ES2330506T3 - Moleculas coestimulantes de celulas dentriticas. - Google Patents
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Abstract
Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido constituido por: (a) los residuos de aminoácidos 26-221 de SEQ ID NO: 2; o (b) una variante de (a) que coestimula la actividad de las células T que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con (a); en donde la variante no es B7-DC de longitud total como se muestra en SEQ ID NO:
Description
Moléculas coestimulantes de células
dendríticas.
La invención en el campo de la bioquímica y la
medicina se refiere a nuevas proteínas que se expresan
selectivamente en la superficie de las células dendríticas y pueden
utilizarse como moléculas de la superficie celular o en forma
soluble en composiciones de vacuna para estimular respuestas
inmunes.
La generación de una respuesta de los linfocitos
T es un proceso complejo que implica interacciones
célula-célula y producción de mediadores solubles
(citoquinas o linfoquinas). Esta respuesta está regulada por varias
moléculas de la superficie de las células T que actúan como
"receptores", con inclusión del complejo célula
T-receptor (TCR) y otras moléculas
"accesorias" de la superficie, muchas de las cuales son
"antígenos de diferenciación" de la superficie celular que
fueron definidos inicialmente como anticuerpos monoclonales
("moléculas CD").
Se cree que la activación óptima de todos los
linfocitos requiere dos señales: una señal específica de antígeno o
señal clonal, y una segunda señal no específica de antígeno
(Janeway, C., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol.
54:1-14 (1989)). Si un linfocito encuentra un
antígeno aislado, sin co-estimulación por las
denominadas moléculas co-estimuladoras (tales como
B7 descritas más adelante), responderá con desactivación clonal
también denominada "anergia" (Schwartz, R. Science 248:
1349 (1990)) o apoptosis (muerte celular programada); si se
proporciona la señal co-estimuladora, aquél
responderá con expansión clonal específica para el antígeno
estimulador. No se produce amplificación significativa alguna de una
respuesta inmune contra un antígeno dado sin
co-estimulación (June et al. (Immunology
Today 15: 321-331, 1994); Chen et al.
(Immunology Today 14: 483-486); Townsend, SE
y Allison, JP (1993) Science 259:
368-370).
La calidad y potencia de una respuesta inmune
depende en gran parte del tipo de células presentadoras de antígeno
(APC) que procesan y presentan el antígeno a las células T. La
densidad del ligando antígeno peptídico/MHC disponible para la
entrada en acción del TCR y la provisión de señales
co-estimuladoras solubles y/o fijadas a la membrana
por las APCs en el momento de la entrada en acción de las células T
y la activación es crítica. Es por estas razones por las que las
estrategias inmunoterapéuticas han comenzado a enfocar su atención
en proporcionar (a) el antígeno diana a los tipos APC apropiados y
(b) moléculas co-estimuladoras apropiadas para
mejorar la activación de las
células T.
células T.
Las APCs que proporcionan las señales requeridas
para activación de las células T incluyen monocitos/macrófagos,
linfocitos B, y, lo que es más importante, células dendríticas
(DCs). Tiempo atrás se creía que los macrófagos activados eran las
APCs críticas que iniciaban las respuestas de las células T in
vivo. Esta idea estaba basada en su capacidad para fagocitar
eficazmente los antígenos y procesar los mismos para exposición y
presentación en la superficie. Más recientemente, la atención se ha
desplazado a DC como el iniciador principal in vivo de las
respuestas de las células T específicas de antígeno. Las DCs tienen
un fenotipo distinto de los macrófagos activados y se clasifican en
subtipos diferentes capaces de iniciar respuestas inmunes
distintivas. Una marca de contraste funcional de las DCs es su
potencia aproximadamente 100 veces mayor que la de los macrófagos
para activar las células T naíf in vitro. Hasta la fecha, la
explicación de esta potencia se ha basado en diferencias
cuantitativas en las moléculas que se sabe son importantes para la
presentación de antígeno. La presente invención está basada en el
descubrimiento de una diferencia cualitativa importante.
La primera señal en la presentación de antígeno
se inicia por interacción de la TCR con el antígeno presentado en
el contexto de las moléculas del complejo principal de
histocompatibilidad (MHC) clase II en la APC (Allen Immunol.
Today 8: 270 (1987)). Las señales
co-estimuladoras proceden de otras moléculas, la
mejor caracterizada de las cuales es la familia B7 (a saber B7.1,
B7.2, y posiblemente B7.3) que están presentes también en las
APCs.
Dos proteínas expresadas en la superficie de las
células T son los ligandos o contra-receptores mejor
caracterizados para moléculas co-estimuladoras
tales como B7. CD28 es una glicoproteína homodímera de la
superfamilia de las inmunoglobulinas (Ig) (Aruffo y Seed, Proc.
Natl. Acad. Sci. 84: 8573-8577 (1987))
encontrada en la mayoría de las células T humanas maduras que
funciona en la activación de las células T. CD28 se expresa
constitutivamente en las células T en reposo y aumenta después de
la activación. Después de señalización por el receptor de las
células T, la ligación de CD28 induce las células T a proliferar y
secretar IL-2 (Linsley, PS, et al. (1991)
J. Exp. Med. 173, 721-730; Gimmi, CD, et
al. (1991) Proc. Natl. Acad Sci. EE.UU. 88,
6575-6579; Thompson, C. B., et al. (1989)
Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 86, 1333-1337; June,
C. H., et al. (1990) Immunol. Today. 11,
211-6; Harding, F. A., et al. (1992)
Nature. 356, 607-609.). CD28 media el
contacto célula-célula ("adhesión
intercelular"), una forma de interacción intercelular
independiente de antígeno que es esencial para las respuestas
inmunes (Springer et al., Ann. Rev. Immunol. 5:
223-252 (1987)).
\newpage
CTLA4 es una molécula de la superficie de las
células T sumamente homogénea a CD28 pero que no se expresa en las
células T en reposo y aparece a continuación de la activación de las
células T (Brunet, J.F., et al. (1987) Nature 328:
267-270). CTLA-4 fue identificada
originariamente por cribado diferencial de una biblioteca de cDNA
de células T citolíticas murinas, Brunet et al.,
supra). El papel de CTLA-4 como segundo
receptor para B7 se discute en Linsley et al., (1991) J.
Exp. Med. 174: 561-569, que indicaron también
que B7 tiene una mayor afinidad para CTLA4 que para CD28. Freeman
et al. (1993) Science 262: 907-909
discutieron CTLA-4 en ratones deficientes en B7. Los
ligandos para CTLA-4 se describen en Lenschow et
al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. 90:
11054-11058.
Las células secretan citoquinas inductoras del
crecimiento y la diferenciación tales como IL-2,
IL-4 e II-6, posiblemente de manera
enfocada en el área de contacto entre las células Th y B, que sirve
para asegurar la activación únicamente de las células B que
presentan el antígeno a las células Th y evitar la activación por
las células B testigo.
CD28 y TCLA-4 interaccionan con
una molécula co-estimuladora conocida generalmente
como B7. B7 se describió originalmente como un antígeno de
activación de las células B debido a que se encontró en células B y
se designó B7/BB-1 (Linsley et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 87: 5031-5035 (1990)). En
lo sucesivo se hará referencia a esta molécula como B7,
B7-1 o B7.1). B7 y los homólogos de B7 descritos más
recientemente son también miembros de la superfamilia Ig. En
contraste con CD28 y CDTL-4, B7 comprende dos
dominios extracelulares Ig, un dominio N-terminal
de tipo variable (V), seguido por un dominio de tipo constante
(C).
Los miembros de la familia B7 se expresan
generalmente en APCs y, como se ha indicado, son de importancia
crítica para la activación de las células T naíf. Estos miembros de
la familia incluyen B7-1 (=B7, designado también
CD80) y B7-2 (designado también CD86). Referencias
que describen B7-1 incluyen Schwartz, R. H.
Cell 71:1065-1068, 1992; Chen, L. et
al Cell 71:1093-1102, 1992; Freeman, G.J. et
al. J. Immunol 143:2714-2722, 1989; y Freeman,
G. J. et al. J. Exp. Med. 174:625-631,
1991)). Referencias que describen B7-2 incluyen
(Freeman, G. 3. et al. Science 262:909-911,
813- 960, 1993). Hasta la fecha, han sido descritas tanto
B7-1 y B7-2 murinas como
B7-1 y B7-2 humanas (Freeman et
al., 1989, supra; 1991, supra; y 1993,
supra). Los linfocitos B humanos activados expresan
contra-receptores B7-2 y
B7-3 de fijación de CTLA4/CD28, los dos cuales
pueden suministrar señales coestimuladoras a las células T por la
vía de CD28 o CTLA4.
B7-2 es expresada por las
células B al cabo de aproximadamente 24 horas después de la
estimulación con mAbs anti-Ig o
anti-MHC clase II. B7-2 induce
secreción de IL-2 y proliferación de las células T
detectables. Al cabo de aproximadamente 48 a 72 horas de la
activación, las células B expresan a la vez B7-1 y
un tercer contrarreceptor de CTLA4 identificado por un mAb
BB-1 (Yokochi, T., et al. (1982) J.
Immunol. 128, 823-827) designado
B7-3. B7-3 se expresa también en
células B B-7 negativas activadas y puede
coestimular la proliferación de las células T sin producción
detectable de IL-2, lo que indica que las moléculas
B7-1 y B7-3 son distintas.
B7-3 se expresa en una gran diversidad de células
que incluyen células B activadas, monocitos activados, células
dendríticas, células de Langerhans y queratinocitos. A las 72 horas
de la activación de las células B, comienza a declinar la expresión
de B7-1 y B7-3. La presencia de
estos contra-receptores de la fijación de CTLA4/CD28
en la superficie de los linfocitos B activados indica que la
coestimulación de las células T está regulada, en parte, por la
expresión temporal de estas moléculas después de la activación de
las células B.
La importancia del o de los caminos
coestimuladores B7:CD28/CTLA4 ha sido demostrada in vitro e
in vivo. Existe una relación directa entre la actividad
incrementada de las células T y la expresión incrementada de B7
(Razi-Wolf et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
EE.UU., 89: 4210-4214 (1992)). Las células T se
vuelven anérgicas cuando las mismas encuentran antígenos peptídicos
en células que carecen de un ligando coestimulador que fija CD28.
El bloqueo de este camino coestimulador da como resultado el
desarrollo de tolerancia específica de antígeno en los sistemas
murinos y humanos (Harding et al., supra; Lenschow,
D.J. et al., (1992) Science, 257,
789-792; Turka, L.A. et al., (1992), Proc.
Natl. Acad. Sci. EE.UU., 89, 11102-11105;
Gimmi, CD et al., (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
90; 6586-6590; Boussiotis, V. et al. (1993)
J. Exp. Med. 178, 1753-1763). Inversamente,
la expresión de B7 por células tumorales murinas
B-7-negativas induce inmunidad
específica mediada por células T acompañada por rechazo de los
tumores y protección de larga duración frente a la exposición a
tumores (Chen, L., et al. (1992) Cell 71:
1093-1102; Townsend et al., supra;
Baskar, S., et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. 90,
5687-5690). Por consiguiente, la manipulación del
camino B7:CD28/CTLA4 ofrece un gran potencial para estimular o
suprimir las respuestas inmunes en los humanos.
Se han caracterizado interacciones entre CD28 y
B7 utilizando fusiones de genes de las porciones extracelulares de
B7 o CD28 con cadenas de Ig C\gamma1 (Linsley et al., J.
Exp. Med. 173: 721-730 (1991)). Cuando se
inmovilizan las proteínas de fusión B7Ig, o cuando se expresa B7 en
la superficie de una célula, tal como una célula CHO transfectada,
aquéllas coestimulan la proliferación de las células T. La
estimulación de las células T con células CHO B7+ estimula también
específicamente niveles incrementados de transcritos para
IL-2.
U.S. 5.521.288 describe un método para
regulación de respuestas inmunes por contacto de células T CD28
positivas con fragmentos codificados por partes de DNA que
codifican B7, correspondientes fundamentalmente al dominio
extracelular (ECD) de B7. Las respuestas inmunes eran reguladas
también por derivados de B7 que son construcciones de proteínas de
fusión que incluyen al menos una porción del ECD de B7 y otra
proteína, tal como el dominio IgC\gamma1 humano, que alteraban la
solubilidad, la afinidad de fijación y/o la valencia de B7. Por
ejemplo, DNA codificante de los residuos de aminoácidos de las
posiciones 1-215 del ECD de B7 se unía a DNA
codificante de los residuos de aminoácidos de las secuencias
correspondientes a las regiones bisagra, CH2 y CH3 de IgC\gamma1
humana para formar un producto de fusión de DNA que codificaba una
proteína de fusión B7Ig. Se describía también un método para
tratamiento de una enfermedad del sistema inmunitario mediada por
células T por administración de B7 o de la proteína de fusión B7Ig
para reaccionar con las células T por fijación del receptor CD28. La
proliferación de las células T en la enfermedad de rechazo inverso
era inhibida por reacción de las células T CD28+ con el antígeno B7
o la proteína de fusión B7Ig en combinación con un
inmunosupresor.
La Patente US 5.860.310 describe células
tumorales modificadas para expresar una o más moléculas
coestimuladoras de las células T, con inclusión de
B7-2 y B7-3. Una realización incluye
expresión adicional de B7. La modificación tenía lugar por
transfección con ácido nucleico codificante de las proteínas
B7-2, B7-3 o B7. Las células
tumorales podían modificarse también genéticamente in vivo.
Se dice que tales células tumorales modificadas son útiles para
tratar un paciente que padece un tumor, a fin de prevenir o inhibir
la propagación de metástasis o inhibir la recurrencia del tumor.
Este documento describía un método para inducir específicamente una
respuesta de las células T CD4+ contra un tumor.
La Patente U.S. 5.942.607 describe ácidos
nucleicos aislados que codifican nuevos ligandos CTLA4/CD28 que
coestimulan la activación de las células T. En una realización, el
ácido nucleico aislado codificaba B7-2. Se
describía también un ácido nucleico que comprendía al menos una
porción de la secuencia B7-2 de longitud total. De
acuerdo con este documento, las secuencias de ácido nucleico podían
integrarse en diversos vectores de expresión que podrían dirigir la
síntesis de las proteínas o péptidos correspondientes en una
diversidad de células hospedadoras que incluían células de mamífero
y de insecto. Se describían también células hospedadoras
transformadas para producir proteínas o péptidos codificados por
estas secuencias de ácido nucleico y proteínas y péptidos aislados
que comprenden al menos una porción de la secuencia
B7-2.
Dong H et al., Nat. Med. 1999, 5:
1365-1399, describieron un tercer miembro de la
familia B7, designado B7-H1 que no se fija a CD28,
CTLA4 o ICOS (co-estimulador inducible). La ligación
de B7-H1 coestimulaba las respuestas de las células
T a estímulos policlonales y aloantígenos, y estimulaba
preferentemente la producción de interleuquina-10.
La IL-2, producida en pequeñas cantidades, era
necesaria para el efecto de la coestimulación por
B7-H1. Este estudio definía una molécula
co-estimuladora no conocida previamente, que puede
estar implicada en la regulación negativa de las respuestas inmunes
mediadas por las células. El mismo laboratorio (Wang S et
al., Blood, 2000; 96: 2808-2813)
describía un nuevo gen humano afín a B7 designado
B7-H2, cuya expresión se detectó en la superficie
de DCs inmaduras derivadas de monocitos. B7-H2
soluble y una proteína de fusión con Ig, B7-H2Ig,
se fijaban a las células T activadas, pero no a las células T en
reposo. Esta fijación era inhibida por una forma soluble de ICOS
(ICOSIg), pero no por CTLA4Ig. ICOSIg teñía las células CHO
transfectadas con el gen B7-H2. Utilizando
reticulación sub-óptima de CD3 como estímulo, se encontró que la
coestimulación de la proliferación de las células T por
B7-H2Ig era dependiente de la dosis y estaba
correlacionada con la secreción de IL-2, mientras
que la ligación óptima de CD3 estimulaba preferentemente la
producción de IL-10. Los autores llegaron a la
conclusión de que B7-H2 es un ligando supuesto para
la molécula ICOS -célula T.
Swallow MM et al., Immunity, 1999,
11: 423-432 consignaron la clonación de un
nuevo gen, B7h, (sic) a es un homólogo próximo de moléculas
B7 que se expresan en APCs. B7h coestimulaba la proliferación de
las células T purificadas por acción sobre un receptor distinto de
CD28 o CTLA-4. Sorprendentemente, aunque B7h se
expresaba en células B no estimuladas, su expresión era inducida en
las células no linfoides (células 3T3; fibroblastos embrionarios)
tratadas con TNF\alpha y estaba regulada en sentido creciente en
tejido no linfoide de ratones tratados con LPS, un activador
potente de TNF\alpha. Estos estudios definieron un nuevo ligando
coestimulador de las células T y sugirieron que la inducción de B7h
por TNF\alpha puede aumentar directamente el reconocimiento del
mismo durante la inflamación.
Yoshinaga SK et al., Nature, 1999,
402: 827-832, describieron un nuevo par
receptor-ligando coestimulador de murino. El
receptor, afín a CD28, era el homólogo murino de la proteína humana
ICOS, y se expresaba en células T activadas y células T de memoria
en reposo. El ligando, que era homólogo a las moléculas B7, se
designó proteína-1 afín a B7
(B7RP-1). B7RP-1 es una proteína
transmembranal tipo 1 con 20% y 19% de identidad de aminoácidos con
B7.1 (CD80) y B7.2 (CD86) murinas, respectivamente. Esta homología
es significativa dado que B7.1 y B7.2 comparten solamente 27% de
identidad de aminoácidos (Freeman, GJ et al., J. Exp. Med.
178: 2185-2192 (1993)). Esta homología incluye las
cisteínas que son importantes para la formación del bucle Ig en
localizaciones conservadas (residuos 62, 138, 185 y 242 de la
metionina de iniciación). La longitud global y la posición relativa
del dominio transmembranal de B7RP-1 eran similares
a las de las moléculas B7 (Greenfield, EA et al. Crit.
Rev. Immunol. 18: 389-418 (1988)). Se demostró
que B7RP-1 se expresaba en células B y macrófagos.
ICOS y B7RP-1 no interaccionaban con las proteínas
en el camino CD28-B7, y B7RP-1
coestimulaba las células T independientemente de CD28. Los ratones
transgénicos que expresaban una proteína de fusión entre
B7RP-1 y la porción Fc de Ig
("B7RP1-Fc") tenían hiperplasia linfoide en el
bazo, los ganglios linfáticos y los parches de Peyer. La actividad
coestimuladora de B7RP-1 in vivo se encontró
por demostración de la hipersensibilidad de tipo retardado
intensificada en ratones presensibilizados con antígeno tratados con
B7RP-1-Fc en el momento de la
exposición al antígeno. Los autores llegaron a la conclusión de que
ICOS y B7RP-1 definen un nuevo par
receptor-ligando distinto que está relacionado
estructuralmente con CD28-B7 y está implicado en la
respuesta inmune adaptativa.
Yoshinaga SK et al., Int.
Immunol., 2000, Oct., 12: 1439-1447, informaron
de la co-estimulación de células T humanas por la
interacción de B7RP-1 e ICOS humano. Este par
ligando-receptor interaccionaba con un K_{D} de
aproximadamente 33 nM y una tasa de expulsión que tenía un
t_{(1/2)} de >10 min. TNF\alpha regulaba diferencialmente la
expresión de B7RP-1 humana en células B, monocitos y
DC. TNF\alpha intensificaba la expresión de
B7RP-1 en células B y monocitos, pero inhibe la
expresión en DC. Una proteína
B7RP-1-Fc humana, o células que
expresaban B7RP-1 fijada a la membrana,
co-estimulaban la proliferación de células T in
vitro. Citoquinas específicas, tales como IFN\alpha e
IL-10, eran inducidas por
co-estimulación con B7RP-1. Aunque
los niveles de IL-2 no aumentaban
significativamente, la co-estimulación inducida por
B7RP-1 era dependiente de IL-2.
Estos estudios definían el ortólogo humano para
B7RP-1 murina y caracterizaban su interacción con
ICOS humano.
PD-1 es un receptor
inmuno-inhibidor expresado por células T, B y
mieloides activadas. Los ratones deficientes en
PD-1 exhibían formas múltiples de autoinmunidad
debido a la pérdida de tolerancia periférica. Freeman, GJ et
al., J. Exp. Med. 192: 1027-1034 (2000)
consignaron que el ligando de PD-1
(PD-L1) es un miembro de la familia de genes B7. La
entrada en acción de PD-1 por PD-L1
daba como resultado la inhibición de la activación de los
linfocitos mediada por TCR (proliferación, secreción de citoquinas).
Adicionalmente, la señalización de PD-1 inhibía
niveles subóptimos de coestimulación mediada por CD28.
PD-L1 es expresada por APCs (monocitos humanos
estimulados con IFN\gamma, DCs humanas activadas). Adicionalmente,
se demostró que PD-L1 se expresa en corazón y
pulmón. Los autores especulaban que la magnitud relativa de las
señales inhibidoras de PD-L1 y las señales
coestimuladoras de B7-1/B7-2 en las
APCs puede determinar la extensión de la activación de las células
T y el umbral entre tolerancia y autoinmunidad. La presencia de
PD-L1 en los tejidos no linfoides puede contribuir
a la magnitud de las respuestas inmunes en sitios de
inflamación.
La citación de los documentos anteriores no
supone una admisión de que nada de lo anterior sea técnica anterior
pertinente. Todas las afirmaciones en cuanto a la fecha o
representación en cuanto a los contenidos de estos documentos están
basadas en la información disponible para la Solicitante y no
constituyen admisión alguna en cuanto a la exactitud de las fechas
o contenidos de estos documentos.
Con objeto de identificar los genes que
codifican nuevas moléculas coestimuladoras específicas de las
células dendríticas (DC) para activación de las células T, los
inventores cribaron una biblioteca de cDNA sustraída entre DCs y
macrófagos activados. Este método de sustracción de cDNA define
genes expresados por DCs pero no por macrófagos activados. El uso
de este método ha conducido al descubrimiento de varios genes nuevos
específicos de DC que son útiles en la intensificación de la
potencia de vacunas que dependen de la activación de las células T.
La presente solicitud está enfocada en un gen de este tipo.
Basándose en la presencia de biblioteca de DC y
la ausencia de la biblioteca de macrófagos activados, se identificó
una nueva secuencia codificante, designada
"B7-DC". El gen B7-DC es un
miembro de la familia B7 de genes que codifican moléculas
coestimuladoras. B7-DC es el primer miembro de la
familia B7 con expresión específica de DC y especificidad de
receptores diferente. El producto de este gen tiene un papel
importante en la mediación de la capacidad singular de las DCs para
estimular las células T. El análisis funcional indicaba que
B7-DC es más activo que B7-1 en la
estimulación de la producción de IFN\gamma por las células T. El
DNA y los polipéptidos de B7-DC son por
consiguiente útiles en composiciones y métodos para aumentar la
eficacia de composiciones de vacuna celulares y moleculares, sean o
no específicas de antígeno.
La presente invención describe una molécula de
ácido nucleico aislada que codifica una proteína de mamífero
designada B7-DC que se expresa selectivamente en
células dendríticas en comparación con los macrófagos activados. La
molécula de ácido nucleico comprende preferiblemente una secuencia
de nucleótidos seleccionada de SEQ ID NO: 1 (de origen humano) o
SEQ ID NO: 5 (de origen murino). La solicitud describe también un
ácido nucleico aislado que se hibrida con la molécula de ácido
nucleico anterior en condiciones de hibridación severas. Condiciones
severas preferidas incluyen incubación en 6X cloruro de
sodio/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45ºC, seguida por un
lavado en aproximadamente 0,2X SSC a una temperatura de
aproximadamente 50ºC. Preferiblemente, la molécula de ácido
nucleico anterior comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO:
1. Una molécula de ácido nucleico como la anterior codifica una
proteína que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ
ID NO: 2 y SEQ ID NO: 4, o codifica un fragmento biológicamente
activo, homólogo u otro derivado funcional de la proteína.
Preferiblemente, la molécula de ácido nucleico codifica la proteína
que tiene la secuencia SEQ ID NO: 2 (B7-DC de
origen humano) o codifica el fragmento, homólogo u otro derivado
funcional de SEQ ID NO: 2 biológicamente activo.
En un aspecto preferido, la molécula de ácido
nucleico codifica el dominio extracelular de la proteína
B7-DC, que incluye los residuos
26-221, que codifica un homólogo
co-estimulante, fragmento u otro derivado funcional
de la misma.
