KR20010101941A

KR20010101941A - 인간 기도 트립신형 효소와 결합하는 항체 및 그의이용법

Info

Publication number: KR20010101941A
Application number: KR1020017009756A
Authority: KR
Inventors: 에구찌히로시; 야마오까가즈요시; 오가와히로꼬; 야스오까스스무
Original assignee: 야스이 쇼사꾸; 데이진 가부시키가이샤
Priority date: 1999-12-06
Filing date: 2000-12-04
Publication date: 2001-11-15
Also published as: AU1651601A; CA2362649A1; US20030073148A1; CN1339064A; EP1152057A4; WO2001042450A1; HK1043389A1; EP1152057A1

Abstract

본 발명의 과제는 생체시료중의 인간 기도 트립신형 효소의 측정에 기초한 병태의 진단방법이나, 인간 기도 트립신형 효소가 관계되는 질환의 치료약을 제공하는 것이다.

이러한 과제는 인간 기도 트립신형 효소와 결합하는 항체, 그것을 사용한 효소면역측정법에 의해 해결된다. 또, 인간 기도 트립신형 효소의 활성화를 저해하는 항체를 함유하는 치료약, 및 인간 기도 트립신형 효소 활성을 중화하는 항체를 함유하는 치료약에 의해 해결된다.

Description

인간 기도 트립신형 효소와 결합하는 항체 및 그의 이용법{ANTIBODY BINDING TO HUMAN AIRWAY TRYPSIN-LIKE ENZYME AND UTILIZATION THEREOF}

최근, 인간의 만성 기도 염증 환자의 객담(喀痰)중에서 인간 기도 트립신형 효소 (Human Airway Tryptase, 이하, HAT 라고도 함) 가 정제되어 (일본 공개특허공보 평7-067640 호 및 S. Yasuoka et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 16: p300-308, 1997 참조) 그의 아미노산 서열 및 cDNA 서열이 이미 명확해져 있다 (일본 공개특허공보 평8-89246 호, US-5804410, EP-699763, 및 Yamaoka K. et al., J. Biol. Chem., 273(19), 11895-11901, 1998 참조). 이 효소가 갖는 활성에 대해서는 인 비트로(in vitro)에서 몇가지 검토가 이루어져 있다. 점액 섬모운동에 대한 관여를 시작으로, 인간 기관지 상피세포주로부터의 IL-8, GM-CSF 등의 사이토카인의 생산증강작용 (테라오노리코 등, 1998 년도 일본호흡기학회) 을 갖는 점에서 기도 염증의 병태로의 관여 가능성이 생각된다. 또한, 피브리노겐의 분해활성 및 플라스미노겐 액티베이터 (프로-우로키나아제) 활성화 작용 등의 효소 활성(요시나가준코 등, 1998 년도 병태와 치료에서의 프로테아제와 인히비터 연구회 (Conference on Proteases and Inhibitors in Pathophysiology and Therapeutics)) 을 갖고 있는 점에서 기도 점막면에서의 피브린 형성을 통해 항염증적으로 작용하거나, 만성 기도질환에서는 그 병태를 수식하고 있을 가능성이 상정되고, 또한 암전이 등에 관여하고 있을 가능성도 생각되고 있다.

본 발명은 인간 기도 트립신형 효소와 결합하는 항체, 그것을 사용한 인간 기도 트립신형 효소의 검출 또는 측정계, 그것을 사용한 진단약, 및 그것을 사용한 치료약에 관한 것이다.

도 1 은 본 발명의 항HAT 항체의 중화활성을 평가한 결과를 나타낸다.

도 2 는 본 발명의 항HAT 폴리클로날 항체를 사용한 측정계의 재조합 HAT 에 대한 표준곡선을 나타낸다.

도 3 은 본 발명의 항HAT 폴리클로날 항체를 사용한 측정계에 의해 객담중의 HAT 를 측정한 결과를 나타낸다.

도 4 는 본 발명의 항HAT 모노클로날 항체와 항HAT 폴리클로날 항체의 재조합 HAT 에 대한 액상항원 반응성을 조사한 결과를 나타낸다.

도 5 는 본 발명의 항HAT 모노클로날 항체와 항HAT 폴리클로날 항체를 사용한 측정계의 재조합 HAT 에 대한 표준곡선을 나타낸다.

본 발명의 과제는 상술한 HAT 를 검출하기 위한 항체의 취득, 및 그 항체를 사용한 측정계의 구축이다. 이에 의해 HAT 의 생체내에서의 농도를 측정하거나 조직이나 세포에서의 HAT 의 분포를 조사할 수 있고, 그에 의해 염증성 질환이나 암 등의 진단을 행할 수 있다. 또, HAT 활성을 중화하는 항체, 및 HAT 의 활성화를 저해하는 항체를 취득하는 것도 본 발명의 과제이다. HAT 활성을 중화하는 항체 또는 HAT 의 활성화를 저해하는 항체는 HAT 가 갖는 응고ㆍ선용계(線溶系)에서의 작용, 기도 리모델링으로의 작용, 기도 염증으로의 작용, 암의 증식이나 전이에 관한 작용, 점액 섬모운동에 대한 작용, 항바이러스 감염작용 등의 생리작용을 억제 또는 수식하고, 병태의 개선 또는 치료에 사용할 수 있다. 그리고, 만성 기도 염증 (COPD, 천식), 응고선용이상, 암 등의 질환을 위한 새로운 치료약, 진단약이 되는 것이다.

본 발명자들은 HAT 에 결합하는 모노클로날 항체 및 폴리클로날 항체를 취득하고, 그것을 사용하여 생체내의 HAT 를 검출하는 것에 성공하였다. 또한, 취득한 항체에 HAT 중화활성을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 인간 기도 트립신형 효소와 결합하는 항체이다. 본 발명에는 그것을 사용한 효소면역측정법에 의해 생체내의 천연 인간 기도 트립신형 효소를 측정할 수 있는 항체나, 그것을 사용한 웨스턴 블로팅법에 의해 생체내의 천연 인간 기도 트립신형 효소를 검출할 수 있는 항체가 포함된다. 또, 본 발명은 그 에피토프가 인간 기도 트립신형 효소의 아미노산 서열의 187 번째에서 418 번째 사이에 존재하는 항체이다.

