 췌장 트립신 반응억제제, diisopropylfluorophosphate(DEP), trasylol)와 함께 투약되어야할 것이다. 또는 리포솜(재래의 water-in-oil-in-water와 같은 리포솜을 포함하는)을 적당한 매개체로 할 수 있을 것이다. (Strejan et al.,(1984) J.Neuroimmunol 7:27).
상기에서 사용된 바와 같이, "약리적으로 허용되는 캐리어 (Pharmaceutically acceptable carrier)"는 임의의/모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항생제, 항진균제, 등장 흡수지연 에이전트 등을 포함한다. 물질을 약리적으로 활성화시키기 위한 미디어(media)와 에이전트(agent)의 용도는 선행기술에서 잘 알려져 있다. 종래의 미디어와 에이전트가 활성화합물과 배합 금지된다는 것을 제외하고는, 치료용 혼합물에서는 사용 가능하다. 또한, 보충적 활성 화합물은 혼합물에서 혼합될 수 있다.
선호되는 약리적으로 허용가능한 희석액은 염류성이면서 수성인 완충용액을 포함한다. 주입에 적합한 약리적 혼합물은 무균의 수성 용액(여기서는 물에 녹을수 있는 물질), 또는 살균 주입성의 용액이나 디스퍼션의 임시 조제품을 위한 디스퍼션과 살균 파우더(sterile powers)를 포함한다. 설탕, 폴리얼 알콜(예를 들면, 마니톨, 소비톨), 염화나트륨 등과 같은 등장 에이전트는, 약리적 혼합물에 포함될 수 있다. 모든 경우에 있어서, 혼합물은 무균이고 유동적이어야 한다. 그리고, 제조 및 저장 상태하에서 안정적이어야 하고, 박테리아나 균류와 같은 미생물로 인한 오염을 예방할 수 있는 프리저버티브(preservative)를 포함해야 한다. 또한, 디스퍼션은 글리세롤, 액성 폴리에틸렌 글리콜, 및 이들의 혼합물이나 오일 속에서 제조되어야 한다.저장 및 사용에 대한 통상적인 조건하에서, 상기와 같은 제조는 미생물의 성장을 예방할 수 있도록 프리저버티브를 포함할 수 있다.
캐리어는 물, 에탄올, 폴리올(예를 들면, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액성 폴리에틸렌 글리콜 등등), 및 이들의 적절한 혼합물을 포함하는 용매나 분산매질일 수 있다. 적절한 유동성은 레시틴(lecithin)과 같은 코팅의 사용, 디스퍼션에 있어서 요구되는 입자 크기의 유지, 및 계면활성제의 사용에 의하여 유지될 수 있다.
미생물의 활성에 대한 방지는 다양한 항균성 및 항진균성의 에이전트(예를 들면, 파라벤즈(parabens), 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등등)에 의하여 이루어질 수 있다.
주입성의 혼합물의 흡수의 지연은, 혼합에서 흡수를 지연시키는 에이전트(예를 들면, 알루미늄 모노스테라이트(monostearate)와 게라틴)를 포함으로써 이루어진다.
비경구성의 혼합물(parenteral compositions)은 복용량의 일정성과 투약의 편리성을 위하여, 완전하게 복용량 단위로 만들어진다. 복용량 단위형태는 포유류 피실험자를 위한 일복용량와 같이, 물리적으로 분리되는 것을 말한다. 각각의 복용량 유닛은, 필요한 약리적 캐리어와 관련된 원하는 치료 효과를 발휘하도록 계산되어 미리 정해진 활성 화합물의 양을 포함한다. 본 발명의 복용량 단위에 대한 상세한 설명은, (1) 활성 화합물의 독특한 특성과, 효과가 발휘될 수 있는 특정한 치료 효과, 및 (2) 각각의 개인에 대한 치료상의 민감성을 위한, 활성화합물과 같은 혼합 방식에 있어서의 본질적인 제약에 직접적으로 의존하면서, 이에 의하여 기술된다.
폐 점적(lung instillation)에 있어서는, 에어로졸화된 용액이 사용된다. 스프레이형 에어로졸 조제품에 있어서는, 활성 단백질은 고체 또는 액체의 비활성 캐리어 물질과 콤비네이션될 수 있다. 또한, 이는 눌러 짜내는 플라스틱병(squeeze bottle), 또는 압축되고 휘발성인 기체 추진제와의 혼합물로 포장될 수 있다. 에어로졸 조제품은 본 발명의 단백질이외에 용매, 완충액, 계면활성제, 산화방지제를 포함한다.
국부 치료(topical application)에 있어서, 본 발명의 단백질은 연고와 같은 바르는 매개물에 국소적으로 혼합되어 구현되는데, 이는 피부를 부드럽게 하는 효과가 있으며, 감염된 곳에 활성 성분(active ingredient)을 직접 투여하는 수단을 갖는다.
활성 성분에 대한 캐리어는 프레레이형이나 비스프레이형으로 될 수 있다.비스프레이형은 국부 치료에 본빌적인 캐리어를 포함하며, 또한 물보다 훨씬 더큰 다이나믹 점성을 가지는 반고체나 고체형으로 될 수 있다. 적당한 포뮬레이션 (formulation)은 용액, 서스펜션, 에멀션, 크림, 연고, 파우더, 바르는약 (liniment), 슬레이브 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 원한다면, 이와 같은 것들은 보조 에이전트(예를 들면, 프리저버티브(preservative), 안정제, 웨팅 에이전트(wetting agent), 완충액, 또는 삼투압에 영향을 끼치는 소금 등등)살균되거나 혼합될 수 있다. 비스프레이형 국부 치료용 비이클(vehicles)로서 선호되는 것은 연고 베이스(ointment bases)(예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜-1000(PEG-1000)), HEB 크림과 같은 컨벤셔널 크림, 젤, 페트롤럼 젤리(petroleum jelly) 등을 포함한다.
본 발명에 따른 B7-DC 폴리펩티드에 대하여 약리적으로 허용 가능한 다른 캐리어는 리포솜, 즉 지질층에 부착된 수용성 동심층(aqueous concentric layers)으로 이루어진 소체들(corpuscules) 속에 흩어져 있거나 다양하게 존재하는 약리적 조제품(그 속에 활성 단백질을 포함하고 있음)이다. 활성 단백질은 수용성층과 지질층내에, 층 내/외부에, 어떤 이벤트에서든지, 리포솜이라고 알려진 비균질계 내에서 완전하게 존재한다. 소수성층, 또는 지질층은 일반적으로 레시틴(lecithin) 및 스핑고미예린(sphingomyelin)과 같은 인지질, 콜레스테롤과 같은 스테로이드, 디세틸파스페이트(dicetylphosphate)과 같은 어느정도의 이온성 표면 활성물질, 스티어리라민(stearylamine)이나 파스페타이딕산 (phosphatidic acid), 및/또는 다른 소수성 물질로 구성되나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
B7-DC와 복합 코스티뮬러토리(costimulatory) 분자를 표현하는 종기 세포들의 변경
발명의 또 다른 양상은 세포로서, 오히려 종기 세포는 복합 코스티뮬러토리(costimulatory) 분자를 표현하기 위하여 변화하였다. B7과 B7-2 그리고 B7-3을 위해 다른 활성화된 B 세포에 코스티뮬러토리(costimulatory) 분자의 때를 나타낸 표현이 있다. 예를 들면, B7-3이 나중에 표현되는 까닭에 B7-2는 일찍 다음 B 세포 활성화로 표시된다. 면역반응의 방침 동안에 다른 코스티뮬러토리(costimulatory) 분자는 이처럼 구별되는 기능에게 편의를 줄지도 모른다. 복합 코스티뮬러토리(costimulatory) 분자로부터 효과적인 T세포에서 분화한 림프구 대답은 T세포에서 분화한 림프구가 코스티뮬러토리(costimulatory) 암호들을 받을 것을 요구할지도 모른다.
그러므로, 본 발명은 종기 세포를 둘러싼다. 그것은 유전학적으로 변경되거나, 1개 이상의 코스티뮬러토리(costimulatory) 분자를 표현한다. 예를 들면, 종기 세포는 B7, B7-2, B7-3의 B7-DC과 1이상을 표현하기 위하여 변경될 수 있다.
변경전에는, 종양 세포와 같은 세포가 얼마간의 코스티뮬러토리(costimulatory) 분자들을 표현할 수 없거나, 정확한 코스티뮬러토리(costimulatory) 분자들 역시 다른 것들을 표현할 수 없다. 여기에 설명된 것처럼, 종기 세포들은 핵산이 홀로 B7-DC을 암호로 고쳐쓴 채로 트랜스펙션에 의해서 변경될 수 있거나, 또 다른 코스티뮬러토리(costimulatory) 분자(들)를 가지고 변경될 수 있다. 예를 들면, 종기 세포에 있어서 B7-DC을 암호로 고쳐쓰는 핵산은 더욱더 핵산이 B7을 암호로 고쳐쓴 채로 트랜스펙션될 수 있다. 인간을 암호로 고쳐쓴 cDNA 분자의 순서 또는 마우스 B7-DC 단백질들은 각각 SEQ ID NO:1 이고, SEQ ID NO:3의 암호로 고쳐 쓰여진다. 양자 택일로, 변경의 1가지 이상의 타입은 사용될 수 있다. 예를 들면, 종기 세포는 핵산이 암호로 고쳐 쓰여진 채로 트랜스펙션된다. B7-DC은 B7-1의 표현(B7-2 아이디 B7-3)을 설득한 대리인과 0으로 자극될 수 있다.
병원균들과 결합된 항원들
본 발명은 치명적인 암과 만성적인 바이러스 감염 치료용 백신의 구성요소로 주로 사용된다. 그러한 우두종들은 감염된 세포들을 제거하도록 설계된다. - 이것은 항원 에피토프(epitope) 그 자체로서 T세포에서 분화한 림프구 대답을 요구한다.
(a) 노출된 DNA, 노출된 RNA와 같은 벡터는 RNA 레플리콘스(replicons), 우두를 포함한 바이러스들, 아데노바이러스(adenoviruses), 아데노(adeno)-어소시에이즈드(associaged) 바이러스(AAV), 렌티바이러스(lentiviruses) 그리고 RNA 알파바이러스(alphaviruses)를 복사하는 것을 자가수분 시킨다.
(b) 항원은 HSP70, 칼레티큐린, 세포외의 지역에서의 flt-3 배합기, 지역?에서의 페세돔나스 외독소 ETA, 단백질을 공격하기 위한 단일의 VP22 포진등과 같은 신호를 공격하거나 처리한다. (U.S. 특허출원 09/421,608; 09/501,097; 09/693,450; 60/222,9002; 60/222,985; 60/268,575과 chang, W-F et al., J.Virol.의 75:2368-2376(2001)을 참조하라)
(c) costimulatory 신호, 현재 발명되거나 용해된 단백질의 B7-DC 단백질, 파생적이거나 기능적인 파생물 (CD40등을 용해할 수 있는 B7.1, B7.2와 같은 단독으로 또는 다른 알려진 costimulatory 단백질)
APCs를 포함하고 있는 종양세포 또는 숙주세포의 다른 형태는 변형되거나 완전 바이어스가 복제되거나 또는 그렇지않으면 면역에 대한 응답이 요구되는 항원을 핵암호화로 변형한다. 상기의 항원들은 오히려 마이크로유기체를 만들어내는 항원이다.
숙주는 T 세포응답, cytotoxic T 림프구(CCL)와 과민한 형태로 연기된 효과기에 의해 방어되어진다. 이와같은 전형적으로 포함된 말레리아나 박테리아와 같은 바이러스들과 세포내적 기생충들은 마이코박테리아와 리스테리아와 같이 세포내적으로 자라게 된다. 그러므로, 이 발명의 백신 성분안에 항생균은 이와 같은 병원균(종기특유의 항생균들의 추가 또는 방향)을 포함한다.
특히 암의 발생원인이 되는 요소의 바이러스의 경우에는 어떤바이러스 항원은 종기 항원이다.