En otro aspecto, la molécula de ácido nucleico
anterior codifica una proteína de fusión B7-DC que
comprende:
- (a)
- una primera secuencia de ácido nucleico que codifica un primer polipéptido que es la totalidad o una parte de una proteína B7-DC (preferiblemente SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4);
- (b)
- opcionalmente, fusionada en marco con la primera secuencia de ácido nucleico, una secuencia enlazadora de ácido nucleico que codifica un péptido enlazador; y
- (c)
- una segunda secuencia de ácido nucleico que está enlazada en marco a la primera secuencia de ácido nucleico o a la secuencia de ácido nucleico enlazadora y que codifica un segundo polipéptido.
\global\parskip0.950000\baselineskip
El segundo polipéptido está constituido
preferiblemente por uno o más dominios de una región constante de
cadena pesada de Ig, preferiblemente los dos dominios de C de IgG
humana, preferiblemente IgG1.
Se proporciona también un vector de expresión
que comprende cualquiera de las moléculas de ácido nucleico
anteriores enlazadas operativamente a
- (a)
- un promotor y
- (b)
- opcionalmente, secuencias reguladoras adicionales que regulan la expresión del ácido nucleico en una célula eucariota.
\vskip1.000000\baselineskip
El vector de expresión anterior puede ser un
plásmido o un vector viral. Estos vectores incluyen replicones de
RNA autorreplicantes (introducidos por DNA, o de RNA), vectores
suicidas de RNA, virus de DNA (tales como adenovirus, virus
Vaccinia, etc.) y viriones de RNA que han crecido sobre
líneas de células de empaquetamiento.
El DNA o RNA vector puede estar complejado a
partículas de oro para introducción mediada por cañón de genes en
un hospedador o complejado con otros polímeros, por ejemplo, en
formulaciones de liberación controlada, que aumentan el suministro
a las células y tejidos diana deseados.
Se incluye también una composición de vector que
comprende:
- (a)
- un primer vector de expresión recombinante que tiene incorporada en su secuencia una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno de interés contra el cual debe inducirse una respuesta inmune; y
- (b)
- un segundo vector de expresión recombinante que tiene incorporada en su secuencia de ácido nucleico (sic) o más secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido co-estimulador, al menos uno de cuyos polipéptidos es B7-DC, o un fragmento, homólogo u otro derivado funcional biológicamente activo del mismo,
donde los vectores de expresión son capaces de
co-infectar o co-transfectar una
célula hospedadora dando como resultado la
co-expresión del antígeno y el polipéptido,
fragmento, homólogo o derivado coestimulador.
\vskip1.000000\baselineskip
En una modificación de la realización anterior,
la invención proporciona una tercera secuencia nucleica que
codifica una proteína de direccionamiento que (i) promueve la
propagación del producto expresado (antígeno) entre las células,
preferiblemente APCs, (ii) aumenta la presentación del antígeno en
las APCs en las cuales se expresa el ácido nucleico, y/o (iii)
promueve la re-presentación (cebado cruzado) y
presentación del antígeno en las APCs de un hospedador en el cual
se introduce el vector. El ácido nucleico codificante de la proteína
de direccionamiento puede estar fusionado al ácido nucleico que
codifica el antígeno o el co-estimulador, o tanto
el ácido (sic) como el primer o segundo vector incluyen ácido
nucleico. En una realización, la composición de vector combina el
ácido nucleico codificante del antígeno, el ácido nucleico
codificante del co-estimulador (preferiblemente
B7-DC) y un ácido nucleico codificante de la
proteína "de direccionamiento" en una sola construcción
fusionada.
Esta invención incluye una célula transfectada o
transformada con cualquiera de las moléculas de ácido nucleico o
vectores de expresión arriba indicados. La célula es preferiblemente
una célula eucariota, más preferiblemente una célula de mamífero, y
muy preferiblemente una célula humana. La célula puede ser una
célula dendrítica o un progenitor de la misma que no se obtiene de
un embrión humano. En otra realización, la célula es una célula
tumoral, preferiblemente una célula tumoral que lleva un antígeno
que es el mismo que, o que reacciona cruzadamente con, un antígeno
en un tumor del hospedador contra el cual se desea una respuesta
inmune.
Una realización preferida es una célula tumoral
de mamífero aislada transfectada con una molécula exógena de ácido
nucleico que codifica una proteína B7-Dc de mamífero
(preferiblemente SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4) o un fragmento,
homólogo u otro derivado funcional del mismo biológicamente activo,
de tal modo que cuando la proteína, el fragmento, el homólogo o el
derivado es expresado por la célula tumoral, y la célula tumoral se
pone en contacto con las células T
- (i)
- la proteína B7-DC, el fragmento, el homólogo o el derivado se fija a las células T; y
- (ii)
- la célula tumoral coestimula las células T a proliferar y/o a producir y secretar citoquinas.
\vskip1.000000\baselineskip
Se describe también un polipéptido que se
expresa selectivamente en células dendríticas comparado con los
macrófagos activados y tiene las propiedades funcionales
siguientes:
- (a)
- se fija a una pareja de fijación en las células T; y
- (b)
- coestimula las células T a proliferar y/o a producir y secretar citoquinas.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Se describen también fragmentos, homólogos u
otros derivados funcionales biológicamente activos del
polipéptido.
El polipéptido, fragmento, homólogo o derivado
funcional es codificado preferiblemente por una molécula de ácido
nucleico que tiene la secuencia SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 5, o un
fragmento, homólogo o equivalente de la molécula de ácido nucleico.
Un polipéptido preferido tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID
NO: 2 o SEQ ID NO: 4.
El polipéptido o un fragmento, homólogo, u otro
derivado funcional biológicamente activo del polipéptido puede
producirse por expresión recombinante de uno de los ácidos nucleicos
anteriores.
Un polipéptido preferido comprende el dominio
extracelular de la proteína B7-DC,
preferiblemente
- (a)
- los residuos de aminoácidos 26-221 de SEQ ID NO: 2 (humanos) o
- (b)
- los residuos de aminoácidos 26-221 de SEQ ID NO: 4 (de ratón).
\vskip1.000000\baselineskip
El polipéptido anterior puede estar
constituido esencialmente por el dominio extracelular de
B7-DC.
Se proporciona también un polipéptido de fusión
B7-DC que tiene una primera pareja de fusión que
comprende la totalidad o una parte de la proteína
B7-DC fusionada
- (i)
- directamente a un segundo polipéptido o,
- (ii)
- opcionalmente, fusionada a una secuencia de péptido enlazador que está fusionada al segundo polipéptido.
\vskip1.000000\baselineskip
La proteína de fusión A B7-DC
anterior puede estar fusionada también a un segundo polipéptido,
preferiblemente uno o más dominios de una región constante de
cadena pesada de Ig, que tiene preferiblemente una secuencia de
aminoácidos correspondiente a las regiones bisagra, C_{H}2 y
C_{H}3 de una cadena G\gamma1 de inmunoglobulina.
En una realización de la proteína de fusión
anterior, la primera pareja de fusión es el dominio extracelular de
una proteína B7-DC, cuya secuencia de longitud total
es SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4.
La proteína de fusión se fija preferiblemente a
una pareja de unión en las células T y co-estimula
las células T en presencia de un estímulo adecuado para el receptor
de las células T.
Se proporciona también una proteína de fusión
dímera o trímera que es un dímero o trímero de las proteínas
de fusión anteriores. Preferiblemente, las cadenas están enlazadas
en tándem por enlaces disulfuro u otros enlaces covalentes
intercatenarios.
En una proteína de fusión dímera preferida, el
dímero es resultado de la unión covalente del residuo Cys en las
regiones C_{H} de dos de las cadenas pesadas de Ig que son los
mismos residuos Cys que están enlazados por disulfuros en cadenas H
de Ig dimerizadas normales.
La proteína de fusión de la invención puede
comprender un multímero de dos o más repeticiones de la primera
pareja de fusión enlazadas extremo con extremo, directamente o con
una secuencia enlazadora entre uno o más monómeros.
La presente invención describe también un
anticuerpo que es específico para un epítope de una proteína
B7-DC, epítope que no está presente en un miembro
conocido de una proteína de la familia B7. El epítope puede ser un
epítope lineal o estructural de un polipéptido de SEQ ID NO:
2 o SEQ ID NO: 4. El anticuerpo es preferiblemente un anticuerpo
monoclonal, más preferiblemente un anticuerpo monoclonal humano o
humanizado (por ingeniería genética).
Se describe también un método de utilización del
anticuerpo arriba indicado para identificar o cuantificar células
que expresan un polipéptido B7-DC en su superficie
en una población de células, que comprende
- (a)
- poner en contacto células de la población con el anticuerpo arriba indicado de tal modo que el anticuerpo se fija a las células que expresan el epítope;
- (b)
- evaluar la presencia de o cuantificar el número de células a las cuales se fija el anticuerpo.
\newpage
Se proporciona otro método para aislamiento de
células que expresan un polipéptido B7-DC en su
superficie a partir de una población de células, que comprende
- (a)
- poner en contacto la población con el anticuerpo arriba indicado de tal manera que el anticuerpo se fija a las células que expresan el epítope;
- (b)
- seleccionar positivamente las células a las cuales se ha fijado el anticuerpo o seleccionar negativamente las células a las cuales no se ha fijado el anticuerpo.
\vskip1.000000\baselineskip
Se proporciona también un método de detección
de la presencia o cuantificación de un polipéptido, fragmento u
homólogo de B7-DC en una muestra, que comprende los
pasos de:
- (a)
- poner en contacto la muestra con el anticuerpo de la reivindicación 43 de tal modo que el anticuerpo se fija a cualesquiera polipéptidos o fragmentos que llevan el epítope;
- (b)
- detectar la presencia de, o cuantificar los polipéptidos o fragmentos fijados al anticuerpo.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención está dirigida también a un
método de inducir o aumentar la expresión de un polipéptido
B7-DC en una célula presentadora de antígeno o un
progenitor de la misma que no se deriva de un embrión humano a fin
de aumentar la capacidad de la célula para
co-estimular células T in vitro o in
vivo en presencia de un estímulo adecuado para el receptor de
las células T, que comprende transformar o transfectar la célula
presentadora de antígeno o la célula progenitora con el vector de
expresión que se ha descrito arriba, de tal modo que se induce o se
incrementa en las células la expresión del polipéptido
B7-DC. Las células presentadoras de antígeno son
preferiblemente células dendríticas y los progenitores son
progenitores de células dendríticas.
Se proporcionan también composiciones
co-estimuladoras celulares así como
co-estimuladores de polipéptidos para uso en un
método para la estimulación de respuestas inmunes. Un método para
aumentar la respuesta de las células T de un mamífero a
estimulación antigénica comprende administrar al individuo una
cantidad eficaz de células como se ha descrito arriba,
preferiblemente células tumorales, en asociación con un estímulo
antigénico, en donde las células son eficaces para aumentar la
respuesta de células T del individuo a la estimulación antigénica.
Lo que antecede se realiza preferiblemente por
co-inyección del antígeno y la composición
co-estimuladora.
Un método para aumentar la respuesta de las
células T de un mamífero a la estimulación antigénica con un
antígeno asociado a un tumor, comprende administrar al individuo
una cantidad eficaz de células tumorales como se ha descrito
arriba, en donde las células tumorales expresan el antígeno, siendo
la administración de las células tumorales eficaz para aumentar la
respuesta de las células T del individuo a la estimulación por el
antígeno tumoral.
Un método para aumentar la respuesta de las
células T de un mamífero a la estimulación antigénica comprende
administrar al individuo una cantidad eficaz de un polipéptido,
fragmento, homólogo o derivado funcional como se ha indicado
arriba, o un polipéptido o proteína de fusión como se ha indicado
arriba, en asociación con un estímulo antigénico, en donde la
administración del polipéptido es eficaz para aumentar la respuesta
de las células T del individuo a la estimulación antigénica.
Se proporciona también un anticuerpo como
se ha descrito para uso en un método para inhibir una respuesta de
las células T de un mamífero a la estimulación antigénica,
comprendiendo el método administrar al individuo una cantidad
eficaz del anticuerpo, en donde la administración del anticuerpo es
eficaz para bloquear la estimulación de las células T o para
eliminar las células T reactivas con el antígeno, inhibiendo con
ello la respuesta de las células T. Los métodos son particularmente
útiles para tratar un individuo con un trasplante de tejido u
órgano a fin de inhibir el rechazo del trasplante y/o promover el
injerto. En el caso de un autoantígeno, el método bloquea o
disminuye las reacciones autoinmunes y sus secuelas patológicas.
Se proporcionan también células T que han
sufrido estimulación ex vivo con las composiciones de esta
invención para uso en métodos terapéuticos. Un método para aumentar
la respuesta inmune de un mamífero a la estimulación antigénica
comprende:
- (a)
- obtener células T del individuo, de un donante inmunitariamente compatible para dicho individuo, o de una línea de células cultivada inmunitariamente aceptable;
- (b)
- poner en contacto las células T ex vivo con una cantidad eficaz de células como se ha descrito arriba, en donde el contacto es eficaz para aumentar la respuesta de las células T a la estimulación antigénica; y
- (c)
- administrar las células T del paso (b) al individuo,
aumentando con ello la respuesta inmune del
individuo.
\vskip1.000000\baselineskip
Otro método para aumentar la respuesta inmune de
un mamífero sometido a estimulación antigénica comprende:
- (a)
- obtener células T del individuo, de un donante inmunitariamente compatible para dicho individuo, o de una línea de células cultivada inmunitariamente aceptable;
- (b)
- poner en contacto las células T ex vivo con una cantidad eficaz de (i) un polipéptido, fragmento, homólogo o derivado funcional como se ha descrito arriba, o (ii) un polipéptido de fusión como se ha descrito arriba, en donde la puesta en contacto es eficaz para aumentar la respuesta de las células T a la estimulación antigénica; y
- (c)
- administrar las células T del paso (b) al individuo,
aumentando (o generando) con ello una respuesta
inmune del individuo.
\vskip1.000000\baselineskip
Se proporciona también en esta memoria una
composición de vacuna que comprende
- (a)
- (i) células como se ha descrito arriba que expresan una construcción B7-DC, (ii) un polipéptido B7-DC, fragmento, homólogo o derivado funcional, (iii) un polipéptido o proteína de fusión B7-DC;
- (b)
- generalmente, una fuente adicional de antígeno para el cual se desea una respuesta inmune - aunque esto puede no ser requerido en el caso de la vacuna basada en células donde las células expresan por sí mismas el antígeno (como en el caso de células tumorales portadoras del antígeno tumoral);
- (c)
- opcionalmente, un agente o adyuvante inmunoestimulador general; y
- (d)
- un excipiente o vehículo farmacéutica e inmunitariamente aceptable para (a), (b) y (c).
\vskip1.000000\baselineskip
Un método para inducir o aumentar una respuesta
inmune a un antígeno en un individuo mamífero comprende administrar
al individuo una cantidad eficaz de la composición de vacuna arriba
indicada.
Se describe también una composición
co-estimuladora para uso con un antígeno o una
vacuna, que comprende:
- (a)
- un polipéptido B7-DC (preferiblemente SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4), un fragmento, un homólogo o un derivado funcional del mismo, o un polipéptido de fusión B7-DC, y
- (b)
- un excipiente o vehículo farmacéutica e inmunitariamente aceptable.
\vskip1.000000\baselineskip
Un método para potenciar una respuesta inmune a
un antígeno o una vacuna en un individuo mamífero, comprende
administrar al individuo, en combinación con el antígeno o vacuna,
la composición coestimuladora anterior.
Un método de estimulación de una respuesta
inmune sistémica a un tumor en un individuo, comprende administrar
al individuo células tumorales alteradas genéticamente, células
que
- (a)
- se derivan de un tumor en el individuo, y
- (b)
- están alteradas genéticamente por introducción ex vivo de un ácido nucleico B7-DC como se ha descrito arriba, cuya expresión proporciona una señal coestimuladora en el individuo,
en donde la administración da como resultado la
estimulación de la respuesta sistémica inmunitaria dirigida al
tumor.
\vskip1.000000\baselineskip
Las células tumorales se tratan preferiblemente,
con preferencia por irradiación, para prevenir su crecimiento
después que han sido administradas.
El individuo puede someterse a un régimen de
quimioterapia, irradiación o resección quirúrgica para reducción de
tumores antes de la administración de las composiciones terapéuticas
arriba indicadas.
Se proporcionan también células de un tumor o
línea de células tumorales para uso en un método de inducción de
una respuesta antitumoral en un mamífero que padece un tumor
antígeno-positivo, en donde la célula del tumor o
la línea de células tumorales:
- (i)
- expresa(n) antígenos compartidos con el tumor del mamífero;
- (ii)
- está(n) transfectada(s) con un vector de ácido nucleico codificante de B7-DC como anteriormente tal que, una vez expresado, una molécula B7-DC hace que las células co-estimulen una respuesta de las células T a los antígenos del tumor;
- (iii)
- opcionalmente, se irradia(n) antes del paso (b);
comprendiendo el método administrar un número
eficaz de las células al mamífero, células que expresan los
antígenos y la molécula B7-DC, induciendo con ello
una respuesta antitumoral.
\vskip1.000000\baselineskip
En el método anterior, la respuesta antitumoral
se caracteriza por:
- (A)
- al menos una disminución de 50% en la suma de los productos de diámetros perpendiculares máximos de todas las lesiones apreciables;
- (B)
- falta de pruebas de nuevas lesiones, y
- (C)
- ausencia de progresión de cualesquiera lesiones preexistentes.
\vskip1.000000\baselineskip
Se describe también un método de inducción de la
regresión o atenuación del crecimiento primario o recrecimiento de
un tumor en un mamífero portador del tumor, que comprende:
- (a)
- proporcionar células del tumor o de una línea de células tumorales que
- (i)
- expresan antígenos compartidos con el tumor del mamífero;
- (ii)
- están transfectadas con un vector de ácido nucleico codificante de B7-DC como anteriormente que, cuando se expresa, como una molécula B7-DC hace que las células co-estimulen una respuesta de las células T a los antígenos del tumor;
- (iii)
- opcionalmente, se irradian antes del paso (b);
- (b)
- administrar un número eficaz de las células al mamífero, células que expresan los antígenos y la molécula B7-DC;
induciendo con ello una respuesta inmune
sistémica específica para los antígenos tumorales del melanoma,
induciendo con ello la regresión o la atenuación.
\vskip1.000000\baselineskip
Un método de inhibición del crecimiento
recurrente de un tumor antígeno-positivo en un
mamífero comprende:
- (a)
- proporcionar células del tumor o de una línea de células tumorales que
- (i)
- expresan antígenos compartidos con el tumor del mamífero;
- (ii)
- están transfectadas con un vector de ácido nucleico codificante de B7-DC como anteriormente que, cuando se expresa, hace que las células coestimulen una respuesta de las células T a los antígenos del tumor;
- (iii)
- opcionalmente, se irradian antes del paso (b);
- (b)
- administrar un número eficaz de las células al mamífero, células que expresan los antígenos y la molécula B7-DC;
induciendo con ello una respuesta inmune
sistémica específica para los antígenos del tumor en el mamífero,
respuesta inmune que inhibe el crecimiento recurrente del tumor.
\vskip1.000000\baselineskip
Otro aspecto está dirigido a un método de
proporcionar una señal co-estimuladora en la
proximidad de un antígeno administrado localmente en un individuo
mamífero para promover la generación local de una respuesta
inflamatoria e inmunitaria que da como resultado un estado de
inmunidad sistémica para el antígeno, comprendiendo el método
administrar a un sitio local en el individuo
- (a)
- células que expresan una cantidad eficaz para la coestimulación de un polipéptido, fragmento, homólogo o derivado funcional de B7-DC como anteriormente, y
- (b)
- el antígeno
de tal modo que la coestimulación en proximidad
física con el antígeno promueve la generación local de la respuesta
y da como resultado el estado de inmunidad sistémica.
\vskip1.000000\baselineskip
En el método anterior, el antígeno es
preferentemente un antígeno tumoral que se administra en (b) en la
forma de células tumorales o material antigénico subcelular. Las
células tumorales pueden ser también las células que expresan el
polipéptido, fragmento, homólogo o derivado de B7/DC en (a).
\vskip1.000000\baselineskip
La Figura 1 es un diagrama que muestra el mapa
de hB7-DC que está localizado en el cromosoma humano
9p24. hB7-DC mapea al clon de BAC
RPCI-11.2.
La Figura 2 muestra que B7-DC se
expresa diferencialmente entre DCs y macrófagos. La distribución del
mRNA de B7-DC en DCs de médula ósea, DCs
esplénicas, macrófagos, líneas y tejidos de macrófagos se evaluó
mediante análisis virtual por transferencia Northern utilizando 0,5
\mug/pista de DNA pasado en un gel de agarosa al 1%. Se utilizó
como control G3PDH. Las células J774A1, Raw264.7,
Pu5-1.8 y WEHI son líneas de células macrófagos.
BM: médula ósea.
La Figura 3 muestra una transferencia Northern
virtual de la expresión de B7-DC en DCs humanas. La
pista 1 muestra DCs humanas cultivadas con
GM-CSF+Flt-3L, la pista 2 muestra
placenta humana y la pista 3 muestra DCs humanas cultivadas con
GM-CSF+IL4. Se utilizaron oligonucleótidos de la
UTR5' y 3' de B7-DC humana para producir una sonda
PCR de DNA para análisis Northern virtual de tRNA total de DCs
humanas. Se utilizó como control \beta-actina
para asegurar la calidad del mRNA.
La Figura 4 representa un análisis citométrico
de flujo que muestra la expresión en la superficie de
B7-DC en BM-DCs maduras. El día 9,
las BM-DCs murinas se bloquearon con Fc y se tiñeron
con anticuerpos de control o antisueros B7-DC. La
especificidad de fijación se demostró por adición de
B7-DC-Ig para competir respecto a
la fijación de anti-B7-DC a la
superficie de las DCs.
La Figura 5 muestra la fijación de
B7-DC a PD-1 pero no a
CTLA-4 o CD28. Se transfectaron transitoriamente
células 293T con pCAGGS-B7.1 o
pCAGGS-B7-DC. Los transfectantes se
tiñeron con moléculas de fusión
PD-1-Ig, 28-Ig y
CTLA-4-Ig seguidas por anticuerpo
secundario marcado con PE. La tinción de los transfectantes pCAGGS
(vector vacío) era negativa (no representada).
La Figura 6 (panel izquierdo y derecho) muestra
la coestimulación de la proliferación de las células T por
anti-CD3 y B7-DC-Ig.
Gráfico izquierdo: se cultivaron células T purificadas (CD4+CD8) en
pocillos previamente revestidos con concentraciones crecientes de
anti-CD3 (mAb 2C11) y una concentración fija (0,1
\mug/ml) de B7.1-Ig inmovilizada
(\blacklozenge), B7-DC-Ig
(\medbullet) o control isotipo (\ding{115}). Los resultados
muestran un experimento representativo de tres. Se incubaron las
células durante 72 h y se marcaron con
^{3}H-timidina. CPM = cuentas por minuto. Gráfico
derecho: se cultivaron células T CD8 purificadas en pocillos
previamente recubiertos con concentraciones crecientes de
anti-CD3 y concentración fija de
B7.1-Ig inmovilizada (\blacklozenge),
B7-DC-Ig (\medbullet) o control
isotipo (\ding{115}) como en (a). Los resultados proceden de un
experimento representativo de dos. Las células se incubaron durante
72 h y se marcaron con ^{3}H-timidina. CPM =
cuentas por minuto.
La Figura 7 muestra la coestimulación de las
respuestas proliferativas de las células T específicas de antígeno.
Se trataron células RENCA con IFN\gamma durante 72 h para inducir
la expresión del MHC clase II y se incubaron con 12,5 \mug/ml de
péptido Ha110-120. Se añadieron células T
transgénicas específicas de HA+I-E^{d} purificadas
junto con concentraciones crecientes de B7.1-Ig
(\blacklozenge), B7-DC-Ig
(\medbullet) o control isotipo (\ding{115}) en forma soluble.
Las células se incubaron durante 48 h y se marcaron con
^{3}H-timidina. CPM = cuentas por minuto. Los
resultados son un experimento representativo de tres.
La Figura 8 muestra la secreción de citoquinas
de las células T coestimuladas por B7-DC.
Paneles superiores: células T purificadas se
cultivaron en pocillos previamente recubiertos con
anti-CD3 (0,12 \mug/ml) y 0,1 \mug/ml de
B7.1-Ig inmovilizada (\blacklozenge),
B7-DC-Ig (\medbullet) o control
isotipo (\ding{115}) como en Fig. 6 (izquierda). Los resultados
muestran un experimento representativo de tres.
