KR20020096925A - 도라지 추출물을 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 및치료용 또는 기억력 증진용 조성물 - Google Patents

도라지 추출물을 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 및치료용 또는 기억력 증진용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 도라지 추출물을 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료용 또는 기억력 증진용 약학 조성물 또는 식품 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 조성물은 콜린성 신경전달물질의 효능을 증강시키고 동시에 신경세포의 손상을 방지하므로 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료제로서, 또한 기억력 증진을 위해 유용하게 사용될 수 있다.

Description

도라지 추출물을 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료용 또는 기억력 증진용 조성물{COMPOSITION FOR PREVENTING AND TREATING A DEGENERATIVE BRAIN DISEASE OR FOR THE ENHANCEMENT OF MEMORY COMPRISING AN EXTRACT OF THE ROOT OF BALLOON-FLOWER}
본 발명은 도라지 추출물을 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료용 또는 기억력 증진용 조성물에 관한 것이다.
퇴행성 뇌질환은 뇌 신경세포의 사멸이 주요한 원인이 되는 질환으로, 치매, 파킨슨병, 뇌졸중, 헌팅턴병 등의 다양한 질환을 포함한다. 또한, 현대사회에서는 노령 인구의 급격한 증가로 인한 노인성 치매(senile dementia) 등의 퇴행성 뇌질환의 증가가 심각한 사회 문제로 대두되고 있으나, 현재까지 이 질환의 예방 및 치료를 위한 효과적인 약제나 치료법은 개발되지 못하고 있다.
대표적인 퇴행성 뇌질환인 치매는 전반적인 인지기능의 장애를 나타내는 뇌질환으로 보통 만성, 또는 진행성 뇌질환에 의해서 발생되고 기억, 사고, 이해, 계산, 학습, 언어 판단 등 다수의 고위 대뇌기능에 장애가 나타난다.
그러나 이러한 치매의 원인은 정확히 밝혀져 있지 않다. 다만 몇 가지 추정되는 원인으로는 대뇌 기저부의 콜린(choline)성 신경세포의 손상, 신경전달물질의 감소, 염증 반응에 의한 베타-아밀로이드(β-amyloid) 단백질 축적, 산화성 스트레스 등이라는 보고가 있다(Davies P.,et al.,Lancet, 21, 1403(1976); Rocher, A. E.,et al.,J. Biol. Chem.,273, 29719(1988); Coyle, J. T.,et al.,Science,262, 689(1993)).
가장 바람직한 치매 치료제는 뇌세포의 파괴와 노화를 지연시켜 뇌세포를 보호하고, 인지 기능을 회복시키며 뇌세포의 재생을 촉진시켜야 하지만, 이를 모두 충족시키는 약은 현재까지 개발되지 못했다.
따라서 본 발명자들은 치매의 예방과 치료에 효과적인 약물을 개발하기 위해 연구하던 중 안전하고 독성이 없으며 다양한 약리 작용을 하는 도라지 추출물이 흥분성 신경전달물질인 글루타메이트의 과다생성을 억제하여 콜린성 신경세포의 손상을 억제함과 동시에 신경전달물질인 아세틸콜린의 효능을 증강시킴으로써 인지기능과 학습능력을 높일 수 있음을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
도라지(Platycodon grandiflorumA. DC)는 오랫동안 식용 및 약용으로 사용되어 왔으며, 이의 주요 약리성분인 테르펜계 사포닌은 진해, 거담작용, 중추신경억제작용(진정, 진통, 해열효과), 급·만성 염증에 대한 항염증작용, 항궤양 및 위액분비억제작용, 혈관을 확장하여 혈압을 낮추는 항콜린작용, 혈당강하작용, 콜레스테롤 대사 개선작용 등이 있는 것으로 밝혀져 있다(Toshiyuki Akiyamaet al.,Chem. Pharm. Bull.,20, 1952(1972); Akihito Tadaet al.,Chem. Pharm. Bull.,23, 2965(1975); Hiroshi Ishiiet al.,J. Chem. Soc., Perkin trans I, 661(1984); Eun Bang Lee,J. Pharm. Soc. Kor., 19, 164(1975)).
또한, 도라지의 열수 및 에탄올 추출물은 곰팡이의 아프라톡신을 억제하며, 이눌린 분획은 식균작용과 고형암 및 복수암에 대한 강력한 항종양효능이 있고, 40% 도라지 엑기스는 알코올흡수 억제작용이 있는 것으로 알려져 있다( Hitokoto H.S.et al.,Mycopathologia,66,16(1979); Michinori Kubo,et al.,Shoyakugaku Zasshi,40, 367(1986); Takaharu Nagaoet al.,Shoyakugaku Zasshi, 40, 375(1986); JPA 60-89427(1985); JPA 3-264534(1991)).