여기에서, 「인간 기도 트립신형 효소」란, 일본 공개특허공보 평8-89246 호에 개시되어 있는 인간 기도 트립신형 효소의 cDNA 서열의 일부 또는 전부를 포함하는 단백질을 말한다. 또, 인간 기도 트립신형 효소 아미노산 서열번호는 Yamaoka K. et al., J. Biol. Chem., 273(19), 11895-11901, 1998 에 개시되어 있는 아미노산 서열번호에 따르고 있다.

또한, 본 발명은 인간 기도 트립신형 효소와 결합하는 항체를 사용하여 인간 기도 트립신형 효소를 검출 또는 측정하는 방법, 및 동 항체를 사용한 인간 기도 트립신형 효소의 효소면역측정법이다.

또, 본 발명은 인간 기도 트립신형 효소의 활성화를 저해하는 항체를 함유하는 치료약, 및 인간 기도 트립신형 효소 활성을 중화하는 항체를 함유하는 치료약이다.

또한, 본 발명은 인간 기도 트립신형 효소와 결합하는 항체를 생산하는 동물세포이다.

본 발명의 폴리클로날 항체는, 예컨대 이하에 서술하는 방법으로 취득할 수 있다. 즉, 항원단백질인 HAT 를 조제하기 위해서는 일본 공개특허공보 평7-067640 호 및 S. Yasuoka et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 16, p300-308, 1997 에 개시되어 있는 방법에 따라 객담중 등의 생체시료 또는 HAT 생산배양세포로부터 정제하여 취득하거나, 또는 일본 공개특허공보 평8-89246 호, US-5804410, EP-699763, 및 Yamaoka K. et al., J. Biol. Chem., 273(19), 11895-11901, 1998 에 개시되어 있는 방법에 따라 재조합 HAT 를 생산시켜 정제하면 된다.

다음으로, 정제 HAT 를 어쥬반트와 함께 동물에 복강내 주사 또는 피하 주사하는 것을 반복하여 동물에 면역응답을 일으킨다. 사용하는 동물로서는 포유류가 바람직하며, 토끼, 염소, 양, 모르모트, 햄스터, 래트 및 마우스 등이 보다 바람직하다. 가장 바람직하게는 토끼이다.

다음으로, 면역된 동물로부터 혈액을 채취하여 혈청성분을 분리하고, 통상법에 따라 프로테인 A 컬럼에 의해 IgG 를 정제하고, 항HAT 폴리클로날 항체를 취득할 수 있다.

본 발명의 모노클로날 항체는 예컨대 이하에 서술하는 방법으로 조제할 수 있다. 즉, 기본적으로는 Galfre 및 Milstein, Methods in Enzymology, 제 73 권, Academic Press, New York (1981) ; James W.Goding, Monoclonal Antibodies: inciples and Practice, Academic Press, Orlando, Florida (1986) ; Current Protocols in Molecular Biology, F.M.Ausubel 등 공편(共編), Wiley Interscience, New York (1987) 등에 기재되어 있는 방법이다.

모노클로날 항체를 조제하기 위해서는 항원 단백질을 정제하는 것이 좋다. 이 정제 단백질은 항체역가검정을 위해서도 사용된다. 본 발명의 모노클로날 항체의 조제시 사용한 재조합 HAT 의 발현방법 및 정제법은 일본 공개특허공보 평8-89246 호에 상세히 서술되어 있다.

다음으로, 정제 재조합 HAT 를 어쥬반트와 함께 동물에 복강내 주사 또는 피하 주사하는 것을 반복하여 동물에 면역응답을 일으킨다. 사용하는 동물로서는 포유류가 바람직하며, 래트 및 마우스가 보다 바람직하다. 가장 바람직하게는 balb/c 마우스이다.

이어서, 그 면역된 동물로부터 B 림프구를 인출하고, 상기 문헌에 기재된 방법으로 무한 증식능을 갖는 동물세포와 세포융합을 행한다. 이 융합의 상대로서 바람직한 세포주는 마우스의 골수종 세포로, P3-X63-Ag8-U1 미에로마 세포 (ATCC CRL1597) 가 특히 바람직하다.

세포융합 후에는 통상법에 따라 적당한 선택배지에서 배양을 계속하고, 생존한 세포 중에서 재조합 HAT 에 결합하는 항체를 생산하고 있는 세포주를 ELISA 법 등에 의해 선별한다. 또한, 얻어진 모노클로날 항체 생산세포에 대해 수회의 클로닝을 행하여 단클론성 및 항체생산능의 안정성이 있는 주(株)를 선별하는 것이 바람직하다. 클로닝법으로서는 한계희석법, 연(軟)아가로오스법, 및 셀소터를 사용한 선별법 등을 사용할 수 있다.

이렇게 하여 얻어진 재조합 HAT 에 대한 모노클로날 항체중에서 활성을 갖는 것을, 예컨대 이하의 방법으로 선별한다. 즉, 항마우스 IgG (Fc) 항체에 의해 항HAT 모노클로날 항체를 결합한 ELISA 용 96 웰 플레이트에 재조합 HAT 를 첨가하여 세정한 후, 형광기질을 반응시켜 HAT 활성을 측정함으로써 HAT 활성을 중화하는 항체를 스크리닝할 수 있다. 또, 항HAT 토끼 폴리클로날 항체를 효소 표지한 것을 2 차 항체로서 첨가함으로써 액상항원 반응성이 높은 항체를 스크리닝할 수 있다.

인간의 치료에 본 발명의 모노클로날 항체를 사용하는 경우에는 인간형 모노클로날 항체를 사용하는 것이 바람직하다. 인간형 모노클로날 항체에는 인간의 모노클로날 항체 외에, 소위 키메라 항체 즉 가변영역만 마우스 등의 동물 유래의 아미노산 서열로 이루어지고, 정상영역에는 인간의 아미노산 서열을 사용한 것도 포함된다. 이 외에, 소위 CDR 그래프팅 기술에 의한 모노클로날 항체 즉 상보성 결정영역만 동물 유래의 아미노산 서열로 이루어지고, 그 이외의 서열은 모두 인간 유래의 것인 것도 여기에서 말하는 인간형 모노클로날 항체에 포함된다.