Paneles inferiores: células RENKA tratadas con
\gamma-IFN, cargadas con 12,5 \mug/ml de péptido
HA (110-120) se incubaron con células T
transgénicas específicas de HA+I-E^{d} purificadas
junto con 2 \mug/ml de B7.1-Ig soluble,
B7-DC-Ig o control isotipo (símbolos
como anteriormente). Los resultados muestran un experimento
representativo de dos. Los sobrenadantes se recogieron después de 24
h y 48 h de cultivo y se ensayaron respecto a las linfoquinas
indicadas utilizando ELISA.
\newpage
La Figura 9 muestra que
B7-DC-Ig aumenta notablemente la
proliferación específica de antígeno después de coestimulación
in vivo. Después de la transferencia adoptiva de 2,5 x
10^{6} células transgénicas TCR específicas para HA, se
inmunizaron tres grupos de ratones por vía subcutánea, en sus
plantas de pie posteriores con péptido HA
(110-120), adyuvante de Freund incompleto (IFA) solo
o en combinación con B7-DC-Ig + IFA
o un anticuerpo de control isotipo con IFA. Se cosecharon ganglios
linfáticos drenantes el día 7. Se incubaron 1,5 x 10^{5} células
LN con el péptido HA durante 48 h, se pulsaron con 1 \muCi de
[^{3}H]timidina y se determinó la radiactividad
incorporada después
de 12 h.
de 12 h.
Los autores de la presente invención han
identificado ahora nuevas proteínas y ácidos nucleicos que sirven
como base para composiciones y métodos inmunoterapéuticos mejorados.
Se han descubierto formas humanas y murinas de una nueva proteína
coestimulante designada B7-DC y se describen en esta
memoria.
El DNA codificante de B7-DC
humana tiene la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 1, que se
muestra a continuación:
\vskip1.000000\baselineskip
La proteína B7-DC humana tiene
la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2, que se muestra a
continuación (indicándose la secuencia conductora, el dominio
transmembranal y la cola citoplásmica):
\vskip1.000000\baselineskip
El dominio extracelular de esta proteína
comprende desde el residuo P^{26} al residuo W^{221}.
Un clon de DNA que incluye la secuencia
codificante que codifica B7-DC murina tiene la
secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 3, que se muestra a
continuación. La secuencia codificante (subrayada, presentada en
tripletes) comienza desde el codón metionina atg (en
negrilla) partiendo del nucleótido 210 y termina con el codón de
parada tag (en negrilla) (nucleótidos
951-953).
SEQ ID NO: 5 es la parte de la secuencia
codificante de SEQ ID NO: 3.
La proteína B7-DC murina,
codificada por la región codificante de SEQ ID NO: 3 (es decir, por
SEQ ID NO: 5) tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 4 que se
muestra a continuación (indicándose la secuencia conductora, el
dominio transmembranal y la cola citoplásmica):
El dominio extracelular de esta proteína
comprende desde el residuo P^{26} al residuo W^{221}.
La secuencia de DNA completa de
B7-DC murina (denominada originalmente "proteína
afín a butirofilina" o "Btdc") tiene el número de acceso de
GenBank AF142780.2.
Este método se describe con mayor detalle en los
ejemplos. Los inventores utilizaron el método PCR Select que
incorpora dos rasgos importantes. En primer lugar, la reacción PCR
inicial antes de los pasos de hibridación requiere únicamente una
pequeña cantidad de RNA. Esta técnica permite el uso de DCs maduras
altamente purificadas que se han modificado de modo que están
sustancialmente exentas de macrófagos contaminantes, células
progenitoras u otras células potencialmente contaminantes. Se sabe
que tales DCs altamente purificadas son difíciles de obtener en
números muy grandes. En segundo lugar, el procedimiento PCR Select
permitía la clonación de genes de número de copias bajo, expresados
diferencialmente.
Para identificar genes expresados
diferencialmente por DCs con relación a su contrapartida celular, el
macrófago activado, y para identificar los genes asociados con
funciones específicas de DC, los autores de esta invención
aplicaron un método de sustracción de cDNA. Los inventores
utilizaron un "análisis diferencial representativo" (RDA)
modificado y basado en PCR, combinado con PCR de supresión (PCR
Select^{TM}) (Diatchenko, L. et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 93: 66025-66030 (1996)).
Textos básicos que describen métodos generales
de biología molecular, todos los cuales se incorporan por
referencia, incluyen: Sambrook, J et al., Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Press, Cold
Spring Harbor, NY, 1989; Ausubel, FM et al. Current Protocols in
Molecular Biology, Vol. 2, Wiley-Interscience,
Nueva York, (edición actual); Kriegler,. Gene Transfer and
Expression: A Laboratory Manual (1990); Glover, DM, compilador,
DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II, IRL
Press, 1985; Albers, B. et al., Molecular Biology of the
Cell, 2ª Ed., Garland Publishing, Inc., Nueva York, NY (1989);
Watson, JD et al., Recombinant DNA, 2ª Edición., Scientific
American Books, Nueva York, 1992; and Old, RW et al., Principles
of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering,
2^{nd} Ed., University of California Press, Berkeley, CA
(1981).
Si no se indica otra cosa, una secuencia
particular de ácido nucleico tiene por objeto abarcar variantes de
sustitución conservadoras de la misma (v.g. sustituciones de codones
degenerados) y una secuencia complementaria. El término "ácido
nucleico" es sinónimo de "polinucleótido" y debe entenderse
que incluye un gen, una molécula de cDNA, una molécula de mRNA,
así como un fragmento de cualquiera de éstos, tal como un
oligonucleótido, y adicionalmente, equivalentes de los mismos
(explicados con mayor detalle más adelante). Los tamaños de los
ácidos nucleicos se expresan como kilobases (kb) o pares de bases
(pb). Éstas son estimaciones derivadas de electroforesis en gel de
agarosa o poliacrilamida (PAGE), de secuencias de ácido nucleico que
están determinadas por el usuario o publicadas. El tamaño de las
proteínas se expresa como peso molecular en kilodaltons (kDa) o
como longitud (número de residuos de aminoácidos). El tamaño de las
proteínas se estima por PAGE, por secuenciación, por secuencias
supuestas de aminoácidos basadas en la secuencia codificante de
ácido nucleico o por secuencias de aminoácidos publicadas.
Específicamente, las moléculas de cDNA que
codifican la secuencia de aminoácidos correspondiente a
B7-DC o fragmentos o derivados de la misma pueden
sintetizarse por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
(véase, por ejemplo, U.S. 4.683.202) utilizando iniciadores
derivados de la secuencia de la proteína descrita en esta memoria.
Estas secuencias de cDNA pueden ensamblarse luego en un vector de
expresión eucariota o procariota, y el vector resultante puede
utilizarse para dirigir la síntesis de B7-DC, o su
fragmento o derivado por células hospedadoras apropiadas, por
ejemplo células COS o CHO.
Esta invención describe ácidos nucleicos
aislados que tienen una secuencia de nucleótidos que codifica la
nueva B7-DC, fragmentos de la misma o equivalentes
de la misma. El término ácido nucleico, como se utiliza en esta
memoria, debe entenderse que incluye tales fragmentos o
equivalentes. Las secuencias de ácido nucleico de esta invención
pueden ser DNA o RNA. Un ácido nucleico preferido es cDNA que
codifica B7-DC humana que tiene la secuencia SEQ ID
NO: 1 o equivalentes de la misma.
Preferiblemente, el ácido nucleico de la
presente invención es una molécula de cDNA que codifica al menos
una porción de B7-DC. Este cDNA puede estar
constituido por mRNA extraído de DCs maduras u otras células que
expresan naturalmente esta proteína. Una secuencia de ácido nucleico
que codifica B7-DC puede obtenerse de DNA genómico
de DC. Así, DNA que codifica B7-DC puede clonarse a
partir de un cDNA o una biblioteca genómica de acuerdo con
protocolos conocidos.
Una secuencia de nucleótidos de cDNA que
codifica B7-DC puede obtenerse por aislamiento de
mRNA total a partir de una línea de células apropiada. cDNA
bicatenario se prepara a partir de mRNA total. cDNA puede insertarse
en un plásmido, bacteriófago o vector viral adecuado utilizando una
cualquiera de varias técnicas conocidas.
Con referencia a una secuencia de nucleótidos,
el término "equivalente" tiene por objeto incluir secuencias
que codifican proteínas estructuralmente homólogas y/o
funcionalmente equivalentes. Por ejemplo, un polimorfismo natural
de la secuencia de nucleótidos de B7-DC
(especialmente en la tercera base de un codón) pueden manifestarse
como mutaciones "silenciosas" que no cambian la secuencia de
aminoácidos. Sin embargo, pueden existir polimorfismos que implican
cambios en la secuencia de aminoácidos en B7-DC en
una población humana (o de otros mamíferos). Los expertos en la
técnica apreciarán que estas variantes alélicas que presentan
cambios en uno o más nucleótidos (hasta aproximadamente
3-4% de la secuencia codificante total) se
encontrarán probablemente en una población humana debido a la
variación alélica natural. Cualquiera y la totalidad de tales
variantes alélicas y polimorfismos de ácido nucleico y polipéptidos
resultantes en el DNA codificante de B7-DC están
dentro del alcance de la invención.
Adicionalmente, pueden existir una o más
isoformas que se presentan naturalmente o miembros afines de la
familia de la proteína B7-DC descrita en esta
memoria, que son capaces de reaccionar inmunitariamente de manera
cruzada. Tales isoformas o miembros de familia se definen como
proteínas que comparten semejanza funcional de secuencia de
aminoácidos con B7-DC, aun cuando estén codificadas
por genes en loci diferentes.
Un fragmento de la secuencia de ácido nucleico
se define como una secuencia de nucleótidos que tiene menos
nucleótidos que la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína
B7-DC de longitud total. Esta invención incluye
tales fragmentos de ácido nucleico que codifican polipéptidos que
retienen (1) la capacidad de B7-DC para fijarse a
su o sus ligandos naturales en las células T y (2) aumentan o
inhiben (dependiendo del modo en que se presenten) las respuestas
inmunes mediadas por las células T activadas (medidas como
producción de citoquinas y/o proliferación de células T por las
células T que han recibido una señal primaria de activación).
Por ejemplo, un fragmento de ácido nucleico como
se entiende en esta memoria codifica un polipéptido
B7-DC que retiene la capacidad para fijarse a la
superficie de las células T para un receptor que no ha sido
identificado toda-vía (pero no parece ser CD28 o
CTLA-4) y suministrar una señal coestimuladora a los
linfocitos T. De acuerdo con otro criterio, el presente fragmento
de ácido nucleico es uno que se hibrida con un ácido nucleico de
otra especie animal
y es por tanto útil en ensayos de cribado para detectar nuevas proteínas que "reaccionan cruzadamente" con B7-DC.
y es por tanto útil en ensayos de cribado para detectar nuevas proteínas que "reaccionan cruzadamente" con B7-DC.
Generalmente, la secuencia de ácido nucleico que
codifica un fragmento del polipéptido B7-DC está
constituida por nucleótidos de la secuencia que codifica la
proteína madura. Sin embargo, en algunos casos puede ser deseable
incluir la totalidad o parte de la porción de la secuencia
conductora del ácido nucleico. Las secuencias de ácido nucleico de
esta invención puede incluir también secuencias enlazadoras, sitios
de endonucleasas de restricción naturales o modificadas, y otras
secuencias que son útiles para manipulaciones relacionadas con la
clonación, expresión o purificación de proteínas o fragmentos
codificados. Estas y otras modificaciones de secuencias de ácido
nucleico se describen en esta memoria o son bien conocidas en la
técnica.
En una realización, DNA que codifica la
secuencia de aminoácidos correspondiente al ECD de
B7-DC, que contiene los aminoácidos que van desde
aproximadamente la posición 26 a la 221, se une a DNA que codifica
las secuencias de aminoácidos correspondientes a las regiones
bisagra, C_{H}2 y C_{H}3 de IgG\gamma1 humana, utilizando
PCR, para formar una construcción que se expresa como proteína de
fusión B7-DC-Ig.
Una molécula de DNA análoga que codifica una
proteína de fusión B7-Ig se describió en el
documento U.S. 5.521.288 y fue depositada con la American Type
Culture Collection en Rockville, MD., bajo el número de acceso
68627.
Los métodos para ensamblaje y expresión de DNA
codificante de B7-DC y proteínas de fusión
B7-DC solubles tales como síntesis de
oligonucleótidos, PCR, células transformantes, vectores de
construcción, sistemas de expresión, y análogos están bien
establecidos en la técnica. Quienes poseen experiencia ordinaria
están familiarizados con los materiales de recurso estándar para
condiciones y procedimientos específicos.
Se describe también DNA codificante de un
dominio o fragmento de B7-DC fusionado con un ácido
nucleico que codifica la mayor parte o la totalidad de la porción
remanente de otra proteína de la familia B7, tal como B7.1, B7.2 o
B7.3. La secuencia completa del DNA de B7.1 humana (CD80) tiene el
número de acceso de Genbank X60958; el número de acceso para la
secuencia de ratón es X60958 (sic); el número para la secuencia de
rata es U05593. La secuencia completa de cDNA de B7.2 humana (CD86)
tiene el número de acceso de Genbank L25259; el número de acceso
para la secuencia de ratón es L25606.
Esta invención incluye un vector de expresión
que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un
polipéptido B7-DC enlazado operativamente a al menos
una secuencia reguladora. "Enlazado operativamente" significa
que la secuencia codificante está enlazada a una secuencia
reguladora de una manera que permite la expresión de la secuencia
codificante. Secuencias reguladoras conocidas se seleccionan para
dirigir la expresión de la proteína deseada en una célula
hospedadora apropiada. De acuerdo con ello, el término "secuencia
reguladora" incluye promotores, intensificadores y otros
elementos de control de la expresión. Tales secuencias reguladoras
se describen, por ejemplo, en Goeddel, Gene Expression
Technology. Methods in Enzymology, vol. 185, Academic
Press, San Diego, Calif. (1990)).
Los expertos en la técnica aprecian que el
diseño particular de un vector de expresión de esta invención
depende de consideraciones tales como la célula hospedadora a
transfectar y/o el tipo de proteína a expresar.
Los presentes vectores de expresión comprenden
la gama completa de moléculas de ácido nucleico que codifican las
diversas realizaciones de B7-DC: proteína de
longitud total y sus derivados funcionales (definidos en esta
memoria) con inclusión de fragmentos polipeptídicos, variantes,
proteínas de fusión, etc. Así, en una realización, el vector de
expresión comprende un ácido nucleico que codifica al menos una
porción de la proteína B7-DC tal como el ECD, solo
o fusionado a otra proteína.
Tales vectores de expresión se utilizan para
transfectar células hospedadoras para la expresión del DNA y
producción de las proteínas codificadas que incluyen proteínas o
péptidos de fusión. Se comprenderá que una célula genéticamente
modificada que expresa el polipéptido B7-DC puede
expresar transitoriamente el DNA exógeno durante un tiempo
suficiente para que la célula sea útil para su finalidad pensada.
Así, si la célula debe servir como inmunógeno que tenga una
capacidad coestimuladora aumentada in vivo o ex vivo,
el periodo de tiempo durante el que se requiere la expresión, o
durante el que la célula debe permanecer viva, es el tiempo
necesario para que la célula ejerza su función inmunógena y/o
coestimuladora. Por ejemplo, en el caso de una célula tumoral
transducida que expresa la B7-DC de la presente
invención, la expresión de B7-DC puede durar tan
poco como 6 horas, preferiblemente 24 horas, más preferiblemente al
menos 2-4 días. Por supuesto, la expresión puede
ser también estable (es decir, durante toda la vida de la célula).
Vectores de expresión y elementos reguladores apropiados (v.g.,
promotores inducibles o constitutivos) expuestos más adelante se
seleccionan de acuerdo con la estabilidad de expresión deseada o
requerida.
La presente invención describe métodos para
producir la proteína B7-DC, fragmentos y derivados.
Por ejemplo, una célula hospedadora transfectada con un vector de
ácido nucleico que codifica al menos una porción de la proteína
B7-DC se cultiva en condiciones apropiadas para
permitir la expresión del polipéptido B7-DC.
Células hospedadoras pueden transfectarse
también con uno o más vectores de expresión que, aisladamente o en
combinación, comprenden DNA codificante de al menos una porción de
la proteína B7-DC y DNA que codifica al menos una
porción de una segunda proteína, de tal modo que las células
hospedadoras producen polipéptidos de fusión que incluyen ambas
porciones.
Cuando el vector de expresión recombinante
comprende DNA que codifica una porción de B7-DC y
DNA que codifica otra proteína, tal como IgC\gamma1, la proteína
de fusión resultante puede exhibir solubilidad, afinidad de
fijación y/o valencia alteradas. Una proteína de fusión
B7-DC Ig, por ejemplo, es secretada preferiblemente
por células hospedadoras transfectadas en cultivos y se aísla por
tanto del medio de cultivo. Alternativamente, si la proteína está
retenida en el citoplasma, las células se cosechan y se lisan, y la
proteína se aísla de este lisado.
Un cultivo incluye típicamente células
hospedadoras, medio de crecimiento apropiado y otros subproductos.
Medios de cultivo adecuados son bien conocidos en la técnica. La
proteína B7-DC puede aislarse del medio o de
lisados de células utilizando técnicas convencionales para
purificación de proteínas y péptidos, que incluyen precipitación
con sulfato de amonio, cromatografía en columna de fraccionamiento
(v.g. cromatografía de intercambio iónico, de filtración con gel,
de afinidad, etc.) y/o electroforesis (véase en líneas generales,
"Enzyme Purification and Related Techniques", Methods in
Enzymology, 22: 233-577 (1971)). Una vez
purificadas, parcialmente o hasta homogeneidad, las proteínas
B7-DC recombinantes de la invención pueden
utilizarse en composiciones farmacéuticas como se describe con
mayor detalle en esta memoria.
Las células hospedadoras procariotas o
eucariotas transformadas o transfectadas para expresar
B7-DC o un homólogo o derivado funcional de la
misma están dentro del alcance de la invención. Por ejemplo,
B7-DC puede expresarse en células bacterianas tales
como E. coli, células de insecto (baculovirus), levadura, o
células de mamífero tales como células de ovario de hámster chino
(CHO) o células humanas. Otras células hospedadoras adecuadas
pueden encontrarse en Goeddel (1990) supra o son conocidas en
cualquier caso por los expertos en la técnica.
La expresión en células eucariotas conduce a
glicosilación parcial o completa y/o formación de enlaces disulfuro
relevantes inter- o intra-catenarios de la proteína
recombinante.
Ejemplos de vectores para expresión en la
levadura S. cerevisiae incluyen pYepSec1 (Baldari et
al., (1987) EMBO J. 6: 229-234), pMFa
(Kurjan et al., (1982) Cell 30:
933-943), pJRY88 (Schultz et al., (1987)
Gene 54: 113-123, y pYES2 (Invitrogen
Corporation, San Diego, Calif.). Vectores de baculovirus
disponibles para expresión de proteínas en células de insecto
cultivadas (células SF9) incluyen la serie pAc (Smith et
al., (1983) Mol. Cell Biol. 3:
2156-2165,) y la serie pVL (Lucklow, V. A., y
Surnmers, M. D., (1989) Virology 170:
31-39). Generalmente, se utilizan células COS
(Gluzman, Y., (1981) Cell 23: 175-182) en
combinación con vectores tales como pCDM8 (Aruffo A. y Seed, B.,
supra) para amplificación/expresión transitoria en células
de mamífero, mientras que se utilizan células CHO (CHO
dhfr-negativas) con vectores tales como pMT2PC (Kaufman
et al. (1987), EMBO J. 6: 187-195)
para amplificación/expresión estables en células de mamífero. La
línea de células de mieloma en NS0 (un sistema de expresión de
glutamina-sintetasa) está disponible de Celltech
Ltd.
A menudo, en los vectores de
fusión-expresión, se introduce un sitio de escisión
proteolítica en la unión del grupo informador y la proteína diana
para permitir la separación de la proteína diana del grupo
informador subsiguientemente a la purificación de la proteína de
fusión. Enzimas proteolíticas para dicha escisión y sus secuencias
de reconocimiento incluyen factor Xa, trombina y enteroquinasa.
Vectores de fusión-expresión
típicos incluyen pGEX (Amrad Corp., Melbourne, Australia), pMAL (New
England Biolabs, Beverly, Mass.) y pRIT5 (Pharmacia, Piscataway,
N.J.) que fusionan
glutatión-S-transferasa, proteína E
de fijación de maltosa, o proteína A, respectivamente, a la
proteína diana recombinante.
Vectores de expresión inducibles que no son de
fusión incluyen pTrc (Amann et al., (1988) Gene 69:
301-315) y pET 11d (Studier et al., Gene
Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic
Press, San Diego, Calif. (1990) 60-89). Si bien la
expresión de genes diana está basada en la transcripción de la
RNA-polimerasa del hospedador por el promotor de
fusión híbrido trp-lac en pTrc, la expresión de
genes diana insertados en pET 11d se basa en la transcripción del
promotor de fusión T7 gn10-lacO mediada por la
RNA-polimerasa viral coexpresada (T7gn1). Esta
polimerasa viral es suministrada por las cepas hospedadoras
BL21(DE3) o HMS174(DE3) de un profago \lambda
residente que alberga un T7gn1 bajo el control transcripcional del
promotor lac-UV5.
Se describe también una célula transfectada que
expresa B7-DC nueva de novo). En el caso de
una célula que expresa ya B7-DC, tal como una DC
madura, la célula transfectada expresa cantidades incrementadas de
proteínas B7-DC o fragmentos de las mismas en la
superficie de la célula.
Por ejemplo, una célula tumoral tal como un
sarcoma, melanoma, leucemia, linfoma, carcinoma o neuroblastoma se
transfecta con un vector de expresión que dirige la expresión de
B7-DC en la superficie de la célula tumoral. Tales
células tumorales transfectadas pueden utilizarse como inmunógenos
para inducir inmunidad terapéutica antitumoral como se describe en
esta memoria.
La construcción de vectores adecuados que
contienen las secuencias codificantes y de control deseadas emplea
métodos estándar de ligación y restricción que son bien conocidos en
la técnica. Plásmidos aislados, secuencias de DNA, u
oligonucleótidos sintetizados se escinden, elaboran, y religan en la
forma deseada.
Las secuencias de DNA que forman los vectores
están disponibles de diversas fuentes. Vectores de cadena principal
y sistemas de control se encuentran generalmente en vectores
"hospedadores" disponibles que se utilizan para el grueso de
las secuencias en construcción. Para la secuencia codificante
pertinente, la construcción inicial puede ser, y usualmente es,
cuestión de recuperación de las secuencias apropiadas a partir de
bibliotecas de cDNA o DNA genómico. Sin embargo, una vez descrita
la secuencia es posible sintetizar la secuencia génica total in
vitro partiendo de los derivados nucleotídicos individuales. La
secuencia génica total para genes de longitud considerable, v.g.,
500-1000 pb puede prepararse por síntesis de
oligonucleótidos individuales solapantes complementarios y llenado
en porciones monocatenarias no solapantes con utilización de
DNA-polimerasa en presencia de los
desoxirribonucleótido-trifosfatos. Este método ha
sido utilizado con éxito en la construcción de varios genes de
secuencia conocida. Véase, por ejemplo, Edge, M. D., Nature
(1981) 292:756; Nambair, K. P., et al., Science (1984)
223:1299; y Jay, E., J Biol Chem (1984) 259:6311.
Se preparan oligonucleótidos sintéticos por el
método del fosfotriéster como se describe en las referencias arriba
citadas o el método del fosforamidito como ha sido descrito por
Beaucage, S.L., y Caruthers, M.H., Tet. Lett (1981) 22:
1859; y Matteucci, M.D., y Caruthers, M.H., J. Am. Chem. Soc.
(1981) 103: 3185) y pueden prepararse utilizando sintetizadores
automáticos de oligonucleótidos disponibles comercialmente. El
tratamiento con quinasa de las cadenas simples antes de la
reasociación o para marcación se realiza utilizando un exceso,
v.g., aproximadamente 10 unidades de
polinucleótido-quinasa para 1 nmol de sustrato en
presencia de Tris 50 mM, pH 7,6, MgCl_{2} 10 mM, ditiotreitol 5
mM, ATP 1-2 mM, 1,7 pmoles de
\gamma-^{32}P-ATP (2,9
mCi/mmol), espermidina 0,1 mM, EDTA 0,1 mM.
