KR20010085974A - 신규 ｇ 단백질 공액형 리셉터 단백질, 그 ｄｎａ 및 그에대한 리간드 - Google Patents

신규 ｇ 단백질 공액형 리셉터 단백질, 그 ｄｎａ 및 그에대한 리간드 Download PDF

Info

Publication number
KR20010085974A
KR20010085974A KR1020017005344A KR20017005344A KR20010085974A KR 20010085974 A KR20010085974 A KR 20010085974A KR 1020017005344 A KR1020017005344 A KR 1020017005344A KR 20017005344 A KR20017005344 A KR 20017005344A KR 20010085974 A KR20010085974 A KR 20010085974A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
protein
present
receptor protein
ligand
salt
Prior art date
Application number
KR1020017005344A
Other languages
English (en)
Inventor
타쿠야 와타나베
야스코 테라오
야스시 신타니
테츠야 오타키
키미코 카네하시
치에코 키타다
Original Assignee
다케다 야쿠힌 고교 가부시키가이샤
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 다케다 야쿠힌 고교 가부시키가이샤 filed Critical 다케다 야쿠힌 고교 가부시키가이샤
Publication of KR20010085974A publication Critical patent/KR20010085974A/ko

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/566—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using specific carrier or receptor proteins as ligand binding reagents where possible specific carrier or receptor proteins are classified with their target compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/06—Antiabortive agents; Labour repressants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/72—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants for hormones
    • G01N2333/726—G protein coupled receptor, e.g. TSHR-thyrotropin-receptor, LH/hCG receptor, FSH
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/02—Screening involving studying the effect of compounds C on the interaction between interacting molecules A and B (e.g. A = enzyme and B = substrate for A, or A = receptor and B = ligand for the receptor)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

래트 뇌간 주변부 및 인체 뇌 유래의 신규 G 단백질 공액형 리셉터 단백질 또는 그 염 및 그 리간드, G 단백질 공액형 리셉터 단백질에 대한 리간드의 결합성을 변화시킬 수 있는 화합물의 스크리닝 방법/키트, 상기 스크리닝에 의해 수득된 화합물 또는 그 염, G 단백질 공액형 리셉터 단백질에 대한 항체 등.

