ES2330506T3

ES2330506T3 - Moleculas coestimulantes de celulas dentriticas.

Info

Publication number: ES2330506T3
Application number: ES01928894T
Authority: ES
Inventors: Drew M. Pardoll; Haruo Tsuchiya; Kevin S. Gorski; Su-Yi Tseng
Original assignee: Johns Hopkins University
Current assignee: Johns Hopkins University
Priority date: 2000-04-28
Filing date: 2001-04-27
Publication date: 2009-12-11
Anticipated expiration: 2021-04-27
Also published as: US20120065374A1; US9370565B2; EP1280900A2; JP2011224008A; US20120065385A1; US20060292593A1; AU5570001A; HK1111726A1; AU2001255700B2; CA2407680A1; WO2001083750A2; US7560540B2; WO2001083750A3; EP1280900B8; US20020091246A1; US20080226662A1; KR20030028466A; MXPA02010670A; AU2001255700C1; US20140099307A1

Abstract

Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido constituido por: (a) los residuos de aminoácidos 26-221 de SEQ ID NO: 2; o (b) una variante de (a) que coestimula la actividad de las células T que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con (a); en donde la variante no es B7-DC de longitud total como se muestra en SEQ ID NO:

Description

Moléculas coestimulantes de células dendríticas.

Antecedentes de la invención Campo de la invención

La invención en el campo de la bioquímica y la medicina se refiere a nuevas proteínas que se expresan selectivamente en la superficie de las células dendríticas y pueden utilizarse como moléculas de la superficie celular o en forma soluble en composiciones de vacuna para estimular respuestas inmunes.

Descripción de la técnica anterior

La generación de una respuesta de los linfocitos T es un proceso complejo que implica interacciones célula-célula y producción de mediadores solubles (citoquinas o linfoquinas). Esta respuesta está regulada por varias moléculas de la superficie de las células T que actúan como "receptores", con inclusión del complejo célula T-receptor (TCR) y otras moléculas "accesorias" de la superficie, muchas de las cuales son "antígenos de diferenciación" de la superficie celular que fueron definidos inicialmente como anticuerpos monoclonales ("moléculas CD").

Se cree que la activación óptima de todos los linfocitos requiere dos señales: una señal específica de antígeno o señal clonal, y una segunda señal no específica de antígeno (Janeway, C., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 54:1-14 (1989)). Si un linfocito encuentra un antígeno aislado, sin co-estimulación por las denominadas moléculas co-estimuladoras (tales como B7 descritas más adelante), responderá con desactivación clonal también denominada "anergia" (Schwartz, R. Science 248: 1349 (1990)) o apoptosis (muerte celular programada); si se proporciona la señal co-estimuladora, aquél responderá con expansión clonal específica para el antígeno estimulador. No se produce amplificación significativa alguna de una respuesta inmune contra un antígeno dado sin co-estimulación (June et al. (Immunology Today 15: 321-331, 1994); Chen et al. (Immunology Today 14: 483-486); Townsend, SE y Allison, JP (1993) Science 259: 368-370).

La calidad y potencia de una respuesta inmune depende en gran parte del tipo de células presentadoras de antígeno (APC) que procesan y presentan el antígeno a las células T. La densidad del ligando antígeno peptídico/MHC disponible para la entrada en acción del TCR y la provisión de señales co-estimuladoras solubles y/o fijadas a la membrana por las APCs en el momento de la entrada en acción de las células T y la activación es crítica. Es por estas razones por las que las estrategias inmunoterapéuticas han comenzado a enfocar su atención en proporcionar (a) el antígeno diana a los tipos APC apropiados y (b) moléculas co-estimuladoras apropiadas para mejorar la activación de las
células T.

Las APCs que proporcionan las señales requeridas para activación de las células T incluyen monocitos/macrófagos, linfocitos B, y, lo que es más importante, células dendríticas (DCs). Tiempo atrás se creía que los macrófagos activados eran las APCs críticas que iniciaban las respuestas de las células T in vivo. Esta idea estaba basada en su capacidad para fagocitar eficazmente los antígenos y procesar los mismos para exposición y presentación en la superficie. Más recientemente, la atención se ha desplazado a DC como el iniciador principal in vivo de las respuestas de las células T específicas de antígeno. Las DCs tienen un fenotipo distinto de los macrófagos activados y se clasifican en subtipos diferentes capaces de iniciar respuestas inmunes distintivas. Una marca de contraste funcional de las DCs es su potencia aproximadamente 100 veces mayor que la de los macrófagos para activar las células T naíf in vitro. Hasta la fecha, la explicación de esta potencia se ha basado en diferencias cuantitativas en las moléculas que se sabe son importantes para la presentación de antígeno. La presente invención está basada en el descubrimiento de una diferencia cualitativa importante.

La primera señal en la presentación de antígeno se inicia por interacción de la TCR con el antígeno presentado en el contexto de las moléculas del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) clase II en la APC (Allen Immunol. Today 8: 270 (1987)). Las señales co-estimuladoras proceden de otras moléculas, la mejor caracterizada de las cuales es la familia B7 (a saber B7.1, B7.2, y posiblemente B7.3) que están presentes también en las APCs.

Dos proteínas expresadas en la superficie de las células T son los ligandos o contra-receptores mejor caracterizados para moléculas co-estimuladoras tales como B7. CD28 es una glicoproteína homodímera de la superfamilia de las inmunoglobulinas (Ig) (Aruffo y Seed, Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 8573-8577 (1987)) encontrada en la mayoría de las células T humanas maduras que funciona en la activación de las células T. CD28 se expresa constitutivamente en las células T en reposo y aumenta después de la activación. Después de señalización por el receptor de las células T, la ligación de CD28 induce las células T a proliferar y secretar IL-2 (Linsley, PS, et al. (1991) J. Exp. Med. 173, 721-730; Gimmi, CD, et al. (1991) Proc. Natl. Acad Sci. EE.UU. 88, 6575-6579; Thompson, C. B., et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 86, 1333-1337; June, C. H., et al. (1990) Immunol. Today. 11, 211-6; Harding, F. A., et al. (1992) Nature. 356, 607-609.). CD28 media el contacto célula-célula ("adhesión intercelular"), una forma de interacción intercelular independiente de antígeno que es esencial para las respuestas inmunes (Springer et al., Ann. Rev. Immunol. 5: 223-252 (1987)).

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CTLA4 es una molécula de la superficie de las células T sumamente homogénea a CD28 pero que no se expresa en las células T en reposo y aparece a continuación de la activación de las células T (Brunet, J.F., et al. (1987) Nature 328: 267-270). CTLA-4 fue identificada originariamente por cribado diferencial de una biblioteca de cDNA de células T citolíticas murinas, Brunet et al., supra). El papel de CTLA-4 como segundo receptor para B7 se discute en Linsley et al., (1991) J. Exp. Med. 174: 561-569, que indicaron también que B7 tiene una mayor afinidad para CTLA4 que para CD28. Freeman et al. (1993) Science 262: 907-909 discutieron CTLA-4 en ratones deficientes en B7. Los ligandos para CTLA-4 se describen en Lenschow et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. 90: 11054-11058.

Las células secretan citoquinas inductoras del crecimiento y la diferenciación tales como IL-2, IL-4 e II-6, posiblemente de manera enfocada en el área de contacto entre las células Th y B, que sirve para asegurar la activación únicamente de las células B que presentan el antígeno a las células Th y evitar la activación por las células B testigo.

CD28 y TCLA-4 interaccionan con una molécula co-estimuladora conocida generalmente como B7. B7 se describió originalmente como un antígeno de activación de las células B debido a que se encontró en células B y se designó B7/BB-1 (Linsley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 5031-5035 (1990)). En lo sucesivo se hará referencia a esta molécula como B7, B7-1 o B7.1). B7 y los homólogos de B7 descritos más recientemente son también miembros de la superfamilia Ig. En contraste con CD28 y CDTL-4, B7 comprende dos dominios extracelulares Ig, un dominio N-terminal de tipo variable (V), seguido por un dominio de tipo constante (C).

Los miembros de la familia B7 se expresan generalmente en APCs y, como se ha indicado, son de importancia crítica para la activación de las células T naíf. Estos miembros de la familia incluyen B7-1 (=B7, designado también CD80) y B7-2 (designado también CD86). Referencias que describen B7-1 incluyen Schwartz, R. H. Cell 71:1065-1068, 1992; Chen, L. et al Cell 71:1093-1102, 1992; Freeman, G.J. et al. J. Immunol 143:2714-2722, 1989; y Freeman, G. J. et al. J. Exp. Med. 174:625-631, 1991)). Referencias que describen B7-2 incluyen (Freeman, G. 3. et al. Science 262:909-911, 813- 960, 1993). Hasta la fecha, han sido descritas tanto B7-1 y B7-2 murinas como B7-1 y B7-2 humanas (Freeman et al., 1989, supra; 1991, supra; y 1993, supra). Los linfocitos B humanos activados expresan contra-receptores B7-2 y B7-3 de fijación de CTLA4/CD28, los dos cuales pueden suministrar señales coestimuladoras a las células T por la vía de CD28 o CTLA4.

B7-2 es expresada por las células B al cabo de aproximadamente 24 horas después de la estimulación con mAbs anti-Ig o anti-MHC clase II. B7-2 induce secreción de IL-2 y proliferación de las células T detectables. Al cabo de aproximadamente 48 a 72 horas de la activación, las células B expresan a la vez B7-1 y un tercer contrarreceptor de CTLA4 identificado por un mAb BB-1 (Yokochi, T., et al. (1982) J. Immunol. 128, 823-827) designado B7-3. B7-3 se expresa también en células B B-7 negativas activadas y puede coestimular la proliferación de las células T sin producción detectable de IL-2, lo que indica que las moléculas B7-1 y B7-3 son distintas. B7-3 se expresa en una gran diversidad de células que incluyen células B activadas, monocitos activados, células dendríticas, células de Langerhans y queratinocitos. A las 72 horas de la activación de las células B, comienza a declinar la expresión de B7-1 y B7-3. La presencia de estos contra-receptores de la fijación de CTLA4/CD28 en la superficie de los linfocitos B activados indica que la coestimulación de las células T está regulada, en parte, por la expresión temporal de estas moléculas después de la activación de las células B.

La importancia del o de los caminos coestimuladores B7:CD28/CTLA4 ha sido demostrada in vitro e in vivo. Existe una relación directa entre la actividad incrementada de las células T y la expresión incrementada de B7 (Razi-Wolf et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 89: 4210-4214 (1992)). Las células T se vuelven anérgicas cuando las mismas encuentran antígenos peptídicos en células que carecen de un ligando coestimulador que fija CD28. El bloqueo de este camino coestimulador da como resultado el desarrollo de tolerancia específica de antígeno en los sistemas murinos y humanos (Harding et al., supra; Lenschow, D.J. et al., (1992) Science, 257, 789-792; Turka, L.A. et al., (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 89, 11102-11105; Gimmi, CD et al., (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90; 6586-6590; Boussiotis, V. et al. (1993) J. Exp. Med. 178, 1753-1763). Inversamente, la expresión de B7 por células tumorales murinas B-7-negativas induce inmunidad específica mediada por células T acompañada por rechazo de los tumores y protección de larga duración frente a la exposición a tumores (Chen, L., et al. (1992) Cell 71: 1093-1102; Townsend et al., supra; Baskar, S., et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. 90, 5687-5690). Por consiguiente, la manipulación del camino B7:CD28/CTLA4 ofrece un gran potencial para estimular o suprimir las respuestas inmunes en los humanos.

Se han caracterizado interacciones entre CD28 y B7 utilizando fusiones de genes de las porciones extracelulares de B7 o CD28 con cadenas de Ig C\gamma1 (Linsley et al., J. Exp. Med. 173: 721-730 (1991)). Cuando se inmovilizan las proteínas de fusión B7Ig, o cuando se expresa B7 en la superficie de una célula, tal como una célula CHO transfectada, aquéllas coestimulan la proliferación de las células T. La estimulación de las células T con células CHO B7+ estimula también específicamente niveles incrementados de transcritos para IL-2.

U.S. 5.521.288 describe un método para regulación de respuestas inmunes por contacto de células T CD28 positivas con fragmentos codificados por partes de DNA que codifican B7, correspondientes fundamentalmente al dominio extracelular (ECD) de B7. Las respuestas inmunes eran reguladas también por derivados de B7 que son construcciones de proteínas de fusión que incluyen al menos una porción del ECD de B7 y otra proteína, tal como el dominio IgC\gamma1 humano, que alteraban la solubilidad, la afinidad de fijación y/o la valencia de B7. Por ejemplo, DNA codificante de los residuos de aminoácidos de las posiciones 1-215 del ECD de B7 se unía a DNA codificante de los residuos de aminoácidos de las secuencias correspondientes a las regiones bisagra, CH2 y CH3 de IgC\gamma1 humana para formar un producto de fusión de DNA que codificaba una proteína de fusión B7Ig. Se describía también un método para tratamiento de una enfermedad del sistema inmunitario mediada por células T por administración de B7 o de la proteína de fusión B7Ig para reaccionar con las células T por fijación del receptor CD28. La proliferación de las células T en la enfermedad de rechazo inverso era inhibida por reacción de las células T CD28+ con el antígeno B7 o la proteína de fusión B7Ig en combinación con un inmunosupresor.

La Patente US 5.860.310 describe células tumorales modificadas para expresar una o más moléculas coestimuladoras de las células T, con inclusión de B7-2 y B7-3. Una realización incluye expresión adicional de B7. La modificación tenía lugar por transfección con ácido nucleico codificante de las proteínas B7-2, B7-3 o B7. Las células tumorales podían modificarse también genéticamente in vivo. Se dice que tales células tumorales modificadas son útiles para tratar un paciente que padece un tumor, a fin de prevenir o inhibir la propagación de metástasis o inhibir la recurrencia del tumor. Este documento describía un método para inducir específicamente una respuesta de las células T CD4+ contra un tumor.

La Patente U.S. 5.942.607 describe ácidos nucleicos aislados que codifican nuevos ligandos CTLA4/CD28 que coestimulan la activación de las células T. En una realización, el ácido nucleico aislado codificaba B7-2. Se describía también un ácido nucleico que comprendía al menos una porción de la secuencia B7-2 de longitud total. De acuerdo con este documento, las secuencias de ácido nucleico podían integrarse en diversos vectores de expresión que podrían dirigir la síntesis de las proteínas o péptidos correspondientes en una diversidad de células hospedadoras que incluían células de mamífero y de insecto. Se describían también células hospedadoras transformadas para producir proteínas o péptidos codificados por estas secuencias de ácido nucleico y proteínas y péptidos aislados que comprenden al menos una porción de la secuencia B7-2.

Dong H et al., Nat. Med. 1999, 5: 1365-1399, describieron un tercer miembro de la familia B7, designado B7-H1 que no se fija a CD28, CTLA4 o ICOS (co-estimulador inducible). La ligación de B7-H1 coestimulaba las respuestas de las células T a estímulos policlonales y aloantígenos, y estimulaba preferentemente la producción de interleuquina-10. La IL-2, producida en pequeñas cantidades, era necesaria para el efecto de la coestimulación por B7-H1. Este estudio definía una molécula co-estimuladora no conocida previamente, que puede estar implicada en la regulación negativa de las respuestas inmunes mediadas por las células. El mismo laboratorio (Wang S et al., Blood, 2000; 96: 2808-2813) describía un nuevo gen humano afín a B7 designado B7-H2, cuya expresión se detectó en la superficie de DCs inmaduras derivadas de monocitos. B7-H2 soluble y una proteína de fusión con Ig, B7-H2Ig, se fijaban a las células T activadas, pero no a las células T en reposo. Esta fijación era inhibida por una forma soluble de ICOS (ICOSIg), pero no por CTLA4Ig. ICOSIg teñía las células CHO transfectadas con el gen B7-H2. Utilizando reticulación sub-óptima de CD3 como estímulo, se encontró que la coestimulación de la proliferación de las células T por B7-H2Ig era dependiente de la dosis y estaba correlacionada con la secreción de IL-2, mientras que la ligación óptima de CD3 estimulaba preferentemente la producción de IL-10. Los autores llegaron a la conclusión de que B7-H2 es un ligando supuesto para la molécula ICOS -célula T.

Swallow MM et al., Immunity, 1999, 11: 423-432 consignaron la clonación de un nuevo gen, B7h, (sic) a es un homólogo próximo de moléculas B7 que se expresan en APCs. B7h coestimulaba la proliferación de las células T purificadas por acción sobre un receptor distinto de CD28 o CTLA-4. Sorprendentemente, aunque B7h se expresaba en células B no estimuladas, su expresión era inducida en las células no linfoides (células 3T3; fibroblastos embrionarios) tratadas con TNF\alpha y estaba regulada en sentido creciente en tejido no linfoide de ratones tratados con LPS, un activador potente de TNF\alpha. Estos estudios definieron un nuevo ligando coestimulador de las células T y sugirieron que la inducción de B7h por TNF\alpha puede aumentar directamente el reconocimiento del mismo durante la inflamación.

Yoshinaga SK et al., Nature, 1999, 402: 827-832, describieron un nuevo par receptor-ligando coestimulador de murino. El receptor, afín a CD28, era el homólogo murino de la proteína humana ICOS, y se expresaba en células T activadas y células T de memoria en reposo. El ligando, que era homólogo a las moléculas B7, se designó proteína-1 afín a B7 (B7RP-1). B7RP-1 es una proteína transmembranal tipo 1 con 20% y 19% de identidad de aminoácidos con B7.1 (CD80) y B7.2 (CD86) murinas, respectivamente. Esta homología es significativa dado que B7.1 y B7.2 comparten solamente 27% de identidad de aminoácidos (Freeman, GJ et al., J. Exp. Med. 178: 2185-2192 (1993)). Esta homología incluye las cisteínas que son importantes para la formación del bucle Ig en localizaciones conservadas (residuos 62, 138, 185 y 242 de la metionina de iniciación). La longitud global y la posición relativa del dominio transmembranal de B7RP-1 eran similares a las de las moléculas B7 (Greenfield, EA et al. Crit. Rev. Immunol. 18: 389-418 (1988)). Se demostró que B7RP-1 se expresaba en células B y macrófagos. ICOS y B7RP-1 no interaccionaban con las proteínas en el camino CD28-B7, y B7RP-1 coestimulaba las células T independientemente de CD28. Los ratones transgénicos que expresaban una proteína de fusión entre B7RP-1 y la porción Fc de Ig ("B7RP1-Fc") tenían hiperplasia linfoide en el bazo, los ganglios linfáticos y los parches de Peyer. La actividad coestimuladora de B7RP-1 in vivo se encontró por demostración de la hipersensibilidad de tipo retardado intensificada en ratones presensibilizados con antígeno tratados con B7RP-1-Fc en el momento de la exposición al antígeno. Los autores llegaron a la conclusión de que ICOS y B7RP-1 definen un nuevo par receptor-ligando distinto que está relacionado estructuralmente con CD28-B7 y está implicado en la respuesta inmune adaptativa.

Yoshinaga SK et al., Int. Immunol., 2000, Oct., 12: 1439-1447, informaron de la co-estimulación de células T humanas por la interacción de B7RP-1 e ICOS humano. Este par ligando-receptor interaccionaba con un K_{D} de aproximadamente 33 nM y una tasa de expulsión que tenía un t_{(1/2)} de >10 min. TNF\alpha regulaba diferencialmente la expresión de B7RP-1 humana en células B, monocitos y DC. TNF\alpha intensificaba la expresión de B7RP-1 en células B y monocitos, pero inhibe la expresión en DC. Una proteína B7RP-1-Fc humana, o células que expresaban B7RP-1 fijada a la membrana, co-estimulaban la proliferación de células T in vitro. Citoquinas específicas, tales como IFN\alpha e IL-10, eran inducidas por co-estimulación con B7RP-1. Aunque los niveles de IL-2 no aumentaban significativamente, la co-estimulación inducida por B7RP-1 era dependiente de IL-2. Estos estudios definían el ortólogo humano para B7RP-1 murina y caracterizaban su interacción con ICOS humano.

PD-1 es un receptor inmuno-inhibidor expresado por células T, B y mieloides activadas. Los ratones deficientes en PD-1 exhibían formas múltiples de autoinmunidad debido a la pérdida de tolerancia periférica. Freeman, GJ et al., J. Exp. Med. 192: 1027-1034 (2000) consignaron que el ligando de PD-1 (PD-L1) es un miembro de la familia de genes B7. La entrada en acción de PD-1 por PD-L1 daba como resultado la inhibición de la activación de los linfocitos mediada por TCR (proliferación, secreción de citoquinas). Adicionalmente, la señalización de PD-1 inhibía niveles subóptimos de coestimulación mediada por CD28. PD-L1 es expresada por APCs (monocitos humanos estimulados con IFN\gamma, DCs humanas activadas). Adicionalmente, se demostró que PD-L1 se expresa en corazón y pulmón. Los autores especulaban que la magnitud relativa de las señales inhibidoras de PD-L1 y las señales coestimuladoras de B7-1/B7-2 en las APCs puede determinar la extensión de la activación de las células T y el umbral entre tolerancia y autoinmunidad. La presencia de PD-L1 en los tejidos no linfoides puede contribuir a la magnitud de las respuestas inmunes en sitios de inflamación.

La citación de los documentos anteriores no supone una admisión de que nada de lo anterior sea técnica anterior pertinente. Todas las afirmaciones en cuanto a la fecha o representación en cuanto a los contenidos de estos documentos están basadas en la información disponible para la Solicitante y no constituyen admisión alguna en cuanto a la exactitud de las fechas o contenidos de estos documentos.

Sumario de la invención

Con objeto de identificar los genes que codifican nuevas moléculas coestimuladoras específicas de las células dendríticas (DC) para activación de las células T, los inventores cribaron una biblioteca de cDNA sustraída entre DCs y macrófagos activados. Este método de sustracción de cDNA define genes expresados por DCs pero no por macrófagos activados. El uso de este método ha conducido al descubrimiento de varios genes nuevos específicos de DC que son útiles en la intensificación de la potencia de vacunas que dependen de la activación de las células T. La presente solicitud está enfocada en un gen de este tipo.

Basándose en la presencia de biblioteca de DC y la ausencia de la biblioteca de macrófagos activados, se identificó una nueva secuencia codificante, designada "B7-DC". El gen B7-DC es un miembro de la familia B7 de genes que codifican moléculas coestimuladoras. B7-DC es el primer miembro de la familia B7 con expresión específica de DC y especificidad de receptores diferente. El producto de este gen tiene un papel importante en la mediación de la capacidad singular de las DCs para estimular las células T. El análisis funcional indicaba que B7-DC es más activo que B7-1 en la estimulación de la producción de IFN\gamma por las células T. El DNA y los polipéptidos de B7-DC son por consiguiente útiles en composiciones y métodos para aumentar la eficacia de composiciones de vacuna celulares y moleculares, sean o no específicas de antígeno.

La presente invención describe una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una proteína de mamífero designada B7-DC que se expresa selectivamente en células dendríticas en comparación con los macrófagos activados. La molécula de ácido nucleico comprende preferiblemente una secuencia de nucleótidos seleccionada de SEQ ID NO: 1 (de origen humano) o SEQ ID NO: 5 (de origen murino). La solicitud describe también un ácido nucleico aislado que se hibrida con la molécula de ácido nucleico anterior en condiciones de hibridación severas. Condiciones severas preferidas incluyen incubación en 6X cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45ºC, seguida por un lavado en aproximadamente 0,2X SSC a una temperatura de aproximadamente 50ºC. Preferiblemente, la molécula de ácido nucleico anterior comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 1. Una molécula de ácido nucleico como la anterior codifica una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 4, o codifica un fragmento biológicamente activo, homólogo u otro derivado funcional de la proteína. Preferiblemente, la molécula de ácido nucleico codifica la proteína que tiene la secuencia SEQ ID NO: 2 (B7-DC de origen humano) o codifica el fragmento, homólogo u otro derivado funcional de SEQ ID NO: 2 biológicamente activo.