사실, 세계적으로 가장 일반적인 헤파토마와 서비칼암은 바이러스 감염에 의해 만들어진다. 헤파티니스 B 바이러스 (Beasley, R.P. et al., Lancet 2, 1129-1133(1981)는 감암 병원체의 원인으로써 영향을 미쳐왔다. 자궁암의 80-90%는 인간의 매우v위험한 파필로마바이러스인 HPV-16, HPV-18, HPV-31와HPV-45 (Gissmann,L.et al., Ciba Found Symp. 120, 190-207(1986); Beaudenon, S. et al.nature 321, 246-249(1986)의 하나로부터 E6 과 E7 항원으로 표현된다. HPV E6과 E7 항원은 쎄비칼 암에 있어서 그들이 편재되어 있기 때문에 개인적인 면역성에 있어서 암에 관련된 바이러스를 위한 가장 확실한 목표가 되고 있다.게다가 암치료을 위한 백신과 종기 항원과 관련된 바이러스의 가장 중요한 목표는 질병예방의 백신에 대한 이상적인 지원자이다. 사실, 아시아에서의 질병예방의 HBV 백신에 대한 도입으로 헤파토마(Chang, M.H., et al. new. Engl j. Med. 336, 1855-1859(1997), 의 발생률이 감소하고 있고, 암 예방에 있어 가장큰 영향력을 나타내고 있다.
만성 인체 바이러스의 병균간염에 있어 가장 중요한 바이러스 가운데에는 "인체 유두종 바이러스(HPV), 병리간염 B 바이러스(HBV), 병리간염 C 바이러스(HCV), 인체 면역결여 바이러스(HIV),엡스타인바 바이러스(EBV),그리고 포진성의 단순한 바이러스가 있다.
인간의 암과 간염성 질병들에 대한 바이러스의 적응성에 더하여 현 발명은 또한 수의학 분야에서 동물의 질병치료용으로 고안되었다. 따라서, 여기에서 묘사되어 있는 접근방법은 아마도 말의 헤르페스바이러스, 소의 헤르페스바이러스, 닭과 기타조류에서 발견되는 마렉(Marek)의 질병 바이러스, 동물성 종양 질병, 광견병과 공수병 등과 같은 것을 포함하여 수의학의 헤르페스바이러스치료법에 대한 기술분야에서 습득된 한가지에 의해 적용될 것이다.
다음의 참고문헌들은 4가지의 원칙과 기본적, 의학적, 수의학적 바이러스의 분야에서 통용되는 정보에 기초를 두고 있으며, 이 참고문헌에 의해 통합되었다(FieldsVirology, Fields, BN et al., eds., Lippincott Williams & Wilkins, NY, 1996)
<약물표적화 분자>
다양한 활동모드를 지니고있는 다수의 단백질은 좀 더 효능있고 효과적인 방법으로 티(T)세포에 있는 항원의 준비를 촉진하는 세포와 세포이하의 구획에 항원을 표적화하기위해 항원과 결합하거나 또는 가급적 용해폴리펩타이드와 결합하는 "약물표적화" 분자들에 의해 영향을 받게 된다.
열쇼크단백질(HSPs)에 있는 항원의 결합은 핵산이 기초된(그리고 기타) 백신들의 잠재력이 증가하기 위한 잠재된 접근법을 제시하고 있다. 열쇼크단백질(HSPs)은 암과 바이러스 백신의 자연 생물학의 보조약으로 활동하기 위해 나타난다. 소포체(ER)에 상주하는 gp96 열쇼크단백질(HSPs)과 사이토졸의 열쇼크단백질 70 양자 모두 면역보조체로 활동한다(Srivastava, PK et al., Semin Immunol. 3, 57-64(1991); Udono, Het al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 3077-3081(1994)). 이러한 열쇼크단백질(HSPs) 또는 샤포로닌스는 넓은 펩티드의 줄로 묶는다(Lammert, E., et al. Eur. J.Immunol. 27, 923-927(1997)). 열쇼크단백질(HSPs)70은 프로테좀(MHC 분류 I 분자와 결합하기 위한 펩티드를 생성하는 주요한 세포의 프로테아제 컴플렉스)에 결합된 단백질을 약물표적화할 수 있는 하나의 케퍼로닌이다. 그러므로, 열쇼크단백질(HSPs)70에 직접 연결된 항원은 MHC 분류 I 분자(leading, inter alia, to CTL response)에 의해 좀 더 효율적으로 나타나게 된다. 두가지 양상은 열쇼크(HSP)보조체에 초래되어 나타난다. 첫번째, in vitro, 효과적으로 gp96이 적재된 펩티드는 항원과 MHC 분류 I 진행 경로에서 만나게 된다. 두번째, 마이크로페이지에 있는 gp96의 묶음은 프로인플램매토리 사이토킨스의 분비작용을 유도한다,따라서, 펩티드 항원에 있는 세포의기능에 대한 논쟁은 표적화되었다. 병리종양으로부터 고립되어있거나 바이러스 감염된 세포로부터 고립된 열쇼크단백질(HSP) 컴플렉스와 함께 면역체는 잠재적 반병리종양면역 또는 반 바이러스성의 면역체를 유도한다(Srivastava, PK et al., Int J Cancer. 33: 417-22, 1984; Srivastava, PK et al., Proc Natl Acad Sci USA. 83: 3407-11, 1986; Udono, Het al., J Immunol. 152: Tamura, Y et al., Science. 278: 117-20, 1997; Janetzki, S et al., J Immunother. 21: 269-76, 1998)). 열쇼크단백질(HSP)과 펩티드를 섞은 in vitro는 면역성의 열쇼크단백질 펩티드 컴플렉스를 생성한다(Ciupitu, AM et al., J Exp Med. 187: 685-91, 1998; Blachere, NE et al., J Exp Med. 186: 1315-22, 1997). 가장 최근에는 현재 발명자들과 그들의 동료들(e.g., Chen, C-H et al., Canc. Res. 60: 1035-1042(2000))이 가공할만한 DNA또는 RNA 레플리콘 백신의 형태로 열쇼크단백질(HSP)을 사용했다. 그들은 HPV-16 E7을 에 마이코막테리엄 튜버큘로시스 HSP 70(Mycobacterium tuberculosis HSP 70)항원으로 사용했다. 종양의 설립에 반대하는 잠재적 반 종양면역에 기인한 E7-특별한 CD 8 +T세포의 확장과 활성이 증가했음을 보여준다(Lin, K-Y. et al., Cancer Res. 56: 21-26., 1996).
또다른 유용한 약물표적화분자는 슈도모나스 독소A(Pseudomonas exotoxin A-ETA),의 도메인, 즉 ETA(급회전 잔여253-364)의 도메인 II(dII)메인의 전이이다. 전이도메인은 세포의 시토졸(cytosol)안네 연결되어있는 단백질 또는 폴리펩티드의 전이를 유도하는 하나의 폴리펩티드이다. 예를 들면, 유사하게 적용되는 폴리펩티드는 Diphtheria, Clostridia (botulinum, tetani), Anthrax, Yersinia, Vibriocholerae, 또는 Bordetella pertusis 톡신으로 부터 유래되었다. 톡신이 기호화된 DNA의 톡신 도메인은 그러한 구성의 준비에서 가급적이면 숙성되거나 삭제된다.
CRT는 풍부한 46 kDa 단백질인데, 이 단백질의 위치는, 렉틴 활동을 보여주고 초기 당단백질의 접이 및 조립에 관여된 것으로 알려져 있는 소포체(ER) 세포간극에 있다.(CRT는 TAP-A 및 TAP-2와 같은 항원과정과 관련된 운반자에 의하여 ER로 운반된 펩티드와 연관된다.) CRT는 시험관내에서 펩티드와 함께 복합체를 형성한다. 이 복합체는 쥐에게 적용될 때 펩티드 지향 CD8+ T세포 반응을 이끌어낸다. 쥐의 종양으로부터 정제된 CRT는 항원적으로 뚜렷한 종양이 아니라 CRT의 출처로서 사용되는 종양에 구체적인 면역성을 이끌어내었다. 시험관내에서 DC들을 CRT 바운드와 함께 펩티드로 보냄으로써, 펩티드는 DC Class I 분자 구조 내에서 재현되었으며, 펩티드 지향 CTL을 자극시켰다.
Flt-3 리간드는 DC 전구체의 성장을 자극하며 다수의 생체내 DC들의 발생을 촉진할 수 있다. Flt-3는 쥐과의 타이로신 키나아제 수용기로서, III 수용기 키나아제 집단의 하나이다. 헤마토포이틱 티슈에서 Flt-3의 발현은 CD34-양성 원종에 한정되어 있다. Flt-3 는 대응되는 리간드, 즉 Flt3-리간드의 성질을 결정하고 이어서 복제하는데 사용된다. Flt3-리간드의 뚜렷한 형태는 막단백질로서 합성되는데, 기능적으로 유사한 가용성 ECD가 단백질분해 난할에 의하여 막단백질로부터 생성된다. 이들 단백질은 독특한 타이로신 키나아제 수용기에 구속되어 그를 활성화한다. 헤마토포이틱 세포들 중에서 Flt3 수용기의 발현은 DC 전구체를 포함한 가장 원시적인 원종 세포들에 주로 한정되어 있다. Flt3-리간드의 ECD는 몇개의 쥐과 모델 종양- 파이브로사코마, 유방암, 간암, 폐암, 흑색소 세포종 및 림프종 포함-에 대항하여 강력한 반-종양 효과를 발생시켰다. 현재 발명가들 그룹은 DNA 인코딩 HPV Ek7 단백질을 DNA 인코딩 Flt3-리간드 ECD에 연결시켰다. 이것에 대한 면역은 E7 항원-지향 CD8+T 세포의 급속하게 증가된 팽창과 활성화를 가져오며, 그 결과로서 기히 형성된 E7-발현 메타스태틱 종양에 대항하여 잠재적인 반종양 면역성이 결과된다.
HSV-1 단백질 VP22는 세포내 운반의 현저한 특성 때문에 항원의 전파에 기여하는 기본형 단백질이다. 예를 들어, p53에 연결된 VP22 또는 타이미딘 키나아제는 시험관내의 서라운딩 세포에 연결된 단백질의 전파 및 모델 종양의 처리를 촉진하였다. DNA 백신 구조에서 HPV-16 E7 항원에 연결된 VP22는, 백신주사를 맞은 쥐(약 50-fold)에게 있어서 E-7 지향 CD8+T 세포 전구체의 수에 있어서 급격한 증가를 이끌어내었고, 덜 효과적인 DNA 백신을 E7-발현 종양에 대항하여 큰 힘을 가진 것으로 전환하였다. 전파되지 않는 VP22 변종은 백신의 힘을 확장하지 못하였다. 비슷한 유형의 액션을 가지고 있는 VP22와 단백질은, 몇가지 방법으로 확장된 백신 힘에 기여한다: (1) 핵산이 넣어진 세포로부터 둘러싸고 있는 APC로 항원의 전파를 촉진하며, 그에 의하여 MHC 분류 I 통로를 통하여 항원을 주는 APC의 수를 증가시킨다; (2) 핵산이 넣어진 세포에 있어서 더 효과적으로 항원을 부여한다; (3) 크로스프라이밍을 실행하며, 그에 의하여, VP22/항원 융합 단백질의 배출은 MHC-I 제한통로를 통하여 DC들(또는 다른 APC들)에 의한 프리젠테이션을 위한 들어올리기 및처리를 이끌게 된다.
당업자라면 이 발명에 따라서 사용 목적의 병원체로부터 관련 단백질의 적절한 항원요소(예를 들어 CTL 항원요소)를 찾아내는 방법을 알 것이다.
세포와 동물에 대한 B7-DC DNA의 배달
예를 들어, 유전자치료라고 일반적으로 알려진 것을 실행하기 위한 DNA 배달은, 외부의 DNA를 세포 및 궁극적으로는 살아있는 동물 속에 도입하는 것을 포함한다. 유전자치료를 위한 몇가지 일반적인 전략이 그동안 연구되어 왔고 광범위하게 검토되어 왔다.
한가지 접근방법은 생체외에서 변이된 세포를 숙주또는 특정 기관이나 조직에 조직적으로 자가이식한 후, 또는 배지(culture)에서 초기 세포로의 핵산을 이동시키는 것이다.