이러한 도라지의 다양한 약리작용에도 불구하고 장기간 재배에 어려움이 있어 의약품으로의 개발이 쉽지 않았으나, 최근에는 20년생 이상의 도라지를 재배할 수 있는 기술(이성호, "다년생 도라지 재배방법", 대한민국 특허 제 045791호)이 개발되어 대량 생산이 가능해졌기에 이를 이용한 연구가 활발히 진행되고 있다.
20년 이상 성장한 도라지를 말하는 장생도라지(장길(長桔)이라고도 함)는 고지혈증 치료 활성(Kyung-sook Kimet al.,J. Nur. Sci. Vitaminol, 41, 485(1995)), 간기능 보호 활성(Jeong H. K.,et al.,CANCER LETTERS,174, 73(2001)) 및 면역기능 조절 활성(Sang B. Hanet al.,International Immunopharmacology, 1 ,1969(2001); Jeong H. K.,et al.,CANCER LETTERS,166, 17(2001); Jeong H. K.,et al.,International Immunopharmacology,1, 1141(2001))을 갖는 것으로 보고된 바 있다.
그러나, 지금까지 도라지 추출물의 퇴행성 뇌질환 예방 및 치료 효과, 및 기억력 증진 효과는 보고된 바 없다.
본 발명의 목적은 퇴행성 뇌질환을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있는 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 퇴행성 뇌질환을 효과적으로 예방할 수 있는 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 기억력을 효과적으로 증진시킬 수 있는 약학 및 식품 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적에 따라, 본 발명에서는 활성성분으로서 도라지(Platycodon grandiflorum)의 추출물을 약학적으로 허용되는 담체와 함께 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료용 약학 조성물이 제공된다.
상기 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 도라지의 추출물을 식품학적으로 허용되는 첨가제와 함께 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방용 식품 조성물이 제공된다.
상기 또 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 활성성분으로서 도라지의 추출물을 약학적으로 허용되는 담체와 함께 포함하는 기억력 증진용 약학 조성물이 제공된다.
상기 또 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 도라지의 추출물을 식품학적으로 허용되는 첨가제와 함께 포함하는 기억력 증진용 식품 조성물이 제공된다.
본 발명에 사용할 수 있는 도라지로서는 도라지(Platycodon grandiflorumA. DC), 백도라지(Platycodon grandiflorumfor. albiflorum Hara) 등을 예시할 수 있으며, 특히 도라지(Platycodon grandiflorumA. DC) 중 20년생 이상인 장생도라지가 바람직하다.
본 발명의 도라지 추출물은 도라지를 물 또는 유기용매로 추출하여 얻을 수 있는데, 유기용매로는 저급 알콜, 아세톤, 클로로포름, 메틸렌클로라이드, 에테르, 에틸아세테이트, 헥산 등을 예시할 수 있다. 저급알콜로는 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 부탄올을 예시할 수 있으며, 에탄올이 가장 바람직하다.
추출시에 도라지는 생도라지, 건조 도라지 또는 도라지 분말의 형태로 사용할 수 있는데, 도라지 분말을 사용하는 것이 바람직하며, 도라지를 수분 함량 5 % 이하가 되도록 건조한 후 입자 크기 0.6 mm 이하로 분쇄한 분말을 사용하는 것이 더욱 바람직하다.
구체적으로, 도라지 분말에 5 내지 15 배, 바람직하게는 10배의 물을 첨가하고 80 내지 100℃, 바람직하게는 90 내지 95℃의 온도에서 1 내지 24시간, 바람직하게는 4 내지 6시간동안 추출한 후 여과하여 도라지의 열수 추출물을 제조할 수 있다. 도라지의 유기용매 추출물은 도라지 분말에 1 내지 5배, 바람직하게는 3배의 유기용매를 첨가하고 실온에서 추출한 후 여과하여 얻어진 여액을 감압농축하여 제조할 수 있다. 상기 추출방법들에서 추출공정은 필요에 따라 2회 이상 반복하여 실시할 수 있으며, 여과 후 얻어진 추출물을 감압건조시켜 분말 형태로 만들 수도 있다.
또한 본 발명의 약학 조성물은 약리효과를 증진시키기 위해 약학적으로 허용되는 다른 생약재 또는 그의 추출물을 추가로 포함할 수 있다. 이 경우, 상기 추출방법에 따라 생약재의 추출물을 제조한 후 약학 조성물에 가하거나 도라지와 생약재를 혼합한 후 상기 방법으로 추출하여 얻어진 추출물을 조성물에 포함시킬 수도 있다.