En un aspecto preferido, la molécula de ácido nucleico codifica el dominio extracelular de la proteína B7-DC, que incluye los residuos 26-221, que codifica un homólogo co-estimulante, fragmento u otro derivado funcional de la misma.

En otro aspecto, la molécula de ácido nucleico anterior codifica una proteína de fusión B7-DC que comprende:

(a): una primera secuencia de ácido nucleico que codifica un primer polipéptido que es la totalidad o una parte de una proteína B7-DC (preferiblemente SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4);

(b): opcionalmente, fusionada en marco con la primera secuencia de ácido nucleico, una secuencia enlazadora de ácido nucleico que codifica un péptido enlazador; y

(c): una segunda secuencia de ácido nucleico que está enlazada en marco a la primera secuencia de ácido nucleico o a la secuencia de ácido nucleico enlazadora y que codifica un segundo polipéptido.

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El segundo polipéptido está constituido preferiblemente por uno o más dominios de una región constante de cadena pesada de Ig, preferiblemente los dos dominios de C de IgG humana, preferiblemente IgG1.

Se proporciona también un vector de expresión que comprende cualquiera de las moléculas de ácido nucleico anteriores enlazadas operativamente a

(a): un promotor y

(b): opcionalmente, secuencias reguladoras adicionales que regulan la expresión del ácido nucleico en una célula eucariota.

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El vector de expresión anterior puede ser un plásmido o un vector viral. Estos vectores incluyen replicones de RNA autorreplicantes (introducidos por DNA, o de RNA), vectores suicidas de RNA, virus de DNA (tales como adenovirus, virus Vaccinia, etc.) y viriones de RNA que han crecido sobre líneas de células de empaquetamiento.

El DNA o RNA vector puede estar complejado a partículas de oro para introducción mediada por cañón de genes en un hospedador o complejado con otros polímeros, por ejemplo, en formulaciones de liberación controlada, que aumentan el suministro a las células y tejidos diana deseados.

Se incluye también una composición de vector que comprende:

(a): un primer vector de expresión recombinante que tiene incorporada en su secuencia una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno de interés contra el cual debe inducirse una respuesta inmune; y

(b): un segundo vector de expresión recombinante que tiene incorporada en su secuencia de ácido nucleico (sic) o más secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido co-estimulador, al menos uno de cuyos polipéptidos es B7-DC, o un fragmento, homólogo u otro derivado funcional biológicamente activo del mismo,

donde los vectores de expresión son capaces de co-infectar o co-transfectar una célula hospedadora dando como resultado la co-expresión del antígeno y el polipéptido, fragmento, homólogo o derivado coestimulador.

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En una modificación de la realización anterior, la invención proporciona una tercera secuencia nucleica que codifica una proteína de direccionamiento que (i) promueve la propagación del producto expresado (antígeno) entre las células, preferiblemente APCs, (ii) aumenta la presentación del antígeno en las APCs en las cuales se expresa el ácido nucleico, y/o (iii) promueve la re-presentación (cebado cruzado) y presentación del antígeno en las APCs de un hospedador en el cual se introduce el vector. El ácido nucleico codificante de la proteína de direccionamiento puede estar fusionado al ácido nucleico que codifica el antígeno o el co-estimulador, o tanto el ácido (sic) como el primer o segundo vector incluyen ácido nucleico. En una realización, la composición de vector combina el ácido nucleico codificante del antígeno, el ácido nucleico codificante del co-estimulador (preferiblemente B7-DC) y un ácido nucleico codificante de la proteína "de direccionamiento" en una sola construcción fusionada.

Esta invención incluye una célula transfectada o transformada con cualquiera de las moléculas de ácido nucleico o vectores de expresión arriba indicados. La célula es preferiblemente una célula eucariota, más preferiblemente una célula de mamífero, y muy preferiblemente una célula humana. La célula puede ser una célula dendrítica o un progenitor de la misma que no se obtiene de un embrión humano. En otra realización, la célula es una célula tumoral, preferiblemente una célula tumoral que lleva un antígeno que es el mismo que, o que reacciona cruzadamente con, un antígeno en un tumor del hospedador contra el cual se desea una respuesta inmune.

Una realización preferida es una célula tumoral de mamífero aislada transfectada con una molécula exógena de ácido nucleico que codifica una proteína B7-Dc de mamífero (preferiblemente SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4) o un fragmento, homólogo u otro derivado funcional del mismo biológicamente activo, de tal modo que cuando la proteína, el fragmento, el homólogo o el derivado es expresado por la célula tumoral, y la célula tumoral se pone en contacto con las células T

(i): la proteína B7-DC, el fragmento, el homólogo o el derivado se fija a las células T; y

(ii): la célula tumoral coestimula las células T a proliferar y/o a producir y secretar citoquinas.

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Se describe también un polipéptido que se expresa selectivamente en células dendríticas comparado con los macrófagos activados y tiene las propiedades funcionales siguientes:

(a): se fija a una pareja de fijación en las células T; y

(b): coestimula las células T a proliferar y/o a producir y secretar citoquinas.

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Se describen también fragmentos, homólogos u otros derivados funcionales biológicamente activos del polipéptido.

El polipéptido, fragmento, homólogo o derivado funcional es codificado preferiblemente por una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 5, o un fragmento, homólogo o equivalente de la molécula de ácido nucleico. Un polipéptido preferido tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4.

El polipéptido o un fragmento, homólogo, u otro derivado funcional biológicamente activo del polipéptido puede producirse por expresión recombinante de uno de los ácidos nucleicos anteriores.

Un polipéptido preferido comprende el dominio extracelular de la proteína B7-DC, preferiblemente

(a): los residuos de aminoácidos 26-221 de SEQ ID NO: 2 (humanos) o

(b): los residuos de aminoácidos 26-221 de SEQ ID NO: 4 (de ratón).

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El polipéptido anterior puede estar constituido esencialmente por el dominio extracelular de B7-DC.

Se proporciona también un polipéptido de fusión B7-DC que tiene una primera pareja de fusión que comprende la totalidad o una parte de la proteína B7-DC fusionada

(i): directamente a un segundo polipéptido o,

(ii): opcionalmente, fusionada a una secuencia de péptido enlazador que está fusionada al segundo polipéptido.

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La proteína de fusión A B7-DC anterior puede estar fusionada también a un segundo polipéptido, preferiblemente uno o más dominios de una región constante de cadena pesada de Ig, que tiene preferiblemente una secuencia de aminoácidos correspondiente a las regiones bisagra, C_{H}2 y C_{H}3 de una cadena G\gamma1 de inmunoglobulina.

En una realización de la proteína de fusión anterior, la primera pareja de fusión es el dominio extracelular de una proteína B7-DC, cuya secuencia de longitud total es SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4.

La proteína de fusión se fija preferiblemente a una pareja de unión en las células T y co-estimula las células T en presencia de un estímulo adecuado para el receptor de las células T.

Se proporciona también una proteína de fusión dímera o trímera que es un dímero o trímero de las proteínas de fusión anteriores. Preferiblemente, las cadenas están enlazadas en tándem por enlaces disulfuro u otros enlaces covalentes intercatenarios.

En una proteína de fusión dímera preferida, el dímero es resultado de la unión covalente del residuo Cys en las regiones C_{H} de dos de las cadenas pesadas de Ig que son los mismos residuos Cys que están enlazados por disulfuros en cadenas H de Ig dimerizadas normales.

La proteína de fusión de la invención puede comprender un multímero de dos o más repeticiones de la primera pareja de fusión enlazadas extremo con extremo, directamente o con una secuencia enlazadora entre uno o más monómeros.

La presente invención describe también un anticuerpo que es específico para un epítope de una proteína B7-DC, epítope que no está presente en un miembro conocido de una proteína de la familia B7. El epítope puede ser un epítope lineal o estructural de un polipéptido de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4. El anticuerpo es preferiblemente un anticuerpo monoclonal, más preferiblemente un anticuerpo monoclonal humano o humanizado (por ingeniería genética).

Se describe también un método de utilización del anticuerpo arriba indicado para identificar o cuantificar células que expresan un polipéptido B7-DC en su superficie en una población de células, que comprende

(a): poner en contacto células de la población con el anticuerpo arriba indicado de tal modo que el anticuerpo se fija a las células que expresan el epítope;

(b): evaluar la presencia de o cuantificar el número de células a las cuales se fija el anticuerpo.

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Se proporciona otro método para aislamiento de células que expresan un polipéptido B7-DC en su superficie a partir de una población de células, que comprende

(a): poner en contacto la población con el anticuerpo arriba indicado de tal manera que el anticuerpo se fija a las células que expresan el epítope;

(b): seleccionar positivamente las células a las cuales se ha fijado el anticuerpo o seleccionar negativamente las células a las cuales no se ha fijado el anticuerpo.

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Se proporciona también un método de detección de la presencia o cuantificación de un polipéptido, fragmento u homólogo de B7-DC en una muestra, que comprende los pasos de:

(a): poner en contacto la muestra con el anticuerpo de la reivindicación 43 de tal modo que el anticuerpo se fija a cualesquiera polipéptidos o fragmentos que llevan el epítope;

(b): detectar la presencia de, o cuantificar los polipéptidos o fragmentos fijados al anticuerpo.

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La presente invención está dirigida también a un método de inducir o aumentar la expresión de un polipéptido B7-DC en una célula presentadora de antígeno o un progenitor de la misma que no se deriva de un embrión humano a fin de aumentar la capacidad de la célula para co-estimular células T in vitro o in vivo en presencia de un estímulo adecuado para el receptor de las células T, que comprende transformar o transfectar la célula presentadora de antígeno o la célula progenitora con el vector de expresión que se ha descrito arriba, de tal modo que se induce o se incrementa en las células la expresión del polipéptido B7-DC. Las células presentadoras de antígeno son preferiblemente células dendríticas y los progenitores son progenitores de células dendríticas.

Se proporcionan también composiciones co-estimuladoras celulares así como co-estimuladores de polipéptidos para uso en un método para la estimulación de respuestas inmunes. Un método para aumentar la respuesta de las células T de un mamífero a estimulación antigénica comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de células como se ha descrito arriba, preferiblemente células tumorales, en asociación con un estímulo antigénico, en donde las células son eficaces para aumentar la respuesta de células T del individuo a la estimulación antigénica. Lo que antecede se realiza preferiblemente por co-inyección del antígeno y la composición co-estimuladora.

Un método para aumentar la respuesta de las células T de un mamífero a la estimulación antigénica con un antígeno asociado a un tumor, comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de células tumorales como se ha descrito arriba, en donde las células tumorales expresan el antígeno, siendo la administración de las células tumorales eficaz para aumentar la respuesta de las células T del individuo a la estimulación por el antígeno tumoral.

Un método para aumentar la respuesta de las células T de un mamífero a la estimulación antigénica comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de un polipéptido, fragmento, homólogo o derivado funcional como se ha indicado arriba, o un polipéptido o proteína de fusión como se ha indicado arriba, en asociación con un estímulo antigénico, en donde la administración del polipéptido es eficaz para aumentar la respuesta de las células T del individuo a la estimulación antigénica.

Se proporciona también un anticuerpo como se ha descrito para uso en un método para inhibir una respuesta de las células T de un mamífero a la estimulación antigénica, comprendiendo el método administrar al individuo una cantidad eficaz del anticuerpo, en donde la administración del anticuerpo es eficaz para bloquear la estimulación de las células T o para eliminar las células T reactivas con el antígeno, inhibiendo con ello la respuesta de las células T. Los métodos son particularmente útiles para tratar un individuo con un trasplante de tejido u órgano a fin de inhibir el rechazo del trasplante y/o promover el injerto. En el caso de un autoantígeno, el método bloquea o disminuye las reacciones autoinmunes y sus secuelas patológicas.

Se proporcionan también células T que han sufrido estimulación ex vivo con las composiciones de esta invención para uso en métodos terapéuticos. Un método para aumentar la respuesta inmune de un mamífero a la estimulación antigénica comprende:

(a): obtener células T del individuo, de un donante inmunitariamente compatible para dicho individuo, o de una línea de células cultivada inmunitariamente aceptable;

(b): poner en contacto las células T ex vivo con una cantidad eficaz de células como se ha descrito arriba, en donde el contacto es eficaz para aumentar la respuesta de las células T a la estimulación antigénica; y

(c): administrar las células T del paso (b) al individuo,

aumentando con ello la respuesta inmune del individuo.

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Otro método para aumentar la respuesta inmune de un mamífero sometido a estimulación antigénica comprende:

(b): poner en contacto las células T ex vivo con una cantidad eficaz de (i) un polipéptido, fragmento, homólogo o derivado funcional como se ha descrito arriba, o (ii) un polipéptido de fusión como se ha descrito arriba, en donde la puesta en contacto es eficaz para aumentar la respuesta de las células T a la estimulación antigénica; y

(c): administrar las células T del paso (b) al individuo,

aumentando (o generando) con ello una respuesta inmune del individuo.

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Se proporciona también en esta memoria una composición de vacuna que comprende

(a): (i) células como se ha descrito arriba que expresan una construcción B7-DC, (ii) un polipéptido B7-DC, fragmento, homólogo o derivado funcional, (iii) un polipéptido o proteína de fusión B7-DC;

(b): generalmente, una fuente adicional de antígeno para el cual se desea una respuesta inmune - aunque esto puede no ser requerido en el caso de la vacuna basada en células donde las células expresan por sí mismas el antígeno (como en el caso de células tumorales portadoras del antígeno tumoral);

(c): opcionalmente, un agente o adyuvante inmunoestimulador general; y

(d): un excipiente o vehículo farmacéutica e inmunitariamente aceptable para (a), (b) y (c).

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Un método para inducir o aumentar una respuesta inmune a un antígeno en un individuo mamífero comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de la composición de vacuna arriba indicada.

Se describe también una composición co-estimuladora para uso con un antígeno o una vacuna, que comprende:

(a): un polipéptido B7-DC (preferiblemente SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4), un fragmento, un homólogo o un derivado funcional del mismo, o un polipéptido de fusión B7-DC, y

(b): un excipiente o vehículo farmacéutica e inmunitariamente aceptable.

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Un método para potenciar una respuesta inmune a un antígeno o una vacuna en un individuo mamífero, comprende administrar al individuo, en combinación con el antígeno o vacuna, la composición coestimuladora anterior.

Un método de estimulación de una respuesta inmune sistémica a un tumor en un individuo, comprende administrar al individuo células tumorales alteradas genéticamente, células que

(a): se derivan de un tumor en el individuo, y

(b): están alteradas genéticamente por introducción ex vivo de un ácido nucleico B7-DC como se ha descrito arriba, cuya expresión proporciona una señal coestimuladora en el individuo,

en donde la administración da como resultado la estimulación de la respuesta sistémica inmunitaria dirigida al tumor.

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Las células tumorales se tratan preferiblemente, con preferencia por irradiación, para prevenir su crecimiento después que han sido administradas.

El individuo puede someterse a un régimen de quimioterapia, irradiación o resección quirúrgica para reducción de tumores antes de la administración de las composiciones terapéuticas arriba indicadas.

Se proporcionan también células de un tumor o línea de células tumorales para uso en un método de inducción de una respuesta antitumoral en un mamífero que padece un tumor antígeno-positivo, en donde la célula del tumor o la línea de células tumorales:

(i): expresa(n) antígenos compartidos con el tumor del mamífero;

(ii): está(n) transfectada(s) con un vector de ácido nucleico codificante de B7-DC como anteriormente tal que, una vez expresado, una molécula B7-DC hace que las células co-estimulen una respuesta de las células T a los antígenos del tumor;

(iii): opcionalmente, se irradia(n) antes del paso (b);

comprendiendo el método administrar un número eficaz de las células al mamífero, células que expresan los antígenos y la molécula B7-DC, induciendo con ello una respuesta antitumoral.

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En el método anterior, la respuesta antitumoral se caracteriza por:

(A): al menos una disminución de 50% en la suma de los productos de diámetros perpendiculares máximos de todas las lesiones apreciables;

(B): falta de pruebas de nuevas lesiones, y

(C): ausencia de progresión de cualesquiera lesiones preexistentes.

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Se describe también un método de inducción de la regresión o atenuación del crecimiento primario o recrecimiento de un tumor en un mamífero portador del tumor, que comprende:

(a): proporcionar células del tumor o de una línea de células tumorales que

(i): expresan antígenos compartidos con el tumor del mamífero;

(ii): están transfectadas con un vector de ácido nucleico codificante de B7-DC como anteriormente que, cuando se expresa, como una molécula B7-DC hace que las células co-estimulen una respuesta de las células T a los antígenos del tumor;

(iii): opcionalmente, se irradian antes del paso (b);

(b): administrar un número eficaz de las células al mamífero, células que expresan los antígenos y la molécula B7-DC;

induciendo con ello una respuesta inmune sistémica específica para los antígenos tumorales del melanoma, induciendo con ello la regresión o la atenuación.

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Un método de inhibición del crecimiento recurrente de un tumor antígeno-positivo en un mamífero comprende:

(i): expresan antígenos compartidos con el tumor del mamífero;

(ii): están transfectadas con un vector de ácido nucleico codificante de B7-DC como anteriormente que, cuando se expresa, hace que las células coestimulen una respuesta de las células T a los antígenos del tumor;

(iii): opcionalmente, se irradian antes del paso (b);

induciendo con ello una respuesta inmune sistémica específica para los antígenos del tumor en el mamífero, respuesta inmune que inhibe el crecimiento recurrente del tumor.

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Otro aspecto está dirigido a un método de proporcionar una señal co-estimuladora en la proximidad de un antígeno administrado localmente en un individuo mamífero para promover la generación local de una respuesta inflamatoria e inmunitaria que da como resultado un estado de inmunidad sistémica para el antígeno, comprendiendo el método administrar a un sitio local en el individuo

(a): células que expresan una cantidad eficaz para la coestimulación de un polipéptido, fragmento, homólogo o derivado funcional de B7-DC como anteriormente, y

(b): el antígeno

de tal modo que la coestimulación en proximidad física con el antígeno promueve la generación local de la respuesta y da como resultado el estado de inmunidad sistémica.

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En el método anterior, el antígeno es preferentemente un antígeno tumoral que se administra en (b) en la forma de células tumorales o material antigénico subcelular. Las células tumorales pueden ser también las células que expresan el polipéptido, fragmento, homólogo o derivado de B7/DC en (a).

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Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es un diagrama que muestra el mapa de hB7-DC que está localizado en el cromosoma humano 9p24. hB7-DC mapea al clon de BAC RPCI-11.2.

La Figura 2 muestra que B7-DC se expresa diferencialmente entre DCs y macrófagos. La distribución del mRNA de B7-DC en DCs de médula ósea, DCs esplénicas, macrófagos, líneas y tejidos de macrófagos se evaluó mediante análisis virtual por transferencia Northern utilizando 0,5 \mug/pista de DNA pasado en un gel de agarosa al 1%. Se utilizó como control G3PDH. Las células J774A1, Raw264.7, Pu5-1.8 y WEHI son líneas de células macrófagos. BM: médula ósea.

La Figura 3 muestra una transferencia Northern virtual de la expresión de B7-DC en DCs humanas. La pista 1 muestra DCs humanas cultivadas con GM-CSF+Flt-3L, la pista 2 muestra placenta humana y la pista 3 muestra DCs humanas cultivadas con GM-CSF+IL4. Se utilizaron oligonucleótidos de la UTR5' y 3' de B7-DC humana para producir una sonda PCR de DNA para análisis Northern virtual de tRNA total de DCs humanas. Se utilizó como control \beta-actina para asegurar la calidad del mRNA.

La Figura 4 representa un análisis citométrico de flujo que muestra la expresión en la superficie de B7-DC en BM-DCs maduras. El día 9, las BM-DCs murinas se bloquearon con Fc y se tiñeron con anticuerpos de control o antisueros B7-DC. La especificidad de fijación se demostró por adición de B7-DC-Ig para competir respecto a la fijación de anti-B7-DC a la superficie de las DCs.

La Figura 5 muestra la fijación de B7-DC a PD-1 pero no a CTLA-4 o CD28. Se transfectaron transitoriamente células 293T con pCAGGS-B7.1 o pCAGGS-B7-DC. Los transfectantes se tiñeron con moléculas de fusión PD-1-Ig, 28-Ig y CTLA-4-Ig seguidas por anticuerpo secundario marcado con PE. La tinción de los transfectantes pCAGGS (vector vacío) era negativa (no representada).

La Figura 6 (panel izquierdo y derecho) muestra la coestimulación de la proliferación de las células T por anti-CD3 y B7-DC-Ig. Gráfico izquierdo: se cultivaron células T purificadas (CD4+CD8) en pocillos previamente revestidos con concentraciones crecientes de anti-CD3 (mAb 2C11) y una concentración fija (0,1 \mug/ml) de B7.1-Ig inmovilizada (\blacklozenge), B7-DC-Ig (\medbullet) o control isotipo (\ding{115}). Los resultados muestran un experimento representativo de tres. Se incubaron las células durante 72 h y se marcaron con ^{3}H-timidina. CPM = cuentas por minuto. Gráfico derecho: se cultivaron células T CD8 purificadas en pocillos previamente recubiertos con concentraciones crecientes de anti-CD3 y concentración fija de B7.1-Ig inmovilizada (\blacklozenge), B7-DC-Ig (\medbullet) o control isotipo (\ding{115}) como en (a). Los resultados proceden de un experimento representativo de dos. Las células se incubaron durante 72 h y se marcaron con ^{3}H-timidina. CPM = cuentas por minuto.

La Figura 7 muestra la coestimulación de las respuestas proliferativas de las células T específicas de antígeno. Se trataron células RENCA con IFN\gamma durante 72 h para inducir la expresión del MHC clase II y se incubaron con 12,5 \mug/ml de péptido Ha110-120. Se añadieron células T transgénicas específicas de HA+I-E^{d} purificadas junto con concentraciones crecientes de B7.1-Ig (\blacklozenge), B7-DC-Ig (\medbullet) o control isotipo (\ding{115}) en forma soluble. Las células se incubaron durante 48 h y se marcaron con ^{3}H-timidina. CPM = cuentas por minuto. Los resultados son un experimento representativo de tres.

La Figura 8 muestra la secreción de citoquinas de las células T coestimuladas por B7-DC.

Paneles superiores: células T purificadas se cultivaron en pocillos previamente recubiertos con anti-CD3 (0,12 \mug/ml) y 0,1 \mug/ml de B7.1-Ig inmovilizada (\blacklozenge), B7-DC-Ig (\medbullet) o control isotipo (\ding{115}) como en Fig. 6 (izquierda). Los resultados muestran un experimento representativo de tres.

Paneles inferiores: células RENKA tratadas con \gamma-IFN, cargadas con 12,5 \mug/ml de péptido HA (110-120) se incubaron con células T transgénicas específicas de HA+I-E^{d} purificadas junto con 2 \mug/ml de B7.1-Ig soluble, B7-DC-Ig o control isotipo (símbolos como anteriormente). Los resultados muestran un experimento representativo de dos. Los sobrenadantes se recogieron después de 24 h y 48 h de cultivo y se ensayaron respecto a las linfoquinas indicadas utilizando ELISA.

\newpage

La Figura 9 muestra que B7-DC-Ig aumenta notablemente la proliferación específica de antígeno después de coestimulación in vivo. Después de la transferencia adoptiva de 2,5 x 10^{6} células transgénicas TCR específicas para HA, se inmunizaron tres grupos de ratones por vía subcutánea, en sus plantas de pie posteriores con péptido HA (110-120), adyuvante de Freund incompleto (IFA) solo o en combinación con B7-DC-Ig + IFA o un anticuerpo de control isotipo con IFA. Se cosecharon ganglios linfáticos drenantes el día 7. Se incubaron 1,5 x 10^{5} células LN con el péptido HA durante 48 h, se pulsaron con 1 \muCi de [^{3}H]timidina y se determinó la radiactividad incorporada después
de 12 h.