상기 본 발명의 목적을 달성하기위한 핵산요법은 기능적으로 활성화된 DNA를 포유동물의 생체내 체세포, 또는 조직 속으로 직접 이동시킴으로써 수행된다. DNA 이동은 아래에 기술된 몇가지 방법으로 행해질수 있다. 이러한 시스템들이 생체내에서 성공적으로 발현(expression)되었는 지는 적절한 면역평가에서 상기 물질에 대한 항체를 사용하여 B7-DC 발현제(유인계의 경우 유인물질로 처리한 후)의 존재를 검출한 다음, G418 Resistance와 같은 선택적 마커(selectablemarker)를 사용하여 상기 DNA를 발현하는 감염된 클론을 선택함으로써 검사할 수 있다. DNA 업테이킹, 플라즈미드 융합 및 융합된 플라즈미드의 안정성 등과 같은 절차의 효율성은 플라즈미드 DNA를 기존의 방법들을 단일화(linearize)하고 고분자량을 가진 포유류의 DNA를 "운반체"로 사용함으로써 개선될수 있다.
"유전자 이동"을 성공적으로 실시한 종래의 예들로는 (a) 플라즈미드 DNA를 쥐의 근육조직으로 직접 주입하여 불일정한 기간동안 마커 유전자의 발현을 가져온 예(Wolff, J.A, et al., Science 247:1465 (1900); Acsadi, G. et al., The New Biologist 3:71 (1991)), (b) 혈관조직의 생체내 및 in situ감염에 레트로바이러스의 벡터가 효과적인 사례; (c) 레트로 바이러스 프레퍼레이션을 간에 문맥 주입 및 직접 주입하여 유전자를 이동시키고 생체내 발현을 하게한 사례 (Horzaglou, M. et al., J. Boil. Chem. 265:17285 (1990); Koleko, M.et al., Human Gene Therapy 2:27 (1991); Ferry, N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8387 (1991)); (d) 유전자 재조합된 아데노바이러스를 폐 조직으로 기관내 주입한 것이 생체내 이동시켜 외부 유전자가 폐 호흡상피조직에서 외부 유전자가 장기 발현하도록 하는 데 효과적이었음을 보여주는 사례 (Rosenfeld, M.A., et al., Science 252:431 (1991)); (e) 단순 헤르페스 바이러스 벡터가 뇌조직으로 생체내 유전자 이동시킨 예(Ahmad, F. et al., eds, Miami Short Reports ?? Advances in Gene Technology: The Molecular Biology of Human Genetic Disease, Vol. 1, Boerringer Manneheim Biochemicals, USA, 1991).
레트로바이러스 요법(retroviral-mediated human theraphy)은amphotrophic하고 항복제성질을 가진 레트로바이러스 계를 사용한다(Temin, H.M., Human Gene Therapy 1:111 (1990); Temin et al., U.S.Patent No. 4,980,289; Temin et al., U.S.Patnet No. 4,650,764; Temin et al., U.S.Patent No. 5,124,263; Wills, J.W.U.S.Patent No. 5,175,099; Miller, A.D., U.S.Patent NO. 4,861,719). 이러한 벡터는 기능성 DNA를 인간의 세포나 조직으로 주입하는데 사용되어왔다. 예를 들면, 아데노신 디아미나제 유전자를 림프구로 주입하거나, NPT-II 유전자 및 종양회저요인 (tumer necrosis factor)을 종양침투 림프구로 주입하는 것이다. 레트로 바이러스를 매개로한 유전자 전달은 보통 유전자를 이동시키기위해 대상세포 증식이 필요하다 (Miller, D.G. et al., Mol. Cell. Biol. 10:4239 (1990). 이 조건은 현재의 DNA 분자가 주입될 어떤 선호 대상 세포, 즉, 활발히 성장하고있는 종양 세포에 의해 충족된다. 여러방법을 사용하는 플라즈미드에 의한 이동 및 페트로바이러스 벡터를 이용한 방광섬유증의 유전자 요법은 미국특허 U.S.Patent No. 5,240,846(Collins et al.,)에 공개되어있다.
B7-DC 시퀀스를 암호화하는 DNA분자는 종래기술(Cone, R.D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6349-6353 (1984); Mann, R.F. et al., Cell 33:153-159 (1993); Miller, A.D., et al., Molec. Cell. Biol. 5:431437(1985); Sorge, J. et al., Molec. Cell. Biol. 4:1730-1737(1984); Hock, R.A. et al., Nature 320:257 (1986); Miller, A.D. et al., Molec. Cell. Biol. 6:2895-2902 (1986).)에 잘 나와있듯이 재생불량 레트로 바이러스를 생산하는 패키지 세포열을 사용하여 레트로바이러스 벡터에 일괄삽입될수있다. 유전자 이동에 효과적이고 안전한 새로운 패티지 세포열은 미국특허 U.S.Patnet No. 5,278,056 (Bank et al.)에 공개되어있다.
본 접근법은 레트로바이러스 벡터를 선택한 조직 또는 기관에 전달하는 특정장소법에 사용가능하다. 일례로 카테터 전달시스템(Nabel, E.G. et al., Science 244:1342 (1989))이 사용될수 있다. 레트로바이러스 벡터 또는 리포좀 벡터를 사용하는 이러한 방법들은 특히 발현될 핵산을 혈관벽에 전달하거나 종양의 혈액순환계 내로 전달하는데 유용하다.
재조합형 아데노바이러스 (Horowitz, M.S., In:Virology, Fields, BN et al., eds, Raven Press, New York, 1990, p.1679; Berkner, K.L., Biotechniques 6:6169191988, Strauss, S.E., In: The Adenoviruses, Ginsberg, HS, ed.,Plenum Press, New York, 1984, chapter 11), 특정 뉴론으로의 전달 및 지속성을 위해 단순 헤르페스 바이러스 (HSV) 등 다른 바이러스 벡터들 역시 사용가능하다. 인간유전자 요법에 아데노바이러스 벡터를 사용시의 장점은 재조합이 드물며, 그러한 바이러스의 사용으로인해 사람이 악성종양에 걸리지는 않으며, 상기 아데노바이러스의 게놈이 두가닥의 DNA로 이루어져 7.5kb 까지의 크기를 가진 외부 유전자를 받아들여 복제할수 있으며, live 아데노바이러스는 안전한 인간 백신 구조라는는 점이다. 또한, 본발명에 따르면 아데노 관련 바이러스는 인간의 치료에 유용하다(smulski, R.J. et al., EMBO J. 10:3941 (1991)).
본 발명의 DNA 분자를 발현시킬수있고 본 치료법(특히 사람을 치료하는 방법)을 세팅하는데 유용한 또다른 벡터로는 벡시니아 바이러스가 있다. 벡시니아 바이러스는 복제가 불가능한 바이러스다(U.S.Patent No.5,225,336;5,204,243;5,155,020;4,769,330;Sutter, G et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89:10847-10851; Fuerst, T.R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1989); 86:2549-2553; Falkner, F.G. et al.,; Nucl. Acids Res (1987) 15:7192; Chakrabarti, S et al., Molec. Cell. Biol. (1985) 5:3403-3409). 재조합형 벡시니아 바이러스 및 이종이식 DNA를 포함하고 있는 다른 바이러스, 그리고 그들 바이러스들의 면역 DNADY요법에서의 사용에 관한 설명은 다음의 문헌들에서 검토되고 있다: Moss, B., Curr. Opin. Genet. Dev. (1993) 3:86-90; Moss, B. Biotechnology (1992) 20:345-362; Moss, B., Curr Top Microbiol Immunol (1992) 158:25-38; Moss, B., Science (1991) 252:1662-1667; Piccini, A et al., Adv. Virus Res. (1988) 34:43-64; Moss, B. et al., Gene Amplif Anal (1983) 3:201-213.
Naked DNA 및 RNA, 즉, 바이러스 벡터이외에도, 조작된 박테리아를 벡터로 사용할 수 있다. 살모넬라, BCG 및 리스테리아 모노시토진스 (LM) (Hoiseth & Stocker, Nature 291, 238-239 (1981); Poirier, TP et al. J. Exp. Med. 168, 25-32 (1988);(Sadoff, J.C., et al., Science 240, 336-338 (1988); Stover, C.K., et at., Nature 351, 456-460 (1991); Aldovini, A.et al., Nature 351, 479-482 (1991); Schafer, R., et al., J. Immunol. 149, 53-59 (1992); Ikonomidis, G.et al., J. Exp. Med. 180, 2209-2218 (1994)). 이러한 기관들은 백신 벡터로 사용하기에 좋은 두가지 promising한 특성을 보인다. (1)하나는, 구강백신 전달가능성을 제공하는 장내 감염로이고, (2)다른하나는 프로페셔널 APC에 대한 항원을 대항으로하는 모노사이트/마크로파지의 감염이다.
바이러스를 매개로한 유전자의 생체내 이동이외에, 플라즈미드 DNA관리(Wolff et al., 1990, supra) 및 입자충격을 매개로한 유전자 이동 (Yang, N.S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:9568 (1990); Williams, R.S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2726 (1991); Zelenin, A.V. et al., FEBS Lett. 280:94 (1991); Zelenin, A.V. et al., FEBS Lett. 244:65 (1989); Johnston, S.A. et al., In Vitro Cell. Dev. Biol. 27:11 (1991))과 같은 종래의 물리적인 수단이 DNA의 직접 이동에 사용될수 있다. 또한, 본발명에 따르면 유전자를 생체내 세포로 이동시키는데 잘 알려진 수단인 electroporation을 사용하여 DNA분자를 생체내 조직으로 이동시킬수도 있다 (Titomirov, A.V. et al., Biochim. Biophys. Acta 1088:131 (1991)).
"운반체를 매개로한 유전자 이동"은 또한 다음의 문헌에 설명되어있다: Wu, C.H. et al., J Biol. Chem. 264:16985 (1989); Wu, G.Y. et al., J. Biol. Chem. 263:14621 (1988); Soriano, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:7128 (1983); Wang, C-Y. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7851 (1982); Wilson, J.M. et al., J. M. et al., J. boil. Chem. 267:963 (1992). 선호되는 운반체들로는, acrylated mAbs를 이중지질층으로 융합시키는 immunoliposomes(Wang et al. supra)과 같은 targeted 리포솜 (Nicolau, C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:1068 (1983); Soriano et al., supra)이있다.
타겟 티슈(간장의 아시아루로소무코이드 (asialoorosomucoid)) 로 인식되는 미립자를 포함하는 공액에 아시아로그리코프로테인(asialoglycoprotein) 혹은 폴릴리사인(Polylysine) 같은 폴리캐이션이 사용된다.(Wu et al., 1989, supra) 그리고 DNA 결합은 DNA가 감염되도록 합성한다. 폴릴리사인 (polysine) DNA가 손상되지 않도록 미립자와 DNA의 결합의 한 예이다. 이 공액(conjugate)은 프리즈마 DNA와 본 발명에 따라 변형(transfer)을 위해 합성된다.
감염에 사용되는 혹은 마이크로인젝션(microinjection)에 사용되는 프리즈마 DNA는 통상적인 방법을 사용하여 DNA 정화를 한 다음에 널리 알려져있는 통상적인 방법, 즉 Quiagen 처리방법,에 의해 준비 된다.
다시 말해서, 상기의 설명과 같이, 본 발명에 따른 변환된 B7-DC 미립자의 실용은 상세한 (stable) 설명을 필요로 하지 않는다. 폴리??타이드의 간략한 (transient) 설명으로도 그들의 면역성(immunogenic)과 costimulatory를 수행하기 위한 변형된 셀을 설명하기에 충분하다.
본 발명의 이해를 돕기 위하여 하기의 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세히 설명하였다. 아래의 실시예는 본발명의 제한하지 않는다.
예1
물질과 방법
셀 제조(cell preparation) 와 배양(culture)
6~12 주된 여자 쥐 BALB/c를 NCI로부터 구입하고 DC와 매크로페이즈(macrophage) 준비로 사용하였다.