Una vez que los componentes de los vectores
deseados están ya disponibles, los mismos pueden escindirse y
ligarse utilizando procedimientos estándar de restricción y
ligación. La escisión de DNA específica del sitio se realiza por
tratamiento con la enzima (o enzimas) de restricción
adecuada(s) en condiciones que son conocidas generalmente en
la técnica, y cuyas particularidades son especificadas por el
fabricante de estas enzimas de restricción disponibles
comercialmente. Véase, v.g., New England Biolabs, Product Catalog.
En general, se escinde aproximadamente 1 mg de secuencia de
plásmido o DNA por una unidad de enzima en aproximadamente 20 ml de
solución tampón; en los ejemplos dados en esta memoria, se utiliza
típicamente un exceso de enzima de restricción para asegurar la
digestión completa del sustrato de DNA. Los tiempos de incubación de
aproximadamente 1 hora a 2 horas a aproximadamente 37ºC son
manejables, aunque pueden tolerarse variaciones. Después de cada
incubación, se separa la proteína por extracción con
fenol/cloroformo, y puede ir seguida por extracción con éter, y el
ácido nucleico recuperarse de las fracciones acuosas por
precipitación con etanol. Si se desea, la separación por tamaños de
los fragmentos escindidos puede realizarse por electroforesis en gel
de poliacrilamida o gel de agarosa utilizando técnicas estándar.
Una descripción de las separaciones por tamaños se encuentra en
Methods in Enzymology (1980) 65: 499-560.
Los fragmentos de restricción escindidos pueden
hacerse romos en los extremos por tratamiento con el fragmento
grande de la DNA-polimerasa I de E. coli
(Klenow) en presencia de los cuatro
desoxinucleótido-trifosfatos (dNTPs) utilizando
tiempos de incubación de aproximadamente 15 a 25 min a 20º hasta
25ºC en Tris 50 mM de pH 7,6, NaCl 50 mM, MgCl_{2} 6 mM, DTT 6 mM
y dNTPs 0,1-1,0 mM. El fragmento Klenow rellena en
los salientes monocatenarios 5', pero recorta las monocadenas 3'
salientes, aun cuando estén presentes los cuatro dNTPs. Si se
desea, puede realizarse una reparación selectiva suministrando
solamente uno de los dNTPs, o dNTPs seleccionados, dentro de las
limitaciones dictadas por la naturaleza del saliente. Después del
tratamiento con Klenow, la mezcla se extrae con fenol/cloroformo y
se precipita con etanol. El tratamiento en condiciones apropiadas
con nucleasa S1 o BAL-31 da como resultado la
hidrólisis de cualquier porción monocatenaria.
Las ligaciones se realizan típicamente en
volúmenes de 15-50 ml en las condiciones y
temperaturas estándar siguientes: por ejemplo,
Tris-HCl 20 mM de pH 7,5, MgCl_{2} 10 mM, DTT 10
mM, BSA 33 \mug/ml, NaCl 10-50 mM, y, o bien ATP
40 \muM, 0,01-0,02 unidades (Weiss) de
DNA-ligasa T4 a 0ºC (para ligación de "extremos
cohesivos") o bien ATP 1 mM, 0,3-0,6 unidades
(Weiss) de DNA-ligasa T4 a 14ºC (para ligación de
"extremos romos"). Las ligaciones intermoleculares de
"extremos cohesivos" se realizan usualmente a concentraciones
totales de DNA de 33-100 \mug/ml (concentración
final total 5-100 nM). Las ligaciones
intermoleculares de extremos romos se realizan a concentración
total 1 mM en los extremos.
\newpage
En la construcción de vectores empleando
"fragmentos de vector", el fragmento se trata comúnmente con
fosfatasa alcalina bacteriana (BAP) o fosfatasa alcalina de
intestino de ternero (CIAP) a fin de eliminar el fosfato 5' y
prevenir la autoligación. Las digestiones se conducen a pH 8 en
Tris-HCl aproximadamente 10 mM, EDTA 1 mM
utilizando BAP o CIAP a aproximadamente 1 unidad/mg de vector a 60ºC
durante aproximadamente 1 hora. La preparación se extrae con
fenol/cloroformo y se precipita con etanol. Alternativamente, la
re-ligación puede prevenirse en vectores que han
sido digeridos doblemente por enzimas de restricción adicionales y
separación de los fragmentos indeseables.
Cualquiera de cierto número de métodos se
utilizan para introducir mutaciones en la secuencia codificante a
fin de generar las variantes de la invención. Estas mutaciones
incluyen deleciones o inserciones simples, deleciones, inserciones
o sustituciones sistemáticas de agrupaciones de bases o
sustituciones de bases simples.
Por ejemplo, se crean modificaciones de la
secuencia de DNA (cDNA o DNA genómico) de B7-DC por
mutagénesis orientada, una técnica bien conocida para la cual están
disponibles comercialmente protocolos y reactivos (Zoller, MJ et
al., Nucleic Acids Res. (1982) 10:
6487-6500 y Adelman, JP et al., DNA
(1983) 2: 183-193)). Las ligaciones correctas para
construcción de plásmidos se confirman, por ejemplo, transformando
en primer lugar la cepa MC1061 de E. coli (Casadaban, M.,
et al., J. Mol. (1980) 138: 179-207)
u otro hospedador adecuado con la mezcla de ligación. Utilizando
métodos convencionales, se seleccionan transformantes basándose en
la presencia del gen de resistencia a ampicilina, tetraciclina u
otro antibiótico (u otro marcador seleccionable) dependiendo del
modo de construcción del plásmido. Se preparan luego plásmidos a
partir de los transformantes por amplificación opcional con
cloranfenicol seguida opcionalmente de amplificación con
cloranfenicol ((Clewell, DB et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA (1969) 62: 1159; Clewell, D.B., J. Bacteriol. (1972)
110: 667). Se utilizan comúnmente varias minipreparaciones de DNA.
Véase, v.g., Holmes, DS, et al., Anal. Biochem.
(1981) 114: 193-197; Birnboim, HC et al., Nucleic
Acids Res. (1979) 7: 1513-1523. El DNA aislado
se analiza por restricción y/o se secuencia por el método de los
didesoxinucleótidos de Sanger (Proc. Natl. Acad. Sci. USA
(1977) 74: 5463) como ha sido descrito ulteriormente por Messing
et al., Nucleic Acids res. (1981) 9: 309; o por el
método de Maxam et al., Methods in Enzymology (1980) 65:
499.
El DNA vector puede introducirse en células de
mamífero por técnicas convencionales tales como
co-precipitación con fosfato de calcio o cloruro de
calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano,
lipofección, o electroporación. Métodos adecuados para
transformación de células hospedadoras pueden encontrarse en
Sambrook et al., supra y otros textos estándar.
A menudo, en los vectores de
fusión-expresión, se introduce un sitio de escisión
proteolítica en la unión del grupo informador y la proteína diana a
fin de permitir la separación de la proteína diana del grupo
informador subsiguientemente a la purificación de la proteína de
fusión. Enzimas proteolíticas para dicha escisión y sus secuencias
de reconocimiento incluyen Factor Xa, trombina y enteroquinasa.
Vectores típicos de de
fusión-expresión incluyen pGEX (Amrad Corp.,
Melbourne, Australia), pMAL (New England Biolabs, Beverly, Mass.) y
pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, N.J.) que fusionan
glutatión-S-transferasa, proteína E
de fijación de maltosa, o proteína A, respectivamente, a la proteína
diana recombinante.
Vectores inducibles que no son de
fusión-expresión incluyen pTrc (Amann et al.,
(1988) Gene 69: 301-315) y pET 11d (Studier
et al., Gene Expression Technology: Methods in
Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)
60-89). Mientras que la expresión de genes diana
está basada en la transcripción de la
RNA-polimerasa del hospedador por el promotor de
fusión híbrido trp-lac en pTrc, la expresión de
genes diana insertados en pET 11d está basada en la transcripción
del promotor de fusión T7gn10-lacO mediada por la
RNA-polimerasa viral coexpresada (T7gn1). Esta
polimerasa viral es suministrada por las cepas hospedadoras
BL21(DE3) o HMS174(DE3) de un profago lambda residente
que alberga un T7gn1 bajo el control transcripcional del promotor
lacUV5.
Una región promotora de una molécula de DNA o
RNA fija RNA-polimerasa y promueve la transcripción
de una secuencia de ácido nucleico "enlazada operativamente".
Como se utiliza en esta memoria, una "secuencia promotora" es
la secuencia de nucleótidos del promotor que se encuentra en la
cadena del DNA o RNA que es transcrita por la
RNA-polimerasa. Dos secuencias de una molécula de
ácido nucleico, tales como una secuencia promotora y una secuencia
codificante, están "enlazadas operativamente" cuando las mismas
están unidas una a otra de una manera que permite que ambas
secuencias se transcriban en el mismo transcrito de RNA o permite
que un transcrito de RNA que se inicia en una secuencia se extienda
en la segunda secuencia. Así, dos secuencias, tales como una
secuencia promotora y una secuencia codificante de DNA o RNA están
enlazadas operativamente si la transcripción que comienza en la
secuencia promotora es capaz de producir un transcrito de RNA de la
secuencia codificante enlazada operativamente. Para estar
"enlazadas operativamente" no es necesario que dos secuencias
sean inmediatamente adyacentes una a otra en la secuencia
lineal.
Las secuencias promotoras preferidas de la
presente invención deben ser operativas en células de mamífero y
pueden ser promotores eucariotas o virales. Los promotores adecuados
pueden ser inducibles, reprimibles o constitutivos. Un ejemplo de
un promotor constitutivo es el promotor viral
MSV-LTR, que es eficiente y activo en una
diversidad de tipos de células y, en contraste con muchos otros
promotores, tiene la misma actividad intensificadora en células en
reposo y células en crecimiento. Otros promotores virales preferidos
incluyen el que se encuentra en la CMV-LTR (de
citomegalovirus) (Bashart, M., et al., Cell 41: 521
(1985)) o en la RSV-LTR (del virus del sarcoma de
Rous) (Gorman, C.M., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 6777
(1982)). Son también útiles el promotor del gen I de metalotioneína
de ratón (Hamer, D., et al., J. Mol. Appl. Gen. 1:
273-288 (1982)); el promotor TK del herpesvirus
(McKnight, S., Cell 31: 355-365 (1982)); el
promotor temprano de SV40 (Benoist, C., et al., Nature 290:
304-310 (1981)); y el promotor del gen gal4
de levadura (Johnston, S.A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
(EE.UU.) 79: 6971-6975 (1982); Silver, P.A.,
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (EE.UU.) 81:
5951-5955 (1984)). Otras descripciones ilustrativas
de asociación de factores de transcripción con regiones promotoras
y la activación y fijación de DNA separadas de factores de
transcripción incluyen: Keegan et al., Nature (1986) 231:699;
Fields et al., Nature (1989) 340:245; Jones, Cell
(1990) 61:9; Lewin, Cell (1990) 61:1161; Ptashne et
al., Nature (1990) 346:329; Adams et al., Cell
(1993) 72:306.
La región promotora puede incluir adicionalmente
una región octámera que puede funcionar también como un
intensificador específico de tejido, por interacción con ciertas
proteínas encontradas en el tejido específico. El dominio
intensificador de la construcción de DNA de la presente invención es
uno que es específico para las células diana a transfectar, o está
fuertemente activado por factores celulares de dichas células diana.
Ejemplos de vectores (plásmido o retrovirus) se describen en
Roy-Burman et al., (Patente de EE.UU. No.
5.112.767). Para una exposición general de intensificadores y sus
acciones en transcripción véase Newin, B.M., Genes IV,
Oxford University Press, Oxford (1990), pp. 552-576.
Son particularmente útiles los intensificadores retrovirales (v.g.
LTR viral). El intensificador está situado preferiblemente aguas
arriba del promotor con el cual interacciona para estimular la
expresión génica. Para uso con vectores retrovirales, la LTR viral
endógena puede privarse de efecto intensificador y sustituirse con
otras secuencias intensificadoras deseadas que confieren
especificidad de tejido u otras propiedades deseables tales como
eficiencia de transcripción en la molécula de DNA codificante de
B7-DC de la presente invención.
Las secuencias de ácido nucleico de la invención
pueden sintetizarse también químicamente utilizando técnicas
estándar. Se conocen diversos métodos de síntesis química de
polidesoxinucleótidos, que incluyen síntesis en fase sólida que,
al igual que la síntesis de péptidos, ha sido totalmente
automatizada con sintetizadores de DNA disponibles comercialmente
(véase, v.g. Itakura et al., Patente de EE.UU. No.
4.598.049; Caruthers et al., patente de EE.UU. No.
4.458.066; Itakura, Patentes de EE.UU. Nos. 4.401.796 y
4.373.071).
Se hace referencia también a una proteína
B7-DC "aislada" que tiene la secuencia SEQ ID
NO: 2 o SEQ ID NO: 4. Si bien la presente descripción ilustra la
proteína de longitud total humana y murina B7-DC (y
el DNA), debe entenderse que homólogos de B7-DC de
otras especies de mamíferos y mutantes de los mismos que poseen las
características descritas en esta memoria se consideran comprendidos
dentro del alcance de esta invención.
Se describe también un "derivado funcional"
de B7-DC, lo que significa una variante de
sustitución de aminoácidos, un "fragmento", o un "derivado
químico" de B7-DC, términos que se definen a
continuación. Un derivado funcional retiene una actividad
apreciable de B7-DC, preferiblemente la de fijación
a un receptor en las células T y coestimulación de la actividad de
las células T, lo que permite su utilidad de acuerdo con la presente
invención. Los "derivados funcionales" abarcan
"variantes" y "fragmentos" con indiferencia de si los
términos se utilizan juntos o alternativamente en esta memoria.
Un homólogo funcional debe poseer la actividad
bioquímica y biológica arriba indicada. Teniendo en cuenta esta
caracterización funcional, el uso de proteínas homólogas
B7-DC de otras especies, con inclusión de proteínas
no descubiertas todavía, cae dentro del alcance de la invención si
estas proteínas tienen semejanza de secuencia y la actividad
bioquímica y biológica citada.
Para determinar el porcentaje de identidad de
dos secuencias de aminoácidos o de dos secuencias de ácido nucleico,
las secuencias se alinean para propósitos óptimos de comparación
(v.g. pueden introducirse lagunas en una o ambas de una primera y
una segunda secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico para
alineación óptima y pueden despreciarse secuencias no homólogas
para propósitos de comparación). En un método de alineación
preferido, se alinean los residuos Cys.
La longitud de una secuencia que se compara es
al menos 90% de la longitud de la secuencia de referencia. Por
ejemplo, cuando se alinea una segunda secuencia con la secuencia de
aminoácidos de la proteína B7-DC humana (SEQ ID NO:
2) que tiene 276 residuos de aminoácidos, se alinean al menos 248
residuos de aminoácidos). Se comparan luego los residuos de
aminoácidos (o nucleótidos) en las posiciones de aminoácidos (o
posiciones de nucleótidos). Cuando una posición en la primera
secuencia está ocupada por el mismo residuo de aminoácido (o
nucleótido) que la posición correspondiente en la segunda secuencia,
entonces las moléculas son idénticas en dicha posición (tal como se
utiliza en esta memoria, "identidad" de aminoácido o de ácido
nucleico es equivalente a "homología" de aminoácido o ácido
nucleico). El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es
función del número de posiciones idénticas compartidas por las
secuencias, teniendo en cuenta el número de lagunas, y la longitud
de cada laguna, que precisa ser introducida para la alineación
óptima de las dos secuencias.
La comparación de secuencias y la determinación
del porcentaje de identidad entre dos secuencias pueden realizarse
utilizando un algoritmo matemático. En una realización preferida, el
porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se
determina utilizando el algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol.
Biol. 48: 444-453 (1970)) que ha sido
incorporado en el programa GAP dentro del paquete de software GCG
(disponible en http://www.gcg.com), utilizando una matriz Blossom
62 o una matriz PAM250, y un peso de laguna de 16, 14, 10, 8, 6, ó 4
y un peso por longitud de 1, 2, 3, 4, 5 ó 6. En otra realización
adicional preferida, el porcentaje de identidad entre dos
secuencias de nucleótidos se determina utilizando el programa GAP
del paquete de software GCG (disponible en http://www.gcg.com),
utilizando una matriz NWSgapdna.CMP y un peso por laguna de 40, 50,
60, 70, u 80 y un peso por longitud de 1, 2, 3, 4, 5, 5 ó 6. En
otra realización, el porcentaje de identidad entre dos secuencias
de aminoácidos o nucleótidos se determina utilizando el algoritmo de
E. Meyers y W. Miller (CABIOS, 4:
11-17 (1989)) que ha sido incorporado en el programa
ALIGN (versión 2.0), utilizando una tabla de residuos de peso
PAM120, una penalidad por longitud de laguna de 12 y una penalidad
por laguna de 4.
Las secuencias de ácido nucleico y proteínas de
la presente invención pueden utilizarse adicionalmente como
"secuencia de consulta" para realizar una búsqueda contra bases
de datos públicas, por ejemplo, para identificar otros miembros de
la familia o secuencias afines. Dichas búsquedas pueden realizarse
utilizando los programas NBLAST y XBLAST (versión 2.0) de Altschul
et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:
403-10. Las búsquedas de nucleótidos BLAST pueden
realizarse con el programa NBLAST, registro = 100, longitud de
palabra = 12 a fin de obtener secuencias de nucleótidos homólogas a
las moléculas de ácido nucleico B7-DC humano o
murino. Las búsquedas de proteínas BLAST pueden realizarse con el
programa XBLAST, registro = 50, longitud de palabra = 3 para
obtener secuencias de aminoácidos homólogas a las moléculas de
proteína B7-DC humana o murina de la invención. A
fin de obtener alineaciones con lagunas para propósitos de
comparación, puede utilizarse Gapped BLAST como se describe en
Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25:
3389-3402. Cuando se utilizan los programas BLAST y
Gapped BLAST, pueden emplearse los parámetros por defecto de los
programas respectivos (v.g., XBLAST y NBLAST). Véase
http://www.ncbi.nlm.nih.gov.
Así pues, un homólogo de la proteína
B7-DC arriba descrita se caracteriza por tener (a)
actividad funcional de B7-DC nativa, y (b)
semejanza de secuencia con una proteína B7-DC nativa
(tal como SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4), cuando se determina
anteriormente, de al menos aproximadamente 30% (al nivel de
aminoácidos), con preferencia al menos aproximadamente 50%, con más
preferencia al menos aproximadamente 70%, y con mayor preferencia
aún al menos aproximadamente 90%.
Está dentro de la experiencia de la técnica la
obtención y expresión de una proteína de este tipo utilizando
sondas de DNA basadas en las secuencias descritas de
B7-DC. A continuación, la actividad bioquímica y
biológica de la proteína puede testarse fácilmente utilizando
métodos reconocidos en la técnica tales como los descritos en esta
memoria, por ejemplo, un ensayo estándar de 'proliferación de
células T o secreción de citoquinas. Un ensayo biológico de
co-estimulación de células T indicará si el homólogo
tiene la actividad requerida para cualificarse como un homólogo
"funcional".
Ensayos preferidos piden las características
funcionales de B7-DC tales como la estimulación de
la síntesis de citoquinas por las células T, que depende de la
fijación o reticulación de la TCR ("señal de activación
primaria"), así como del suministro de una señal coestimuladora.
La fijación de B7-DC a su o sus ligandos naturales
en las células T transmite una señal que induce producción
incrementada de citoquinas, tales como IL-2, lo
cual estimula a su vez una proliferación que puede ser medida
también rutinariamente.
Una "variante" de B7-DC se
refiere a una molécula sustancialmente idéntica a la proteína entera
o a un fragmento de la misma en el cual uno o más residuos de
aminoácidos han sido reemplazados (variante de sustitución) o que
tiene uno o varios residuos delecionados (variante de deleción) o
añadidos (variante de adición). Un "fragmento" de
B7-DC hace referencia a cualquier subconjunto de la
molécula, preferiblemente uno que incluye el ECD, es decir, un
polipéptido más corto de la proteína de longitud total.
Pueden utilizarse cierto número de procesos para
generar fragmentos, mutantes y variantes de la secuencia de DNA
aislada. Pequeñas subregiones o fragmentos del ácido nucleico que
codifica la proteína B7-DC, por ejemplo
1-30 bases de longitud, pueden prepararse por
síntesis química estándar. Oligonucleótidos antisentido e
iniciadores para uso en la generación de fragmentos sintéticos
mayores (sic).
Un derivado funcional preferido es una proteína
de fusión, un polipéptido que incluye un fragmento funcional de
B7-DC. Por ejemplo, un derivado útil de B7 es una
proteína de fusión B7-DC-Ig que
comprende un polipéptido correspondiente al ECD de
B7-DC y una región Ig C. La presencia de la pareja
de fusión puede alterar la solubilidad, afinidad y/o valencia
(definida aquí como el número de sitios de fijación disponibles por
molécula) de la proteína B7-DC. Una proteína de
fusión B7-DC soluble, si bien está fijada todavía a
un receptor de las células T, puede tener un efecto biológico
diferente del de la proteína nativa expresada en una APC, es decir
inhibición de la estimulación de las células T por fijación
competitiva más bien que coestimulación.
Como se utiliza en esta memoria, un dominio
extracelular (ECD) de B7-Dc es la porción
extracelular entera de la proteína o cualquier fragmento de la
misma que reconoce y se fija a PD-1 o a otro
receptor en las células T que no es CD28 o CTLA-4.
Preferiblemente, un ECD de B7-DC es aquella porción
codificada por residuos de aminoácidos desde aproximadamente la
posición 26 hasta aproximadamente la posición 221 de SEQ ID NO: 2 o
SEQ ID NO: 4.
Por "B7-DC soluble" se
entiende una forma exenta de células de B7-DC que
puede ser derramada, secretada o extraída de cualquier otro modo de
las células productoras. B7-DC soluble incluye, pero
sin carácter limitante, proteínas de fusión solubles tales como
B7-DC-Ig, EDC libre de
B7-DC, o el ECD de B7-DC fusionado
(genética o químicamente) a una molécula biológicamente activa.
Como se ha indicado anteriormente, esta
invención incluye también proteínas de fusión híbridas entre un
dominio B7-DC y un dominio o fragmento de otra
proteína de la familia B7, expresado preferiblemente en la
superficie de la célula en forma coestimuladora.
Un grupo preferido de variantes de
B7-DC son aquéllas en las cuales al menos un residuo
de aminoácido y preferiblemente, sólo uno, ha sido sustituido por
un residuo diferente. Para una descripción detallada de la química y
estructura de las proteínas, véase Schulz, GE et al., Principles
of Protein Structure, Springer-Verlag, Nueva
York, 1978, y Creighton, T.E., Proteins: Structure and Molecular
Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, 1983. Los
tipos de sustituciones que pueden hacerse en la molécula de la
proteína pueden estar basados en análisis de las frecuencias de
cambios de aminoácidos entre una proteína homóloga de especies
diferentes, tales como las presentadas en la Tabla
1-2 de Schulz et al. (supra) y la
Figura 3-9 de Creighton (supra). Basándose
en un análisis de este tipo, las sustituciones conservadoras se
definen en esta memoria como cambios dentro de uno de los cinco
grupos siguientes:
Los tres residuos de aminoácidos anteriores
entre paréntesis tienen papeles especiales en la arquitectura de la
proteína. Gly es el único residuo que carece de una cadena lateral,
e imparte por tanto flexibilidad a la cadena. Pro, debido a su
geometría inusual, constriñe fuertemente la cadena. Cys puede
participar en la formación de enlaces disulfuro, que es importante
en el plegamiento de las proteínas.
Cambios más sustanciales en las propiedades
bioquímicas, funcionales (o inmunitarias) se realizan por selección
de sustituciones que son menos conservadoras, tales como entre los
cinco grupos anteriores, más bien que dentro de los mismos. Tales
cambios diferirán más significativamente en su efecto sobre el
mantenimiento de (a) la estructura de la cadena principal peptídica
en el área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación de
hoja o hélice, (b) la carga o carácter hidrófobo de la molécula en
el sitio diana, o (c) el grueso de la cadena lateral. Ejemplos de
tales sustituciones son (i) sustitución de Gly y/o Pro por otro
aminoácido o deleción o inserción de Gly o Pro; (ii) sustitución de
un residuo hidrófilo v.g., Ser o Thr, en lugar de (o por) un
residuo hidrófobo, v.g., Leu, Ile, Phe, Val o Ala; (iii)
sustitución de un residuo Cys en lugar de (o por) cualquier otro
residuo; (iv) sustitución de un residuo que tiene una cadena lateral
electropositiva, v.g., Lys, Arg o His, en lugar de (o por)
un residuo que tenga una carga electronegativa, v.g., Glu o Asp; o
(v) sustitución de un residuo que tiene una cadena lateral
voluminosa (v.g., Phe, en lugar de (o por) un residuo que no
tiene una cadena lateral de este tipo, v.g. Gly.