본 발명의 조성물에 추가될 수 있는 생약재는 약학적으로 허용되는 임의의 생약재일 수 있으며, 예를 들면, 고본(Angelicae tenuissimae Radix), 천마(Gastrodiae Rhizoma), 시호(Bapleuri Radix), 당귀(Angelicae gigantis Radix), 도인(Persicae Semen), 계지(Cinnamomi Ramulus), 대황(Rhei Rhizoma), 감초(Glycyrrhizae Radix), 천궁(Cnidii Rhizoma), 진피(Aurantii nobilis Pericarpium), 택사(Alismatis Rhizoma), 황련(Coptidis Rhizoma), 황금(Scutellariae Radix), 복령(Hoelen), 작약(Paeoniae Radix), 백출(Atractylodis Rhizoma alba), 황백(Phellodendri Cortex), 치자(Gardeniae Fructus), 반하(Pinelliae Tuber), 조구등(Uncaria Ramuluset Uncus), 지실(Ponciri Fructus), 인삼(Gingseng), 맥문동(Liriopis Tuber), 원지(Polygalae Radix), 석창포(Acori graminei Rhizoma), 창출(Atractylodis Rhizoma alba), 감국(Chrysanthemi Flos), 방풍(Ledebouriellae Radix), 생강(Zingiberis Rhizoma crudus), 망초(Natrii sulfas), 대조(Zizyphi Fructus), 단삼(Salviae Radix), 도인(Persicae Semen), 목단피(Mautan Radicis Cortex), 지황(Rehmanniae Radix), 박하(Menthae Herba), 산약(Dioscoreae Rhizoma), 저령(Polyporus), 하수오(Polygonimultiflori Radix), 구자(Allii tuberosi Semen), 결명자(Cassiae Semen), 구기자(Lycii Fructus), 독활(Araliae cordatae Radix), 두충(Eucommiae Cortex), 백화사설초(Hedyotis Herba), 삼백초(Saururus Herba), 인진(Artemisiae capillaris Herba), 지모(Anemarrhenae Rhizoma), 홍화(Carthami Flos), 황기(Astragali Radix), 석송자(Lycopodium), 은행잎(Ginkgonis Folium), 황정(Polygonati Rhizoma), 연자육(Nelumbinis Semen), 용골(Fossilia ossis Mastodi), 지골피(Lycii radicis Cortex), 우슬(Achyranthis Radix), 숙지황(Rehmanniae Radix preparata), 흑임자(Perillae Semen), 백자인(Thujae Semen), 맥아(Hordei Fructus germinatus), 토사자(Cuscutae Semen), 파극천(Morindae Radix), 해송(Pini koraiensis Radix) 등을 단독으로 또는 배합하여 사용할 수 있다. 특히, 구자, 당귀, 목단피, 작약, 백출, 복령, 산약, 석송자, 원지, 은행잎, 저령, 천궁, 천마, 택사, 황련을 추가로 포함하는 조성물이 바람직하다.
본 발명의 약학 조성물은 도라지 추출물을 조성물 총 중량의 10 내지 100 중량%, 바람직하게는 30 내지 70 중량%의 양으로 포함할 수 있으며, 생약재 추출물은 조성물 총 중량의 0 내지 90 중량%, 바람직하게는 30 내지 70 중량%의 양으로 추가할 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 글리신 결합사이트를 효과적으로 억제하여 흥분성 신경전달물질인 글루타메이트의 과다 생성으로 인한 뇌신경세포의 파괴를 억제함과 동시에 무스카린 수용체에서 콜린성 신경전달물질의 효능을 증강시켜 인지기능의 감퇴를 효과적으로 억제함으로써 치매, 파킨슨병, 뇌졸중, 헌팅턴병 등의 퇴행성 뇌질환에 대해 우수한 예방 및 치료 효과를 나타낸다.
또한, 본 발명의 약학 조성물을 투여한 생쥐에서는 학습과 기억력 증진 효과가 현저하게 나타난다.
상기와 같은 유효성에도 불구하고, 도라지 추출물을 함유하는 본 발명의 약학 조성물은 랫트를 사용한 시험에서 급성 독성 등의 독성을 전혀 나타내지 않으며 간 기능에 부작용을 보이지 않는다.
본 발명의 약학 조성물을 이용하여 통상적인 방법에 따라 약학 제형을 제조할 수 있다. 제형의 제조에 있어, 활성 성분인 도라지 추출물을 담체와 함께 혼합 또는 희석하거나, 용기 형태의 담체내에 봉입시키는 것이 바람직하다. 담체가 희석제로 사용되는 경우에는 활성 성분에 대한 비히클, 부형제 또는 메디움으로 작용하는 고형, 반고형 또는 액상의 물질일 수 있다. 따라서, 제형은 정제, 환제, 분제, 새세이, 엘릭시르, 현탁제, 유제, 용액제, 시럽제, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀제, 멸균 주사제, 멸균 분제 등의 형태일 수 있다. 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제형은 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 약학 조성물은 포유 동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에잘 알려진 방법을 사용하여 제형화될 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다. 사람의 경우, 통상적인 1일 투여량은 1 내지 1,000 ㎎/㎏ 체중, 바람직하게는 10 내지 100 ㎎/㎏ 체중의 범위일 수 있고, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 실제 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중, 건강상태 및 질환의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 한다.