골수에서부터 얻어낸 DC들은 RPMI1640 (Gibco BRL) 매질(medium)과 같이 공급된 5%의 fetal calf serum (FCS)(Hyclone), penicillin/Streptomycin(JRH Biosciences), Gentamycin (Sigma), Nonessential amino acids (JRH Biosciences), L-Glutanmate (JRH Biosciences), Sodium Pyruvate(Sigma), 2 mercaptoethanol (Sigma) 및 상기에서 설명된 (26) 1000 units/ml recombinant murine GM-CSF(Immunex)에서 배양된다. DAY-8 골수에서부터 얻어낸 DC들은 통상적은 방법을 써서 모노클로날 안티바디들(monoclonal antibodies)과 착색된다. MHC 클래스 II 및 14-4-4와 대비되는 모노클로날 안티바디는 하이플리도마 상청액으로부터 정화된다. William Baldwin 박사 (John Hopkins 대학)CTLA4-Ig 휴전 미립자를 공급했다. MHC class I (28-14-8), F4/80 (C1.A3-1), B7.1(1G10), B7.2(GL1), Fc gamma RII/III(2.4G2)및 Mac-1(M1/70)의 앤타이바디들(Antibodies)은 파르민겐(PharMingen)으로부터 구입되었다. 실험제 cDNA의 제조를 위해서, DAY-8 세포들은 존 홉킨스 대학의 종양학 센터에서 14-4-4s 및 CTLA4-Ig를 사용한 셀 정렬기 (cell sorter)에 의해 정화되었다. 정렬후, MHC class Iihi와 B7hi의 순도는93-98% 이다.
골수에서부터 얻어낸 매크로페이즈들(macrophages)은 10% FCS, Penicillin/Streptomycin, non-essential amino acids, sodium pyruvate, L glutamine, 2-mercaptoethanol, 250 units/ml recombinant murine M-CSF들을 상기에서 설명한 것 (27)과 같이 500 units/ml gamma -IFN (Pharmingen) 및 5 mu g/ml LPS (sigma)에서 처리허여 함께 공급된 RPMI-1640의 매질(medium)에서 배양 된다. 자극을 준뒤, MHC class II와 B7 셀의 표면 형질 (cell surface expression)은 배양 10 day에 flow cytometric analysis를 상용하여 확립 된다..
매크로페이지 셀 라인들, WEHI-3, RAQ264.7, J774A.1, PUS-1.8들은 NIAID, National Institutes of Health의 죠슈아 팔르벨에 의해 제공되었다. 이것들은 ATCC매질과 함께 배양되었다.
Allogeneic Mixed Lymphocyte 반응
MHC class Iihi and B7hi 의 특성이 있는 DAY 8 BM에서 추출된 Dc들은 MLC안의 allogeneic T cell들을 자극할수 있는 능력이 있는지 검사된다. MLC 반응은 BALB/C 자극 셀들의 수를 3x105allogeneic C57BL/6 lmphocytes로 증가시킴으로써 96 well flat bottom microplates에서 수행된다. 배양 3일 후, T세포분열은 최후 18째의 배양의 위하여 [3H]-methyl-thymidine 의 1 mu Ci를 각 well에 더하여 할당된다(assess). 이후 세포들은 채취되고 방사선과의 결합 (incorporation of radioactivity)는 베타 카운터( beta count )를 사용하여 결정된다.
CDNA subtractive hybridization
Total RNA로 부터의 정렬된 DC들과 활성화된 매크로파이즈는 TRIZOL(Gibco BRL)과 함께 추출된다. 메신저 RNA (messenger RNA)는 Oligotex mRNA 정화 장치 (Qiagen)에 의하여 정화 된다. CDNA를 증폭시키기 위하여 우리는 PCR based SMART cDNA synthesis system (Clonetech)을 PCR based subtraction system PCR select (Clonetech)에 따라서 사용하였다. 뺄셈 (Subtraction)은 제공사의 기계어에 따라서 실행되었다. 마지막 PCR 감산 (subtractive)후에, DNA조각들은 프라즈마이드 벡터 pCR2.1 (Invitrogen) or pCR Blunt (Invitrogent)으로 결찰된다. 변형후, 각 클론(clone)은 프라즈마이드 DNA 증폭과 miniprop DNA를 위하여 키워지고, 실제의 삽입(presence of inserts)을 확증하기 위하여 EcoRI와 함께 분류(digested)되어진다. 복제된 cDNA가 수지상 결정 세포 특성 (dendritic cell specific)이라는것을 확인 하기 위하여 프리즈마이드 점 얼룩(Plasmid dot blot)이가 실행된다. 알칼라인 변성 미니프렙 DNA(Alkaline denatured miniprep DNA)들은 Hybond N+ membrane 위에 반점으로 표시되고 정렬된 DC혹은 활성화된 macrophages으로부터 유츨된 SMART cDNA probe와 교배된다(hybridixed). 위의 cDNA probe들은 랜텀 프리머 레벨링 방법 (random primer labeling method)(StratagenePrime-It II)를 사용하여32P 레벨이 붙는다. 교배(hybridization) 및 세척(washing)은 상기한 바와 같이(28)에 이루졌다. 멤브레인(membranes)은 1-2일동안 필름 (Amersham)에 노출되어 발육되었다.
플래즈미드 닷 블랏 분석(Plasmid Dot Blot Analysis)
알카라인 변성 미니프리프(Alkaline denatured miniprep) DNA 샘플은 하이본드(Hybond) N+ 멤브레인 (Amersham)상에 배치되고 소팅된 DCs로부터 탐침-유도된 SMART DNA 또는 활성화된 매크로페이지(macrophages)와 교배된다. 이들 cDNA 탐침은 랜던 프리머 레이블링 방법(Stratagene Prime-It II)을 이용하여 명명된32P였다. 교배(hybridization) 및 세척(washing)은 상기한 바[인용문헌??]와 같이 이루졌다. 자동뢴트겐사진술(autoradiography)에 있어서, 멤브레인은 1-2일동안 필름(Amersham)에 노출되어 발육되었다.
cDNA라이브러리 구조 및 스크리닝-B7-DC의 클로닝(cDNA library construction and screening-Cloning of B7-DC)
뼈 골수-유도(bone marrow-drived) DCs는 소팅없이 8일째에 수거되었다. 이들 셀의 약 20%-40%가 MHC 클래스 II 및 B7을 나타내었다. 폴리 A RNA 세정후의 전체 RNA 추출은 상기한 바와 같이 이루어졌다. 올리고 dT 프라임드(primed) DC 라이브러리 구조(oligo dT primed DC library construction)에 대해서는, 람다 ZAP 익스프레스 cDNA 합성 시스템(Lamda ZAP Express cDNA synthesis system) (Stratagene)를 사용하였다. B7-DC의 PCR DNA 프레그먼트는 탐지되었으며 스크리닝(screening)을 위해 사용되었다. 멤브레인 전이(transfer), 변성(denaturation), 재생(renaturation) 은 Stratagene 프로토콜을 이용하여 수행되었다. 탐침의 래디오레이블링(radiolabling), 교배(hybridiazation), 세척 및 자동뢴트겐사진술은 상기한 바와 같이 수행되었다. 포지티브(positive) 클론(clone)은 분리되었고 이차 스크리닝이 수행되었다. 2차 스크리닝이후에 플래즈미드가in vivo절제(excision)에 의해 절제되고 도트 블러팅(dot blotting) 및 스크리닝(screening)에 의해 테스트되었다. 시퀀싱(sequencing)은 존 홉킨스 대학 약학과에서 주요 기관(Core Facility)에 의해 이루어졌다. BLAST 프로그램은 이전에 보고된 유전자에 대한 유사성을 위하여 유전자은행(Genbank, NCBI)에 대하여 뉴클레오타이드 시퀀스(nucleotide sequence)의 상동성(homology) 연구를 수행하는데 사용되었다. 전체 길이 B7-DC cDNA 클론은 DC cDNA 라이브로리로부터 추출되었다. 5'RACE는 SMART RACE cDNA 증폭키드(Clontech)를 이용하여 수행되었다. 5'RACE 제품은 pCR2.1 벡터로 무성생식되었으며 시퀀스되었다. 2이상의 전체 길이 B7-DC 클론은 RT-PCR에 의해 획득되었고 그 시퀀스는 시퀀스 에러를 방지하기 위하여 비교되었다.
인간의 B7-DC는 다음과 같이 무성번식되었다. 인간의 DCs는 상기(29)의 GM-DCF+IL-4 또는 GM-CSF+Flt-3L에서 배양에 의해 정상 말초 혈액 단핵 세포로부터 획득된다. RNA는 상기한 바와 같이 추출된다. A BLAST 조사는 오버랩 EST 클론(overlapping EST clone), 유전자은행 접근번호 AK001879을 쥐 B7-DC와 상동성을 갖는 것으로 식별했다. 5'RACE는 상기한 바와 같이 수행된다. 5'RACE 프래그먼트를 시퀀싱했으며, 인간의 B7DC의 5'-UTR에 상응하는 프리머(primer)를 디자인했다. 5'-URT 및 3'URT에서 다음과 같은 프리머는 전체 길이의 인간 B7-DC를 증폭하기 위하여 사용되었다.
5'-GGAGCTACTGCATGTTGATTGTTTTG-3' [SEQ ID No:6]; 및
5'-TGCAAACTGAGGCACTGAAAAGTC-3' [SEQ ID No:7]
인간의 전체 길이 cDNA 시퀀스 및 쥐의 B7-DC cDNAs 는 억세스번호 AF329193 및 AF142780에 EMBL/GenBank/DDBS로 기탁되어있다.
BAC(129SVJ) 라이브러리/스크리닝/유전자 클로닝 및 매핑 (BAC(129SVJ) library screening/Genomic cloning and mapping)
BAC 라이브러리 스크리닝은 다음의 생산자 프로토콜(Genome systems, Inc.) 프리머를 사용하였다.
5'-TTGTTGTCTCCTTCTGTCTCCCAAC-3' [SEQ ID No:8]; 및
5'-ACAGTTGCTCCTTGTATCAGGTTC-3' [SEQ ID No:9]
BAC 라이브러리 스크리닝은 3포지티브 클론을 획득하였다. 염색체 위치 매핑은 situ hybridization (Genome Systems Inc.)에서 형광에 의해 수행된다. 총 80메타페이즈(metaphase) 세포가 79 진열 스펙 레이블링 (exhibiting specific labling)으로 분석되었다. 인간의 B7-Dc 매핑은 바이오정보 기구(bioinformatic tool), NCBI의 BLAST 프로그램 및 국제 RH 매핑 컨소시엄을 이용하여 수행되었다. hB7-DC 시퀀스는 htsg에서 조사되었으며 염색체 9에 국한된 두개의 DBc 클론 RP11-574F11 (AL162253) 및 Rp11-635N21 (AL354744)에 매핑시키기 위하여 발견되었다.
가상 북부 블러팅(Virtual Northern Blotting)
4-6주된 여성 Balb/c 쥐들을 NCI로부터 구매하여 조직 RNA 준비를 위해 사용되었다. RNA 추출 및 SMART cDNA 조직 합성, 소트된 DC 및 활성화된 매크로페이지는 상기한 바와 같이 수행되었다. SMART PCR cDNAs는 PCR 세정 키트(Qiagen)d 의해 세정되었다. 0.5㎍/레인(lane) 세정 DNA는 1% 애그로즈 젤(agarose gel)에서 수행되었고 Nytran 나일론 멤브레인(Nytran nylon membrane) Schleier and Schuell)로 전이되었다. 플래즈미드 DNA 의 클로닝 사이트에 바로 인접한 프리머 세트를 이용하는 PCR에 의해 DNA를 증폭하였고, 교배 탐침을 위한 각 클론의 세정된 PCR DNA를 사용하였다. 이들 프리머(primer)의 뉴클레오타이드 시퀀스(nucleotide sequence)는 다음과 같다.
5'-GTAACGGCCGCCAGTGTGCTG-3' [SEQ ID NO:10] 및
5'-CGCCAGTGTGATGGATATCTGCA-3' [SEQ ID NO:11]
인간 DCs의 총 RNA 및 제어 태반의 가상 북부 분석도 또한 수행되었다. 사용된 탐침 및 RNA 준비는 상기한 바와 같다. 탐침의 래디오레이블링(radiolabling), 교배, 세척 및 자동뢴트겐사진술은 상기한 바와 같이 수행된다.