Las deleciones, inserciones y sustituciones más
aceptables de acuerdo con la presente invención son aquéllas que no
producen cambios radicales en las características de la proteína
B7-DC en términos de su actividad coestimuladora de
las células T. Sin embargo, cuando es difícil predecir el efecto
exacto de la sustitución, deleción o inserción antes de hacerlo, un
experto en la técnica apreciará que el efecto puede evaluarse por
ensayos rutinarios de cribado tales como los descritos en esta
memoria, sin requerir experimentación excesiva.
En tanto que pueden hacerse variantes de cadena
más corta por síntesis química, para la presente invención, las
variantes preferidas de cadena más larga se realizan típicamente por
mutagénesis orientada del ácido nucleico codificante del
polipéptido B7-DC, expresión del ácido nucleico
variante en cultivo de células y, opcionalmente, purificación del
polipéptido a partir del cultivo de células, por ejemplo, por
cromatografía de inmunoafinidad utilizando anticuerpos específicos
inmovilizados a una columna (para absorber la variante por fijación
a al menos un epítope).
Los "derivados químicos" de
B7-DC contienen restos químicos adicionales que no
forman normalmente parte de la proteína. Modificaciones covalentes
del polipéptido se incluyen dentro del alcance de esta invención.
Tales restos derivatizados pueden mejorar la solubilidad,
absorción, semivida biológica, y análogos. Restos capaces de mediar
tales efectos se describen, por ejemplo, en Remington's
Pharmaceutical Sciences, edición 16ª, Mack Publishing Co.,
Easton, PA (1980).
Tales modificaciones pueden introducirse en la
molécula por reacción de residuos direccionados de aminoácidos del
polipéptido con un agente orgánico de derivatización que es capaz de
reaccionar con cadenas laterales seleccionadas o residuos
terminales. Otra modificación es la ciclación de la proteína.
Ejemplos de derivados químicos del polipéptido
siguen a continuación.
Lisinilo y los residuos aminoterminales se
derivatizan con anhídrido succínico u otros anhídridos de ácidos
carboxílicos. La derivatización con un anhídrido carboxílico cíclico
tiene el efecto de invertir la carga de los residuos lisinilo.
Otros reactivos adecuados para derivatización de residuos que
contienen amino incluyen imidoésteres tales como picolinimidato de
metilo; fosfato de piridoxal; piridoxal; clorohidruro de boro; ácido
trinitrobencenosulfónico; O-metilisourea;
2,4-pentanodiona; y reacción con glioxilato
catalizada por trans-aminasas.
Los grupos secundarios carboxilo, aspartilo o
glutamilo, pueden modificarse selectivamente por reacción con
carbodiimidas (R-N=C=N-R') tales
como
1-ciclohexil-3-(2-morfolinil-(4-etil)-carbodiimida
o
1-etil-3-(4-azonia-4,4'-dimetilpentil)-carbodiimida.
Adicionalmente, los residuos aspartilo y glutamilo pueden
convertirse en residuos asparaginilo y glutaminilo por reacción con
amoniaco.
Otras modificaciones incluyen hidroxilación de
prolina y lisina, fosforilación de los grupos hidroxilo de residuos
serilo o treonilo, metilación del grupo amino de la lisina
(Creighton, supra, pp. 79-86), acetilación
de la amina N-terminal, y amidación de los grupos
carboxilo C-terminales.
Se incluyen también péptidos en los cuales uno o
más D-aminoácidos están sustituidos en lugar de uno
o más L-aminoácidos.
La presente invención incluye también
polipéptidos más largos en los cuales una secuencia peptídica básica
obtenida a partir de la secuencia de B7-DC se
repite desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 100 veces, con
o sin espaciadores o enlazadores interpuestos. Debe entenderse que
tales multímeros pueden construirse a partir de cualquiera de las
variantes peptídicas definidas en esta memoria. Además, un multímero
peptídico puede comprender diferentes combinaciones de monómeros
peptídicos y las variantes de sustitución descritas de los mismos.
Tales péptidos oligómeros o multímeros pueden producirse por
síntesis química o por técnicas de DNA recombinante como se expone
en esta memoria. Cuando se producen químicamente, los oligómeros
tienen preferiblemente de 2 a 8 repeticiones de la secuencia
peptídica básica. Cuando se producen recombinantemente, los
multímeros pueden tener tantas repeticiones como permita el sistema
de expresión, por ejemplo desde 2 a aproximadamente 100
repeticiones.
En los multímeros en tándem, preferiblemente
dímeros y trímeros, del péptido o polipéptido B7-DC,
las cadenas unidas por enlaces disulfuro intercatenarios u otros
enlaces covalentes "artificiales" entre las cadenas están
situadas "lado a lado" en lugar de "extremo con extremo"
(sic). Dímeros y trímeros preferidos son los formados entre
proteínas de fusión de B7-DC tales como
B7-DC-Ig, como se describe en esta
memoria.
En la descripción que sigue, se hará referencia
a diversas metodologías conocidas por los expertos en la técnica de
inmunología, biología celular y biología molecular. Publicaciones y
otros materiales que exponen tales metodologías conocidas a las que
se hace referencia se incorporan en esta memoria por referencia en
sus totalidades como si se expusieran detalladamente. Trabajos
estándar de referencia que exponen los principios generales de la
inmunología incluyen A.K. Abbas et al., Cellular and
Molecular Immunology (4ª edición), W.B. Saunders Co.,
Philadelphia, 2000; Janeway et al., Immunobiology. The
Immune System in Health and Disease, 4ª edición, Garland
Publishing Co., Nueva York, 1999; Roitt, I. et al.,
Imrnunology, (compilador actual) C.V. Mosby Co., St. Louis, MO
(1999); Klein, J., Immunology, Blackwell Scientific
Publications, Inc., Cambridge, MA., (1990).
Anticuerpos monoclonales (mAbs) y métodos para
su producción y uso se describen en Kohler y Milstein, Nature
256:495-497 (1975); Patente EE.UU. No. 4,376,110;
Hartlow, E. et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1988);
Monoclonal Antibodies and Hybridomas: A New Dimension in
Biological Analyses, Pienum Press, Nueva York, NY (1980); H.
Zola et al., en Monoclonal Hybridoma Antibodies:
Techniques and Applications, CRC Press, 1982)).
Métodos de inmunoensayo se describen también en
Coligan, J.E. et al., compiladores, Current Protocols in
Immunology, Wiley-Interscience, Nueva York 1991
(o edición actual); Butt, W.R. (compilador) Practical
Immunoassay: The State of the Art, Dekker, Nueva York, 1984;
Bizollon, Ch. A., compilador, Monoclonal Antibodies and New
Trends in Immunoassays, Elsevier, Nueva York, 1984; Butler,
J.E., ELISA (capítulo 29), en: van Oss, C.J. et al.,
(compiladores), IMMUNOCHEMISTRY, Marcel Dekker, Inc., Nueva
York, 1994, pp. 759-803; Butler, J.E. (compilador),
Immunochemistry of Solid-Phase Immunoassay,
CRC Press, Boca Ratón, 1991; Weintraub, B., Principies of
Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay
Techniques, The Endocrine Society, marzo 1986; Work, T.S. et al.,
Laboratory Techniques, and Biochemistry in Molecular Biology,
North Holland Publishing Company, NY, (1978) (Capítulo por Chard,
T., "An Introduction to Radioimmune Assay and Related
Techniques").
Anticuerpos anti-idiotípicos se
describen, por ejemplo, en Idiotypy in Biology and Medicine,
Academic Press, Nueva York, 1984; Immunological Reviews,
Volumen 79, 1984; Immunological Reviews, Volumen 90, 1986;
Curr. Top. Microbiol., Immunol, Volumen 119, 1985; Bona, C.
et al, CRC Crit. Rev. Immunol., pp. 33-81
(1981); Jeme, NK, Ann. Immunol. 125C:373-389
(1974); Jeme, NK, en: Idiotypes-Antigens on the
Inside, Westen-Schnurr, I., compilador, Editions
Roche, Basilea, 1982, Urbain, J et al., Ann. Immunol.
133D:179- (1982); Rajewsky, K. et al., Ann. Rev.
Immunol. 1:569-607 (1983).
Se describen también anticuerpos, tanto
policlonales como monoclonales, reactivos con nuevos epítopes de
B7-DC que están ausentes de las proteínas conocidas
de la familia B7. Los anticuerpos pueden ser xenógenos, alógenos,
singénicos, o formas modificadas de los mismos, tales como
anticuerpos humanizados o quiméricos. Se incluyen también
anticuerpos anti-idiotípicos específicos para el
idiotipo de un anticuerpo
anti-B7-DC. Debe entenderse que el
término "anticuerpo" incluye también tanto moléculas intactas
como fragmentos de las mismas que incluyen el sitio de fijación de
antígeno y son capaces de fijarse a un epítope de
B7-DC. Éstos incluyen fragmentos Fab y
F(ab')_{2} que carecen del fragmento Fc de un anticuerpo
intacto, se aclaran más rápidamente de la circulación, y pueden
tener menos fijación tisular inespecífica que un anticuerpo intacto
(Wahl et al., J. Nucl. Med. 24:316-325
(1983)). Se incluyen también fragmentos Fv (Hochrnan, J. et
al. (1973) Biochemistry 12:1130-1135;
Sharon, J. et al. (1976) Biochemistry
15:1591-1594).). Estos diversos fragmentos se
producen utilizando técnicas convencionales tales como escisión con
proteasas o escisión química (véase, v.g., Rousseaux et al.,
Meth. Enzymol., 121: 663-69 (1986)).
Los anticuerpos policlonales se obtienen como
sueros a partir de animales inmunizados tales como conejos, cabras,
roedores, etc. y pueden utilizarse directamente sin
tratamiento ulterior o pueden someterse a métodos convencionales de
enriquecimiento o purificación tales como precipitación con sulfato
de amonio, cromatografía de intercambio iónico, y cromatografía de
afinidad (véase Zola et al., supra).
El inmunógeno puede comprender la proteína
B7-D6 completa, o fragmentos o derivados de la
misma. Inmunógenos preferidos comprenden la totalidad o parte del
ECD de B7-DC humana (residuos de aminoácidos
26-221), donde estos residuos contienen las
modificaciones posteriores a la traducción, tales como
glicosilación, que se encuentran en la B7-DC
nativa. Los inmunógenos que comprenden el dominio extracelular se
producen de una diversidad de maneras conocidas en la técnica,
v.g., expresión de genes clonados utilizando métodos recombinantes
convencionales, aislamiento a partir de las células originarias,
poblaciones de células que expresan niveles altos de
B7-DC, etc.
Los mAbs pueden producirse utilizando tecnología
convencional de hibridomas, tales como los procedimientos
introducidos por Kohler y Milstein (Nature, 256,
495-97 (1975)), y modificaciones de los mismos
(véanse las referencias anteriores). Un animal, preferiblemente un
ratón, se ceba por inmunización con un inmunógeno como
anteriormente para provocar la respuesta deseada de anticuerpos en
el animal cebado.
Los linfocitos B de los ganglios linfáticos, de
bazos o de sangre periférica de un animal cebado, se fusionan con
células de mieloma, generalmente en presencia de un agente promotor
de fusión tal como polietilenglicol (PEG). Cualquiera de cierto
número de líneas de células de mieloma murinas están disponibles
para dicho uso: las líneas de mieloma
P3-NS1/1-Ag4-1,
P3-x63-k0Ag8.653,
Sp2/0-Ag14, o HL1-653 (disponibles
de la ATCC, Rockville, MD). Pasos subsiguientes incluyen
crecimiento en medio selectivo de tal modo que las células de
mieloma parentales no fusionadas y las células de linfocitos
donantes mueren finalmente en tanto que sólo sobreviven las células
de hibridoma. Éstas se clonan y se cultivan y sus sobrenadantes se
criban respecto a la presencia de anticuerpo de la especificidad
deseada, v.g. por técnicas de inmunoensayo utilizando la proteína de
fusión B7-DC-Ig. Los clones
positivos se subclonan, v.g., por dilución limitante, y se aíslan
los mAbs.
Los hibridomas producidos de acuerdo con estos
métodos pueden propagarse in vitro o in vivo (en
fluido de ascitis) utilizando métodos conocidos en la técnica
(véanse generalmente Fink et al., Prog. Clin. Pathol., 9:
121-33 (1984)). Generalmente, la línea de células
individual se propaga en cultivo, y el medio de cultivo que
contiene altas concentraciones de un mAb individual puede recogerse
por decantación, filtración, o centrifugación. El anticuerpo puede
producirse como un anticuerpo monocatenario o scFv en lugar de la
estructura multímera normal. Los anticuerpos monocatenarios
incluyen las regiones hipervariables de una Ig de interés y recrean
el sitio de fijación de antígeno de la Ig nativa mientras que se
trata de unja fracción del tamaño de la Ig intacta (Skerra, A.
et al. (1988) Science, 240: 1038-1041;
Pluckthun, A. et al. (1989) Methods Enzymol. 178:
497-515; Winter, G. et al. (1991)
Nature, 349: 293-299); Bird et al.,
(1988) Science 242:423; Huston et al. (1988) Proc.
Natl. Acad. Science EE.UU. 85:5879; Jost CR et al., J Biol.
Chem. 1994, 269:26267-26273; Patentes EE.UU. No.
4.704.692, 4.853.871, 4.946.778, 5.260.203, 5.455.0Kn (sic) en
contacto con la solución que contiene una cantidad desconocida de
anticuerpo marcado (que funciona como una "molécula
informadora"). Después de un segundo periodo de incubación para
permitir que el anticuerpo marcado se compleje con el antígeno
fijado al soporte sólido a través del anticuerpo sin marcar, el
soporte sólido se lava una segunda vez para eliminar el anticuerpo
marcado que no ha reaccionado. Este tipo de ensayo sándwich directo
puede ser un ensayo simple "sí/no" para determinar si el
antígeno está presente, o puede hacerse cuantitativo por
comparación de la me-
dida del anticuerpo marcado con la obtenida para una muestra estándar que contiene cantidades conocidas de antígeno.
dida del anticuerpo marcado con la obtenida para una muestra estándar que contiene cantidades conocidas de antígeno.
En otro tipo de ensayo "sándwich", se
utilizan los denominados ensayos "simultáneo" y "inverso".
Un ensayo simultáneo implica un solo paso de incubación dado que el
anticuerpo fijado al soporte sólido y el anticuerpo marcado se
añaden ambos a la muestra que se somete a test al mismo tiempo. Una
vez que se ha completado la incubación, el soporte sólido se lava
para eliminar el residuo de muestra fluida y el anticuerpo marcado
sin complejar. La presencia de anticuerpo marcado asociado con el
soporte sólido se determina luego como se haría en un ensayo
convencional sándwich "directo".
En el ensayo "inverso", se utiliza la
adición progresiva primeramente de una solución del anticuerpo
marcado a la muestra fluida seguida por la adición de anticuerpo
sin marcar fijado a un soporte sólido después de un periodo de
incubación adecuado. Después de una segunda incubación, la fase
sólida se lava de manera convencional para liberarla del residuo de
la muestra que se somete a test, y la solución de anticuerpo marcado
sin reaccionar. La determinación del anticuerpo marcado asociado
con un soporte sólido se realiza luego como en los ensayos
"simultáneo" y "directo".
Los anticuerpos que anteceden son útiles en un
método de inhibición de la estimulación de las células T y el
tratamiento de enfermedades asociadas con la activación indeseable
de las células T, tales como rechazo de trasplantes y
autoinmunidad. Este método implica la administración a un individuo
que se encuentra en necesidad de dicho tratamiento de una cantidad
eficaz de un anticuerpo, preferiblemente un mAb, más preferiblemente
un mAb humano o humanizado para un epítope coestimulador de
B7-DC. La administración del anticuerpo debe ser
eficaz en la estimulación del bloqueo de las células T o en la
eliminación de las células T reactivas con el antígeno, inhibiendo
con ello la respuesta direccionada de las células T. Los intervalos
de dosificación relevantes se describen a continuación.
Los ácidos nucleicos de esta invención se
utilizan diagnósticamente para monitorizar el progreso de una
enfermedad, por medida de la expresión de B7-DC en
células de muestras biológicas o para ensayar el efecto de un agente
sobre la expresión de B7-DC. Esto se realiza
preferiblemente por medida de los niveles celulares de mRNA. Para
uso en tales métodos de diagnóstico, la secuencia de ácido nucleico
se marca de manera detectable, v.g., con una etiqueta radiactiva o
fluorescente o biotina, y se utiliza en una transferencia de puntos
convencional o procedimiento de hibridación Northern para sondar
las moléculas de mRNA presentes en, por ejemplo, una preparación,
de RNA total o poli(A+) de una muestra biológica.
El polipéptido B7-DC o una
células que expresa este polipéptido tal como una célula DC o célula
tumoral se administra a un individuo mamífero, preferiblemente un
humano. Se utilizan formas asociadas a las células, inmovilizadas o
agregadas de cualquier otro modo del polipéptido para intensificar
la reactividad de los linfocitos T y la inmunidad resultante. La
proteína de fusión B7-DC-Ig se
ensambla como un dímero y, como se muestra en los ejemplos,
co-estimula las células T. Formas solubles monómeras
del polipéptido B7-DC pueden fijarse al receptor en
las células T sin estimular actividad y por consiguiente pueden
considerarse como inhibidores o antagonistas de la
co-estimulación de las células T competitivos por
una forma estimuladora de la molécula. La fijación de un
antagonista B7-DC de este tipo puede suprimir la
reactividad progresiva de las células T o puede interferir con el
efecto de una señal estimuladora presentada por
B7-DC endógena o incluso por otros miembros de la
familia B7 que actúan a través de sus receptores (v.g., CD28
o CTLA-4).
Una composición que tiene la actividad de
B7-DC como se describe en esta memoria se administra
en un vehículo farmacéuticamente aceptable en una cantidad
biológicamente eficaz o terapéuticamente eficaz. El polipéptido
B7-DC (o la célula que expresa el polipéptido) puede
administrarse solo o en combinación con otra proteína o péptido tal
como uno (una) que tenga la actividad de otro miembro de la familia
B7 u otra molécula inmunoestimuladora. El tratamiento puede incluir
administración de un adyuvante, usado en su sentido más amplio para
incluir cualquier compuesto inespecífico inmunitariamente
estimulante tal como un interferón. Los adyuvantes contemplados en
esta memoria incluyen resorcinoles, agentes tensioactivos no iónicos
tales como polioxietileno-oleil-éter y
n-hexadecil-polietileno-éter.
Las dosis y cantidades siguientes se refieren
también a los anticuerpos de la invención cuando se administran a
un individuo.
Una cantidad terapéuticamente eficaz es una
dosis que, cuando se administra durante un periodo eficaz, alcanza
el efecto inmunitario o clínico deseado.
Una cantidad terapéuticamente activa de un
polipéptido que tiene actividad de B7-DC (o un
anticuerpo anti-B7-DC) puede variar
de acuerdo con factores tales como el estado de enfermedad, la edad,
el sexo, y el peso del individuo, así como la capacidad del péptido
para provocar una respuesta deseada en el individuo. Los regímenes
de dosificación pueden ajustarse para proporcionar la respuesta
terapéutica óptima. Por ejemplo, pueden administrarse diariamente
varias dosis divididas o la dosis puede reducirse proporcionalmente
según venga indicado por las exigencias de la situación
terapéutica. Una cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína, en
forma asociada a células puede establecerse en términos de
equivalentes de proteína o de células.
Así, una cantidad eficaz está comprendida entre
aproximadamente 1 ng y aproximadamente 1 gramo por kilogramo de
peso corporal del receptor, de modo más preferible entre
aproximadamente 1 \mug y 100 mg/kg, más preferiblemente entre
aproximadamente 100 \mug y aproximadamente 100 mg/kg. Las formas
de dosificación adecuadas para administración interna contienen
preferiblemente (para el último intervalo de dosis) desde
aproximadamente 0,1 mg a 500 mg de ingrediente activo por unidad.
El ingrediente activo puede variar desde 0,5 a 95% en peso, basado
en el peso total de la composición. Alternativamente, una dosis
eficaz de células que expresan B7-DC, tales como
preferiblemente células transducidas tales como DC's o células
tumorales desactivadas, está comprendida entre aproximadamente
10^{4} y 10^{9} células, de modo más preferible entre
aproximadamente 10^{6} y 10^{8} células por individuo,
preferiblemente en dosis divididas. Los expertos en la técnica de la
inmunoterapia podrán ajustar estas dosis sin experimentación
excesiva.
excesiva.
El compuesto activo (v.g., el polipéptido
B7-DC o las células transducidas con DNA de
B7-DC) puede administrarse de manera conveniente,
v.g. por inyección por una vía cómoda y eficaz. Vías preferidas
incluyen las vías subcutánea, intradérmica, intravenosa e
intramuscular. Otras vías posibles incluyen administración oral,
intratecal, inhalación, aplicación transdérmica, o administración
rectal. Para el tratamiento de tumores que no se han resecado por
completo, se contempla también la inyección intratumoral
directa.
Dependiendo de la ruta de administración, el
compuesto activo puede estar recubierto con un material para
proteger el compuesto de la acción de enzimas, ácidos y otras
condiciones naturales que pueden desactivar el compuesto. Así, para
administrar un polipéptido o péptido que tiene actividad de
B7-DC por una ruta enteral, puede ser necesario
recubrir la composición con, o coadministrar la composición con un
material para prevenir su desactivación. Por ejemplo, puede
administrarse un péptido a un individuo en un vehículo, diluyente o
adyuvante apropiado, coadministrarse con inhibidores enzimáticos
(v.g., inhibidor de la tripsina pancreática, fluorofosfato de
diisopropilo (DEP) y trasilol) o en un vehículo apropiado tal como
liposomas (con inclusión de emulsiones de agua en aceite en agua
así como liposomas convencionales (Strejan et al., (1984)
J. Neuroinmunol 7:27).
Como se utiliza en esta memoria, "vehículo
farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera y la totalidad
de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes
antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y de retardo de
la absorción, y análogos. El uso de tales medios y agentes para
sustancias farmacéuticamente activas es bien conocido en la
técnica. Excepto en lo que respecta a cualquier medio o agente
convencional que sea incompatible con el compuesto activo, se
contempla el uso de los mismos en las composiciones terapéuticas.
Compuestos activos suplementarios pueden incorporarse también en las
composiciones.
Diluyentes preferidos farmacéuticamente
aceptables incluyen solución salina y soluciones tampón acuosas.
Composiciones farmacéuticas adecuadas para inyección incluyen
soluciones acuosas estériles (en el caso de ser solubles en agua) o
dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de
soluciones o dispersiones estériles inyectables. Agentes
isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol,
sorbitol, cloruro de sodio pueden incluirse en la composición
farmacéutica. En todos los casos, la composición debe ser estéril y
debe ser fluida. La misma debe ser estable en las condiciones de
fabricación y almacenamiento y tiene que incluir conservantes que
impidan la contaminación con microorganismos tales como bacterias y
hongos. Pueden prepararse también dispersiones en glicerol,
polietilen-glicoles líquidos y mezclas de los
mismos, y en aceites. En condiciones ordinarias de almacenamiento y
uso, estas preparaciones pueden contener un conservante para
prevenir el crecimiento de microorganismos.
El vehículo puede ser un disolvente o medio de
dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por
ejemplo, glicerol, propilenglicol, y polietilenglicol líquido, y
análogos), y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez apropiada
puede mantenerse, por ejemplo, por el uso de un recubrimiento tal
como lecitina, por el mantenimiento del tamaño de partícula
requerido en el caso de las dispersiones y por el uso de agentes
tensioactivos.
La prevención de la acción de microorganismos
puede conseguirse por diversos agentes antibacterianos y
antifúngicos, por ejemplo, parabenes, clorobutanol, fenol, ácido
ascórbico, timerosal, y análogos.
La absorción prolongada de las composiciones
inyectables puede llevarse a cabo por inclusión en la composición
de un agente que retarda la absorción, por ejemplo, monoestearato de
aluminio y gelatina.