또한, 본 발명의 상기 도라지 추출물 및 추가 생약 추출물들은 각종 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 기억력 증진 등의 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이때, 식품 또는 음료 중의 상기 추출물의 양은 일반적으로 건강식품의 경우 전체 식품 중량의 0.1 내지 15 중량%, 바람직하게는 1 내지 10 중량%로 첨가할 수 있으며, 건강음료의 경우 100 ㎖을 기준으로 1∼30 g, 바람직하게는 3∼10 g의 비율로 첨가할 수 있다.
본 발명의 건강음료는 지시된 비율로 필수성분으로서 상기 도라지 추출물 및추가 생약 추출물을 함유하는 외에는 액체성분에 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 향미제로서는 천연 향미제 (타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등), 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 예는 단당류, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 이당류, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 다당류, 예를 들어 덱스트린,시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 크실리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1∼20 g, 바람직하게는 약 5∼12 g이다.
상기 외에 본 발명의 식품 또는 음료 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
건강보조식품 개발을 위하여 본 발명의 상기 도라지 추출물 및 추가 생약 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어 각종 식품류, 음료류, 껌류, 비타민 복합제 등이 있다.
이하에서 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이로써 한정되는 것은 아니다.
또한, 하기 실시예에서 고체와 고체 혼합물, 액체와 액체, 및 액체와 고체에 대한 하기 백분율은 각각 중량/중량, 부피/부피 및 중량/부피에 기초한 것이며 특별한 언급이 없는 한 모든 반응은 실온에서 수행하였다.
실시예 1: 생약 추출물 및 이를 포함하는 약학 조성물의 제조
(1) 열수 추출물의 제조
장생도라지(입수처: (주)장생도라지:경남 진주시 금곡면 정자리) 분말 0.2 ㎏에 증류수 2 ℓ를 가하고 90∼95℃에서 5시간동안 2회 추출한 후 여과지로 여과하여 장생도라지 추출물 80 g을 얻었다.
한편, 동일한 방법으로 표 1a 및 1b에 기재된 생약재들의 추출물을 얻고 이를 상기에서 얻은 장생도라지 추출물과 혼합하여 약학 조성물을 얻었다.
(2) 에탄올 추출물의 제조
장생도라지와 생약재들을 표 1a 및 1b에 기재된 양으로 혼합한 후 3배량의 에탄올을 가하고 실온에서 2회 추출하였다. 추출물을 합하여 여과지로 여과한 후 여액을 감압 농축하여 약학 조성물을 얻었다.
조성물번호 AL-1 AL-2 AL-3 AL-4 AL-5 AL-6 AL-7 AL-8 AL-9 AL-10
조성 장길 20 장길 20고본 3천마 3택사 6천궁 6당귀 3복령 3백출 3작약 10 장길 20고본 3천마 3황련 5황금 5황백 5치자 5 장길 20고본 3천마 3시호 2당귀 3창출 4복령 4감초 1.5천궁 3조구등 3진피 3반하 5 장길 20고본 3천마 3감국 3맥문동 3반하 3진피 3복령 3인삼 2조구등 3생강 1감초 1방풍 2 장길 20고본 3천마 3도인 5계지 4대황 1.5감초 1.5망초 0.9 장길 20고본 3천마 3시호 16반하 4황금 10작약 10대조 2지실 6생강 1대황 4 장길 20고본 3천마 3황련 3황금 3대황 3 장길 20고본 3천마 3계지 3작약 3복령 3도인 3목단피 3단삼 5잇꽃 3 장길 20고본 3천마 3작약 3지황 3당귀 3천궁 3
조성물 번호 AL-11 AL-12 AL-13 AL-14 AL-15 AL-16 AL-17 AL-18 AL-19
조성 장길 20고본 3천마 3당귀 3작약 3시호 3백출 3복령 3박하 1목단피 2치자 2감초 2생강 1 장길 20백복신 4원지 4석창포 4 장길 20백복령 20석창포 3하수오 6원지 3산약 9황련 6천마 3고본 3저령 6계지 1.5 장길 20고본 3천마 3택사 6천궁 6당귀 3복령 3백출 3작약 10황련 5산약 4구자 5저령 10황백 5 장길 20감초 6.7결명자 5.6구기자 5.6황기 5.6지모 7.8독활 5.6방풍 5.6계지 5.6백출 5.6인진 1.1두충 5.6산약 22홍화자 7.2삼백초 5백화사 1.7 장길 20원지 6천마 4택사 6천궁 6당귀 6복령 3백출 3작약 5황련 5산약 5구자 5저령 10석송자 10목단피 8은행잎 10 장길 20원지 9황련 5산약 10구자 5당귀 10복령 10저령 10석송자 10목단피 8은행잎 10 장길 20황정 4산약 8연자육 4용골 4원지 8지골피 4구기자 4석창포 8두충 4우슬 4숙지황 4흑임자 4천마 8백자인 3맥아 3토사자 6당귀신 6파극 6인삼 6해송 4고본 4 장길 20황정 4산약 8연자육 4용골 4원지 10지골피 4구기자 4석창포 8두충 4우슬 4숙지황 4흑임자 4천마 12백자인 3맥아 3토사자 6당귀신 10파극 6인삼 6해송 8고본 4
실시예 2: 콜린성 신경전달물질 아세틸콜린의 효능 증강 효과
실시예 1에서 제조된 조성물들의 신경전달물질 아세틸콜린의 효능 증강 효과는 무스카린성 아세틸콜린 수용체 서브타입 1(M1)에 대한 수용체-리간드 결합에 대한 저해효과를 통하여 확인하였다.