햄스터 안티-mB7-DC 항체 생산
DC2.4, RAW246.7 및 RENCA 세포주의 B7-DC의 안정된 세포감염체 (transfectant)는 아르메니안 (Armenian) 햄스터를 면역 시키기 위해 사용되었다. 상기 B7-DC는 수정된 pCAGGS 벡터 (30) 로 클론된다. 상기 햄스터는 B7-DC 를 포함하는 플라스미드가 세번 주입된다 (Rockland). 본 연구에 사용되는 상기 안티-B7-DC 항체는 면역된 세 마리의 햄스터 중 한마리의 혈청 중의 하나이다.
DC28-Ig, CTLA4-Ig and PD-1-Ig 결합 분석시험
293T 세포들은 B7.1-pCAGGS, B7-DC-pCAGG, PD-1-pCAGGS 또는 리포펙타민 (lipofectamine) 2000 을 사용하는 벡터만을 이용하여 세포감염 시킨다. 24시간 이후, 상기 세포들은 FACS 완충액 (buffer) (1 x HBSS, 2 % 송아지 혈청, 10mMHEPES 및 0.1 % NaN3로 이루어진)에 다시 부유하고 4 c 에서 오분동안 1000rpm으로 회전시킨다. 상기 완충액은 따로 붓고 튜브에 항체를 부어서 약 4 C 에서 20분간 배양하고 (incubate) 상기 FACS 완충액으로 2번 세정하는 스텝을 2차 항체를 위해 반복한다. 시료를 FACScan에 통과시킨다. B7.1 항체는 1:5의 희석비로 이용되며, 10 l/시료 (Cal-Tag), 유전자 재조합형 CD28-Ig, CTLA-4-Ig 및 PD-1-Ig 키메라 (chimera)는 2 g/ml, 10 l/시료 (R & D system, Inc)에 이용된다. 염소F(ab')2안티-인간 IgG-PE는 1: 20 의 희석비로 이용된다 (Southern Biotechnology Associates, Inc.).
B7-DC-Ig 2분자체 (dimmer) 합성
B7-DC-Ig 구조는 막횡단(transmembrane) 도메인(domain) 이 프레임안에 없는 B7-DC의 서열 암호화 N-터미널 아미노산을 Pig-Tail Plus 벡터 (R & D system)에 있는 인간 IgG1Fc의 서열 암호화 C-터미널 아미노산에 융합시켜 이루어 진다. COS-7 세포들은 리포펙타민 2000 (LipofectAMINE 2000)(GIBCO BRL) 또는 GINE JAMMER (작전유전자: Stratagene)을 이용하는 pIg/B7-DC와 함께 일시적으로 세포 감염 시킨다. B7-DC-Ig 융합 단백질은 포화된 황산 암모니움 침천물을 이용하는 혈청이 없는 상청액을 정화하여 얻어진다. SDS-PAGE 및 은 염색 (silver staining)의 순도는 90% 이상으로 나타났다.
T-세포 증식 및 세포질 분열 분석시험
안티-CD3를 포함하는 상호자극 분석시험을 위해, 96 웰 (well) 평탄한 하부판 (이뮬론: Dynex로부터 공급되는 immulon 4)은 안티-CD3 항체들 (2C11, 팔미젠: pharmigen) 및 B7.1-Ig (R & D system)로 미리 도포되며, 100 ng/ml에서 B7-DC-Ig 또는 동위원소 제어 (Sigma)는 일회 PBS (Gibco) PH 7.4에서 두시간 동안 37 C의 조건에서 희석된다. 이후, 하부판은 일회 PBS와 함께 3회 세정되어 10 % FCS, 페니실린/스트렙토마이신, 비필수아미노산, 피루빈 나트륨 (sodium pyruvate), L 글루타민, 2-멀켑토에탄올로 공급 되어진 RPMI1640 매체로 T 세포들을 첨가하기 전에 1시간 반 동안 블록 되어진다. 비장 및 임파절은 6주 내지 10주된 BALB/c 쥐로부터 얻는다. RBC들은 ACK 완충액을 이용하여 절단하고 (lyse) T 세포들은 dynabeads M-280 (Dynex)를 이용하여 간접적인 방법으로 정화된다. 구슬들 (beads)은 세포들을 첨가하기 전에 PBS PH 7.4 + 1% FCS로 2번 세정 되며 안티-IEd및 B220/CD45RO 또는 CD8 (팔미젠: pharmigen)로 구성된 항체 칵테일을 상기 세포들에 첨가하여 4 C 에서 30분 동안 양방향으로 혼합하여 배양된다. 상기 세포들은 튜브를 오분동안 Dynal MPC에 놓아 분리하며 오분동안 1500rpm으로 원심분리하여 결합하지 않은 항체들을 제거하기 위해 PBS pH 7,4 + 1% FCS로 2회 세정한다. 상기 과정은 15분 동안의 배양 및 2 105세포/웰로 이루어진 셀들에 반복된다. 72시간동안 배양후에 10 l 의3H-타이미딘 (thymidine) (1 Ci/well)이 각 웰에 첨가되어 18시간동안 배양된다. 세포들은 Packard Micromate Cell Harvester를 이용하여 채취하며 Packard Matrix 96 direct Counter는 피터를 읽는다.
RENCA 시스템을 현재 HA 항원에 이용하는 상호자극 분석시험을 위해, RENCA 세포들은 10 % FCS, 페니실린/스트렙토마이신, 비필수아미노산, 피루빈 나트륨이 함유된 RPMI-1640 매체와 함께 배양된다. MHC 클래스 (class) II 발현을 위해 72시간동안 IFN- (75U/ml)를 이용하여 유도한다. 배양된 세포들은 13,200 rad 동안 비추고 2 104세포들/웰 (96 웰 평판 하부판)으로 만든다. HA110-120 펩타이드는 2.5 g/well에 첨가되며 다양한 농도의 Ig-융합 분자들이 첨가 되어진다. 트랜스제닉 (transgenic) I-Ed+ HA 특정 T 세포들 (kind gift of H. von Boehmer, Harvard University)는 상기의 설명대로 분리되며 4 105cells/well 만들어진다. 48시간 동안의 배양후에, 10 l of3H-thymidine (1 Ci/well)이 각 웰에 첨가되어 18시간동안 배양된다. 세포들은 Packard Micromate Cell Harvester를 이용하여 채취하며 Packard Matrix 96 direct Counter는 피터를 읽는다.
ELISA를 이용한 세포분열 생산 분석을 위해, 배양은 위에서 설명한 바와 같이 설정되며 상청액은 명시된 시간에서 채취한다. IL-2, IL-10 및 IFN- 농도들은 통상적으로 이용 가능한 ELISA 측정기 (엔도진: endogen) 및 IL-4 및 IL-6 (R & D system)을 사용하여 결정한다.
In Vivo Costimulation
B10.D2 유전학적 배경에서 I-Ed 제한 HA 에피토프 (110SFERFEIFPKE120 [SEQ ID NO:12])를 인식하는 TCR를 나타내는 TCR 성전환 쥐로부터 고인 엽액, 사타구니, 경부의 및 장간막 LNs는 RPMI 매체 (GIBCO BRL)에서 분리되고, 100um 나이론 셀 여과기 이상을 통과하며 멸균 Hank's 버퍼(GIBCO BRL)에서 세척된다. 클로노타이픽 CD4 셀의 비율을 결정하기 위한 FACS 염색후에, 0.2ml 살균 Hank's 버퍼에 2.5 X 106 클로노타이픽 셀를 포함하는 셀 준비는 수용 B10.D2 쥐의 꼬리 정맥에 정맥주사된다. 이 채택된 트랜스퍼이후 3일, 동물은 뒷발바닥에 피하주사에 의해서 멱역이 발생한다. 각 쥐들은 세개의 준비된 것 중 하나의 양방향 주사를 받았다.
(A) 10 g 합성 HA (풋페드: footpad당) (불완전 Freund's Adjuvant (IFA)로 1:1 v/v 비율로서 결합되어진 HA 펩타이드 (110-120)) (Sigma);
(B) 25 g의 B7-DC-Ig와 혼합된 HA-IFA 혼합물; 또는
(C) 25 g의 동위원소 제어 항체와 혼합된 HA-IFA 혼합물. 7일후에 배수 LN 결절 (node)가 채취된다; 1.5 105LN 세포들는 명시된 합성 HA 펩타이드 농도로 원형 하부 96 웰 티슈 배양판 에서 배양된다. 증식 분석시험은 포함된 방사선의 양의 취득 및 결정전에 48시간동안 배양을 1Ci [3H] 타이미딘 과 함께 펄스 하고 부가적으로 12시간동안 배양하여 수행한다.
예2
B7-DC의 확인 및 특징부여
B7-DC는 DC와 활성화된 매크로페이지(macrophage) 사이의 (일부) 제거된 라이브러리로부터 분리된다. cDNA 삭감을 위해 사용되는 두 파퓰레이션(population)은 테스터 파퓰레이션으로서 뼈 골수-유도된(bone marrow-derived) GM-CSF 배양된 DCs와 드라이버 파퓰레이션으로서 (감마)-인터페론 + LPS 활성화된 접착성의 뼈 골수-유도된(bone marrow-derived) M-CSF 메크로페이지이다. 데이 8(day 8) MHC 클래스 IihhiB7hi 숙성한 DCs는 테스터 cDNA의 소스로서 93% 이상 순도로 분류된다. DCs는 유동성 사이토미트리(cytometry)에 의해 매크로페이지보다 거의 50배 높은 MHC II 클래스 레벨로 특정된다. 비록 B7.2 레벨은 DCs 내에서 상당히 더 높음에도 불구하고 두 파퓰레이션은 B7.1 과 B7.2를 표현하였다. F4/80과 cd16은 매크로페이지 팝퓰레이션 상에서 더 높은 레벨에 표현되었다. 두 파퓰레이션의 기능적인 비교는, DC 파퓰레이션은 동종이계의 혼합된 림포사이트(lymphcyte) 반응의 자극에 있어서 매키로페이지 파퓰레이션보다 대략 100배 더 영향을 미친다.
양쪽 집단으로부터 RNA 추출후, PCR선택, 즉, 감법절차에 근거한 PCR에 의해서 잇따른 cDNA 합성 시스템에 근거한 PCR을 사용한다. 차별적으로 표현된 클론중에 하나는 B7-DC로 명명한 새로운 면역 글로블린 수퍼유전자 계 일부를 기호화했다. 247 아미노산(aa) 전구체 단백질을 23 aa N-터미널 신호 펩티드 및 예측된 25kd(테이블 1)의 분자량으로 기호화한 쥐과의 B7-DC cDNA는 ~1.7kb의 길이를 가진다. 추정의 리더 열과 트랜스멤브레인(막을 통해서 생기는) 영역(domain)은SOSUI 프로그램(31)을 이용하여 확인한다. 두개의 충전된(charged) aa는 접합가능한 파트너로 제안된 mB7-DC의 23 aa 트랜스메브레인 영역에서 발견된다. aa 레벨에서, 쥐과의 B7-DC는 오소로그(orthologue)를 나타내는 인간의 B7-DC의 70%와 동일하다 (아래 테이블 볼 것). 상기 hB7-DC는 세포질 꼬리가 더 길어서 쥐과의 B7-DC와 다소 차이가 있다.
동족관계 연구를 통해서, B7-DC는 B7-H1(34% 동일성, 48% 유사성) 및 더 적은 크기 부티로필린(30% 동일성, 45% 유사성)에 중요한 동족관계(테이블 1) 및 B7.1 과 B7.2에 20%이하의 동일성을 가진다. 계통 발생론적 연구는 부티로필린이 엑손 서플링을 통해서 B7계와 관계가 있을 수 있다. 그들 각각은 규범적인 IgV-IgC 구조 및 트랜스멤브레인 영역을 가진다. 다른 B7계 멤버와 반대로, 쥐과의 B7-DC는 극히 짧은 세포질 꼬리를 가진다(4 aa).
쥐과의 B7-DC 와 인간의 B7-DC의 아미노산열 비교. 상기 mB7-DC 추정의 리더와 트랜스메브레인 영역은 윗줄로 표시하였슴. 배열은 Clustalw-Gonnet Pam25 매트릭스를 이용하였슴. [*]표시는 동일 아미노산을 나타내고 [:]는 전통적 대체를 보여준다. 면역 글로블린 V 또는 C 안에 이류화 본드의 형성에 중요한 사이타인 잉여물은 이탤릭체로 표시되었다.