이들 키메라 항체 또는 CDR 그래프팅 기술에 의한 모노클로날 항체는 현재의 유전자 재조합 기술에 의하면, 본 발명의 모노클로날 항체를 생산하는 마우스의 하이브리도마로부터 그것에 대응하는 유전자를 인출하여 인간 항체 유전자와 재조합, 동물세포에 도입하여 발현시킴으로써도 용이하게 제작할 수 있다. 예컨대, Int. J.Cancer, 44, 424-433 (1989), Pro Natl Acad Sci USA, 87, 8095-8099 (1990) 에 기재된 바와 같다. 또, 아미노산 서열을 바꾸지 않고 모노클로날 항체의 생산효율을 향상시킬 목적으로, 하이브리도마로부터 인출된 본 발명의 항체에 대응하는 유전자를 다른 동물세포에서 발현시키는 것도 가능하다. 본 발명의 모노클로날 항체에는 이들 유전자 재조합 기술에 의해 얻어지는 모노클로날 항체 및 그것을 생산하는 동물세포도 포함된다.

인간형 모노클로날 항체의 제작방법에는 상기 외에, 인간의 B 림프구를 인간 또는 마우스의 미에로마 또는 헤테로미에로마와 세포융합하는 방법도 있다. 인간의 미에로마와 세포융합하는 방법으로서는 예컨대 J. Immunol Methods, 61, 17-32 (1983) 에, 마우스의 미에로마와 세포융합하는 방법으로서는 예컨대 Proc Natl Acad Sci USA, 77, 6841-6845 (1980) 에, 헤테로미에로마와 세포융합하는 방법으로서는 예컨대 Proc Natl Acad Sci USA, 81, 3214 (1984) 등에 기재되어 있다. 이들 방법을 실시하는데 있어서는 인간의 B 림프구를 세포융합하기 전에 인 비트로 (in vitro)에서 자극해 두는 것이 좋다. 그 방법으로서는, 예컨대 BiochemBiophys Rec Commun, 135, 495 (1986) 에 기재된 방법에 따르면 된다.

이 외에, 인간 모노클로날 항체를 제작하는 방법으로서는 EB 바이러스에 의한 인간 B 림프구의 형질전환을 들 수 있다.

즉, 본 발명의 모노클로날 항체 및 폴리클로날 항체는 생체내 및 세포에 존재하는 HAT 를 검출 및 측정할 수 있는 항체, 또는 HAT 활성을 중화하는 항체, 또는 HAT 의 활성화를 저해하는 항체로, 어느 종류의 것인지, 어떠한 방법으로 제작되었는지 등은 문제되지 않는다. 당업자라면, 이러한 활성을 갖는 모노클로날 항체가 존재하는 것을 알면 종류를 바꾸는 것이나 제작방법을 바꾸는 것에 아무런 어려움은 없을 것이다.

본 발명의 모노클로날 항체 및 폴리클로날 항체는 HAT 를 검출 및 측정하는데 사용할 수 있다. 즉, ELISA 법 또는 RIA 법으로 알려진 면역화학적 측정수단에 의해 HAT 농도를 측정할 수 있다. 예컨대, 고상측에 항HAT 모노클로날 항체를 고정한 플레이트를 사용함으로써 HAT 를 고감도로 측정하는 것이 가능하게 된다. 또, 면역조직염색, 면역세포염색, 플로사이토메트리 등에 의한 HAT 의 검출 및 측정을 할 수도 있다.

또한, 본 발명의 모노클로날 항체 및 폴리클로날 항체를 사용하여 막과 결합하고 있는 HAT 를 측정할 수도 있다. 이 막 결합형 HAT 의 활성형의 것과 불활화형의 것을 구별하여 측정하는 것도 가능하다.

이하, 실시예에 의해 본 발명을 더욱 상세하게 설명하는데, 본 발명은 이에 의해 조금도 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1] HAT 의 조제

객담중으로부터의 천연 HAT 의 정제에 대해서는 일본 공개특허공보 평7-067640 호 및 S. Yasuoka et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 16, p300-308, 1997 에 개시되어 있는 방법에 따랐다. 또, 재조합 HAT 의 정제에 대해서는 일본 공개특허공보 평8-89246 호, US-5804410, EP-699763 및 Yamaoka K. et al., J. Biol. Chem., 273(19), 11895-11901, 1998 에 개시되어 있는 방법에 따라 행하였다. 즉, 곤충세포 (Tn-5 세포) 를 단층에서 5 ×10⁶개/㎖ 의 밀도까지 생육시키고, 배지를 제거한 후, 세포당 MOI = 0.2-0.5 가 되도록 재조합 HAT 발현 바큐로 바이러스 (#1B3) 를 포함하는 무혈청 배지를 첨가하여 감염시키고, 3 일간 배양하여 HAT 를 발현시켰다. 발현된 단백질의 확인은 SDS-PAGE 및 항HAT-N-19 펩티드 항체를 사용한 웨스턴 블롯법 (Anal.Biochem., 112, 195-203, 1981) 에 의해 행하였다. 원심분리 (약 500 ×g) 로 상청과 세포를 분리하고, 상청은 한외여과 (후지필터 필트론 미니세트 분획분자량 300 kDa) 에 의해 바이러스를 제거한 후, 50 mM 트리스 염산-50 mM 염화나트륨 완충액 (pH 8.0) 에 하룻밤 투석 또는 희석하였다. 세포는 50 mM 트리스 염산-500 mM 염화나트륨 완충액 (pH 8.0) 에 현탁하고, 종농도가 1 % 가 되도록 Triton X-100 을 첨가하고, 0 ℃ 로 60 분간 방치하여 세포를 용해시켰다. 세포 잔사를 원심분리한 후, 50 mM 트리스 염산-500 mM 염화나트륨 완충액 (pH 8.0) 에 하룻밤 투석 또는 희석하였다. 이들 용액을 50 mM 트리스 염산-500 mM 염화나트륨 완충액 (pH 8.0) 으로 평형화한 벤자미딘 어피니티 컬럼 (pharmacia 사 제조) 에 로드하고, 동 완충액으로 세정한 후, 10 mM 염산-500 mM 염화나트륨 용액 (pH 2.0) 으로 용출시켰다. 각 분획에 대하여 실시예 5 (1) 에 나타낸 방법에 의해 트립신형 효소 활성을 측정검출하였다. 메인피크를 모아 SDS-PAGE 를 행하여 분자량 약 28 kDa 의 단백질을 검출하고, 항트립신형 효소 펩티드 항체를 사용한 웨스턴 블롯법에 의해 이 28 kDa 단백질이 트립신형 효소인 것을 확인하였다 (일본 공개특허공보 평8-89246 호, US-5804410, EP-699763, 및 Yamaoka K. et al., J. Biol. Chem., 273(19), 11895-11901, 1998 참조).

