JP2003531615A - 樹状細胞補助刺激分子 - Google Patents
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Abstract
Description
され、そして免疫応答を刺激するために細胞表面分子として用いられ得るか、ま
たはワクチン組成物において可溶性形態で用いられ得る新規なタンパク質に関す
る。
トカインまたはリンホカイン)の生成に関与する複雑なプロセスである。この応
答は、「レセプター」として働くいくつかのT細胞表面分子によって調節される
。このT細胞表面分子としては、T細胞レセプター(TCR)複合体、および他
の「補助的な」表面分子(その多くはモノクローナル抗体によって最初に規定さ
れた細胞表面の「ディファレンシャル抗原」(「CD分子」)である)が挙げら
れる。
れる:抗原特異的シグナルまたはクローン(clonal)シグナル、および第
二の抗原非特異的シグナル(Janeway,C.,Cold Spring
Harbor Symp.Quant.Biol.54:1〜14(1989)
)。リンパ球が、いわゆる補助刺激分子(例えば、以下に記載のB7)による補
助刺激なしに、単独の抗原に接触する場合、リンパ球は、「アネルギー」とも呼
ばれるクローン性不活性(Schwartz,R,Science 248:1
349(1990))、またはアポトーシス(プログラムされた細胞死)のいず
れかに応答する;補助刺激シグナルが提供される場合、それは刺激抗原に特異的
なクローン性増殖に応答する。所定の抗原に対する免疫応答の有意な増大は、補
助刺激なしには生じない(Juneら(Immunology Today 1
5:321〜331,1994);Chenら(Immunology Tod
ay 14:483〜486);Townsend,SEおよびAllison
,JP(1993)Science 259:368〜370)。
る抗原提示細胞(APC)の型に依存する。TCRの係合に利用可能なペプチド
抗原/MHCリガンドの密度、ならびにT細胞の係合および活性化の時点でのA
PCによる可溶性のおよび/または膜結合型の補助刺激シグナルの提供が重要で
ある。これらの理由によって、免疫治療ストラテジーは、(a)標的抗原を適切
な型のAPCに提供すること、そして(b)適切な補助刺激分子を提供してT細
胞活性化を増強することに、集中し始めてきている。
ァージ、Bリンパ球、そして最も重要である樹状細胞(DC)が挙げられる。過
去には、活性化されたマクロファージは、インビボにおいてT細胞応答を開始す
る重要なAPCであると考えられた。この知見はマクロファージが抗原を効率的
に食菌し、そして表面ディスプレイおよび提示のために抗原を処理する能力に基
づく。より最近では、抗原特異的T細胞応答のインビボにおける主なイニシエー
タとして、DCに注意が移ってきた。DCは、活性化マクロファージ由来の異な
る表現型を有し、そして異なる免疫応答を開始し得る異なるサブタイプに分類さ
れる。DCの機能的な欠点は、インビトロにおいてナイーブなT細胞を活性化す
る能力がマクロファージよりも約100倍大きいことである。今日まで、この力
価の解釈は、抗原提示に重要であると考えられる分子の量的な差異に基づいてい
た。本発明は、重要な量的差異の発見に基づく。
合性複合体(MHC)分子の状況で提示された抗原とTCRとの相互作用によっ
て開始される(Allen、Immunol.Today 8:270(198
7))。補助刺激シグナルは、他の分子に由来する。その分子のうちの最も特徴
づけされたものはB7ファミリー(すなわち、B7.1、B7.2、およびおそ
らくB7.3)であり、これはAPC上にも存在する。
最も特徴付けられたリガンドまたは対応レセプターである。CD28は、T細胞
活性化において機能する最も成熟したヒトT細胞で見出された免疫グロブリン(
Ig)スーパーファミリー(AruffoおよびSeed,Proc.Natl
.Acad.Sci.84:8573〜8577(1987))のホモダイマー
糖タンパク質である。CD28は、休止しているT細胞で構成的に発現され、そ
して活性化後に増大する。T細胞レセプターを通じたシグナル伝達後、CD28
の連結は、T細胞が増殖してIL−2を分泌するように誘導する(Linsle
y,PSら(1991)J.Exp.Med.173、721〜730;Gim
mi,CDら(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.8
8,6575〜6579;Thompson,C.B.ら(1989)Proc
.Natl.Acad.Sci.USA.86,1333〜1337;June
,C.H.ら(1990)Immunol.Today.11,211〜6;H
arding,F.A.ら(1992)Nature.356,607〜609
)。CD28は、免疫応答に必須である抗原依存性の細胞間相互作用の形態であ
る、細胞間接触(「細胞間接着」)を媒介する(Springerら、Ann.
Rev.Immunol.5:223〜252(1987))。
ているT細胞では発現されず、そしてT細胞活性化後に生じる(Brunet,
J.Fら(1987)Nature 328,267〜270)。CTLA−4
は、マウス細胞傷害性T細胞cDNAライブラリーの示差的スクリーニングによ
ってもともと同定された(Brunetら、前出)。B7の第二のレセプターと
してのCTLA−4の役割は、Linsleyら(1991)J.Exp.Me
d.174:561〜569(これはまた、B7がCD28についてよりもCT
LA4について高い親和性を有することを注記している)に考察されている。F
reemanら(1993)Science 262:907〜909は、B7
欠損マウスにおけるCTLA−4を考察した。CTLA−4のリガンドは、Le
nschowら(1993)Proc.Nat’l.Acad.Sci.90:
11054〜11058に記載されている。
るように働き、そしてバイスタンダーB細胞の活性化を回避する、Th細胞−B
細胞接触の領域において、おそらく集中的な様式で、IL−2、IL−4、およ
びIL−6のような増殖および分化誘導のサイトカインを分泌する。
作用する。B7は、B細胞活性化抗原としてもともと記載されている。なぜなら
、B7はB細胞上で見出され、そしてB7/BB−1と名づけられたからである
(Linsleyら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:
5031〜5035(1990))。本明細書中において以降は、この分子をB
7、B7−1、またはB7.1と呼ぶ。B7(より詳細には、B7ホモログと呼
ばれる)はまた、Igスーパーファミリーのメンバーである。CD28およびC
TLA−4と比較して、B7は、2つの細胞外Igドメイン(N末端可変(V)
様ドメイン、それに続く定常(C)様ドメイン)を含む。
うに、ナイーブT細胞の活性化に非常に重要なものである。これらのファミリー
のマンバーとしては、B7−1(=B7、CD80とも呼ばれる)、およびB7
−2(CD86とも呼ばれる)が挙げられる。B7−1を記載する参考文献とし
ては、Schwartz,R.H.Cell 71:1065〜1068,19
92;Chen,Lら、Cell 71:1093〜1102、1992;Fr
eeman,G.J.ら、J.Immunol 143:2714〜2722,
1989;およびFreeman,G.J.ら、J.Exp.Med.174:
625〜631,1991が挙げられる。B7−2を記載する参考文献としては
、Freeman,G.J.ら、Science 262:909〜911 8
13〜960、1993が挙げられる。現在まで、マウスB7−1およびB7−
2ならびにヒトB7−1およびB7−2の両方が記載されている(Freema
nら、1989、前出;1991、前出;および1993、前出)。活性化ヒト
Bリンパ球は、CTLA4/CD28結合カウンターレセプターであるB7−2
およびB7−3を発現する。これは両方ともCD28またはCTLA4のいずれ
かを介してT細胞に補助刺激シグナルを送達し得る。
れかでの刺激後約24時間でB細胞によって発現される。B7−2は、検出可能
IL−2分泌およびT細胞増殖を誘導する。活性化後約48時間〜72時間で、
B細胞は、B7−1およびB7−3と名づけられた第三のCTLA4対応レセプ
ター(mAb BB−1によって同定された)(Yokochi,Tら(198
2)J.Immunol.128,823〜827)の両方を発現する。B7−
3はまた、B7陰性活性化B細胞で発現され、そして検出可能なIL−2産生な
しにT細胞増殖を補助刺激し得、このことは、B7−1分子およびB7−3分子
が異なることを示す。B7−3は、活性化B細胞、活性化単球、樹状細胞、ラン
ゲルハンス細胞、およびケラチノサイトを含む広範な種々の細胞で発現される。
B細胞活性化後72時間で、B7−1およびB7−3の発現が低下し始める。活
性化Bリンパ球の表面でのこれらのCTLA4/CD28結合対応レセプターの
存在によって、T細胞補助刺激が、部分的には、B細胞活性化後のこれらの分子
の一時的発現によって調節されることが示される。
ビボで実証されている。T細胞活性化の増大とB7発現の増大との間に直接的な
関係が存在する(Razi−Wolfら,Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA,89:4210〜4214(1992))。T細胞は、それが補助
刺激リガンド(この補助刺激経路のCD28遮断に結合する)を欠く細胞上のペ
プチド抗原に接触した場合、アネルギーにされ、マウスおよびヒトの系において
抗原特異的寛容の発生を生じる(Hardingら、前出;Lenschow,
D.J.ら(1992)Science.257,789〜792;Turka
、LAら(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89,
11102〜11105;Gimmi,CDら(1993)Proc.Natl
.Acad.Sci.USA 90、6586〜6590;Boussioti
s,V.ら(1993)J.Exp.Med.178、1753〜1763)。
逆に、B7−陰性マウス腫瘍細胞によるB7の発現は、腫瘍拒絶によって付随す
るT細胞媒介特異的免疫、および腫瘍チャレンジに対する長期防御を誘導する(
Chen,Lら(1992)Cell 71:1093〜1102;Towns
endら、前出;Baskar、Sら(1993)Proc.Natl.Aca
d.Sci.90,5687〜5690)。従って、B7:CD28/CTLA
4経路の操作によって、ヒトにおいて免疫応答を刺激または抑制する大きな能力
が得られる。
Cγ1鎖の遺伝子融合を用いて特徴づけされた(Linsleyら、J.Ex
p.Med.173:721〜730(1991))。B7Ig融合タンパク質
を固定するか、またはB7を細胞(例えば、トランスフェクトされたCHO細胞
)の表面で発現する場合、それらはT細胞増殖を補助刺激する。B7+CHO細
胞でのT細胞刺激はまた、IL−2の転写物のレベルの増大を特異的に刺激する
。
るDNAの一部によってコードされるフラグメント(B7の細胞外ドメイン(E
CD)に主に対応する)と接触させることによって、免疫応答を調節するための
方法を記載する。免疫応答はまた、B7 ECDの少なくとも一部および別のタ
ンパク質(例えば、B7の可溶性、結合親和性、および/または原子価を変化さ
せるヒトIgCγ1ドメイン)を含む融合タンパク質構築物であるB7の誘導体
によって調節された。例えば、B7 ECDの位置1〜215に由来するアミノ
酸残基をコードするDNAは、ヒトIgCγ1のヒンジ領域、CH2領域および
CH3領域に対応する配列のアミノ酸残基をコードするDNAに連結され、B7
Ig融合タンパク質をコードしたDNA融合産物を形成する。また、CD28レ
セプターを結合することによって、T細胞と反応するB7またはB7Ig融合タ
ンパク質を投与することにより、T細胞によって媒介される免疫系疾患を処置す
るための方法が開示されている。対宿主性移植片病におけるT細胞増殖を、CD
28+T細胞を、B7抗原またはB7Ig融合タンパク質と、免疫抑制剤と組み
合わせて、反応させることによって阻害した。
2およびB7−3を含む)を発現するように改変された腫瘍細胞を開示する。1
つの実施形態は、B7のさらなる発現を含む。改変は、B7−2タンパク質、B
7−3タンパク質またはB7タンパク質をコードする核酸でのトランスフェクシ
ョンによるものであった。腫瘍細胞はまたインビボで遺伝的に改変され得る。こ
のような改変腫瘍細胞は、腫瘍を有する患者の処置に有用であり、腫瘍の転移性
伝播を防止もしくは阻害するために、または腫瘍の再発を阻害するために有用で
あると言われている。本明細書は、腫瘍に対するCD4+T細胞応答を特異的に
誘導するための方法を開示している。
LA4/CD28リガンドをコードする単離された核酸を開示する。1つの実施
形態において、単離された核酸は、B7−2をコードした。また、開示された全
長B7−2配列の少なくとも一部を含む核酸を開示している、本明細書に従って
、核酸配列は、哺乳動物細胞および昆虫細胞を含む種々の宿主細胞においてタン
パク質またはペプチドに対応する合成を指向し得る種々の発現ベクター中に組み
込まれ得る。これらの核酸配列によってコードされるタンパク質またはペプチド
、および単離されたタンパク質およびペプチド(B7−2配列の少なくとも一部
を含む)を生成するように形質転換された宿主細胞がまた開示されている。
D28、CTLA4、またはICOS(誘導性補助刺激因子)に結合しないB7
−H1と名付けられたB7ファミリーの第三のメンバーを記載している。B7−
H1の連結は、T細胞応答をポリクローナル刺激およびアロ抗原に対して補助刺
激し、そして優先的にインターロイキン10の生成を刺激した。少量生成された
IL−2は、B7−H1補助刺激の効果を必要とした。この研究によって、細胞
媒介性免疫応答の負の調節に関与し得る、以前には未知であった補助刺激分子が
規定された。同じ研究室(Wang Sら、Blood.2000;96:28
08〜2813)は、B7−H2と名付けられた新しいヒトB7様遺伝子を記載
している。この遺伝子の発現は単球由来の未成熟DCの表面で検出された。可溶
性のB7−H2およびIgの融合タンパク質である、B7−H2Igは、活性化
T細胞には結合したが休止T細胞には結合しない。この結合は、ICOSの可溶
性形態(ICOSIg)により阻害されたが、CTLA4Igによっては阻害さ
れなかった。ICOSIgは、B7−H2遺伝子でトランスフェクトされたCH
O細胞を染色した。刺激因子としてCD3の最適以下の架橋を用いて、B7−H
2IgによるT細胞増殖の補助刺激は、用量依存性でありそしてIL−2の分泌
と関連しており、一方至適CD3連結は好ましくはIL−10生成を刺激したこ
とが見出された。著者らは、B7−H2がICOS T細胞分子の推定リガンド
であると結論した。
2は、APC上で発現されるB7分子の近接するホモログ(相同体)である、新
規な遺伝子b7hのクローニングを報告した。B7hは、CD28またはCTL
A−4由来の異なるレセプター上で作用することにより精製したT細胞の増殖を
補助刺激した。驚くべきことに、B7hは、刺激されていないB細胞で発現され
たが、その発現は、TNFαで処理した非リンパ球性細胞(3T3細胞;胎児性
線維芽細胞)で誘導され、そしてLPS(TNFαの強力なアクチベータ)で処
理されたマウスの非リンパ球性組織で上方制御された。これらの研究は、T細胞
の新規な補助刺激リガンドを規定し、そしてTNFαによるB7hの誘導は、炎
症中の自己の認識を直接増強し得る。
32は、新しいマウス補助刺激レセプターリガンド対を記載している。このレセ
プター(CD28に関連する)は、ヒトタンパク質ICOSのマウスホモログで
あり、そして活性化T細胞および休止している記憶T細胞で発現された。B7分
子に相同であるリガンドは、B7関連タンパク質−1(B7−related
protein−1)(B7RP−1)と呼ばれる。B7RP−1は、それぞれ
マウスB7.1(CD80)およびB7.2(CD86)に対して、20%アミ
ノ酸同一性および19%アミノ酸同一性である1型膜貫通タンパク質である。こ
の相同性は、27%アミノ酸同一性しか共有しないB7.1およびB7.2とし
て有意である(Freeman,GJら、J.Exp.Med.178:218
5〜2192(1993))。この相同性は、保存位置でIgループ形成に重要
であるシステインを含む(開始メチオニンから残基62、138、185および
242)。B7RP−1の膜貫通ドメインの全体的長さおよび相対的位置は、B
7分子の長さおよび位置と類似している(Greenfield,EAら、Cr
it.Rev.Immunol.18:389〜418(1998))。B7R
P−1は、B細胞およびマクロファージで発現されることが示された。ICOS
およびB7RP−Iは、CD28−B7経路においてタンパク質と相互作用せず
、そしてB7RP−1は、CD28と独立してT細胞を補助刺激した。B7RP
−1とIgのFc部分との間の融合タンパク質(「B7−RP1−Fc」)を発
現するトランスジェニックマウスは、脾臓においてリンパ過形成、リンパ節およ
びパイアー斑を有した。インビボにおけるB7RP−1の補助刺激活性は、抗原
チャレンジの時点でB7RP−1−Fcで処理された抗原提示化マウスにおいて
、増強した遅延型過敏症を実証することによって見出された。著者らは、ICO
SおよびB7RP−1が、CD28−B7に構造的に関連し、そして適応的免疫
反応に関与する異なる新しいレセプター−リガンド対を規定すると結論した。
12:1439〜1447は、ヒトB7RP−1およびICOS相互作用を通じ
たヒトT細胞の補助刺激を報告した。このリガンド−レセプター対は、約33n
MのKDおよび10分より長いt(1/2)を有するオフレート(off−ra
te)で相互作用した。TNFαは、B細胞、単球、およびDC上のヒトB7R
P−1の発現を示差的に調節した。TNFαは、B細胞および単球上のB7RP
−1発現を増強したが、DCの発現は阻害した。ヒトB7RP−1−Fcタンパ
ク質または膜結合したB7RP−1を発現した細胞は、インビトロにおいてT細
胞増殖を補助刺激した。特定のサイトカイン(例えば、IFNγおよびIL−1
0)は、B7RP−1補助刺激によって誘導された。IL−2レベルは有意に増
大しなかったが、B7RP−1が誘導した補助刺激は、IL−2に依存した。こ
れらの研究により、マウスB7RP−1に対するヒトオルソログが規定され、そ
してヒトICOSとの相互作用が特徴付けられた。
害レセプターである。PD−1欠損マウスは、末梢寛容の損失に起因して自己免
疫の複数の形態を示した。Freeman、GJら、J.Exp.Med.19
2:1027〜1034(2000)は、PD−1(PD−L1)のリガンドが
、B7遺伝子ファミリーのメンバーであることを報告した。PD−L1によるP
D−1の係合によって、TCR媒介リンパ球活性化(増殖、サイトカイン分泌)
の阻害が生じた。さらに、PD−1シグナル伝達は、CD28媒介補助刺激の至
適以下のレベルを阻害した。PD−L1は、APC(IFNγで刺激されたヒト
単球、活性化ヒトDC)により発現される。さらに、PD−L1は、心臓および
肺において発現されることが示された。著者らは、APC上の阻害性PD−L1
シグナルおよび補助刺激B7−1/B7−2シグナルの相対的な大きさが、T細
胞活性化の程度および寛容と自己免疫との間の閾値を決定し得ることを推測した
。非リンパ性組織でのPD−L1の存在は、炎症の部位での免疫応答の大きさに
寄与し得る。
は解釈されない。これらの文献の内容についての、今日までの全ての記述または
説明は、本出願人に対して利用可能な情報に基づき、そしてこれらの文献の日付
または内容の正確さに関してなんらの承認をも構成しない。
する遺伝子を同定するために、本発明者らは、DCと活性化マクロファージとの
間のサブトラクトcDNAライブラリーをスクリーニングした。このcDNAの
サブトラクションアプローチによって、DCによって発現されたが、活性化マク
ロファージによって発現されない遺伝子が規定される。このアプローチを用いて
、T細胞の活性化に依存するワクチンの力価を増強するのに有用ないくつかの新
規なDC特異的遺伝子の発見がもたらされた。本出願はこのような遺伝子の1つ
に焦点をあてる。
存在であることに基づいて、新規なコード配列(「B7−DC」と名付けられた
)を同定した。B7−DC遺伝子は、補助刺激分子をコードする遺伝子のB7フ
ァミリーのメンバーである。B7−DCは、DC特異的発現および異なるレセプ
ター特異性を有する第一のB7ファミリーメンバーである。この遺伝子の産物は
、DCがT細胞を刺激する特有の能力を媒介するのにおいて重要な役割を有する
。機能的分析によって、T細胞によるIFNγ産生を刺激する際に、B7−1よ
りもB7−DCがさらに活性であることが示された。従って、B7−DC DN
Aおよびポリペプチドは、抗原特異的であろうとなかろうと、細胞性および分子
性のワクチン組成物の効力を増強するための組成物および方法において有用であ
る。
上で選択的に発現されるB7−DCと名付けられた哺乳動物タンパク質をコード
する単離された核酸分子を提供する。核酸分子は好ましくは、配列番号1(ヒト
起源)、または配列番号5(マウス起源)から選択されたヌクレオチド配列を含
む。本発明はまた、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で上記の
核酸分子にハイブリダイズする単離された核酸に関する。好ましいストリンジェ
ントな条件は、約45℃での6×塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム(SSC
)中でのインキュベーション、続いて約50℃の温度での約0.2×SSC中で
の洗浄を含む。好ましくは、上記の核酸分子は、配列番号1のヌクレオチド配列
を含む。上記のような好ましい核酸分子は、配列番号2および配列番号4から選
択されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするか、またはこのタンパク
質の生物学的に活性なフラグメント、ホモログ、もしくは他の機能的誘導体をコ
ードする。好ましくは、この核酸分子は、配列番号2(ヒト起源のB7−DC)
の配列を有するタンパク質をコードするか、または配列番号2の生物学的に活性
なフラグメント、ホモログ、もしくは他の機能的誘導体をコードする。
イン(残基26〜221を含む)をコードする。この核酸分子は、その補助刺激
ホモログ、フラグメントまたは他の機能的誘導体をコードする。
ドし、この核酸分子は以下: (a)B7−DCタンパク質(好ましくは、配列番号2または配列番号4)の
全てまたは一部である第一のポリペプチドをコードする第一の核酸配列; (b)必要に応じて、この第一の核酸配列とインフレームで融合した、リンカ
ーペプチドをコードするリンカー核酸;および (c)この第一の核酸配列またはこのリンカー核酸配列にインフレームで結合
し、そして第二のポリペプチドをコードする第二の核酸配列、 を含む。 この第二のポリペプチドは、好ましくは、Igの重鎖定常領域の1つ以上のドメ
イン、好ましくはヒトIgG(好ましくはIgG1)の2つのCドメイン、から
構成される。
節配列、 に作動可能に連結された上記の任意の核酸分子、 を含む発現ベクターも提供される。
らのベクターとしては、自己複製するRNAレプリコン(DNA−ランチャー、
またはRNA)、自殺RNAベクター、DNAウイルス(例えば、アデノウイル
ス、ワクシニアウイルスなど)、およびRNAビリオン(パッケージング細胞株
で増殖する)が挙げられる。
を増強する、徐放性処方物中で、宿主への遺伝子銃媒介導入のための金粒子に複
合体化されてもよいし、または他のポリマーと複合体化されてもよい。
される目的の抗原をコードするヌクレオチド配列を、その配列中に組み込んでい
る、ベクター;および (b)第二の組み換え発現ベクターであって、該ベクターは、補助刺激ポリペ
プチド(このポリペプチドの少なくとも1つは、B7−DCであるか、またはそ
の生物学的に活性なフラグメント、ホモログ、もしくは他の機能的誘導体である
)をコードする1つ以上のヌクレオチド配列をその核酸配列中に組み込んでおり
、ここで該発現ベクターは、宿主細胞に同時感染または同時トランスフェクトし
得、抗原および補助刺激ポリペプチド、複合体、ホモログもしくは誘導体の同時
発現を生じる、ベクター、 を含むベクター組成物も含まれる。
、APC)で発現された産物(抗原)の伝播を促進し、(ii)核酸が発現され
るAPCでの抗原の提示を増大し、そして/または(iii)ベクターが導入さ
れている宿主のAPCにおける抗原の再提示(交差プライミング)および提示を
促進する、標的タンパク質をコードする第三の核酸配列を提供する。この標的化
タンパク質コード核酸は、抗原または補助刺激因子またはその両方をコードする
核酸に融合され得る。第一または第二のベクターは、核酸を含む。1つの実施形
態において、このベクター組成物は、これらの抗原コード核酸、補助刺激コード
核酸(好ましくはB7−DC)、および「標的化」タンパク質コード核酸を、単
一の融合構築物中に組みあわせる。
スフェクトされた細胞を含む。この細胞は、好ましくは真核生物細胞、より好ま
しくは哺乳動物細胞、最も好ましくはヒト細胞である。この細胞は、樹状細胞ま
たはその前駆体であり得る。別の実施形態において、この細胞は、腫瘍細胞、好
ましくは抗原(宿主における腫瘍上の抗原(それに対して免疫応答が所望される
)と同じであるか、またはその抗原と交差反応性である抗原)を保有する腫瘍細
胞である。
または配列番号4)、またはその生物学的に活性なフラグメント、ホモログ、も
しくは他の機能的誘導体をコードする外因性核酸分子でトランスフェクトされた
単離された哺乳動物腫瘍細胞であり、その結果、この腫瘍細胞によって、このタ
ンパク質、フラグメント、ホモログ、または誘導体が発現される場合、そしてこ
の腫瘍細胞がT細胞と接触する場合、 (i)B7−DCタンパク質、フラグメント、ホモログ、または誘導体が、T
細胞に結合し;そして (ii)この腫瘍細胞は、T細胞を補助刺激して増殖し、そして/またはサイ
トカインを産生し、そして分泌する。
そして以下: (a)T細胞上の結合パートナーに結合する; (b)T細胞を補助刺激して増殖し、そして/またはサイトカインを産生し、