테이블 2
mB7-DC 와 mB7-H11의 아미노산열 비교.
테이블 3
B7 계 멤버에서 B7-DC의 아미노산열 비교
MB7-DC의 게놈 구조를 결정하기 위해서, 본 발명은 5' 및 3' UTRs로부터 프로브를 이용한 고인(pooled) 박테리아 인공 염색체(BAC, bacteria artificial chromosome)를 걸러내어 게놈 클론으로 고립시켰다. 염색체 위치 매핑은 상기 BAC클론을 이용하여 수행된다. B7-DC의 염색체 위치화는 형광 인시츄 교배를 이용하여 이뤄졌다. 10개의 특정하게 분류된 염색체 19의 측정은 이질염색질-진정염색질 경계에서 염색체 19의 말단소립까지의 거리의 47%의 위치 및 19C2 과 19C3의 사이에 인터페이스에 해당하는 면적으로 위치한다. 특정 교배 징후는 DAPI로 반대 착색으로 형광된 항디고티제닌 항체에 교배된 슬라이드를 배양함으로써 감지된다. 이 위치는 hB7-H1이 매핑되는 인간 염색체 9의 영역에 해당한다.
hB7-DC은 두개의 염색체 9 BAC 클론상에 위치함으로 발견되었다. 게다가, hB7-DC 및 hB7-H1은 대략 164kb의 삽입 크기로 단일 염색체 9 BAC 클론 상에 위치하여 발견되었다 (도 1). B7-DC 과 B7-H1의 게놈적 근접은 서로서로의 메가베이스에서 매핑된 B7.1/B7.2쌍을 상기하게 된다.
예 III
B7-DC는 모수석상의 세포에서 선택적으로 표현된다.
B7-DC의 표현 패턴을 결정하기 위해서, 다중 티슈로부터 추출된 RNA, macrophage 세포 라인, macrophage 배양 및 뼈 골수 및 비장으로부터 유도된 모수석상의 세포를 이용한 가상 노던(Northern) 분석이 수행되었다. 강한 교배가 미숙한 (4, 6일) 및 성숙한 (8 내지 sorted MHC IihiB7hi) 뼈골수 유도 DC 및 비장의 DC에 B7-DC 프로브를 이용하여 감지되는 동안, 4 macrophage 셀 라인, 활성화된 BMmachrophage 또는 복막의 machrophage 중에 어디에서도 징후는 발견되지 않았다 (도 2).
hB7-DC의 강한 표현은 IL-4 또는 Flt-3L의 GM-CSF 플러스로 주변 혈액 분자 셀로부터 길러진 인간 DCs에서 감지된다. B7-DC의 셀 표면 표현을 확인하기 위해서, 안티-mB7-DC 안티 바디는 DC를 착색하기 위해서 사용되었다. 용매 B7-DC-Ig로 blockable한 착색은 DC에서 관찰된다(도 4).
B7-DC는 CD28 또는 CTLA-4에 연결되는 것이 아니라 PD-1에 연결된다.
B7-DC가 B7계에 구조적 및 열 동족관계를 가질지라도, 추정의 CD28/CTLA-4 바인딩 열, SQDXXXELY (SEQ ID NO:13) 또는 XXXYXXRT [SEQ ID NO:14](34)(X=임의 아미노산)를 가지고 있지는 않다. 바인딩을 직접 억세스 하기 위해서, B7-DC 또는 B7.1로 감염된 293T 셀을 착색하기위한 이수성의 CD28-Ig와 CTLA-4-Ig의 능력이 연구되었다. 강한 바인딩은 B7.1 트랜스펙턴드에서 관찰되는 반면에, B7-DC 트랜스펙턴드에는 바인딩이 없다 (도5). B7-DC 및 B7-H1/PD-L1들 상이의 동족관계 및 게놈 근접성에 근거하여, B7-DC에 대한 후보 바인딩 파트너로서 PD-1을 테스트하귀해서 실험되었다. 사실상, PD-100IG는 B7-DC 트랜스펙턴트에 바인딩 되지만 B7.1 트랜스펙턴트에는 바인딩 되지 않는다. 비록 특정적일 지라도 B7-DC 트랜스펙턴트에 대한 BPD-1-Ig의 바인딩은 B7.1에 대해서 CTL-4-It 및 CD28-Ig의 바인딩보다 작다. B7-DC에대해서 PD-1의 바인딩에 대한 확인은 PD-1-Ig와 안정된 B7-DC-GFP 트랜스펙턴트의 포지티브 착색으로부터 얻어진다. B7-H1 및 B7h/B7Rb-1로서 B7-DC는 수용자로서 CD28 또는 CILA-4를 이용하지는 않는다. PD-1은 B7-DC에 대해서 수용자로 나타난다.
예 4
B7-DC는 T 세포를 위한 공동자극(Costimulatory) 분자로서 기능한다.
T 세포 자극 분석물에 첨가될 수 있는 용해가능한 B7-DC-Ig 융합물 분자는 B7-DC가 함유된 공동 자극제 활성 여부를 테스팅하는데 사용되기 위해 생산된다. T 세포의 증식 반응은 B7-DC-Ig, B7.1-Ig 또는 아이소타입(isotype) 중 어느 하나가 존재할 때 고정된(immobilized) 항-CD3의 양에 증가에 의해 자극에 달한다. 도 6(좌)은 차선의 항-CD3 농도일 때, B7-DC은 B7.1이 한 것 보다 더 큰 T 세포 증식 반응을 공동자극했다는 것을 보이고 있다. 더욱이, B7-DC 공동 자극된 증식 반응은 CD8 세포 보다 cd4에서 더 높다(도 6 우). B7-DC가 진정한 공동 자극 신호를 공급하고 있었다는 것을 나타내는 TCR-집중 자극(TCR-focused stimulus)이 없을 때 B7-DC은 T 세포를 자극할 수 없다.
B7-DC는 MHC-펩티드 복합제에 의해 " 신호 1"이 공급되었을 때 증식 반응을 또한 공동 자극했다. (RT-PCR 분석에 의한 내생적인 B7.1, B7.2 또는 B7-DC이 없음을 표현하는) RENCA 세포는 MHC 클래스-II 표현을 유도하기 위해 ??(감마)-IFN으로 처리된다. 이러한 세포들에 I-Ed제한된 HA 110-120 펩티드(FERFEIFPKE)(35)[SEQ ID NO:15]이 공급된다. I-Ed+ HA 110-120 특정 TCR 이식 유전자 생쥐 교미로부터 얻어진 정화된 비장의 T 세포들이 첨가되었고 B7-DC-Ig, B7.1-Ig 또는 아이소타입(isotype) 중 어느 하나가 존재할 때 증식 반응이 측정되었다. 도 7은 B7-DC가 B7.1이 한 것 보다 더 큰 공동 자극 활동을 가지고 있음을 보이고 있다.
B7-DC에 의해 공동 자극된 림포카인(lymphokine) 생성물의 유형
B7계 분자에 의한 공동자극에 대한 가장 특징적인 T 세포 반응은 림포카인 반응물이다. 이러한 림포카인들은 T 세포 효과의 중요한 매개자이다. 항 CD-3나 B7-DC-Ig, B7.1-Ig 또는 아이소타입(isotype)으로 공동자극된 HA 항원(도 8)으로 자극된 T 세포에 의한 다수의 다른 림포카인의 생성물을 분석하는 것에 대한 연구가 이루어졌다. 림포카인 공동자극의 유형은 항-CD3 또는 MHC-펩타이드 복합제가 "신호1'로서 사용되었는가의 여부와 상당히 관계가 있다. 현저하게, B7-DC는 B7.1 보다 ??(감마)-IFN을 보다 높게 공동자극한다. 또한, B7-DC는 상당량의 IL-6 생성물을 공동자극하는 반면에, B7.1은 사실상 아무것도 공동자극하지 못한다. 두 분자들이 IL-2를 공동자극하는 동안, B7.1은 B7-DC 보다 더 효율적으로 공동자극했다. 따라서, B7-DC와 B7.1의 공동 자극 유형은 뚜렷한 것이며, 중요한 프로인플레이메토리 림포카인(proinflammotory lymphokine)들을 자극하는데에는 B7-DC이 더 효율적이다.
예 5
B7-DC는 비브오(Vivo) 면역 반응을 향상시킨다.
비브오 생물적 활동에 있어서 B7-DC가 지배하는가 여부를 결정하기 위하여, 발명자들은 B7-DC-Ig가 펩타이드 백신에 대한 면역 반응을 증가시켰는가 여부를 요구하였다. B7-DC-Ig 또는 아이소타입(isotype) 제어 항체가 HA110-120 펩타이드와 IFA의 면역성 혼합물에 첨가되었다. 비브오 내의 HA-특정 CD4 셀을 계산할 수 있도록, 면역조치 3일전에 생쥐들에게 2.5 X 106항-HA 6.5 T 셀을 옮겼다. 면역조치 7일 후, 물이 흐르는 LN 세포가 얻어졌고 이틀 동안 HA110-120 펩타이드 양의 변화에 따라 비브오 내의 세포들은 자극되었다. 도 9는 B7-DC-Ig의 첨가가 실로 극적으로 HA에 대한 증식 반응을 증가시킴을 보이고 있다. 물이 흐르는 LN 내의 HA-특정 T 세포의 총수는 아이소타입 항체 제어에 관계하여 B7-DC-Ig를 받는 그룹 내에서 대략 2배 만큼 증가한다. 따라서, B7-DC는 심지어 셀 기본 마다에서도 항원-특정 반응을 증가시키는 능력을 가진다고 결론지을 수 있다.
예 6
토론 및 결론
본 발명자들은 DCs에 강하게 제한된 표현을 갖으며 T 셀에 대한 유일한 공동자극 특질을 갖는 새로운 B7계 구성요소들을 발견하고 특성을 나타내었다. B7-DC의 휴먼 오솔로그(humane orthologue)는 또한 DCs로 표현된다.
이 제한된 표현 유형은, 알려진 B7.1/2 경로와는 다르게 B7-DC는 다른 면역 반응에 관여한다는 것을 암시하는 이전에 표현된 B7계 구성요소들과 대조를 이룬다. 약한 B7-DC 신호는 활성화된 매크로페이지(macrophage) 내의 RT-PCR에 의해 감지되는 동안에, 예비적인 실시간 RT-PCR 분석은 DSs 내의 B7-DC mRNA 표현은 활성화된 매크로페이지 내에서 보다 15배 이상인 것을 보인다. 항체 오염과 같은 것은 활성화된 거대생물의 표면 상에서 매우 낮은 정도의 B7-DC를 감지한다. 이것이 중요한 T 세포 활성화에 충분한 것인지는 불명확하다.
B7-DC가 자극하는(costimulate) 림포카인(lymphokine) 생성물의 비정상적인 유형은 다른 B7족에 비해 독특한 생물적 역할을 수반한다. 시토킨(cytokine)은 다음과 같이 일반적으로 구분된다. Th1 시토킨은 IL-2, ??-IFN 및 림포톡신(lymphotoxin)을 포함하며, Th2 시토킨은 IL-4, IL-5, IL-6 및 IL-13을 포함한다. B7-DC는 전형적인 Th1 이나 Th2 림포카인을 포함하지 않는다. B7-DC는 극소량의 IL-4를 포함하나 IL-10은 포함하지 않는다. 그러나, IL-6는 Th2 시토킨으로 간주된다. B7.1 에 비례하는 B7-DC에 의해 상호자극받는 낮은 IL-2와 높은 ??-IFN은 전형적인 Th1 유형을 따르지 않는다. 그럼에도 불구하고, 높은 ??-IFN 생성물은 B7-DC가 중요한 T 세포 작동체 기능을 일으키도록 자극한다.