[실시예 2] 항HAT 폴리클로날 항체의 취득

(1) 항펩티드 항체의 취득

성숙 HAT 의 1 에서 19 잔기까지의 서열의 N 말단에 시스테인을 갖는 20 잔기의 펩티드 (서열번호 1)를 펩티드 합성기 (Applide Biosystems Model 431A) 로 화학합성하였다. 이 합성 펩티드를 10 mM 인산완충액 (pH 7.5) 에 용해시키고 (10 ㎎/㎖), 10㎎ 의 말레이미드 활성화 헤모시아닌 (Boehringer Mannheim Biochemica 사 제조) 과 25 ℃ 에서 2 시간 배양한 후, 반응용액을 10 mM 인산완충액 (pH 7.5) 에 대하여 투석하였다. 헤모시아닌에 결합시킨 펩티드를 집토끼의 피하에 투여 (0.5 ㎎/1 회) 하였다. 투여는 2 주 간격으로 6 회 반복하였다. 전체 피를 채취, 혈청을 조제한 후, 프로테인 A 세파로스 4B 컬럼 (Pharmacia 사 제조) 으로 정제하여 항HAT 폴리클로날 항체 (anti-N19 PAb) 를 얻었다.

(2) 항재조합 HAT 항체의 취득

실시예 1 에서 조제한 재조합 HAT (40 ㎍/1 회) 를 프로인드의 완전 어쥬반트 (BACTO 사 제조, 1:1) 와 함께 2 주마다 집토끼에 피내 투여하였다. 이것을 4 회 행한 후, 전체 피를 채취하여 항혈청을 얻었다. 이 혈청으로부터 통상법에 따라 프로테인 A 세파로스 4B 컬럼 (Pharmacia 사 제조) 으로 IgG 를 정제하고, 항HAT 폴리클로날 항체 (anti-rHAT PAb) 를 얻었다.

[실시예 3] 항HAT 모노클로날 항체의 제작

(1) 재조합 HAT 에 의한 마우스의 면역

실시예 1 에서 조제한 재조합 HAT 10-20 ㎍/회/head 를 프로인드의 완전 어쥬반트 (BACTO 사 제조, 1:1) 와 함께 2 주마다 Balb/c 마우스 (7 주령, 수컷) 에 복강내 투여하였다. 이것을 4 회 행한 후, 5 회째는 세포융합의 3 일전에 재조합 HAT 용액 50 ㎍ 을 정맥내 투여하였다.

마우스의 꼬리 정맥으로부터 채혈하고, 37 ℃ 에서 30 분간 배양한 후, 3000 rpm 으로 10 분간 원심하여 혈청을 회수하고, 마우스 혈청중의 항HAT 항체가를 ELISA 에 의해 측정하였다. 이하에 그 방법을 서술한다.

96 웰 ELISA 플레이트 (Falcon3912, Becton Dickinson 사) 에 0.05 M Na₂CO₃완충액 (pH 10.5) 으로 1 ㎍/㎖ 로 희석한 재조합 HAT 를 50 ㎕ 첨가하고, 4 ℃ 에서 하룻밤 반응시켰다. 0.05 % Tween 20 을 포함하는 PBS 로 3 회 세정한 후, 3 % 소 혈청 알부민 (BSA) 을 포함하는 PBS 로 실온에서 1 시간 처리하였다. 0.05 % Tween 20 을 포함하는 PBS 로 3 회 세정한 후, 검체를 50 ㎕ 첨가하여 실온에서 1 시간 반응시켰다. 0.05 % Tween 20 을 포함하는 PBS 로 3 회 세정한 후, 3 % BSA 를 포함하는 PBS 로 1000 배로 희석한 알칼리 포스파타아제 결합 염소 항마우스 IgG 항체 (ZYMED 사) 를 50 ㎕ 첨가하여 실온에서 1 시간 반응시켰다. 0.05 % Tween 20을 포함하는 PBS로 3 회 세정한 후, PNPP (p-Nitrophenylphosphate, 와꼬준야꾸) 를 실온에서 1 시간 반응시켜 405 ㎚ 에서의 흡광도를 측정하였다.

(2) 세포융합에 의한 하이브리도마의 제작

세포융합 직전에 마우스를 죽이고, 비장세포를 PBS 중에서 균질화시키고, 잔사를 나일론 메시로 여과한 후, PBS 로 원심세정을 1 회 행하였다. 이 비장세포와 마우스 미에로마 (P3X63Ag8U.1)를 통상법 (Kohler, Milstein ; Nature, 256, 495-497 (1975)) 에 따라 세포융합하였다.

즉, 비장세포 5 ×10⁷개와 마우스 미에로마 세포 P3 ×63Ag8U.1 (P3U1) 5 ×10⁶개를 RPMI 1640 배지에서 세정한 후, 1500 rpm 으로 5 분간 원심하여 세포 펠릿으로 하였다. 35 % 폴리에틸렌글리콜액 (RPMI 1640 배지 5.75 ㎖ + 폴리에틸렌글리콜 3.5 ㎖ + 디메틸술폭시드 0.75 ㎖) 을 2 분간 1 ㎖ 첨가하고, 세포를 천천히 부유시켰다. RPMI 1640 배지를 2 분간 1 ㎖ 첨가한 후, 추가로 2 분간 2 ㎖ 첨가하였다. 다음으로, GIT-HAT 배지 (95 μM 히폭산틴, 0.4 μM 아미노프테린, 1.6 μM 티미딘, 및 5 % FCS 를 포함하는 GIT 배지) 를 2 분간 4 ㎖ 첨가한 후, 추가로 2 분간 8 ㎖ 첨가하였다. 37 ℃ 에서 30 분간 배양한 후, 각 웰당약 10⁴개의 마우스 복강침출세포를 뿌린 96 웰 평저(平底) 플레이트 1 장에 분주하고, 5 % CO₂존재하에서 37 ℃ 에서 배양하였다.