そして分泌する、 という機能的特性を有するポリペプチドに関連する。
的誘導体もまた含まれる。
は、配列番号1または配列番号5の配列を有する核酸分子、またはこの核酸分子
のフラグメント、ホモログもしくは等価物によってコードされる。好ましいポリ
ペプチドは、配列番号2または配列番号4のアミノ酸配列を有する。
ホモログもしくは他の機能的誘導体は、上記核酸の一つの組換え発現によって、
生成され得る。
ましくは、以下: (a)配列番号2(ヒト)のアミノ酸残基26〜221または (b)配列番号4(マウス)のアミノ酸残基26〜221である。 上記ポリペプチドは、B7−DCの細胞外ドメインから「本質的になり」得る。
列に融合している、 B7−DCタンパク質の全てまたは一部を含む、第一の融合パートナーを有する
B7−DC融合ポリペプチドもまた、提供される。
この第二のポリペプチドは、好ましくは、Ig重鎖定常領域の1つ以上のドメイ
ンであり、好ましくは、ヒト免疫グロブリンCγ1鎖のヒンジ領域、CH2領域
およびCH3領域に対応するアミノ酸配列を有する。
7−DCタンパク質の細胞外ドメインであり、これの全長配列は、配列番号2ま
たは配列番号4である。
してT細胞レセプターに対する十分な刺激の存在下で、T細胞を補助刺激する。
ーの融合タンパク質もまた提供される。好ましくは、これらの鎖は、ジスルフィ
ド結合または他の鎖間共有結合を介して、縦列で連結される。
のCH領域のCys残基の共有結合から生じ、これらのCys残基は、二量化し
た通常のIg H鎖において、ジスルフィド結合しているものと同じCys残基
である。
配列を伴って、末端同士で結合した第一の融合パートナーの2つ以上の繰返し体
のマルチマーを含み得る。
供し、このエピトープは、B7ファミリータンパク質の公知のメンバーには存在
しない。このエピトープは、配列番号2または配列番号4のポリペプチドの「直
鎖またはコンホメーション」エピトープであり得る。この抗体は、好ましくは、
モノクローナル抗体であり、より好ましくは、ヒトまたはヒト化(操作による)
モノクローナル抗体である。
おいて発現する細胞を同定または定量する方法もまた提供され、この方法は、以
下の工程を包含する: (a)この抗体がこのエピトープを発現する細胞に結合するように、この集団の
細胞を、上記抗体と接触させる工程; (b)この抗体が結合する細胞の数の存在を評価するかまたはその細胞の数を定
量する工程。
ための、別の方法が提供され、この方法は、以下の工程を包含する: (a)この抗体がこのエピトープを発現する細胞に結合するように、この集団を
、上記抗体に接触させる工程; (b)この抗体が結合する細胞をポジティブに選択するか、またはこの抗体が結
合しない細胞をネガティブに選択する工程。
検出するかまたは定量する方法もまた提供され、この方法は、以下の工程を包含
する: (a)この抗体が、このエピトープを保有する任意のポリペプチドまたはフラグ
メントに結合するように、このサンプルを請求項43の抗体と接触させる工程;
(b)この抗体に結合するポリペプチドまたはフラグメントの存在を検出するか
、または定量する工程。
チドの発現を誘導または増加して、この細胞が、インビトロまたはインビボで、
T細胞レセプターに対する十分な刺激の存在下で、T細胞を補助刺激する能力を
増加させる方法に関し、この方法は、B7−DCポリペプチドの発現がその細胞
において誘導または増加されるように、抗原提示細胞または前駆細胞を上記のよ
うな発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトする工程を包含する。この
抗原提示細胞は、好ましくは、樹状細胞であり、そして前駆細胞は、樹状細胞前
駆細胞である。
疫応答を刺激するための方法を提供する。抗原性刺激に対する哺乳動物被験体の
T細胞応答を増加させるための1つの方法は、この被験体に、有効量の上記細胞
(好ましくは、腫瘍細胞)を、抗原性刺激と組み合わせて投与する工程を包含し
、ここで、これらの細胞は、この抗原性刺激に対するこの被験体のT細胞応答を
増加するために効果的である。上記のことは、好ましくは、抗原と補助刺激組成
物との同時注入によって、達成される。
るための方法は、この被験体に、有効量の上記のような腫瘍細胞を投与する工程
を包含し、ここで、これらの腫瘍細胞は、この抗原を発現し、この腫瘍細胞の投
与は、腫瘍抗原刺激に対するこの被験体のT細胞応答を増加させるために効果的
である。
この被験体に、有効量のポリペプチド、上記のようなフラグメント、ホモログも
しくは機能的誘導体、または上記のような融合ポリペプチドもしくはタンパク質
を、抗原性刺激と組み合わせて投与する工程を包含し、ここで、このポリペプチ
ドの投与は、抗原性刺激に対するこの被験体のT細胞応答を増加させるために効
果的である。
めの方法を提供し、この方法は、この被験体に、有効量の上記のような「抗体」
を投与する工程を包含し、ここで、この抗体の投与は、T細胞の刺激をブロック
するかまたは抗原反応性T細胞を排除するために効果的であり、これによって、
T細胞応答を阻害する。これらの方法は、組織または器官の移植を有する被験体
を処置して、移植片の拒絶を阻害するためおよび/または移植を促進するために
、特に有用である。自己抗原の場合には、この方法は、自己免疫応答およびこれ
らの病理学的続発症をブロックまたは低下させる。
療方法を提供する。抗原性刺激に対する哺乳動物被験体の免疫応答を増加させる
ための1つの方法は、以下: (a)この被験体から、この被験体に免疫学的に適合性のドナーから、または免
疫学的に受容可能な培養細胞株から、T細胞を得る工程; (b)このT細胞を、エキソビボで、有効量の上記のような細胞と接触させる工
程であって、ここで、この接触は、抗原性刺激に対するT細胞の応答を増加させ
るために効果的である、工程;および (c)工程(b)のT細胞を、この被験体に投与する工程、 を包含し、これによって、この被験体の免疫応答を増加させる。
させるための方法は、以下の工程: (a)被験体から、この被験体に対して免疫学的に適合性のドナーから、または
免疫学的に受容可能な培養細胞株から、T細胞を得る工程; (b)このT細胞をエキソビボで有効量の以下:(i)上記のようなポリペプチ
ド、フラグメント、ホモログまたは機能的誘導体、あるいは(ii)上記のよう
な融合ポリペプチドと接触させる工程であって、ここで、この接触は、抗原性刺
激に対するT細胞の応答を増加させるために効果的である、工程;ならびに (c)工程(b)のT細胞をこの被験体に投与する工程、 を包含し、これによって、この被験体の免疫応答を増加(または発生)させる。
、以下を含有する: (a)(i)B7−DC構築物を発現する、上記のような細胞、(ii)B7−
DCポリペプチド、フラグメント、ホモログまたは機能的誘導体、(iii)B
7−DC融合ポリペプチドまたはタンパク質 (b)一般に、免疫応答が所望される抗原のさらなる供給源(これは、細胞自体
がこの抗原を発現する、細胞に基づくワクチンの場合には、必要とされないかも
しれないが(腫瘍抗原を保有する腫瘍細胞の場合のように)); (c)必要に応じて、一般的な免疫刺激因子またはアジュバント;ならびに (d)(a)、(b)および(c)のための薬学的かつ免疫学的に受容可能な賦
形剤またはキャリア。
法は、この被験体に、有効量の上記ワクチン組成物を投与する工程を包含する。
この組成物は、以下を含有する: (a)B7−DCポリペプチド(好ましくは、配列番号2または配列番号4)、
そのフラグメント、ホモログもしくは機能的誘導体、あるいはB7−DC 融合
ポリペプチド、ならびに (b)薬学的かつ免疫学的に受容可能な賦形剤またはキャリア。
めの方法は、この被験体に、この抗原またはワクチンと組み合わせて、上記補助
刺激組成物を投与する工程を包含する。
に、遺伝子改変された腫瘍細胞を投与する工程を包含し、この細胞は: (a)この被験体中の腫瘍細胞由来であり、そして (b)上記のようなB7−DC核酸のエキソビボでの導入によって遺伝子改変さ
れており、この核酸の発現は、この被験体において補助刺激シグナルを提供し、
ここで、この投与は、この腫瘍に対する全身性免疫応答の刺激を生じる。
に、好ましくは照射によって、好ましくは処理されている。
除の腫瘍減少レジメンに供され得る。
供され、この方法は、以下: (a)(i)この哺乳動物の腫瘍と共通する抗原を発現し; (ii)上記のようにB7−DCコード核酸ベクターでトランスフェクトされ、
これは、B7−DC分子として発現される場合に、この細胞に、この腫瘍の抗原
に対するT細胞応答を補助刺激させ; (iii)必要に応じて、工程(b)の前に照射される、 腫瘍または腫瘍細胞株の細胞を提供する工程; (b)有効数の細胞をこの哺乳動物に投与する工程であって、この細胞は、この
抗原およびB7−DC分子を発現する、工程; を包含し、これによって、抗腫瘍応答を誘導する。
減少; (B)新たな病巣の証拠がないこと、および (C)任意の先在病巣の進行がないこと。
弱化を誘導する方法もまた提供され、この方法は、以下: (a)(i)この哺乳動物の腫瘍と共通する抗原を発現し; (ii)上記のようにB7−DCコード核酸ベクターでトランスフェクトされ、
これは、B7−DC分子として発現される場合に、この細胞に、この腫瘍の抗原
に対するT細胞応答を補助刺激させ; (iii)必要に応じて、工程(b)の前に照射される、 腫瘍または腫瘍細胞株の細胞を提供する工程; (b)有効数の細胞をこの哺乳動物に投与する工程であって、この細胞は、この
抗原およびB7−DC分子を発現する、工程; を包含し、これによって、黒色腫の腫瘍細胞に対して特異的な全身性免疫応答を
誘導し、これによって、この抑制または弱化を誘導する。
を包含する: (a)(i)この哺乳動物の腫瘍と共通する抗原を発現し; (ii)上記のようにB7−DCコード核酸ベクターでトランスフェクトされ、
これは、発現される場合に、この細胞に、この腫瘍の抗原に対するT細胞応答を
補助刺激させ; (iii)必要に応じて、工程(b)の前に照射される、 腫瘍または腫瘍細胞株の細胞を提供する工程; (b)有効数の細胞をこの哺乳動物に投与する工程であって、この細胞は、この
抗原およびB7−DC分子を発現する、工程; を包含し、これによって、この哺乳動物において腫瘍抗原に対して特異的な全身
性免疫応答を誘導し、この免疫応答が、腫瘍の反復性の増殖を阻害する。
激シグナルを提供して、この抗原に対する全身性免疫の状態を生じる炎症応答お
よび免疫応答の局所的発生を促進する方法に関し、この方法は、被験体における
局所部位に、以下: (a)補助刺激に有効な量の、上記のようなB7−DCポリペプチド、フラグメ
ント、ホモログまたは機能的誘導体を発現する細胞、および (b)抗原 を投与する工程を包含し、その結果、この抗原に物理的に近い位置での補助刺激
が、この応答の局所的発生を促進し、そして全身性免疫の状態を生じる。
は非細胞抗原性物質の形態で投与される、腫瘍抗原である。この腫瘍細胞はまた
、工程(a)において、B7−DCポリペプチド、フラグメント、ホモログまた
は誘導体を発現する細胞であり得る。
して働く、新たなタンパク質および核酸を同定した。ヒトおよびマウス形態の、
新規補助刺激タンパク質(B7−DCと命名された)が発見され、そして本明細
書中に開示される。
配列を有する:
(リーダー配列、膜貫通ドメインおよび細胞質テイルが注釈を付けられている)
:
す配列番号3のヌクレオチド配列を有する。このコード配列(下線を引かれた、
三つ組みで示される)は、ヌクレオチド210で開始するメチオニンコドンat
g(太字)から開始し、そしてtag終止コドン(太字)(ヌクレオチド951
〜953)で終止する。
れるマウスB7−DCタンパク質は、以下に示す配列番号4のアミノ酸配列を有
する(リーダー配列、膜貫通ドメインおよび細胞質テイルが注釈をつけられてい
る):
」または「Btdc」と称された)は、Genbank登録番号AF14278
0.2を有する。
要な特徴を組み込むPCR Selectアプローチを利用した。第1に、ハイ
ブリダイゼーション工程前の最初のPCR反応は、少量のRNAのみを必要とす
る。この技術は、夾雑するマクロファージ、前駆体細胞または他の潜在的な夾雑
細胞を実質的に含まないようになった高度に精製された成熟DCの使用を可能に
する。このような高度に精製されたDCを非常に多数で得ることが困難であるこ
とは公知である。第2に、PCR Select手順は、低いコピー数の差次的
に発現される遺伝子のクローニングを可能にする。
次的に発現される遺伝子を同定するために、ならびにDC特異的機能と関連する
遺伝子を同定するために、本発明者らは、cDNAサブトラクションアプローチ
を適用した。これは、抑制PCR(PCR SelectTM)と組み合わせた
、改変型PCRベースの「代表差次的分析(representative d
ifferential analysis)」(RDA)を使用した(Dia
tchenko,L.ら,Proc.Natl.Acad.Sci USA 9
3:66025−6030(1996))。
用される)としては、以下が挙げられる:Sambrook,Jら,Molec
ular Cloning:A Laboratory Manual,第2版
,Cold Spring Harbor Press,Cold Sprin
g Harbor,NY,1989;Ausubel,FMら、Current
Protocols in Molecular Biology,Vol.
2,Wiley−Interscience,New York(最新版);K
riegler,Gene Transfer and Expression
:A Laboratory Manual(1990);Glover,DM
,編,DNA Cloning:A Practical Approach,
vol.I & II,IRL Press,1985;Albers,B.ら
,Molecular Biology of the Cell,第2版,G
arland Publishing,Inc.,New York,NY(1
989);Watson,JDら,Recombinant DNA,第2版,
Scientific American Books,New York,1
992;ならびにOld,RWら,Principles of Gene M
anipulation:An Introduction to Genet
ic Engineering,第2版,University of Cal
ifornia Press,Berkeley,CA(1981)。
ン置換)改変体および相補配列を含むことが意図される。用語「核酸」は、「ポ
リヌクレオチド」と同義であり、そして遺伝子、cDNA分子、mRNA分子、
ならびにこれらのいずれかのフラグメント(例えば、オリゴヌクレオチド)を含
み、そしてさらに、これらの等価物を含むことが意図される(より完全に以下に
説明される)。核酸のサイズは、キロベース(kb)または塩基対(bp)のい
ずれかで示される。これらは、アガロースまたはポリアクリルアミドゲル電気泳
動(PAGE)から、使用者によって決定される核酸配列から、または公開され
る核酸配列から誘導される推定値である。タンパク質サイズは、キロダルトン(
kDa)の分子量または長さ(アミノ酸残基の数)で示される。タンパク質サイ
ズは、PAGEから、配列決定から、コード核酸配列に基づく推定アミノ酸配列
から、または公開されるアミノ酸配列から概算される。
ノ酸配列をコードするcDNA分子は、本明細書中に開示されるタンパク質の配
列由来のプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応(PCR)(例えば、米国特
許第4,683,202号を参照のこと)によって合成され得る。次いでこれら
のcDNA配列は、真核生物発現ベクターまたは原核生物発現ベクターに組み立
てられ得、そして生じるベクターが使用されて、適切な宿主細胞(例えば、CO
S細胞またはCHO細胞)によってB7−DCまたはそのフラグメントもしくは
誘導体の合成を指向し得る。
核酸、そのフラグメントまたはその等価物を含む。用語、核酸は、本明細書中に
使用される場合、そのようなフラグメントまたは等価物を含むことが意図される
。本発明の核酸配列は、DNAであってもRNAであってもよい。好ましい核酸
は、配列番号1の配列を有するヒトB7−DCをコードするcDNAまたはその
等価物である。
NA分子である。このcDNAは、成熟DCまたはこのタンパク質を天然に発現
する他の細胞から抽出されたmRNAから作製され得る。B7−DCをコードす
る核酸配列は、DCゲノムDNAから入手可能である。従って、B7−DCをコ
ードするDNAは、公知のプロトコールに従ってcDNAライブラリーまたはゲ
ノムライブラリーからクローン化され得る。
RNAを単離することによって入手され得る。二本鎖cDNAが総mRNAから
調製される。cDNAが、多数の公知の技術のうちのいずれか1つを用いて、適
切なプラスミド、バクテリオファージまたはウイルスベクターに挿入され得る。
び/または機能的に等価なタンパク質をコードする配列を含むことが意図される
。例えば、B7−DCヌクレオチド配列の天然の多型(特にコドンの第3の塩基
において)は、アミノ酸配列を変更しない「サイレント」な変異として公知であ
り得る。しかし、B7−DC中のアミノ酸配列変化を含む多型が、ヒト(または
他の哺乳動物)集団中に存在し得る。1つ以上のヌクレオチド中に変化を有する
これらの対立遺伝子改変体(コード配列の総数のうちの約3〜4%まで)が、天
然の対立遺伝子バリエーションに起因してヒト集団中におそらく見出されるとい
うことを、当業者は認識する。B7−DCをコードするDNAにおける、これら
の対立遺伝子改変体ならびに生じる核酸多型およびポリペプチド多型のいずれか
および全てが、本発明の範囲内である。
存在するアイソフォームまたは関連する免疫学的に交差反応性のファミリーのメ
ンバーが存在し得る。このようなアイソフォームまたはファミリーのメンバーは
、たとえそれらが異なる遺伝子座の遺伝子によってコードされるとしても、B7
−DCに対して機能アミノ酸配列の類似性を共有するタンパク質として規定され
る。
チド配列よりも少ないヌクレオチドを有するヌクレオチド配列として規定される
。本発明は、(1)T細胞上でその天然のリガンドに結合するB7−DCの能力
を保持し、かつ(2)活性化T細胞媒介免疫応答(一次活性化シグナルを受けた
T細胞によるサイトカイン産生および/またはT細胞増殖として測定される)を
(それらがどのように提示されるかに依存して)増強または阻害するポリペプチ
ドをコードする、核酸フラグメントを含む。
いない(しかし、CD28またはCTLA−4ではないようである)レセプター
に対してT細胞表面に結合し、そして補助刺激シグナルをTリンパ球に送達する
能力を保持するB7−DCポリペプチドをコードする。別の基準によって、本発
明の核酸フラグメントは、別の動物種由来の核酸とハイブリダイズする核酸フラ
グメントであり、ゆえに、B7−DCと「交差反応性」である新規タンパク質を
検出するためのスクリーニングアッセイにおいて有用である。
成熟タンパク質をコードする配列由来のヌクレオチドを含む。しかし、いくつか
の場合、核酸のリーダー配列部分の全てまたは一部を含むことが、望ましくあり
得る。本発明の核酸配列はまた、リンカー配列、天然または改変された制限エン
ドヌクレアーゼ部位、およびコードされるタンパク質もしくはフラグメントのク
ローニング、発現または精製に関連する操作のために有用である他の配列を含み
得る。核酸配列のこれらおよび他の改変は、本明細書中に記載されるか、または
当該分野で周知である。
よそ26〜221位のアミノ酸を含む)をコードするDNAは、PCRを用いて
、ヒトIgCγ1のヒンジ領域、CH2領域、CH3領域に対応するアミノ酸配
列をコードするDNAに連結されて、B7−DC−Ig融合タンパク質として発
現される構築物を形成する。
521,288号に開示され、そして登録番号68627の下でAmerica
n Type Culture Collection(Rockville,
Md.)に寄託されている。
立て、そして発現させるための技術(例えば、オリゴヌクレオチド合成、PCR
、細胞の形質転換、ベクターの構築、発現系など)は、当該分野で十分に確立さ
れている。当業者は、特定の条件および手順のための標準的な供給原材料に精通
している。
るDNAは、別のB7ファミリータンパク質(例えば、B7.1、B7.2、ま
たはB7.3)の残りの部分のほとんどまたは全てをコードする核酸と融合され
る。ヒトB7.1(CD80)の完全DNA配列は、Genbank登録番号X
60958を有し;マウス配列についての登録番号は、X60958であり;ラ
ット配列についての登録番号は、U05593である。ヒトB7.2(CD86
)の完全cDNA配列は、Genbank登録番号L25259を有し;マウス
配列についての登録番号は、L25606である。
ペプチドをコードする核酸配列を含む発現ベクターを含む。「作動可能に連結さ
れた」は、コード配列の発現を可能にする条件下で、コード配列が調節配列に連
結されていることを意味する。既知の調節配列が選択されて、適切な宿主細胞中
での所望のタンパク質の発現を指向する。従って、用語「調節配列」は、プロモ
ーター、エンハンサーおよび他の発現制御エレメントを含む。このような調節配
列は、例えば、Goeddel,Gene Expression Techn
ology.Methods in Enzymology,vol.185,
Academic Press,San Diego,Calif.(1990
)に記載される。
ェクトされる宿主細胞および/または発現されるタンパク質の型)に依存するこ
とを、認識する。
びその機能的誘導体(本明細書中に規定される)(ポリペプチドフラグメント、
改変体、融合タンパク質などを含む))をコードする核酸分子の完全な範囲を含
む。従って、1つの実施形態において、発現ベクターは、単独または別のタンパ
ク質に融合した、B7−DCタンパク質の少なくとも一部(例えば、ECD)を
コードする核酸を含む。
ク質またはペプチドを含むコードされるタンパク質の産生のために、宿主細胞に
トランスフェクトされる。B7−DCポリペプチドを発現する遺伝学的に改変さ
れた細胞は、細胞が示された目的のために有用であるために十分な時間、外因性
DNAを一過性に発現し得ることが理解される。従って、細胞が、インビボまた
はエキソビボにおいて増大した補助刺激能力を有する免疫源として作用する場合
、発現が必要とされる時間の長さまたは細胞が生存したままである長さは、細胞
がその免疫原性機能および/または補助刺激機能と発揮するために必要とされる
時間である。例えば、本発明のB7−DCを発現する形質導入された腫瘍細胞の
場合、B7−DCの発現は、少なくとも6時間、好ましくは24時間、より好ま
しくは少なくとも2〜4日間であり得る。当然ながら、発現はまた、安定(すな
わち、その細胞の寿命の間、安定)であり得る。以下に考察される適切な発現ベ
クターおよび調節エレメント(例えば、誘導性プロモーターまたは構成性プロモ
ーター)は、所望または必要とされる発現の安定性に従って選択される。
導体を産生するための方法を提供する。例えば、B7−DCタンパク質の少なく
とも一部をコードする核酸ベクターを用いてトランスフェクトされた宿主細胞は
、B7−DCポリペプチドの発現を可能にする適切な条件下で培養される。
および第2タンパク質の少なくとも一部をコードするDNAを、単独でかまたは
組み合わせて含む1つ以上の発現ベクターを用いてトランスフェクトされ得、そ
の結果、この宿主細胞は、両方の部分を含む融合ポリペプチドを産生する。
ンパク質(例えば、ヒトIgCγ1)をコードするDNAを含む場合、生じる融
合タンパク質は、変更された可溶性、結合親和性および/または結合価を有し得
る。例えば、B7−DC Ig融合タンパク質は、好ましくは、培養物において
トランスフェクトされた宿主細胞によって分泌され、ゆえに、この培養培地から
単離される。あるいは、タンパク質が細胞質に保持される場合、細胞が収集され
、溶解され、そしてタンパク質がこの溶解物から単離される。
適切な培養培地は、当該分野で周知である。B7−DCタンパク質は、タンパク
質およびペプチドを精製するための従来技術を用いて培地または細胞溶解物から
単離され得、これには、硫酸アンモニウム沈澱、分画カラムクロマトグラフィー
(例えば、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフ
ィニティークロマトグラフィーなど)、および/または電気泳動が挙げられる(
一般的に、「Enzyme Purification and Relate
d Techniques」Methods in Enzymology,2
2:233−577(1971)を参照のこと)。一旦、部分的または均質的に
まで精製されると、本発明の組み換えB7−DCタンパク質は、本明細書中によ
り詳細に記載されるように薬学的組成物中に使用され得る。
は機能的誘導体を発現する、原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞は、本発
明の範囲内である。例えば、B7−DCは、E.coliのような細菌細胞、昆
虫細胞(バキュロウイルス)、酵母、またはチャイニーズハムスター卵巣細胞(
CHO)もしくはヒト細胞のような哺乳動物細胞中で発現され得る。他の適切な
宿主細胞は、Goeddel(1990)(前出)に見出され得るか、さもなく
ば当業者に公知である。
たは組み換えタンパク質の関連する鎖間ジスルフィド結合もしくは鎖内ジスルフ
ィド結合の形成を導く。
、pYepSec1(Baldariら(1987)EMBO J.6:229
−234)、pMFa(Kurjanら(1982)Cell 30:933−
943)、pJRY88(Schultzら(1987)Gene 54:11
3−123)、およびpYES2(Invitrogen Corporati
on,San Diego,Calif.)が挙げられる。培養される昆虫細胞
(SF9細胞)におけるタンパク質発現のために利用可能なバキュロウイルスベ
クターとしては、pAcシリーズ(Smithら(1983)Mol.Cell
Biol.3:2156−2165)およびpVLシリーズ(Lucklow
,V.A.,およびSummers,M.D.(1989)Virology
170:31−39)が挙げられる。一般的に、COS細胞(Gluzman,
Y.(1981)Cell 23:175−182)が、哺乳動物細胞における
一過性の増殖/発現のためにpCDM8のようなベクター(Aruffo A.