B7-DC는 IL-6를 자극하는 데 탁월하다. B7-DC에 의해 유도된 T 세포의 강한 증식반응은 B7.1과 관찰되지 않는 IL-6 생성물의 강한 자극에 의해 부분적으로 설명가능하다. IL-6는 다른 증식자극과 협력하여 T 세포 증식을 강하게 확대시킨다. IL-6는 T 세포 기능뿐만 아니라 선동적인 반응(?, proinflammatory responses), 단핵세포 분화, B 세포 분화, thrombopoiesis, 뼈흡수 및 특정 hematopoietic 종양의 성장을 통제하는 다기능 시토킨이다. chemokines 와 백혈구 보충물을 유도할 때, IL-6는 수용성 IL6 수용체 (sIL-6R)과 함께 작용할 수 있다. IL-6는 Stat-3 활성화를 통해 강한 antiapoptotic 유효물을 중재할 수 있다. 다른 보고에서는 Stat-3가 T 세포를 사용하지 않고 그대로 둔다고 하지만, T 세포에서 IL-6에 의존하는 Stat-3 활성화는 활성화된 T 세포를 살리는 데 중요한 경로로 보고되고 있다.
B7-DC가 CD28이나 CTLA-4와 결합하지 못하면, B7-H1PC-L1의 수용체인 PD-1과 결합한다. B7h/B7RP-1의 수용체인 ICOS와의 결합여부는 아직 알려지지 않았다. B7-DC와 B7-H1/PDL-1 사이의 상동관계(homology), hB7-H1/PD-L1과 hB7-DC의 긴밀한 물리적 결합 및 일반 수용체에의 결합은 두 물질이 최근 유전자 복사에 관련되어 있다는 것을 제시한다. 이는, 쥐 염색체 16호와 인간 염색체 3호위의 megabase 내에 유전자를 위치시키는 B7.1과 B7.2 사이의 관계와 유사하다.
PD-1과 다른 가상 수용체에 의해 중재되는 것 처럼, B7-DC 대 B7-H1/PD-L1의상대적인 생물적 역할을 식별하는 것이 중요할 것이다. PD-1은 T 세포의 활성화에 이어 나타나는 것으로 보인다. PD-1은 고농도의 반-CD3와 T 세포의 자극으로 apoptosis를 유도한다. PD-1에 압도된 쥐들은 비대성 심근증의 임상표시인 반면역증후군으로 발달된다. 반대로, 동씨 외 다른 사람들은 B7-H1/PD-L1은 저농도의 반-CD3에서 T 세포 증식과 시토킨 분비를 상호자극시킨다고 보고하였다. CD28/CTLA-4의 관계와의 유사성에 의해, PD-L1은 아직 알려지지 않은 활성 수용체로, 반수용체가 될 것이다. PD-1과의 결합성을 공유함에도 불구하고, B7-DC와 B7-H1은 림포카인 자극유형면에서 구별된다. B7-H1은 T 세포 IL-10 생성물을 자극하지만, B7-DC는 자극하지 않는다. B7-DC의 차별적인 세포 표현유형과 자극작용은 면역기능에서 독특한 역할을 한다.
본 발명은 특정 내용과 관련하여 기술되었지만, 수정가능하다. 본 발명의 기술 사상은 상기 바람직한 실시예에 따라 구체적으로 기술되었으나, 상기한 실시예는 그 설명을 위한 것이며 그 제한을 위한 것이 아님을 주의하여야 한다. 또한, 본 발명의 기술분야의 통상의 전문가라면 본 발명의 기술사상의 범위 내에서 다양한 실시예가 가능함을 이해할 수 있을 것이다.

Claims (68)

  1. 활성화된 대식세포에 비하여 수상세포에 선택적으로 발현되는 B7-DC 말단 포유류 단백질을 코드화하는 유리된 핵산 분자.
  2. 제1항에 있어서,
    염기 서열 1 또는 염기 서열 5로부터 선택되는 핵산 서열을 포함하는
    핵산 분자.
  3. 엄격한 하이브리드 형성 조건 하에서 제1항 또는 제2항에 따른 핵산 분자와 하이브리드하는 유리된 핵산 분자.
  4. 제2항에 있어서,
    염기 서열 1을 포함하는
    핵산 분자.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 염기 서열 2 및 염기 서열 4로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코드화 하거나, 또는 상기 단백질의 또다른 작용성 유도체, 상동체 또는 생물학적으로 활성인 단편을 코드화 하는
    핵산 분자.
  6. 제6항에 있어서,
    염기 서열 2를 포함하는 단백질을 코드화하거나, 또는 염기 서열 2의 또다른 작용성 유도체, 상동체 또는 생물학적으로 활성인 단편을 코드화 하는
    핵산 분자.
  7. 상기 B7-DC 단백질의 세포외 영역의 일부 또는 전부를 코드화 하는 제5항 또는 제6항 중 한 항에 따른 핵산 분자의 단편.
  8. 제5항에 있어서,
    B7-DC 융해 폴리펩타이드를 코드화 하는 핵산 분자에 있어서, 상기 분자가
    (a) B7-DC 단백질 염기 서열 2 또는 염기 서열 4의 일부 또는 전부인 제1 폴리펩타이드를 코드화하는 제1 핵산 서열;
    (b) 선택적으로, 상기 제1 핵산 서열과 함께 프레임 내에서 융해된, 링커 펩타이드를 코드화하는 링커 핵산 서열; 및
    (c) 프레임 내에서 상기 제1 핵산 서열 또는 상기 링커 핵산 서열에 연결되고, 제2 폴리펩타이드를 코드화하는 제2 핵산 서열
    을 포함하는 핵산 분자.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 제2 폴리펩타이드는 하나 이상의 Ig 중쇄 불변부 영역으로 이루어지는
    핵산 분자.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 제2 폴리펩타이드는 인간 IgG 불변부의 두 영역으로 이루어지는
    핵산 분자.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 핵산을 포함하며,
    (a) 프로모터 및 (b) 선택적으로, 진핵 세포 내 상기 핵산의 발현을 조절하는 부가적인 조절 서열과 작동적으로 링크되어 있는
    발현 벡터.
  12. 제11항에 있어서,
    플라스미드인
    발현 벡터
  13. 제11항에 있어서,
    바이러스성 벡터인
    발현 벡터.
  14. (a) 혼입된 뉴클레오티드 서열을 자체 핵산 내에 갖는 제1 재조합 발현 벡터 - 상기 뉴클레오티드는 유도되어야 하는 면역 반응에 대한 관련 항원을 코드화 함 - ; 및
    (b) 상호 자극성 폴리펩타이드들을 코드화하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 자체 핵산 내에 갖는 제2 재조합 발현 벡터 - 상기 상호 자극성 폴리펩타이드 중 적어도 하나는 B7-DC 이거나, 또는 그의 다른 작용성 유도체, 상동체 또는 생물학적으로 활성인 단편임 - ;
    - 여기서, 상기 발현 벡터들은 호스트 세포를 상호 감염 또는 상호 전이하여, 상기 항원 및 상기 상호 자극성 폴리펩타이드, 단편 상동체 또는 유도체의 공동 발현을 야기할 수 있음 - 을 포함하는
    을 포함하는 벡터 조성물.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 제2 벡터는 염기 서열 1 또는 염기 서열 5를 포함하는
    벡터.
  16. 제14 또는 제15항에 있어서,
    상기 제2 벡터는 염기 서열 1 을 포함하는
    벡터.
  17. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 핵산 분자를 사용하여 형질 전환 또는 형질 전이된 세포.
  18. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 발현 벡터를 사용하여 형질 전환 또는 형질 전이된 세포.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 세포는 포유류 세포인
    세포.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 세포는 인간의 세포인
    세포.
  21. 제19항에 있어서,
    상기 세포는 모수석 세포 또는 그것의 원종인
    세포.
  22. 제19항에 있어서,
    상기 세포는 종양 세포인
    세포.
  23. 단백질, 단편, 상동체 또는 다른 유도체가 종양 세포에 의해 발현될 때에, 상기 종양 세포가 T 세포와 접촉하도록, 포유류 B7-DC 단백질 또는 생물학적 활동 단편, 상동체 또는 다른 작용성 유도체를 암호화하는 외인성 핵산 분자로 트랜스펙트되는 분리된 포유류 종양 세포에 있어서,
    (i) 상기 B7-DC 단백질, 단편, 상동체 또는 유도체가 상기 T 세포에 체결되고;
    (ii) 시토킨을 생성 및 분비하거나 증식시키기 위해 상기 종양 세포가 상기 T 세포를 상호자극하는
    종양 세포.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 외인성 핵산 분자는 SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:5 또는 상기 시퀀스의 단편을 포함하는
    종양 세포.
  25. 활성화된 마크로페이지(macrophages)에 비교하여 모수석 세포상에 선택적으로 발현되고, 다음의 기능적 특징, 즉,
    (a) T 세포상에 바인딩 파트너를 체결하고;
    (b) 시토킨을 생성 및 분비하거나 증식시키기 위해 상기 T 세포를 상호자극하는 특징을 갖는 폴리펩티드.
  26. 제25항에 있어서,
    상기 폴리펩티드, 단편, 상동체 또는 다른 유도체는 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:5 시퀀스를 갖는 핵산 분자, 또는 상기 핵산 분자의 단편, 상동체 또는 등가물에 의해 암호화되는
    폴리펩티드.
  27. 제26항에 있어서,
    SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:4 아미노산 시퀀스를 갖는 폴리펩티드, 또는 상기 폴리펩티드의 단편, 상동체 또는 등가물인
    폴리펩티드.
  28. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 핵산의 재조합형 발현에 의해 생성되는 폴리펩티드 또는 상기 폴리펩티드의 생물학적 활동 단편, 상동체 또는 다른 작용성 유도체.
  29. 제25항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
    SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:4의 아미노산 잔기 26-221을 포함하는 영역, 또는 상기 영역의 상호-자극 단편, 상동체 또는 다른 작용성 유도체를 포함하는, B7-DC 단백질의 세포외 영역을 포함하는
    폴리펩티드.
  30. 제25항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
    SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:4의 아미노산 잔기 26-221을 포함하는 영역, 또는 상기 영역의 상호-자극 단편, 상동체 또는 다른 작용성 유도체를 포함하는, B7-DC의 세포외 영역으로 필수 구성되는
    폴리펩티드.
  31. (i) 제2 폴리펩티드로 직접 융합되거나, 또는
    (ii) 선택적으로, 상기 제2 폴리펩티드로 융합되는 링커 펩티드 시퀀스로 융합되는 B7-DC 단백질의 전부 또는 일부를 포함하는 제1 융합 파트너를 가진 B7-DC 융합 폴리펩티드.
  32. 제2 폴리펩티드로 융합되는 상기 제25항 내지 제30항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 포함하는 B7-DC 융합 폴리펩티드.
  33. 제32항에 있어서,
    T 세포 수체에 대한 충분한 자극에 직면하여, 상기 T 세포에 대한 바인딩 파트너 분자에 체결되고, 상기 T 세포를 상호-자극하는
    융합 폴리펩티드.
  34. 제33항에 있어서,
    상기 바인딩 파트너 분자는 PD-1인
    융합 폴리펩티드.
  35. 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제2 폴리펩티드는 Ig 중쇄 불변부의 하나 또는 그 이상의 영역인
    융합 폴리펩티드.
  36. 제31항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 융합 파트너는 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:4의 아미노산 잔기 26-221을 포함하거나, 또는 그것의 상호-자극 단편, 상동체 또는 다른 작용성 유도체를 포함하는
    융합 폴리펩티드.
  37. 제36항에 있어서,
    상기 제1 융합 파트너는 SEQ ID NO:2의 아미노산 26-221을 포함하거나, 또는 그것의 상호-자극 단편, 상동체 또는 다른 작용성 유도체를 포함하는
    융합 폴리펩티드.
  38. 제 35항에 있어서,
    상기 폴리펩티드는 인간 면역글로불린 Cγ1 사슬의 힌지와, CH2와, CH3 영역에 대응하는 아미노산 서열을 가지는
    융합 폴리펩티드.
  39. 제 31항 내지 제 38항 중 어느 한 항에 있어서,
    이량체 또는 삼량체 융합 폴리펩티드는 직렬로 연결된 이량체 또는 삼량체의 융합 폴리펩티드인
    융합 폴리펩티드.
  40. 제 31항 내지 제 38항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제 1 융합 상대인 단량체의 두 개 이상의 반복체인 선형 다량체의 구성은 끝부분과 끝부분을 직접적으로 또는 상기 단량 반복체 간에 존재하는 연결자 서열에 의해 연결되는
    융합 폴리펩티드.