1 주 후에 GIT-HT 배지 (GIT-HAT 배지로부터 아미노프테린을 제거한 배지) 에서 배지를 절반량 교환하고, 또한 5 % CO₂존재하, 37 ℃ 에서 약 1 주간 배양함으로써 각 웰당 수개의 하이브리도마의 콜로니가 얻어졌다.

(3) 하이브리도마의 스크리닝

2 주 후에 재조합 HAT 를 피복한 플레이트에 의한 스크리닝을 행하였다. 재조합 HAT 의 50 mM Na₂CO₃완충액 (pH 10.5) 용액 (1 ㎍/㎖) 을 96 웰 플레이트 (Falcon 사, PVC 제조) 에 각 웰당 50 ㎕ 씩 분주하고, 4 ℃ 에서 하룻밤 방치하였다. 세정한 후, 3 % BSA/PBS 를 각 웰당 200 ㎕ 첨가하여 37 ℃ 에서 1 시간 블로킹하였다. 다시 세정한 후, 각 웰당 50 ㎕ 의 배양상청을 첨가하여 실온에서 1 시간 방치하고, 0.05 % Tween/PBS 로 3 회 세정하였다.

다음으로, 3 % BSA 및 0.2 % 탈지유를 포함하는 PBS 로 2000 배로 희석한 염소 항마우스 IgG-알칼리 포스파타아제 컨쥬게이트 (Tago 사) 를 웰당 50 ㎕ 첨가하여 실온에서 1 시간 방치하였다. 다시 세정하고, 0.25 mM 의 염화마그네슘을 포함하는 1M 디에탄올아민 완충액 (pH 9.8) 에 용해시킨 p-니트로페닐포스페이트 이나트륨염 (와꼬준야꾸) 의 1 ㎎/㎖ 용액을 웰당 100 ㎕ 첨가하여 실온에서 30 분간 반응시켰다. 이 405 ㎚ 에서의 흡광도를 96 웰 플레이트용 ELISA 리더 측정기 (Molecular Davice 사 Vmax) 를 사용하여 조사하고, 재조합 HAT 와 결합하는 모노클로날 항체를 분비하는 하이브리도마를 선택하였다.

(4) 하이브리도마의 클로닝

이와 같이 선택한 하이브리도마에 대하여 한계희석법에 의한 클로닝을 2 회 행하여 주화(株化)하였다. 구체적으로는 마우스 복강침출세포를 HT 배지중 10⁶개/㎖ 의 비율로 조제한 것을 각 웰에 분주하고, 이것에 웰당 0.5 개의 비율로 HT 배지에 현탁한 하이브리도마 세포를 뿌렸다. 5 % CO₂의 CO₂배양기 내에서 37 ℃ 에서 2 주간 배양하고, 그 배양상청에 대하여 상기 ELISA 법으로 스크리닝하여 단일 콜로니를 픽업함으로써 주화하였다.

(5) 하이브리도마의 배양 및 항체 정제

이상의 조작으로 얻어진 항HAT 항체를 생산하는 하이브리도마 20 클론 중 6 클론을 인슐린, 트랜스페린, 에탄올아민, 셀레나이트를 포함하는 무혈청 배지인 eRDF 배지 (Gibco BRL 사) 에 적응시켜 배양하고, 배양상청을 회수하였다. 배양상청중의 항체를 프로테인 G 컬럼으로 통상법에 의해 정제하였다.

(6) HAT 모노클로날 항체의 서브타이핑

상기 (5) 의 조작으로 얻어진 정제 항HAT 모노클로날 항체 6 클론에 관하여, 베링거사 제조의 IsoStrip (마우스 모노클로날 항체의 Isotyping Kit) 을 사용하여 서브타이핑을 행하였다. 그 결과, #A3, #B3, #B5 의 3 클론이 IgG1 이고, #A6, #C2 가 IgM 인 것이 판명되었다. #C3 에 관해서는 불명확했다.

[실시예 4] 항HAT 항체에 의한 웨스턴 블로팅

재조합 HAT 또는 천연 HAT 를 환원조건하, SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분획한 후, 니트로셀룰로오스막 (BIO-RAD 사) 에 웨스턴 블로팅하였다. 3 % BSA 를 포함하는 PBS 로 실온에서 하룻밤 처리한 후, 3 % BSA 를 포함하는 PBS 로 10 ㎍/㎖ 로 희석한 [실시예 2, 3] 에서 얻어진 항HAT 항체와 실온에서 1 시간 반응시켰다. 니트로셀룰로오스막을 1 % BSA 를 포함하는 PBS 로 6 회 세정한 후, 3 % BSA 를 포함하는 PBS 로 25 ㎍/㎖ 로 희석한 알칼리 포스파타아제 결합 염소 항인간 IgG 항체 (TAGO 사) 와 실온에서 1 시간 반응시켰다. 니트로셀룰로오스막을 1 % BSA 를 포함하는 PBS 로 6 회 세정한 후, NBT (Nitro-Blue Tetrazolium Chloride)/BICP (5-Bromo-4-Chloro-3'-Indolyphosphate p-Toluidine Salt, PIERCE 사) 로 실온에서 10 분간 반응시켜 발색시킨 결과, 각각의 항HAT 항체가 재조합 HAT 와 결합하는 것이 나타났다. 웨스턴 블로팅의 반응성은 모노클로날 항체에서는 #A3 및 #B5 의 반응성이 높고, #B3 의 반응성은 매우 낮았다. 또, 폴리클로날 항체에서는 항N-19 항체 (anti-N19 PAb) 가 반응성이 높고, 항rHAT 항체 (anti-rHAT PAb) 는 반응성이 낮았다. 또한, anti-rHAT PAb 는 마스트셀 유래 트립타아제 및 트립신과는 교차반응성을 나타내지 않았다. 그리고, 네거티브 컨트롤로서는 정상 토끼 IgG 를 사용하였다.

[실시예 5] HAT 중화활성의 평가

(1) HAT 활성의 측정방법

트립신용 합성기질 Boc-Phe-Ser-Arg-MCA (MCA : Methylcoumarin amide) 를 100 μM, BSA 를 0.01 % 함유하는 50 mM Tris-HCl 완충액 (pH 8.6) 1.0 ㎖ 에 대하여 HAT 함유 용액을 50 ㎕ 첨가하여 37 ℃ 에서 1 시간 배양하였다. 이어서, 1 ㎖ 의 30 % 아세트산을 첨가하고, 생성된 7-아미노-4-메틸쿠마린 (AMC) 량을 형광측정에 의해 정량하여 (형광 460 ㎚, 여기광 380 ㎚) 효소의 활성을 산출하였다. 1 분간 1 pM 의 AMC 를 생성시키는 활성을 1 단위로 정의한다 (1 단위 = 1 pM AMC/분).