즉, 방사성 동위원소가 부착된 리간드를 상기 수용체와 반응시킨 후 유리섬유 필터(glass fiber filter)로 여과하는 과정을 거쳐 결합하지 않은 여분의 리간드를 제거한 뒤 세척된 필터 디스크에 잔존하는 동위원소의 양을 측정하여 수용체에 대한 리간드의 결합반응을 정량하고 이를 이용하여 본 발명에 따른 조성물의 효과를 결정하였다.
수용체로는 CHO(Chinese Hamster Ovary) 세포에서 발현된 재조합 인간 무스카린성 아세틸콜린 수용체 서브타입 1(mAChR-M1, BSR-MM1H, BSR)을 사용하였다.
-70℃에 냉동 보관된 수용체 분획 250 ㎕를 10 ㎖의 인산염 완충 식염수(PBS)(pH 7.4)에 현탁시켜 단백질 함량을 130 ㎍/㎖의 농도로 조정하였다.
96-웰 마이크로타이터 플레이트(Inotech harvester)의 웰에 방사선 표지된 리간드로서 50 ㎕의 0.5 nM [3H] N-메틸-스코폴아민(N-methyl-scopolamine, 24,605 DPM)(NEN, NET-636)과 10 ㎕의 시험 조성물을 가하였다. 여기에, 비특이적 결합을 보정하기 위하여 5 μM 아트로핀 설페이트(atropine sulfate) 50 ㎕를 첨가하고, 상기에서 제조된 수용체 현탁액 100 ㎕를 첨가한 후 PBS로 반응액의 최종 부피를 0.25 ㎖로 하였다. 반응액을 25℃에서 60분간 진탕하면서 반응시킨 후 차가운 0.9% 식염수 중의 50 mM Tris-HCl 완충액(pH 7.4) 0.5 ㎖을 가하여 반응을 종료시켰다. 반응액을 즉시 월락 유리 섬유 필터매트 GF/C(Wallac glass fiber filtermat GF/C, 제작사: Wallac, P.O. Box 10, FIN-20101 Tutku, Finland)를 이용한 이노테크 세포 배양 시스템(Inotech cell harvester system)으로 여과하고 차가운 PBS로 3회 세척하였다. 필터매트를 마이크로웨이브 오븐에서 건조시킨 후 방사선량(radioactivity)을 액체 신틸레이션 카운터(MicroBeta 1450 Plus; Wallac, Finland)로 측정하여 수용체에 대한 리간드의 결합율을 산출하였다. 실시예 1의 각 조성물은 소량의 디메틸설폭시드(DMSO)에 녹인 PBS로 희석하였으며 반응액 중의 DMSO 농도가 0.1% 미만이 되도록 하였다. 모든 시료는 2회 측정하여 평균값을 산출하였으며, 시험 조성물을 사용하지 않고 동일하게 실시한 대조군과 비교하여 방사선량의 감소 정도를 저해 활성 %로 표 2에 나타내었다. 표준 대조약물로는 4-DAMP 메트요오다이드(methiodide)를 사용하였으며, 이 약물은 수용체에 대한 리간드의 결합을 0.024 μM 농도에서 50 % 저해하는 것으로 관찰되었다.
조성물 번호 수용체 결합 저해율0.5(㎎/㎖), % 조성물 번호 수용체 결합 저해율 0.5(㎎/㎖), %
AL-1 <0.0 AL-11 <0.0
AL-2 <0.0 AL-12 <0.0
Al-3 87.39 AL-13 69.4
AL-4 <0.0 AL-14 71.2
AL-5 <0.0 AL-15 40.9
AL-6 <0.0 AL-16 52.2
AL-7 <0.0 AL-17 25.3
AL-8 18.49 AL-18 39.8
AL-9 <0.0 AL-19 40.8
AL-10 <0.0
상기 표 3에서 알 수 있는 바와 같이, 조성물 AL-3, AL-13, AL-14, AL-16은 0.5 ㎎/㎖의 농도에서 50 % 이상의 무스카린 수용체-리간드 결합 저해활성을 나타내었으며, AL-15, AL-18 및 AL-19 역시 비교적 높은 저해활성을 나타내었다.
이와 같이 본 발명의 약학 조성물은 무스카린 수용체와 리간드의 결합을 효과적으로 억제함으로써 뇌에서 콜린성 신경전달물질의 효능을 증강시키고 인지기능의 감퇴를 효과적으로 억제한다.