Descripción de las realizaciones preferidas

Los autores de la presente invención han identificado ahora nuevas proteínas y ácidos nucleicos que sirven como base para composiciones y métodos inmunoterapéuticos mejorados. Se han descubierto formas humanas y murinas de una nueva proteína coestimulante designada B7-DC y se describen en esta memoria.

El DNA codificante de B7-DC humana tiene la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 1, que se muestra a continuación:

1

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La proteína B7-DC humana tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2, que se muestra a continuación (indicándose la secuencia conductora, el dominio transmembranal y la cola citoplásmica):

2

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El dominio extracelular de esta proteína comprende desde el residuo P^{26} al residuo W^{221}.

Un clon de DNA que incluye la secuencia codificante que codifica B7-DC murina tiene la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 3, que se muestra a continuación. La secuencia codificante (subrayada, presentada en tripletes) comienza desde el codón metionina atg (en negrilla) partiendo del nucleótido 210 y termina con el codón de parada tag (en negrilla) (nucleótidos 951-953).

3

SEQ ID NO: 5 es la parte de la secuencia codificante de SEQ ID NO: 3.

La proteína B7-DC murina, codificada por la región codificante de SEQ ID NO: 3 (es decir, por SEQ ID NO: 5) tiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 4 que se muestra a continuación (indicándose la secuencia conductora, el dominio transmembranal y la cola citoplásmica):

4

La secuencia de DNA completa de B7-DC murina (denominada originalmente "proteína afín a butirofilina" o "Btdc") tiene el número de acceso de GenBank AF142780.2.

Método Molecular Básico

Este método se describe con mayor detalle en los ejemplos. Los inventores utilizaron el método PCR Select que incorpora dos rasgos importantes. En primer lugar, la reacción PCR inicial antes de los pasos de hibridación requiere únicamente una pequeña cantidad de RNA. Esta técnica permite el uso de DCs maduras altamente purificadas que se han modificado de modo que están sustancialmente exentas de macrófagos contaminantes, células progenitoras u otras células potencialmente contaminantes. Se sabe que tales DCs altamente purificadas son difíciles de obtener en números muy grandes. En segundo lugar, el procedimiento PCR Select permitía la clonación de genes de número de copias bajo, expresados diferencialmente.

Para identificar genes expresados diferencialmente por DCs con relación a su contrapartida celular, el macrófago activado, y para identificar los genes asociados con funciones específicas de DC, los autores de esta invención aplicaron un método de sustracción de cDNA. Los inventores utilizaron un "análisis diferencial representativo" (RDA) modificado y basado en PCR, combinado con PCR de supresión (PCR Select^{TM}) (Diatchenko, L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 66025-66030 (1996)).

Métodos generales de DNA recombinante

Textos básicos que describen métodos generales de biología molecular, todos los cuales se incorporan por referencia, incluyen: Sambrook, J et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989; Ausubel, FM et al. Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, Wiley-Interscience, Nueva York, (edición actual); Kriegler,. Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); Glover, DM, compilador, DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II, IRL Press, 1985; Albers, B. et al., Molecular Biology of the Cell, 2ª Ed., Garland Publishing, Inc., Nueva York, NY (1989); Watson, JD et al., Recombinant DNA, 2ª Edición., Scientific American Books, Nueva York, 1992; and Old, RW et al., Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering, 2^{nd} Ed., University of California Press, Berkeley, CA (1981).

Si no se indica otra cosa, una secuencia particular de ácido nucleico tiene por objeto abarcar variantes de sustitución conservadoras de la misma (v.g. sustituciones de codones degenerados) y una secuencia complementaria. El término "ácido nucleico" es sinónimo de "polinucleótido" y debe entenderse que incluye un gen, una molécula de cDNA, una molécula de mRNA, así como un fragmento de cualquiera de éstos, tal como un oligonucleótido, y adicionalmente, equivalentes de los mismos (explicados con mayor detalle más adelante). Los tamaños de los ácidos nucleicos se expresan como kilobases (kb) o pares de bases (pb). Éstas son estimaciones derivadas de electroforesis en gel de agarosa o poliacrilamida (PAGE), de secuencias de ácido nucleico que están determinadas por el usuario o publicadas. El tamaño de las proteínas se expresa como peso molecular en kilodaltons (kDa) o como longitud (número de residuos de aminoácidos). El tamaño de las proteínas se estima por PAGE, por secuenciación, por secuencias supuestas de aminoácidos basadas en la secuencia codificante de ácido nucleico o por secuencias de aminoácidos publicadas.

Específicamente, las moléculas de cDNA que codifican la secuencia de aminoácidos correspondiente a B7-DC o fragmentos o derivados de la misma pueden sintetizarse por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (véase, por ejemplo, U.S. 4.683.202) utilizando iniciadores derivados de la secuencia de la proteína descrita en esta memoria. Estas secuencias de cDNA pueden ensamblarse luego en un vector de expresión eucariota o procariota, y el vector resultante puede utilizarse para dirigir la síntesis de B7-DC, o su fragmento o derivado por células hospedadoras apropiadas, por ejemplo células COS o CHO.

Esta invención describe ácidos nucleicos aislados que tienen una secuencia de nucleótidos que codifica la nueva B7-DC, fragmentos de la misma o equivalentes de la misma. El término ácido nucleico, como se utiliza en esta memoria, debe entenderse que incluye tales fragmentos o equivalentes. Las secuencias de ácido nucleico de esta invención pueden ser DNA o RNA. Un ácido nucleico preferido es cDNA que codifica B7-DC humana que tiene la secuencia SEQ ID NO: 1 o equivalentes de la misma.

Preferiblemente, el ácido nucleico de la presente invención es una molécula de cDNA que codifica al menos una porción de B7-DC. Este cDNA puede estar constituido por mRNA extraído de DCs maduras u otras células que expresan naturalmente esta proteína. Una secuencia de ácido nucleico que codifica B7-DC puede obtenerse de DNA genómico de DC. Así, DNA que codifica B7-DC puede clonarse a partir de un cDNA o una biblioteca genómica de acuerdo con protocolos conocidos.

Una secuencia de nucleótidos de cDNA que codifica B7-DC puede obtenerse por aislamiento de mRNA total a partir de una línea de células apropiada. cDNA bicatenario se prepara a partir de mRNA total. cDNA puede insertarse en un plásmido, bacteriófago o vector viral adecuado utilizando una cualquiera de varias técnicas conocidas.

Con referencia a una secuencia de nucleótidos, el término "equivalente" tiene por objeto incluir secuencias que codifican proteínas estructuralmente homólogas y/o funcionalmente equivalentes. Por ejemplo, un polimorfismo natural de la secuencia de nucleótidos de B7-DC (especialmente en la tercera base de un codón) pueden manifestarse como mutaciones "silenciosas" que no cambian la secuencia de aminoácidos. Sin embargo, pueden existir polimorfismos que implican cambios en la secuencia de aminoácidos en B7-DC en una población humana (o de otros mamíferos). Los expertos en la técnica apreciarán que estas variantes alélicas que presentan cambios en uno o más nucleótidos (hasta aproximadamente 3-4% de la secuencia codificante total) se encontrarán probablemente en una población humana debido a la variación alélica natural. Cualquiera y la totalidad de tales variantes alélicas y polimorfismos de ácido nucleico y polipéptidos resultantes en el DNA codificante de B7-DC están dentro del alcance de la invención.

Adicionalmente, pueden existir una o más isoformas que se presentan naturalmente o miembros afines de la familia de la proteína B7-DC descrita en esta memoria, que son capaces de reaccionar inmunitariamente de manera cruzada. Tales isoformas o miembros de familia se definen como proteínas que comparten semejanza funcional de secuencia de aminoácidos con B7-DC, aun cuando estén codificadas por genes en loci diferentes.

Fragmento de Ácido Nucleico

Un fragmento de la secuencia de ácido nucleico se define como una secuencia de nucleótidos que tiene menos nucleótidos que la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína B7-DC de longitud total. Esta invención incluye tales fragmentos de ácido nucleico que codifican polipéptidos que retienen (1) la capacidad de B7-DC para fijarse a su o sus ligandos naturales en las células T y (2) aumentan o inhiben (dependiendo del modo en que se presenten) las respuestas inmunes mediadas por las células T activadas (medidas como producción de citoquinas y/o proliferación de células T por las células T que han recibido una señal primaria de activación).

Por ejemplo, un fragmento de ácido nucleico como se entiende en esta memoria codifica un polipéptido B7-DC que retiene la capacidad para fijarse a la superficie de las células T para un receptor que no ha sido identificado toda-vía (pero no parece ser CD28 o CTLA-4) y suministrar una señal coestimuladora a los linfocitos T. De acuerdo con otro criterio, el presente fragmento de ácido nucleico es uno que se hibrida con un ácido nucleico de otra especie animal
y es por tanto útil en ensayos de cribado para detectar nuevas proteínas que "reaccionan cruzadamente" con B7-DC.

Generalmente, la secuencia de ácido nucleico que codifica un fragmento del polipéptido B7-DC está constituida por nucleótidos de la secuencia que codifica la proteína madura. Sin embargo, en algunos casos puede ser deseable incluir la totalidad o parte de la porción de la secuencia conductora del ácido nucleico. Las secuencias de ácido nucleico de esta invención puede incluir también secuencias enlazadoras, sitios de endonucleasas de restricción naturales o modificadas, y otras secuencias que son útiles para manipulaciones relacionadas con la clonación, expresión o purificación de proteínas o fragmentos codificados. Estas y otras modificaciones de secuencias de ácido nucleico se describen en esta memoria o son bien conocidas en la técnica.

En una realización, DNA que codifica la secuencia de aminoácidos correspondiente al ECD de B7-DC, que contiene los aminoácidos que van desde aproximadamente la posición 26 a la 221, se une a DNA que codifica las secuencias de aminoácidos correspondientes a las regiones bisagra, C_{H}2 y C_{H}3 de IgG\gamma1 humana, utilizando PCR, para formar una construcción que se expresa como proteína de fusión B7-DC-Ig.

Una molécula de DNA análoga que codifica una proteína de fusión B7-Ig se describió en el documento U.S. 5.521.288 y fue depositada con la American Type Culture Collection en Rockville, MD., bajo el número de acceso 68627.

Los métodos para ensamblaje y expresión de DNA codificante de B7-DC y proteínas de fusión B7-DC solubles tales como síntesis de oligonucleótidos, PCR, células transformantes, vectores de construcción, sistemas de expresión, y análogos están bien establecidos en la técnica. Quienes poseen experiencia ordinaria están familiarizados con los materiales de recurso estándar para condiciones y procedimientos específicos.

Se describe también DNA codificante de un dominio o fragmento de B7-DC fusionado con un ácido nucleico que codifica la mayor parte o la totalidad de la porción remanente de otra proteína de la familia B7, tal como B7.1, B7.2 o B7.3. La secuencia completa del DNA de B7.1 humana (CD80) tiene el número de acceso de Genbank X60958; el número de acceso para la secuencia de ratón es X60958 (sic); el número para la secuencia de rata es U05593. La secuencia completa de cDNA de B7.2 humana (CD86) tiene el número de acceso de Genbank L25259; el número de acceso para la secuencia de ratón es L25606.

Vectores de expresión y células hospedadoras

Esta invención incluye un vector de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido B7-DC enlazado operativamente a al menos una secuencia reguladora. "Enlazado operativamente" significa que la secuencia codificante está enlazada a una secuencia reguladora de una manera que permite la expresión de la secuencia codificante. Secuencias reguladoras conocidas se seleccionan para dirigir la expresión de la proteína deseada en una célula hospedadora apropiada. De acuerdo con ello, el término "secuencia reguladora" incluye promotores, intensificadores y otros elementos de control de la expresión. Tales secuencias reguladoras se describen, por ejemplo, en Goeddel, Gene Expression Technology. Methods in Enzymology, vol. 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)).

Los expertos en la técnica aprecian que el diseño particular de un vector de expresión de esta invención depende de consideraciones tales como la célula hospedadora a transfectar y/o el tipo de proteína a expresar.

Los presentes vectores de expresión comprenden la gama completa de moléculas de ácido nucleico que codifican las diversas realizaciones de B7-DC: proteína de longitud total y sus derivados funcionales (definidos en esta memoria) con inclusión de fragmentos polipeptídicos, variantes, proteínas de fusión, etc. Así, en una realización, el vector de expresión comprende un ácido nucleico que codifica al menos una porción de la proteína B7-DC tal como el ECD, solo o fusionado a otra proteína.

Tales vectores de expresión se utilizan para transfectar células hospedadoras para la expresión del DNA y producción de las proteínas codificadas que incluyen proteínas o péptidos de fusión. Se comprenderá que una célula genéticamente modificada que expresa el polipéptido B7-DC puede expresar transitoriamente el DNA exógeno durante un tiempo suficiente para que la célula sea útil para su finalidad pensada. Así, si la célula debe servir como inmunógeno que tenga una capacidad coestimuladora aumentada in vivo o ex vivo, el periodo de tiempo durante el que se requiere la expresión, o durante el que la célula debe permanecer viva, es el tiempo necesario para que la célula ejerza su función inmunógena y/o coestimuladora. Por ejemplo, en el caso de una célula tumoral transducida que expresa la B7-DC de la presente invención, la expresión de B7-DC puede durar tan poco como 6 horas, preferiblemente 24 horas, más preferiblemente al menos 2-4 días. Por supuesto, la expresión puede ser también estable (es decir, durante toda la vida de la célula). Vectores de expresión y elementos reguladores apropiados (v.g., promotores inducibles o constitutivos) expuestos más adelante se seleccionan de acuerdo con la estabilidad de expresión deseada o requerida.

La presente invención describe métodos para producir la proteína B7-DC, fragmentos y derivados. Por ejemplo, una célula hospedadora transfectada con un vector de ácido nucleico que codifica al menos una porción de la proteína B7-DC se cultiva en condiciones apropiadas para permitir la expresión del polipéptido B7-DC.

Células hospedadoras pueden transfectarse también con uno o más vectores de expresión que, aisladamente o en combinación, comprenden DNA codificante de al menos una porción de la proteína B7-DC y DNA que codifica al menos una porción de una segunda proteína, de tal modo que las células hospedadoras producen polipéptidos de fusión que incluyen ambas porciones.

Cuando el vector de expresión recombinante comprende DNA que codifica una porción de B7-DC y DNA que codifica otra proteína, tal como IgC\gamma1, la proteína de fusión resultante puede exhibir solubilidad, afinidad de fijación y/o valencia alteradas. Una proteína de fusión B7-DC Ig, por ejemplo, es secretada preferiblemente por células hospedadoras transfectadas en cultivos y se aísla por tanto del medio de cultivo. Alternativamente, si la proteína está retenida en el citoplasma, las células se cosechan y se lisan, y la proteína se aísla de este lisado.

Un cultivo incluye típicamente células hospedadoras, medio de crecimiento apropiado y otros subproductos. Medios de cultivo adecuados son bien conocidos en la técnica. La proteína B7-DC puede aislarse del medio o de lisados de células utilizando técnicas convencionales para purificación de proteínas y péptidos, que incluyen precipitación con sulfato de amonio, cromatografía en columna de fraccionamiento (v.g. cromatografía de intercambio iónico, de filtración con gel, de afinidad, etc.) y/o electroforesis (véase en líneas generales, "Enzyme Purification and Related Techniques", Methods in Enzymology, 22: 233-577 (1971)). Una vez purificadas, parcialmente o hasta homogeneidad, las proteínas B7-DC recombinantes de la invención pueden utilizarse en composiciones farmacéuticas como se describe con mayor detalle en esta memoria.

Las células hospedadoras procariotas o eucariotas transformadas o transfectadas para expresar B7-DC o un homólogo o derivado funcional de la misma están dentro del alcance de la invención. Por ejemplo, B7-DC puede expresarse en células bacterianas tales como E. coli, células de insecto (baculovirus), levadura, o células de mamífero tales como células de ovario de hámster chino (CHO) o células humanas. Otras células hospedadoras adecuadas pueden encontrarse en Goeddel (1990) supra o son conocidas en cualquier caso por los expertos en la técnica.

La expresión en células eucariotas conduce a glicosilación parcial o completa y/o formación de enlaces disulfuro relevantes inter- o intra-catenarios de la proteína recombinante.

Ejemplos de vectores para expresión en la levadura S. cerevisiae incluyen pYepSec1 (Baldari et al., (1987) EMBO J. 6: 229-234), pMFa (Kurjan et al., (1982) Cell 30: 933-943), pJRY88 (Schultz et al., (1987) Gene 54: 113-123, y pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, Calif.). Vectores de baculovirus disponibles para expresión de proteínas en células de insecto cultivadas (células SF9) incluyen la serie pAc (Smith et al., (1983) Mol. Cell Biol. 3: 2156-2165,) y la serie pVL (Lucklow, V. A., y Surnmers, M. D., (1989) Virology 170: 31-39). Generalmente, se utilizan células COS (Gluzman, Y., (1981) Cell 23: 175-182) en combinación con vectores tales como pCDM8 (Aruffo A. y Seed, B., supra) para amplificación/expresión transitoria en células de mamífero, mientras que se utilizan células CHO (CHO dhfr-negativas) con vectores tales como pMT2PC (Kaufman et al. (1987), EMBO J. 6: 187-195) para amplificación/expresión estables en células de mamífero. La línea de células de mieloma en NS0 (un sistema de expresión de glutamina-sintetasa) está disponible de Celltech Ltd.

A menudo, en los vectores de fusión-expresión, se introduce un sitio de escisión proteolítica en la unión del grupo informador y la proteína diana para permitir la separación de la proteína diana del grupo informador subsiguientemente a la purificación de la proteína de fusión. Enzimas proteolíticas para dicha escisión y sus secuencias de reconocimiento incluyen factor Xa, trombina y enteroquinasa.

Vectores de fusión-expresión típicos incluyen pGEX (Amrad Corp., Melbourne, Australia), pMAL (New England Biolabs, Beverly, Mass.) y pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, N.J.) que fusionan glutatión-S-transferasa, proteína E de fijación de maltosa, o proteína A, respectivamente, a la proteína diana recombinante.

Vectores de expresión inducibles que no son de fusión incluyen pTrc (Amann et al., (1988) Gene 69: 301-315) y pET 11d (Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 60-89). Si bien la expresión de genes diana está basada en la transcripción de la RNA-polimerasa del hospedador por el promotor de fusión híbrido trp-lac en pTrc, la expresión de genes diana insertados en pET 11d se basa en la transcripción del promotor de fusión T7 gn10-lacO mediada por la RNA-polimerasa viral coexpresada (T7gn1). Esta polimerasa viral es suministrada por las cepas hospedadoras BL21(DE3) o HMS174(DE3) de un profago \lambda residente que alberga un T7gn1 bajo el control transcripcional del promotor lac-UV5.

Se describe también una célula transfectada que expresa B7-DC nueva de novo). En el caso de una célula que expresa ya B7-DC, tal como una DC madura, la célula transfectada expresa cantidades incrementadas de proteínas B7-DC o fragmentos de las mismas en la superficie de la célula.

Por ejemplo, una célula tumoral tal como un sarcoma, melanoma, leucemia, linfoma, carcinoma o neuroblastoma se transfecta con un vector de expresión que dirige la expresión de B7-DC en la superficie de la célula tumoral. Tales células tumorales transfectadas pueden utilizarse como inmunógenos para inducir inmunidad terapéutica antitumoral como se describe en esta memoria.

Construcción de Vectores

La construcción de vectores adecuados que contienen las secuencias codificantes y de control deseadas emplea métodos estándar de ligación y restricción que son bien conocidos en la técnica. Plásmidos aislados, secuencias de DNA, u oligonucleótidos sintetizados se escinden, elaboran, y religan en la forma deseada.

Las secuencias de DNA que forman los vectores están disponibles de diversas fuentes. Vectores de cadena principal y sistemas de control se encuentran generalmente en vectores "hospedadores" disponibles que se utilizan para el grueso de las secuencias en construcción. Para la secuencia codificante pertinente, la construcción inicial puede ser, y usualmente es, cuestión de recuperación de las secuencias apropiadas a partir de bibliotecas de cDNA o DNA genómico. Sin embargo, una vez descrita la secuencia es posible sintetizar la secuencia génica total in vitro partiendo de los derivados nucleotídicos individuales. La secuencia génica total para genes de longitud considerable, v.g., 500-1000 pb puede prepararse por síntesis de oligonucleótidos individuales solapantes complementarios y llenado en porciones monocatenarias no solapantes con utilización de DNA-polimerasa en presencia de los desoxirribonucleótido-trifosfatos. Este método ha sido utilizado con éxito en la construcción de varios genes de secuencia conocida. Véase, por ejemplo, Edge, M. D., Nature (1981) 292:756; Nambair, K. P., et al., Science (1984) 223:1299; y Jay, E., J Biol Chem (1984) 259:6311.

Se preparan oligonucleótidos sintéticos por el método del fosfotriéster como se describe en las referencias arriba citadas o el método del fosforamidito como ha sido descrito por Beaucage, S.L., y Caruthers, M.H., Tet. Lett (1981) 22: 1859; y Matteucci, M.D., y Caruthers, M.H., J. Am. Chem. Soc. (1981) 103: 3185) y pueden prepararse utilizando sintetizadores automáticos de oligonucleótidos disponibles comercialmente. El tratamiento con quinasa de las cadenas simples antes de la reasociación o para marcación se realiza utilizando un exceso, v.g., aproximadamente 10 unidades de polinucleótido-quinasa para 1 nmol de sustrato en presencia de Tris 50 mM, pH 7,6, MgCl_{2} 10 mM, ditiotreitol 5 mM, ATP 1-2 mM, 1,7 pmoles de \gamma-^{32}P-ATP (2,9 mCi/mmol), espermidina 0,1 mM, EDTA 0,1 mM.

Una vez que los componentes de los vectores deseados están ya disponibles, los mismos pueden escindirse y ligarse utilizando procedimientos estándar de restricción y ligación. La escisión de DNA específica del sitio se realiza por tratamiento con la enzima (o enzimas) de restricción adecuada(s) en condiciones que son conocidas generalmente en la técnica, y cuyas particularidades son especificadas por el fabricante de estas enzimas de restricción disponibles comercialmente. Véase, v.g., New England Biolabs, Product Catalog. En general, se escinde aproximadamente 1 mg de secuencia de plásmido o DNA por una unidad de enzima en aproximadamente 20 ml de solución tampón; en los ejemplos dados en esta memoria, se utiliza típicamente un exceso de enzima de restricción para asegurar la digestión completa del sustrato de DNA. Los tiempos de incubación de aproximadamente 1 hora a 2 horas a aproximadamente 37ºC son manejables, aunque pueden tolerarse variaciones. Después de cada incubación, se separa la proteína por extracción con fenol/cloroformo, y puede ir seguida por extracción con éter, y el ácido nucleico recuperarse de las fracciones acuosas por precipitación con etanol. Si se desea, la separación por tamaños de los fragmentos escindidos puede realizarse por electroforesis en gel de poliacrilamida o gel de agarosa utilizando técnicas estándar. Una descripción de las separaciones por tamaños se encuentra en Methods in Enzymology (1980) 65: 499-560.