  41. 항체는 B7-DC 단백질의 에피토프에 대해 특이하고, 에피토프는 공지된 B7 계열 단백질의 부재에 존재하지 않는
    항체.
  42. 제 41항에 있어서,
    상기 에피토프는 선형이거나 또는 서열 ID NO:2 또는 서열 ID NO:4의 폴리펩티드와 일치하는 에피토프인
    항체.
  43. 제 42항에 있어서,
    상기 에피토프는 선형이거나 또는 서열 ID NO:2 의 폴리펩티드와 일치하는 에피토프인
    항체.
  44. 제 41항 내지 제 42항에 있어서,
    항체는 단클론 항체인
    항체.
  45. 제 43항에 있어서, 항체는 인간 또는 인간화된 단클론 항체인
    항체.
  46. 세포 집단에서 표면 상에 B7-DC 폴리펩티드를 발현하는 세포를 동정하거나 양을 분석하는 방법은,
    (a) 제 41항 내지 제 45항 중 어느 한 항의 항체와 상기 집단의 세포를 접촉하여, 상기 항체가 상기 에피토프를 발현하는 세포에 결합하게 하고;
    (b) 상기 항체에 결합된 세포의 존재를 확인하거나 또는 개수를 분석하는 것을 포함하는
    B7-DC 폴리펩티드 발현 세포의 동정 및 양 분석방법.
  47. 세포 집단으로부터 표면 상에 B7-DC 폴리펩티드를 발현하는 세포를 분리하는 방법은,
    (a) 제 41항 내지 제 45항 중 어느 한 항의 항체와 상기 집단의 세포를 접촉하여, 상기 항체를 상기 에피토프를 발현한 세포에 결합하게 하고;
    (b) 상기 항체와 결합된 세포를 취하고, 상기 항체와 결합하지 않은 세포는취하지 않는 것을 포함하는
    B7-DC 폴리펩티드 발현 세포의 분리방법.
  48. 시료 내에서 B7-DC 폴리펩티드 또는 단편 또는 동족체의 존재를 검출하거나 또는 양을 분석하는 방법은,
    (a) 제 41항 내지 제 45항 중 어느 한 항의 항체와 시료를 접촉하여, 항체와 상기 에피토프를 보유하는 폴리펩티드 또는 단편이 결합하게 하는 단계;
    (b) 상기 항체가 결합된 폴리펩티드 또는 단편의 존재를 검출하거나 또는 양을 분석하는 단계
    를 포함하는 B7-DC 폴리펩티드 또는 단편 또는 동족체의 존재의 검출 및 양 분석방법.
  49. T 세포 리셉터에 대한 적절한 자극이 존재하는 생체 외 또는 생체 내에서 T 세포를 동시-자극하는 상기 세포의 활성을 증가하기 위해, 항원 표출 세포 또는 그 원종에서 B7-DC 폴리펩티드의 발현을 유도하거나 또는 증가하는 방법은, 제 11항 내지 제 13항 중 어느 한 항의 발현 벡터로 상기 항원 표출 세포 또는 그 원종 세포를 형질전환하거나 또는 감염시켜, 상기 B7-DC 폴리펩티드의 발현이 상기 세포에서 유도되거나 또는 증가되도록 하는 것을 포함하는
    B7-DC 폴리펩티드의 발현의 유도 또는 증가방법.
  50. T 세포 리셉터에 대한 적절한 자극이 존재하는 생체 외 또는 생체 내에서 T 세포를 동시-자극하는 상기 세포의 활성을 증가하기 위해, 항원 표출 세포 또는 그 원종에서 B7-DC 폴리펩티드의 발현을 유도하거나 또는 증가하는 방법은, 제 11항 내지 제 13항 중 어느 한 항의 발현 벡터로 상기 항원 표출 세포 또는 그 원종 세포를 형질전환하거나 또는 감염시켜, 상기 B7-DC 폴리펩티드의 발현이 상기 세포에서 유도되거나 또는 증가되도록 하는 것을 포함하는
    B7-DC 폴리펩티드의 발현의 유도 또는 증가방법.
  51. 제 49항 또는 제 50항에 있어서,
    상기 항원 표출 세포는 수지상 세포이고, 상기 원종은 수지상 세포 원종인
    B7-DC 폴리펩티드의 발현의 유도 또는 증가방법.
  52. 항원의 자극을 받은 포유류의 T 세포 반응을 증가하는 방법으로, 항원에 관련된 제 17항 내지 제 24항 중 어느 한 항에 의한 세포의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 것에 있어서, 상기 세포는 상기 항원 자극에 대한 T 세포 반응을 증가하는데 효과적인 세포인 것을 특징으로 하는
    T 세포 반응의 증가방법.
  53. 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 종양 세포는 상기 항원을 나타내고, 상기 종양 세포의 투여는 상기 종양 항원 자극에 대한 상기 환자의 T 세포 반응을 증가시키는데 효과적인
    방법.
  54. 제25항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리펩티드의 투여는 상기 항원 자극에 대한 상기 환자의 T 세포 반응을 증가시키는데 효과적인
    방법.
  55. 제31항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리펩티드의 투여는 상기 항원 자극에 대한 상기 환자의 T 세포 반응을 증가시키는데 효과적인
    방법.
  56. 제41항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체의 투여는 T 세포의 자극을 차단하거나 또는 항원-반응 T 세포를 제거하여, 이에 따라 T 세포 반응을 억제하는데 효과적인
    방법.
  57. 제56항에 있어서,
    상기 방법이 이식 거부반응 또는 자기 면역 반응을 억제하도록, 상기 T 세포 반응이 조직 이식 또는 자가항원(autoantigen)에 지시되는
    방법.
  58. 항원 자극에 대한 포유류 환자의 면역 반응을 증가시키기 위한 방법에 있어서,
    (a) (i) 상기 환자, (ii) 상기 환자에 대해 면역학적으로 용이한 제공자(donor) 또는 (iii) 면역학적으로 용이하거나 허용가능한 배양 세포 라인으로부터 T 세포를 획득하는 단계;
    (b) 상기 제17항 내지 제24항 중 어느 한 항에 따른 세포의 유효량으로 상기T 세포를 생체외 접촉시키는 단계 - 여기서, 상기 접촉단계는 항원 자극에 대한 상기 T 세포의 반응을 증가시키는데 효과적임 - ; 및
    (c) 상기 환자에 대해 상기 (b) 단계의 T 세포를 투여하여, 상기 환자의 상기 면역 반응을 증가시키는 단계
    를 포함하는 방법.
  59. 항원 자극에 대한 포유류 환자의 면역 반응을 증가시키기 위한 방법에 있어서,
    (a) (i) 상기 환자, (ii) 상기 환자에 대해 면역학적으로 용이한 제공자(donor) 또는 (iii) 면역학적으로 용이하거나 허용가능한 배양 세포 라인으로부터 T 세포를 획득하는 단계;
    (b) 상기 제17항 내지 제24항 중 어느 한 항에 따른 세포의 유효량으로 상기 T 세포를 생체외 접촉시키는 단계 - 여기서, 상기 접촉단계는 항원 자극에 대한 상기 T 세포의 반응을 증가시키는데 효과적임 - ; 및
    (c) 상기 환자에 대해 상기 (b) 단계의 T 세포를 투여하여, 상기 환자의 상기 면역 반응을 증가시키는 단계
    를 포함하는 방법.
  60. 항원 자극에 대한 포유류 환자의 면역 반응을 증가시키기 위한 방법에 있어서,
    (a) (i) 상기 환자, (ii) 상기 환자에 대해 면역학적으로 용이한 제공자(donor) 또는 (iii) 면역학적으로 용이하거나 허용가능한 배양 세포 라인으로부터 T 세포를 획득하는 단계;
    (b) 상기 제25항 내지 제30항 중 어느 한 항의 폴리펩티드, 단편, 상동체 또는 작용성 유도체의 유효량으로 상기 T 세포를 생체외 접촉시키는 단계 - 여기서, 상기 접촉단계는 항원 자극에 대한 상기 T 세포의 반응을 증가시키는데 효과적임 - ; 및
    (c) 상기 환자에 대해 상기 (b) 단계의 T 세포를 투여하여, 상기 환자의 상기 면역 반응을 증가시키는 단계
    를 포함하는 방법.
  61. 항원 자극에 대한 포유류 환자의 면역 반응을 증가시키기 위한 방법에 있어서,
    (a) (i) 상기 환자, (ii) 상기 환자에 대해 면역학적으로 용이한 제공자 또는 (iii) 면역학적으로 용이하거나 허용가능한 배양 세포 라인으로부터 T 세포를 획득하는 단계;
    (b) 상기 제31항 내지 제40항 중 어느 한 항의 융합 폴리펩티드의 유효량으로 상기 T 세포를 생체외 접촉시키는 단계 - 여기서, 상기 접촉단계는 항원 자극에 대한 상기 T 세포의 반응을 증가시키는데 효과적임 - ; 및
    (c) 상기 환자에 대해 상기 (b) 단계의 T 세포를 투여하여, 상기 환자의 상기 면역 반응을 증가시키는 단계
    를 포함하는 방법.
  62. 병원성 세포 또는 미생물과 관련된 항원에 대한 보호적 면역 반응을 촉진하는데 유용한 백신 조성물에 있어서,
    (a) 상기 항원을 선택적으로 발현하는, 상기 청구항 제17항 내지 제24항 중 어느 한 항에서의 변형되거나 또는 트랜스펙트된(transfected) 세포;
    (b) (a)의 세포가 상기 항원을 발현하지 않는 경우, 상기 항원의 부가적인 소스;
    (c) 선택적으로, 보편적인 면역자극성 약품 또는 보조제; 및
    (d) (a), (b) 및 (c)에 대해 조제학적 및 면역학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체
    를 포함하는 백신 조성물.
  63. 병원성 세포 또는 미생물과 관련된 항원에 대한 보호적 면역 반응을 촉진하는데 유용한 백신 조성물에 있어서,
    (a) 면역 반응이 요구되는 항원의 소스;
    (b) 상기 제25항 내지 제30항 중 어느 한 항의 폴리펩티드, 단편, 상동체 또는 기능적인 파생물;
    (c) 선택적으로, 보편적인 면역자극성 약품 또는 보조제; 및
    (d) (a), (b) 및 (c)에 대해 조제학적 및 면역학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체
    를 포함하는 백신 조성물.
  64. 병원성 세포 또는 미생물과 관련된 항원에 대한 보호적 면역 반응을 촉진하는데 유용한 백신 조성물에 있어서,
    (a) 면역 반응이 요구되는 항원의 소스;
    (b) 상기 제31항 내지 제40항 중 어느 한 항의 융합 폴리펩티드;
    (c) 선택적으로, 보편적인 면역자극성 약품 또는 보조제; 및
    (d) (a), (b) 및 (c)에 대해 조제학적 및 면역학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체
    를 포함하는 백신 조성물.
  65. 항원 또는 백신의 면역유전자를 증가시키기 위해 항원 또는 백신과 함께 사용되는 상호-자극 조성물에 있어서,
    (a) 상기 제25항 내지 제30항 중 어느 한 항의 폴리펩티드, 단편, 상동체 또는 기능적인 파생물; 및
    (b) 조제학적 및 면역학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체
    를 포함하는 상호-자극 조성물.
  66. 항원 또는 백신의 면역유전자를 증가시키기 위해 항원 또는 백신과 함께 사용되는 상호-자극 조성물에 있어서,
    (a) 상기 제31항 내지 제40항 중 어느 한 항의 융합 폴리펩티드; 및
    (b) 조제학적 및 면역학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체
    을 포함하는 상호-자극 조성물.
  67. 상기 제62항 내지 제64항 중 어느 한 항의 백신 조성물의 유효량을 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 포유류 환자내의 항원에 대한 면역 반응을 촉진 또는 강화시키기 위한 방법.
  68. 상기 제65항 또는 제66항의 상호-자극 조성물을 상기 항원 또는 백신과 함께 조합하여 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 포유류 환자내의 항원 또는 백신에 대한 면역 반응을 강화시키기 위한 방법.
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