실시예 3: 신경세포 손상 억제 효과
본 발명에 따른 조성물의 신경세포 손상 억제 효과는 흥분성 신경전달물질로 작용하여 신경세포의 손상을 유도하는 NMDA(N-Methyl-D-Aspartate)의 작용과 밀접한 관련이 있는 NMDA 수용체(글리신 사이트)에서 수용체-리간드 결합을 저해하는 효과를 통해 확인하였다.
즉, 방사성 동위원소가 부착된 리간드를 상기 수용체와 반응시킨 후 유리섬유 필터(glass fiber filter)로 여과하는 과정을 거쳐 결합하지 않은 여분의 리간드를 제거한 뒤 세척된 필터 디스크에 잔존하는 동위원소의 양을 측정하여 수용체에 대한 리간드의 결합반응을 정량하고 이를 이용하여 본 발명에 따른 조성물의 효과를 결정하였다.
(단계 1) 쥐의 대뇌로부터 NMDA 수용체 분획의 분리
웅성 스프라그-다우리(Sprague-Dawley) 래트의 전뇌를 적출하여 잘게 자른후 10배 용량의 차가운 수크로오스 용액(0.32 mM)을 가하였다. 이를 테프론-글래스 호모게나이저를 이용하여 균질화(5 스트로크)시킨 후 1000g(10분, 4℃)로 원심분리하여 상등액을 얻고, 이 상등액을 20000g(20분, 4℃)로 원심분리하여 침전을 얻었다. 얻어진 침전에 20배 용량의 차가운 증류수를 가하여 브링크만 폴리트론 호모게나이저(Brinkman Polytron Homogenizer)로 균질화시킨 후 4℃에서 30분간 교반한 다음 8000g(20분, 4℃)로 원심분리하여 상등액을 얻었다. 이 상등액을 39800g (25분, 4℃)로 원심분리하여 침전을 얻고 이를 -70℃에서 냉동보관하였다. 냉동된 침전물을 상온에서 10분간 녹인 다음 20배 용량의 0.04 % 트리톤 X-100을 함유한 50 mM 트리스-아세테이트 완충액(pH 7.1)에 균질화시키고 이를 37℃에서 20분간 교반하고 39800g(20분, 4℃)으로 원심분리하여 침전을 얻었다. 얻어진 침전을 20배 용량의 50 mM 트리스-아세테이트 완충액(pH 7.1)에 균질화시키고 원심분리하는 세척과정을 3회 반복한 후 동일 완충액에 현탁하여 브랫퍼드(bradford)의 방법에 따라 단백질 농도를 측정한 다음 단백질 농도를 1 ㎎/㎖로 분주하여 -70℃에서 보관하였다.
(단계 2) 신경세포 손상 억제 시험
-70℃에 냉동 보관된 수용체 세포 분획을 50 mM 트리스-아세테이트 완충액(pH 7.1)에 현탁하였다.
96-웰 마이크로타이터 플레이트(Inotech harvester)의 웰에 방사선 표지된리간드로서 50 ㎕의 4 nM [3H]MDL 105,519 (140,000 DPM, Amersham Pharmacia Biotech)과 10 ㎕의 시험 조성물을 가하였다. 여기에, 비특이적 결합을 보정하기 위하여 5 mM 글리신 50 ㎕를 첨가하고, 상기에서 제조된 수용체 현탁액 100 ㎕를 첨가한 후 50 mM 트리스-아세테이트 완충액을 가하여 반응액의 총 부피를 0.25 ㎖로 하였다. 이 때 반응액중 수용체 단백질의 양은 5 ㎍/웰이었다. 반응액을 25℃에서 30분간 진탕하면서 반응시킨 후 차가운 0.9 % 식염수 중의 50 mM Tris-HCl 완충액(pH 7.4) 0.2 ㎖을 가하여 반응을 종료시켰다. 반응액을 즉시 월락 유리 섬유 필터매트 GF/C(Wallac glass fiber filtermat GF/C, 제작사: Wallac, P.O. Box 10, FIN-20101 Tutku, Finland)를 이용한 이노테크 세포 배양 시스템(Inotech cell harvester system)으로 여과하고 차가운 50 mM 트리스-아세테이트 완충액으로 9회 반복 세척하였다. 필터매트를 마이크로웨이브 오븐에서 건조시킨 후 방사선량(radioactivity)을 액체 신틸레이션 카운터(MicroBeta 1450 Plus; Wallac, Finland)로 측정하여 수용체에 대한 리간드의 결합율을 산출하였다. 실시예 1의 각 조성물은 소량의 DMSO에 녹인 후 50 mM 트리스-아세테이트 완충액으로 희석하였으며 반응액 중의 DMSO 농도가 0.1 % 미만이 되도록 하였다. 모든 시료는 2회 측정하여 평균값을 산출하였으며, 시험 조성물을 사용하지 않고 동일하게 실시한 대조군과 비교하여 방사선량의 감소 정도로부터 확인한 각 조성물의 IC50값을 표 3에 나타내었다. 표준 대조약물로는 5,7-DCKA (5,7-Dichlorokynurenic acid, RBI)를 사용하였으며, 이 약물의 IC50값은 1.0 μM 이었다.