Los fragmentos de restricción escindidos pueden hacerse romos en los extremos por tratamiento con el fragmento grande de la DNA-polimerasa I de E. coli (Klenow) en presencia de los cuatro desoxinucleótido-trifosfatos (dNTPs) utilizando tiempos de incubación de aproximadamente 15 a 25 min a 20º hasta 25ºC en Tris 50 mM de pH 7,6, NaCl 50 mM, MgCl_{2} 6 mM, DTT 6 mM y dNTPs 0,1-1,0 mM. El fragmento Klenow rellena en los salientes monocatenarios 5', pero recorta las monocadenas 3' salientes, aun cuando estén presentes los cuatro dNTPs. Si se desea, puede realizarse una reparación selectiva suministrando solamente uno de los dNTPs, o dNTPs seleccionados, dentro de las limitaciones dictadas por la naturaleza del saliente. Después del tratamiento con Klenow, la mezcla se extrae con fenol/cloroformo y se precipita con etanol. El tratamiento en condiciones apropiadas con nucleasa S1 o BAL-31 da como resultado la hidrólisis de cualquier porción monocatenaria.

Las ligaciones se realizan típicamente en volúmenes de 15-50 ml en las condiciones y temperaturas estándar siguientes: por ejemplo, Tris-HCl 20 mM de pH 7,5, MgCl_{2} 10 mM, DTT 10 mM, BSA 33 \mug/ml, NaCl 10-50 mM, y, o bien ATP 40 \muM, 0,01-0,02 unidades (Weiss) de DNA-ligasa T4 a 0ºC (para ligación de "extremos cohesivos") o bien ATP 1 mM, 0,3-0,6 unidades (Weiss) de DNA-ligasa T4 a 14ºC (para ligación de "extremos romos"). Las ligaciones intermoleculares de "extremos cohesivos" se realizan usualmente a concentraciones totales de DNA de 33-100 \mug/ml (concentración final total 5-100 nM). Las ligaciones intermoleculares de extremos romos se realizan a concentración total 1 mM en los extremos.

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En la construcción de vectores empleando "fragmentos de vector", el fragmento se trata comúnmente con fosfatasa alcalina bacteriana (BAP) o fosfatasa alcalina de intestino de ternero (CIAP) a fin de eliminar el fosfato 5' y prevenir la autoligación. Las digestiones se conducen a pH 8 en Tris-HCl aproximadamente 10 mM, EDTA 1 mM utilizando BAP o CIAP a aproximadamente 1 unidad/mg de vector a 60ºC durante aproximadamente 1 hora. La preparación se extrae con fenol/cloroformo y se precipita con etanol. Alternativamente, la re-ligación puede prevenirse en vectores que han sido digeridos doblemente por enzimas de restricción adicionales y separación de los fragmentos indeseables.

Cualquiera de cierto número de métodos se utilizan para introducir mutaciones en la secuencia codificante a fin de generar las variantes de la invención. Estas mutaciones incluyen deleciones o inserciones simples, deleciones, inserciones o sustituciones sistemáticas de agrupaciones de bases o sustituciones de bases simples.

Por ejemplo, se crean modificaciones de la secuencia de DNA (cDNA o DNA genómico) de B7-DC por mutagénesis orientada, una técnica bien conocida para la cual están disponibles comercialmente protocolos y reactivos (Zoller, MJ et al., Nucleic Acids Res. (1982) 10: 6487-6500 y Adelman, JP et al., DNA (1983) 2: 183-193)). Las ligaciones correctas para construcción de plásmidos se confirman, por ejemplo, transformando en primer lugar la cepa MC1061 de E. coli (Casadaban, M., et al., J. Mol. (1980) 138: 179-207) u otro hospedador adecuado con la mezcla de ligación. Utilizando métodos convencionales, se seleccionan transformantes basándose en la presencia del gen de resistencia a ampicilina, tetraciclina u otro antibiótico (u otro marcador seleccionable) dependiendo del modo de construcción del plásmido. Se preparan luego plásmidos a partir de los transformantes por amplificación opcional con cloranfenicol seguida opcionalmente de amplificación con cloranfenicol ((Clewell, DB et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1969) 62: 1159; Clewell, D.B., J. Bacteriol. (1972) 110: 667). Se utilizan comúnmente varias minipreparaciones de DNA. Véase, v.g., Holmes, DS, et al., Anal. Biochem. (1981) 114: 193-197; Birnboim, HC et al., Nucleic Acids Res. (1979) 7: 1513-1523. El DNA aislado se analiza por restricción y/o se secuencia por el método de los didesoxinucleótidos de Sanger (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1977) 74: 5463) como ha sido descrito ulteriormente por Messing et al., Nucleic Acids res. (1981) 9: 309; o por el método de Maxam et al., Methods in Enzymology (1980) 65: 499.

El DNA vector puede introducirse en células de mamífero por técnicas convencionales tales como co-precipitación con fosfato de calcio o cloruro de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, lipofección, o electroporación. Métodos adecuados para transformación de células hospedadoras pueden encontrarse en Sambrook et al., supra y otros textos estándar.

A menudo, en los vectores de fusión-expresión, se introduce un sitio de escisión proteolítica en la unión del grupo informador y la proteína diana a fin de permitir la separación de la proteína diana del grupo informador subsiguientemente a la purificación de la proteína de fusión. Enzimas proteolíticas para dicha escisión y sus secuencias de reconocimiento incluyen Factor Xa, trombina y enteroquinasa.

Vectores típicos de de fusión-expresión incluyen pGEX (Amrad Corp., Melbourne, Australia), pMAL (New England Biolabs, Beverly, Mass.) y pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, N.J.) que fusionan glutatión-S-transferasa, proteína E de fijación de maltosa, o proteína A, respectivamente, a la proteína diana recombinante.

Vectores inducibles que no son de fusión-expresión incluyen pTrc (Amann et al., (1988) Gene 69: 301-315) y pET 11d (Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 60-89). Mientras que la expresión de genes diana está basada en la transcripción de la RNA-polimerasa del hospedador por el promotor de fusión híbrido trp-lac en pTrc, la expresión de genes diana insertados en pET 11d está basada en la transcripción del promotor de fusión T7gn10-lacO mediada por la RNA-polimerasa viral coexpresada (T7gn1). Esta polimerasa viral es suministrada por las cepas hospedadoras BL21(DE3) o HMS174(DE3) de un profago lambda residente que alberga un T7gn1 bajo el control transcripcional del promotor lacUV5.

Promotores e Intensificadores

Una región promotora de una molécula de DNA o RNA fija RNA-polimerasa y promueve la transcripción de una secuencia de ácido nucleico "enlazada operativamente". Como se utiliza en esta memoria, una "secuencia promotora" es la secuencia de nucleótidos del promotor que se encuentra en la cadena del DNA o RNA que es transcrita por la RNA-polimerasa. Dos secuencias de una molécula de ácido nucleico, tales como una secuencia promotora y una secuencia codificante, están "enlazadas operativamente" cuando las mismas están unidas una a otra de una manera que permite que ambas secuencias se transcriban en el mismo transcrito de RNA o permite que un transcrito de RNA que se inicia en una secuencia se extienda en la segunda secuencia. Así, dos secuencias, tales como una secuencia promotora y una secuencia codificante de DNA o RNA están enlazadas operativamente si la transcripción que comienza en la secuencia promotora es capaz de producir un transcrito de RNA de la secuencia codificante enlazada operativamente. Para estar "enlazadas operativamente" no es necesario que dos secuencias sean inmediatamente adyacentes una a otra en la secuencia lineal.

Las secuencias promotoras preferidas de la presente invención deben ser operativas en células de mamífero y pueden ser promotores eucariotas o virales. Los promotores adecuados pueden ser inducibles, reprimibles o constitutivos. Un ejemplo de un promotor constitutivo es el promotor viral MSV-LTR, que es eficiente y activo en una diversidad de tipos de células y, en contraste con muchos otros promotores, tiene la misma actividad intensificadora en células en reposo y células en crecimiento. Otros promotores virales preferidos incluyen el que se encuentra en la CMV-LTR (de citomegalovirus) (Bashart, M., et al., Cell 41: 521 (1985)) o en la RSV-LTR (del virus del sarcoma de Rous) (Gorman, C.M., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 6777 (1982)). Son también útiles el promotor del gen I de metalotioneína de ratón (Hamer, D., et al., J. Mol. Appl. Gen. 1: 273-288 (1982)); el promotor TK del herpesvirus (McKnight, S., Cell 31: 355-365 (1982)); el promotor temprano de SV40 (Benoist, C., et al., Nature 290: 304-310 (1981)); y el promotor del gen gal4 de levadura (Johnston, S.A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (EE.UU.) 79: 6971-6975 (1982); Silver, P.A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (EE.UU.) 81: 5951-5955 (1984)). Otras descripciones ilustrativas de asociación de factores de transcripción con regiones promotoras y la activación y fijación de DNA separadas de factores de transcripción incluyen: Keegan et al., Nature (1986) 231:699; Fields et al., Nature (1989) 340:245; Jones, Cell (1990) 61:9; Lewin, Cell (1990) 61:1161; Ptashne et al., Nature (1990) 346:329; Adams et al., Cell (1993) 72:306.

La región promotora puede incluir adicionalmente una región octámera que puede funcionar también como un intensificador específico de tejido, por interacción con ciertas proteínas encontradas en el tejido específico. El dominio intensificador de la construcción de DNA de la presente invención es uno que es específico para las células diana a transfectar, o está fuertemente activado por factores celulares de dichas células diana. Ejemplos de vectores (plásmido o retrovirus) se describen en Roy-Burman et al., (Patente de EE.UU. No. 5.112.767). Para una exposición general de intensificadores y sus acciones en transcripción véase Newin, B.M., Genes IV, Oxford University Press, Oxford (1990), pp. 552-576. Son particularmente útiles los intensificadores retrovirales (v.g. LTR viral). El intensificador está situado preferiblemente aguas arriba del promotor con el cual interacciona para estimular la expresión génica. Para uso con vectores retrovirales, la LTR viral endógena puede privarse de efecto intensificador y sustituirse con otras secuencias intensificadoras deseadas que confieren especificidad de tejido u otras propiedades deseables tales como eficiencia de transcripción en la molécula de DNA codificante de B7-DC de la presente invención.

Las secuencias de ácido nucleico de la invención pueden sintetizarse también químicamente utilizando técnicas estándar. Se conocen diversos métodos de síntesis química de polidesoxinucleótidos, que incluyen síntesis en fase sólida que, al igual que la síntesis de péptidos, ha sido totalmente automatizada con sintetizadores de DNA disponibles comercialmente (véase, v.g. Itakura et al., Patente de EE.UU. No. 4.598.049; Caruthers et al., patente de EE.UU. No. 4.458.066; Itakura, Patentes de EE.UU. Nos. 4.401.796 y 4.373.071).

Proteínas y polipéptidos

Se hace referencia también a una proteína B7-DC "aislada" que tiene la secuencia SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4. Si bien la presente descripción ilustra la proteína de longitud total humana y murina B7-DC (y el DNA), debe entenderse que homólogos de B7-DC de otras especies de mamíferos y mutantes de los mismos que poseen las características descritas en esta memoria se consideran comprendidos dentro del alcance de esta invención.

Se describe también un "derivado funcional" de B7-DC, lo que significa una variante de sustitución de aminoácidos, un "fragmento", o un "derivado químico" de B7-DC, términos que se definen a continuación. Un derivado funcional retiene una actividad apreciable de B7-DC, preferiblemente la de fijación a un receptor en las células T y coestimulación de la actividad de las células T, lo que permite su utilidad de acuerdo con la presente invención. Los "derivados funcionales" abarcan "variantes" y "fragmentos" con indiferencia de si los términos se utilizan juntos o alternativamente en esta memoria.

Un homólogo funcional debe poseer la actividad bioquímica y biológica arriba indicada. Teniendo en cuenta esta caracterización funcional, el uso de proteínas homólogas B7-DC de otras especies, con inclusión de proteínas no descubiertas todavía, cae dentro del alcance de la invención si estas proteínas tienen semejanza de secuencia y la actividad bioquímica y biológica citada.

Para determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos o de dos secuencias de ácido nucleico, las secuencias se alinean para propósitos óptimos de comparación (v.g. pueden introducirse lagunas en una o ambas de una primera y una segunda secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico para alineación óptima y pueden despreciarse secuencias no homólogas para propósitos de comparación). En un método de alineación preferido, se alinean los residuos Cys.

La longitud de una secuencia que se compara es al menos 90% de la longitud de la secuencia de referencia. Por ejemplo, cuando se alinea una segunda secuencia con la secuencia de aminoácidos de la proteína B7-DC humana (SEQ ID NO: 2) que tiene 276 residuos de aminoácidos, se alinean al menos 248 residuos de aminoácidos). Se comparan luego los residuos de aminoácidos (o nucleótidos) en las posiciones de aminoácidos (o posiciones de nucleótidos). Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo residuo de aminoácido (o nucleótido) que la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en dicha posición (tal como se utiliza en esta memoria, "identidad" de aminoácido o de ácido nucleico es equivalente a "homología" de aminoácido o ácido nucleico). El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias, teniendo en cuenta el número de lagunas, y la longitud de cada laguna, que precisa ser introducida para la alineación óptima de las dos secuencias.

La comparación de secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias pueden realizarse utilizando un algoritmo matemático. En una realización preferida, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se determina utilizando el algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. 48: 444-453 (1970)) que ha sido incorporado en el programa GAP dentro del paquete de software GCG (disponible en http://www.gcg.com), utilizando una matriz Blossom 62 o una matriz PAM250, y un peso de laguna de 16, 14, 10, 8, 6, ó 4 y un peso por longitud de 1, 2, 3, 4, 5 ó 6. En otra realización adicional preferida, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos se determina utilizando el programa GAP del paquete de software GCG (disponible en http://www.gcg.com), utilizando una matriz NWSgapdna.CMP y un peso por laguna de 40, 50, 60, 70, u 80 y un peso por longitud de 1, 2, 3, 4, 5, 5 ó 6. En otra realización, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos o nucleótidos se determina utilizando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller (CABIOS, 4: 11-17 (1989)) que ha sido incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0), utilizando una tabla de residuos de peso PAM120, una penalidad por longitud de laguna de 12 y una penalidad por laguna de 4.

Las secuencias de ácido nucleico y proteínas de la presente invención pueden utilizarse adicionalmente como "secuencia de consulta" para realizar una búsqueda contra bases de datos públicas, por ejemplo, para identificar otros miembros de la familia o secuencias afines. Dichas búsquedas pueden realizarse utilizando los programas NBLAST y XBLAST (versión 2.0) de Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10. Las búsquedas de nucleótidos BLAST pueden realizarse con el programa NBLAST, registro = 100, longitud de palabra = 12 a fin de obtener secuencias de nucleótidos homólogas a las moléculas de ácido nucleico B7-DC humano o murino. Las búsquedas de proteínas BLAST pueden realizarse con el programa XBLAST, registro = 50, longitud de palabra = 3 para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a las moléculas de proteína B7-DC humana o murina de la invención. A fin de obtener alineaciones con lagunas para propósitos de comparación, puede utilizarse Gapped BLAST como se describe en Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402. Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, pueden emplearse los parámetros por defecto de los programas respectivos (v.g., XBLAST y NBLAST). Véase http://www.ncbi.nlm.nih.gov.

Así pues, un homólogo de la proteína B7-DC arriba descrita se caracteriza por tener (a) actividad funcional de B7-DC nativa, y (b) semejanza de secuencia con una proteína B7-DC nativa (tal como SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4), cuando se determina anteriormente, de al menos aproximadamente 30% (al nivel de aminoácidos), con preferencia al menos aproximadamente 50%, con más preferencia al menos aproximadamente 70%, y con mayor preferencia aún al menos aproximadamente 90%.

Está dentro de la experiencia de la técnica la obtención y expresión de una proteína de este tipo utilizando sondas de DNA basadas en las secuencias descritas de B7-DC. A continuación, la actividad bioquímica y biológica de la proteína puede testarse fácilmente utilizando métodos reconocidos en la técnica tales como los descritos en esta memoria, por ejemplo, un ensayo estándar de 'proliferación de células T o secreción de citoquinas. Un ensayo biológico de co-estimulación de células T indicará si el homólogo tiene la actividad requerida para cualificarse como un homólogo "funcional".

Ensayos preferidos piden las características funcionales de B7-DC tales como la estimulación de la síntesis de citoquinas por las células T, que depende de la fijación o reticulación de la TCR ("señal de activación primaria"), así como del suministro de una señal coestimuladora. La fijación de B7-DC a su o sus ligandos naturales en las células T transmite una señal que induce producción incrementada de citoquinas, tales como IL-2, lo cual estimula a su vez una proliferación que puede ser medida también rutinariamente.

Una "variante" de B7-DC se refiere a una molécula sustancialmente idéntica a la proteína entera o a un fragmento de la misma en el cual uno o más residuos de aminoácidos han sido reemplazados (variante de sustitución) o que tiene uno o varios residuos delecionados (variante de deleción) o añadidos (variante de adición). Un "fragmento" de B7-DC hace referencia a cualquier subconjunto de la molécula, preferiblemente uno que incluye el ECD, es decir, un polipéptido más corto de la proteína de longitud total.

Pueden utilizarse cierto número de procesos para generar fragmentos, mutantes y variantes de la secuencia de DNA aislada. Pequeñas subregiones o fragmentos del ácido nucleico que codifica la proteína B7-DC, por ejemplo 1-30 bases de longitud, pueden prepararse por síntesis química estándar. Oligonucleótidos antisentido e iniciadores para uso en la generación de fragmentos sintéticos mayores (sic).

Un derivado funcional preferido es una proteína de fusión, un polipéptido que incluye un fragmento funcional de B7-DC. Por ejemplo, un derivado útil de B7 es una proteína de fusión B7-DC-Ig que comprende un polipéptido correspondiente al ECD de B7-DC y una región Ig C. La presencia de la pareja de fusión puede alterar la solubilidad, afinidad y/o valencia (definida aquí como el número de sitios de fijación disponibles por molécula) de la proteína B7-DC. Una proteína de fusión B7-DC soluble, si bien está fijada todavía a un receptor de las células T, puede tener un efecto biológico diferente del de la proteína nativa expresada en una APC, es decir inhibición de la estimulación de las células T por fijación competitiva más bien que coestimulación.

Como se utiliza en esta memoria, un dominio extracelular (ECD) de B7-Dc es la porción extracelular entera de la proteína o cualquier fragmento de la misma que reconoce y se fija a PD-1 o a otro receptor en las células T que no es CD28 o CTLA-4. Preferiblemente, un ECD de B7-DC es aquella porción codificada por residuos de aminoácidos desde aproximadamente la posición 26 hasta aproximadamente la posición 221 de SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 4.

Por "B7-DC soluble" se entiende una forma exenta de células de B7-DC que puede ser derramada, secretada o extraída de cualquier otro modo de las células productoras. B7-DC soluble incluye, pero sin carácter limitante, proteínas de fusión solubles tales como B7-DC-Ig, EDC libre de B7-DC, o el ECD de B7-DC fusionado (genética o químicamente) a una molécula biológicamente activa.

Como se ha indicado anteriormente, esta invención incluye también proteínas de fusión híbridas entre un dominio B7-DC y un dominio o fragmento de otra proteína de la familia B7, expresado preferiblemente en la superficie de la célula en forma coestimuladora.

Un grupo preferido de variantes de B7-DC son aquéllas en las cuales al menos un residuo de aminoácido y preferiblemente, sólo uno, ha sido sustituido por un residuo diferente. Para una descripción detallada de la química y estructura de las proteínas, véase Schulz, GE et al., Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, Nueva York, 1978, y Creighton, T.E., Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, 1983. Los tipos de sustituciones que pueden hacerse en la molécula de la proteína pueden estar basados en análisis de las frecuencias de cambios de aminoácidos entre una proteína homóloga de especies diferentes, tales como las presentadas en la Tabla 1-2 de Schulz et al. (supra) y la Figura 3-9 de Creighton (supra). Basándose en un análisis de este tipo, las sustituciones conservadoras se definen en esta memoria como cambios dentro de uno de los cinco grupos siguientes:

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Los tres residuos de aminoácidos anteriores entre paréntesis tienen papeles especiales en la arquitectura de la proteína. Gly es el único residuo que carece de una cadena lateral, e imparte por tanto flexibilidad a la cadena. Pro, debido a su geometría inusual, constriñe fuertemente la cadena. Cys puede participar en la formación de enlaces disulfuro, que es importante en el plegamiento de las proteínas.

Cambios más sustanciales en las propiedades bioquímicas, funcionales (o inmunitarias) se realizan por selección de sustituciones que son menos conservadoras, tales como entre los cinco grupos anteriores, más bien que dentro de los mismos. Tales cambios diferirán más significativamente en su efecto sobre el mantenimiento de (a) la estructura de la cadena principal peptídica en el área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación de hoja o hélice, (b) la carga o carácter hidrófobo de la molécula en el sitio diana, o (c) el grueso de la cadena lateral. Ejemplos de tales sustituciones son (i) sustitución de Gly y/o Pro por otro aminoácido o deleción o inserción de Gly o Pro; (ii) sustitución de un residuo hidrófilo v.g., Ser o Thr, en lugar de (o por) un residuo hidrófobo, v.g., Leu, Ile, Phe, Val o Ala; (iii) sustitución de un residuo Cys en lugar de (o por) cualquier otro residuo; (iv) sustitución de un residuo que tiene una cadena lateral electropositiva, v.g., Lys, Arg o His, en lugar de (o por) un residuo que tenga una carga electronegativa, v.g., Glu o Asp; o (v) sustitución de un residuo que tiene una cadena lateral voluminosa (v.g., Phe, en lugar de (o por) un residuo que no tiene una cadena lateral de este tipo, v.g. Gly.

Las deleciones, inserciones y sustituciones más aceptables de acuerdo con la presente invención son aquéllas que no producen cambios radicales en las características de la proteína B7-DC en términos de su actividad coestimuladora de las células T. Sin embargo, cuando es difícil predecir el efecto exacto de la sustitución, deleción o inserción antes de hacerlo, un experto en la técnica apreciará que el efecto puede evaluarse por ensayos rutinarios de cribado tales como los descritos en esta memoria, sin requerir experimentación excesiva.

En tanto que pueden hacerse variantes de cadena más corta por síntesis química, para la presente invención, las variantes preferidas de cadena más larga se realizan típicamente por mutagénesis orientada del ácido nucleico codificante del polipéptido B7-DC, expresión del ácido nucleico variante en cultivo de células y, opcionalmente, purificación del polipéptido a partir del cultivo de células, por ejemplo, por cromatografía de inmunoafinidad utilizando anticuerpos específicos inmovilizados a una columna (para absorber la variante por fijación a al menos un epítope).

Derivados Químicos de B7-DC

Los "derivados químicos" de B7-DC contienen restos químicos adicionales que no forman normalmente parte de la proteína. Modificaciones covalentes del polipéptido se incluyen dentro del alcance de esta invención. Tales restos derivatizados pueden mejorar la solubilidad, absorción, semivida biológica, y análogos. Restos capaces de mediar tales efectos se describen, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, edición 16ª, Mack Publishing Co., Easton, PA (1980).

Tales modificaciones pueden introducirse en la molécula por reacción de residuos direccionados de aminoácidos del polipéptido con un agente orgánico de derivatización que es capaz de reaccionar con cadenas laterales seleccionadas o residuos terminales. Otra modificación es la ciclación de la proteína.

Ejemplos de derivados químicos del polipéptido siguen a continuación.

Lisinilo y los residuos aminoterminales se derivatizan con anhídrido succínico u otros anhídridos de ácidos carboxílicos. La derivatización con un anhídrido carboxílico cíclico tiene el efecto de invertir la carga de los residuos lisinilo. Otros reactivos adecuados para derivatización de residuos que contienen amino incluyen imidoésteres tales como picolinimidato de metilo; fosfato de piridoxal; piridoxal; clorohidruro de boro; ácido trinitrobencenosulfónico; O-metilisourea; 2,4-pentanodiona; y reacción con glioxilato catalizada por trans-aminasas.