(2) 항HAT 항체의 HAT 중화활성의 평가

재조합 HAT 를 2 ng/㎖, BSA 를 0.01 % 함유하는 50 mM Tris-HCl 완충액 (pH 8.6) 0.5 ㎖ 에 대하여 항HAT 항체 함유 용액을 50 ㎕ 첨가하여 37 ℃ 에서 30 분간 배양하였다. 그 후, 트립신용 합성기질 Boc-Phe-Ser-Arg-MCA 를 200 μM 함유하는 50 mM Tris-HCl 완충액 (pH 8.6) 0.5 ㎖ 를 첨가하여 37 ℃ 에서 1 시간 배양하였다. 이어서 1 ㎖ 의 30 % 아세트산을 첨가하고, 생성된 7-아미노-4-메틸쿠마린 (AMC) 량을 형광측정에 의해 측정하고 (형광 460 ㎚, 여기광 380 ㎚), 항HAT 항체의 효소 활성 중화능을 평가하였다. 결과를 도 1 에 나타낸다. 실시예 2 에서 취득한 재조합 HAT (곤충세포-바큐로 바이러스계) 를 면역하여 얻어진 항HAT 폴리클로날 항체에 236 ㎍/㎖ 의 농도로 27 % 의 활성저해효과가 확인되었다.

[실시예 6] HAT 측정계의 구축

1. 폴리클로날 항체에 의한 샌드위치 EIA (Enzyme Immunoassay) 의 구축

실시예 2 (B) 에서 얻어진 항HAT 폴리클로날 항체 (anti-rHAT PAb) 를 사용하여 이하의 조작을 행하고, 샌드위치 EIA 계를 구축하였다.

(A) 호스라디쉬ㆍ퍼옥시다아제 (HRP) 표지항체의 조제

(1) 항체 (F(ab')₂) 의 조제 ;

항체 (IgG) 를 2.0 ㎎/㎖ 포함하는 PBS 용액 1 ㎖ 에 1 M 의 아세트산 완충액 (pH 4.2) 100 ㎕ 와, 40 ㎍ 의 펩신을 20 ㎕ 의 동 완충액에 용해시킨 것을 첨가하여 37 ℃ 에서 4 시간 반응시켰다. 반응종료후, PBS 로 평형화한 세파덱스 G25 컬럼 (ø2 ㎝ ×45 ㎝) 을 사용하여 분리하고, F(ab')₂를 채취하였다.

(2) 항체 (F(ab')₂) 의 HRP 표지

항체 (F(ab')₂) 를 1 ㎎/㎖ 포함하는 0.01 M 인산, 0.15 M NaCl (pH 7.4) 용액 2 ㎖ 에 N-(m-말레이미드벤조산)-N-숙신이미드에스테르 (MBS) 의 10 ㎎/㎖ 디메틸포름아미드 용액 50 ㎕ 를 첨가하여 25 ℃ 에서 30 분간 반응시켰다. 이어서 세파덱스 G-25 를 충전한 컬럼을 사용하여 0.1 M 인산완충액 (pH 6.0) 으로 겔 여과하고, 말레이미드화 항체와 미반응 MBS 를 분리하였다. 한편, HRP 의 10 ㎎/㎖ 의 0.1 M 인산완충액 (pH 6.5) 용액 2 ㎖ 에 S-아세틸메르캅토 무수 숙신산의 60 ㎎/㎖ 디메틸포름아미드 용액 120 ㎕ 를 첨가하여 25 ℃ 에서 2 시간 반응시켰다. 다음으로, 0.1 M 트리스-염산완충액 (pH 7.0) 을 800 ㎕, 0.1 M EDTA 를 160 ㎕, 1 M 히드록실아민을 1.6 ㎖ 첨가하여 0 ℃ 에서 4 분간 반응시켰다. 그 후, 반응액을 콜로디온 백에 넣고, 0.1 M 인산완충액 (pH 6.0), 5 mM EDTA 함유 용액을 사용하여 4 ℃ 에서 3 일간 투석하여 티올화 HRP 를 얻었다.

다음으로, 말레이미드화 항체 2 ㎎ 과 티올화 HRP 4 ㎎ 을 혼합하고, 콜로디온 백을 사용하여 빙냉하에 4-10 ㎎/㎖ 의 단백질농도가 될때까지 농축하고, 15-20 ℃ 에서 하룻밤 방치하였다. 그 액을 울토로 겔 AcA44 (pharmacia LKB 사 제조) 를 충전한 컬럼으로 겔 여과하고, 항HAT (F(ab')₂) HRP 표지항체를 얻었다.

(B) 항체 고정화 플레이트의 조제

96 웰 플레이트 (스미또모베이크라이트사 제조, MS-3796F/카르보플레이트) 를 잘 세정하고나서, 항체의 20 ㎍/㎖ PBS 용액중에 4 ℃ 에서 하루종일 방치한 후, PBS 로 세정하고, 1 % 소 혈청 알부민 (BSA) 의 PBS 용액중에 4 ℃ 에서 하루종일 방치하여 항체 고정화 플레이트를 얻었다.