조성물 번호 IC50(㎎) 조성물 번호 IC50(㎎)
AL-1 0.051 AL-11 0.044
AL-2 0.015 AL-12 0.056
Al-3 0.052 AL-13 0.057
AL-4 0.024 AL-14 0.056
AL-5 0.051 AL-15 0.048
AL-6 0.031 AL-16 0.048
AL-7 0.041 AL-17 0.050
AL-8 0.033 AL-18 0.038
AL-9 0.025 AL-19 0.041
AL-10 0.039
표 3에서 볼 수 있는 바와 같이, 본 발명의 약학 조성물들은 NMDA 수용체의 글리신 결합 사이트에서 15 내지 50 ㎍의 농도에서 수용체-리간드의 결합을 강력하게 저해하였다.
이와 같이 본 발명에 따른 약학 조성물들은 NMDA 수용체의 글리신 결합사이트를 효과적으로 억제함으로써 흥분성 신경전달물질인 글루타메이트의 과다 생성으로 인한 뇌신경세포의 파괴를 억제함으로써 인지기능의 감퇴를 효과적으로 억제한다.
실시예 4: 수동회피실험
(1) 실험방법
18∼20 g의 수컷생쥐를 22±1℃에서 12시간을 주기로 명암을 조절하면서 7일간 사육하였다. 사육시에 물과 사료는 자유롭게 섭취하도록 했으며 3일 이상 순화시킨 후 실험에 사용하였다. 실시예 1에서 제조한 약학 조성물을 트윈(Tween80(Polyoxyethylenesorbitan monooleate): 시그마)에 녹인 후 250 ㎎/㎏의 용량으로 매일 1회 일주일간 경구 투여하였다. 양성 대조군에는 타크린(Tacrine(9-amino-1,2,3,4-테트라하이드로아크리딘): 시그마) 2.5 ㎎/㎏을 투여하고 대조군에는 5 % 트윈을 투여하였다.
수동회피실험은 PACS-30 셔틀 박스 시스템(콜롬부스 인스트루먼트사)을 사용하였으며, 학습(learning)과 실험(testing)으로 나누어 2일 연속(간격: 24시간)으로 행하였다.
(1-1) 학습 시험
마지막 약물 투여 30분 후에 50 % 에탄올 용액을 3 g/㎏의 용량으로 경구 투여하고, 에탄올 투여 1시간 후에 쥐를 조명을 비춘 밝은 쪽 구획에 놓고 30초의 탐색시간 후 길로틴문(guillotin door)이 열려 어두운 구획으로 들어갈 수 있게 하였다. 이때 길로틴문이 열린 후 120초 이내에 어두운 쪽으로 들어가지 않는 쥐는 실험에서 제외시켰다. 길로틴문이 열린 후 쥐가 어두운 쪽으로 들어갈 때까지의 시간을 자동적으로 측정하였다. 일단 쥐가 어두운 쪽으로 들어가면 길로틴문이 닫히고 0.4 ㎃의 스크램블된 충격이 5초 동안 그리드 바닥을 통해 흐르게 되고 쥐는 이것을 기억하게 된다.
(1-2) 실험
학습 시험이 끝난지 24시간 후에 시행하였다. 쥐가 30초의 탐색시간 후 길로틴문이 열리고 어두운 쪽으로 들어갈 때까지의 도달시간(latency time)을 300초까지 측정하였다. 그 결과를 표 6에 나타내었다. 도달시간이 길수록 수동회피의 학습과 기억이 좋음을 나타낸다.
(2) 실험 결과
표 4에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 조성물은 대조군 또는 양성 대조군에 비해 기억력 증강 효과가 뚜렷하였다.
실험 물질 도달시간(초) 실험 물질 도달시간(초)
대조군 20 AL-13 26
양성 대조군(타크린) 31 AL-14 131
AL-01 96 AL-15 31
AL-02 101 AL-16 233
AL-04 236 AL-17 194
AL-06 236 AL-18 13
AL-12 257 AL-19 34
제제 실시예
본 발명의 조성물은 단독으로 또는 약제학적으로 사용되는 부형제들과 함께 통상의 방법에 따라 다양한 제제 형태로 제제화할 수 있다. 하기에 제제예를 예시하나, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
<제제예 1> 산제의 제조
조성물 AL-1의 건조 추출물 2 g
유당 1 g
상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.
<제제예 2> 정제의 제조
조성물 AL-16의 건조 추출물 100 ㎎
옥수수전분 100 ㎎
유 당 100 ㎎
스테아린산 마그네슘 2 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.