Los grupos secundarios carboxilo, aspartilo o glutamilo, pueden modificarse selectivamente por reacción con carbodiimidas (R-N=C=N-R') tales como 1-ciclohexil-3-(2-morfolinil-(4-etil)-carbodiimida o 1-etil-3-(4-azonia-4,4'-dimetilpentil)-carbodiimida. Adicionalmente, los residuos aspartilo y glutamilo pueden convertirse en residuos asparaginilo y glutaminilo por reacción con amoniaco.

Otras modificaciones incluyen hidroxilación de prolina y lisina, fosforilación de los grupos hidroxilo de residuos serilo o treonilo, metilación del grupo amino de la lisina (Creighton, supra, pp. 79-86), acetilación de la amina N-terminal, y amidación de los grupos carboxilo C-terminales.

Se incluyen también péptidos en los cuales uno o más D-aminoácidos están sustituidos en lugar de uno o más L-aminoácidos.

Péptidos multímeros

La presente invención incluye también polipéptidos más largos en los cuales una secuencia peptídica básica obtenida a partir de la secuencia de B7-DC se repite desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 100 veces, con o sin espaciadores o enlazadores interpuestos. Debe entenderse que tales multímeros pueden construirse a partir de cualquiera de las variantes peptídicas definidas en esta memoria. Además, un multímero peptídico puede comprender diferentes combinaciones de monómeros peptídicos y las variantes de sustitución descritas de los mismos. Tales péptidos oligómeros o multímeros pueden producirse por síntesis química o por técnicas de DNA recombinante como se expone en esta memoria. Cuando se producen químicamente, los oligómeros tienen preferiblemente de 2 a 8 repeticiones de la secuencia peptídica básica. Cuando se producen recombinantemente, los multímeros pueden tener tantas repeticiones como permita el sistema de expresión, por ejemplo desde 2 a aproximadamente 100 repeticiones.

En los multímeros en tándem, preferiblemente dímeros y trímeros, del péptido o polipéptido B7-DC, las cadenas unidas por enlaces disulfuro intercatenarios u otros enlaces covalentes "artificiales" entre las cadenas están situadas "lado a lado" en lugar de "extremo con extremo" (sic). Dímeros y trímeros preferidos son los formados entre proteínas de fusión de B7-DC tales como B7-DC-Ig, como se describe en esta memoria.

Anticuerpos específicos para epítopes de B7-DC

En la descripción que sigue, se hará referencia a diversas metodologías conocidas por los expertos en la técnica de inmunología, biología celular y biología molecular. Publicaciones y otros materiales que exponen tales metodologías conocidas a las que se hace referencia se incorporan en esta memoria por referencia en sus totalidades como si se expusieran detalladamente. Trabajos estándar de referencia que exponen los principios generales de la inmunología incluyen A.K. Abbas et al., Cellular and Molecular Immunology (4ª edición), W.B. Saunders Co., Philadelphia, 2000; Janeway et al., Immunobiology. The Immune System in Health and Disease, 4ª edición, Garland Publishing Co., Nueva York, 1999; Roitt, I. et al., Imrnunology, (compilador actual) C.V. Mosby Co., St. Louis, MO (1999); Klein, J., Immunology, Blackwell Scientific Publications, Inc., Cambridge, MA., (1990).

Anticuerpos monoclonales (mAbs) y métodos para su producción y uso se describen en Kohler y Milstein, Nature 256:495-497 (1975); Patente EE.UU. No. 4,376,110; Hartlow, E. et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1988); Monoclonal Antibodies and Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Pienum Press, Nueva York, NY (1980); H. Zola et al., en Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications, CRC Press, 1982)).

Métodos de inmunoensayo se describen también en Coligan, J.E. et al., compiladores, Current Protocols in Immunology, Wiley-Interscience, Nueva York 1991 (o edición actual); Butt, W.R. (compilador) Practical Immunoassay: The State of the Art, Dekker, Nueva York, 1984; Bizollon, Ch. A., compilador, Monoclonal Antibodies and New Trends in Immunoassays, Elsevier, Nueva York, 1984; Butler, J.E., ELISA (capítulo 29), en: van Oss, C.J. et al., (compiladores), IMMUNOCHEMISTRY, Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1994, pp. 759-803; Butler, J.E. (compilador), Immunochemistry of Solid-Phase Immunoassay, CRC Press, Boca Ratón, 1991; Weintraub, B., Principies of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, marzo 1986; Work, T.S. et al., Laboratory Techniques, and Biochemistry in Molecular Biology, North Holland Publishing Company, NY, (1978) (Capítulo por Chard, T., "An Introduction to Radioimmune Assay and Related Techniques").

Anticuerpos anti-idiotípicos se describen, por ejemplo, en Idiotypy in Biology and Medicine, Academic Press, Nueva York, 1984; Immunological Reviews, Volumen 79, 1984; Immunological Reviews, Volumen 90, 1986; Curr. Top. Microbiol., Immunol, Volumen 119, 1985; Bona, C. et al, CRC Crit. Rev. Immunol., pp. 33-81 (1981); Jeme, NK, Ann. Immunol. 125C:373-389 (1974); Jeme, NK, en: Idiotypes-Antigens on the Inside, Westen-Schnurr, I., compilador, Editions Roche, Basilea, 1982, Urbain, J et al., Ann. Immunol. 133D:179- (1982); Rajewsky, K. et al., Ann. Rev. Immunol. 1:569-607 (1983).

Se describen también anticuerpos, tanto policlonales como monoclonales, reactivos con nuevos epítopes de B7-DC que están ausentes de las proteínas conocidas de la familia B7. Los anticuerpos pueden ser xenógenos, alógenos, singénicos, o formas modificadas de los mismos, tales como anticuerpos humanizados o quiméricos. Se incluyen también anticuerpos anti-idiotípicos específicos para el idiotipo de un anticuerpo anti-B7-DC. Debe entenderse que el término "anticuerpo" incluye también tanto moléculas intactas como fragmentos de las mismas que incluyen el sitio de fijación de antígeno y son capaces de fijarse a un epítope de B7-DC. Éstos incluyen fragmentos Fab y F(ab')_{2} que carecen del fragmento Fc de un anticuerpo intacto, se aclaran más rápidamente de la circulación, y pueden tener menos fijación tisular inespecífica que un anticuerpo intacto (Wahl et al., J. Nucl. Med. 24:316-325 (1983)). Se incluyen también fragmentos Fv (Hochrnan, J. et al. (1973) Biochemistry 12:1130-1135; Sharon, J. et al. (1976) Biochemistry 15:1591-1594).). Estos diversos fragmentos se producen utilizando técnicas convencionales tales como escisión con proteasas o escisión química (véase, v.g., Rousseaux et al., Meth. Enzymol., 121: 663-69 (1986)).

Los anticuerpos policlonales se obtienen como sueros a partir de animales inmunizados tales como conejos, cabras, roedores, etc. y pueden utilizarse directamente sin tratamiento ulterior o pueden someterse a métodos convencionales de enriquecimiento o purificación tales como precipitación con sulfato de amonio, cromatografía de intercambio iónico, y cromatografía de afinidad (véase Zola et al., supra).

El inmunógeno puede comprender la proteína B7-D6 completa, o fragmentos o derivados de la misma. Inmunógenos preferidos comprenden la totalidad o parte del ECD de B7-DC humana (residuos de aminoácidos 26-221), donde estos residuos contienen las modificaciones posteriores a la traducción, tales como glicosilación, que se encuentran en la B7-DC nativa. Los inmunógenos que comprenden el dominio extracelular se producen de una diversidad de maneras conocidas en la técnica, v.g., expresión de genes clonados utilizando métodos recombinantes convencionales, aislamiento a partir de las células originarias, poblaciones de células que expresan niveles altos de B7-DC, etc.

Los mAbs pueden producirse utilizando tecnología convencional de hibridomas, tales como los procedimientos introducidos por Kohler y Milstein (Nature, 256, 495-97 (1975)), y modificaciones de los mismos (véanse las referencias anteriores). Un animal, preferiblemente un ratón, se ceba por inmunización con un inmunógeno como anteriormente para provocar la respuesta deseada de anticuerpos en el animal cebado.

Los linfocitos B de los ganglios linfáticos, de bazos o de sangre periférica de un animal cebado, se fusionan con células de mieloma, generalmente en presencia de un agente promotor de fusión tal como polietilenglicol (PEG). Cualquiera de cierto número de líneas de células de mieloma murinas están disponibles para dicho uso: las líneas de mieloma P3-NS1/1-Ag4-1, P3-x63-k0Ag8.653, Sp2/0-Ag14, o HL1-653 (disponibles de la ATCC, Rockville, MD). Pasos subsiguientes incluyen crecimiento en medio selectivo de tal modo que las células de mieloma parentales no fusionadas y las células de linfocitos donantes mueren finalmente en tanto que sólo sobreviven las células de hibridoma. Éstas se clonan y se cultivan y sus sobrenadantes se criban respecto a la presencia de anticuerpo de la especificidad deseada, v.g. por técnicas de inmunoensayo utilizando la proteína de fusión B7-DC-Ig. Los clones positivos se subclonan, v.g., por dilución limitante, y se aíslan los mAbs.

Los hibridomas producidos de acuerdo con estos métodos pueden propagarse in vitro o in vivo (en fluido de ascitis) utilizando métodos conocidos en la técnica (véanse generalmente Fink et al., Prog. Clin. Pathol., 9: 121-33 (1984)). Generalmente, la línea de células individual se propaga en cultivo, y el medio de cultivo que contiene altas concentraciones de un mAb individual puede recogerse por decantación, filtración, o centrifugación. El anticuerpo puede producirse como un anticuerpo monocatenario o scFv en lugar de la estructura multímera normal. Los anticuerpos monocatenarios incluyen las regiones hipervariables de una Ig de interés y recrean el sitio de fijación de antígeno de la Ig nativa mientras que se trata de unja fracción del tamaño de la Ig intacta (Skerra, A. et al. (1988) Science, 240: 1038-1041; Pluckthun, A. et al. (1989) Methods Enzymol. 178: 497-515; Winter, G. et al. (1991) Nature, 349: 293-299); Bird et al., (1988) Science 242:423; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Science EE.UU. 85:5879; Jost CR et al., J Biol. Chem. 1994, 269:26267-26273; Patentes EE.UU. No. 4.704.692, 4.853.871, 4.946.778, 5.260.203, 5.455.0Kn (sic) en contacto con la solución que contiene una cantidad desconocida de anticuerpo marcado (que funciona como una "molécula informadora"). Después de un segundo periodo de incubación para permitir que el anticuerpo marcado se compleje con el antígeno fijado al soporte sólido a través del anticuerpo sin marcar, el soporte sólido se lava una segunda vez para eliminar el anticuerpo marcado que no ha reaccionado. Este tipo de ensayo sándwich directo puede ser un ensayo simple "sí/no" para determinar si el antígeno está presente, o puede hacerse cuantitativo por comparación de la me-
dida del anticuerpo marcado con la obtenida para una muestra estándar que contiene cantidades conocidas de antígeno.

En otro tipo de ensayo "sándwich", se utilizan los denominados ensayos "simultáneo" y "inverso". Un ensayo simultáneo implica un solo paso de incubación dado que el anticuerpo fijado al soporte sólido y el anticuerpo marcado se añaden ambos a la muestra que se somete a test al mismo tiempo. Una vez que se ha completado la incubación, el soporte sólido se lava para eliminar el residuo de muestra fluida y el anticuerpo marcado sin complejar. La presencia de anticuerpo marcado asociado con el soporte sólido se determina luego como se haría en un ensayo convencional sándwich "directo".

En el ensayo "inverso", se utiliza la adición progresiva primeramente de una solución del anticuerpo marcado a la muestra fluida seguida por la adición de anticuerpo sin marcar fijado a un soporte sólido después de un periodo de incubación adecuado. Después de una segunda incubación, la fase sólida se lava de manera convencional para liberarla del residuo de la muestra que se somete a test, y la solución de anticuerpo marcado sin reaccionar. La determinación del anticuerpo marcado asociado con un soporte sólido se realiza luego como en los ensayos "simultáneo" y "directo".

Los anticuerpos que anteceden son útiles en un método de inhibición de la estimulación de las células T y el tratamiento de enfermedades asociadas con la activación indeseable de las células T, tales como rechazo de trasplantes y autoinmunidad. Este método implica la administración a un individuo que se encuentra en necesidad de dicho tratamiento de una cantidad eficaz de un anticuerpo, preferiblemente un mAb, más preferiblemente un mAb humano o humanizado para un epítope coestimulador de B7-DC. La administración del anticuerpo debe ser eficaz en la estimulación del bloqueo de las células T o en la eliminación de las células T reactivas con el antígeno, inhibiendo con ello la respuesta direccionada de las células T. Los intervalos de dosificación relevantes se describen a continuación.

Usos de ácidos nucleicos que codifican la proteína B7-DC

Los ácidos nucleicos de esta invención se utilizan diagnósticamente para monitorizar el progreso de una enfermedad, por medida de la expresión de B7-DC en células de muestras biológicas o para ensayar el efecto de un agente sobre la expresión de B7-DC. Esto se realiza preferiblemente por medida de los niveles celulares de mRNA. Para uso en tales métodos de diagnóstico, la secuencia de ácido nucleico se marca de manera detectable, v.g., con una etiqueta radiactiva o fluorescente o biotina, y se utiliza en una transferencia de puntos convencional o procedimiento de hibridación Northern para sondar las moléculas de mRNA presentes en, por ejemplo, una preparación, de RNA total o poli(A+) de una muestra biológica.

Composiciones terapéuticas y su administración

El polipéptido B7-DC o una células que expresa este polipéptido tal como una célula DC o célula tumoral se administra a un individuo mamífero, preferiblemente un humano. Se utilizan formas asociadas a las células, inmovilizadas o agregadas de cualquier otro modo del polipéptido para intensificar la reactividad de los linfocitos T y la inmunidad resultante. La proteína de fusión B7-DC-Ig se ensambla como un dímero y, como se muestra en los ejemplos, co-estimula las células T. Formas solubles monómeras del polipéptido B7-DC pueden fijarse al receptor en las células T sin estimular actividad y por consiguiente pueden considerarse como inhibidores o antagonistas de la co-estimulación de las células T competitivos por una forma estimuladora de la molécula. La fijación de un antagonista B7-DC de este tipo puede suprimir la reactividad progresiva de las células T o puede interferir con el efecto de una señal estimuladora presentada por B7-DC endógena o incluso por otros miembros de la familia B7 que actúan a través de sus receptores (v.g., CD28 o CTLA-4).

Una composición que tiene la actividad de B7-DC como se describe en esta memoria se administra en un vehículo farmacéuticamente aceptable en una cantidad biológicamente eficaz o terapéuticamente eficaz. El polipéptido B7-DC (o la célula que expresa el polipéptido) puede administrarse solo o en combinación con otra proteína o péptido tal como uno (una) que tenga la actividad de otro miembro de la familia B7 u otra molécula inmunoestimuladora. El tratamiento puede incluir administración de un adyuvante, usado en su sentido más amplio para incluir cualquier compuesto inespecífico inmunitariamente estimulante tal como un interferón. Los adyuvantes contemplados en esta memoria incluyen resorcinoles, agentes tensioactivos no iónicos tales como polioxietileno-oleil-éter y n-hexadecil-polietileno-éter.

Las dosis y cantidades siguientes se refieren también a los anticuerpos de la invención cuando se administran a un individuo.

Una cantidad terapéuticamente eficaz es una dosis que, cuando se administra durante un periodo eficaz, alcanza el efecto inmunitario o clínico deseado.

Una cantidad terapéuticamente activa de un polipéptido que tiene actividad de B7-DC (o un anticuerpo anti-B7-DC) puede variar de acuerdo con factores tales como el estado de enfermedad, la edad, el sexo, y el peso del individuo, así como la capacidad del péptido para provocar una respuesta deseada en el individuo. Los regímenes de dosificación pueden ajustarse para proporcionar la respuesta terapéutica óptima. Por ejemplo, pueden administrarse diariamente varias dosis divididas o la dosis puede reducirse proporcionalmente según venga indicado por las exigencias de la situación terapéutica. Una cantidad terapéuticamente eficaz de la proteína, en forma asociada a células puede establecerse en términos de equivalentes de proteína o de células.

Así, una cantidad eficaz está comprendida entre aproximadamente 1 ng y aproximadamente 1 gramo por kilogramo de peso corporal del receptor, de modo más preferible entre aproximadamente 1 \mug y 100 mg/kg, más preferiblemente entre aproximadamente 100 \mug y aproximadamente 100 mg/kg. Las formas de dosificación adecuadas para administración interna contienen preferiblemente (para el último intervalo de dosis) desde aproximadamente 0,1 mg a 500 mg de ingrediente activo por unidad. El ingrediente activo puede variar desde 0,5 a 95% en peso, basado en el peso total de la composición. Alternativamente, una dosis eficaz de células que expresan B7-DC, tales como preferiblemente células transducidas tales como DC's o células tumorales desactivadas, está comprendida entre aproximadamente 10^{4} y 10^{9} células, de modo más preferible entre aproximadamente 10^{6} y 10^{8} células por individuo, preferiblemente en dosis divididas. Los expertos en la técnica de la inmunoterapia podrán ajustar estas dosis sin experimentación
excesiva.

El compuesto activo (v.g., el polipéptido B7-DC o las células transducidas con DNA de B7-DC) puede administrarse de manera conveniente, v.g. por inyección por una vía cómoda y eficaz. Vías preferidas incluyen las vías subcutánea, intradérmica, intravenosa e intramuscular. Otras vías posibles incluyen administración oral, intratecal, inhalación, aplicación transdérmica, o administración rectal. Para el tratamiento de tumores que no se han resecado por completo, se contempla también la inyección intratumoral directa.

Dependiendo de la ruta de administración, el compuesto activo puede estar recubierto con un material para proteger el compuesto de la acción de enzimas, ácidos y otras condiciones naturales que pueden desactivar el compuesto. Así, para administrar un polipéptido o péptido que tiene actividad de B7-DC por una ruta enteral, puede ser necesario recubrir la composición con, o coadministrar la composición con un material para prevenir su desactivación. Por ejemplo, puede administrarse un péptido a un individuo en un vehículo, diluyente o adyuvante apropiado, coadministrarse con inhibidores enzimáticos (v.g., inhibidor de la tripsina pancreática, fluorofosfato de diisopropilo (DEP) y trasilol) o en un vehículo apropiado tal como liposomas (con inclusión de emulsiones de agua en aceite en agua así como liposomas convencionales (Strejan et al., (1984) J. Neuroinmunol 7:27).

Como se utiliza en esta memoria, "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera y la totalidad de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y de retardo de la absorción, y análogos. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es bien conocido en la técnica. Excepto en lo que respecta a cualquier medio o agente convencional que sea incompatible con el compuesto activo, se contempla el uso de los mismos en las composiciones terapéuticas. Compuestos activos suplementarios pueden incorporarse también en las composiciones.

Diluyentes preferidos farmacéuticamente aceptables incluyen solución salina y soluciones tampón acuosas. Composiciones farmacéuticas adecuadas para inyección incluyen soluciones acuosas estériles (en el caso de ser solubles en agua) o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones estériles inyectables. Agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, cloruro de sodio pueden incluirse en la composición farmacéutica. En todos los casos, la composición debe ser estéril y debe ser fluida. La misma debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y tiene que incluir conservantes que impidan la contaminación con microorganismos tales como bacterias y hongos. Pueden prepararse también dispersiones en glicerol, polietilen-glicoles líquidos y mezclas de los mismos, y en aceites. En condiciones ordinarias de almacenamiento y uso, estas preparaciones pueden contener un conservante para prevenir el crecimiento de microorganismos.

El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, y polietilenglicol líquido, y análogos), y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, por el uso de un recubrimiento tal como lecitina, por el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de las dispersiones y por el uso de agentes tensioactivos.

La prevención de la acción de microorganismos puede conseguirse por diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenes, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal, y análogos.

La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede llevarse a cabo por inclusión en la composición de un agente que retarda la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Las composiciones parenterales se formulan preferiblemente en forma de dosis unitaria para facilidad de administración y uniformidad de dosificación. La forma de dosificación unitaria hace referencia a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para un individuo mamífero; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. La especificación de las formas de dosis unitaria de la invención viene dictada por y depende directamente de (a) las características singulares del compuesto activo y el efecto terapéutico particular a alcanzar, y (b) las limitaciones inherentes en la técnica de la composición de un ingrediente activo de este tipo para el tratamiento de la sensibilidad en los individuos.

Para instilación en el pulmón, se utilizan soluciones aerosolizadas. En las preparaciones de aerosol pulverizables, la proteína activa puede encontrarse en combinación con un material vehículo inerte sólido o líquido. Éste puede envasarse también en una botella estrujable o en mezcla con un propelente volátil presurizado, normalmente gaseoso. Las preparaciones de aerosol pueden contener disolventes, tampones, agentes tensioactivos, y antioxidantes además de la proteína de la invención.

Para aplicación tópica, las proteínas de la presente invención pueden incorporarse en vehículos aplicados tópicamente tales como pomadas o ungüentos, que tienen a la vez un efecto calmante sobre la piel así como un medio para administrar el ingrediente activo directamente al área afectada.

El vehículo para el ingrediente activo puede encontrarse en forma pulverizable o no pulverizable. Las formas no pulverizables pueden ser formas semisólidas o sólidas que comprenden un vehículo nativo para aplicación tópica y que tiene una viscosidad dinámica preferiblemente mayor que la del agua. Formulaciones adecuadas incluyen, pero sin carácter limitante, soluciones, suspensiones, emulsiones, cremas, ungüentos, polvos, linimentos, pomadas, y análogas. En caso deseado, éstas pueden esterilizarse o mezclarse con agentes adyuvantes, v.g., conservantes, estabilizadores, agentes humectantes, tampones, o sales para influir en la presión osmótica, y análogos. Ejemplos de vehículos preferidos para preparaciones tópicas no pulverizables incluyen bases de ungüentos, v.g., polietilenglicol-1000 (PEG-1000); cremas convencionales tales como crema HEB; geles; así como petrolatum y análogos.

Otros vehículos farmacéuticamente aceptables para el polipéptido B7-DC de acuerdo con la presente invención son liposomas, composiciones farmacéuticas en las cuales la proteína activa está contenida en forma dispersada o presente de diversas maneras en corpúsculos constituidos por capas acuosas concéntricas adherentes a capas lipídicas. La proteína activa está presente preferiblemente en la capa acuosa y en la capa lipídica, en el interior o en el exterior, o, en cualquier caso, en el sistema no homogéneo conocido generalmente como una suspensión liposómica. La capa hidrófoba, o capa lipídica, comprende por regla general, pero no exclusivamente, fosfolípidos tales como lecitina y esfingomielina, esteroides tales como colesterol, sustancias tensioactivas más o menos iónicas tales como fosfato de dicetilo, estearilamina o ácido fosfatídico, y/u otros materiales de naturaleza hidrófoba.

Modificación de las Células Tumorales para Expresar B7-DC y Moléculas Coestimuladoras Múltiples

Otro aspecto de la invención es una célula, preferiblemente una célula tumoral, modificada para expresar moléculas coestimuladoras múltiples. La expresión temporal de moléculas coestimuladoras en células B activadas es diferente para B7, B7-2 y B7-3. Por ejemplo, B7-2 se expresa inicialmente después de la activación de las células B, en tanto que B7-3 se expresa más tarde. Las diferentes moléculas coestimuladoras pueden servir así para funciones distintas durante el curso de una respuesta inmune. Una respuesta eficaz de las células T puede requerir que la célula T reciba señales coestimuladoras de moléculas coestimuladoras múltiples.

Se describe también una célula tumoral que está modificada genéticamente para expresar más de una molécula coestimuladora. Por ejemplo, una célula tumoral puede estar modificada para expresar B7-DC y una o más de B7, B7-2 y B7-3.