Description

신규 Ｇ 단백질 공액형 리셉터 단백질, 그 ＤＮＡ 및 그에 대한 리간드 {NOVEL G PROTEIN-COUPLED RECEPTOR PROTEINS, DNAS THEREOF AND LIGANDS TO THE SAME}
대부분 호르몬이나 신경전달물질 등의 생리활성물질은 세포막에 존재하는 특이적인 리셉터 단백질을 통해 생체 기능을 조절하고 있다. 이들 리셉터 단백질 중 대부분은 공액되어 있는 구아닌 누클레오티드-결합 단백질 (이하 G 단백질이라고 한다) 의 활성화를 통해 세포 내의 시그널 전달을 하면서 또한 7개의 막 관통영역을 갖는 공통된 구조를 갖고 있어 G 단백질 공액형 리셉터 단백질 또는 7회 막 관통형 리셉터 단백질 (7TMR) 로 총칭된다.
G 단백질 공액형 리셉터 단백질은 생체 세포나 장기의 각 기능 세포 표면에 존재하고 이들 세포나 장기 기능을 조절하는 분자, 예컨대 호르몬, 신경전달물질 및 생리생활물질 등의 표적으로서 생리적으로 중요한 역할을 담당하고 있다. 이리셉터 단백질은 생리활성물질과의 결합을 통해서 시그널을 세포 내에 전달하고, 이 시그널에 의해 세포 활성화 또는 억제라는 여러 반응이 야기된다.
각종 생체 세포나 장기 내의 복잡한 기능을 조절하는 물질과, 이 특이적 리셉터 단백질, 특히 G 단백질 공액형 리셉터 단백질의 관계를 명확히 하는 것은 각종 생체 세포나 장기 기능을 해명하여 이들 기능과 밀접하게 관련된 의약품 개발에 매우 중요한 수단을 제공하게 된다.
예컨대 생체의 각종 기관에서는 대부분 호르몬, 호르몬같은 물질, 신경전달물질 또는 생리활성물질에 의한 조절 하에서 생리적인 기능 조절이 이루어지고 있다. 특히, 생리활성물질은 생체 내의 여러 부위에 존재하고, 각각에 대응하는 리셉터 단백질을 통해 그 생리 기능을 조절하고 있다. 생체 내에는 아직 알려지지 않은 호르몬이나 신경전달물질 기타 생리활성물질도 많고, 이들 리셉터 단백질 구조에 대해서도 지금까지 보고되지 않은 것이 많다. 또한, 이미 알려진 리셉터 단백질에서도 서브타입이 존재할지의 여부에 대해서도 알 수 없는 것이 많다.
생체에서의 복잡한 기능을 조절하는 물질과, 그 특이적 리셉터 단백질의 관계를 명확히 하는 것은 의약품 개발에 매우 중요한 수단이다. 또, 리셉터 단백질에 대한 작용물질, 길항물질을 효율적으로 스크리닝하고, 의약품을 개발하기 위해서는 생체 내에서 발현된 리셉터 단백질의 유전자 기능을 해명하여 이들을 적당한 발현계에서 발현시키는 것이 필요하였다.
최근 생체 내에서 발현된 유전자를 해석하는 수단으로 cDNA 서열을 랜덤하게 해석하는 연구가 활발히 이루어지고 있으며, 이렇게 해서 얻은 cDNA 의 단편 서열이 발현된 서열 태그 (EST) 로서 데이터 베이스에 등록되고 공개되어 있다. 그러나 대부분의 EST 는 서열 정보뿐만을 포함하고, 그 기능을 추정하는 것은 어렵다.
종래 G 단백질 공액형 리셉터와 생리활성물질 (즉, 리간드) 의 결합을 저해하는 물질이나 결합되어 생리활성물질 (즉, 리간드) 과 동일한 시그널 전달을 일으키는 물질은 이들 리셉터의 특이적인 길항물질 또는 작용물질로서 생체 기능을 조절하는 의약품으로 활용되어왔다. 따라서, 이렇게 생체 내에서의 생리 발현에서 중요할 뿐아니라 의약품 개발의 표적이 될 수도 있는 G 단백질 공액형 리셉터 단백질을 신규로 발견하고, 그 유전자 (예컨대 cDNA) 를 클로닝하는 것은 신규 G 단백질 공액형 리셉터 단백질의 특이적 리간드나 작용물질, 길항물질을 발견할 때에 매우 중요한 수단이 된다.
그러나, G 단백질 공액형 리셉터는 그 모두가 발견된 것이 아니라 현 시점에서도 역시 알려지지 않은 G 단백질 공액형 리셉터, 또 대응하는 리간드가 동정되지 않은 이른바 오펀 리셉터가 다수 존재하고 있으며, 신규 G 단백질 공액형 리셉터의 탐색 및 기능 해명이 절실히 요구되고 있다.
G 단백질 공액형 리셉터는 그 시그널 전달작용을 지표로 하는 새로운 생리활성물질 (즉, 리간드) 의 탐색, 또 이 리셉터에 대한 작용물질 또는 길항물질) 의 검색에 유용하다. 한편, 생리적인 리간드가 발견되지 않아도 이 리셉터의 불활성 실험 (노크 아웃 동물) 에서 이 리셉터 생리작용을 해석함으로써 이 리셉터에 대한 작용물질 또는 길항물질을 제작할 수도 있다. 이들 이 리셉터에 대한 리간드, 작용물질 또는 길항물질 등은 G 단백질 공액형 리셉터의 기능 부전에 관련된 질환의 예방/치료약이나 진단약으로 활용하는 것을 기대할 수 있다.