<제제예 3> 캡슐제의 제조
조성물 AL-1의 건조 추출물 100 ㎎
옥수수전분 100 ㎎
유 당 100 ㎎
스테아린산 마그네슘 2 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후 통상의 젤라틴 캡슐의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
<제제예 4> 주사제의 제조
조성물 AL-16의 건조 추출물 100 ㎎
주사용 증류수 적량
pH 조절제 적량
통상의 주사제의 제조방법에 따라 활성성분을 주사용 증류수에 용해하고 pH를 약 7.5로 조절한 다음 전체를 주사용 증류수로 2 ㎖ 용량의 앰플에 충진하고 멸균시켜서 주사제를 제조하였다.
<건강음료의 제조>
건강음료 총량을 기준으로 실시예 1의 조성물 AL-1 1∼10 중량%, 설탕 5∼10 중량%, 구연산 0.05∼0.3중량%, 카라멜 0.005∼0.02 중량%, 비타민 C 0.1∼1 중량%를 혼합하고 여기에 잔량의 정제수를 섞어서 시럽을 만들고, 상기 시럽을 85∼98℃에서 20∼180초간 살균하여 냉각수와 1:4의 비율로 혼합한 다음 탄산가스를 0.5 내지 0.82% 주입하여 도라지 추출물을 함유하는 탄산음료를 제조하였다.
한편, 액상 과당(0.5 %), 올리고당(2 %), 설탕(2 %), 식염 (0.5 %), 물 (75 %)과 같은 부재료와 실시예 1의 조성물 AL-16을 균질하게 배합하여 순간 살균을 하여 건강음료를 제조하였다.
상술한 바와 같이 도라지 추출물을 포함하는 본 발명의 약학 조성물은 흥분성 신경전달물질인 글루타메이트의 과다 생성으로 인한 뇌신경세포의 파괴를 억제함과 동시에 뇌에서의 콜린성물질의 감소를 억제함으로써 인지기능개선에 탁월한 효과를 나타내므로 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료제로서 또한 기억력 증진제로서 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (14)

  1. 도라지 추출물 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 도라지 추출물 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 기억력 증진용 약학 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    도라지가 20년생 이상의 장생 도라지인 조성물.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    도라지 추출물이 도라지를 물 또는 유기용매로 추출한 것인 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    도라지 추출물이 도라지 분말에 5 내지 15 배의 물을 가하고 80 내지 100℃에서 1 내지 24시간동안 추출한 후 여과하여 얻어지는 조성물.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    약학적으로 허용되는 생약재 또는 이의 추출물을 추가로 포함하는 조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    생약재가 고본, 천마, 시호, 당귀, 도인, 계지, 대황, 감초, 천궁, 진피, 택사, 황련, 황금, 복령, 작약, 백출, 황백, 치자, 반하, 조구등, 지실, 인삼, 맥문동, 원지, 석창포, 창출, 감국, 방풍, 생강, 망초, 대조, 단삼, 도인, 목단피, 잇꽃, 지황, 박하, 산약, 저령, 하수오, 구자, 결명자, 구기자, 독활, 두충, 백화사설초, 삼백초, 인진, 지모, 홍화, 황기, 석송자, 은행잎, 황정, 연자육, 용골, 지골피, 우슬, 숙지황, 흑임자, 백자인, 맥아, 토사자, 파극천, 해송 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 조성물.
  8. 도라지 추출물 및 식품학적으로 허용되는 담체를 포함하는 퇴행성 뇌질환 예방용 식품 조성물.
  9. 도라지 추출물 및 식품학적으로 허용되는 담체를 포함하는 기억력 증진용 식품 조성물.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서,
    도라지가 20년생 이상의 장생 도라지인 조성물.
  11. 제8항 또는 제9항에 있어서,
    도라지 추출물이 도라지를 물 또는 유기용매로 추출한 것인 조성물.
  12. 제11항에 있어서,
    도라지 추출물이 도라지 분말에 5 내지 15 배의 물을 가하고 80 내지 100℃에서 1 내지 24시간동안 추출한 후 여과하여 얻어지는 조성물.
  13. 제8항 또는 제9항에 있어서,
    약학적으로 허용되는 생약재 또는 이의 추출물을 추가로 포함하는 조성물.
  14. 제13항에 있어서,
    생약재가 고본, 천마, 시호, 당귀, 도인, 계지, 대황, 감초, 천궁, 진피, 택사, 황련, 황금, 복령, 작약, 백출, 황백, 치자, 반하, 조구등, 지실, 인삼, 맥문동, 원지, 석창포, 창출, 감국, 방풍, 생강, 망초, 대조, 단삼, 도인, 목단피, 잇꽃, 지황, 박하, 산약, 저령, 하수오, 구자, 결명자, 구기자, 독활, 두충, 백화사설초, 삼백초, 인진, 지모, 홍화, 황기, 석송자, 은행잎, 황정, 연자육, 용골, 지골피, 우슬, 숙지황, 흑임자, 백자인, 맥아, 토사자, 파극천, 해송 및 이들의 혼합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 조성물.
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