Las composiciones parenterales se formulan
preferiblemente en forma de dosis unitaria para facilidad de
administración y uniformidad de dosificación. La forma de
dosificación unitaria hace referencia a unidades físicamente
discretas adecuadas como dosis unitarias para un individuo
mamífero; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de
compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico
deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. La
especificación de las formas de dosis unitaria de la invención viene
dictada por y depende directamente de (a) las características
singulares del compuesto activo y el efecto terapéutico particular a
alcanzar, y (b) las limitaciones inherentes en la técnica de la
composición de un ingrediente activo de este tipo para el
tratamiento de la sensibilidad en los individuos.
Para instilación en el pulmón, se utilizan
soluciones aerosolizadas. En las preparaciones de aerosol
pulverizables, la proteína activa puede encontrarse en combinación
con un material vehículo inerte sólido o líquido. Éste puede
envasarse también en una botella estrujable o en mezcla con un
propelente volátil presurizado, normalmente gaseoso. Las
preparaciones de aerosol pueden contener disolventes, tampones,
agentes tensioactivos, y antioxidantes además de la proteína de la
invención.
Para aplicación tópica, las proteínas de la
presente invención pueden incorporarse en vehículos aplicados
tópicamente tales como pomadas o ungüentos, que tienen a la vez un
efecto calmante sobre la piel así como un medio para administrar el
ingrediente activo directamente al área afectada.
El vehículo para el ingrediente activo puede
encontrarse en forma pulverizable o no pulverizable. Las formas no
pulverizables pueden ser formas semisólidas o sólidas que comprenden
un vehículo nativo para aplicación tópica y que tiene una
viscosidad dinámica preferiblemente mayor que la del agua.
Formulaciones adecuadas incluyen, pero sin carácter limitante,
soluciones, suspensiones, emulsiones, cremas, ungüentos, polvos,
linimentos, pomadas, y análogas. En caso deseado, éstas pueden
esterilizarse o mezclarse con agentes adyuvantes, v.g.,
conservantes, estabilizadores, agentes humectantes, tampones, o
sales para influir en la presión osmótica, y análogos. Ejemplos de
vehículos preferidos para preparaciones tópicas no pulverizables
incluyen bases de ungüentos, v.g.,
polietilenglicol-1000 (PEG-1000);
cremas convencionales tales como crema HEB; geles; así como
petrolatum y análogos.
Otros vehículos farmacéuticamente aceptables
para el polipéptido B7-DC de acuerdo con la presente
invención son liposomas, composiciones farmacéuticas en las cuales
la proteína activa está contenida en forma dispersada o presente de
diversas maneras en corpúsculos constituidos por capas acuosas
concéntricas adherentes a capas lipídicas. La proteína activa está
presente preferiblemente en la capa acuosa y en la capa lipídica, en
el interior o en el exterior, o, en cualquier caso, en el sistema
no homogéneo conocido generalmente como una suspensión liposómica.
La capa hidrófoba, o capa lipídica, comprende por regla general,
pero no exclusivamente, fosfolípidos tales como lecitina y
esfingomielina, esteroides tales como colesterol, sustancias
tensioactivas más o menos iónicas tales como fosfato de dicetilo,
estearilamina o ácido fosfatídico, y/u otros materiales de
naturaleza hidrófoba.
Otro aspecto de la invención es una célula,
preferiblemente una célula tumoral, modificada para expresar
moléculas coestimuladoras múltiples. La expresión temporal de
moléculas coestimuladoras en células B activadas es diferente para
B7, B7-2 y B7-3. Por ejemplo,
B7-2 se expresa inicialmente después de la
activación de las células B, en tanto que B7-3 se
expresa más tarde. Las diferentes moléculas coestimuladoras pueden
servir así para funciones distintas durante el curso de una
respuesta inmune. Una respuesta eficaz de las células T puede
requerir que la célula T reciba señales coestimuladoras de
moléculas coestimuladoras múltiples.
Se describe también una célula tumoral que está
modificada genéticamente para expresar más de una molécula
coestimuladora. Por ejemplo, una célula tumoral puede estar
modificada para expresar B7-DC y una o más de B7,
B7-2 y B7-3.
Antes de la modificación, una célula tal como
una célula tumoral puede no expresar molécula coestimuladora
alguna, o puede expresar ciertas moléculas coestimuladoras pero no
otras. Como se describe en esta memoria, las células tumorales
pueden modificarse por transfección con ácido nucleico que codifica
B7-DC sola o con otra u otras moléculas
coestimuladoras. Por ejemplo, una célula tumoral transfectada con
ácido nucleico que codifica B7-DC puede
transfectarse ulteriormente con ácido nucleico que codifica B7. La
secuencia de moléculas de cDNA que codifican proteínas
B7-DC humanas o de ratón son SEQ ID NO: 1 y la
porción codificante de SEQ ID NO: 3, respectivamente.
Alternativamente, más de un tipo de modificación puede utilizarse.
Por ejemplo, una célula tumoral transfectada con un ácido nucleico
que codifica B7-DC puede estimularse con un agente
que induce la expresión de B7-1,
B7-2 o B7-3.
Una utilidad principal para la presente
invención es el uso de las presentes composiciones en vacunas
terapéuticas para el cáncer y para infecciones virales crónicas
importantes que causan morbilidad y mortalidad en todo el mundo.
Tales vacunas están diseñadas para eliminar células infectadas -
esto requiere respuestas de las células T dado que los anticuerpos
son ineficaces. Las vacunas de la presente invención incluyen,
además del epítope antigénico propiamente dicho:
- (a)
- un vector tal como DNA desnudo, RNA desnudo, RNA autorreplicante, replicones y virus de RNA que incluyen vaccinia, adenovirus, virus adenoasociado (AAV), lentivirus y alfavirus de RNA;
- (b)
- una señal de direccionamiento o procesamiento de antígeno tal como HSP70, calreticulina, el dominio extracelular del ligando Flt-3, el dominio II de la exotoxina ETA de Pseudomonas, proteína de direccionamiento del herpes simplex VP22, y análogos. (Véanse las solicitudes de patente de EE.UU. cedidas al mismo cesionario 09/421.608; 09/501.097; 09/693.450; 60/222.902; 60/222.985; 60/268.575 y Chang, W-F et al., J. Virol. 75:2368-2376 (2001), que se incorporan por la presente como referencia en su totalidad); y
- (c)
- una señal coestimuladora, preferiblemente la proteína B7-DC de la presente invención o una proteína de fusión, fragmento o derivado funcional de la misma (sola o en combinación con otras proteínas coestimuladoras conocidas tales como B7.1, B7.2, CD40 soluble, etc).
Células tumorales u otros tipos de células
hospedadoras, con inclusión de APCs, se transforman, transfectan o
transducen de otro modo con un ácido nucleico que codifica un
antígeno para el cual se desea una respuesta inmune. Tales
antígenos son preferiblemente epítopes de microorganismos patógenos
contra los cuales el hospedador se defiende por respuestas de
células T efectoras, con inclusión de linfocitos T citotóxicos (CTL)
e hipersensibilidad de tipo retardado. Éstas incluyen típicamente
virus, parásitos intracelulares tales como malaria, y bacterias que
crecen intracelularmente tales como micobacterias y listeria. Así,
los tipos de antígenos incluidos en las composiciones de vacuna de
esta invención son cualquiera de los asociados con tales patógenos
(además, por supuesto, de los antígenos específicos de tumores). Es
digno de mención que algunos antígenos virales son también
antígenos tumorales en el caso en que el virus es un factor causante
de cáncer.
De hecho, los dos cánceres más comunes
mundialmente, el hepatoma y el cáncer cervical, están asociados con
infección viral. El virus de la hepatitis B (HBV) (Beasley, R.B.
et al., Lancet 2, 1129-1133
(1981) ha sido implicado como agente etiológico de los
hepatomas. El 80-90% de los cánceres cervicales
expresan los antígenos E6 y E7 de uno de cuatro tipos de
papilomavirus humano de "alto riesgo": HPV-16,
HPV-18, HPV-31 y
HPV-45 (Gissmann, L. et al., Ciba Found Symp
120, 190-207 (1986); Beaudenon, S. et
al., Nature 321, 246-249 (1986). Los
antígenos HPV E6 y E7 son las dianas más prometedoras para cánceres
asociados a virus en individuos inmunocompetentes debido a su
expresión ubicua en el cáncer cervical. Además de su importancia
como dianas para vacunas terapéuticas contra el cáncer, los
antígenos tumorales asociados a virus son también candidatos
ideales para vacunas profilácticas. De hecho, la introducción de
vacunas profilácticas de HBV en Asia ha disminuido la incidencia
del hepatoma (Chang, M.H., et al., New Engl. J. Med.
336, 1855-1859 (1997), representando un gran
impacto en la prevención del cáncer.
Entre los virus más importantes en las
infecciones virales humanas crónicas se encuentran el papilomavirus
humano (HPV), el virus de la hepatitis B (HBV), el virus de la
hepatitis C (HCV), el virus de la inmunodeficiencia humana (HIV),
el virus Epstein Barr (EBV) y el virus del herpes simplex (HSV).
Además de su aplicabilidad al cáncer y
enfermedades infecciosas humanas, la presente invención tiene por
objeto también el uso en el tratamiento de enfermedades animales en
el contexto de la medicina veterinaria. Así, los métodos descritos
en esta memoria pueden ser aplicados fácilmente por un experto en la
técnica al tratamiento de infecciones veterinarias por herpesvirus
que incluyen herpesvirus equinos, herpesvirus bovinos, el virus de
la enfermedad de Marek en las gallinas y otras aves de corral;
enfermedades retrovirales animales; pseudorrabia y rabia, y
análogas.
Las referencias que siguen exponen principios e
información actual en el campo de la virología básica, médica y
veterinaria: Fields Virology, Fields, BN et al.,
compiladores, Lippincott Williams & Wilkins, NY, 1996;
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Control, Flint, S.J. et al., compiladores, Amer Society for
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Clinical Virology, 4ª edición, Zuckerman. A.J. et
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Hepatitis C Viruses, by Hagedorn, CH et al.,
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compiladores, Academic Press, NY, 1999; Avian Viruses: Function
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Viruses: Seventh Report of the International Cornmittee on Taxonomy
of Viruses, by M. H. V. Van Regenmortel, MHV et al.,
compiladores, Academic Press; NY, 2000.
Cierto número de proteínas que tienen modos de
acción variables han sido implicadas como moléculas "de
direccionamiento" para ser utilizadas en asociación con
antígenos, preferiblemente como polipéptidos de fusión, a fin de
direccionar el antígeno a las células y compartimientos
subcelulares que promueven la presentación del antígeno a las
células T de una manera más potente y eficaz.
El enlace de antígenos a las proteínas del
choque térmico (HSPs) representa un método potencial para aumentar
la potencia de las vacunas basadas en ácido nucleico (y otras). Las
HSPs parecen actuar como adyuvantes biológicos naturales en la
vacunación contra el cáncer viral. Tanto la HSP gp96 residente en el
retículo endoplasmático (ER) como la HSP70 citosólica actúan como
adyuvantes inmunitarios (Srivastava, PK et al., Semin.
Immunol. 3, 57-64 (1991); Udono, H.
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91,
3077-3081 (1994)). Estas HSPs, o chaperoninas, se
unen a una amplia serie de péptidos (Lammert, E., et al., Eur. J.
Immunol. 27, 923-927 (1997)). HSP70 es una
chaperonina que puede direccionar proteínas asociadas al proteosoma
- el complejo de proteasas celular primario que genera péptidos
para asociación con moléculas del MHC clase I. Por esta razón, los
antígenos unidos directamente a HSP70 son presentados más
eficazmente por el MHC clase I (conduciendo, entre otras
cosas, a las respuestas CTL). Dos características parecen ser
responsables del poder adyuvante de las HSP: (1) in vitro,
gp96 cargada con péptido introduce eficazmente antígenos en el
camino de procesamiento del MHC clase I; (2) la fijación de gp96 a
los macrófagos induce secreción de citoquinas proinflamatorias,
aumentado así la función de las células para las cuales se ha
direccionado el antígeno peptídico.
La inmunización con complejos de HSP aislados de
un tumor o de células infectadas por virus induce inmunidad
antitumoral (Srivastava, PK et al., Int J Cancer. 33:
417-22, 1984; Srivastava, PK et al, Proc Natl
Acad Sci EE.UU.. 83: 3407-11, 1986; Udono, H
et al., J Immunol. .152: 5398-5403, 1994;
Blachere, NE et al., J Immunother. 14:
352-6, 1993; Udono, H et al., supra; Tamura,
Y et al, Science. 278: 117-20, 1997;
Janetzki, S et al., J Immunother. 21: 269-76,
1998)) o inmunidad antiviral potente (Heikema, A et al.,
Irnmunol Lett. 57: 69-74, 1997; Suto, R et
al., Science. 269: 1585-8, 1995). La mezcla de
péptidos con HSPs in vitro generaba complejos inmunógenos
HSP-péptido (Ciupitu, AM et al., J.Exp Med.
187: 685-91, 1998; Blachere, NE et al., J.Exp
Med. 86: 1315-22, 1997). Algunas vacunas
proteínicas basadas en HSP implicaban fusión del antígeno a la HSP
(Suzue, K et al., J Immunol. 156: 873-9,
1996; Suzue, K. et al., Proc Natl Acad Sci EE.UU. 94:
13146-51, 1997). Más recientemente, los presentes
inventores y sus colegas (v.g., Chen, C-H
et al., Canc. Res. 60:1035-1042
(2000)) utilizaron HSPs en la forma de vacunas quiméricas de
replicones de DNA o RNA. Los inventores utilizaron
HPV-16 E7 como antígeno fusionado a
Mycobacterium tuberculosis HSP70 y demostraron expansión y
activación incrementadas de las células T CD8+ específicas para E7,
lo que daba como resultado una inmunidad antitumoral potente contra
tumores establecidos (Lin, K.-Y. et al., Cancer Res. 56:
21-26, 1996).
Otra molécula de direccionamiento útil es el
dominio de translocación de una exotoxina A de Pseudomonas
(ETA), v.g. el dominio II (dII) de ETA (los residuos que abarcaban
253-364). Un dominio de translocación es un
polipéptido que induce translocación de la proteína o polipéptido
con el cual está enlazado en el citosol de una célula. Por ejemplo,
polipéptidos aplicables análogamente se derivan de una toxina de
Diphtheria, Clostridia (botulinum, tetani), Ántrax,
Yersinia, Vibrio cholerae, o Bordetella pertussis. El dominio
tóxico del DNA codificante de la toxina se muta o se selecciona
preferiblemente en la preparación de tales composiciones.
La calreticulina (CRT) es una proteína abundante
de 46 kDa localizada en el lumen del retículo endoplasmático (ER)
que exhibe actividad de lectina y se sabe que está implicada en el
plegamiento y ensamblaje de glicoproteínas nacientes (Nash (1994)
Mol. Cell. Biochem. 135: 71-78; Hebert
(1997) J.Cell Biol 139:613-623; Vassilakos
0998) Biochemistry 37:3480-3490; Spiro (1996)
J. Biol. Chem. 271:11588-11594. CRT se asocia
con péptidos transportados al ER por transportadores asociados con
el procesamiento de antígenos, tales como TAP-1 y
TAP-2 (Spee (1997) Eur. J. Immunol. 27:
2441-2449). CRT forma complejos in vitro con
péptidos. Estos complejos, cuando se administraron a ratones,
provocaban respuestas de células T CD8+ específicas de péptidos
(Basu (1999) J. Exp. Med. 189: 797-802; Nair
(1999) J. Immunol. 162: 6426-6432). Las CRT
purificadas de tumores de ratón provocaban inmunidad específica para
el tumor utilizado como la fuente de CRT, pero no para un tumor
antigénicamente distinto (Basu, supra). Sometiendo a pulsos
de DCs in vitro con una CRT unida a un péptido, el péptido
se presentaba nuevamente en el contexto de las moléculas de DC
clase I y estimulaba las CTLs específicas de péptidos (Nair,
supra).
El ligando Flt-3 estimula el
crecimiento de los precursores de DC y puede promover la generación
de grandes números de DCs in vivo (Maraskovsky, E. et
al., J. Exp. Med. 184: 1953-62, 1996;
Shurin MR. et al., Cell Immunol. 179:
174-84, 1997). Flt-3, un receptor de
tirosina-quinasa murino (Rosnet, O. et al.,
Oncogene 6: 1641-50, 1991) es un miembro de la
familia de quinasas receptoras III (para revisión véase Lyman, SD,
Curr. Opin Hematol. 5: 192-6 (1998). En los
tejidos hematopoyéticos, la expresión de Flt3 está restringida a
los progenitores CD34-positivos. Se utilizó Flt3
para identificar y clonar subsiguientemente el ligando
correspondiente, ligando Flt3 (Lyman, SD. et all., Cell
75: 1157-67, 1993; Hannum, C. et al., Nature
368, 643-8, 1994). La forma predominante del
ligando Flt3 se sintetiza como una proteína transmembranal a partir
de la cual se genera el ECD soluble funcionalmente similar por
escisión proteolítica (Lyman et al., supra). Estas proteínas
se fijan a y activan receptores de tirosina-quinasas
singulares. Entre las células hematopoyéticas, la expresión del
receptor Flt3 está restringida fundamentalmente a las células
progenitoras más primitivas, con inclusión de los precursores DC.
El ECD del ligando Flt3 generaba efectos
anti-tumorales potentes contra varios tumores
modelo murinos con inclusión de fibrosarcoma, cáncer de mama, cáncer
de hígado, cáncer de pulmón, melanoma y linfoma (Lynch DH et
al., Nat. Med. 3: 625-631, 1997; Chen, K et
al, Cancer Res. 57: 3511-3516, 1997; Braun, SE
et al., Hum Gene Ther. 10: 2141-2151, 1999;
Peron, JM et al., J Immunol. 161: 6164-6170,
1998; Chakravarty, PK et al, Cancer Res. 59:
6028-6032, 1999; Esche, C et al., Cancer Res.
58: 380-383, 1998.) (19). Los colegas de los
presentes inventores enlazaron DNA que codificaba la proteína HPV
Ek7 a DNA que codificaba el ECD del ligando Flt3. La inmunización
con esta construcción aumentaba espectacularmente la expansión y
activación de las células T CD8^{+} específicas del antígeno E7,
dando como resultado una inmunidad antitumoral potente contra los
tumores metastásicos establecidos que expresaban E7.
La proteína VP22 del HSV-1 es
una proteína prototipo que contribuye, entre otras cosas, a una
expansión aumentada del antígeno debida a su notable propiedad de
transporte intercelular (Elliott G., y P. O'Hare, 1997, Cell
88: 223-33) puede utilizarse (sic). Por ejemplo,
VP22 enlazada a P53 (Phelan, A. et al., 1998, Natl
Biotechnol 16: 440-443) o
timidina-quinasa (Dilber, MS et al., 1999,
Gene Ther 6: 12-21), facilitaba la extensión
de la proteína enlazada a las células circundantes in vitro y
el tratamiento de tumores modelo. VP22 enlazada al antígeno E7 de
HPV-16 en el contexto de una vacuna de DNA conducía
a un aumento espectacular en el número de precursores de células T
CD8^{+} específicas de E7 en ratones vacunados (aproximadamente
50 veces) y convertía una vacuna de DNA menos efectiva en una con
potencia significativa contra tumores que expresan E7. Un mutante
de VP22 no expansivo fracasaba en la mejora de la potencia de la
vacuna. VP22 y las proteínas que pueden tener un modo de acción
similar, contribuyen de diversas maneras a una potencia incrementada
de las vacunas: (1) facilitan la propagación del antígeno de las
células transfectadas a las APCs circundantes, aumentando con ello
el número de APCs que presentan antígeno por el camino del MHC clase
I; (2) presentan el antígeno más eficientemente en las células
transfectadas; (3) realizan el "cebado cruzado", con lo cual
la liberación de una proteína de fusión VP22/antígeno conduce a la
absorción y el procesamiento por DCs (u otras APCs) para
presentación por la vía del camino MHC-I restringido
(Huang, AY et al., 1994, Science 264:
961-965).
Los expertos en la técnica conocerán el modo de
identificar epítopes apropiados, v.g., epítopes CTL, de las
proteínas pertinentes a partir de los patógenos para uso de acuerdo
con esta invención.
El suministro de DNA, por ejemplo para efectuar
lo que se conoce generalmente como "terapia génica" implica la
introducción de un DNA "extraño" en una célula y finalmente, en
un animal vivo. Varias estrategias generales para terapia génica
han sido estudiadas y han sido revisadas extensamente (Yang,
N-S., Crit. Rev., Biotechnol.
12:335-356 (1992); Anderson, W.F., Science
256:808-813 (1992); Miller, A.S., Nature
357:455-460 (1992); Crystal, R.G., Amer. J. Med
92 (supl. 6A):44S-52S (1992); Zwiebel, J.A.
et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 618:394-404
(1991); McLachlin, J.R. et al., Prog. Nucl. Acid Res. Molec.
Biol. 38:91-135 (1990); Kohn, D.B. et al.,
Cancer Invest. 7:179-192 (1989).
Un método comprende transferencia de ácido
nucleico a células primarias en cultivo, seguido por trasplante
autólogo de las células transformadas ex vivo al hospedador,
sea sistémicamente o en un órgano o tejido particular.
Para la consecución de los objetivos de la
presente invención, la terapia con ácido nucleico podría realizarse
por transferencia directa de un DNA funcionalmente activo en tejido
somático de mamífero u órgano in vivo. La transferencia de
DNA puede conseguirse utilizando cierto número de métodos descritos
más adelante. Estos sistemas pueden testarse para expresión con
éxito in vitro por el uso de un marcador seleccionable (v.g.,
resistencia a G418) para seleccionar clones transfectados que
expresan el DNA, seguido por detección de la presencia del producto
de expresión de B7-DC (después de tratamiento con el
inductor en el caso de un sistema inducible) utilizando un
anticuerpo para el producto en un inmunoensayo apropiado. La
eficiencia del procedimiento, con inclusión de la absorción de DNA,
integración de plásmido y estabilidad de los plásmidos integrados,
puede mejorarse por linealización del DNA plasmídico utilizando
métodos conocidos, y co-transfección utilizando DNA
de mamífero de peso molecular alto como "vehículo".
Ejemplos de "transferencia génica" con
éxito consignados en el artículo incluyen: (a) inyección directa de
DNA plasmídico en tejido muscular de ratones, que condujo a la
expresión de genes marcadores durante un periodo de tiempo
indefinido (Wolff, J.A. et al., Science 247: 1465 (1990);
Acsadi, G. et al., The New Biologist 3: 71 (1991)); (b) los
vectores retrovirales son eficaces para infección in vivo e
in situ de tejidos de vasos sanguíneos; (c) la inyección en
la vena portal y la inyección directa de preparaciones retrovirales
en el hígado producían transferencia y expresión génica in
vivo (Horzaglou, M. et al., J. Biol. Chem. 265:17285
(1990); Koleko, M. et al., Human Gene Therapy 2:27 (1991);
Ferry, N. et al., Proc. Acad, Sci. USA 88:8387 (1991)); (d)
la infusión intratraqueal de adenovirus recombinante en tejidos
pulmonares era eficaz para transferencia in vivo y expresión
prolongada de genes extraños en el epitelio respiratorio del pulmón
(Rosenfeld, M.A. et al., Science 252: 431 (1991); (e)
vectores virales de herpes simplex consiguieron transferencia
génica in vivo en tejido cerebral (Ahmad, F. et al.,
compiladores, Miami Short Reports - Advances in Gene Technology:
The Molecular Biology of Human Genetic Disease, Vol 1,
Boehringer Mannheim Biochemicals, EE.UU., 1991).
La terapia humana mediada por retrovirus utiliza
sistemas de retrovirus anfotróficos, deficientes en replicación
(Temin, H.M., Human Gene Therapy 1:111 (1990); Temin et
al, Patente de EE.UU. 4.980.289; Temin et al., Patente
de EE.UU. 4.650.764; Temin et al, Patente de EE.UU. No.
5.124.263; Wills, J.W. Patente de EE.UU. 5.175.099; Miller, A.D.,
Patente de EE.UU. No. 4.861.719). Tales vectores han sido utilizados
para introducir DNA funcional en células o tejidos humanos, por
ejemplo, el gen de adenosina-desaminasa en
linfocitos, el gen NPT-II y el gen para el factor
de necrosis tumoral en los linfocitos infiltrantes de tumores. El
suministro de genes mediados por retrovirus requiere generalmente
la proliferación de dianas celulares para transferencia génica
(Miller, D.G. et al., Mol. Cell. Biol. 10: 4239 (1990). Esta
condición es satisfecha por algunas de las células diana preferidas
en las cuales deben introducirse las presentes moléculas de DNA, es
decir, células de tumores que crecen activamente. La terapia génica
de la fibrosis quística utilizando transfección por plásmidos con
utilización de cualquiera de cierto número de métodos y por vectores
retrovirales ha sido descrita por Collins et al., Patente de
EE.UU. 5.240.846.