Antes de la modificación, una célula tal como una célula tumoral puede no expresar molécula coestimuladora alguna, o puede expresar ciertas moléculas coestimuladoras pero no otras. Como se describe en esta memoria, las células tumorales pueden modificarse por transfección con ácido nucleico que codifica B7-DC sola o con otra u otras moléculas coestimuladoras. Por ejemplo, una célula tumoral transfectada con ácido nucleico que codifica B7-DC puede transfectarse ulteriormente con ácido nucleico que codifica B7. La secuencia de moléculas de cDNA que codifican proteínas B7-DC humanas o de ratón son SEQ ID NO: 1 y la porción codificante de SEQ ID NO: 3, respectivamente. Alternativamente, más de un tipo de modificación puede utilizarse. Por ejemplo, una célula tumoral transfectada con un ácido nucleico que codifica B7-DC puede estimularse con un agente que induce la expresión de B7-1, B7-2 o B7-3.

Antígenos asociados con patógenos

Una utilidad principal para la presente invención es el uso de las presentes composiciones en vacunas terapéuticas para el cáncer y para infecciones virales crónicas importantes que causan morbilidad y mortalidad en todo el mundo. Tales vacunas están diseñadas para eliminar células infectadas - esto requiere respuestas de las células T dado que los anticuerpos son ineficaces. Las vacunas de la presente invención incluyen, además del epítope antigénico propiamente dicho:

(a): un vector tal como DNA desnudo, RNA desnudo, RNA autorreplicante, replicones y virus de RNA que incluyen vaccinia, adenovirus, virus adenoasociado (AAV), lentivirus y alfavirus de RNA;

(b): una señal de direccionamiento o procesamiento de antígeno tal como HSP70, calreticulina, el dominio extracelular del ligando Flt-3, el dominio II de la exotoxina ETA de Pseudomonas, proteína de direccionamiento del herpes simplex VP22, y análogos. (Véanse las solicitudes de patente de EE.UU. cedidas al mismo cesionario 09/421.608; 09/501.097; 09/693.450; 60/222.902; 60/222.985; 60/268.575 y Chang, W-F et al., J. Virol. 75:2368-2376 (2001), que se incorporan por la presente como referencia en su totalidad); y

(c): una señal coestimuladora, preferiblemente la proteína B7-DC de la presente invención o una proteína de fusión, fragmento o derivado funcional de la misma (sola o en combinación con otras proteínas coestimuladoras conocidas tales como B7.1, B7.2, CD40 soluble, etc).

Células tumorales u otros tipos de células hospedadoras, con inclusión de APCs, se transforman, transfectan o transducen de otro modo con un ácido nucleico que codifica un antígeno para el cual se desea una respuesta inmune. Tales antígenos son preferiblemente epítopes de microorganismos patógenos contra los cuales el hospedador se defiende por respuestas de células T efectoras, con inclusión de linfocitos T citotóxicos (CTL) e hipersensibilidad de tipo retardado. Éstas incluyen típicamente virus, parásitos intracelulares tales como malaria, y bacterias que crecen intracelularmente tales como micobacterias y listeria. Así, los tipos de antígenos incluidos en las composiciones de vacuna de esta invención son cualquiera de los asociados con tales patógenos (además, por supuesto, de los antígenos específicos de tumores). Es digno de mención que algunos antígenos virales son también antígenos tumorales en el caso en que el virus es un factor causante de cáncer.

De hecho, los dos cánceres más comunes mundialmente, el hepatoma y el cáncer cervical, están asociados con infección viral. El virus de la hepatitis B (HBV) (Beasley, R.B. et al., Lancet 2, 1129-1133 (1981) ha sido implicado como agente etiológico de los hepatomas. El 80-90% de los cánceres cervicales expresan los antígenos E6 y E7 de uno de cuatro tipos de papilomavirus humano de "alto riesgo": HPV-16, HPV-18, HPV-31 y HPV-45 (Gissmann, L. et al., Ciba Found Symp 120, 190-207 (1986); Beaudenon, S. et al., Nature 321, 246-249 (1986). Los antígenos HPV E6 y E7 son las dianas más prometedoras para cánceres asociados a virus en individuos inmunocompetentes debido a su expresión ubicua en el cáncer cervical. Además de su importancia como dianas para vacunas terapéuticas contra el cáncer, los antígenos tumorales asociados a virus son también candidatos ideales para vacunas profilácticas. De hecho, la introducción de vacunas profilácticas de HBV en Asia ha disminuido la incidencia del hepatoma (Chang, M.H., et al., New Engl. J. Med. 336, 1855-1859 (1997), representando un gran impacto en la prevención del cáncer.

Entre los virus más importantes en las infecciones virales humanas crónicas se encuentran el papilomavirus humano (HPV), el virus de la hepatitis B (HBV), el virus de la hepatitis C (HCV), el virus de la inmunodeficiencia humana (HIV), el virus Epstein Barr (EBV) y el virus del herpes simplex (HSV).

Además de su aplicabilidad al cáncer y enfermedades infecciosas humanas, la presente invención tiene por objeto también el uso en el tratamiento de enfermedades animales en el contexto de la medicina veterinaria. Así, los métodos descritos en esta memoria pueden ser aplicados fácilmente por un experto en la técnica al tratamiento de infecciones veterinarias por herpesvirus que incluyen herpesvirus equinos, herpesvirus bovinos, el virus de la enfermedad de Marek en las gallinas y otras aves de corral; enfermedades retrovirales animales; pseudorrabia y rabia, y análogas.

Las referencias que siguen exponen principios e información actual en el campo de la virología básica, médica y veterinaria: Fields Virology, Fields, BN et al., compiladores, Lippincott Williams & Wilkins, NY, 1996; Principies of Virology: Molecular Biology, Pathogenesis, and Control, Flint, S.J. et al., compiladores, Amer Society for Microbiology, Washington, 1999; Principies and Practice of Clinical Virology, 4ª edición, Zuckerman. A.J. et al., compiladores, John Wiley & Sons, NY, 1999; The Hepatitis C Viruses, by Hagedorn, CH et al., compiladores, Springer Verlag, 1999; Hepatitis B Virus: Molecular Mechanisms in Disease and Novel Strategies for Therapy, Koshy, R. et al., compiladores, World Scientific Pub Co, 1998; Veterinary Virology, Murphy, P.A. et al., compiladores, Academic Press, NY, 1999; Avian Viruses: Function and Control, Ritchie, B.W., Iowa State University Press, Ames , 2000; Virus Taxonomy: Classification and Nomenclatura of Viruses: Seventh Report of the International Cornmittee on Taxonomy of Viruses, by M. H. V. Van Regenmortel, MHV et al., compiladores, Academic Press; NY, 2000.

Moléculas de Direccionamiento

Cierto número de proteínas que tienen modos de acción variables han sido implicadas como moléculas "de direccionamiento" para ser utilizadas en asociación con antígenos, preferiblemente como polipéptidos de fusión, a fin de direccionar el antígeno a las células y compartimientos subcelulares que promueven la presentación del antígeno a las células T de una manera más potente y eficaz.

El enlace de antígenos a las proteínas del choque térmico (HSPs) representa un método potencial para aumentar la potencia de las vacunas basadas en ácido nucleico (y otras). Las HSPs parecen actuar como adyuvantes biológicos naturales en la vacunación contra el cáncer viral. Tanto la HSP gp96 residente en el retículo endoplasmático (ER) como la HSP70 citosólica actúan como adyuvantes inmunitarios (Srivastava, PK et al., Semin. Immunol. 3, 57-64 (1991); Udono, H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 3077-3081 (1994)). Estas HSPs, o chaperoninas, se unen a una amplia serie de péptidos (Lammert, E., et al., Eur. J. Immunol. 27, 923-927 (1997)). HSP70 es una chaperonina que puede direccionar proteínas asociadas al proteosoma - el complejo de proteasas celular primario que genera péptidos para asociación con moléculas del MHC clase I. Por esta razón, los antígenos unidos directamente a HSP70 son presentados más eficazmente por el MHC clase I (conduciendo, entre otras cosas, a las respuestas CTL). Dos características parecen ser responsables del poder adyuvante de las HSP: (1) in vitro, gp96 cargada con péptido introduce eficazmente antígenos en el camino de procesamiento del MHC clase I; (2) la fijación de gp96 a los macrófagos induce secreción de citoquinas proinflamatorias, aumentado así la función de las células para las cuales se ha direccionado el antígeno peptídico.

La inmunización con complejos de HSP aislados de un tumor o de células infectadas por virus induce inmunidad antitumoral (Srivastava, PK et al., Int J Cancer. 33: 417-22, 1984; Srivastava, PK et al, Proc Natl Acad Sci EE.UU.. 83: 3407-11, 1986; Udono, H et al., J Immunol. .152: 5398-5403, 1994; Blachere, NE et al., J Immunother. 14: 352-6, 1993; Udono, H et al., supra; Tamura, Y et al, Science. 278: 117-20, 1997; Janetzki, S et al., J Immunother. 21: 269-76, 1998)) o inmunidad antiviral potente (Heikema, A et al., Irnmunol Lett. 57: 69-74, 1997; Suto, R et al., Science. 269: 1585-8, 1995). La mezcla de péptidos con HSPs in vitro generaba complejos inmunógenos HSP-péptido (Ciupitu, AM et al., J.Exp Med. 187: 685-91, 1998; Blachere, NE et al., J.Exp Med. 86: 1315-22, 1997). Algunas vacunas proteínicas basadas en HSP implicaban fusión del antígeno a la HSP (Suzue, K et al., J Immunol. 156: 873-9, 1996; Suzue, K. et al., Proc Natl Acad Sci EE.UU. 94: 13146-51, 1997). Más recientemente, los presentes inventores y sus colegas (v.g., Chen, C-H et al., Canc. Res. 60:1035-1042 (2000)) utilizaron HSPs en la forma de vacunas quiméricas de replicones de DNA o RNA. Los inventores utilizaron HPV-16 E7 como antígeno fusionado a Mycobacterium tuberculosis HSP70 y demostraron expansión y activación incrementadas de las células T CD8+ específicas para E7, lo que daba como resultado una inmunidad antitumoral potente contra tumores establecidos (Lin, K.-Y. et al., Cancer Res. 56: 21-26, 1996).

Otra molécula de direccionamiento útil es el dominio de translocación de una exotoxina A de Pseudomonas (ETA), v.g. el dominio II (dII) de ETA (los residuos que abarcaban 253-364). Un dominio de translocación es un polipéptido que induce translocación de la proteína o polipéptido con el cual está enlazado en el citosol de una célula. Por ejemplo, polipéptidos aplicables análogamente se derivan de una toxina de Diphtheria, Clostridia (botulinum, tetani), Ántrax, Yersinia, Vibrio cholerae, o Bordetella pertussis. El dominio tóxico del DNA codificante de la toxina se muta o se selecciona preferiblemente en la preparación de tales composiciones.

La calreticulina (CRT) es una proteína abundante de 46 kDa localizada en el lumen del retículo endoplasmático (ER) que exhibe actividad de lectina y se sabe que está implicada en el plegamiento y ensamblaje de glicoproteínas nacientes (Nash (1994) Mol. Cell. Biochem. 135: 71-78; Hebert (1997) J.Cell Biol 139:613-623; Vassilakos 0998) Biochemistry 37:3480-3490; Spiro (1996) J. Biol. Chem. 271:11588-11594. CRT se asocia con péptidos transportados al ER por transportadores asociados con el procesamiento de antígenos, tales como TAP-1 y TAP-2 (Spee (1997) Eur. J. Immunol. 27: 2441-2449). CRT forma complejos in vitro con péptidos. Estos complejos, cuando se administraron a ratones, provocaban respuestas de células T CD8+ específicas de péptidos (Basu (1999) J. Exp. Med. 189: 797-802; Nair (1999) J. Immunol. 162: 6426-6432). Las CRT purificadas de tumores de ratón provocaban inmunidad específica para el tumor utilizado como la fuente de CRT, pero no para un tumor antigénicamente distinto (Basu, supra). Sometiendo a pulsos de DCs in vitro con una CRT unida a un péptido, el péptido se presentaba nuevamente en el contexto de las moléculas de DC clase I y estimulaba las CTLs específicas de péptidos (Nair, supra).

El ligando Flt-3 estimula el crecimiento de los precursores de DC y puede promover la generación de grandes números de DCs in vivo (Maraskovsky, E. et al., J. Exp. Med. 184: 1953-62, 1996; Shurin MR. et al., Cell Immunol. 179: 174-84, 1997). Flt-3, un receptor de tirosina-quinasa murino (Rosnet, O. et al., Oncogene 6: 1641-50, 1991) es un miembro de la familia de quinasas receptoras III (para revisión véase Lyman, SD, Curr. Opin Hematol. 5: 192-6 (1998). En los tejidos hematopoyéticos, la expresión de Flt3 está restringida a los progenitores CD34-positivos. Se utilizó Flt3 para identificar y clonar subsiguientemente el ligando correspondiente, ligando Flt3 (Lyman, SD. et all., Cell 75: 1157-67, 1993; Hannum, C. et al., Nature 368, 643-8, 1994). La forma predominante del ligando Flt3 se sintetiza como una proteína transmembranal a partir de la cual se genera el ECD soluble funcionalmente similar por escisión proteolítica (Lyman et al., supra). Estas proteínas se fijan a y activan receptores de tirosina-quinasas singulares. Entre las células hematopoyéticas, la expresión del receptor Flt3 está restringida fundamentalmente a las células progenitoras más primitivas, con inclusión de los precursores DC. El ECD del ligando Flt3 generaba efectos anti-tumorales potentes contra varios tumores modelo murinos con inclusión de fibrosarcoma, cáncer de mama, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, melanoma y linfoma (Lynch DH et al., Nat. Med. 3: 625-631, 1997; Chen, K et al, Cancer Res. 57: 3511-3516, 1997; Braun, SE et al., Hum Gene Ther. 10: 2141-2151, 1999; Peron, JM et al., J Immunol. 161: 6164-6170, 1998; Chakravarty, PK et al, Cancer Res. 59: 6028-6032, 1999; Esche, C et al., Cancer Res. 58: 380-383, 1998.) (19). Los colegas de los presentes inventores enlazaron DNA que codificaba la proteína HPV Ek7 a DNA que codificaba el ECD del ligando Flt3. La inmunización con esta construcción aumentaba espectacularmente la expansión y activación de las células T CD8^{+} específicas del antígeno E7, dando como resultado una inmunidad antitumoral potente contra los tumores metastásicos establecidos que expresaban E7.

La proteína VP22 del HSV-1 es una proteína prototipo que contribuye, entre otras cosas, a una expansión aumentada del antígeno debida a su notable propiedad de transporte intercelular (Elliott G., y P. O'Hare, 1997, Cell 88: 223-33) puede utilizarse (sic). Por ejemplo, VP22 enlazada a P53 (Phelan, A. et al., 1998, Natl Biotechnol 16: 440-443) o timidina-quinasa (Dilber, MS et al., 1999, Gene Ther 6: 12-21), facilitaba la extensión de la proteína enlazada a las células circundantes in vitro y el tratamiento de tumores modelo. VP22 enlazada al antígeno E7 de HPV-16 en el contexto de una vacuna de DNA conducía a un aumento espectacular en el número de precursores de células T CD8^{+} específicas de E7 en ratones vacunados (aproximadamente 50 veces) y convertía una vacuna de DNA menos efectiva en una con potencia significativa contra tumores que expresan E7. Un mutante de VP22 no expansivo fracasaba en la mejora de la potencia de la vacuna. VP22 y las proteínas que pueden tener un modo de acción similar, contribuyen de diversas maneras a una potencia incrementada de las vacunas: (1) facilitan la propagación del antígeno de las células transfectadas a las APCs circundantes, aumentando con ello el número de APCs que presentan antígeno por el camino del MHC clase I; (2) presentan el antígeno más eficientemente en las células transfectadas; (3) realizan el "cebado cruzado", con lo cual la liberación de una proteína de fusión VP22/antígeno conduce a la absorción y el procesamiento por DCs (u otras APCs) para presentación por la vía del camino MHC-I restringido (Huang, AY et al., 1994, Science 264: 961-965).

Los expertos en la técnica conocerán el modo de identificar epítopes apropiados, v.g., epítopes CTL, de las proteínas pertinentes a partir de los patógenos para uso de acuerdo con esta invención.

Suministro de DNA de B7-DC a células y animales

El suministro de DNA, por ejemplo para efectuar lo que se conoce generalmente como "terapia génica" implica la introducción de un DNA "extraño" en una célula y finalmente, en un animal vivo. Varias estrategias generales para terapia génica han sido estudiadas y han sido revisadas extensamente (Yang, N-S., Crit. Rev., Biotechnol. 12:335-356 (1992); Anderson, W.F., Science 256:808-813 (1992); Miller, A.S., Nature 357:455-460 (1992); Crystal, R.G., Amer. J. Med 92 (supl. 6A):44S-52S (1992); Zwiebel, J.A. et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 618:394-404 (1991); McLachlin, J.R. et al., Prog. Nucl. Acid Res. Molec. Biol. 38:91-135 (1990); Kohn, D.B. et al., Cancer Invest. 7:179-192 (1989).

Un método comprende transferencia de ácido nucleico a células primarias en cultivo, seguido por trasplante autólogo de las células transformadas ex vivo al hospedador, sea sistémicamente o en un órgano o tejido particular.

Para la consecución de los objetivos de la presente invención, la terapia con ácido nucleico podría realizarse por transferencia directa de un DNA funcionalmente activo en tejido somático de mamífero u órgano in vivo. La transferencia de DNA puede conseguirse utilizando cierto número de métodos descritos más adelante. Estos sistemas pueden testarse para expresión con éxito in vitro por el uso de un marcador seleccionable (v.g., resistencia a G418) para seleccionar clones transfectados que expresan el DNA, seguido por detección de la presencia del producto de expresión de B7-DC (después de tratamiento con el inductor en el caso de un sistema inducible) utilizando un anticuerpo para el producto en un inmunoensayo apropiado. La eficiencia del procedimiento, con inclusión de la absorción de DNA, integración de plásmido y estabilidad de los plásmidos integrados, puede mejorarse por linealización del DNA plasmídico utilizando métodos conocidos, y co-transfección utilizando DNA de mamífero de peso molecular alto como "vehículo".

Ejemplos de "transferencia génica" con éxito consignados en el artículo incluyen: (a) inyección directa de DNA plasmídico en tejido muscular de ratones, que condujo a la expresión de genes marcadores durante un periodo de tiempo indefinido (Wolff, J.A. et al., Science 247: 1465 (1990); Acsadi, G. et al., The New Biologist 3: 71 (1991)); (b) los vectores retrovirales son eficaces para infección in vivo e in situ de tejidos de vasos sanguíneos; (c) la inyección en la vena portal y la inyección directa de preparaciones retrovirales en el hígado producían transferencia y expresión génica in vivo (Horzaglou, M. et al., J. Biol. Chem. 265:17285 (1990); Koleko, M. et al., Human Gene Therapy 2:27 (1991); Ferry, N. et al., Proc. Acad, Sci. USA 88:8387 (1991)); (d) la infusión intratraqueal de adenovirus recombinante en tejidos pulmonares era eficaz para transferencia in vivo y expresión prolongada de genes extraños en el epitelio respiratorio del pulmón (Rosenfeld, M.A. et al., Science 252: 431 (1991); (e) vectores virales de herpes simplex consiguieron transferencia génica in vivo en tejido cerebral (Ahmad, F. et al., compiladores, Miami Short Reports - Advances in Gene Technology: The Molecular Biology of Human Genetic Disease, Vol 1, Boehringer Mannheim Biochemicals, EE.UU., 1991).

La terapia humana mediada por retrovirus utiliza sistemas de retrovirus anfotróficos, deficientes en replicación (Temin, H.M., Human Gene Therapy 1:111 (1990); Temin et al, Patente de EE.UU. 4.980.289; Temin et al., Patente de EE.UU. 4.650.764; Temin et al, Patente de EE.UU. No. 5.124.263; Wills, J.W. Patente de EE.UU. 5.175.099; Miller, A.D., Patente de EE.UU. No. 4.861.719). Tales vectores han sido utilizados para introducir DNA funcional en células o tejidos humanos, por ejemplo, el gen de adenosina-desaminasa en linfocitos, el gen NPT-II y el gen para el factor de necrosis tumoral en los linfocitos infiltrantes de tumores. El suministro de genes mediados por retrovirus requiere generalmente la proliferación de dianas celulares para transferencia génica (Miller, D.G. et al., Mol. Cell. Biol. 10: 4239 (1990). Esta condición es satisfecha por algunas de las células diana preferidas en las cuales deben introducirse las presentes moléculas de DNA, es decir, células de tumores que crecen activamente. La terapia génica de la fibrosis quística utilizando transfección por plásmidos con utilización de cualquiera de cierto número de métodos y por vectores retrovirales ha sido descrita por Collins et al., Patente de EE.UU. 5.240.846.

Las moléculas de DNA que codifican las secuencias de B7-DC pueden empaquetarse en vectores de retrovirus utilizando líneas de células de empaquetamiento que producen retrovirus eficientes en replicación, como es bien conocido en la técnica (véase, por ejemplo Cone, R.D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6349-6353 (1984); Mann, R.F. et al., Cell 33:153-159 (1983); Miller, A.D. et al., Molec. Cell. Biol. 5:431-437 (1985); Sorge, J., et al., Molec. Cell. Biol. 4:1730-1737 (1984); Hock, R.A. et al., Nature 320:257 (1986); Miller, A.D. et al., Molec. Cell. Biol. 6:2895-2902 (1986). Nuevas líneas de células de empaquetamiento que son eficientes y seguras para transferencia génica han sido también descritas (Bank et al., documento EE.UU. 5278056).

Este método puede utilizarse con especificidad de sitio para suministrar el vector retroviral al tejido u órgano de elección. Así, por ejemplo, puede utilizarse un sistema de suministro mediante catéter (Nabel, EG et al., Science 244: 1342 (1989)). Tales vectores, que utilizan un vector retroviral o un vector de liposoma, son particularmente útiles para suministrar el ácido nucleico a expresar a una pared de vaso sanguíneo, o al interior de la circulación sanguínea de un tumor.

Pueden utilizarse también otros vectores virales, que incluyen adenovirus recombinantes (Horowitz, M.S., en: Virology, Fields, BN et al., compiladores, Raven Press, Nueva York, 1990, p. 1679; Berkner, K.L., Biotechniques 6:616 9191988), Strauss, S.E., en: The Adenoviruses, Ginsberg, HS, compilador, Plenum Press, Nueva York, 1984, capítulo 11), virus del herpes simplex (HSV) para suministro y persistencia específicos en las neuronas. Ventajas de los vectores de adenovirus para terapia génica humana incluyen el hecho de que la recombinación es rara, no se conocen enfermedades malignas humanas que estén asociadas con tales virus, el genoma del adenovirus es DNA bicatenario que puede manipularse para aceptar genes extraños de hasta 7,5 kb de tamaño, y el adenovirus vivo es un organismo de vacuna humana seguro. El virus adenoasociado es también útil para terapia humana (Samulski, R.J. et al., EMBO J. 10: 3941 (1991) de acuerdo con la presente invención.

Otro vector que puede expresar la molécula de DNA de la presente invención, y es útil en el escenario terapéutico presente, particularmente en humanos, es el virus vaccinia, que puede hacerse no replicante (Patentes de EE.UU. 5.225.336; 6.204.243; 5.155.020; 4.769.330; Sutter G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982) 89: 10847-10851; Fuerst, T. R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1989) 86:2549-2553; Falkner F.G. et al.; Nucl. Acids Res (1987) 15:7192; Chakrabarti, S et al., Molec. Cell. Biol. (1985) 5:3403-3409). Descripciones de virus vaccinia recombinante y otros virus que contienen DNA heterólogo y sus usos en inmunización y terapia con DNA se revisan en: Moss, B., Curr. Opin. Genet Dev. (1993) 3:86-90; Moss, B. Biotechnology (1992) 20: 345-362; Moss, B., Curr Top Microbiol Immunol (1992)158:25-38; Moss, B., Science (1991) 252:1662-1667; Piccini, A et al., Adv. Virus Res. (1988) 34:43-64; Moss, B. et al., Gene Amplif Anal (1983) 3:201-213.