およびSeed,B.(前出))と組み合わせて使用され、一方、CHO(dh
fr−ネガティブCHO)細胞が、哺乳動物細胞における安定な増殖/発現のた
めにpMT2PCのようなベクター(Kaufmanら(1987)EMBO
J.6:187−195)と共に使用される。NS0骨髄腫細胞株(グルタミン
シンセターゼ発現系)が、Celltech Ltd.から利用可能である。
ター基および標的タンパク質の連結部に導入されて、融合タンパク質の精製に続
く、標的タンパク質のレポーター基からの分離を可能にする。このような切断お
よびその認識配列に対するタンパク質分解性酵素としては、第Xa因子、トロン
ビンおよびエンテロキナーゼが挙げられる。
elbourne,Australia)、pMAL(New England
Biolabs,Beverly,Mass.)およびpRIT5(Phar
macia,Piscataway,N.J.)が挙げられ、これらはそれぞれ
、グルタチオンS−トランスフェラーゼ、マルトースE結合タンパク質、プロテ
インAを標的組み換えタンパク質に融合する。
)Gene 69:301−315)およびpET 11d(Studierら
,Gene Expression Technology:Methods
in Enzymology 185,Academic Press,San
Diego,Calif.(1990)60−89)が挙げられる。標的遺伝
子発現は、pTrcにおいてハイブリッドtrp−lac融合プロモーターから
の宿主RNAポリメラーゼ転写に依存するが、pET11dに挿入された標的遺
伝子の発現は、同時発現されるウイルスRNAポリメラーゼ(T7gn1)によ
って媒介されるT7 gn10−lacO融合プロモーターからの転写に依存す
る。これは、ウイルスポリメラーゼであり、lacUV5プロモーターの転写制
御下で、T7gn1を保有するレジデントλプロファージから宿主株BL21(
DE3)またはHMS174(DE3)によって供給される。
トされた細胞である。すでにB7−DCを発現する細胞(例えば、成熟DC)の
場合、トランスフェクトされた細胞は、細胞表面上に増加した量のB7−DCタ
ンパク質またはそのフラグメントを発現させる。
経芽細胞腫)は、腫瘍細胞表面上でのB7−DCの発現を指向する発現ベクター
でトランスフェクトされる。このようなトランスフェクトされた腫瘍細胞は、本
明細書中に記載されるように治療的抗腫瘍免疫を誘導するための免疫原として使
用され得る。
野で十分に理解された標準的な連結技術および制限技術を使用する。単離された
プラスミド、DNA配列、または合成オリゴヌクレオチドは、所望される形態に
、切断され、調整され、そして連結され得る。
ベクターおよびコントロール系は、一般的に構築において大量の配列のために使
用される利用可能な「宿主」ベクター上に見出される。適切なコード配列につい
て、最初の構築物は、適切な配列をcDNAライブラリーまたはゲノムDNAラ
イブラリーから回収することが問題であるかもしれず、通常はこれが問題である
。しかし、一旦配列が開示されると、個々のヌクレオチド誘導体から開始して、
全遺伝子配列をインビトロで合成することが可能である。かなり大きいサイズ(
例えば、500〜1000bp)の長さの遺伝子についての全遺伝子配列は、個
々の重複する相補オリゴヌクレオチドを合成し、そして一本鎖の非重複部分をデ
オキシリボヌクレオチド三リン酸の存在下でDNAポリメラーゼを用いて充填す
ることによって、調製され得る。このアプローチは、既知配列のいくつかの遺伝
子の構築の場合に好首尾に使用されている。例えば、Edge,M.D.,Na
ture(1981)292:756;Nambair,K.P.ら,Scie
nce(1984)223:1299;およびJay,E.,J Biol C
hem(1984)259:6311を参照のこと。
うなホスホトリエステル方法によってか、またはBeaucage,S.L.,
およびCaruthers,M.H.,Tet Lett(1981)22:1
859;ならびにMatteucci,M.D.,およびCaruthers,
M.H.,J Am Chem Soc(1981)103:3185によって
記載されるようなホスホロアミダイト方法のいずれかによって調製され、そして
市販の自動化オリゴヌクレオチド合成機を用いて調製され得る。アニーリング前
または標識のための一本鎖のキナーゼ処理は、50mM Tris(pH7.6
)、10mM MgCl2、5mM ジチオスレイトール、1〜2mM ATP
、1.7pmole γ−32P−ATP(2.9mCi/mmole)、0.
1mM スペルミジン、0.1mM EDTAの存在下、過剰のポリヌクレオチ
ドキナーゼ(例えば、1nmoleの基質に対して約10ユニットのポリヌクレ
オチドキナーゼ)を使用することによって達成される。
準的な制限手順および連結手順を用いて、切り出され、そして連結され得る。部
位特異的DNA切断は、当該分野で一般的に理解される条件下で適切な制限酵素
(単数または複数)を用いて処理することによって実行され、そしてこの詳細は
、市販の制限酵素の製造業者らによって特定される。例えば、New Engl
and Biolabsの製品カタログを参照のこと。一般的に、約1mgのプ
ラスミドまたはDNA配列が、約20mlの緩衝溶液中で1ユニットの酵素によ
って切断される;本明細書中の実施例において、代表的に、過剰の制限酵素が、
DNA基質の完全な消化を確実にするために使用される。37℃で約1時間〜2
時間のインキュベーション時間が、実行可能であるが、バリエーションが許容さ
れ得る。各インキュベーション後、タンパク質が、フェノール/クロロホルムを
用いた抽出によって除去され、そしてエーテル抽出が続き得、そして核酸が、エ
タノールを用いる沈澱によって水性画分から回収される。所望される場合、切断
されたフラグメントのサイズ分画は、標準的な技術を用いてポリアクリルアミド
ゲルまたはアガロースゲル電気泳動によって実行され得る。サイズ分画の一般的
な説明は、Methods in Enzymology(1980)65:4
99−560に見出される。
TP)の存在下、20℃〜25℃で約15〜25分間のインキュベーション時間
を用いて、50mM Tris(pH7.6)、50mM NaCl、6mM
MgCl2、6mM DTTおよび0.1〜1.0mM dNTP中でE.co
li DNAポリメラーゼI(Klenow)の大きなフラグメントを用いて処
理することによって、平滑末端化処理し得る。Klenowフラグメントは、5
’一本鎖オーバーハングを充填するが、たとえ4つのdNTPが存在していても
突出している(protruding)3’一本鎖を破壊する。所望される場合
、選択的な修復が、オーバーハングの性質によって規定される制限内で、1種類
のdNTPだけ、または選択されたdNTPを供給することによって、実行され
得る。Klenowを用いた処理後、混合物を、フェノール/クロロホルムを用
いて抽出し、そしてエタノール沈澱する。S1ヌクレアーゼまたはBAL−31
を用いての適切な条件下での処理は、いずれかの一本鎖部分の加水分解をもたら
す。
0mlの容量で実行される:20mM Tris−HCl(pH7.5)、10
mM MgCl2、10mM DTT、33μg/ml BSA、10〜50m
M NaCl、40μM ATP、0.01〜0.02(Weiss)ユニット
のT4 DNAリガーゼ、0℃(「粘着性末端」連結について)または1mM
ATP、0.3〜0.6(Weiss)ユニットのT4 DNAリガーゼ、14
℃(「平滑末端」連結について)のいずれか。分子間「粘着末端」連結は、通常
、33〜100μg/mlの総DNA濃度(5〜100nMの末端濃度)で実行
される。分子間平滑末端連結は、1mMの総末端濃度で実行される。
般的に、5’ホスフェートを除去し、そして自己連結を回避するために、細菌ア
ルカリホスファターゼ(BAP)またはウシ腸アルカリホスファターゼ(CIA
P)を用いて処理される。消化は、おおよそ10mM Tris−HCl、1m
M EDTA中、pH8、60°で、約1時間かけて約1ユニット/mgベクタ
ーでBAPまたはCIAPを用いて実行される。調製物は、フェノール/クロロ
ホルムを用いて抽出され、そしてエタノール沈澱される。あるいは、さらなる制
限酵素および所望されないフラグメントの分離によって二重に消化されたベクタ
ーにおいて、再連結が回避され得る。
本発明の改変体を作製する。これらの変異としては、単純な欠失または挿入、体
系的な欠失、挿入または塩基クラスターの置換あるいは1塩基の置換が挙げられ
る。
プロトコールおよび試薬が市販されている周知技術である部位指向型変異誘発に
よって作製される(Zoller,MJら,Nucleic Acids Re
s(1982)10:6487−6500およびAdelman,JPら,DN
A(1983)2:183−193))。プラスミド構築のための正確な連結が
、例えば、最初にE.coli株MC1061(Casadaban,M.ら,
J Mol Biol(1980)138:179−207)、または他の適切
な宿主を、連結混合物を用いて形質転換することによって確立される。従来方法
を用いて、形質転換体は、プラスミド構築の様式に依存して、アンピシリン耐性
遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、または他の抗生物質耐性遺伝子(または
他の選択マーカー)の存在に基づいて選択される。次いで、プラスミドは、任意
のクロラムフェニコール増幅(必要に応じてクロラムフェニコール増幅が続く)
を用いて形質転換体から調製される(Clewell,DBら,Proc Na
tl Acad Sci USA(1969)62:1159;Clewell
,D.B.,J Bacteriol(1972)110:667)。いくつか
のミニDNAプレップが、一般的に使用される。例えば、Holmes,DSら
,Anal Biochem(1981)114:193−197;Birnb
oim,HCら,Nucleic Acids Res(1979)7:151
3−1523を参照のこと。単離されたDNAは、制限によって分析され、そし
て/またはMessingら,Nucleic Acids Res(1981
)9:309によってさらに記載されるようなSanger(Proc Nat
l Acad Sci USA(1977)74:5463)のジデオキシヌク
レオチド方法、またはMaxamら、Methods in Enzymolo
gy(1980)65:499の方法によって配列決定される。
ウム共沈澱、DEAE−デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクシ
ョン、またはエレクトロポレーションを介して、哺乳動物細胞に導入され得る。
宿主細胞を形質転換するための適切な方法は、Sambrookら(前出)およ
び他の標準的な文書に見出され得る。
ター基および標的タンパク質の連結部に導入されて、融合タンパク質の精製に続
く、標的タンパク質のレポーター基からの分離を可能にする。このような切断お
よびその認識配列に対するタンパク質分解性酵素としては、第Xa因子、トロン
ビンおよびエンテロキナーゼが挙げられる。
elbourne,Australia)、pMAL(New England
Biolabs,Beverly,Mass.)およびpRIT5(Phar
macia,Piscataway,N.J.)が挙げられ、これらはそれぞれ
、グルタチオンS−トランスフェラーゼ、マルトースE結合タンパク質、プロテ
インAを標的組み換えタンパク質に融合する。
)Gene 69:301−315)およびpET 11d(Studierら
,Gene Expression Technology:Methods
in Enzymology 185,Academic Press,San
Diego,Calif.(1990)60−89)が挙げられる。標的遺伝
子発現は、pTrcにおいてハイブリッドtrp−lac融合プロモーターから
の宿主RNAポリメラーゼ転写に依存するが、pET11dに挿入された標的遺
伝子の発現は、同時発現されるウイルスRNAポリメラーゼ(T7gn1)によ
って媒介されるT7 gn10−lacO融合プロモーターからの転写に依存す
る。これは、ウイルスポリメラーゼであり、lacUV5プロモーターの転写制
御下で、T7gn1を保有するレジデントλプロファージから宿主株BL21(
DE3)またはHMS174(DE3)によって供給される。
合し、そして「作動可能に連結された」核酸配列の転写を促進する。本明細書中
に使用される場合、「プロモーター配列」は、RNAポリメラーゼによって転写
されるDNAまたはRNAの鎖の上に見出されるプロモーターのヌクレオチド配
列である。核酸分子の2つの配列(例えば、プロモーター配列およびコード配列
)は、両方の配列が同じRNA転写物上に転写されることを可能にするか、また
は1つの配列において開始するRNA転写物が第2配列に伸長されることを可能
にする様式で、これらが互いに連結している場合、「作動可能に連結されている
」。従って、2つの配列(例えば、DNAまたはRNAのプロモーター配列およ
びコード配列)は、プロモーター配列から始まる転写物が作動可能に連結された
コード配列のRNA転写物を産生する場合、作動可能に連結されている。「作動
可能に連結された」状態であるためには、2つの配列が、直線配列中で互いに直
ぐに隣接する必要はない。
ればならず、そして真核生物プロモーターまたはウイルス性プロモーターのいず
れかであり得る。適切なプロモーターは、誘導可能、抑制可能または構成的であ
り得る。構成的プロモーターの例は、ウイルス性プロモーターMSV−LTRで
あり、これは、種々の細胞において有効であり、かつ活性であり、そしてほとん
どの他のプロモーターとは対照的に、停止細胞および増殖中の細胞において同じ
高い活性を有する。他の好ましいウイルス性プロモーターとしては、CMV−L
TR(サイトメガロウイルス由来)(Bashart,M.ら、Cell 41
:521(1985))またはRSV−LTR(ラウス肉腫ウイルス由来)(G
orman,C.M.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79
:6777(1982))に存在するウイルス性プロモーターが挙げられる。マ
ウスメタロチオネインI遺伝子のプロモーター(Hamer,D.ら、J.Mo
l.Appl.Gen.1:273−288(1982));ヘルペスウイルス
のTKプロモーター(McKnight,S.,Cell 31:355−36
5(1982));SV40初期プロモーター(Benoist,C.ら、Na
ture 290:304−310(1981));および酵母gal4遺伝子
プロモーター(Johnston,S.A.ら、Proc.Natl.Acad
.Sci.(USA)79:6971−6975(1982);Silver,
P.A.ら、Proc.Natl.Acad.Sci(USA)81:5951
−5955(1984))もまた、有用である。プロモーター領域に関連する転
写因子および分離活性化および転写因子のDNA結合の他の例示的記載としては
、以下が挙げられる:Keeganら、Nature(1986)231:69
9;Fieldsら、Nature(1989)340:245;Jones,
Cell(1990)61:9;Lewin,Cell(1990)61:11
61;Ptashneら、Nature(1990)346:329;Adam
sら、Cell(1993)72:306。これらの上記の参考文献全ての関連
する開示は、参考として本明細書に援用される。
相互作用によって組織特異的エンハンサーとして機能もし得る八量体領域を含み
得る。本発明のDNA構築物のエンハンサードメインは、トランスフェクトされ
るべき標的細胞に特異的かまたは、このような標的細胞の細胞性因子によって高
く活性化されるものである。ベクター(プラスミドまたはレトロウイルス)の例
は、(Roy−Burmanら、米国特許第5,112,767号)に開示され
る。エンハンサーおよび転写におけるその作用の一般的な議論については、Le
win,B.M.,Genes IV,Oxford University
Press,Oxford、(1990)、pp.552−576を参照のこと
。特に有用なものは、レトロウイルスエンハンサー(例えば、ウイルス性LTR
である)。エンハンサーは、好ましくは、プロモーターから上流に配置され、相
互作用して遺伝子発現を刺激する。レトロウイルスベクターの使用のために、内
因性ウイルスLTRは、エンハンサーがなくされ、そして組織特異性または他の
所望の特性(例えば、本発明のB7−DCコードDNA分子に対する転写効果)
を与える他の所望のエンハンサー配列で置換され得る。
オキシヌクレオチドを化学的に合成する種々の方法は公知であり、市販されるD
NA合成装置で完全に自動化されている固相合成(ペプチド合成など)を含む(
例えば、本明細書中に援用されるItakuraら、米国特許第4,598,0
49号;Caruthersら、米国特許第4,458,066号;ならびにI
takura 米国特許第4,401,796号および同第4,373,071
号を参照のこと)。
DCタンパク質を含む。本開示は、全長ヒトおよびマウスB7−DCタンパク質
(およびDNA)を例示するが、本明細書中に開示される特徴を所有する他の哺
乳動物種由来のB7−DCの相同体およびその変異体が、本発明の範囲内である
ことを意図されることは理解されるべきである。
誘導体」、「フラグメント」、またはB7−DCの「化学誘導体」である。これ
らの用語は、下で定義される。機能的誘導体は、測定可能なB7−DC活性、好
ましくはT細胞上のレセプターに結合する活性および本発明に従ってその有用性
を可能にするT細胞活性を補助刺激する活性を保持する。「機能的誘導体」は、
この用語が本明細書中に接続語でまたは選択肢で使用されるか否かによらず「改
変体」および「フラグメント」を含む。
ない。この機能的特徴付けを考慮して、他の種由来の相同体タンパク質B7−D
C(まだ発見されていないタンパク質を含む)の使用は、これらのタンパク質が
配列類似性ならびに上記の生化学的活性および生物学的活性を有する場合、本発
明の範囲内に含まれる。
ために、この配列は、最適な比較目的のためにアラインメントされる(例えば、
ギャップが、最適なアラインメントのために第1のアミノ酸および第2のアミノ
酸の1つまたは両方、あるいは核酸配列において導入され得、そして非相同配列
は比較目的のために無視され得る)。好ましいアラインメントの方法において、
Cys残基がアラインメントされる。
少なくとも30%、好ましくは少なくとも40%、より好ましくは少なくとも5
0%、さらにより好ましくは少なくとも60%、そしてより好ましくは少なくと
も70%、80%、または90%である。例えば、276アミノ酸残基を有する
ヒトB7−DCタンパク質アミノ酸配列(配列番号2)に対して第2の配列をア
ラインメントする場合、少なくとも83アミノ酸残基、好ましくは少なくとも1
10アミノ酸残基、より好ましくは少なくとも138アミノ酸残基、さらにより
好ましくは少なくとも166アミノ酸残基、そしてより好ましくは193アミノ
酸残基、221アミノ酸残基または248アミノ酸残基が、アラインメントされ
る。次いで、対応するアミノ酸位置(またはヌクレオチド位置)におけるアミノ
酸残基(またはヌクレオチド)が、比較される。次いで第1の配列における位置
が、第2の配列における対応位置と同じアミノ酸残基(またはヌクレオチド)に
よって占有される場合、この分子は、その位置で同一性である(本明細書で使用
されるアミノ酸または核酸「同一性」は、アミノ酸または核酸「相同」と等価で
ある)。2つの配列間のパーセント同一性は、この2つの配列の最適なアライン
メントのために誘導される必要があるギャップの数、および各ギャップの長さを
考慮に入れて、配列によって共有される同一位置の数の関数である。
ズムを使用して達成され得る。好ましい実施形態において、2つのアミノ酸配列
間のパーセント同一性は、NeedlemanおよびWunsch(J.Mol
.Biol.48:444−453(1970))アルゴリズムを使用して測定
される。このアルゴリズムは、GCGソフトウェアパッケージ(http://
www.gcg.comから入手可能)中のGAPプログラムに組み込まれてい
る。これは、Blossom62マトリクスまたはPAM250マトリクスのい
ずれか、および16、14、12、10、8、6、もしくは4のgap wei
ghtおよび1、2、3、4、5、もしくは6のlength weightを
使用する。さらに別の好ましい実施形態において、2つのヌクレオチド配列間の
パーセント同一性は、GCGソフトウェアパッケージ(http://www.