Las moléculas de DNA que codifican las
secuencias de B7-DC pueden empaquetarse en vectores
de retrovirus utilizando líneas de células de empaquetamiento que
producen retrovirus eficientes en replicación, como es bien conocido
en la técnica (véase, por ejemplo Cone, R.D. et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 81: 6349-6353 (1984);
Mann, R.F. et al., Cell 33:153-159 (1983);
Miller, A.D. et al., Molec. Cell. Biol.
5:431-437 (1985); Sorge, J., et al., Molec.
Cell. Biol. 4:1730-1737 (1984); Hock, R.A. et
al., Nature 320:257 (1986); Miller, A.D. et al., Molec.
Cell. Biol. 6:2895-2902 (1986). Nuevas líneas de
células de empaquetamiento que son eficientes y seguras para
transferencia génica han sido también descritas (Bank et al.,
documento EE.UU. 5278056).
Este método puede utilizarse con especificidad
de sitio para suministrar el vector retroviral al tejido u órgano
de elección. Así, por ejemplo, puede utilizarse un sistema de
suministro mediante catéter (Nabel, EG et al., Science 244:
1342 (1989)). Tales vectores, que utilizan un vector retroviral o un
vector de liposoma, son particularmente útiles para suministrar el
ácido nucleico a expresar a una pared de vaso sanguíneo, o al
interior de la circulación sanguínea de un tumor.
Pueden utilizarse también otros vectores
virales, que incluyen adenovirus recombinantes (Horowitz, M.S., en:
Virology, Fields, BN et al., compiladores, Raven
Press, Nueva York, 1990, p. 1679; Berkner, K.L., Biotechniques
6:616 9191988), Strauss, S.E., en: The Adenoviruses,
Ginsberg, HS, compilador, Plenum Press, Nueva York, 1984, capítulo
11), virus del herpes simplex (HSV) para suministro y persistencia
específicos en las neuronas. Ventajas de los vectores de adenovirus
para terapia génica humana incluyen el hecho de que la
recombinación es rara, no se conocen enfermedades malignas humanas
que estén asociadas con tales virus, el genoma del adenovirus es
DNA bicatenario que puede manipularse para aceptar genes extraños de
hasta 7,5 kb de tamaño, y el adenovirus vivo es un organismo de
vacuna humana seguro. El virus adenoasociado es también útil para
terapia humana (Samulski, R.J. et al., EMBO J. 10: 3941
(1991) de acuerdo con la presente invención.
Otro vector que puede expresar la molécula de
DNA de la presente invención, y es útil en el escenario terapéutico
presente, particularmente en humanos, es el virus vaccinia, que
puede hacerse no replicante (Patentes de EE.UU. 5.225.336;
6.204.243; 5.155.020; 4.769.330; Sutter G. et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA (1982) 89: 10847-10851;
Fuerst, T. R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1989)
86:2549-2553; Falkner F.G. et al.; Nucl. Acids
Res (1987) 15:7192; Chakrabarti, S et al., Molec. Cell.
Biol. (1985) 5:3403-3409). Descripciones de
virus vaccinia recombinante y otros virus que contienen DNA
heterólogo y sus usos en inmunización y terapia con DNA se revisan
en: Moss, B., Curr. Opin. Genet Dev. (1993)
3:86-90; Moss, B. Biotechnology (1992)
20: 345-362; Moss, B., Curr Top Microbiol
Immunol (1992)158:25-38; Moss, B.,
Science (1991) 252:1662-1667;
Piccini, A et al., Adv. Virus Res. (1988)
34:43-64; Moss, B. et al., Gene Amplif Anal
(1983) 3:201-213.
Además de DNA o RNA desnudo, o vectores virales,
pueden utilizarse como vectores bacterias modificadas por
ingeniería genética. Cierto número de cepas bacterianas que incluyen
Salmonella, BCG y Listeria monocytogenes (LM)
(Hoiseth & Stocker, Nature 291,
238-239 (1981); Poirier, TP et al. J. Exp.
Med 168, 25-32 (1988); (Sadoff, J.C.,
et al., Science 240, 336-338 (1988);
Stover, C.K., et al., Nature 351,
456-460 (1991); Aldovini, A. et al., Nature
351, 479-482 (1991); Schafer, R., et al.,
J. Immunol. 149, 53-59 (1992);
Ikonomidis, G. et al., J. Exp. Med 180,
2209-2218 (1994)). Estos organismos exhiben dos
características prometedoras para uso como vectores de vacunas: (1)
rutas de infección entéricas, que proporcionan la posibilidad de
suministro oral de vacunas; y (2) infección de monocitos/macrófagos
direccionando con ello los antígenos a las APCs profesionales.
Además de la transferencia génica mediada por
virus in vivo, pueden utilizarse medios físicos bien
conocidos en la técnica para transferencia directa de DNA, que
incluyen la administración de DNA plasmídico (Wolf et al.,
1990 supra) y la transferencia génica mediada por bombardeo
con partículas (Yang, N.-S., et al., Proc. Natl Acad Sci.
USA 87:9568 (1990); Williams, R.S. et al., Proc. Natl. Acad
Sci. USA 88:2726 (1991); Zelenin, A.V, el al., FEBS
Lett. 280:94 (1991); Zelenin, A.V. et al, FEBS Lett.
244:65 (1989); Johnston, S.A. et al., In Vitro Cell. Dev.
Biol. 27:11 (1991)). Adicionalmente, la electroporación, un
medio bien conocido para transferir genes a células in vitro
puede utilizarse para transferir moléculas de DNA de acuerdo con la
presente invención a los tejidos in vivo (Titomirov, A.V.
et al., Biochim. Biophys. Acta 1088: 131 (1991)).
Se ha descrito también la "transferencia
génica mediada por vehículo" (Wu, C.H. et al., J Biol. Chem.
264:16985 (1989); Wu, G.Y. et al., J. Biol. Chem.
263:14621 (1988); Soriano, P. et al, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 80:7128 (1983); Wang, C-Y. et al, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 84:7851 (1982); Wilson, J.M. et al, J.
Biol Chem. 267:963 (1992)). Vehículos preferidos son liposomas
direccionados (Nicolau, C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
80: 1068 (1983); Soriano et al., supra) tales como
inmunoliposomas, que pueden incorporar mAbs acilados en la bicapa
lipídica (Wang et al., supra). Pueden utilizarse policationes
tales como asialoglicoproteína/polilisina (Wu et al., 1989,
supra), donde el conjugado incluye una molécula que reconoce
el tejido diana (v.g., asialoorosomucoide en el caso del hígado) y
un compuesto de fijación de DNA para fijar al DNA a transfectar. La
polilisina es un ejemplo de una molécula de fijación de DNA que fija
DNA sin deteriorarlo. Este conjugado se compleja luego con DNA
plasmídico de acuerdo con la presente invención para
transferencia.
El DNA plasmídico utilizado para transfección o
microinyección puede prepararse utilizando métodos bien conocidos
en la técnica, por ejemplo utilizando el procedimiento de Qiagen
(Qiagen), seguido por purificación del DNA utilizando métodos
conocidos, tales como los métodos ilustrados en esta memoria.
Una vez más, como se ha indicado arriba, para la
utilidad de las moléculas transducidas B7-DC de
acuerdo con esta invención puede no requerir expresión estable. En
lugar de ello, la expresión transitoria del polipéptido puede ser
suficiente para que las células transducidas realicen su función
inmunógena y/ coestimuladora.
Una vez descrita en líneas generales la
invención, la misma se comprenderá más fácilmente por referencia a
los ejemplos que siguen, lo cual se proporcionan a modo de
ilustración, y debe entenderse que no limitan la presente
invención, a no ser que se especifique.
Se adquirieron de NCI ratones BALB/c hembra de 6
a 12 semanas y se utilizaron para preparación de DC y
macrófagos.
Se cultivaron DCs derivadas de médula ósea en
medio RPMI1640 (Gibco BRL), complementado con 5% de suero de
ternero fetal (FCS) (Hyclone), penicilina/estreptomicina (JRH
Biosciences), gentamicina (Sigma), aminoácidos no esenciales (JRH
Biosciences), L-glutamato (JRH Biosciences),
piruvato de sodio (Sigma), 2-mercaptoetanol (Sigma)
y 1000 unidades/ml de GM-CSF murino recombinante
(Immunex) como se ha descrito previamente (26). El día 8, las DCs
derivadas de médula ósea se tiñeron con anticuerpos monoclonales por
métodos convencionales. El anticuerpo monoclonal contra MHC clase
II, 14-4-4s, se purificó a partir de
sobrenadante de hibridoma. El Dr. William Baldwin, Universidad
Johns Hopkins, suministró amablemente la molécula de fusión
CTLA4-Ig. Los anticuerpos para MHC clase I
(28-14-8), F4/80
(C1.A3-1), B7.1 (1G10), B7.2 (GL1), FcyRII/III
(2.4G2) y Mac-1 (M1/70) se adquirieron de
PharMingen. Para la preparación del cDNA de test, se purificaron las
células el día 8 por medio del seleccionador de células utilizando
14-4-4s y CTLA4-Ig
en el Centro de Oncología de la Universidad Johns Hopkins. La
pureza de la población de MHC clase II^{hi} y B7^{hi} después de
la selección era 93-98%.
Se cultivaron macrófagos derivados de médula
ósea con medio RPMI-1640 complementado con 10% FCS,
penicilina/estreptomicina, aminoácidos no esenciales, piruvato de
sodio, L-glutamina, 2-mercaptoetanol
y 250 unidades/ml de M-CSF murinos recombinantes, y
se trataron con 500 unidades/ml de \gamma-IFN
(PharMingen) y 5 \mug/ml de LPS (Sigma) como se ha descrito
previamente (27). Después de la estimulación, se confirmó la
expresión en la superficie celular de MHC clase II y B7 utilizando
análisis por citometría de flujo el día 10 de cultivo.
Las líneas de células macrófagos
WEHI-3, RAW264.7, J774.A.1, PU5-1.8
fueron proporcionadas amablemente por el Dr. Joshua Farber de los
NIAID, Institutos Nacionales de la Salud. Las mismas se cultivaron
con el medio recomendado por la ATCC.
El día 8, DCs derivadas de BM caracterizadas
como MHC clase II^{hi} y B7^{hi} se testaron respecto a su
capacidad para estimular las células T alogénicas en MLC. Se
llevaron a cabo reacciones MLC en microplacas de 96 pocillos con
fondo plano por adición de número creciente de células s
estimuladoras BALB/c a 3 x 10^{5} linfocitos C57BL/6 alogénicos.
Después de 3 días de cultivo, se evaluó la proliferación de células
T por adición de 1 \muCi de
[^{3}H]-metil-timidina (Amersham)
a cada pocillo durante las 18 h finales de cultivo. Las células se
cosecharon luego, y se determinó la incorporación de radiactividad
utilizando un contador \beta (Packard 96).
El RNA total de DCs seleccionadas y macrófagos
activados se extrajo con TRIZOL (Gibco BRL). El RNA mensajero se
purificó con el kit de purificación de mRNA Oligotex (Qiagen). Los
inventores utilizaron el sistema de síntesis de cDNA SMART basado
en PCR (Clonetech) para amplificar el cDNA, seguido por el sistema
de sustracción PCR Select basado en PCR (Clonetech). La sustracción
se llevó a cabo siguiendo el protocolo del fabricante. Después de
la PCR sustractiva final, los fragmentos de DNA se ligaron en
vectores plasmídicos pCR2.1 (Invitrogen) o pCR Blunt (Invitrogen).
Después de la transformación, cada clon se dejó crecer para
amplificación del DNA plasmídico y DNA Miniprep, y se digirió luego
con EcoRI para confirmar la presencia de las inserciones. Se
realizó luego una transferencia de puntos de plásmido para confirmar
que el cDNA clonado es específico de las células dendríticas. Los
DNAs Miniprep alcalinas desnaturalizadas se aplicaron en forma de
puntos sobre membrana Hybond N+ (Amersham) y se hibridaron con cDNA
SMART derivado de una sonda de DCs seleccionadas o macrófagos
activados. Estas sondas de cDNA se marcaron con ^{32}P utilizando
un método de marcación con iniciadores aleatorios (Stratagene
Prime-It II). Las hibridaciones y el lavado se
realizaron como ha sido descrito previamente (28). Las membranas se
expusieron a una película (Amersham) durante 1-2
días y se revelaron.
Las muestras de DNA Miniprep alcalinas
desnaturalizadas se aplicaron en forma de mancha sobre membrana
Hybond N+ (Amersham) y se hibridaron con cDNA Smart® derivado de
sondas de DCs seleccionadas o macrófagos activados. Estas sondas de
cDNA se marcaron con ^{32}P utilizando un método de marcación con
iniciadores aleatorios (Stratagene Prime-It II).
Las hibridaciones y el lavado se realizaron como se ha descrito
previamente [citas ??] (sic). Para autorradiografía, las
membranas se expusieron a una película (Amersham) durante
1-2 días y se revelaron.
Se cosecharon DCs derivadas de médula ósea el
día 8 sin seleccionar. Aproximadamente 20% a 40% de estas células
expresaban una proporción elevada de MHC clase II y B7. La
extracción de RNA total seguida por purificación de poliA RNA se
realizó como se ha descrito arriba. Para la construcción de una
biblioteca de DC iniciada con oligo dT se utilizó el sistema de
síntesis de cDNA Lambda ZAP Express (Stratagene). El fragmento de
DNA PCR de B7-DC se sondó y se utilizó para
cribado. Se realizaron transferencia de membrana, desnaturalización
y renaturalización, utilizando el protocolo de Stratagene. La
radiomarcación de sondas, hibridación, lavado, y autorradiografía
se realizaron como se ha descrito arriba. Los clones positivos se
aislaron y se realizó un segundo cribado. Después del segundo
cribado, los plásmidos se escindieron por escisión in vivo y
se testaron por transferencia de puntos y secuenciación. La
secuenciación fue realizada por la Core Facility en la Escuela de
Medicina de la Universidad Johns Hopkins. Se utilizó el programa
BLAST para realizar la búsqueda de homología de la secuencia de
nucleótidos contra Genbank (NCBI) respecto a semejanza con genes
consignados previamente. El clon de cDNA de longitud total
B7-DC se extrajo de la biblioteca de cDNA de DC. Se
realizó 5' RACE utilizando el kit de amplificación de cDNA SMART
RACE (Clontech). Los productos de la 5'-RACE se
clonaron en el vector pCR2.1 y se secuenciaron. Se obtuvieron dos
clones B7-DC más de longitud total por
RT-PCR y se compararon sus secuencias a fin de
evitar error de secuenciación.
Se clonó B7-DC humana como
sigue: se obtuvieron DCs humanas a partir de células mononucleares
de sangre periférica normal por cultivo en GM-CSF +
IL-4 o GM-CSF +
Flt-3L como se ha descrito previamente (29). Se
extrajo el RNA como se ha descrito arriba. Una búsqueda BLAST
identificó un clon EST solapante, número de acceso en GenBank
AK001879, con homología a B7-DC de ratón. Se realizó
5' RACE como se ha descrito arriba. Los inventores secuenciaron un
fragmento PCR 5'-RACE y diseñaron un iniciador
correspondiente a 5'-UTR de B7-DC
humana. Se utilizaron los iniciadores siguientes en la
5'-UTR y 3'-UTR de
B7-DC para amplificar la B7-DC
humana de longitud total:
\newpage
Las secuencias de cDNA de longitud total de los
cDNAs de B7-DC humana y murina han sido depositadas
en EMBL/GenBank/DDBS bajo los números de acceso AF329193 y
AF142780.
El cribado de la biblioteca BAC siguió el
protocolo del fabricante (Genome Systems, Inc.). Iniciadores
utilizados:
El cribado de la biblioteca BAC obtuvo 3 clones
positivos. El mapeado de la localización cromosómica se realizó por
hibridación con fluorescencia in situ (Genome Systems Inc.). Se
analizaron un total de 80 células en metafase, exhibiendo 79 de
ellas marcación específica. El mapeado de B7-DC
humana se realizó por utilización de herramientas bioinformáticas
disponibles, el programa BLAST de NCBI y el International RH Mapping
Consortium. La secuencia de hB7-DC se investigó en
htsg y se encontró que mapeaba para dos clones BAC,
RP11-574F11 (AL1621253) y
Rp11-635N21 (AL354744) que estaban localizados en
el cromosoma 9.
Se adquirieron de NCI ratones Balb/c hembra de
4-6 semanas de NCI y se utilizaron para preparación
de RNA tisular. La extracción de RNA y la síntesis SMART de cDNA
para los tejidos, DCs seleccionadas y macrófagos activados se
purificaron como se ha descrito arriba. Los cDNAs SMART PCR se
modificaron por medio del kit de purificación PCR (Qiagen). Se
pasaron 0,5 \mug/pista de DNAs purificados en un gel de agarosa
al 1% y se transfirieron a una membrana de nailon Nytran
(Schleicher y Schuell). Para preparar las sondas radiactivas, se
amplificaron DNAs plasmídicos sustraídos derivados de una biblioteca
como moldes. Los inventores amplificaron el DNA por PCR utilizando
series de iniciadores inmediatamente adyacentes al sitio de
clonación del DNA plasmídico y se utilizó el DNA PCR purificado de
cada uno de los clones para sondas de hibridación. Las secuencias de
nucleótidos de estos iniciadores son como sigue:
Se realizó también un análisis Northern virtual
de RNA total de DCs humanas y de la placenta de control. Las sondas
utilizadas y la preparación de RNA se han descrito arriba. La
radiomarcación, hibridación, lavado y autorradiografía de las
sondas se realizaron como se ha descrito arriba.
Se utilizaron transfectantes estables de
B7-DC en líneas de células DC2.4, RAW246.7 y RENCA
para inmunizar hámsters armenios. La B7-DC se clonó
en el vector pCAGGS modificado (30). Los hámsters se reforzaron tres
veces con plásmidos que contenían B7-DC (Rockland).
El anticuerpo anti-B7-DC utilizado
en este estudio procedía de los sueros de uno de los tres hámsters
inmunizados.
Se transfectaron células 293T con
B7.1-pCAGGS,
B7-DC-pCAGG,
PD-1-pCAGGS o vector solo utilizando
Lipofectamina 2000 (Gibco BRL). Después de 24 horas, se
suspendieron de nuevo las células en tampón FACS (1 x HBSS, 2% suero
de ternero, HEPES 10 mM y 0,1% de NaN_{3}) y se centrifugaron a
1000 rpm durante 5 min a 4ºC. El tampón se decantó luego, se añadió
anticuerpo a los tubos, se incubó a 4ºC durante 20 min, se lavó dos
veces con tampón FACS, y se repitió esto para el anticuerpo
secundario. Las muestras se hicieron pasar sobre FACScan. El
anticuerpo B7.1 se utilizó en dilución 1:5, 10 \mul/muestra
(Cal-Tag). Se utilizaron quimeras recombinantes
CD28-Ig, CTLA-4-Ig y
PD-1-Ig a 2 \mug/ml, 10
\mul/muestra (R&D Systems, Inc). Se utilizó
IgG-PE anti-humana de cabra
F(ab')_{2} a dilución 1:20 (Southern Biotechnology
Associates, Inc.).
Se fabricó la construcción
B7-DC-Ig por fusión de la secuencia
que codificaba los aminoácidos N-terminales de
B7-DC sin el dominio transmembranal en marco con la
secuencia codificante de los aminoácidos
C-terminales del Fc de IgG_{1} en el vector
pIg-TailPlus (R&D Systems). Se transfectaron
transitoriamente células COS-7 con
pIg/B7-DC utilizando Lipofectamine 2000 (GIBCO BRL)
o GINE JAMMER (Stratagene). La proteína de fusión
B7-DC-Ig se purificó de los
sobrenadantes exentos de suero utilizando la precipitación con
sulfato de amonio saturado. La SDS-PAGE y la
tinción con plata demostraron una pureza superior a 90%.
Para los ensayos de coestimulación con
anti-CD3, se recubrieron previamente placas de 96
pocillos con fondo plano (Immunol 4 de Dinex) con anticuerpos
anti-CD3 (2C11, Pharmingen) y se diluyeron
B7.1-Ig (R&D Systems),
B7-DC-Ig o control Isotipo (Sigma) a
100 ng/ml en 1X PBS (Gibco), pH 7,4, durante 2 horas a 37ºC. Se
lavaron luego las placas 3 veces con 1X PBS y se bloquearon con
medio RPMI1640 complementado con 10% FCS, penicilina/estreptomicina,
aminoácidos no esenciales, piruvato de sodio,
L-glutamina y 2-mercaptoetanol
durante media hora antes de añadir células T. Se obtuvieron bazos y
ganglios linfáticos de ratones BALB/c de 6 a 10 semanas. Se lisaron
los RBCs utilizando tampón ACK y las células T se purificaron
utilizando Dynabeads M-280 (Dynex), con el método
indirecto. Las cuentas se lavaron dos veces con PBS pH 7,4 + 1% FCS
antes de añadir las células, y se añadió un cóctel de anticuerpos
compuesto de anti-IE^{d} y B220/CD45RO o
CD8\alpha (Pharmingen), a las células y se incubaron a 4ºC con
mezcladura bidireccional durante 30 minutos. Las células se aislaron
poniendo el tubo en un MPC Dynal durante 5 min, se centrifugaron a
1500 rpm durante 5 min y se lavaron dos veces con PBS de pH 7,4 +
1% de FCS para eliminar los Abs no fijados. Se repitió el mismo
procedimiento con incubación durante 15 min, y las células se
extendieron a 2 x 10^{5} células/pocillo. Después de 72 h de
incubación, se añadieron a cada pocillo 10 \mul de
^{3}H-timidina (1 \muCi/pocillo) y se incubaron
durante 18 horas. Las células se cosecharon con un Cosechador de
Células Packard Micromate, y los filtros se leyeron en un contador
beta Packard Matrix 96 Direct.
Para ensayos de coestimulación utilizando el
sistema RENCA para representar el antígeno HA, se cultivaron
células RENCA con medio RPMI-1640 complementado con
10% de FCS, penicilina/estreptomicina, aminoácidos no esenciales y
piruvato de sodio. Se indujo con IFN-\gamma (75
U/ml) durante 72 horas para la expresión del MHC clase II. Se
irradiaron luego con 13.200 Rad. y se extendieron en placas a 2 x
10^{4} células/pocillo (placas de 96 pocillos con fondo plano).
Se añadió luego el péptido HA 110-120 a 2,5
\mug/pocillo y se añadieron diversas concentraciones de las
moléculas de fusión con Ig. Se aislaron células transgénicas
I-E^{d} + células T específicas de HA (obsequio
amable de H. von Boehmer, Universidad de Harvard) como se ha
descrito arriba y se extendieron a razón de 4 x 10^{5}
células/pocillo. Después de 48 horas de incubación, se añadieron a
cada pocillo 10 \mul de ^{3}H-timidina (1
\muCi/pocillo) y se incubaron durante 18 horas. Las células se
cosecharon con un Cosechador de Células Packard Micromate y los
filtros se leyeron en un contador beta Packard Matrix 96
Direct.
Para el análisis de la producción de citoquinas
por ELISA, se prepararon los cultivos como se ha descrito arriba y
se recogieron los sobrenadantes en los momentos indicados. Se
determinaron las concentraciones de IL-2,
IL-10 e IFN-\gamma utilizando kits
ELISA disponibles comercialmente (Endogen), e IL-4 e
IL-6 (R&D Systems).
LNs axilares, inguinales, cervicales, y
mesentéricas agrupadas de la línea de ratones transgénicos TCR 6.5
que expresa un TCR que reconoce un epítope HA
I-E^{d} restringido (^{110}SFERFEIFPKE^{120}
[SEQ ID NO: 12]) en un fondo genético B10.D2 se disociaron en medio
RPMI (GIBCO BRL), se pasaron sobre un filtro de células de nailon
de 100 \mum, y se lavaron en tampón Hank's estéril (GIBCO BRL).