또한, G 단백질 공액형 리셉터의 유전자 변이에 의거한 생체에서의 이 리셉터 기능의 저하 또는 항진이 어떠한 질환 원인이 되는 경우도 많다. 이 경우에는 이 리셉터에 대한 길항물질이나 작용물질 투여뿐아니라 이 리셉터 유전자의 생체 내 (또는 어느 특정한 장기) 로의 도입이나 이 리셉터 유전자에 대한 앤티센스 핵산의 도입에 따른 유전자 치료에 응용할 수도 있다. 이 경우에는 이 리셉터의 염기 서열은 유전자 상의 결실이나 변이 유무를 조사하기 위해서 필요 불가결한 정보로, 이 리셉터 유전자는 이 리셉터의 기능 부전에 관여한 질환 예방 / 치료약이나 진단약에 응용할 수도 있다.
덧붙여 이 리셉터에 대한 내인성 리간드 또는 이 리간드 활성이 있는 물질을 발견할 수 있으면 이 리셉터에 대한 길항물질이나 작용물질의 스크리닝계의 구축이 가능해진다.
본 발명은 래트 뇌간 주변부 및 인체 뇌 유래의 신규 G 단백질 공액형 리셉터 단백질 또는 그 염 및 그것을 코딩하는 DNA 및 이 G 단백질 공액형 리셉터 단백질에 대한 리간드 활성을 갖는 펩티드 또는 그 아미드 또는 그 에스테르 또는 그의 염 등에 관한 것이다.
도 1 은 실시예 1 에서 얻은 본 발명의 래트 뇌간 주변부 유래의 신규 G 단백질 공액형 리셉터 단백질 rOT7T175 을 코딩하는 DNA 의 염기 서열 및 그것에서 추정되는 아미노산 서열을 나타낸다 (도 2 에 계속됨).
도 2 는 실시예 1 에서 얻은 본 발명의 래트 뇌간 주변부 유래의 G 단백질 공액형 리셉터 단백질 rOT7T175 을 코딩하는 DNA 의 염기 서열 및 그것에서 추정되는 아미노산 서열을 나타낸다 (도 1 에 계속되고, 도 3 에 계속됨).
도 3 은 실시예 1 에서 얻은 본 발명의 래트 뇌간 주변부 유래의 G 단백질 공액형 리셉터 단백질 rOT7T175 을 코딩하는 DNA 의 염기 서열 및 그것에서 추정되는 아미노산 서열을 나타낸다 (도 2 에 계속됨).
도 4 는 도 1 ∼ 도 3 에 나타낸 아미노산 서열을 기초로 작성한 본 발명의래트 뇌간 주변부 유래의 G 단백질 공액형 리셉터 단백질 rOT7T175 의 소수성 플롯을 나타낸다.
도 5 는 실시예 2 에서 얻은 본 발명의 인체 뇌 유래의 신규 G 단백질 공액형 리셉터 단백질 hOT7T175 을 코딩하는 DNA 의 염기 서열 및 그것에서 추정되는 아미노산 서열을 나타낸다 (도 6 에 계속됨).
도 6 은 실시예 2 에서 얻은 본 발명의 인체 뇌 유래의 신규 G 단백질 공액형 리셉터 단백질 hOT7T175 을 코딩하는 DNA 의 염기 서열 및 그것에서 추정되는 아미노산 서열을 나타낸다 (도 5 에 계속되고, 도 7 에 계속됨).
도 7 은 실시예 2 에서 얻은 본 발명의 인체 뇌 유래의 신규 G 단백질 공액형 리셉터 단백질 hOT7T175 을 코딩하는 DNA 의 염기 서열 및 그것에서 추정되는 아미노산 서열을 나타낸다 (도 6 에 계속됨).
도 8 은 도 5 ∼ 도 7 에 나타낸 아미노산 서열을 기초로 작성한 본 발명의 인체 뇌 유래의 신규 G 단백질 공액형 리셉터 단백질 hOT7T175 의 소수성 플롯을 나타낸다.
도 9 는 실시예 3(1-2) 에서 실시된 세포내 Ca 이온 농도 상승 활성의 측정 결과를 나타낸다.
발명을 실시하기 위한 최량 형태
본 발명의 단백질 (리셉터 단백질, G 단백질 공액형 리셉터 단백질, 이하「본 발명의 리셉터 단백질」이라고 한다) 은 서열 번호:1 로 표시되는 아미노산 서열 (도 1 ∼ 도 3 중의 아미노산 서열) 과 동일하거나 실질적으로 동일한 아미노산서열을 함유한 단백질이다.