gcg.comから入手可能)中のGAPプログラムを使用して測定される。こ
れは、NMSgapdna.CMPマトリクスおよび40、50、60、70、
もしくは80のgap weightおよび1、2、3、4、5、もしくは6の
length weightを使用する。別の実施形態において、2つのアミノ
酸または2つのヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、E.Meyersお
よびW.Miller(CABIOS,4:11−17(1989))のアルゴ
リズムを使用して測定される。これは、PAM120 weight resi
due table、12のgap length penaltyおよび4の
gap penaltyを使用するALIGNプログラム(バージョン2.0)
に組み込まれている。
れて、公開されているデータベースに対する探索を実行(例えば、他のファミリ
ーメンバーまたは関連配列を同定する)し得る。このような探索は、Altsh
ulら(1990)J.Mol.Biol.215:403−10のNBLAS
TおよびXBLASTプログラム(バージョン2.0)を使用して実行され得る
。BLASTヌクレオチド探索は、NBLASTプログラム(score=10
0、wordlength=12)を用いて実行されて、ヒトまたはマウスB7
−DC核酸分子に対するヌクレオチド配列相同性を獲得し得る。BLASTタン
パク質探索は、XBLASTプログラム(score=50、wordleng
th=3)を用いて実行されて、本発明のヒトまたはマウスB7−DCタンパク
質分子に対するアミノ酸配列相同性を獲得し得る。比較目的のためのギャップを
挿入したアラインメントを獲得するために、Gapped BLASTは、Al
tshulら(1997)Nucleic Acids Res.25:338
9−3402に記載されるように利用され得る。BLASTおよびGapped
BLASTプログラムを利用する場合、各々のプログラムのデフォルトパラメ
ータ(例えば、XBLASTおよびNBLAST)が使用され得る。http:
//www.ncbi.nlm.nih.gov.を参照のこと。
DC機能的活性、および(b)ネイティブのB7−DCタンパク質(例えば、上
で測定された配列番号2または配列番号4)に対する配列類似性(少なくとも約
30%(アミノ酸レベルで)、好ましくは少なくとも約50%、より好ましくは
少なくとも約70%、さらにより好ましくは少なくとも約90%)を有すると特
徴付けられる。
ンパク質を得、そして発現することは当該分野の技術範囲内である。次いで、こ
のタンパク質の生化学的活性および生物学的活性は、本明細書中に記載されるよ
うな当該分野で認識される方法(例えば、標準的なT細胞増殖またはサイトカイ
ン分泌アッセイ)を使用して、容易に試験され得る。T細胞補助刺激の生物学的
アッセイは、相同体が「機能的」相同体として適切であるような必須な活性を有
するかどうかを示す。
および補助刺激シグナルの送達に依存するB7−DCの機能的特徴(例えば、サ
イトカインのT細胞合成の刺激)を測定する。T細胞上のその天然のリガンドへ
のB7−DCの結合は、増加したサイトカイン産生(例えば、IL−2)を誘導
するシグナルを伝達し、IL−2は、慣用的に測定もされ得る増殖を順番に刺激
する。
換改変体)または1つもしくはいくつかの欠失した残基(欠失改変体)もしくは
付加された残基(付加改変体)を有する、全タンパク質あるいはそのフラグメン
トのいずれかに実質的に同一な分子をいう。B6−DCの「フラグメント」とは
、分子の任意のサブセット、好ましくはECDを含むサブセット(すなわち、全
長タンパク質のより短いポリペプチド)をいう。
および改変体を産生し得る。B7−DCタンパク質をコードする核酸の小さなサ
ブ領域またはフラグメント(例えば、1〜30塩基長)は、標準的な、化学的な
合成によって調製され得る。より大きな合成フラグメントの産生において使用す
るためのアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびプライマー。
を含むポリペプチド)である。例えば、B7の有用な誘導体は、B7−DCのE
CDおよびIg C領域に対応するポリペプチドを含むB7−DC−Ig融合タ
ンパク質である。融合パートナーの存在は、B7−DCタンパク質の可溶性、親
和性および/または結合価(ここでは1分子あたりの利用可能な結合部位の数と
して規定される)を変更し得る。可溶性B7−DC融合タンパク質(T細胞上の
レセプターにまだ結合している間)は、APC上に発現されるネイティブタンパ
ク質の効果とは異なる生物学的効果(すなわち、補助刺激よりも競合結合による
T細胞刺激の阻害)を有し得る。
D−1またはCD28もしくはCTLA−4ではないT細胞上の別のレセプター
を認識し、そして結合するタンパク質またはその任意のフラグメントの全体の細
胞外部分である。好ましくは、B7−DCのECDは、配列番号2または配列番
号4の約26位〜約221位のアミノ酸残基によりコードされる部分である。
は、さもなければ抽出され得るB7−DCの無細胞形態が意図される。可溶性B
7−DCとしては、可溶性融合タンパク質(例えば、生物学的に活性な分子に(
遺伝的にまたは化学的に)融合されるB7−DC−Ig、B7−DCの遊離EC
D、またはB7−DC ECD)が挙げられるが、それらに限定されない。
リータンパク質のドメインまたはフラグメント(好ましくは補助刺激形態で細胞
表面に発現される)との間のハイブリッド融合タンパク質を含む。
しくは、たった1つのアミノ酸残基が異なる残基によって置換されている群であ
る。タンパク質化学およびタンパク質構造の詳細な記載について、Schulz
,GEら、Principles of Protein Structure
,Springer−Verlag,New York,1978,およびCr
eighton,T.E.,Proteins:Structure and
Molecular Properties,W.H.Freeman & C
o.,San Francisco,1983(本明細書中に参考として援用さ
れる)を参照のこと。タンパク質分子において作製され得る置換の型は、異なる
種の相同性タンパク質(例えば、Schulzら(上記)の表1〜2およびCr
eighton(上記)の表3〜9に示されるタンパク質)間のアミノ酸変化の
頻度の分析に基づき得る。このような分析に基づいて、保存的置換は、以下の5
つの群のうちの1つにおける交換として本明細書中に定義される。
lyは、側鎖を欠く唯一の残基であり、従って鎖に可撓性を与える。その通常で
はないジオメトリーのため、Proは、鎖をきつく拘束する。Cysは、タンパ
ク質折り畳みに重要なジスルフィド結合形成に関係し得る。
ば、上の5つの群の中よりも間でほとんど保存されていない置換を選択すること
によって作製される。このような変化は、(a)置換の領域におけるペプチド骨
格の構造(例えば、シートまたはヘリックス構造)、(b)標的部位での分子の
荷電もしくは疎水性、または(c)側鎖の大きさを維持することに対する効果に
おいてより有意に異なる。このような置換の例は、(i)別のアミノ酸によるG
lyおよび/もしくはProの置換またはGlyもしくはProの欠失または挿
入;(ii)疎水性残基(例えば、Leu、Lle、Phe、ValもしくはA
la)による親水性残基(例えば、SerもしくはThr)の置換;(iii)
任意のほかの残基によるCys残基の置換;(iv)電気陰性の電荷を有する残
基(例えば、GluもしくはAsp)による電気陽性の側鎖を有する残基(例え
ば、Lys、ArgもしくはHis)の置換;あるいは(v)巨大な側鎖を有さ
ない残基(例えば、Gly)によるこのような側鎖を有する残基(例えば、Ph
e)の置換である。
激活性に関するB7−DCタンパク質の特徴においてラジカル変化を産生しない
ものである。しかし、そのようにするより前に、置換、欠失または挿入の確かな
効果を予測することが困難な場合、当業者は、この効果が慣習的なスクリーニン
グアッセイ(例えば、本明細書に記載される)によって過度の実験を必要とせず
評価され得ることを正しく認識する。
ましいより長い鎖の改変体は、B7−DCポリペプチドをコードする核酸の部位
特異的変異誘発、細胞培養における改変体核酸の発現、および必要に応じて細胞
培養物からのポリペプチドの精製によって(例えば、(少なくとも1つのエピト
ープに結合することによって改変体を吸収するため)カラムに固定された特異的
な抗体を使用する免疫親和性クロマトグラフィーによって)典型的に作製される
。
る化学的部分を含む。ポリペプチドの共有結合修飾は、本発明の範囲内に含まれ
る。このような誘導された部分は、可溶性、吸収性、生物学的半減期などを改良
し得る。このような効果を媒介し得る部分は、例えば、Remington’s
Pharmaceutical Sciences,第16版、Mack P
ublishing Co.,Easton,PA(1980)に開示される。
たは末端残基と反応し得る有機誘導化因子と反応することによって分子に導入さ
れ得る。
ルボキシル酸無水物で誘導される。環式カルボキシル無水物を用いる誘導は、リ
ジニル残基の電荷を逆転する効果を有する。アミノ含有残基を誘導するための他
の適切な試薬としては、イミドエステル(例えば、メチルピコリンイミデート;
ピリドキサールリン酸;ピリドキサール;クロロ水素化ホウ素(chlorob
rohydride);トリニトロベンゼンスルホン酸;O−メチルイソ尿素;
2,4ペンタンジオン;およびグリオキシレートを用いるトランスアミラーゼ触
媒反応)が挙げられる。
−N=C=N−R’)(例えば、1−シクロヘキシル−3−(2−モルホリニル
−(4−エチル)カルボジイミドまたは1−エチル−3−(4−アゾニア−4,
4−ジメチルペンチル)カルボジイミド)との反応によって選択的に修飾され得
る。さらに、アスパルチル残基およびグルタミル残基は、アンモニアとの反応に
よってアスパラギニル残基グルタミニル残基へ変換され得る。
はスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジンのアミノ基のメチル化(
Creighton、上記、pp.79−86)、N末端アミンのアセチル化、
ならびに、C末端カルボキシル基のアミド化が挙げられる。
わりに置換されたペプチドである。
ペーサ−またはリンカーを用いてか、または用いずに約2〜約100回繰り返さ
れる、より長いポリペプチドを含む。このようなマルチマーは、本明細書中に定
義される任意のペプチド改変体から構築され得ることが理解される。さらに、ペ
プチドマルチマーは、ペプチドモノマーおよびその開示された置換改変体の異な
る組合せを含み得る。このようなオリゴマーまたはマルチマーペプチドは、化学
合成によってか、または本明細書中で考察されるような組換えDNA技術によっ
て作製され得る。化学的に産生される場合、オリゴマーは、好ましくは、塩基性
ペプチド配列の2〜8回繰り返しを有する。組換え的に産生される場合、マルチ
マーは、例えば、発現系が2〜約100回繰り返すことを可能にするのと同じく
らい多くの繰り返しを有し得る。
イマーおよびトリマーにおいて、鎖は、鎖間ジスルフィド結合または鎖間の他の
「構造的」共有結合によって結合され、その結果、この鎖は、「末端から末端」
よりも「横 対 横」である。好ましいダイマーおよびトリマーは、本明細書に
記載されるようなB7−DCの融合タンパク質(例えば、B7−DC−Ig)間
のものである。
の種々の方法論について言及がなされる。刊行物および言及されるこのような公
知の方法論を示す他の材料は、まるで全てを示すようにその全体において参考と
して本明細書中に援用される。免疫学の一般的な原理を記載する標準的な参考著
述としては、A.K.Abbasら、Cellular and Molecu
lar Immunology(第4版),W.B.Saunders Co.
,Philadelphia,2000;C.A.Janewayら、Immu
nobiology.The Immune System in Healt
h and Disease,第4版,Garland Publishing
Co.,New York,1999;Roitt,I.ら、Immunol
ogy,(最新版)C.V.Mosby Co.,St.Louis,MO(1
999);Klein,J.,Immunology,Blackwell S
cientific Publications,Inc.,Cambridg
e,MA,(1990)が挙げられる。
ohlerおよびMilstein,Nature 256:495−497(
1975);米国特許第4,376,110号;Hartlow,E.ら、An
tibodies:A Laboratory Manual,Cold Sp
ring Harbor Laboratory Press,Cold Sp
ring Harbor,NY,1988);Monoclonal Anti
bodies and Hybridomas:A New Dimensio
n in Biological Analyses,Plenum Pres
s,New York,NY(1980);H.Zolaら、Monoclon
al Hybridoma Antibodies:Techniques a
nd Applications,CRC Press,1982)に記載され
る。
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ience,New York 1991(または最新版);Butt,W.R
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of the Art,Dekker,New York,1984;Bizo
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TRY,Marcel Dekker,Inc.,New York,1994
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mistry of Solid−Phase Immunoassay,CR
C Press,Boca Raton,1991;Weintraub,B.
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enth Training Course on Radioligand
Assay Techniques,The Endocrine Socie
ty,March,1986;Work,T.S.ら、Laboratory
Techniques and Biochemistry in Molec
ular Biology,North Holland Publishin
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Introduction to Radioimmune Assay a
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k,1984;Immunological Reviews Volume
79,1984;Immunological Reviews Volume
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.Volume 119,1985;Bona,C.ら、CRC Crit.R
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Ann.Immunol.125C:373−389(1974);Jerne
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ide,Westen−Schnurr,I.編,Editiones Roc
he,Basel,1982,Urbain,Jら、Ann.Immunol.
133D:179−(1982);Rajewsky,K.ら、Ann.Rev
.Immunol.1:569−607(1983)に記載される。
ープを反応する抗体(ポリクローナルおよびモノクローナルの両方)を提供する
。抗体は、異種の、同種異系の、同系のまたはそれらの修飾形態(例えば、ヒト
化抗体またはキメラ抗体)であり得る。抗B7−DC抗体のイディオタイプに対
して特異的な抗イディオタイプ抗体もまた、含まれる。用語「抗体」はまた、抗
原結合部位を含み、そしてB7−DCエピトープに結合し得るインタクトな分子
およびそのフラグメントの両方を含むことが意味される。これらは、インタクト
な抗体のFcフラグメントを欠くFabおよびF(ab’)2フラグメント(循
環からより速やかに除去され、そしてインタクトな抗体よりも少ない非特異的な
組織結合を有し得る)を含む(Wahlら、J.Nucl.Med.24:31
6−325(1983))。含まれるものはまた、Fvフラグメントである(H
ochman,J.ら、(1973)Biochemistry 12:113
0−1135;Sharon,J.ら、(1976)Biochemistry
15:1591−1594))。これらの種々のフラグメントは、従来の技術
(例えば、プロテアーゼ切断または化学的切断)を使用して産生される(例えば
、Rousseauxら、Meth.Enzymol.,121:663−69
(1986)を参照のこと)。
清として得られ、そしてさらなる処理をせずに直接使用され得るか、または、慣
習的な富化または精製方法(例えば、硫酸アンモニウム沈殿、イオン交換クロマ
トグラフィー、および親和性クロマトグラフィー)に供され得る(Zolaら、
前記を参照のこと)。
体を含み得る。好ましい免疫原は、ヒトB7−DCのECD(アミノ酸残基26
−221)の全てまたは一部を含み、ここでこれらの残基は、ネイティブなB7
−DC上に見出される翻訳後修飾(例えば、グリコシル化)を含む。細胞外ドメ
インを含む免疫原は、当該分野で公知の種々の方法(例えば、従来の組換え方法
を使用するクローニングされた遺伝子の発現、起源の細胞からの単離、高いレベ
ルのB7−DCを発現する細胞集団など)において産生される。
tein(Nature,256:495−97(1975))、ならびにその
改変(上の参考文献を参照のこと)によって導入された手順)を使用して産生さ
れ得る。動物、好ましくはマウスは、上のような免疫原を用いる免疫化によって
プライムされて、プライムされた動物において所望の抗体応答を誘導する。
的に、融合促進剤(例えば、ポリエチレングリコール(PEG))の存在化で骨
髄腫細胞と融合させる。任意の多くのマウス骨髄腫細胞株は、このような使用の
ために入手可能である:P3−NS1/1−Ag4−1,P3−x63−kOA
g8.653,Sp2/0−Agl4,またはHL1−653骨髄腫株(ATC
C,Rockville,MDから入手可能)。次の工程は、選択培地における
増殖を含み、その結果、融合されていない親骨髄腫細胞およびドナーリンパ球細
胞は、最終的に死亡するが、ハイブリドーマ細胞のみが生存する。これらは、ク
ローニングされ、そして増殖させて、そしてその上清は、例えば、B7−DC−
Ig融合タンパク質を使用する免疫アッセイ技術によって、所望の特異性の抗体
の存在についてスクリーニングされる。陽性クローンは、例えば、限界希釈によ
ってサブクローニングされ、そしてmAbが単離される。
使用してインビトロまたはインビボで(腹水中で)増殖され得る(一般的に、F
inkら、Prog.Clin.Pathol.,9:121−33(1984
)を参照のこと)。一般的に、個々の細胞株は、培養において増殖され、そして
高い濃度の単一のmAbを含有する培養培地は、デカンテーション、濾過、また
は遠心沈殿法によって収穫され得る。
て生成され得る。単鎖抗体は、目的のIg由来の超可変領域を含み、未知量の標
識された抗体(これは、「リポーター分子」として機能する)を含む溶液と接触
させた場合、インタクトなIgの大きさの一部ではあるが、ネイティブなIgの
抗原結合部位を再現する(Skerra,A.ら(1988)Science、
240:1038−1041;Pluckthun,A.ら(1989)Met
hods Enzymol.178:497−515;Winter,G.ら(
1991)Nature、349:293−299);Birdら(1988)
Science 242:423;Hustonら(1988)Proc.Na
tl.Acad.Sci.USA 85:5879;Jost CRら、J B
iol Chem.(1994)269:26267−26273;米国特許第
4,704,692号、同第4,853,871号、同第4,946,778号
、同第5,260,203号、同第5,455,0Kn)。標識抗体が、非標識
抗体を介して固体支持体に結合した抗原と複合体化するのを可能にするための、
二回目のインキュベーション期間の後、この固体支持体は2回目に洗浄され、未
反応の標識抗体が除去される。この型の正のサンドイッチアッセイは、抗原が存
在するか否かを決定するための単純な「あり/なし」のアッセイであり得るか、
または標識抗体の程度と、既知量の抗原を含む標準サンプルについて得られた程
度を比較することによって定量的にされ得る。
逆」アッセイが使用される。同時アッセイは、固体支持体に結合した抗体および
標識抗体の両方が、試験されるサンプルに同時に添加されるので、1回のインキ
ュベーション工程を包含する。このインキュベーションが完了した後、この固体
支持体を洗浄して、残りの液体サンプルおよび複合体化されていない標識抗体を
除去する。次いで、固体支持体に結合した標識抗体の存在は、従来の「正」サン
ドイッチアッセイにおけるのと同じようにして決定される。
て適切なインキュベーション期間後の、固体支持体に結合した非標識抗体の添加
という段階的添加が利用される。2回目のインキュベーション後、この固相を従
来の様式で洗浄し、試験される残りのサンプルおよび未反応の標識抗体の溶液が
固相にない状態にする。次いで、固体支持体に結合した標識抗体の決定は、「同
時」アッセイおよび「正」アッセイのように決定される。
活性化に関連する疾患(例えば、移植片拒絶および自己免疫)を処置するための
方法において有用である。この方法は、このような処置が必要な被験体にB7−
DCの補助刺激エピトープに特異的な有効量の抗体、好ましくはmAb、より好
ましくはヒトmAbまたはヒト化mAbを、投与する工程を包含する。抗体の投
与は、T細胞刺激をブロックするか、または抗原反応性T細胞を排除し、これに
よって、標的T細胞応答を阻害するのに効果的でなければならない。関連する用
量範囲を以下に記載する。
ることによって、疾患の進行をモニターするために診断的に使用されるかまたは
B7−DCの発現に対する薬剤の影響をアッセイするために使用される。好まし
くは、これは、細胞性mRNAレベルの測定によって達成される。このような診
断方法での使用のために、この核酸配列は、例えば、放射性標識もしくは蛍光標
識またはビオチンで検出可能に標識され、従来のドットブロットまたはノザン−
ハイブリダイゼーション手順において使用され、例えば、生物学的サンプル由来
の総korポリ(A+)RNAの調製物中に存在するmRNA分子がプローブさ
れる。
Cまたは腫瘍細胞)は、哺乳動物被験体に、好ましくはヒトに投与される。細胞
に結合した形態、固定化された形態、またそうでなければ凝集された形態のポリ
ペプチドを使用して、Tリンパ球の反応性および得られる免疫を増強する。B6
−DC−Ig融合タンパク質はダイマーとして組み立てられる、実施例に示され
るようにT細胞を補助刺激する。B6−DCポリペプチドの可溶性単量体形態は
、活性を刺激することなくT細胞上のレセプターに結合し得、従って、これは、
この分子の刺激性形態によるT細胞補助刺激の競合的インヒビターまたはアンタ
ゴニストと考えられ得る。このようなB6−DCアンタゴニストの結合は、進行