(C) 측정계의 구성

상기 (B) 에서 조제한 항HAT 항체 IgG 고정화 플레이트에 정제한 재조합 HAT (표준물질) 를 0-1600 ng/㎖ 의 범위로 포함하는 1 % BSA-0.1 % 탈지유 함유 10 mM PBS (pH 7.2) 용액 (검체 희석액) 100 ㎕ 를 첨가하고, 25 ℃ 에서 4 시간 배양하였다. 그 후, 0.05 % Tween 20 함유 10 mM PBS (pH 7.2) 에 의해 세정하고, 상기 (A) 에서 작성한 항HAT (F(ab')₂) HRP 표지항체 (500 ㎍/㎖) 의 1 % BSA 함유 10 mM PBS (pH 7.2) 100 배 희석용액을 100 ㎕ 씩 각각의 웰에 첨가하고, 25 ℃ 에서 2 시간 배양하였다. 다음으로, 각 웰내의 용액을 흡인제거한 후, 0.05 % Tween 20 함유 10 mM PBS (pH 7.2) 에 의해 세정하고, 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 염산염, 0.02 % H₂O₂2.5 mM 을 함유하는 0.1 M 인산/시트르산 완충액 (pH 4.3) 을 100 ㎕ 씩 각 웰에 첨가하고, 25 ℃ 에서 30 분간 반응시킨 후, 반응정지제로서 0.5 M황산수용액을 100 ㎕ 씩 첨가하여 효소반응을 정지시켰다. 이어서, 분광광도계를 사용하여 파장 450 ㎚ 에서의 이 용액의 흡수강도를 측정하고, 이것을 표준물질 농도 0-1600 ng/㎖ 에 대응하여 블롯하였다. 결과를 도 2 에 나타낸다.

(D) 생체내 성분중의 HAT 의 검출

(1) 타액중의 HAT 의 검출

상기 (C) 의 측정계를 사용하여 인간 타액중의 HAT 를 측정하였다. 인간으로부터 채취한 타액을 15000 rpm 으로 15 분간 원심한 상청을 측정 샘플로 하였다. 원액 그대로의 것과 1 % BSA-0.1 % 탈지유 함유 10 mM PBS (pH 7.2) 용액 (검체 희석액) 으로 16 배 희석한 것 합계 6 검체에 대하여 측정하였다. 3 검체에 관해서는 측정값이 낮으므로 원액의 값을 채택하고, 다른 3 검체에 대해서는 16 배 희석한 값을 채택하여 타액중의 HAT 농도로 하였다. 측정결과를 검체중의 HAT 활성 (트립신 기질 분해활성) 과 함께 표 1 에 나타낸다.

	HAT (ng/㎖)
타액 검체	ELISA	HAT 활성 환산*
KM123	1616	3333
KY123	24	120
KT123	22	518
HO123	720	1772
KY112	25	208
HO112	784	2349
* 재조합 HAT 환산 트립신형 효소 활성

(2) 객담중의 HAT 의 검출

객담을 만성 기도 염증 환자로부터 채취하고, 9 배량의 생리식염수로 희석한 후 균질화시키고, 10,000 ×g 으로 10 분간 원심한 상청을 측정검체로 하였다.검체를 20 배 희석하여 측정한 결과를 도 3 에 나타낸다. 여기에서, 점액성-점액 고름성 가래는 이하의 환자로부터 채취하였다.

CB ; 만성 기관지염

SecCB ; 속발(續發)성 기관지염

BA ; 기관지 천식

BE ; 기관지 확장증

DPB ; 미만성(彌漫性) 범세기관지(汎細氣管支)염

또, 고름성 가래는 이하의 환자로부터 채취하였다.

BE ; 기관지 확장증

DPB ; 미만성 범세기관지염

그리고, 도 3 중, M 은 점액성 가래를, P 는 점액 고름성 가래를 나타낸다.

고름성 가래가 점액성 가래보다 낮은 측정값을 나타내고 있다.

2. 모노클로날 항체 및 폴리클로날 항체에 의한 샌드위치 EIA 의 구축

(1) 각 항HAT 모노클로날 항체의 액상항원 반응성의 평가

서브타이핑에 의해 IgG1 타입이었던 #A3, #B3, #B5 3 종류의 항HAT 모노클로날 항체에 대하여 액상중의 재조합 HAT 에 대한 결합성의 평가를 하였다.

평가방법은 실시예 6 의 1. (B) (C) 에 준하여 행하였다. 즉, 96 웰 플레이트에 각 항HAT 모노클로날 항체의 1 또는 5 ㎍/㎖ PBS 용액을 50 ㎕/웰로 첨가하고, 4 ℃ 에서 하룻밤 정치하여 플레이트에 항체를 고정화하였다.

조제한 항HAT 모노클로날 항체 고정화 플레이트에 정제한 재조합 HAT (표준물질) 를 0-300 ng/㎖ 의 범위로 함유하는 1 % BSA-0.1 % 탈지유 함유 10 mM PBS (pH 7.2) 용액 (검체 희석액) 100 ㎕ 를 첨가하여 25 ℃ 에서 4 시간 배양하였다. 그 후, 0.05 % Tween 20 함유 10 mM PBS (pH 7.2) 에 의해 세정하고, (A) 에서 작성한 HRP 표지항체 (500 ㎍/㎖) 의 1 % BSA 함유 10 mM PBS (pH 7.2) 100 배 희석용액을 100 ㎕ 씩 각각의 웰에 첨가하여 25 ℃ 에서 2 시간 배양하였다. 다음으로, 각 웰내의 용액을 흡인제거한 후, 0.05 % Tween 20 함유 10 mM PBS (pH 7.2) 에 의해 세정하고, 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 염산염, 0.02 % H₂O₂2.5 mM 을 함유하는 0.1 M 인산/시트르산 완충액 (ph 4.3) 을 100 ㎕ 씩 각 웰에 첨가하여 25 ℃ 에서 30 분간 반응시킨 후, 반응정지제로서 0.5 M 황산수용액을 100 ㎕ 씩 첨가하여 효소반응을 정지시켰다. 이어서, 분광광도계를 사용하여 450 ㎚ 파장에서의 이 용액의 흡수강도를 측정하고, 이것을 표준물질 농도 0-300 ng/㎖ 에 대응하여 블롯하였다. 그 결과, #B3 > #B5 > #A3 의 순서로 액상항원 반응성이 높은 것이 명확해졌다. 결과를 도 4 에 나타낸다.