Además de DNA o RNA desnudo, o vectores virales, pueden utilizarse como vectores bacterias modificadas por ingeniería genética. Cierto número de cepas bacterianas que incluyen Salmonella, BCG y Listeria monocytogenes (LM) (Hoiseth & Stocker, Nature 291, 238-239 (1981); Poirier, TP et al. J. Exp. Med 168, 25-32 (1988); (Sadoff, J.C., et al., Science 240, 336-338 (1988); Stover, C.K., et al., Nature 351, 456-460 (1991); Aldovini, A. et al., Nature 351, 479-482 (1991); Schafer, R., et al., J. Immunol. 149, 53-59 (1992); Ikonomidis, G. et al., J. Exp. Med 180, 2209-2218 (1994)). Estos organismos exhiben dos características prometedoras para uso como vectores de vacunas: (1) rutas de infección entéricas, que proporcionan la posibilidad de suministro oral de vacunas; y (2) infección de monocitos/macrófagos direccionando con ello los antígenos a las APCs profesionales.

Además de la transferencia génica mediada por virus in vivo, pueden utilizarse medios físicos bien conocidos en la técnica para transferencia directa de DNA, que incluyen la administración de DNA plasmídico (Wolf et al., 1990 supra) y la transferencia génica mediada por bombardeo con partículas (Yang, N.-S., et al., Proc. Natl Acad Sci. USA 87:9568 (1990); Williams, R.S. et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 88:2726 (1991); Zelenin, A.V, el al., FEBS Lett. 280:94 (1991); Zelenin, A.V. et al, FEBS Lett. 244:65 (1989); Johnston, S.A. et al., In Vitro Cell. Dev. Biol. 27:11 (1991)). Adicionalmente, la electroporación, un medio bien conocido para transferir genes a células in vitro puede utilizarse para transferir moléculas de DNA de acuerdo con la presente invención a los tejidos in vivo (Titomirov, A.V. et al., Biochim. Biophys. Acta 1088: 131 (1991)).

Se ha descrito también la "transferencia génica mediada por vehículo" (Wu, C.H. et al., J Biol. Chem. 264:16985 (1989); Wu, G.Y. et al., J. Biol. Chem. 263:14621 (1988); Soriano, P. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:7128 (1983); Wang, C-Y. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7851 (1982); Wilson, J.M. et al, J. Biol Chem. 267:963 (1992)). Vehículos preferidos son liposomas direccionados (Nicolau, C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 1068 (1983); Soriano et al., supra) tales como inmunoliposomas, que pueden incorporar mAbs acilados en la bicapa lipídica (Wang et al., supra). Pueden utilizarse policationes tales como asialoglicoproteína/polilisina (Wu et al., 1989, supra), donde el conjugado incluye una molécula que reconoce el tejido diana (v.g., asialoorosomucoide en el caso del hígado) y un compuesto de fijación de DNA para fijar al DNA a transfectar. La polilisina es un ejemplo de una molécula de fijación de DNA que fija DNA sin deteriorarlo. Este conjugado se compleja luego con DNA plasmídico de acuerdo con la presente invención para transferencia.

El DNA plasmídico utilizado para transfección o microinyección puede prepararse utilizando métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo utilizando el procedimiento de Qiagen (Qiagen), seguido por purificación del DNA utilizando métodos conocidos, tales como los métodos ilustrados en esta memoria.

Una vez más, como se ha indicado arriba, para la utilidad de las moléculas transducidas B7-DC de acuerdo con esta invención puede no requerir expresión estable. En lugar de ello, la expresión transitoria del polipéptido puede ser suficiente para que las células transducidas realicen su función inmunógena y/ coestimuladora.

Una vez descrita en líneas generales la invención, la misma se comprenderá más fácilmente por referencia a los ejemplos que siguen, lo cual se proporcionan a modo de ilustración, y debe entenderse que no limitan la presente invención, a no ser que se especifique.

Ejemplo I Materiales y Métodos Preparación y Cultivo de Células

Se adquirieron de NCI ratones BALB/c hembra de 6 a 12 semanas y se utilizaron para preparación de DC y macrófagos.

Se cultivaron DCs derivadas de médula ósea en medio RPMI1640 (Gibco BRL), complementado con 5% de suero de ternero fetal (FCS) (Hyclone), penicilina/estreptomicina (JRH Biosciences), gentamicina (Sigma), aminoácidos no esenciales (JRH Biosciences), L-glutamato (JRH Biosciences), piruvato de sodio (Sigma), 2-mercaptoetanol (Sigma) y 1000 unidades/ml de GM-CSF murino recombinante (Immunex) como se ha descrito previamente (26). El día 8, las DCs derivadas de médula ósea se tiñeron con anticuerpos monoclonales por métodos convencionales. El anticuerpo monoclonal contra MHC clase II, 14-4-4s, se purificó a partir de sobrenadante de hibridoma. El Dr. William Baldwin, Universidad Johns Hopkins, suministró amablemente la molécula de fusión CTLA4-Ig. Los anticuerpos para MHC clase I (28-14-8), F4/80 (C1.A3-1), B7.1 (1G10), B7.2 (GL1), FcyRII/III (2.4G2) y Mac-1 (M1/70) se adquirieron de PharMingen. Para la preparación del cDNA de test, se purificaron las células el día 8 por medio del seleccionador de células utilizando 14-4-4s y CTLA4-Ig en el Centro de Oncología de la Universidad Johns Hopkins. La pureza de la población de MHC clase II^{hi} y B7^{hi} después de la selección era 93-98%.

Se cultivaron macrófagos derivados de médula ósea con medio RPMI-1640 complementado con 10% FCS, penicilina/estreptomicina, aminoácidos no esenciales, piruvato de sodio, L-glutamina, 2-mercaptoetanol y 250 unidades/ml de M-CSF murinos recombinantes, y se trataron con 500 unidades/ml de \gamma-IFN (PharMingen) y 5 \mug/ml de LPS (Sigma) como se ha descrito previamente (27). Después de la estimulación, se confirmó la expresión en la superficie celular de MHC clase II y B7 utilizando análisis por citometría de flujo el día 10 de cultivo.

Las líneas de células macrófagos WEHI-3, RAW264.7, J774.A.1, PU5-1.8 fueron proporcionadas amablemente por el Dr. Joshua Farber de los NIAID, Institutos Nacionales de la Salud. Las mismas se cultivaron con el medio recomendado por la ATCC.

Reacción de los Linfocitos Mixtos Alogénicos

El día 8, DCs derivadas de BM caracterizadas como MHC clase II^{hi} y B7^{hi} se testaron respecto a su capacidad para estimular las células T alogénicas en MLC. Se llevaron a cabo reacciones MLC en microplacas de 96 pocillos con fondo plano por adición de número creciente de células s estimuladoras BALB/c a 3 x 10^{5} linfocitos C57BL/6 alogénicos. Después de 3 días de cultivo, se evaluó la proliferación de células T por adición de 1 \muCi de [^{3}H]-metil-timidina (Amersham) a cada pocillo durante las 18 h finales de cultivo. Las células se cosecharon luego, y se determinó la incorporación de radiactividad utilizando un contador \beta (Packard 96).

Hibridación Sustractiva de cDNA

El RNA total de DCs seleccionadas y macrófagos activados se extrajo con TRIZOL (Gibco BRL). El RNA mensajero se purificó con el kit de purificación de mRNA Oligotex (Qiagen). Los inventores utilizaron el sistema de síntesis de cDNA SMART basado en PCR (Clonetech) para amplificar el cDNA, seguido por el sistema de sustracción PCR Select basado en PCR (Clonetech). La sustracción se llevó a cabo siguiendo el protocolo del fabricante. Después de la PCR sustractiva final, los fragmentos de DNA se ligaron en vectores plasmídicos pCR2.1 (Invitrogen) o pCR Blunt (Invitrogen). Después de la transformación, cada clon se dejó crecer para amplificación del DNA plasmídico y DNA Miniprep, y se digirió luego con EcoRI para confirmar la presencia de las inserciones. Se realizó luego una transferencia de puntos de plásmido para confirmar que el cDNA clonado es específico de las células dendríticas. Los DNAs Miniprep alcalinas desnaturalizadas se aplicaron en forma de puntos sobre membrana Hybond N+ (Amersham) y se hibridaron con cDNA SMART derivado de una sonda de DCs seleccionadas o macrófagos activados. Estas sondas de cDNA se marcaron con ^{32}P utilizando un método de marcación con iniciadores aleatorios (Stratagene Prime-It II). Las hibridaciones y el lavado se realizaron como ha sido descrito previamente (28). Las membranas se expusieron a una película (Amersham) durante 1-2 días y se revelaron.

Análisis de los Plásmidos por Transferencia de Puntos

Las muestras de DNA Miniprep alcalinas desnaturalizadas se aplicaron en forma de mancha sobre membrana Hybond N+ (Amersham) y se hibridaron con cDNA Smart® derivado de sondas de DCs seleccionadas o macrófagos activados. Estas sondas de cDNA se marcaron con ^{32}P utilizando un método de marcación con iniciadores aleatorios (Stratagene Prime-It II). Las hibridaciones y el lavado se realizaron como se ha descrito previamente [citas ??] (sic). Para autorradiografía, las membranas se expusieron a una película (Amersham) durante 1-2 días y se revelaron.

Construcción y Cribado de Bibliotecas de cDNA- Clonación de B7-DC

Se cosecharon DCs derivadas de médula ósea el día 8 sin seleccionar. Aproximadamente 20% a 40% de estas células expresaban una proporción elevada de MHC clase II y B7. La extracción de RNA total seguida por purificación de poliA RNA se realizó como se ha descrito arriba. Para la construcción de una biblioteca de DC iniciada con oligo dT se utilizó el sistema de síntesis de cDNA Lambda ZAP Express (Stratagene). El fragmento de DNA PCR de B7-DC se sondó y se utilizó para cribado. Se realizaron transferencia de membrana, desnaturalización y renaturalización, utilizando el protocolo de Stratagene. La radiomarcación de sondas, hibridación, lavado, y autorradiografía se realizaron como se ha descrito arriba. Los clones positivos se aislaron y se realizó un segundo cribado. Después del segundo cribado, los plásmidos se escindieron por escisión in vivo y se testaron por transferencia de puntos y secuenciación. La secuenciación fue realizada por la Core Facility en la Escuela de Medicina de la Universidad Johns Hopkins. Se utilizó el programa BLAST para realizar la búsqueda de homología de la secuencia de nucleótidos contra Genbank (NCBI) respecto a semejanza con genes consignados previamente. El clon de cDNA de longitud total B7-DC se extrajo de la biblioteca de cDNA de DC. Se realizó 5' RACE utilizando el kit de amplificación de cDNA SMART RACE (Clontech). Los productos de la 5'-RACE se clonaron en el vector pCR2.1 y se secuenciaron. Se obtuvieron dos clones B7-DC más de longitud total por RT-PCR y se compararon sus secuencias a fin de evitar error de secuenciación.

Se clonó B7-DC humana como sigue: se obtuvieron DCs humanas a partir de células mononucleares de sangre periférica normal por cultivo en GM-CSF + IL-4 o GM-CSF + Flt-3L como se ha descrito previamente (29). Se extrajo el RNA como se ha descrito arriba. Una búsqueda BLAST identificó un clon EST solapante, número de acceso en GenBank AK001879, con homología a B7-DC de ratón. Se realizó 5' RACE como se ha descrito arriba. Los inventores secuenciaron un fragmento PCR 5'-RACE y diseñaron un iniciador correspondiente a 5'-UTR de B7-DC humana. Se utilizaron los iniciadores siguientes en la 5'-UTR y 3'-UTR de B7-DC para amplificar la B7-DC humana de longitud total:

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Las secuencias de cDNA de longitud total de los cDNAs de B7-DC humana y murina han sido depositadas en EMBL/GenBank/DDBS bajo los números de acceso AF329193 y AF142780.

Cribado de la biblioteca BAC (129SVJ)/Clonación y Mapeado Genómicos

El cribado de la biblioteca BAC siguió el protocolo del fabricante (Genome Systems, Inc.). Iniciadores utilizados:

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El cribado de la biblioteca BAC obtuvo 3 clones positivos. El mapeado de la localización cromosómica se realizó por hibridación con fluorescencia in situ (Genome Systems Inc.). Se analizaron un total de 80 células en metafase, exhibiendo 79 de ellas marcación específica. El mapeado de B7-DC humana se realizó por utilización de herramientas bioinformáticas disponibles, el programa BLAST de NCBI y el International RH Mapping Consortium. La secuencia de hB7-DC se investigó en htsg y se encontró que mapeaba para dos clones BAC, RP11-574F11 (AL1621253) y Rp11-635N21 (AL354744) que estaban localizados en el cromosoma 9.

Transferencia Northern Virtual

Se adquirieron de NCI ratones Balb/c hembra de 4-6 semanas de NCI y se utilizaron para preparación de RNA tisular. La extracción de RNA y la síntesis SMART de cDNA para los tejidos, DCs seleccionadas y macrófagos activados se purificaron como se ha descrito arriba. Los cDNAs SMART PCR se modificaron por medio del kit de purificación PCR (Qiagen). Se pasaron 0,5 \mug/pista de DNAs purificados en un gel de agarosa al 1% y se transfirieron a una membrana de nailon Nytran (Schleicher y Schuell). Para preparar las sondas radiactivas, se amplificaron DNAs plasmídicos sustraídos derivados de una biblioteca como moldes. Los inventores amplificaron el DNA por PCR utilizando series de iniciadores inmediatamente adyacentes al sitio de clonación del DNA plasmídico y se utilizó el DNA PCR purificado de cada uno de los clones para sondas de hibridación. Las secuencias de nucleótidos de estos iniciadores son como sigue:

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Se realizó también un análisis Northern virtual de RNA total de DCs humanas y de la placenta de control. Las sondas utilizadas y la preparación de RNA se han descrito arriba. La radiomarcación, hibridación, lavado y autorradiografía de las sondas se realizaron como se ha descrito arriba.

Producción de Ab anti-mP7-DC de Hámster

Se utilizaron transfectantes estables de B7-DC en líneas de células DC2.4, RAW246.7 y RENCA para inmunizar hámsters armenios. La B7-DC se clonó en el vector pCAGGS modificado (30). Los hámsters se reforzaron tres veces con plásmidos que contenían B7-DC (Rockland). El anticuerpo anti-B7-DC utilizado en este estudio procedía de los sueros de uno de los tres hámsters inmunizados.

Ensayo de fijación de CD28-Ig, CTLA4-Ig y PD-1-Ig

Se transfectaron células 293T con B7.1-pCAGGS, B7-DC-pCAGG, PD-1-pCAGGS o vector solo utilizando Lipofectamina 2000 (Gibco BRL). Después de 24 horas, se suspendieron de nuevo las células en tampón FACS (1 x HBSS, 2% suero de ternero, HEPES 10 mM y 0,1% de NaN_{3}) y se centrifugaron a 1000 rpm durante 5 min a 4ºC. El tampón se decantó luego, se añadió anticuerpo a los tubos, se incubó a 4ºC durante 20 min, se lavó dos veces con tampón FACS, y se repitió esto para el anticuerpo secundario. Las muestras se hicieron pasar sobre FACScan. El anticuerpo B7.1 se utilizó en dilución 1:5, 10 \mul/muestra (Cal-Tag). Se utilizaron quimeras recombinantes CD28-Ig, CTLA-4-Ig y PD-1-Ig a 2 \mug/ml, 10 \mul/muestra (R&D Systems, Inc). Se utilizó IgG-PE anti-humana de cabra F(ab')_{2} a dilución 1:20 (Southern Biotechnology Associates, Inc.).

Síntesis de Dímeros B7-DC-Ig

Se fabricó la construcción B7-DC-Ig por fusión de la secuencia que codificaba los aminoácidos N-terminales de B7-DC sin el dominio transmembranal en marco con la secuencia codificante de los aminoácidos C-terminales del Fc de IgG_{1} en el vector pIg-TailPlus (R&D Systems). Se transfectaron transitoriamente células COS-7 con pIg/B7-DC utilizando Lipofectamine 2000 (GIBCO BRL) o GINE JAMMER (Stratagene). La proteína de fusión B7-DC-Ig se purificó de los sobrenadantes exentos de suero utilizando la precipitación con sulfato de amonio saturado. La SDS-PAGE y la tinción con plata demostraron una pureza superior a 90%.

Ensayos de Proliferación de Células T y Citoquinas

Para los ensayos de coestimulación con anti-CD3, se recubrieron previamente placas de 96 pocillos con fondo plano (Immunol 4 de Dinex) con anticuerpos anti-CD3 (2C11, Pharmingen) y se diluyeron B7.1-Ig (R&D Systems), B7-DC-Ig o control Isotipo (Sigma) a 100 ng/ml en 1X PBS (Gibco), pH 7,4, durante 2 horas a 37ºC. Se lavaron luego las placas 3 veces con 1X PBS y se bloquearon con medio RPMI1640 complementado con 10% FCS, penicilina/estreptomicina, aminoácidos no esenciales, piruvato de sodio, L-glutamina y 2-mercaptoetanol durante media hora antes de añadir células T. Se obtuvieron bazos y ganglios linfáticos de ratones BALB/c de 6 a 10 semanas. Se lisaron los RBCs utilizando tampón ACK y las células T se purificaron utilizando Dynabeads M-280 (Dynex), con el método indirecto. Las cuentas se lavaron dos veces con PBS pH 7,4 + 1% FCS antes de añadir las células, y se añadió un cóctel de anticuerpos compuesto de anti-IE^{d} y B220/CD45RO o CD8\alpha (Pharmingen), a las células y se incubaron a 4ºC con mezcladura bidireccional durante 30 minutos. Las células se aislaron poniendo el tubo en un MPC Dynal durante 5 min, se centrifugaron a 1500 rpm durante 5 min y se lavaron dos veces con PBS de pH 7,4 + 1% de FCS para eliminar los Abs no fijados. Se repitió el mismo procedimiento con incubación durante 15 min, y las células se extendieron a 2 x 10^{5} células/pocillo. Después de 72 h de incubación, se añadieron a cada pocillo 10 \mul de ^{3}H-timidina (1 \muCi/pocillo) y se incubaron durante 18 horas. Las células se cosecharon con un Cosechador de Células Packard Micromate, y los filtros se leyeron en un contador beta Packard Matrix 96 Direct.

Para ensayos de coestimulación utilizando el sistema RENCA para representar el antígeno HA, se cultivaron células RENCA con medio RPMI-1640 complementado con 10% de FCS, penicilina/estreptomicina, aminoácidos no esenciales y piruvato de sodio. Se indujo con IFN-\gamma (75 U/ml) durante 72 horas para la expresión del MHC clase II. Se irradiaron luego con 13.200 Rad. y se extendieron en placas a 2 x 10^{4} células/pocillo (placas de 96 pocillos con fondo plano). Se añadió luego el péptido HA 110-120 a 2,5 \mug/pocillo y se añadieron diversas concentraciones de las moléculas de fusión con Ig. Se aislaron células transgénicas I-E^{d} + células T específicas de HA (obsequio amable de H. von Boehmer, Universidad de Harvard) como se ha descrito arriba y se extendieron a razón de 4 x 10^{5} células/pocillo. Después de 48 horas de incubación, se añadieron a cada pocillo 10 \mul de ^{3}H-timidina (1 \muCi/pocillo) y se incubaron durante 18 horas. Las células se cosecharon con un Cosechador de Células Packard Micromate y los filtros se leyeron en un contador beta Packard Matrix 96 Direct.

Para el análisis de la producción de citoquinas por ELISA, se prepararon los cultivos como se ha descrito arriba y se recogieron los sobrenadantes en los momentos indicados. Se determinaron las concentraciones de IL-2, IL-10 e IFN-\gamma utilizando kits ELISA disponibles comercialmente (Endogen), e IL-4 e IL-6 (R&D Systems).

Coestimulación in vivo

LNs axilares, inguinales, cervicales, y mesentéricas agrupadas de la línea de ratones transgénicos TCR 6.5 que expresa un TCR que reconoce un epítope HA I-E^{d} restringido (^{110}SFERFEIFPKE^{120} [SEQ ID NO: 12]) en un fondo genético B10.D2 se disociaron en medio RPMI (GIBCO BRL), se pasaron sobre un filtro de células de nailon de 100 \mum, y se lavaron en tampón Hank's estéril (GIBCO BRL). Después de tinción con FACS® para determinar la proporción de células CD4 clonotípicas, se inyectó una preparación de células que contenía 2,5 x 10^{6} células clonotípicas en 0,2 ml de tampón Hank's estéril por vía intravenosa (i.v.) en la vena del rabo de los ratones receptores B10.D2. Tres días después de esta transferencia adoptiva, se vacunaron los animales por inyección subcutánea (s.c.) en las plantas de las patas posteriores. Cada ratón recibió inyecciones bilaterales de una de tres
preparaciones:

(A) 10 \mug de HA sintético (por pata) (péptido HA (110-120) combinado en una relación 1:1 v/v con Adyuvante de Freund Incompleto (IFA) (Sigma),

(B) la mezcla HA-IFA con 25 \mug de B7-DC-Ig, o

(C) la mezcla HA-IFA con 25 \mug de un anticuerpo de control isotipo. Siete días después, se cosecharon los ganglios LNs drenantes; se incubaron 1,5 x 10^{5} células LN en placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos con fondo redondo con la concentración indicada de péptido HA sintético. Se realizaron ensayos de proliferación sometiendo a pulsos durante 48 h los cultivos con 1 \muCi de [^{3}H]timidina e incubación durante 12 horas adicionales antes de la cosecha y determinación de la cantidad de radiactividad incorporada.

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Ejemplo II Identificación y Caracterización de B7-DC

Se aisló B7-DC de una biblioteca sustraída entre DCs y macrófagos activados. Las dos poblaciones utilizadas para sustracción de cDNA eran DCs cultivadas en GM-CSF derivados de médula ósea como la población "comprobadora" y macrófagos M-CSF derivados de médula ósea adherentes activados con \gamma-interferón + LPS como la población "impulsora". El día 8, se seleccionaron DCs "maduras" del MHC clase II^{hi}B7^{hi} a >93% de pureza como la fuente de cDNA comprobadora. Se caracterizaron las DCs por citometría de flujo, teniendo niveles aproximadamente 50 veces mayores de MHC clase II que los macrófagos. Ambas poblaciones expresaban B7.1 y B7.2, aunque los niveles de B7.2 eran significativamente mayores en las DCs. F4/80 y CD16 se expresaban a niveles mayores en la población de macrófagos. La comparación funcional de las dos poblaciones demostró que la población de DC era aproximadamente 100 veces más potente que la población de macrófagos en la estimulación de una reacción de linfocitos alogénicos mixtos.

Después de la extracción del RNA de ambas poblaciones, se utilizó un sistema de síntesis de cDNA basado en PCR, seguido por el procedimiento de sustracción basado en PCR, PCR Select. U/no de los clones expresados diferencialmente codificaba un nuevo miembro de la familia de supergenes de inmunoglobulina, que fue designado por los inventores como B7-DC. El cDNA de B7-DC murino tiene \sim 1,7 kb de longitud, codificando una proteína precursora de 247 aminoácidos (aa) con un péptido señal N-terminal de 23 aa y un peso molecular predicho de \sim 25 kd (Tabla 1). La secuencia conductora supuesta y el dominio transmembranal se identificaron utilizando el programa SOSUI (31). Se encuentran dos aa cargados dentro del dominio transmembranal de 23 aa de mB7-DC, lo que sugiere una posible pareja de fijación. Al nivel de aa, la B7-DC murina es 70% idéntica a la B7-DC humana, lo que indica que las mismas son ortólogas (véanse las tablas siguientes). La hB7-DC difiere ligeramente de la B7-DC murina en que tiene una cola citoplásmica más larga.