中のT細胞反応性を抑制し得るか、または内因性のB6−DCまたはさらにこれ
らのレセプター(例えば、CD28またはCTLA−4)を介して作用するB7
ファミリーの他のメンバーによって提示される補助刺激シグナルの効果を妨害し
得る。
な量または治療的に有効な量で、薬学的に受容可能なキャリア中で投与される。
B7−DCポリペプチド(またはそのポリペプチドを発現する細胞)は、単独で
、またはB7ファミリーの別のメンバーもしくは別の免疫刺激分子の活性を有す
るタンパク質もしくはペプチドのような別のタンパク質もしくはペプチドと組合
せて、投与され得る。処置はアジュバント(アジュバントの最も広い意味で使用
され、インターフェロンのような任意の非特異的免疫刺激化合物を含む)の投与
を含み得る。本明細書中で意図されるアジュバントとして、レゾルシノール、非
イオン性界面活性剤(例えば、ポリオキシエチレンオレイルエーテルおよびn−
ヘキサデシルポリエチレンエーテル)が挙げられる。
連する。
または臨床的効果を達成する投与量である。
活性な量は、因子(例えば、個体の疾患状態、年齢、性別および体重)、ならび
にペプチドが個体において所望の応答を惹起するための能力によって変化し得る
。投与量のレジメは、最適な治療応答を提供するように調整され得る。例えば、
いくつかに分けられた用量を毎日投与してもよいし、この用量を治療状態の緊急
性によって示されるように比例して減少させてもよい。細胞に結合した形態の治
療的に有効な量のタンパク質は、タンパク質当量または細胞当量で記述され得る
。
間、より好ましくは約1μgと100mg/kgとの間、より好ましくは約10
0μgと100mg/kgとの間である。内部投与に適切な投薬形態は、好まし
くは、(後者の容量範囲について)1単位当たり約0.1mg〜500mgの活
性成分のを含む。活性成分は、組成物の総重量に基づいて、0.5重量%〜95
重量%まで変化し得る。あるいは、B7−DCを発現する細胞(DCまたは不活
化された腫瘍細胞のような、好ましく形質導入された細胞)の有効な用量は、好
ましくは分割用量で、被験体当たり、約104個との細胞と約109個の細胞と
の間、より好ましくは約106個の細胞と108個の細胞との間である。免疫療
法の当業者は、過度の実験なしにこれらの用量を調整し得る。
形質導入された細胞)は、便利な様式(例えば、便利でかつ有効な経路による注
射)で投与され得る。好ましい経路として、皮下経路、皮内経路、静脈内経路お
よび筋肉内経路が挙げられる。他の可能性のある経路としては、経口投与、くも
膜下腔内適用、吸入適用、経皮適用、または直腸投与が挙げられる。完全には除
去されていない腫瘍の処置については、腫瘍内への直接注入もまた、意図される
。
し得る他の天然の条件の作用からこの化合物を保護するための材料でコーティン
グされ得る。従って、B7−DC活性を有するポリペプチドまたはペプチドを、
経腸経路によって投与するために、B7−DC活性の不活化を防止するための材
料で組成物をコーティングするか、またはそのような材料と組成物を同時投与す
る必要があり得る。例えば、ペプチドは、適切なキャリア、希釈液またはアジュ
バント中で個体に投与され得るか、酵素インヒビター(例えば、膵臓トリプシン
インヒビター、ジイソプロピルフルオロホスフェート(DEP)およびトラシロ
ール(trasylol))と共に同時投与され得るか、またはリポソーム(水
中油中水エマルジョンおよび従来のリポソーム(Strejanら(1984)
J.Neuroimmunol 7:27)を含む)のような適切なキャリア中
で投与され得る。
のおよび全ての溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗細菌剤および抗真菌剤、等
張剤および吸収遅延剤などが挙げられる。薬学的に活性な物質についてこのよう
な媒体および薬剤の使用は、当該分野で周知である。任意の従来の媒体または薬
剤が、この活性な化合物と不適合である範囲を除いて、治療組成物中でその使用
が意図される。補助的な活性化合物もまた、この組成物中に組込まれ得る。
挙げられる。注射のために適切な薬学的組成物としては、滅菌水性溶液(水溶性
である場合)または滅菌水性分散剤および滅菌注射用溶液または滅菌注射用分散
液の即時調製のための滅菌粉末が挙げられる。等張剤(例えば、糖、ポリアルコ
ール(例えば、マンニトール、ソルビトール)、塩化ナトリウム)は、薬学的組
成物中に含まれ得る。全ての場合において、組成物は無菌でありかつ流体である
べきである。組成物は、製造および保存の条件下で安定であるべきであり、そし
て細菌および真菌のような微生物による汚染を予防する保存剤を含まなければな
らない。分散液はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそ
れらの混合物中に、ならびに油中に調製され得る。保存および使用の通常の条件
下で、これらの調製物は、微生物の増殖を防ぐための保存剤を含み得る。
プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど)、およびそれ
らの適切な混合物を含む、溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性は、例
えば、レシチンのようなコーティングの使用によって、必要とされる粒子サイズ
の維持によって(分散液の場合)、および界面活性剤の使用によって、維持され
得る。
ロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなど)によって達
成され得る。
ノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン)を組成物中に含ませることによっ
てもたらされ得る。
投薬単位形態で処方される。投薬単位形態は、哺乳動物の被験体のための投薬単
位として適切な物理学的に別個の単位を言い;各単位は、必要とされる薬学的キ
ャリアと結合して所望の治療的効果を生成するように計算された予め決定された
量の活性化合物を含む。本発明の投薬単位形態のための詳細は、(a)活性化合
物の固有の特徴および達成されるべき特定の治療効果、ならびに(b)個体の感
受性を処置するためのこのような活性化合物を配合する分野に固有の制限によっ
て、決定され、そしてこれらに直接的に依存する。
ゾール調製物において、活性なタンパク質は、固体または液体の不活性キャリア
材料との組合せで存在し得る。これはまた、スクイーズボトルにパッケージング
され得るか、加圧された揮発性(通常は気体の)プロペラントと混合してパッケ
ージングされ得る。エアゾール調製物は、本発明のタンパク質に加えて溶媒、緩
衝剤、界面活性剤、および抗酸化剤を含み得る。
剤(ointment)(これは、皮膚への平滑効果および罹患領域への活性成
分の直接的な投与のための手段の両方を有する)のような局所適用ビヒクルに組
込まれ得る。
れであってもよい。噴霧不可能な形態は、局所適用に固有のキャリアを含み、か
つ、好ましくは水の動的粘度よりも大きな動的粘度を有する半固形または固形で
あり得る。適切な処方物として、液剤、懸濁剤、乳剤、クリーム剤、軟膏剤(o
intment)、散剤、リニメント剤、軟膏剤(salve)などが挙げられ
るが、これらに限定されない。所望である場合には、これらは、滅菌しても、補
助剤(例えば、保存剤、安定化剤、湿潤剤、緩衝剤、または浸透圧に影響を与え
るための塩など)と混合してもよい。噴霧不可能な局所的調製物のための好まし
いビヒクルの例として、軟膏基剤(例えば、ポリエチレングリコール−1000
(PEG−1000);HEBクリームのような従来のクリーム;ゲル;ならび
にワセリンなどが挙げられる。
アは、リポソームであり、これは、活性なタンパク質が、脂質層に接着した水性
の同心層からなる小体に分散しているか、またはその中に多様に存在しているか
のいずれかで含まれる、の薬学的組成物である。活性なタンパク質は、好ましく
は、水性層および脂質層の内側または外側(すなわち、いずれの事象においても
、リポソーム懸濁液として一般的に公知の不均一な系)に存在する。疎水性の層
、または脂質層は、一般的には(しかし、排他的にではない)、レシチンおよび
スフィンゴミエリンのようなリン脂質、コレステロールのようなステロイド、多
少イオン性の界面活性剤(例えば、ジセチルホスフェート、ステアリルアミンま
たはホスファチジン酸)、および/または疎水性の性質の他の物質を含む。
例えば、腫瘍細胞)である。活性化B細胞での補助刺激分子の時間的な発現は、
B7、B7−2、およびB7−3で異なる。例えば、B7−2は、B細胞の活性
化に続いて初期に発現されるが、B7−3は、後期に発現される。従って、この
異なる補助刺激分子は、免疫応答の過程の間に、別個の機能を果たし得る。効果
的なT細胞応答は、T細胞が複数の補助刺激分子から補助刺激シグナルを受ける
ことを必要とし得る。
子を発現する腫瘍細胞を含む。例えば、腫瘍細胞を改変して、B7−DCと、B
7、B7−2、およびB7−3のうちの1つ以上とを発現させ得る。
ないかもしれず、または特定の補助刺激分子は発現するが、他の分子は発現しな
いかもしれない。本明細書中で記載されるように、腫瘍細胞は、B7−DCのみ
をコードする核酸または別の補助刺激分子とともにB7−DCをコードする核酸
を用いるトランスフェクションによって改変され得る。例えば、B7−DCをコ
ードする核酸でトランスフェトされた腫瘍細胞は、B7をコードする核酸でさら
にトランスフェクトされ得る。ヒトB7−DCタンパク質またはマウスB7−D
Cタンパク質をコードするcDNA分子の配列は、それぞれ、配列番号1および
配列番号3のコード部分である。あるいは、1より多くの型の改変が使用され得
る。例えば、B7−DCをコードする核酸でトランスフェクトされた腫瘍細胞は
、B7−1、B7−2、またはB7−3の発現を誘導する薬剤で刺激され得る。
起こしている主な慢性的ウイルス感染症についての治療用ワクチンの本願組成物
の使用である。このようなワクチンは、感染した細胞を排除する(これは、抗体
が無効であるためにT細胞応答を必要とする)ように設計される。本発明のワク
チンは、抗原性エピトープそれ自身に加えて: (a)ベクター(例えば、裸の(naked)DNA、裸のRNA、自己複製R
NAレプリコン)ならびにウイルス(ワクシニアウイルス、アデノウイルス、ア
デノ随伴ウイルス(AAV)、レンチウイルスおよびRNAアルファウイルスを
含む); (b)抗原標的化シグナルまたはプロセシングシグナル(例えば、HSP70)
、カルレティキュリン、Flt−3リガンドの細胞外ドメイン、Pseudom
onasの菌体外毒素ETAのドメインII、単純ヘルペスのVP22標的化タ
ンパク質など(同一人に譲渡された米国特許出願第09/421,608号;同
第09/501,097号;同第09/693,450号;同第60/222,
9002号;同第60/222,985号;同第60/268,575号および
Chang,W−Fら、J.Virol.75:2368−2376(2001
)(これらは、その全体が参考として本明細書中で援用される);ならびに (c)補助刺激シグナル、好ましくは本発明のB7−DCタンパク質またはその
融合タンパク質、フラグメントもしくは機能的誘導体(単独でまたはB7.1、
B7.2、可溶性CD40などのような他の公知の補助刺激タンパク質との組み
合わせ)を含む。
る抗原をコードする核酸で形質転換されるか、トランスフェクトされるか、また
はそうでなければ、形質導入される。このような抗原は、好ましくは、病原性微
生物のエピトープであり、これに対して宿主は、エフェクターT細胞応答(細胞
障害性Tリンパ球(CTL)および遅延型過敏症を含む)によって防御されてい
る。代表的には、これらとして、ウイルス、マラリアのような細胞内寄生生物、
およびミコバクテリアおよびリステリアのような細胞内で増殖する細菌が挙げら
れる。従って、本発明のワクチン組成物に含まれるこの型の抗原は、(もちろん
、腫瘍特異性抗原に加えて)このような病原体に関連する抗原のいずれかである
。いくつかのウイルス抗原がまた、ウイルスが癌の原因となる因子である場合の
腫瘍抗原であることは注目すべきである。
染と関連する。B型肝炎ウイルス(HBV)は、肝癌の病因となる因子として関
連付けられてきた(Beasley,R.P.ら、Lancet 2、1129
−1133(1981))。80〜90%の子宮頚癌は、以下の4つの「高度に
危険な(ハイリスク)」ヒトパピローマウイルス型のうちの1つに由来するE6
抗原およびE7抗原を発現する:HPV−16、HPV−18、HPV−31お
よびHPV−45(Gissmann,L.ら、Ciba Found Sym
p.120、190−207(1986);Beaudenon,S.ら、Na
ture 321、246−249(1986))。HPV E6抗原およびE
7抗原は、免疫適格性個体におけるウイルス関連の癌のための最も有望な標的で
ある。なぜなら、これらが、子宮頚癌において遍在的に発現されるからである。
治療的癌ワクチンの標的としてのこれらの重要性に加えて、ウイルス関連腫瘍抗
原はまた、予防的ワクチンのための理想的な候補である。実際に、アジアにおけ
る予防的HBVワクチンの導入は、肝癌の発生率を減少させ、癌予防に対する大
きな影響を示している(Chang,M.H.ら、New Engl.J.Me
d.336、1855−1859(1997))。
ピローマウイルス(HPV)、B型肝炎ウイルス(HBV)、C型肝炎ウイルス
(HCV)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、エプスタイン−バーウイルス(
EBV)および単純ヘルペスウイルス(HSV)である。
医薬の状況において動物の疾患の処置に使用することが意図される。従って、本
明細書中で記載されるこのアプローチは、当業者によって容易に適用されて、獣
医学的なヘルペスウイルス感染(ウマのヘルペスウイルス、ウシのヘルペスウイ
ルス、ニワトリおよび他の家禽におけるマレク病ウイルスを含む);動物のレト
ロウイルス疾患;仮性狂犬病および狂犬病などを処置し得る。
る原理ならびに現在の情報を示し、これらは、参考として援用される:Fiel
ds Virology、Fields,BNら編、Lippincott W
illiams & Wilkins、NY、1996;Principles
of Virology:Molecular Biology,Patho
genesis,and Control、Flint,S.J.ら編、Ame
r Society for Microbiology、Washingto
n、1999;Principles and Practice of Cl
inical Virology,第4版、Zuckerman.A.J.ら編
、John Wiley & Sons、NY、1999;The Hepat
itis C Viruses、Hagedorn,CHら編、Springe
r Verlag、1999;Hepatitis B Virus:Mole
cular Mechanisms in Disease and Nove
l Strategies for Therapy、Koshy,R.ら編、
World Scientific Pub Co、1998;Veterin
ary Virology、Murphy,F.A.ら編、Academic
Press、NY、1999;Avian Viruses:Function
and Control、Ritchie,B.W.、Iowa State
University Press、Ames、2000;Virus Ta
xonomy:Classification and Nomenclatu
re of Viruses:Seventh Report of the
International Committee on Taxonomy
of Viruses、M.H.V.Van Regenmortel,MHV
ら編、Academic Press;NY、2000。
れてきた。この「標的化」分子は、抗原と共に(好ましくは、融合ポリペプチド
として)使用されて、細胞および細胞下区画へ抗原を標的化し、このことは、よ
り強力かつ効果的な様式でT細胞に対する抗原提示を促進する。
の)ワクチンの能力を増強するための潜在的アプローチを示す。HSPは、癌性
ワクチン接種およびウイルス性ワクチン接種における天然の生物学的アジュバン
トとして作用するらしい。小胞体(ER)に常在するgp96 HSPおよび細
胞質Hsp70は両方とも、免疫学的アジュバントとして作用する(Sriva
stava,PKら、Semin.Immunol.3、57−64(1991
);Udono,Hら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91
、3077−3081(1994))。これらのHSPまたはシャペロニンは、
広範なペプチドアレイに結合する(Lammert,E.ら、Eur.J.Im
munol.27、923−927(1997))。Hsp70は、会合したタ
ンパク質をプロテオソーム(MHCクラスI分子と会合するためのペプチドを生
成する主な細胞性プロテアーゼ複合体)に標的化し得るシャペロニンである。従
って、Hsp70に直接結合する抗原は、MHCクラスIによってより効率的に
提示される(特に、CTL応答を生じる)。2つの特徴が、HSPのアジュバン
ト活性の原因であるらしい:(1)インビトロでペプチドをロードされたgp9
6は、MHCクラスIプロセシング経路に抗原を効果的に導入する;(2)gp
96のマクロファージへの結合は、炎症誘発性サイトカインの分泌を誘導し、従
って、ペプチド性抗原が標的化されている細胞の機能を増強する。
強力な抗腫瘍免疫(Srivastava,PKら、Int J Cancer
.33:417−22、1984;Srivastava,PKら、Proc
Natl Acad Sci USA.83:3407−11、1986;Ud
ono,Hら、J Immunol.152:5398−5403、1994;
Blachere,NEら、J Immunother.14:352−6、1
993;Udono,Hら(前出);Tamura,Yら、Science.2
78:117−20、1997;Janetzki,Sら、J Immunot
her.21:269−76、1998)、または抗ウイルス免疫(Heike
ma,Aら、Immunol Lett.57:69−74、1997;Sut
o,Rら、Science.269:1585−8、1995)を誘導する。ペ
プチドとHSPとをインビトロで混合することにより、免疫原性HSP−ペプチ
ド複合体が生成された(Ciupitu,AMら、J Exp Med.187
:685−91、1998;Blachere,NEら、J Exp Med.
186:1315−22、1997)。HSPに基づくいくつかのタンパク質ワ
クチンは、HSPへの抗原の融合物を含んだ(Suzue,Kら、J Immu
nol.156:873−9、1996;Suzue,K.ら、Proc Na
tl Acad Sci USA 94:13146−51、1997)。より
最近では、本発明者およびその同僚は、キメラDNAまたはRNAレプリコンワ
クチンの形態でHSPを使用した(例えば、Chen,C−Hら、Canc.R
es.60:1035−1042(2000))。彼らは、Mycobacte
rium tuberculosis HSP70に融合させる抗原としてHP
V−16 E7を使用し、そしてE7特異的CD8+T細胞の増加した増殖およ
び活性化(これは、確立された腫瘍に対する強力な抗腫瘍免疫を生じた)を示し
た(Lin,K.−Y.ら、Cancer Res.56:21−26.、19
96)。
例えば、ETAのドメインII(dII)(残基253〜364にわたる))の
トランスロケーションドメインである。トランスロケーションドメインは、細胞
の細胞質ゾルに結合するタンパク質またはポリペプチドのトランスロケーション
を誘導するポリペプチドである。例えば、同様に適用可能なポリペプチドは、ジ
フテリア毒素、クロストリジウム属(botulinum、tetani)毒素
、炭疽毒素、エルジニア属毒素、Vibrio choleraeの毒素、また
はBordetella pertussis毒素由来である。毒素をコードす
るDNAの毒素ドメインは、好ましくは、このような組成物の調製物において変
異または欠失されている。
ク質の折り畳みおよび組立てに関連することが公知である、小胞体(ER)腔に
豊富に存在する46kDaのタンパク質である(Nash(1994)Mol.
Cell.Biochem.135:71−78;Hebert(1997)J
.Cell Biol.139:613−623;Vassilakos(19
98)Biochemistry 37:3480−3490;Spiro(1
996)J.Biol.Chem.271:11588−11594)。CRT
は、抗原プロセシングに関連するトランスポーター(例えば、TAP−1および
TAP−2)によってERに輸送されたペプチドと会合する(Spee(199
7)Eur.J.Immunol.27:2441−2449)。CRTは、イ
ンビトロでペプチドと複合体を形成する。これらの複合体は、マウスに投与され
た場合に、ペプチド特異的CD8+T細胞応答を惹起した(Basu(1999
)J.Exp.Med.189:797−802;Nair(1999)J.I
mmunol.162:6426−6432)。マウス腫瘍から精製されたCT
Rは、CRTの供給源として使用される腫瘍に対して特異的な免疫を惹起したが
、抗原的に別個の腫瘍に対しては免疫を惹起しなかった(Basu、前出)。ペ
プチドに結合するCRTを用いて、DCをインビトロでパルスすることによって
、このペプチドは、DCクラスI分子の状況において再提示され、そしてペプチ
ド特異的CTLを刺激した(Nair、前出)。
DCの生成を促進し得る(Maraskovsky,E.ら、J Exp Me
d.184:1953−62、1996;Shurin,MR.ら、Cell
Immunol.179:174−84、1997)。Flt3は、マウスチロ
シンキナーゼレセプターであり(Rosnet,O.ら、Oncogene 6
:1641−50、1991)、これは、第IIIレセプターキナーゼファミリ
ーのメンバーである(概説については、Lyman,SD、Curr Opin
Hematol.5:192−6、1998を参照のこと)。造血組織におい
て、Flt3の発現は、CD34ポジティブ前駆体に制限される。Flt3を使
用して、対応するリガンドであるFlt3−リガンドを同定し、そして引続いて
クローン化した(Lyman,SDら、Cell 75:1157−67、19
93;Hannum,Cら、Nature 368:643−8、1994)。
Flt3−リガンドの主な形態は、膜貫通タンパク質として合成され、機能的に
類似の可溶性ECDは、このタンパク質からタンパク質分解切断によって生成さ
れる(Lymanら、前出)。これらのタンパク質は、固有のチロシンキナーゼ
レセプターに結合し、そして活性化する。造血細胞の中で、Flt3レセプター
の発現は、DC前駆体を含む最も未分化の前駆体細胞に主に限定される。Flt
3−リガンドのECDは、いくつかのマウスモデル腫瘍(線維肉腫、乳癌、肝癌
、肺癌、黒色腫およびリンパ腫を含む)に対する強力な抗腫瘍効果を生成した(
Lynch,DHら、Nat Med.3:625−631、1997;Che
n,Kら、Cancer Res.57:3511−3516、1997;Br
aun,SEら、Hum Gene Ther.10:2141−2151、1
999;Peron,JMら、J Immunol.161:6164−617
0、1998;Chakravarty,PKら、Cancer Res.59
:6028−6032、1999;Esche,Cら、Cancer Res.