Después de tinción con FACS® para determinar la proporción de
células CD4 clonotípicas, se inyectó una preparación de células que
contenía 2,5 x 10^{6} células clonotípicas en 0,2 ml de tampón
Hank's estéril por vía intravenosa (i.v.) en la vena del rabo de
los ratones receptores B10.D2. Tres días después de esta
transferencia adoptiva, se vacunaron los animales por inyección
subcutánea (s.c.) en las plantas de las patas posteriores. Cada
ratón recibió inyecciones bilaterales de una de tres
preparaciones:
preparaciones:
(A) 10 \mug de HA sintético (por pata)
(péptido HA (110-120) combinado en una relación 1:1
v/v con Adyuvante de Freund Incompleto (IFA) (Sigma),
(B) la mezcla HA-IFA con 25
\mug de B7-DC-Ig, o
(C) la mezcla HA-IFA con 25
\mug de un anticuerpo de control isotipo. Siete días después, se
cosecharon los ganglios LNs drenantes; se incubaron 1,5 x 10^{5}
células LN en placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos con fondo
redondo con la concentración indicada de péptido HA sintético. Se
realizaron ensayos de proliferación sometiendo a pulsos durante 48
h los cultivos con 1 \muCi de [^{3}H]timidina e
incubación durante 12 horas adicionales antes de la cosecha y
determinación de la cantidad de radiactividad incorporada.
\vskip1.000000\baselineskip
Se aisló B7-DC de una biblioteca
sustraída entre DCs y macrófagos activados. Las dos poblaciones
utilizadas para sustracción de cDNA eran DCs cultivadas en
GM-CSF derivados de médula ósea como la población
"comprobadora" y macrófagos M-CSF derivados de
médula ósea adherentes activados con
\gamma-interferón + LPS como la población
"impulsora". El día 8, se seleccionaron DCs "maduras" del
MHC clase II^{hi}B7^{hi} a >93% de pureza como la fuente de
cDNA comprobadora. Se caracterizaron las DCs por citometría de
flujo, teniendo niveles aproximadamente 50 veces mayores de MHC
clase II que los macrófagos. Ambas poblaciones expresaban B7.1 y
B7.2, aunque los niveles de B7.2 eran significativamente mayores en
las DCs. F4/80 y CD16 se expresaban a niveles mayores en la
población de macrófagos. La comparación funcional de las dos
poblaciones demostró que la población de DC era aproximadamente 100
veces más potente que la población de macrófagos en la estimulación
de una reacción de linfocitos alogénicos mixtos.
Después de la extracción del RNA de ambas
poblaciones, se utilizó un sistema de síntesis de cDNA basado en
PCR, seguido por el procedimiento de sustracción basado en PCR, PCR
Select. U/no de los clones expresados diferencialmente codificaba
un nuevo miembro de la familia de supergenes de inmunoglobulina, que
fue designado por los inventores como B7-DC. El
cDNA de B7-DC murino tiene \sim 1,7 kb de
longitud, codificando una proteína precursora de 247 aminoácidos
(aa) con un péptido señal N-terminal de 23 aa y un
peso molecular predicho de \sim 25 kd (Tabla 1). La secuencia
conductora supuesta y el dominio transmembranal se identificaron
utilizando el programa SOSUI (31). Se encuentran dos aa cargados
dentro del dominio transmembranal de 23 aa de
mB7-DC, lo que sugiere una posible pareja de
fijación. Al nivel de aa, la B7-DC murina es 70%
idéntica a la B7-DC humana, lo que indica que las
mismas son ortólogas (véanse las tablas siguientes). La
hB7-DC difiere ligeramente de la
B7-DC murina en que tiene una cola citoplásmica más
larga.
Mediante una búsqueda de homología, se encontró
que B7-DC tiene homología significativa con
B7-H1 (34% de identidad, 48% de semejanza) (Tabla
2), en menor extensión butirofilina (30% identidad, 45 semejanza), y
< 20% identidad con B7.1 y B7.2 (Tabla 3). Los estudios
filogenéticos indican que butirofilina está análogamente
relacionada con la familia B7 por desordenamiento de exones (32,
33). Cada una de ellas posee la estructura canónica
IgV-IgC y un dominio transmembranal. En contraste
con los otros miembros de la familia B7, la B7-DC
murina tiene una cola citoplásmica extremadamente corta (4 aa).
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Para determinar la estructura genómica de
mB7-DC, los autores de la presente invención
aislaron un clon genómico por cribado de una biblioteca de
Cromosomas Artificiales Bacterianos (BAC) agrupados utilizando
sondas de las UTRs 5' y 3'. El mapeado de la localización
cromosómica se realizó utilizando los clones BAC. La localización
de los cromosomas de B7-DC se realizó utilizando
hibridación in situ con fluorescencia (FISH). Medidas de 10
cromosomas 19 marcados específicamente demostraron que
mB7-DC está localizada en una posición que se
encuentra a 47% de la distancia del límite
heterocromático-eucromático respecto al telómero del
cromosoma 19, un área que corresponde a la interfaz entre las
bandas 19C2 y 19C3. Se detectaron señales específicas de
hibridación por incubación de los portaobjetos hibridados en
anticuerpos antidigoxigenina marcados con fluoresceína seguida por
contratinción con DAPI. Este locus corresponde a una región del
cromosoma 9 humano, en la que se ha mapeado
hB7-H1.
Se encontró que hB7-DC está
localizada en dos clones BAC del cromosoma 9. Adicionalmente, se
encontró que tanto hB7-DC como
hB7-H1 están localizadas en un solo clon BAC del
cromosoma 9 con un tamaño de inserción de aproximadamente 164 kb
(Figura 1). La proximidad genómica de B7-DC y
B7-H1 es una reminiscencia del par B7.1/B7.2, que
mapean dentro de una megabase una de otra.
\vskip1.000000\baselineskip
A fin de determinar el patrón de expresión de
B7-DC, se realizó un análisis Northern virtual
utilizando RNA extraído de tejidos múltiples, líneas de células
macrófagos, cultivos de macrófagos y células dendríticas derivadas
tanto de médula ósea como de bazo. Si bien se detectó una
hibridación fuerte utilizando una sonda B7-DC en DC
inmaduras (día 4, 6) y maduros (día 8 y MHC II^{hi}B7^{hi}
seleccionados) derivadas de médula ósea y DC esplénicas, no se
detectó señal alguna en ninguna de las cuatro líneas de células
macrófagos, macrófagos BM activados o macrófagos peritoneales
(Figura 2). Se detectó una expresión fuerte de
hB7-DC en DCs humanas cultivadas a partir de
células mononucleares de sangre periférica con
GM-CSF más IL-4 o
Flt-3L (Figura 3). A fin de verificar la expresión
en la superficie celular de la proteína B7-DC, se
utilizaron anticuerpos anti-mB7-DC
para teñir DCs. Se observó en DC una tinción bloqueable con
B7-DC-Ig soluble (Figura 4).
Aunque B7-DC tiene homología
estructural y secuencial con la familia B7, no contiene la secuencia
de fijación CD28/CTLA-4 supuesta, SQDXXXELY [SEQ ID
NO: 13] o XXXYXXRT [SEQ ID NO: 14] (34) (donde X = cualquier
aminoácido). Para evaluar directamente la fijación, se investigó la
capacidad de CD28-Ig dímera y
CTLA-4-Ig para teñir las células
293T transfectadas con B7-DC o B7.1. Mientras que se
observó fijación fuerte con los transfectantes B7.1, no se apreció
fijación alguna a los transfectantes B7-DC (Figura
5). Basándose en homología y proximidad genómica entre
B7-DC y B7-H1/PDL1, se condujeron
experimentos para testar PD-1 como pareja de
fijación candidata para B7-DC. De hecho,
PD-100IG se fijaba a los transfectantes
B7-DC, pero no a los transfectantes B7.1. La
fijación de BPD-1-Ig a los
transfectantes B7-DC era menor que la fijación de
CTL-4-It y CD28-Ig a
los transfectantes B7.1, aunque era específica. La confirmación
ulterior de la fijación de PD-1 a
B7-DC se obtuvo por tinción positiva de
transfectantes estables B7-DC-GFP
con PD-1-Ig. Se llegó a la
conclusión de que, como en el caso de B7-H1 y
B7h/B7RP-1, B7-DC no utiliza CD28 o
CTLA-4 como receptores. En lugar de ello,
PD-1 parece ser un receptor para
B7-DC.
\vskip1.000000\baselineskip
Se produjo una proteína de fusión soluble
B7-DC-Ig que podría añadirse a los
ensayos de estimulación de las células T para uso con objeto de
testar si B7-DC poseía actividad coestimuladora. La
respuesta proliferativa de las células T se midió respecto a la
estimulación por cantidades crecientes de anti-CD3
inmovilizados en presencia de
B7-DC-Ig, B7.1-Ig o
un control isotipo. La Figura 6 (izquierda) muestra que, en
presencia de una concentración subóptima de
anti-CDE3, B7-DC coestimulaba una
respuesta proliferativa de las células T mayor que lo hacía B7.1.
Adicionalmente, las respuestas proliferativas coestimuladas por
B7-DC eran mayores en las células CD4 que en las
CD8 (Figura 6, derecha). B7-DC no conseguía
estimular las células T en ausencia de un estímulo enfocado de TCR,
lo que indicaba que B7-DC proporcionaba una señal
coestimuladora verdadera.
B7-DC coestimulaba también
respuestas proliferativas cuando la "señal 1" era proporcionada
por un complejo MHC-péptido. Se trataron células
RENCA (que no expresan B7.1, B7.2 o B7-DC endógena
alguna por análisis RT-PCR) con
\gamma-IFN para inducir la expresión de MHC clase
II. Estas células se cargaron con el péptido
HA110-120 restringido en I-E^{d}
(FERFEIFPKE) (35) [SEQ ID NO: 15]. Se añadieron células T esplénicas
purificadas de una línea de ratones transgénicos TCR específica
I-E^{d} + HA110-120 y se midió la
respuesta proliferativa en presencia de
B7-DC-Ig, B7.1-Ig o
un control isotipo. La Figura 7 muestra que B7-DC
poseía mayor actividad coestimuladora que lo hacía B7.1.
La respuesta mejor caracterizada de las células
T a la coestimulación por las moléculas de la familia B7 es la
producción de linfoquinas. Estas linfoquinas son mediadores
importantes de los efectos de las células T. Se realizaron estudios
para analizar la producción de cierto número de linfoquinas
diferentes por células T que se habían estimulado con antígeno
anti-DC3 o HA (Figura 8) coestimulado con
B7-DC-Ig, B7.1-Ig o
un control isotipo. Los patrones de la coestimulación de
linfoquinas eran satisfactoriamente concordantes tanto si se
utilizaba como "señal 1" anti-CD3 o un complejo
MHC-péptido. Resulta significativo que
B7-DC coestimulaba niveles mayores de
\gamma-IFN que lo hacía B7.1.
B7-DC coestimulaba también cantidades significativas
de producción de IL-6, en tanto que B7.1 no
coestimulaba prácticamente cantidad alguna. Si bien ambas moléculas
coestimulaban la producción de IL-2, B7.1 lo hacía
más eficientemente que B7-DC. Así pues, los patrones
de coestimulación por B7-DC y B7.1 son distintos,
siendo B7-DC más eficiente en la coestimulación de
linfoquinas proinflamatorias importantes.
\vskip1.000000\baselineskip
A fin de determinar si B7-DC
posee actividad biológica in vivo, los inventores
investigaron si B7-DC-Ig aumentaba
las respuestas inmunes a las vacunas peptídicas.
B7-DC-Ig o un anticuerpo de control
isotipo se añadió al cóctel inmunógeno del péptido
HA110-120 e IFA. A fin de permitir la enumeración de
las células T CD4 específicas de HA in vivo, se
transfirieron 2,5 x 10^{6} células T anti-HA 6.5 a
los ratones 3 días antes de la inmunización. Siete días después de
la inmunización, se cosecharon células LN drenantes y se estimularon
las células in vitro durante 2 días con cantidades variables
de péptido HA110-120. La Figura 9 muestra que la
adición de B7-DC-Ig aumentaba de
hecho espectacularmente la respuesta proliferativa a HA. El número
total de células T específicas de HA en las LN drenantes se
incrementaba aproximadamente dos veces en los grupos que recibían
B7-DC-Ig con relación a los
controles de anticuerpos isotipo. Por esta razón, se dedujo que
B7-DC tenía capacidad para aumentar las respuestas
específicas de antígeno incluso en una base por célula.
\vskip1.000000\baselineskip
Los autores de la presente invención han
descubierto y caracterizado un nuevo miembro de la familia B7 con
expresión muy restringida a DCs y que tiene propiedades
coestimuladoras singulares para las células T. El ortólogo humano
de B7-DC se expresa también en DCs.
Este patrón de expresión restringida contrasta
con los miembros de la familia B7 descritos previamente, lo que
sugiere que B7-DC participa en respuestas inmunes
diferentes que los caminos conocidos de B7.1/2. Mientras que se
detectaba una señal B7-DC débil por
RT-PCR en macrófagos activados, el análisis
RT-PCR preliminar en tiempo real indicaba que la
expresión de mRNA de B7-DC en DCs era más de 15
veces mayor que en los macrófagos activados. La tinción de
anticuerpos detectaba análogamente niveles muy bajos de
B7-DC en la superficie de los macrófagos activados.
No está claro si esto es suficiente para una activación importante
de las células T.
El patrón inusual de la producción de
linfoquinas que coestimula B7-DC implica un papel
biológico singular comparado con otros miembros de la familia B7.
La clasificación tradicional de las citoquinas es como sigue: las
citoquinas Th1 incluyen IL-2,
\gamma-IFN y linfotoxina; las citoquinas Th2
incluyen IL-4, IL-5,
IL-6 e IL-13 (36).
B7-DC no induce un perfil de linfoquinas Th1 o Th2
clásico. B7-DC induce muy poco IL-4
y no induce en absoluto IL-10. Sin embargo,
IL-6 está considerada como una citoquina Th2. La
menor coestimulación de IL-2 y mayor de
\gamma-IFN por B7-DC con relación
a B7.1 no se ajusta a un patrón clásico Th1. Sin embargo, la
elevada producción de \gamma-IFN sugiere que
B7-DC suscita una función efectora importante de
células T.
B7-DC es notable por su
capacidad para coestimular IL-6. La fuerte respuesta
proliferativa de células T inducidas por B7-DC se
explica en parte por su fuerte coestimulación de la producción de
IL-6, que no se observa con B7.1.
IL-6 es un amplificador potente de la proliferación
de las células T (en asociación con otros estímulos proliferativos)
(37,38). IL-6 es una citoquina multifuncional que
regula no sólo la función de las células T sino también respuestas
proinflamatorias, diferenciación de monocitos, diferenciación de
células B, trombopoyesis, resorción ósea, y el crecimiento de
ciertos tumores hematopoyéticos (39, 40): IL-6 puede
funcionar en concierto con receptores solubles de
IL-6 (sIL-6R) en la inducción de
quimioquinas y el reclutamiento de leucocitos (41). La misma puede
mediar efectos antiapoptóticos potentes por la vía de la activación
de Stat-3. Se ha informado que la activación de
Stat-3 dependiente de IL-6 en las
células T es un camino importante para la supervivencia de las
células T activadas (42, 43) aunque otros informes sugieren que
Stat-3 ejerce su efecto sobre las células T en
reposo.
Mientras que B7-DC no se fija a
CD28 o CTLA-4, sí lo hace a PD-1, un
receptor para B7-H1/PD-L1 (22, 47,
48). No se ha determinado todavía si la misma se fija a ICOS, un
receptor para B7h/B7RP-1 (23-25,
44-46). La marcada homología entre
B7-DC y B7-H1/PDL-1
(mayor que la existente entre B7.1 y B7.2), el estrecho enlace
físico de hB7-H1/PD-L1 y
hB7-DC , y su fijación a un receptor común, sugieren
que las mismas están relacionadas por un suceso de duplicación
génica relativamente reciente. Esto es análogo a la relación entre
B7.1 y B7.2, que mapean ambas hasta dentro de una megabase en el
cromosoma 16 del ratón y el cromosoma 3 humano (49).
Será importante discernir los papeles biológicos
relativos de B7-DC frente a
B7-H1/PD-L1 tal como son mediados
por PD-1 y otro u otros receptores supuestos.
PD-1 se expresa subsiguientemente a la activación de
las células T, y parece inhibir la misma. PD-1
induce apoptosis en condiciones de estimulación de las células T con
concentraciones elevadas de anti-CD3. Los ratones
con PD-1 silenciado desarrollan un síndrome
autoinmune (22) caracterizado por manifestaciones clínicas de
cardiomiopatía hipertrófica. En contraste, Dong et al. (21)
informaron que B7-H1/PD-L1
coestimulaba la proliferación de las células T y la liberación de
citoquinas a menores concentraciones de anti-CD3.
Por analogía a la relación de CD28/CTLA-4,
PD-L1 puede ser un contrarreceptor para un receptor
de activación todavía no identificado. A pesar de compartir la
propiedad de fijación a PD-1, B7-DC
y B7-H1 son distintos en sus patrones de
coestimulación de linfoquinas; B7-H1 coestimulaba la
producción de IL-10 por las células T, mientras que
B7-DC no lo hace. Los distintos patrones de
expresión celular y funciones coestimuladoras de
B7-DC sugieren un papel singular en la función
inmunológica.
\vskip1.000000\baselineskip
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- WO 02/24 891 (Amgen)
- D12:
- WO 01/94 413 (Bristol Myers Squibb)
Claims (28)
1. Una molécula de ácido nucleico aislada que
codifica un polipéptido constituido por:
- (a)
- los residuos de aminoácidos 26-221 de SEQ ID NO: 2; o
- (b)
- una variante de (a) que coestimula la actividad de las células T que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con (a); en donde la variante no es B7-DC de longitud total como se muestra en SEQ ID NO: 2.
2. La molécula de ácido aislada de acuerdo con
la reivindicación 1, que codifica la variante y en donde uno o más
residuos de aminoácidos de (a) han sido sustituidos por un residuo
diferente.
3. La molécula de ácido nucleico aislada de
acuerdo con la reivindicación 2, que codifica la variante y en
donde un solo residuo de aminoácido de (a) ha sido sustituido por un
residuo diferente.
4. La molécula de ácido nucleico aislada de
acuerdo con la reivindicación 1, en donde el polipéptido está
constituido por (a).
5. La molécula de ácido nucleico aislada de
acuerdo con la reivindicación 1, en donde el polipéptido está
constituido por (b) y dicha variante es un derivado funcional que
tiene la actividad funcional de los residuos de aminoácidos
26-221 de SEQ ID NO: 2.
6. Una molécula de ácido nucleico que codifica
un polipéptido que está constituido por:
- (a)
- los residuos de aminoácidos 26-221 de SEQ ID NO: 2; o
- (b)
- una variante de (a) que coestimula la actividad de las células T que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con (a); en donde la variante no es B7-DC de longitud total como se muestra en SEQ ID NO: 2
fusionado directamente a otra proteína, u
opcionalmente, fusionado a una secuencia de péptido enlazador que
está fusionada a dicha otra proteína.
7. Una molécula de ácido nucleico de acuerdo con
la reivindicación 6 en donde dicha otra proteína está constituida
por:
- (a)
- uno o más dominios de una región constante de cadena pesada de Ig;
- (b)
- dos dominios C de una región constante de cadena pesada de IgG; o
- (c)
- la regiones bisagra, C_{H}2 y C_{H}3 de una cadena de inmunoglobulina humana G\gamma1.
8. Una molécula de ácido nucleico de acuerdo con
la reivindicación 6 ó 7 en donde dicha otra proteína está
constituida por dos dominios de una región constante de IgG
humana.
9. Un vector de expresión que comprende una
molécula de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores enlazado operativamente a:
- (a)
- un promotor; y
- (b)
- opcionalmente, secuencias reguladoras adicionales que regulan la expresión del ácido nucleico en una célula eucariota.
10. Un vector de expresión de acuerdo con la
reivindicación 9 que es un plásmido o un vector viral.
11. Una composición de vector que comprende:
- (a)
- un primer vector de expresión recombinante que tiene incorporada en su ácido nucleico una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno de interés contra el cual se pretende inducir una respuesta inmune; y
- (b)
- un segundo vector de expresión recombinante que tiene incorporada(s) en su ácido nucleico una o más secuencias de nucleótidos que comprenden una molécula de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8;
en donde los vectores de expresión son capaces
de coinfectar o cotransfectar una célula hospedadora dando como
resultado la coexpresión del antígeno y el polipéptido
coestimulador.
\newpage
12. Una célula transformada o transfectada con
una molécula de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, un vector de acuerdo con la reivindicación 9
ó 10, o una composición de vector de acuerdo con la reivindicación
11.
13. Una célula de acuerdo con la reivindicación
12 que es una célula de mamífero y/o una célula humana.
14. Una célula de acuerdo con la reivindicación
12 ó 13 que es una célula dendrítica o un progenitor de la misma
que no se obtiene a partir de un embrión humano, o una célula
tumoral.
15. Un polipéptido que está constituido por:
- (a)
- los residuos de aminoácidos 26-221 de SEQ ID NO: 2; o
- (b)
- una variante de (a) que coestimula la actividad de las células T, que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con (a), en donde la variante no es B7-DC de longitud total como se muestra en SEQ ID NO: 2;
y puede obtenerse por expresión recombinante de
una molécula de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5.
16. Un polipéptido de fusión que está
constituido por:
- (a)
- los residuos de aminoácidos 26-221 de SEQ ID NO: 2; o
- (b)
- una variante de (a) que coestimula la actividad de las células T, que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con (a), en donde la variante no es B7-DC de longitud total como se muestra en SEQ ID NO: 2;
fusionado directamente a otra proteína; u
opcionalmente, fusionado a una secuencia de péptido enlazador que
está fusionada a dicha otra proteína.
17. Un polipéptido de fusión de acuerdo con la
reivindicación 16, que se fija a una molécula pareja de fijación en
las células T y coestimula las células T en presencia de un estímulo
adecuado para el receptor de las células T.
18. Un polipéptido de fusión de acuerdo con la
reivindicación 17, en donde la molécula pareja de fijación es
PD-1 u otro receptor en las células T que no es CD28
o CTLA-4.
19. Un polipéptido de fusión de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18 en donde dicha otra
proteína es uno o más dominios de una región constante de cadena
pesada de Ig.
20. Un polipéptido de fusión de acuerdo con la
reivindicación 19, en donde dicha otra proteína tiene una secuencia
de aminoácidos que corresponde a las regiones bisagra, C_{H}2 y
C_{H}3 de una cadena G\gamma1 de inmunoglobulina humana.
21. Una molécula de ácido nucleico de acuerdo
con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, un vector o
composición de vector de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 9 a 11, o un polipéptido de acuerdo con la
reivindicación 15 ó 16 para uso en un método de tratamiento del
cuerpo humano o animal.
22. Uso de un polipéptido de acuerdo con la
reivindicación 15 ó 16 para la fabricación de un medicamento para
aumentar la respuesta de las células T de un individuo mamífero a
estimulación antigénica, en donde la administración de la célula o
el polipéptido en asociación con un antígeno es eficaz para aumentar
la respuesta de las células T del individuo a la estimulación
antigénica.
23. Un método para aumentar la respuesta de las
células T de mamífero a estimulación antigénica, que comprende
poner en contacto las células T ex vivo con una cantidad
eficaz de un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 15 a 20, en donde la puesta en contacto es eficaz
para aumentar la respuesta de las células T a la estimulación
antigénica.
24. Una composición de vacuna para inducir una
respuesta inmune protectora contra un antígeno asociado a una
célula o microorganismo patógeno, que comprende:
- (a)
- una fuente de dicho antígeno;
- (b)
- un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 20;
- (c)
- opcionalmente, un agente o adyuvante inmunoestimulador general; y
- (d)
- un excipiente o vehículo farmacéutica e inmunitariamente aceptable para (a), (b) y (c).
\newpage
25. Uso de un polipéptido de acuerdo con una
cualquiera de las reivindicaciones 15 a 20 para la fabricación de
una composición de vacuna para inducir o aumentar una respuesta
inmune a un antígeno en donde la composición de vacuna comprende
una fuente del antígeno.
26. Una composición coestimuladora para aumentar
la inmunogenicidad de un antígeno o vacuna, que comprende un
polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 15
a 20 y un excipiente o vehículo farmacéutica e inmunitariamente
aceptable.
27. Uso de una composición coestimuladora de
acuerdo con la reivindicación 26 para la fabricación de un
medicamento para potenciar una respuesta inmune a un antígeno o una
vacuna en un individuo mamífero.
28. Productos que contienen un antígeno o una
vacuna y una composición coestimuladora de acuerdo con la
reivindicación 26 como una preparación combinada para uso combinado
en la potenciación de una respuesta inmune al antígeno o
vacuna.
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