Mediante una búsqueda de homología, se encontró que B7-DC tiene homología significativa con B7-H1 (34% de identidad, 48% de semejanza) (Tabla 2), en menor extensión butirofilina (30% identidad, 45 semejanza), y < 20% identidad con B7.1 y B7.2 (Tabla 3). Los estudios filogenéticos indican que butirofilina está análogamente relacionada con la familia B7 por desordenamiento de exones (32, 33). Cada una de ellas posee la estructura canónica IgV-IgC y un dominio transmembranal. En contraste con los otros miembros de la familia B7, la B7-DC murina tiene una cola citoplásmica extremadamente corta (4 aa).

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TABLA 1 Comparación de la secuencia de aminoácidos de B7-DC murina y B7-DC humana. Los dominios conductor y transmembranal supuestos de mB7-DC están marcados con una línea por encima. La alineación se realizó utilizando la matriz Clustalw-Gonnet Pam250. El [*] indica aminoácidos idénticos y [..] muestra sustituciones conservadoras. Los residuos cisteína que pueden ser importantes en la formación de enlaces disulfuro en los dominios de inmunoglobulina V o C se representan en cursiva

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TABLA 2 Comparación de las secuencias de aminoácidos de mB7-DC y mB7-H1

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TABLA 3 Comparación de la secuencia de aminoácidos de B7-DC con los miembros de la familia B7

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La comparación se realizó utilizando la búsqueda NCBI blast 2 (matriz BLOSUM 62). 1. Aminoácidos idénticos en posiciones correspondientes 2. Aminoácidos similares en posición correspondiente - agrupados como sigue: (A, G); (S, T); (E, D); (R, K, H); (Q, N); (V, I, L, M); (Y, F); (W); (C); (P) 3. No se encontró semejanza significativa alguna utilizando la matriz BLOSUM 62 4. BT = butirofilina 5. = PDL-1

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Para determinar la estructura genómica de mB7-DC, los autores de la presente invención aislaron un clon genómico por cribado de una biblioteca de Cromosomas Artificiales Bacterianos (BAC) agrupados utilizando sondas de las UTRs 5' y 3'. El mapeado de la localización cromosómica se realizó utilizando los clones BAC. La localización de los cromosomas de B7-DC se realizó utilizando hibridación in situ con fluorescencia (FISH). Medidas de 10 cromosomas 19 marcados específicamente demostraron que mB7-DC está localizada en una posición que se encuentra a 47% de la distancia del límite heterocromático-eucromático respecto al telómero del cromosoma 19, un área que corresponde a la interfaz entre las bandas 19C2 y 19C3. Se detectaron señales específicas de hibridación por incubación de los portaobjetos hibridados en anticuerpos antidigoxigenina marcados con fluoresceína seguida por contratinción con DAPI. Este locus corresponde a una región del cromosoma 9 humano, en la que se ha mapeado hB7-H1.

Se encontró que hB7-DC está localizada en dos clones BAC del cromosoma 9. Adicionalmente, se encontró que tanto hB7-DC como hB7-H1 están localizadas en un solo clon BAC del cromosoma 9 con un tamaño de inserción de aproximadamente 164 kb (Figura 1). La proximidad genómica de B7-DC y B7-H1 es una reminiscencia del par B7.1/B7.2, que mapean dentro de una megabase una de otra.

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Ejemplo III B7-DC se expresa selectivamente en células dendríticas

A fin de determinar el patrón de expresión de B7-DC, se realizó un análisis Northern virtual utilizando RNA extraído de tejidos múltiples, líneas de células macrófagos, cultivos de macrófagos y células dendríticas derivadas tanto de médula ósea como de bazo. Si bien se detectó una hibridación fuerte utilizando una sonda B7-DC en DC inmaduras (día 4, 6) y maduros (día 8 y MHC II^{hi}B7^{hi} seleccionados) derivadas de médula ósea y DC esplénicas, no se detectó señal alguna en ninguna de las cuatro líneas de células macrófagos, macrófagos BM activados o macrófagos peritoneales (Figura 2). Se detectó una expresión fuerte de hB7-DC en DCs humanas cultivadas a partir de células mononucleares de sangre periférica con GM-CSF más IL-4 o Flt-3L (Figura 3). A fin de verificar la expresión en la superficie celular de la proteína B7-DC, se utilizaron anticuerpos anti-mB7-DC para teñir DCs. Se observó en DC una tinción bloqueable con B7-DC-Ig soluble (Figura 4).

B7-DC no se fija a CD28 o CTLA-4, pero sí lo hace a PD-1

Aunque B7-DC tiene homología estructural y secuencial con la familia B7, no contiene la secuencia de fijación CD28/CTLA-4 supuesta, SQDXXXELY [SEQ ID NO: 13] o XXXYXXRT [SEQ ID NO: 14] (34) (donde X = cualquier aminoácido). Para evaluar directamente la fijación, se investigó la capacidad de CD28-Ig dímera y CTLA-4-Ig para teñir las células 293T transfectadas con B7-DC o B7.1. Mientras que se observó fijación fuerte con los transfectantes B7.1, no se apreció fijación alguna a los transfectantes B7-DC (Figura 5). Basándose en homología y proximidad genómica entre B7-DC y B7-H1/PDL1, se condujeron experimentos para testar PD-1 como pareja de fijación candidata para B7-DC. De hecho, PD-100IG se fijaba a los transfectantes B7-DC, pero no a los transfectantes B7.1. La fijación de BPD-1-Ig a los transfectantes B7-DC era menor que la fijación de CTL-4-It y CD28-Ig a los transfectantes B7.1, aunque era específica. La confirmación ulterior de la fijación de PD-1 a B7-DC se obtuvo por tinción positiva de transfectantes estables B7-DC-GFP con PD-1-Ig. Se llegó a la conclusión de que, como en el caso de B7-H1 y B7h/B7RP-1, B7-DC no utiliza CD28 o CTLA-4 como receptores. En lugar de ello, PD-1 parece ser un receptor para B7-DC.

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Ejemplo IV B7-DC se Comporta como una Molécula Coestimuladora para las Células T

Se produjo una proteína de fusión soluble B7-DC-Ig que podría añadirse a los ensayos de estimulación de las células T para uso con objeto de testar si B7-DC poseía actividad coestimuladora. La respuesta proliferativa de las células T se midió respecto a la estimulación por cantidades crecientes de anti-CD3 inmovilizados en presencia de B7-DC-Ig, B7.1-Ig o un control isotipo. La Figura 6 (izquierda) muestra que, en presencia de una concentración subóptima de anti-CDE3, B7-DC coestimulaba una respuesta proliferativa de las células T mayor que lo hacía B7.1. Adicionalmente, las respuestas proliferativas coestimuladas por B7-DC eran mayores en las células CD4 que en las CD8 (Figura 6, derecha). B7-DC no conseguía estimular las células T en ausencia de un estímulo enfocado de TCR, lo que indicaba que B7-DC proporcionaba una señal coestimuladora verdadera.

B7-DC coestimulaba también respuestas proliferativas cuando la "señal 1" era proporcionada por un complejo MHC-péptido. Se trataron células RENCA (que no expresan B7.1, B7.2 o B7-DC endógena alguna por análisis RT-PCR) con \gamma-IFN para inducir la expresión de MHC clase II. Estas células se cargaron con el péptido HA110-120 restringido en I-E^{d} (FERFEIFPKE) (35) [SEQ ID NO: 15]. Se añadieron células T esplénicas purificadas de una línea de ratones transgénicos TCR específica I-E^{d} + HA110-120 y se midió la respuesta proliferativa en presencia de B7-DC-Ig, B7.1-Ig o un control isotipo. La Figura 7 muestra que B7-DC poseía mayor actividad coestimuladora que lo hacía B7.1.

Patrones de producción de linfoquinas coestimulada por B7-DC

La respuesta mejor caracterizada de las células T a la coestimulación por las moléculas de la familia B7 es la producción de linfoquinas. Estas linfoquinas son mediadores importantes de los efectos de las células T. Se realizaron estudios para analizar la producción de cierto número de linfoquinas diferentes por células T que se habían estimulado con antígeno anti-DC3 o HA (Figura 8) coestimulado con B7-DC-Ig, B7.1-Ig o un control isotipo. Los patrones de la coestimulación de linfoquinas eran satisfactoriamente concordantes tanto si se utilizaba como "señal 1" anti-CD3 o un complejo MHC-péptido. Resulta significativo que B7-DC coestimulaba niveles mayores de \gamma-IFN que lo hacía B7.1. B7-DC coestimulaba también cantidades significativas de producción de IL-6, en tanto que B7.1 no coestimulaba prácticamente cantidad alguna. Si bien ambas moléculas coestimulaban la producción de IL-2, B7.1 lo hacía más eficientemente que B7-DC. Así pues, los patrones de coestimulación por B7-DC y B7.1 son distintos, siendo B7-DC más eficiente en la coestimulación de linfoquinas proinflamatorias importantes.

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Ejemplo V B7-DC Aumenta las Respuestas Inmunes in Vivo

A fin de determinar si B7-DC posee actividad biológica in vivo, los inventores investigaron si B7-DC-Ig aumentaba las respuestas inmunes a las vacunas peptídicas. B7-DC-Ig o un anticuerpo de control isotipo se añadió al cóctel inmunógeno del péptido HA110-120 e IFA. A fin de permitir la enumeración de las células T CD4 específicas de HA in vivo, se transfirieron 2,5 x 10^{6} células T anti-HA 6.5 a los ratones 3 días antes de la inmunización. Siete días después de la inmunización, se cosecharon células LN drenantes y se estimularon las células in vitro durante 2 días con cantidades variables de péptido HA110-120. La Figura 9 muestra que la adición de B7-DC-Ig aumentaba de hecho espectacularmente la respuesta proliferativa a HA. El número total de células T específicas de HA en las LN drenantes se incrementaba aproximadamente dos veces en los grupos que recibían B7-DC-Ig con relación a los controles de anticuerpos isotipo. Por esta razón, se dedujo que B7-DC tenía capacidad para aumentar las respuestas específicas de antígeno incluso en una base por célula.

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Ejemplo VI Discusión y Conclusiones

Los autores de la presente invención han descubierto y caracterizado un nuevo miembro de la familia B7 con expresión muy restringida a DCs y que tiene propiedades coestimuladoras singulares para las células T. El ortólogo humano de B7-DC se expresa también en DCs.

Este patrón de expresión restringida contrasta con los miembros de la familia B7 descritos previamente, lo que sugiere que B7-DC participa en respuestas inmunes diferentes que los caminos conocidos de B7.1/2. Mientras que se detectaba una señal B7-DC débil por RT-PCR en macrófagos activados, el análisis RT-PCR preliminar en tiempo real indicaba que la expresión de mRNA de B7-DC en DCs era más de 15 veces mayor que en los macrófagos activados. La tinción de anticuerpos detectaba análogamente niveles muy bajos de B7-DC en la superficie de los macrófagos activados. No está claro si esto es suficiente para una activación importante de las células T.

El patrón inusual de la producción de linfoquinas que coestimula B7-DC implica un papel biológico singular comparado con otros miembros de la familia B7. La clasificación tradicional de las citoquinas es como sigue: las citoquinas Th1 incluyen IL-2, \gamma-IFN y linfotoxina; las citoquinas Th2 incluyen IL-4, IL-5, IL-6 e IL-13 (36). B7-DC no induce un perfil de linfoquinas Th1 o Th2 clásico. B7-DC induce muy poco IL-4 y no induce en absoluto IL-10. Sin embargo, IL-6 está considerada como una citoquina Th2. La menor coestimulación de IL-2 y mayor de \gamma-IFN por B7-DC con relación a B7.1 no se ajusta a un patrón clásico Th1. Sin embargo, la elevada producción de \gamma-IFN sugiere que B7-DC suscita una función efectora importante de células T.

B7-DC es notable por su capacidad para coestimular IL-6. La fuerte respuesta proliferativa de células T inducidas por B7-DC se explica en parte por su fuerte coestimulación de la producción de IL-6, que no se observa con B7.1. IL-6 es un amplificador potente de la proliferación de las células T (en asociación con otros estímulos proliferativos) (37,38). IL-6 es una citoquina multifuncional que regula no sólo la función de las células T sino también respuestas proinflamatorias, diferenciación de monocitos, diferenciación de células B, trombopoyesis, resorción ósea, y el crecimiento de ciertos tumores hematopoyéticos (39, 40): IL-6 puede funcionar en concierto con receptores solubles de IL-6 (sIL-6R) en la inducción de quimioquinas y el reclutamiento de leucocitos (41). La misma puede mediar efectos antiapoptóticos potentes por la vía de la activación de Stat-3. Se ha informado que la activación de Stat-3 dependiente de IL-6 en las células T es un camino importante para la supervivencia de las células T activadas (42, 43) aunque otros informes sugieren que Stat-3 ejerce su efecto sobre las células T en reposo.

Mientras que B7-DC no se fija a CD28 o CTLA-4, sí lo hace a PD-1, un receptor para B7-H1/PD-L1 (22, 47, 48). No se ha determinado todavía si la misma se fija a ICOS, un receptor para B7h/B7RP-1 (23-25, 44-46). La marcada homología entre B7-DC y B7-H1/PDL-1 (mayor que la existente entre B7.1 y B7.2), el estrecho enlace físico de hB7-H1/PD-L1 y hB7-DC , y su fijación a un receptor común, sugieren que las mismas están relacionadas por un suceso de duplicación génica relativamente reciente. Esto es análogo a la relación entre B7.1 y B7.2, que mapean ambas hasta dentro de una megabase en el cromosoma 16 del ratón y el cromosoma 3 humano (49).

Será importante discernir los papeles biológicos relativos de B7-DC frente a B7-H1/PD-L1 tal como son mediados por PD-1 y otro u otros receptores supuestos. PD-1 se expresa subsiguientemente a la activación de las células T, y parece inhibir la misma. PD-1 induce apoptosis en condiciones de estimulación de las células T con concentraciones elevadas de anti-CD3. Los ratones con PD-1 silenciado desarrollan un síndrome autoinmune (22) caracterizado por manifestaciones clínicas de cardiomiopatía hipertrófica. En contraste, Dong et al. (21) informaron que B7-H1/PD-L1 coestimulaba la proliferación de las células T y la liberación de citoquinas a menores concentraciones de anti-CD3. Por analogía a la relación de CD28/CTLA-4, PD-L1 puede ser un contrarreceptor para un receptor de activación todavía no identificado. A pesar de compartir la propiedad de fijación a PD-1, B7-DC y B7-H1 son distintos en sus patrones de coestimulación de linfoquinas; B7-H1 coestimulaba la producción de IL-10 por las células T, mientras que B7-DC no lo hace. Los distintos patrones de expresión celular y funciones coestimuladoras de B7-DC sugieren un papel singular en la función inmunológica.

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Documentos Citados Además de los documentos citados detalladamente en el texto, ciertos documentos se citan únicamente por su número (entre paréntesis); los últimos se enumeran a continuación.

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Documentos citados por la Oficina de la Patente Europea durante el examen

D1:: DATABASE EM_MUS [Online] EMBL; Accession NO: AF142780, 1 June 1999 (1999-06-01) TSENG S Y ET AL: "Mus musculus Butyrophilin-like protein (Btdc) mRNA, complete cds." XP002189417 cited in the application

D2:: HENRY J ET AL: "Structure and evolution of the extended B7 family" IMMUNOLOGY TODAY, ELSEVIER PUBLICATIONS, CAMBRIDGE, GB, vol. 20, no. 6, June 1999 (1999-06), pages 285-288, XP004169718 ISSN: 0167-5699

D3:: DATABASE EM_HUM [Online] EMBL; Accession NO: AK001872, 22 February 2000 (2000-02-22) ISOGAI T ET AL: "Homo sapiens cDNA FLJ11010 fis" XP002189418

D4:: GERSTMAYER BERNHARD ET AL: "Costimulation of T-cell proliferation by a chimeric B7-antibody fusion protein." CANCER IMMUNOLOGY IMMUNOTHERAPY, vol. 45, no. 3-4, November 1997 (1997-11), pages 156-158, XP002932422 ISSN: 0340-7004

D5:: WO 92 00092 A (SQUIBB BRISTOL MYERS CO) 9 January 1992 (1992-01-09)

D6:: CHEN L ET AL: "COSTIMULATION OF ANTITUMOR IMMUNITY BY THE B7 COUNTERRECEPTOR OF THE T LYMPHOCYTE MOLECULES CD28 AND CTLA-4" CELL, CELL PRESS, CAMBRIDGE, NA, US, vol. 71, 24 December 1992 (1992-12-24), pages 1093-1102, XP000941406 ISSN: 0092-8674

D7:: WO 97 24447 A (VIAGENE INC) 10 July 1997 (1997-07-10)

D8:: WO 01 34629 A (HUMAN GENOME SCIENCES INC ;BAKER KEVIN P (US); RUBEN STEVEN M (US)) 17 May 2001 (2001-05-17)

D9:: EP-A-1 074 617 (HELIX RES INST) 7 February 2001 (2001-02-07) & DATABASE GSN [Online] Accession NO: AAH14818, 26 June 2001 (2001-06-26) OTA T. ET AL.: "Human cDNA sequence"

D10:: WO 00 61612 A (CORIXA CORP; FAN LIQUN (US); WANG TONGTONG (US)) 19 October 2000 (2000-10-19)

D11:: WO 02/24 891 (Amgen)

D12:: WO 01/94 413 (Bristol Myers Squibb)

Claims

1. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido constituido por:

(a): los residuos de aminoácidos 26-221 de SEQ ID NO: 2; o

(b): una variante de (a) que coestimula la actividad de las células T que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con (a); en donde la variante no es B7-DC de longitud total como se muestra en SEQ ID NO: 2.

2. La molécula de ácido aislada de acuerdo con la reivindicación 1, que codifica la variante y en donde uno o más residuos de aminoácidos de (a) han sido sustituidos por un residuo diferente.

3. La molécula de ácido nucleico aislada de acuerdo con la reivindicación 2, que codifica la variante y en donde un solo residuo de aminoácido de (a) ha sido sustituido por un residuo diferente.

4. La molécula de ácido nucleico aislada de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el polipéptido está constituido por (a).

5. La molécula de ácido nucleico aislada de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el polipéptido está constituido por (b) y dicha variante es un derivado funcional que tiene la actividad funcional de los residuos de aminoácidos 26-221 de SEQ ID NO: 2.

6. Una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que está constituido por:

(a): los residuos de aminoácidos 26-221 de SEQ ID NO: 2; o

(b): una variante de (a) que coestimula la actividad de las células T que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con (a); en donde la variante no es B7-DC de longitud total como se muestra en SEQ ID NO: 2

fusionado directamente a otra proteína, u opcionalmente, fusionado a una secuencia de péptido enlazador que está fusionada a dicha otra proteína.

7. Una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 6 en donde dicha otra proteína está constituida por:

(a): uno o más dominios de una región constante de cadena pesada de Ig;

(b): dos dominios C de una región constante de cadena pesada de IgG; o

(c): la regiones bisagra, C_{H}2 y C_{H}3 de una cadena de inmunoglobulina humana G\gamma1.

8. Una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 6 ó 7 en donde dicha otra proteína está constituida por dos dominios de una región constante de IgG humana.

9. Un vector de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores enlazado operativamente a:

(a): un promotor; y

10. Un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 9 que es un plásmido o un vector viral.

11. Una composición de vector que comprende:

(a): un primer vector de expresión recombinante que tiene incorporada en su ácido nucleico una secuencia de nucleótidos que codifica un antígeno de interés contra el cual se pretende inducir una respuesta inmune; y

(b): un segundo vector de expresión recombinante que tiene incorporada(s) en su ácido nucleico una o más secuencias de nucleótidos que comprenden una molécula de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8;

en donde los vectores de expresión son capaces de coinfectar o cotransfectar una célula hospedadora dando como resultado la coexpresión del antígeno y el polipéptido coestimulador.

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12. Una célula transformada o transfectada con una molécula de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, un vector de acuerdo con la reivindicación 9 ó 10, o una composición de vector de acuerdo con la reivindicación 11.

13. Una célula de acuerdo con la reivindicación 12 que es una célula de mamífero y/o una célula humana.

14. Una célula de acuerdo con la reivindicación 12 ó 13 que es una célula dendrítica o un progenitor de la misma que no se obtiene a partir de un embrión humano, o una célula tumoral.

15. Un polipéptido que está constituido por:

(a): los residuos de aminoácidos 26-221 de SEQ ID NO: 2; o

(b): una variante de (a) que coestimula la actividad de las células T, que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con (a), en donde la variante no es B7-DC de longitud total como se muestra en SEQ ID NO: 2;

y puede obtenerse por expresión recombinante de una molécula de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

16. Un polipéptido de fusión que está constituido por:

(a): los residuos de aminoácidos 26-221 de SEQ ID NO: 2; o

fusionado directamente a otra proteína; u opcionalmente, fusionado a una secuencia de péptido enlazador que está fusionada a dicha otra proteína.

17. Un polipéptido de fusión de acuerdo con la reivindicación 16, que se fija a una molécula pareja de fijación en las células T y coestimula las células T en presencia de un estímulo adecuado para el receptor de las células T.

18. Un polipéptido de fusión de acuerdo con la reivindicación 17, en donde la molécula pareja de fijación es PD-1 u otro receptor en las células T que no es CD28 o CTLA-4.

19. Un polipéptido de fusión de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18 en donde dicha otra proteína es uno o más dominios de una región constante de cadena pesada de Ig.

20. Un polipéptido de fusión de acuerdo con la reivindicación 19, en donde dicha otra proteína tiene una secuencia de aminoácidos que corresponde a las regiones bisagra, C_{H}2 y C_{H}3 de una cadena G\gamma1 de inmunoglobulina humana.

21. Una molécula de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, un vector o composición de vector de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, o un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 15 ó 16 para uso en un método de tratamiento del cuerpo humano o animal.

22. Uso de un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 15 ó 16 para la fabricación de un medicamento para aumentar la respuesta de las células T de un individuo mamífero a estimulación antigénica, en donde la administración de la célula o el polipéptido en asociación con un antígeno es eficaz para aumentar la respuesta de las células T del individuo a la estimulación antigénica.

23. Un método para aumentar la respuesta de las células T de mamífero a estimulación antigénica, que comprende poner en contacto las células T ex vivo con una cantidad eficaz de un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 20, en donde la puesta en contacto es eficaz para aumentar la respuesta de las células T a la estimulación antigénica.

24. Una composición de vacuna para inducir una respuesta inmune protectora contra un antígeno asociado a una célula o microorganismo patógeno, que comprende:

(a): una fuente de dicho antígeno;

(b): un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 20;

(c): opcionalmente, un agente o adyuvante inmunoestimulador general; y

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25. Uso de un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 20 para la fabricación de una composición de vacuna para inducir o aumentar una respuesta inmune a un antígeno en donde la composición de vacuna comprende una fuente del antígeno.

26. Una composición coestimuladora para aumentar la inmunogenicidad de un antígeno o vacuna, que comprende un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 20 y un excipiente o vehículo farmacéutica e inmunitariamente aceptable.

27. Uso de una composición coestimuladora de acuerdo con la reivindicación 26 para la fabricación de un medicamento para potenciar una respuesta inmune a un antígeno o una vacuna en un individuo mamífero.

28. Productos que contienen un antígeno o una vacuna y una composición coestimuladora de acuerdo con la reivindicación 26 como una preparación combinada para uso combinado en la potenciación de una respuesta inmune al antígeno o vacuna.