58:380−383、1998)(19)。本発明者らの同僚らは、HPV
Ek7タンパク質をコードするDNAを、Flt3−リガンドECDをコードす
るDNAに連結した。この構築物での免疫は、E7抗原特異的CD8+T細胞の
増殖および活性化を劇的に増強し、確立されたE7発現転移性腫瘍に対する強力
な抗腫瘍免疫を生じた。
使用され得る(Elliott,G.およびP.O’Hare.1997.Ce
ll 88:223−33)ことに起因して、抗原の伝播の増強に寄与するプロ
トタイプタンパク質である。例えば、p53に連結されたVP22(Phela
n,A.ら,1998,Nat Biotechnol 16:440−443
)またはチミジンキナーゼに連結されたVP22(Dilber,MSら,19
99,Gene Ther 6:12−21)は、連結したタンパク質の、イン
ビトロでの周囲の細胞への伝播およびモデル腫瘍の処置を容易にした。DNAワ
クチンの状況でHPV−16 E7抗原に連結されたVP22は、ワクチン接種
したマウスにおいてE7特異的CD8+ T細胞前駆体の数における劇的な増加
(約50倍)を導き、そしてあまり有効でないDNAワクチンをE7発現腫瘍に
対して顕著な効力を有するDNAワクチンへと変換させた。非伝播性VP22変
異体は、ワクチン効力を増強することができなかった。VP22および同様の作
用形態を有し得るタンパク質は、以下のいくつかの方法でワクチン効力の増強に
寄与する:(1)トランスフェクトされた細胞から周囲のAPCへの抗原の伝播
を容易にし、それによってMHCクラスI経路を通して抗原を提示するAPCの
数を増加させる;(2)抗原を、トランスフェクトされた細胞において、より効
率的に提示する;(3)「交叉プライム(crosspriming)」を行い
、それによってVP22/抗原融合タンパク質の放出が、MHC−I拘束経路を
介した提示のための、DC(または他のAPC)による取り込みおよびプロセシ
ングを導く(Huang,AYら,1994,Science 264:961
−965)。
なエピトープ(例えば、CTLエピトープ)をどのようにして同定するかがわか
る。
すためのDNA送達)は、細胞への、そして最終的には生存動物への「外来」D
NAの導入を含む。遺伝子治療についてのいくつかの一般的ストラテジーが研究
されており、そして広範に概説されている(Yang,N−S.,Crit.R
ev.Biotechnol.12:335−356(1992);Ander
son,W.F.,Science 256:808−813(1992);M
iller,A.S.,Nature 357:455−460(1992);
Crystal,R.G.,Amer.J.Med.92(補遺6A):44S
−52S(1992);Zwiebel,J.A.ら,Ann.N.Y.Aca
d.Sci.618:394−404(1991);McLachlin,J.
R.ら,Prog.Nucl.Acid Res.Molec.Biol.38
:91−135(1990);Kohn,D.B.ら,Cancer Inve
st.7:179−192(1989)(これらの参考文献は、その全体が、本
明細書中に参考として援用される)。
質転換された細胞の、全身的または特定の器官もしくは組織へかのいずれかの、
宿主への自己移植を含む。
組織または器官への機能的に活性なDNAの直接的移入によって達成される。D
NA移入は、以下に記載の多数のアプローチを用いて達成され得る。これらの系
は、選択マーカー(例えば、G418耐性)の使用によってインビトロでの好首
尾の発現について試験されて、DNAを発現するトランスフェクトされたクロー
ンが選択され得、続いて適切な免疫アッセイにおいてB7−DC発現産物に対す
る抗体を用いてのこの産物の存在が(誘導性系での場合はインデューサーでの処
置後に)検出され得る。この手順(DNA取り込み、プラスミド組み込みおよび
組み込まれたプラスミドの安定性を含む)の効率は、公知の方法を用いたプラス
ミドDNAの直鎖化および高分子量哺乳動物DNAを「キャリア」として用いた
同時トランスフェクションによって改善され得る。
る:(a)マウス筋肉組織へのプラスミドDNAの直接注入(これは、無期限に
わたってマーカー遺伝子の発現を導いた)(Wolff,J.A.ら,Scie
nce 247:1465(1990);Acsadi,G.ら,The Ne
w Biologist 3:71(1991));(b)レトロウイルスベク
ターは、インビボおよびインサイチュでの血管組織の感染に有効である;(c)
レトロウイルス調製物の門脈注射および肝臓への直接注射は、遺伝子移入および
インビボでの発現をもたらした(Horzaglou,M.ら,J.Biol.
Chem.265:17285(1990);Koleko,M.ら,Huma
n Gene Therapy 2:27(1991);Ferry,N.ら,
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:8387(1991)
);(d)肺組織への組換えアデノウイルスの気管内注入は、肺の気道上皮にお
ける外来遺伝子のインビボでの移入および長期発現に有効であった(Rosen
feld,M.A.ら,Science 252:431(1991);(e)
単純ヘルペスウイルスベクターは、脳組織へのインビボでの遺伝子移入を達成し
た(Ahmad,F.ら編,Miami Short Reports−Adv
ances in Gene Technology:The Molecul
ar Biology of Human Genetic Disease,
第1巻,Boerringer Manneheim Biochemical
s,USA,1991)。
する(Temin,H.M.,Human Gene Therapy 1:1
11(1990);Teminら,米国特許4,980,289;Teminら
,米国特許4,650,764;Teminら,米国特許第5,124,263
号;Wills,J.W.米国特許5,175,099;Miller,A.D
.,米国特許第4,861,719号)。このようなベクターは、機能的DNA
をヒトの細胞または組織へと(例えば、アデノシンデアミナーゼ遺伝子をリンパ
球へと、NPT−II遺伝子および腫瘍壊死因子遺伝子を腫瘍浸潤性リンパ球へ
と)導入するために用いられている。レトロウイルス媒介遺伝子送達は一般に、
遺伝子移入のために標的細胞の増殖を必要とする(Miller,D.G.ら,
Mol.Cell.Biol.10:4239(1990))。この条件は、本
発明のDNA分子が導入されるべき特定の好ましい標的細胞(すなわち、活発に
増殖する腫瘍細胞)によって満たされる。多数の方法のうちのいずれかを用いた
プラスミドによる、およびレトロウイルスベクターによる、トランスフェクショ
ンを用いた嚢胞性線維症の遺伝子治療は、Collinsら,米国特許5,24
0,846によって記載されている。
に、複製欠損レトロウイルスを産生するパッケージング細胞株を用いてレトロウ
イルスベクター中にパッケージングされ得る(例えば、Cone,R.D.ら,
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6349−6353(
1984);Mann,R.F.ら,Cell 33:153−159(198
3);Miller,A.D.ら,Molec.Cell.Biol.5:43
1−437(1985);Sorge,J.ら,Molec.Cell.Bio
l.4:1730−1737(1984);Hock,R.A.ら,Natur
e 320:257(1986);Miller,A.D.ら,Molec.C
ell.Biol.6:2895−2902(1986)を参照のこと)。遺伝
子移入について効率的でかつ安全な、より新しいパッケージング細胞株もまた記
載されている(Bankら,U.S.5,278,056)。
送達するために部位特異的様式で利用され得る。従って、例えば、カテーテル送
達系が使用され得る(Nabel,EGら,Science 244:1342
(1989))。レトロウイルスベクターまたはリポソームベクターのいずれか
を使用するこのような方法は、発現されるべき核酸を血管壁へと、または腫瘍の
血液循環物へと送達するために特に有用である。
ス(Horowitz,M.S.,In:Virology,Fields,B
Nら編,Raven Press,New York,1990,1679頁;
Berkner,K.L.,Biotechniques 6:616−919
,1988),Strauss,S.E.,In:The Adenoviru
ses,Ginsberg,HS編,Plenum Press,New Yo
rk,1984,第11章)、ニューロン特異的送達および持続性のための単純
ヘルペスウイルス(HSV)。ヒトの遺伝子治療のためのアデノウイルスベクタ
ーの利点としては、組換えは稀であり、このようなウイルスと関連するヒトの悪
性疾患は知られておらず、アデノウイルスゲノムは7.5kbの大きさまでの外
来遺伝子を受け入れるように操作され得る二本鎖DNAであり、そして生のアデ
ノウイルスは、安全なヒトワクチン生物であるという事実が挙げられる。アデノ
随伴ウイルスもまた、本発明によるヒトの治療のために有用である(Samul
ski,R.J.ら,EMBO J.10:3941(1991)。
定において有用である別のベクターは、ワクシニアウイルスであり、ワクシニア
ウイルスは、非複製性にされ得る(米国特許5,225,336;同5,204
,243;同5,155,020;同4,769,330;Sutter,Gら
,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1992)89:1084
7−10851;Fuerst,T.R.ら,Proc.Natl.Acad.
Sci.USA(1989)86:2549−2553;Falkner F.
G.ら;Nucl.Acids Res(1987)15:7192;Chak
rabarti,Sら,Molec.Cell.Biol.(1985)5:3
403−3409)。組換えワクシニアウイルスおよび異種DNAを含む他のウ
イルス、ならびに免疫およびDNA治療におけるそれらの使用の説明は、以下に
概説されている:Moss,B.,Curr.Opin.Genet.Dev.
(1993)3:86−90;Moss,B.Biotechnology(1
992)20:345−362;Moss,B.,Curr Top Micr
obiol Immunol(1992)158:25−38;Moss,B.
,Science(1991)252:1662−1667;Piccini,
Aら,Adv.Virus Res.(1988)34:43−64;Moss
,B.ら,Gene Amplif Anal(1983)3:201−213
。
はベクターとして使用され得る。以下を含む多数の細菌株:Salmonell
a、BCGおよびListeria monocytogenes(LM)(H
oisethおよびStocker,Nature 291,238−239(
1981);Poirier,TPらJ:Exp.Med.168,25−32
(1988);(Sadoff,J.C.ら,Science 240,336
−338(1988);Stover,C.K.ら,Nature 351,4
56−460(1991);Aldovini,A.ら,Nature 351
,479−482(1991);Schafer,R.ら,J.Immunol
.149,53−59(1992);Ikonomidis,G.ら,J.Ex
p.Med.180,2209−2218(1994))。これらの生物は、ワ
クチンベクターとしての使用のために有望な以下の2つの特徴を提示する:(1
)経口ワクチン送達の可能性を提供する、腸感染経路;および(2)単球/マク
ロファージの感染(それによってプロフェッショナルAPCへと抗原を標的化す
る)。
知の物理的手段は、DNAの直接移入のために用いられ得る:プラスミドDNA
の投与(Wolffら,1990,前出)およびパーティクル−ボンバードメン
ト媒介遺伝子移入(Yang,N.−S.ら,Proc.Natl.Acad.
Sci.USA 87:9568(1990);Williams,R.S.ら
,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:2726(1991
);Zelenin,A.V.ら,FEBS Lett.280:94(199
1);Zelenin,A.V.ら,FEBS Lett.244:65(19
89);Johnston,S.A.ら,In Vitro Cell.Dev
.Biol.27:11(1991))。さらに、インビトロで細胞へと遺伝子
を移入するための周知の手段であるエレクトロポレーションを用いて、本発明に
よるDNA分子をインビボで組織へと移入し得る(Titomirov,A.V
.ら,Biochim.Biophys.Acta 1088:131((19
91))。
Biol.Chem.264:16985(1989);Wu,G.Y.ら,J
.Biol.Chem.263:14621(1988);Soriano,P
.ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:7128(19
83);Wang,C−Y.ら,Proc.Natl.Acad.Sci.US
A 84:7851(1982);Wilson,J.M.ら,J:Biol.
Chem.267:963(1992))。好ましいキャリアは、標的化された
リポソーム(Nicolau,C.ら,Proc.Natl.Acad.Sci
.USA 80:1068(1983);Sorianoら,前出)(例えば、
免疫リポソーム(これは、アシル化mAbを脂質二重層へと取り込み得る(Wa
ngら,前出)))である。アシアロ糖タンパク質/ポリリジン(Wuら,19
89,前出)のようなポリカチオンが用いられ得、ここで、結合体は、標的組織
を認識する分子(例えば、肝臓についてはアシアロオロソムコイド)およびトラ
ンスフェクトされるべきDNAに結合するDNA結合化合物を含む。ポリリジン
は、DNAに損傷を与えることなくDNAを結合するDNA結合分子の一例であ
る。次いで、この結合体は、移入のために本発明に従ってプラスミドDNAと複
合体化される。
ラスミドDNAは、当該分野で周知の方法を用いて(例えば、Quiagen手
順(Quiagen)を用いて)調製され得、続いてDNAが、公知の方法(例
えば、本明細書中に例示される方法)を用いて精製され得る。
については、安定な発現を必要としないかもしれない。むしろ、ポリペプチドの
一過性の発現は、形質導入された細胞がその免疫原性機能および/または補助刺
激機能を果たすために充分であり得る。
てより容易に理解される。以下の実施例は、例示のために提供され、明記しない
限り、本発明を限定することを意図しない。
びマクロファージの調製のために用いた。
S)(Hyclone)、ペニシリン/ストレプトマイシン(JRH Bios
ciences)、ゲンタマイシン(Sigma)、非必須アミノ酸(JRH
Biosciences)、L−グルタメート(JRH Bioscience
s)、ピルビン酸ナトリウム(Sigma)、2メルカプトエタノール(Sig
ma)および1000単位/ml組換えマウスGM−CSF(Immunex)
を補充したRPMI1640(Gibco BRL)培地中で培養した。8日目
の骨髄由来DCを、従来法によってモノクローナル抗体で染色した。MHCクラ
スIIに対するモノクローナル抗体14−4−4を、ハイブリドーマ上清から精
製した。Johns Hopkins UniversityのWilliam
Baldwin博士は親切なことに、CTLA4−Ig融合分子を供給した。
MHCクラスIについての抗体(28−14−8)、F4/80についての抗体
(Cl.A3−1)、B7.1についての抗体(1G10)、B7.2について
の抗体(GL1)、FcγRII/IIIについての抗体(2.4G2)および
Mac−1についての抗体(M1/70)を、PharMingenから購入し
た。テスターcDNA調製のために、8日目の細胞を、Johns Hopki
ns University Oncology Centerで14−4−4
sおよびCTLA4−Igを用いてセルソーターによって精製した。選別後のM
HCクラスIIhiおよびB7hi集団の純度は93%〜98%であった。
ン、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、Lグルタミン、2−メルカプトエ
タノールおよび250単位/ml組換えマウスM−CSFを補充したRPMI−
1640培地で培養し、そして以前に記載された(27)通りにこれらを500
単位/mlのγ−IFN(Pharmingen)および5μg/ml LPS
(Sigma)で処理した。刺激後、MHCクラスIIおよびB7の細胞表面発
現を、培養10日目のフローサイトメトリー分析を用いて確認した。
PU5−1.8は、親切なことに、NIAID,National Insti
tutes of HealthのJoshua Farber博士によって提
供された。これらを、ATCCの推奨する培地で培養した。
を、MLC中の同種T細胞を刺激する能力について試験した。MLC反応を、3
×105同種C57BL/6リンパ球へ漸増数のBALB/c刺激細胞を添加す
ることによって、96ウェル平底マイクロプレートにおいて行った。3日間の培
養後、T細胞増殖を、最後の18時間の培養にわたる、各ウェルへの1μCiの
[3H]−メチル−チミジン(Amersham)の添加によって評価した。次
いで、細胞を収集し、そして放射能の取り込みを、β計数管(Packard
96)を用いて決定した。
L(Gibco BRL)を用いて抽出した。メッセンジャーRNAを、Oli
gotex mRNA精製キット(Qiagen)によって精製した。本発明者
らは、PCRベースのSMART cDNA合成系(Clonetech)を用
いてcDNAを増幅し、続いてPCRベースの差引き系PCR Select(
Clonetech)を用いた。差引きを、製造業者のプロトコルに従って行っ
た。最後の差引きPCR後、DNAフラグメントを、プラスミドベクターpCR
2.1(Invitrogen)またはpCR Blunt(Invitrog
en)に連結した。形質転換後、各クローンを、プラスミドDNA増幅およびミ
ニプレップDNAのために増殖させ、次いでEcoRIで消化して挿入物の存在
を確認した。次いで、プラスミドドットブロットを行って、このcDNAクロー
ンが樹状細胞特異的であることを確認した。アルカリ変性ミニプレップDNAを
Hybond N+メンブレン(Amersham)にスポットし、そして選別
されたDCまたは活性化されたマクロファージ由来のSMART cDNAプロ
ーブとハイブリダイズさせた。これらのcDNAプローブを、ランダムプライマ
ー標識法(Stratagene Prime−It II)を用いて32P標
識した。ハイブリダイゼーションおよび洗浄を、以前に記載された(28)通り
に行った。メンブレンをフィルム(Amersham)に1日間〜2日間にわた
って暴露し、そして現像した。
(Amersham)にスポッティングし、選別されたDCまたは活性化したマ
クロファージから誘導されたSMART(登録商標)cDNAプローブとハイブ
リダイズさせた。これらのcDNAプローブを、ランダムプライマー標識法(S
tratagene Prime−It II)を用いて32P標識した。ハイ
ブリダイゼーションおよび洗浄を、以前に記載された通りに行った。オートラジ
オグラフィーについては、メンブレンを、フィルム(Amersham)に1〜
2日間にわたって暴露し、そして現像した。
ング) 骨髄由来DCを8日目に選別をせずに収集した。これらの細胞の約20%〜4
0%は、高いMHCクラスIIおよびB7を発現した。総RNA抽出、続いてポ
リA RNA精製を上記に記載された通りに行った。オリゴdTプライムDCラ
イブラリー構築については、本発明者らは、λZAP Express cDN
A合成系(Stratagene)を用いた。B7−DCのPCR DNAフラ
グメントをプローブし、そしてスクリーニングのために用いた。メンブレン転移
、変性、再生を、Stratageneのプロトコルを用いて行った。プローブ
の放射性標識、ハイブリダイゼーション、洗浄およびオートラジオグラフィーを
、上記に記載の通りに行った。陽性クローンを単離し、そして2回目のスクリー
ニングを行った。2回目のスクリーニングの後、プラスミドをインビボ切り出し
によって切り出し、そしてドットブロッティングおよび配列決定によって試験し
た。配列決定を、Johns Hopkins University Sch
ool of MedicineのCore Facilityによって行った
。BLASTプログラムを用いて、以前に報告された遺伝子に対する類似性につ
いて、このヌクレオチド配列の、Genbank(NCBI)に対する相同性検
索を行った。全長のB7−DC cDNAクローンを、DC cDNAライブラ
リーから取り出した。5’RACEを、SMART RACE cDNA増幅キ
ット(Clontech)を用いて行った。5’−RACE産物をpCR2.1
ベクター中にクローニングし、そして配列決定した。さらに2つの全長B7−D
CクローンをRT−PCRによって入手し、そしてそれらの配列を比較して、配
列の誤りを回避した。
29)の通りのGM−CSF+IL−4またはGM−CSF+Flt−3Lのい
ずれかにおける培養によって正常末梢血単核細胞から入手した。RNAを上記の
通りに抽出した。BLAST検索は、マウスB7−DCに対する相同性を有する
、GenBank登録番号AK001879の重複するESTクローンを同定し
た。5’RACEを、上記の通りに行った。本発明者らは、5’−RACE P
CRフラグメントを配列決定し、そしてヒトB7DCの5’−UTRに対応する
プライマーを設計した。B7−DCの5’−UTRおよび3’−UTRにおける
以下のプライマーを用いて、全長ヒトB7−DCを増幅した:
GenBank/DDBSに登録番号AF329193およびAF142780
の下で寄託された。
グおよびマッピング) BACライブラリーのスクリーニングは、製造業者(Genome Syst
ems,Inc.)のプロトコルに従った。以下のプライマーを用いた:
た。染色体位置決定マッピングを、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション(
Genome Systems Inc.)によって行った。合計80個の分裂
中期細胞を分析し、79個が特異的標識を示した。ヒトB7−DCマッピングを
、入手可能なバイオインフォーマティックツールであるNCBIのBLASTプ
ログラムおよびInternational RH Mapping Cons
ortiumを用いることによって行った。hB7−DCの配列をhtsgにお
いて検索し、そして第9染色体に局在する2つのBACクローンRP11−57
4F11(AL162253)およびRp11−635N21(AL35474
4)にマッピングされることが見い出された。
調製のために用いた。組織、選別されたDCおよび活性化されたマクロファージ
についてのRNA抽出およびSMART cDNA合成を、上記の通りに行った
。SMART PCR cDNAを、PCR精製キット(Qiagen)によっ
て精製した。0.5μg/レーンの精製DNAを1%アガロースゲルに泳動し、
そしてNytranナイロンメンブレン(Schleier and Schu
ell)に移した。放射性プローブを作製するために、本発明者らは、差引きし
たライブラリーから誘導されたプラスミドDNAをテンプレートとして増幅した
。本発明者らは、プラスミドDNAのクローニング部位にすぐ隣接したプライマ
ーセットを用いるPCRによってDNAを増幅し、そしてクローンの各々の精製
したPCR DNAをハイブリダイゼーションプローブのために用いた。これら
のプライマーのヌクレオチド配列は以下の通りである。
た。用いたプローブおよびRNA調製は、上に記載された。プローブの放射性標
識、ハイブリダイゼーション、洗浄およびオートラジオグラフィーを、上記の通
りに行った。
−DCの安定なトランスフェクタントを用いて、Armenian Hamst
erを免疫した。B7−DCを、改変したpCAGGSベクター(30)中にク
ローニングした。このハムスターを、B7−DC(Rockland)を含むプ
ラスミドで3回追加免疫した。この研究において用いた抗B7−DC抗体は、免
疫した3匹のハムスターのうちの1匹の血清由来であった。
L)を用いてB7.1−pCAGGS、B7−DC−pCAGG、PD−1−p
CAGGSまたはベクター単独でトランスフェクトした。24時間後、細胞をF
ACS緩衝液(1×HBSS、2%仔ウシ血清、10M HEPESおよび0.