(2) 측정계의 구축

(A) 비오틴화 항체의 제작

상기 (1) 의 평가결과에서 가장 액상항원 반응성이 높았던 #B3 항HAT 모노클로날 항체 및 실시예 2(B) 에서 얻어진 항HAT 폴리클로날 항체 (anti-rHAT PAb) 를 사용하여 IgG 의 비오틴화를 이하와 같이 행하였다. 1-3 ㎎/㎖ 의 IgG 용액 (PBS(-)) 1 ㎖ 와, 등량의 0.2 M NaHCO₃(pH 8.0) 을 혼합하고, 다음으로 100 배의몰 농도의 비오틴화 시약 10 mM 을 첨가하여 37 ℃ 에서 1 시간 배양하였다. 비오틴화 시약은 NHS-LC-Biotin (PIERCE 사 제조 #21335 : 분자량 556) 을 디메틸포름아미드로 10 mM 에 용해시켜 사용하였다. 그 후, 10 분의 1 양의 1 M 모노에탄올아민을 첨가하고, 추가로 37 ℃ 에서 1 시간 배양하였다. 이 반응액을 PBS(-) 로 2.5 ㎖ 로 메스업하고, G-25 겔 여과 컬럼에 적용하고, PBS(-) 로 유출시켜 비오틴화 IgG 를 회수하였다. 또한, 최종농도 3 % 의 BSA 와 최종농도 0.1 % 의 NaN₃을 첨가하여 보존하였다.

(B) 항체 고정화 플레이트의 조제

96 웰 플레이트 (스미또모베이크라이트사 제조, MS-3796F/카르보플레이트) 를 잘 세정하고, 항체 (#B3 및 anti-rHAT PAb) 의 20 ㎍/㎖ PBS 용액을 100 ㎕ 씩 각 웰에 첨가하여 4 ℃ 의 온도에서 하루종일 방치하였다. 이것을 PBS-0.05 % Tween 20 으로 세정하고, 1 % 소 혈청 알부민 (BSA) 의 PBS 용액을 380 ㎕ 각 웰에 첨가하여 4 ℃ 에서 하루종일 방치하여 항체 고정화 플레이트를 얻었다.

(C) 측정계의 구축

상기 (B) 에서 조제한 항HAT IgG 고정화 플레이트에 정제한 재조합 HAT (표준물질) 를 0-400 ng/㎖ 의 범위로 함유하는 1 % BSA-0.1 % 탈지유 함유 10 mM PBS (pH 7.2) 용액 (검체 희석액) 50 ㎕ 및 상기 (A) 에서 제작한 비오틴화 IgG 를 10 ㎍/㎖ 함유하는 1 % BSA-0.1 % 탈지유 함유 10 mM PBS (pH 7.2) 용액을 50 ㎕ 첨가하고, 4 ℃ 에서 하룻밤 정치하였다. 다음으로, 플레이트를 세정한 후, 100㎕/웰로 스트렙토아비딘 표지 퍼옥시다아제 (TAGO 사 제조, #SNN1004) 를 1 만배 희석한 1 % BSA-0.1 % 탈지유 함유 10 mM PBS (pH 7.2) 용액을 첨가하여 25 ℃ 에서 1 시간 배양하였다. 다음으로, 각 웰내의 용액을 흡인제거한 후, 0.05 % Tween 20 함유 10 mM PBS (pH 7.2) 로 세정하고, 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 염산염, 0.02 % H₂O₂2.5 mM 을 함유하는 0.1 M 인산/시트르산 완충액 (pH 4.3) 을 100 ㎕ 씩 각 웰에 첨가하여 25 ℃ 에서 15 분간 반응시킨 후, 반응정지제로서 0.5 M 황산수용액을 100 ㎕ 씩 첨가하여 효소반응을 정지시켰다. 이어서, 분광광도계를 사용하여 450 ㎚ 파장에서의 이 용액의 흡수강도를 측정하고, 이것을 표준물질 농도 0-200 ng/㎖ 에 대응하여 블롯하였다. 결과를 도 5 에 나타낸다.

본 발명의 모노클로날 항체 및 폴리클로날 항체를 치료약으로서 사용함으로써 HAT 의 응고ㆍ선용계에서의 작용, 기도 리모델링으로의 작용, 기도 염증으로의 작용, 암의 증식이나 전이에 관한 작용, 점액 섬모운동에 대한 작용, 항바이러스 감염작용 등의 생리작용을 억제 또는 수식하고, 병태의 개선이나 치료에 사용할 수 있다.

또, 본 발명의 모노클로날 항체 및 폴리클로날 항체를 사용한 진단약에 의하면, 예컨대 타액중, 객담중 및 혈중의 HAT 농도를 측정할 수 있다.

Claims

인간 기도 트립신형 효소와 결합하는 항체.
제 1 항에 있어서, 항체가 모노클로날 항체인 항체.
제 2 항에 있어서, 항체가 마우스 모노클로날 항체인 항체.
제 3 항에 있어서, 항체가 마우스 IgG 모노클로날 항체인 항체.
제 3 항에 있어서, 항체가 마우스 IgM 모노클로날 항체인 항체.
제 1 항에 있어서, 항체가 폴리클로날 항체인 항체.
제 6 항에 있어서, 항체가 토끼 폴리클로날 항체인 항체.
인간 기도 트립신형 효소의 부분 펩티드를 면역하여 얻어진 항체.
인간 기도 트립신형 효소의 성숙부분의 N 말단측 1 에서 19 잔기의 일부 또는 전체를 포함하는 부분 펩티드를 면역하여 얻어진 항체.
제 8 항 또는 제 9 항에 있어서, 항체가 폴리클로날 항체인 항체.
제 10 항에 있어서, 항체가 토끼 폴리클로날 항체인 항체.
제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 그것을 사용한 효소면역측정법에 의해 생체내의 천연 인간 기도 트립신형 효소를 측정할 수 있는 항체.
제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 그것을 사용한 웨스턴 블로팅법에 의해 생체내의 천연 인간 기도 트립신형 효소를 검출할 수 있는 항체.
제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 기도 트립신형 효소의 활성화를 저해하는 항체.
제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 기도 트립신형 효소 활성을 중화하는 항체.
제 3 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 에피토프가 인간 기도 트립신형 효소의 아미노산 서열의 187 번에서 418 번 사이에 존재하는 항체.
제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 면역원이 재조합 인간 기도 트립신형 효소인 항체.
제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 기재된 항체를 사용하여 인간 기도 트립신형 효소를 검출 또는 측정하는 방법.
제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 기재된 항체를 사용한 인간 기도 트립신형 효소의 효소면역측정법.
제 14 항에 기재된 항체를 함유하는 치료약.
제 15 항에 기재된 항체를 함유하는 치료약.
제 2 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 기재된 항체를 생산하는 동물세포.
제 2 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 기재된 항체를 생산하는 하이브리도마 세포 또는 하이브리도마 세포로부터 유도된 동물세포.