1% NaN3)中に再懸濁し、そして1000rpmで5分間、4℃で回転さ
せた。次いで、この緩衝液を棄て、抗体をチューブに添加し、4℃で20分間イ
ンキュベートし、FACS緩衝液で2回洗浄し、そしてこれを二次抗体について
繰り返した。サンプルをFACScanに泳動した。B7.1抗体を、1:5希
釈、10μl/サンプル(Gal−Tag)で用いた。組換えCD28−Ig、
CTLA−4−IgおよびPD−1−Igキメラを、2μg/ml、10μl/
サンプル(R&D System,Inc)で用いた。ヤギF(ab’)2抗ヒ
トIgG−PEを、1:20希釈(Southern Biotechnolo
gy Associates,Inc.)で用いた。
ミノ酸をコードする配列を、pIg−Tail Plusベクター(R&D s
ystems)中のヒトIgG1 FcのC末端アミノ酸をコードする配列に対
してインフレームで融合することによって作製した。COS−7細胞を、Lip
ofectAMINE 2000(GIBCO BRL)またはGINE JA
MMER(Stratagene)を用いてpIg/B7−DCで一過性にトラ
ンスフェクトした。B7−DC−Ig融合タンパク質を、飽和硫酸アンモニウム
沈澱を用いて無血清上清から精製した。SDS−PAGEおよび銀染色は、90
%を超える純度を実証した。
nex製のImmulon 4)を、1×PBS(Gibco)pH7.4中に
希釈した100ng/mlの抗CD3抗体(2C11,Pharmingen)
およびB7.1−Ig(R&D System)、B7−DC−IgまたはIs
otypeコントロール(Sigma)で37℃で2時間にわたって予めコーテ
ィングした。次いで、これらのプレートを1×PBSで3回洗浄し、そして10
% FCS、ペニシリン/ストレプトマイシン、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナ
トリウム、Lグルタミン、2−メルカプトエタノールを補充したRPMI164
0培地で30分間にわたってブロッキングし、その後、T細胞を添加した。脾臓
およびリンパ節を、6〜10週齢のBALB/cマウスから入手した。RBCを
ACK緩衝液を用いて溶解し、そしてT細胞を、間接的方法で、ダイナビーズ(
dynabeads)M−280(Dynex)を用いて精製した。このビーズ
をPBS(pH7.4)+1% FCSで2回洗浄し、その後、この細胞を添加
し、そして抗IEdおよびB220/CD45ROまたはCD8α(Pharm
ingen)から構成される抗体カクテルを、この細胞に添加し、そして4℃で
30分間にわたって二方向性混合を用いてインキュベートした。この細胞を、D
ynal MPC中のチューブに5分間配置することによって単離し、1500
rpmで5分間遠心分離し、そしてPBS(pH7.4)+1% FCSで2回
洗浄して未結合のAbを除去した。同じ手順を15分間のインキュベーションを
用いて繰り返し、そしてこの細胞を2×105細胞/ウェルでプレーティングし
た。72時間のインキュベーション後、10μlの3H−チミジン(1μCi/
ウェル)を各ウェルに添加し、そして18時間にわたってインキュベートした。
細胞をPackard Micromate Cell Harvesterを
用いて収集し、そしてフィルターをPackard Matrix 96直接β
計数管で読み取った。
、RENCA細胞を、10% FCS、ペニシリン/ストレプトマイシン、非必
須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウムを補充したRPMI−1640培地で培養し
た。これを、MHCクラスII発現について、IFN−γ(75U/ml)を用
いて72時間にわたって誘導した。次いで、これらを13,200Radで照射
し、そして2×104細胞/ウェル(96ウェル平底プレート)でプレーティン
グした。次いで、HA110−120ペプチドを2.5μg/ウェルで添加し、
そして種々の濃度のIg−融合分子を添加した。トランスジェニックI−Ed+
HA特異的T細胞(H.von Boehmer,Harvard Unive
rsityの親切な贈与物)を上記の通りに単離し、そして4×105細胞/ウ
ェルでプレーティングした。48時間のインキュベーション後、10μlの3H
チミジン(1μCi/ウェル)を各ウェルに添加し、そして18時間にわたって
インキュベートした。細胞を、Packard Micromate Cell
Harvesterを用いて収集し、そしてフィルターをPackard M
atrix 96 Directβ計数管で読み取った。
定し、そして上清を指定の時間で収集した。IL−2、IL−10およびIFN
−γの濃度を、市販のELISAキット(Endogen)ならびにIL−4お
よびIL−6(R&D System)を用いて決定した。
TCRトランスジェニックマウス系統6.5由来のプールされた腋窩、鼡径、頚
部、および腸間膜のLNを、RPMI培地(GIBCO BRL)中で解離し、
100μmのナイロン細胞ストレイナーを通過させ、そして滅菌ハンクス緩衝液
(GIBCO BRL)中で洗浄した。FACS(登録商標)染色して、クロー
ン型(clonotypic)CD4細胞の割合を決定した後、0.2mlの滅
菌ハンクス緩衝液中に2.5×106クローン型細胞を含む細胞調製物を、レシ
ピエントB10.D2マウスの尾静脈に静脈内(i.v.)注射した。この養子
移入から3日後、この動物を、後足蹠(footpad)に皮下(s.c.)注
射することによりワクチン接種した。各マウスに、以下の3つの調製物のうちの
1つを両側に注射した: (A)10μgの合成HA(足蹠1つにつき)(HAペプチド(110−120
)を1:1のv/v比で不完全フロイントアジュバント(IFA)(Sigma
)と合わせた) (B)HA−IFAと25μgのB7−DC−Igとの混合物、または (C)HA−IFAと25μgのアイソタイプコントロール抗体との混合物。7
日後、排出LN節を採取し;1.5×105LN細胞を丸底96ウェル組織培養
プレート中で示された濃度の合成HAペプチドとともにインキュベートした。4
8時間培養物を1μCi[3H]チミジンでパルスし、そしてさらに12時間イ
ンキュベートした後採取し、そして組み込まれた放射活性の量を決定することに
より増殖アッセイを行った。
単離した。cDNA差引きに用いた2つの集団は、「テスター」集団としてのG
M−CSFと培養した骨髄由来DC、および「ドライバー」集団としてのγ−イ
ンターフェロン+LPS活性化した接着性骨髄由来M−CSFマクロファージで
あった。8日目に、MHCクラスIIhiB7hi「成熟」DCを、テスターc
DNAの供給源として、>93%純度までソートした。DCを、フローサイトメ
トリーにより、マクロファージより約50倍MHCクラスIIレベルが高いと特
徴付けた。両方の集団がB7.1およびB7.2を発現したが、B7.2レベル
はDCにおいて有意に高かった。F4/80およびCD16は、マクロファージ
集団で高レベルで発現された。2つの集団の機能的比較により、DC集団は、同
種異系の混合したリンパ球反応を刺激することにおいてマクロファージ集団より
約100倍強力であることが実証された。両方の集団からRNAを抽出した後、
本発明者らは、PCRベースのcDNA合成システム、続いてPCRベースの差
引き手順であるPCR Selectを用いた。差示的に発現されるクローンの
うちの1つが、新規な免疫グロブリンスーパー遺伝子ファミリーのメンバー(本
発明者らは、これをB7−DCと名付けた)をコードした。マウスB7−DC
cDNAは、長さが約1.7kbであり、これは、23アミノ酸(aa)のN末
端シグナルペプチドを有し、そして推定分子量が約25kdの247アミノ酸(
aa)の前駆体タンパク質をコードする(表1)。推定リーダー配列および膜貫
通ドメインを、SOSUIプログラム(31)を用いて同定した。2つの荷電a
aは、mB7−DCの23aa膜貫通ドメイン内に見出される。このことは、あ
り得る結合パートナーを示唆する。aaレベルで、マウスB7−DCは、ヒトB
7−DCと70%同一であり、このことは、それらがオルソログであることを示
す(以下の表を参照のこと)。hB7−DCは、より長い細胞質テイルを有する
という点で、マウスB7−DCとはわずかに異なる。
34%同一性、48%類似性)(表2)、より低い程度には、ブチロフィリン(
butyrophilin)に対して(30%同一性、45%類似性)、そして
B7.1およびB7.2に対して20%未満の同一性を有することが見出された
(表3)。系統発生的な研究により、エキソンシャッフリング(32,33)を
介して、ブチロフィリンがB7スーパーファミリーに関連する可能性が高いこと
が示される。これらは、各々、標準的な(canonical)IgV−IgC
構造および膜貫通ドメインを有する。他のB7ファミリーのメンバーとは対照的
に、マウスB7−DCは、非常に短い細胞質テイル(4aa)を有する。
推定リーダードメインおよび膜貫通ドメインは、上に線を引いた。アラインメン
トは、Clustalw−Gonnet Pam250マトリクスを用いて行っ
た。[*]は、同一アミノ酸を示し、[:]は、保存的置換を示す。免疫グロブ
リンVまたはCドメイン内部のジスルフィド結合の形式に重要であり得るシステ
イン残基は、斜体にされている。
2)。 1.対応する位置での同一アミノ酸 2.対応する位置での類似アミノ酸−以下のようにグループ分けされる:(A,
G);(S,T);(E,D);(R,K,H);(Q,N);(V,I,L,
M);(Y,F);(W);(C);(P)。 3.マトリクスBLOSUM62を用いて有意な類似性は見出されなかった。 4.BT=ブチロフィリン 5.=PDL−1。
UTRに由来するプローブを用いてプールされたBacterial Arti
ficial Chromosome(BAC)ライブラリーをスクリーニング
することによりゲノムクローンを単離した。染色体位置のマッピングを、BAC
クローンを用いて行った。B7−DCの染色体位置は、蛍光インサイチュハイブ
リダイゼーション(FISH)を用いて行った。10の特異的に染色した第19
染色体の測定により、mB7−DCが、第19染色体の異質染色質−真性染色質
境界からテロメアまでの距離(19C2と19C3のバンドの間の境界に対応す
る領域)の47%である位置に位置することが実証された。ハイブリダイズした
スライドをフルオレセイン化抗ジゴキシゲニン抗体中でインキュベートし、続い
てDAPIで対比染色することにより、特異的ハイブリダイゼーションシグナル
を検出した。この遺伝子座は、ヒト第9染色体の領域に対応し、この領域におい
てhB7−H1がマッピングされている。
た。さらに、hB7−DCおよびhB7−H1はともに、約164kbの挿入物
サイズを有する、単一の第9染色体のBACクローンに位置することが見出され
た(図1)。B7−DCおよびB7−H1がゲノム上で近位にあることは、B7
.1/B7.2対を暗示し、この対は、互いに1メガ塩基以内にマッピングされ
る。
胞株、マクロファージ培養物、ならびに骨髄および脾臓の両方から得られた樹上
細胞から抽出したRNAを用いて、事実上のノザンブロッティングを行った。未
熟(4日目および6日目)および成熟(8日目およびソートされたMHC IIhi B7hi)の骨髄由来DCおよび脾臓由来DCにおいてB7−DCプローブ
を用いて強いハイブリダイゼーションが検出されたが、4つのマクロファージ細
胞株、活性化BMマクロファージ、腹膜マクロファージのいずれにおいてもシグ
ナルは検出されなかった(図2)。GM−CSF+IL−4またはGM−CSF
+Flt−3Lのいずれかを用いて末梢血単球から増殖させたヒトDCにおいて
hB7−DCの強い発現が検出された(図3)。B7−DCタンパク質の細胞表
面発現を確認するために、抗mB7−DC抗体を用いて、DCを染色した。可溶
性B7−DC−Igを用いた染色および遮断が、DCで観察された(図4)。
結合する) B7−DCはB7ファミリーに対して構造的相同性および配列相同性を有する
が、推定CD28/CTLA−4結合配列、SQDXXXELY(配列番号13
)も、XXXYXXRT(配列番号14)も含まない(34)(ここで、X=任
意のアミノ酸)。結合を直接評価するために、2量体CD28−IgおよびCT
LA−4−Igが、B7−DCまたはB7.1のいずれかでトランスフェクトさ
れた293T細胞を染色する能力を調査した。B7.1トランスフェクタントで
強い結合が観察された一方、B7−DCトランスフェクタントに対する結合は観
察されなかった(図5)。B7−DCとB7−H1/PD−L1との間の相同性
およびゲノム上で近位であることに基づいて、B7−DCについての候補結合パ
ートナーとしてPD−1を試験するために実験を行った。実際に、PD−100
IGは、B7−DCトランスフェクタントに結合したが、B7.1トランスフェ
クタントには結合しなかった。PD−1−IgのB7−DCトランスフェクタン
トへの結合は、CTLA−IgおよびCD28−IgのB7.1トランスフェク
タントへの結合より低かったが、特異的であった。PD−1のB7−DCへの結
合のさらなる確認を、本発明者らは、PD−1−Igとの安定なB7−DC−G
FPトランスフェクタントのポジティブな染色から得た。B7−H1およびB7
h/B7RP−1と同様に、B7−DCは、レセプターとしてCD28もCTL
A−4も用いないことが結論付けられた。むしろ、PD−1は、B7−DCにつ
いてのレセプターであるようである。
) T細胞刺激アッセイに添加され得る可溶性B7−DC−Ig融合タンパク質を
、B7−DCが補助刺激活性を有するか否かを試験することにおける使用のため
に生成した。T細胞の増殖応答を、B7−DC−Ig、B7.1−Igまたはア
イソタイプコントロールいずれかの存在下で、漸増量の固定化抗CD3による刺
激に対して測定した。図6(左)は、最適未満の抗CD3濃度の存在下で、B7
−DCがB7.1より大きなT細胞増殖応答を補助刺激したことを示す。さらに
、B7−DCにより補助刺激された増殖応答は、CD8細胞よりCD4細胞にお
いて高かった(図6、右)。B7−DCは、TCRに集中した刺激がない場合に
はT細胞を刺激できなかった。このことは、B7−DCが、真の補助刺激シグナ
ルを提供することを示す。
場合に増殖応答を補助刺激した。RENCA細胞(RT−PCR分析により内因
性B7.1、B7.2、またはB7−DCを発現しない)を、γ−IFNで処理
して、MHCクラスII発現を誘導した。これらの細胞に、I−Ed拘束HA1
10−120ペプチド(FERFEIFPKE)(35)(配列番号15)を負
荷した。I−Ed+HA110−120特異的TCRトランスジェニックマウス
系統から精製した脾臓T細胞を添加し、そして増殖応答をB7−DC−Ig、B
7.1−Igまたはアイソタイプコントロールいずれかの存在下で測定した。図
7は、B7−DCがB7.1より大きな補助刺激活性を有したことを示す。
答は、リンホカイン生成である。これらのリンホカインは、T細胞効果の重要な
メディエーターである。抗CD3またはHA抗原で刺激し、B7−DC−Ig、
B7.1−Igまたはアイソタイプコントロールいずれかで補助刺激したT細胞
による多くの異なるリンホカイン生成を分析するための研究を行った(図8)。
リンホカイン補助刺激のパターンは、抗CD3またはMHCペプチド複合体が「
シグナル1」として利用されるか否かとかなり一致した。重大なことには、B7
−DCは、B7.1より大きなレベルのγ−IFNを補助刺激した。B7−DC
はまた、有意な量のIL−6生成を補助刺激したのに対し、B7.1は、実質的
に補助刺激しなかった。両方の分子が、IL−2生成を補助刺激したが、B7.
1は、B7−DCより非常に効率的に刺激した。従って、B7−DCおよびB7
.1の補助刺激のパターンは異なり、B7−DCは重要な前炎症性リンホカイン
を補助刺激することにおいて効率的である。
明者らは、B7−DC−Igがペプチドワクチンに対する免疫応答を増強するか
否かを調べた。B7−DC−Igまたはアイソタイプコントロール抗体を、HA
110−120ペプチドおよびIFAの免疫原性カクテルに添加した。HA特異
的CD4T細胞のインビボでの計数を可能にするために、2.5×106抗HA
6.5T細胞を免疫の3日前にマウスに移入した。免疫して7日後、排出LN細
胞を採取し、そしてこの細胞をインビトロで2日間、種々の量のHA110−1
20ペプチドで刺激した。図9は、B7−DC−Igの添加が、実際にHAに対
する増殖応答を劇的に増強したことを示す。排出LNにおけるHA特異的T細胞
の総数は、アイソタイプ抗体コントロールに対して、B7−DC−Igを受けた
群において約2倍増加した。従って、B7−DCが1細胞あたりですら抗原特異
的応答を増強する能力を有することが結論付けられた。
助刺激特性を有する新たなB7ファミリーメンバーを発見し、そして特徴づけた
。B7−DCのヒトオルソログもまた、DCにおいて発現される。
照をなし、このことは、B7−DCが、公知のB7.1/2経路とは異なる免疫
応答に関与することを示唆する。弱いB7−DCシグナルが、活性化マクロファ
ージにおいてRT−PCRにより検出されたが、予備のリアルタイムRT−PC
R分析により、DCにおけるB7−DC mRNA発現が、活性化マクロファー
ジより15倍高いことが示された。同様に、抗体染色により、活性化マクロファ
ージの表面で非常に低いレベルのB7−DCが検出された。このことが、有意な
T細胞活性化に十分か否かは明瞭ではない。
ァミリーメンバーと比較して、独特の生物学的役割を示す。サイトカインの伝統
的な分類は、以下のとおりである:Th1サイトカインは、IL−2、γ−IF
Nおよびリンホトキシンを含む;Th2サイトカインは、IL−4、IL−5、
IL−6およびIL−13を含む(36)。B7−DCは、いずれの古典的なT
h1リンホカインプロフィールもTh2リンホカインプロフィールも誘導しない
。B7−DCは、非常にわずかなIL−4を誘導し、IL−10を誘導しない。
しかし、IL−6は、Th2サイトカインと考えられる。B7.1に対して、B
7−DCにより補助刺激されたより低いIL−2およびより高いγ−IFNは、
古典的なTh1パターンに合わない。にもかかわらず、高いγ−IFN生成は、
B7−DCが重要なT細胞エフェクター機能を誘起することを示唆する。
り誘導されたT細胞の活発な増殖性応答は、B7.1では観察されないIL−6
生成の強い補助刺激により一部説明される。IL−6は、(他の増殖刺激と関連
して)T細胞増殖の強力な増幅因子(amplifier)である(37,38
)。IL−6は、T細胞機能のみならず、前炎症性応答、単球分化、B細胞分化
、血小板新生、骨の吸収、および特定の造血性腫瘍の増殖もまた調節する多機能
性サイトカインである(39,40)。IL−6は、ケモカインおよび白血球動
員の誘導において、可溶性IL6レセプター(sIL−6R)と協同して機能し
得る(41)。これは、Stat−3活性化を介して強力な抗アポトーシス効果
を媒介し得る。T細胞におけるIL−6依存性Stat−3活性化は、活性化T
細胞の生存についての重要な経路であると報告されている(42,43)が、他
の報告では、Stat−3が休止T細胞に対してその効果を発揮することが示唆
されている。
H1/PD−L1についてのレセプター)を結合する(22,47,48)。B
7−DCが、ICOS(B7h/B7RP−1についてのレセプター)を結合す
るか否かは未だ決定されていない(23−25,44−46)。B7−DCとB
7−H1/PDL−1との間の顕著な相同性(B7.1とB7.2との間の相同
性より大きい)、hB7−H1/PD−L1とhB7−DCとの密接な物理的連
鎖、およびそれらの共通するレセプターへの結合により、これらが比較的最近の
遺伝子重複事象に関連することが示唆される。このことは、B7.1とB7.2
との間の関係と同様であり、B7.1およびB7.2の両方が、マウス第16染
色体およびヒト第3染色体上の1メガ塩基内にマッピングする(49)。
1および他の推定レセプターにより媒介されると認識することは重要である。P
D−1は、T細胞活性化に続いて発現され、そしてT細胞活性化を阻害するよう
である。PD−1は、高濃度の抗CD−3でのT細胞刺激条件下でアポトーシス
を誘導する。PD−1ノックアウトマウスは、肥大型心筋症の臨床的発現により
特徴付けられる自己免疫症候群を発症する(22)。対照的に、Dongら(2
1)は、B7−H1/PD−L1が、低濃度の抗CD−3でT細胞増殖およびサ
イトカイン増殖を補助刺激することを報告した。CD28/CTLA−4の関係
に類推して、PD−L1は、未だ同定されていない活性化レセプターについての
対レセプター(counterreceptor)であり得る。PD−1に結合
するという特性を共有しているにもかかわらず、B7−DCおよびB7−H1は
、それらのリンホカイン補助刺激パターンが異なる;B7−H1は、T細胞のI
L−10生成を補助刺激するのに対し、B7−DCはIL−10生成を補助刺激
しない。B7−DCの異なる細胞発現パターンおよび補助刺激機能は、免疫機能
における独特の役割を示唆する。
否かにかかわらず、全て本明細書中に参考として援用される。
濃度、および条件の範囲内で、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、
そして過度な実験なくして実施され得ることは当業者に明らかである。
が行われ得ることは理解される。本出願は、概して、本発明の原理に従って、そ
して本発明が属する分野において公知または慣用的な実施の範囲内であり、およ
び添付の特許請求の範囲の範囲に入るように本明細書中で先に記載された本質的
特徴に適用され得る、本開示からのこのような逸脱を含む、本発明の任意のバリ
エーション、使用または適合を含むことが意図される。
列挙(挿入)され、以下に列挙される。
グラムである。hB7−DCは、BACクローンRPCI−11.2にマッピン
グされる。
とを示す。骨髄DC、脾性DC、マクロファージ、マクロファージ株および組織
におけるB7−DC mRNAの分布を、0.5μg/レーンの精製したDNA
を使用して、1%アガロースゲルで泳動する、バーチャルノーザンブロット分析
によって評価した。G3PDHを、コントロールとして使用した。J774A1
細胞、Raw264.7細胞、Pu5−1.8細胞およびWEHI細胞は、マク
ロファージ細胞株である。BM:骨髄。
す。レーン1は、GM−CSFおよびFlt−3Lと共に培養されたヒトDCを
示し、レーン2は、ヒト胎盤を示し、そしてレーン3は、GM−CSFおよびI
L4と共に培養されたヒトDCを示す。ヒトB7−DCの5’および3’UTR
由来のオリゴヌクレオチドを使用して、ヒトDCの全RNAのバーチャルノーザ
ン分析のためのPCR DNAプローブを作製した。β−アクチンをコントロー
ルとして使用して、mRNAの品質を確認した。
メトリー分析を代表する。9日目に、マウスBM−DCをFcブロックし、そし
てコントロール抗体またはB7−DC抗血清を用いて染色した。結合の特異性を
、DCの表面への抗B7−DCの結合に対して競合するためのB7−DC−Ig
を添加することによって、実証した。
結合しないことを示す。293T細胞を、pCAGGS−B7.1 o pCA
GGS−B7−DCを用いて、一時的にトランスフェクトした。トランスフェク
ト体を、PD−1−Ig融合分子、28−Ig融合分子およびCTLA−4−I
g融合分子で染色し、続いてPE標識した二次抗体で染色した。pCAGGS(
空のベクター)トランスフェクト体の染色は、ネガティブであった(示さず)。
の補助刺激を示す。左側のグラフ:精製T細胞(CD4+CD8)を、次第に増
加する濃度の抗CD3(mAb 2C11)および一定濃度(0.1μg/ml
)の固定したB7.1−Ig(黒菱形)、B7−DC−Ig(黒丸)またはアイ
ソタイプコントロール(黒三角)で予めコートしたウェル内で培養した。結果は
、3つのうちの1つの代表的な実験を示す。細胞を、72時間インキュベートし
、そして3H−チミジンで標識した。CPMとは、1分間あたりの計数である。
右側のグラフ:精製CD8 T細胞を、次第に増加する濃度の抗CD3および一
定濃度の固定したB7.1−Ig(黒菱形)、B7−DC−Ig(黒丸)または
アイソタイプコントロール(黒三角)で(a)においてと同様に予めコートした
ウェル内で、培養した。結果は、2つのうちの1つの代表的な実験のものである
。細胞を72時間インキュベートし、そして3H−チミジンで標識した。CPM
とは、1分間あたりの計数である。
Nγで72時間処理して、MHCクラスIIの発現を誘導し、そして12.5μ
g/mlのHA110−120ペプチドとともにインキュベートした。精製した
HAおよびI−Ed特異的トランスジェニックT細胞を、次第に増加する濃度の
B7.1−Ig(黒菱形)、B7−DC−Ig(黒丸)またはアイソタイプコン
トロール(黒三角)のいずれかと共に、可溶化形態で添加した。細胞を48時間
インキュベートし、そして3H−チミジンで標識した。CPMとは、1分間あた
りの計数である。結果は、3つのうちの1つの代表的な実験である。
。 上のパネル:精製したT細胞を、抗CD3(0.12μg/ml)および0.1
μg/mlの固定化B7.1−Ig(黒菱形)、B7−DC−Ig(黒丸)また
はアイソタイプコントロール(黒三角)で、図6(左)と同様に予めコートした
ウェル内で培養した。結果は、3つのうちの1つの代表的な実験を示す。 下のパネル:12.5μg/ml HA(110−120)ペプチドで負荷した
γ−IFN処理したRENCA細胞を、精製したHAおよびI−Ed特異的トラ
ンスジェニックT細胞と共に、2μg/mlの可溶性B7.1−Ig、B7−D
C−Igまたはアイソタイプコントロール(記号は上記のとおり)と一緒にイン
キュベートした。結果は、2つのうちの1つの代表的な実験を示す。上清を、2
4時間および48時間の培養の後に収集し、そしてELISAを使用して、示さ
れるリンホカインについてアッセイした。
いに増強することを示す。HAに対して特異的な2.5×106のTCRトラン
スジェニック細胞の養子移入の後に、3群のマウスを、HAペプチド(110−
120)、不完全フロイントアジュバント(IFA)のいずれかで、単独でかま
たはB7−DC−IgおよびIFAまたはIFAを含むアイソタイプコントロー
ル抗体のいずれかとの組合せで、後肢裏において皮下で免疫した。リンパ節の排
液を、7日目に獲得した。1.5×105のLN細胞を、HAペプチドと共に4
8時間インキュベートし、1μCi[3H]チミジンでパルス化し、そして12
時間後に組み込んだ放射能を、決定した。
Claims (68)
- 【請求項1】 B7−DCと称される哺乳動物タンパク質をコードする単離
された核酸分子であって、該タンパク質は、活性化したマクロファージと比較し
て樹状細胞上に選択的に発現される、核酸分子。 - 【請求項2】 配列番号1または配列番号5より選択されるヌクレオチド配
列を含む、請求項1に記載の核酸分子。 - 【請求項3】 ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、請求
項1または2に記載の核酸分子とハイブリダイズする、単離された核酸分子。 - 【請求項4】 配列番号1のヌクレオチド配列を含む、請求項2に記載の核
酸分子。 - 【請求項5】 請求項1〜4のいずれか1項に記載の核酸分子であって、該
核酸分子は、配列番号2および配列番号4より選択されるアミノ酸配列を有する
タンパク質をコードするか、または該タンパク質の生物学的に活性なフラグメン
ト、ホモログもしくは他の機能的誘導体をコードする、核酸分子。 - 【請求項6】 請求項5に記載の核酸分子であって、該核酸分子は、配列番
号2の配列を有するタンパク質をコードするか、または配列番号2の生物学的に
活性なフラグメント、ホモログもしくは他の機能的誘導体をコードする、核酸分
子。 - 【請求項7】 前記B7−DCタンパク質の細胞外ドメインの全てまたは一
部をコードする、請求項5または6に記載の核酸分子の、フラグメント。 - 【請求項8】 B7−DC融合ポリペプチドをコードする、請求項5に記載
の核酸分子であって、該分子は、以下: (a)配列番号2または配列番号4のB7−DCタンパク質の全てまたは一部
である、第一のポリペプチドをコードする、第一の核酸配列; (b)必要に応じて、該第一の核酸配列とインフレームで融合される、リンカ
ーポリペプチドをコードする、リンカー核酸配列;および (c)該第一の核酸配列または該リンカー核酸配列にインフレームで連結され
かつ第二のポリペプチドをコードする、第二の核酸配列、 を含む、核酸分子。 - 【請求項9】 前記第二のポリペプチドがIg重鎖定常領域の1以上のドメ
インからなる、請求項8に記載の核酸分子。 - 【請求項10】 前記第二のポリペプチドがヒトIgG定常領域の2つのド
メインからなる、請求項8に記載の核酸分子。 - 【請求項11】 請求項1〜10のいずれか1項に記載の核酸を含む発現ベ
クターであって、以下: (a)プロモーター、および (b)必要に応じて、真核生物細胞において該核酸の発現を調節する、さらな
る調節配列、 に作動可能に連結された、発現ベクター。 - 【請求項12】 プラスミドである、請求項11に記載の発現ベクター。
- 【請求項13】 ウイルスベクターである、請求項11に記載の発現ベクタ
ー。 - 【請求項14】 ベクター組成物であって、以下: (a)第一の組み換え体発現ベクターであって、その核酸中に、免疫応答が誘
導される目的の抗原をコードするヌクレオチド配列が組み込まれている、ベクタ
ー;および (b)第二の組み換え体発現ベクターであって、その核酸中に、補助刺激ポリ
ペプチドをコードする1以上のヌクレオチド配列が組み込まれており、ここで、
該補助刺激ポリペプチドの少なくとも1つは、B7−DCであるか、またはその
生物学的に活性なフラグメント、ホモログもしくは他の機能的誘導体である、ベ
クター、 を含み、ここで、該発現ベクターは、抗原と、該補助刺激ポリペプチド、フラグ
メント、ホモログもしくは誘導体との同時発現を生じる宿主細胞に同時感染され
得るかまたは同時トランスフェクトされ得る、ベクター組成物。 - 【請求項15】 前記第二のベクターが配列番号1または配列番号5を含む
、請求項14に記載のベクター組成物。 - 【請求項16】 前記第二のベクターが配列番号1を含む、請求項14また
は15に記載のベクター組成物。 - 【請求項17】 請求項1〜6のいずれか1項に記載の核酸分子を用いて形
質転換またはトランスフェクトされる、細胞。 - 【請求項18】 請求項11〜16のいずれか1項に記載の発現ベクターを
用いて形質転換またはトランスフェクトされる、細胞。 - 【請求項19】 哺乳動物細胞である、請求項18に記載の細胞。
- 【請求項20】 ヒト細胞である、請求項19に記載の細胞。
- 【請求項21】 樹状細胞またはその前駆体である、請求項19に記載の細
胞。 - 【請求項22】 腫瘍細胞である、請求項19に記載の細胞。
- 【請求項23】 外因性核酸分子でトランスフェクトされた、単離された哺
乳動物腫瘍細胞であって、該核酸分子は、哺乳動物B7−DCタンパク質または
その生物学的に活性なフラグメント、ホモログもしくは他の機能的誘導体をコー
ドし、その結果、該タンパク質、フラグメント、ホモログまたは誘導体は、該腫
瘍細胞によって発現され、そして該腫瘍細胞は、T細胞と接触され、 (i)該B7−DCタンパク質、フラグメント、ホモログまたは誘導体は、該
T細胞に結合し;そして (ii)該腫瘍細胞は、該T細胞を補助刺激して増殖ならびに/またはサイト
カインを生成および分泌する、 腫瘍細胞。 - 【請求項24】 前記外因性核酸分子は、配列番号1もしくは配列番号5の
配列、または該配列のフラグメントを含む、請求項23に記載の腫瘍細胞。 - 【請求項25】 ポリペプチドであって、活性化されたマクロファージと比
較して樹状細胞上に選択的に発現されかつ以下の機能的特性: (a)T細胞上の結合パートナーに結合すること;および (b)増殖ならびに/またはサイトカインを生成および分泌するようにT細胞
を補助刺激すること、 を有する、ポリペプチド。 - 【請求項26】 配列番号1もしくは配列番号5の配列を有する核酸分子、
または該核酸分子のフラグメント、ホモログもしくは等価物によってコードされ
る、請求項25に記載のポリペプチド、フラグメント、ホモログまたは機能的誘
導体。 - 【請求項27】 請求項26に記載のポリペプチドであって、該ポリペプチ
ドは、配列番号2もしくは配列番号4のアミノ酸配列、または該ポリペプチドの
フラグメント、ホモログもしくは等価物を有する、ポリペプチド。 - 【請求項28】 請求項1〜10のいずれか1項に記載の核酸の組み換え体
発現によって生成される、ポリペプチド、または該ポリペプチドの生物学的に活
性なフラグメント、ホモログもしくは他の機能的誘導体。 - 【請求項29】 B7−DCタンパク質の細胞外ドメインを含む、請求項2
5〜28のいずれか1項に記載のポリペプチドであって、該ドメインは、配列番
号2もしくは配列番号4のアミノ酸残基26〜221、または該ドメインの補助
刺激フラグメント、ホモログもしくは他の機能的誘導体を含む、ポリペプチド。 - 【請求項30】 B7−DCの細胞外ドメインを実質的に含む、請求項25
〜28のいずれか1項に記載のポリペプチドであって、該ドメインは、配列番号
2もしくは配列番号4のアミノ酸残基26〜221、または残基26〜221の
補助刺激フラグメント、ホモログもしくは他の機能的誘導体を含む、ポリペプチ
ド。 - 【請求項31】 B7−DCタンパク質の全てまたは一部を含む第一の融合
パートナーを有する、B7−DC融合ポリペプチドであって、該B7−DCタン
パク質は: (i)第二のポリペプチドに直接融合されるか、または (ii)必要に応じて、該第二のポリペプチドに融合されるリンカーペプチド
配列に融合される、 B7−DC融合ポリペプチド。 - 【請求項32】 第二のポリペプチドに融合される請求項25〜30のいず
れか1項に記載のポリペプチドを含む、B7−DC融合ポリペプチド。 - 【請求項33】 請求項32に記載の融合ポリペプチドであって、T細胞上
の結合パートナー分子に結合し、そしてT細胞レセプターに対する十分な刺激の
存在下で該T細胞を補助刺激する、融合ポリペプチド。 - 【請求項34】 前記結合パートナー分子がPD−1である、請求項33に
記載の融合ポリペプチド。 - 【請求項35】 前記第二のポリペプチドがIg重鎖定常領域の1以上のド
メインである、請求項31〜33のいずれか1項に記載の融合ポリペプチド。 - 【請求項36】 請求項31〜35のいずれか1項に記載の融合ポリペプチ
ドであって、前記第一の融合パートナーは、配列番号2もしくは配列番号4のア
ミノ酸26〜221、またはその補助刺激フラグメント、ホモログもしくは他の
機能的誘導体を含む、融合ポリペプチド。 - 【請求項37】 請求項36に記載の融合ポリペプチドであって、前記第一
の融合パートナーは、配列番号2のアミノ酸26〜221、またはその補助刺激
フラグメント、ホモログもしくは他の機能的誘導体を含む、融合ポリペプチド。 - 【請求項38】 ヒト免疫グロブリンCγ1鎖のヒンジ領域、CH2領域お
よびCH3領域に対応するアミノ酸配列を有する、請求項35に記載の融合ポリ
ペプチド。 - 【請求項39】 請求項31〜38のいずれか1項に記載の融合ポリペプチ
ドの直列に連結されたダイマーまたはトリマーである、ダイマー融合ポリペプチ
ドまたはトリマー融合ポリペプチド。 - 【請求項40】 末端と末端とで、直接にか、または前記モノマーの反復の
間に存在するリンカー配列を有して連結された、前記第一の融合パートナーのモ
ノマーが2以上反復する直鎖状マルチマーを含む、請求項31〜38のいずれか
1項に記載の融合ポリペプチド。 - 【請求項41】 B7−DCタンパク質のエピトープに特異的である抗体で
あって、該エピトープは、B7ファミリータンパク質の既知のメンバー中には存
在しない、抗体。 - 【請求項42】 前記エピトープは、配列番号2または配列番号4のポリペ
プチドの線状エピトープまたは立体的エピトープである、請求項41に記載の抗
体。 - 【請求項43】 前記エピトープは、配列番号2のポリペプチドの線状エピ
トープまたは立体的エピトープである、請求項42に記載の抗体。 - 【請求項44】 モノクローナル抗体である、請求項41または42に記載
の抗体。 - 【請求項45】 ヒトモノクローナル抗体またはヒト化モノクローナル抗体
である、請求項43に記載の抗体。 - 【請求項46】 細胞集団中の、その表面上にB7−DCポリペプチドを発
現する細胞を同定または定量化する方法であって、該方法は、以下の工程: (a)該集団の細胞を、請求項41〜45のいずれか1項に記載の抗体と接触
させて、その結果、該抗体が該エピトープを発現する細胞に結合する、工程;お
よび (b)該抗体が結合する細胞の存在を評価する工程、または該抗体が結合する
細胞の数を定量化する工程、 を包含する、方法。 - 【請求項47】 その表面上にB7−DCポリペプチドを発現する細胞を細
胞集団から単離する方法であって、該方法は、以下の工程: (a)該集団の細胞を、請求項41〜45のいずれか1項に記載の抗体と接触
させて、その結果、該抗体が該エピトープを発現する細胞に結合する、工程; (b)該抗体が結合している細胞をポジティブに選択する工程、または該抗体
が結合していない細胞をネガティブに選択する工程、 を包含し、これにより該細胞を単離する、方法。 - 【請求項48】 サンプル中の、B7−DCポリペプチド、フラグメントも
しくはホモログの存在を検出するか、またはB7−DCポリペプチド、フラグメ
ントもしくはホモログを定量化する方法であって、該方法は、以下の工程: (a)該サンプルを、請求項41〜45のいずれか1項に記載の抗体と接触さ
せて、その結果、該抗体が該エピトープを保有する任意のポリペプチドまたはフ
ラグメントに結合する、工程;および (b)該抗体に結合する該ポリペプチドもしくはフラグメントの存在を検出す
る工程、または該抗体に結合する該ポリペプチドもしくはフラグメントを定量化
する工程、 を包含する、方法。 - 【請求項49】 T細胞レセプターに対する十分な刺激の存在下にて、イン
ビトロまたはインビボでT細胞を補助刺激する抗原提示細胞またはその前駆体の
能力を増加するために、該抗原提示細胞またはその前駆体中にB7−DCポリペ
プチドの発現を誘導するかまたは増加する方法であって、該方法は、該抗原提示
細胞またはその前駆体細胞を請求項11〜13のいずれか1項に記載の発現ベク
ターを用いて形質転換またはトランスフェクトし、その結果、該B7−DCポリ
ペプチドの発現が該細胞上で誘導または増加される工程を包含する、方法。 - 【請求項50】 T細胞レセプターに対する十分な刺激の存在下にて、イン
ビトロまたはインビボでT細胞を補助刺激する抗原提示細胞またはその前駆体の
能力を増加するために、該抗原提示細胞またはその前駆体中にB7−DCポリペ
プチドの発現を誘導するかまたは増加する方法であって、該方法は、該抗原提示
細胞またはその前駆体細胞を請求項11〜13のいずれか1項に記載の発現ベク
ターを用いて形質転換またはトランスフェクトし、その結果、該B7−DCポリ
ペプチドの発現が該細胞上で誘導または増加される工程を包含する、方法。 - 【請求項51】 前記抗原提示細胞は樹状細胞であり、そして前記前駆体は
樹状細胞前駆体である、請求項49または50に記載の方法。 - 【請求項52】 抗原性刺激に対する哺乳動物被験体のT細胞応答を増加す
る方法であって、該方法は、請求項17〜24にいずれか1項に記載の、有効量
の細胞を、抗原とともに該被験体に投与する工程を包含し、ここで、該細胞は、
該抗原性刺激に対する該被験体のT細胞応答を増加するために効果的である、方
法。 - 【請求項53】 腫瘍関連抗原を用いる抗原性刺激に対する哺乳動物被験体
のT細胞応答を増加する方法であって、該方法は、請求項22〜24にいずれか
1項に記載の、有効量の腫瘍細胞を、該被験体に投与する工程を包含し、ここで
、該腫瘍細胞は、該抗原を発現し、該腫瘍細胞の投与は、該腫瘍抗原刺激に対す
る該被験体のT細胞応答を増加するために効果的である、方法。 - 【請求項54】 抗原性刺激に対する哺乳動物被験体のT細胞応答を増加す
る方法であって、該方法は、請求項25〜30にいずれか1項に記載の、有効量
のポリペプチド、フラグメント、ホモログまたは機能的誘導体を、抗原とともに
該被験体に投与する工程を包含し、ここで、該ポリペプチドの投与は、該抗原性
刺激に対する該被験体のT細胞応答を増加するために効果的である、方法。 - 【請求項55】 抗原性刺激に対する哺乳動物被験体のT細胞応答を増加す
る方法であって、該方法は、請求項31〜40にいずれか1項に記載の、有効量
の融合ポリペプチドを、抗原とともに該被験体に投与する工程を包含し、ここで
、該ポリペプチドの投与は、該抗原性刺激に対する該被験体のT細胞応答を増加
するために効果的である、方法。 - 【請求項56】 抗原性刺激に対する哺乳動物被験体のT細胞応答を阻害す
る方法であって、該方法は、請求項41〜45にいずれか1項に記載の、有効量
の抗体を、該被験体に投与する工程を包含し、ここで、該抗体の投与は、T細胞
の刺激をブロックするかまたは抗原反応性T細胞を排除して、それによりT細胞
応答を阻害するために効果的である、方法。 - 【請求項57】 前記T細胞応答は、組織移植物または自己抗原に対して指
向され、その結果、移植物拒絶または自己免疫反応を阻害する、請求項56に記
載の方法。 - 【請求項58】 抗原性刺激に対する哺乳動物被験体の免疫応答を増加する
方法であって、該方法は、以下の工程: (a)(i)該被験体、(ii)該被験体に対して免疫学的に適合可能なドナ
ー、または(iii)免疫学的に適合可能であるかまたは受容可能な培養された
細胞株、よりT細胞を得る工程; (b)該T細胞を、請求項17〜24のいずれか1項に記載の、有効量の細胞
とエキソビボで接触させる工程であって、ここで、該接触させる工程は、抗原性
刺激に対する該T細胞の応答を増加するために効果的である、工程;および (c)該被験体に工程(b)の該T細胞を投与する工程、 を包含し、これにより、該被験体の該免疫応答を増加する、方法。 - 【請求項59】 抗原性刺激に対する哺乳動物被験体の免疫応答を増加する
方法であって、該方法は、以下の工程: (a)(i)該被験体、(ii)該被験体に対して免疫学的に適合可能なドナ
ー、または(iii)免疫学的に適合可能であるかまたは受容可能な培養された
細胞株、よりT細胞を得る工程; (b)該T細胞を、請求項17〜24のいずれか1項に記載の、有効量の細胞
とエキソビボで接触させる工程であって、ここで、該接触させる工程は、抗原性
刺激に対する該T細胞の応答を増加するために効果的である、工程;および (c)該被験体に工程(b)の該T細胞を投与する工程、 を包含し、これにより、該被験体の該免疫応答を増加する、方法。 - 【請求項60】 抗原性刺激に対する哺乳動物被験体の免疫応答を増加する
方法であって、該方法は、以下の工程: (a)(i)該被験体、(ii)該被験体に対して免疫学的に適合可能なドナ
ー、または(iii)免疫学的に適合可能であるかまたは受容可能な培養された
細胞株、よりT細胞を得る工程; (b)該T細胞を、請求項25〜30のいずれか1項に記載の、有効量のポリ
ペプチド、フラグメント、ホモログまたは機能的誘導体とエキソビボで接触させ
る工程であって、ここで、該接触させる工程は、抗原性刺激に対する該T細胞の
応答を増加するために効果的である、工程;および (c)該被験体に工程(b)の該T細胞を投与する工程、 を包含し、これにより、該被験体の該免疫応答を増加する、方法。 - 【請求項61】 抗原性刺激に対する哺乳動物被験体の免疫応答を増加する
方法であって、該方法は、以下の工程: (a)(i)該被験体、(ii)該被験体に対して免疫学的に適合可能なドナ
ー、または(iii)免疫学的に適合可能であるかまたは受容可能な培養された
細胞株、よりT細胞を得る工程; (b)該T細胞を、請求項31〜40のいずれか1項に記載の、有効量の融合
ポリペプチドとエキソビボで接触させる工程であって、ここで、該接触させる工
程は、抗原性刺激に対する該T細胞の応答を増加するために効果的である、工程
;および (c)該被験体に工程(b)の該T細胞を投与する工程、 を包含し、これにより、該被験体の該免疫応答を増加する、方法。 - 【請求項62】 病原細胞または病原微生物に関連する抗原に対する保護免
疫応答を誘導するために有用なワクチン組成物であって、以下: (a)必要に応じて該抗原を発現する、請求項17〜24のいずれか1項に記
載の形質転換された細胞またはトランスフェクトされた細胞; (b)(a)の細胞が該抗原を発現しない場合、該抗原のさらなる供給源; (c)必要に応じて、一般的な免疫刺激剤またはアジュバント;ならびに (d)(a)、(b)および(c)のための薬学的および免疫学的に受容可能
な賦形剤またはキャリア、 を含む、ワクチン組成物。 - 【請求項63】 病原細胞または病原微生物に関連する抗原に対する保護免
疫応答を誘導するために有用なワクチン組成物であって、以下: (a)免疫応答が所望される抗原の供給源; (b)請求項25〜30のいずれか1項に記載のポリペプチド、フラグメント
、ホモログまたは機能的誘導体; (c)必要に応じて、一般的な免疫刺激剤またはアジュバント;ならびに (d)(a)、(b)および(c)のための薬学的および免疫学的に受容可能
な賦形剤またはキャリア、 を含む、ワクチン組成物。 - 【請求項64】 病原細胞または病原微生物に関連する抗原に対する保護免
疫応答を誘導するために有用なワクチン組成物であって、以下: (a)免疫応答が所望される抗原の供給源; (b)請求項31〜40のいずれか1項に記載の融合ポリペプチド; (c)必要に応じて、一般的な免疫刺激剤またはアジュバント;ならびに (d)(a)、(b)および(c)のための薬学的および免疫学的に受容可能
な賦形剤またはキャリア、 を含む、ワクチン組成物。 - 【請求項65】 抗原またはワクチンの免疫原性を増加するために、抗原ま
たはワクチンと使用するための補助刺激組成物であって、以下: (a)請求項25〜30のいずれか1項に記載のポリペプチド、フラグメント
、ホモログまたは機能的誘導体;ならびに (b)薬学的および免疫学的に受容可能な賦形剤またはキャリア、 を含む、補助刺激組成物。 - 【請求項66】 抗原またはワクチンの免疫原性を増加するために、抗原ま
たはワクチンと使用するための補助刺激組成物であって、以下: (a)請求項31〜40のいずれか1項に記載の融合ポリペプチド;ならびに (b)薬学的および免疫学的に受容可能な賦形剤またはキャリア、 を含む、補助刺激組成物。 - 【請求項67】 請求項62〜64のいずれか1項に記載の、有効量のワク
チン組成物を、被験体に投与する工程を包含する、哺乳動物被験体において抗原
に対する免疫応答を誘導または増強する方法。 - 【請求項68】 請求項65または66に記載の補助刺激組成物を、抗原ま
たはワクチンとともに被験体に投与する工程を包含する、哺乳動物被験体におい
て抗原またはワクチンに対する免疫応答を増強する方法。
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