본 발명의 리셉터 단백질은 예컨대 인체나 포유동물 (예컨대, 기니아 피그, 래트, 마우스, 토끼, 돼지, 양, 소, 원숭이 등) 의 모든 세포 (예컨대, 비장 세포, 신경 세포, 신경교 세포, 췌장β세포, 골수 세포, 사구체 세포, 랑겔한스 세포, 표피 세포, 상피 세포, 내피 세포, 섬유아 세포, 섬유 세포, 근 세포, 지방 세포, 면역 세포 (예, 마크로파지, T 세포, B 세포, 내츄럴킬러 세포, 비만 세포, 호중구, 호염기구, 호산구, 단일구 등), 거핵구, 골막 세포, 연골 세포, 골 세포, 골아 세포, 파골 세포, 유선 세포, 간(肝) 세포 또는 간질 세포, 또는 이들 세포의 전구 세포, 간(幹) 세포 또는 암 세포 등) 이나 혈구계의 세포, 또는 이들 세포가 존재하는 모든 조직, 예컨대 뇌, 뇌의 각 부위 (예, 후구, 편두핵, 대뇌 기저구, 해마, 시상, 시상 하부, 시상 하핵, 대뇌 피질, 연수, 소뇌, 후두엽, 전두엽, 측두엽, 피곡, 미상핵, 뇌염, 흑질), 척수, 하수체, 위, 췌장, 신장, 간장, 생식선, 갑상선, 담낭, 골수, 부신, 피부, 근육, 폐, 소화관 (예, 대장, 소장), 혈관, 심장, 흉선, 비장, 악하선, 말초혈, 말초혈구, 전립선, 고환, 정소, 난소, 태반, 자궁, 골, 관절, 골격근 등 (특히, 뇌나 뇌의 각 부위) 에서 유래하는 단백질이어도 되고 또한 합성 단백질이어도 된다.
서열 번호:1 로 표시되는 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열로는 예컨대, 서열 번호:1 로 표시되는 아미노산 서열과 약 50% 이상, 바람직하게는 약 70% 이상, 더 바람직하게는 약 80% 이상, 더더욱 바람직하게는 약 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 상동성 (相同性) 을 갖는 아미노산 서열 등을 들 수있다.
구체적으로는 서열 번호:5 로 표시되는 아미노산 서열 (도 5 ∼ 도 7 중의 아미노산 서열) 을 함유한 단백질 등을 들 수 있다.
본 발명의 서열 번호:1 로 표시되는 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 함유한 단백질로는 예컨대 서열 번호:1 로 표시되는 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 가지며, 서열 번호:1 로 표시되는 아미노산 서열과 실질적으로 동질인 활성을 갖는 단백질 등이 바람직하다.
실질적으로 동질인 활성으로는 예컨대 리간드 결합 활성, 시그널정보 전달작용 등을 들 수 있다. 실질적으로 동질이란 이들 활성이 성질적으로 동질임을 나타낸다. 따라서, 리간드 결합 활성이나 시그널정보 전달작용 등의 활성이 동등 (예, 약 0.01 ∼ 100 배, 바람직하게는 약 0.5 ∼ 20 배, 더 바람직하게는 0.5 ∼ 2 배) 인 것이 바람직하지만, 이들 활성 정도나 단백질 분자량 등의 양적 요소는 달라도 된다.
리간드 결합 활성이나 시그널정보 전달작용 등 활성 측정은 자체 공지된 방법에 준하여 실시할 수 있으나, 예컨대 후술하는 리간드 결정방법이나 스크리닝 방법에 따라 측정할 수 있다.
또, 본 발명의 리셉터 단백질로는 ① 서열 번호:1 로 표시되는 아미노산 서열 중 1 또는 2 개 이상 (바람직하게는 1 ∼ 30 개 정도, 더 바람직하게는 1 ∼ 10 개 정도, 더더욱 바람직하게는 몇개 (1 개 또는 2 개)) 의 아미노산이 결실된 아미노산 서열, ② 서열 번호:1 로 표시되는 아미노산 서열에 1 또는 2 개 이상 (바람직하게는 1 ∼ 30 개 정도, 더 바람직하게는 1 ∼ 10 개 정도, 더더욱 바람직하게는 몇개 (1 개 또는 2 개)) 의 아미노산이 부가된 아미노산 서열, ③ 서열 번호:1 로 표시되는 아미노산 서열 중 1 또는 2 개 이상 (바람직하게는 1 ∼ 30 개 정도, 더 바람직하게는 1 ∼ 10 개 정도, 더더욱 바람직하게는 몇개 (1 개 또는 2 개)) 의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열 또는 ④ 그들을 조합시킨 아미노산 서열을 함유한 단백질 등도 사용될 수 있다.
또, 본 발명의 리셉터 단백질로는 ① 서열 번호:5 로 표시되는 아미노산 서열 중 1 또는 2 개 이상 (바람직하게는 1 ∼ 30 개 정도, 더 바람직하게는 1 ∼ 10 개 정도, 더더욱 바람직하게는 몇개 (1 개 또는 2 개)) 의 아미노산이 결실된 아미노산 서열, ② 서열 번호:5 로 표시되는 아미노산 서열에 1 또는 2 개 이상 (바람직하게는 1 ∼ 30 개 정도, 더 바람직하게는 1 ∼ 10 개 정도, 더더욱 바람직하게는 몇개 (1 개 또는 2 개)) 의 아미노산이 부가된 아미노산 서열, ③ 서열 번호:5 로 표시되는 아미노산 서열 중 1 또는 2 개 이상 (바람직하게는 1 ∼ 30 개 정도, 더 바람직하게는 1 ∼ 10 개 정도, 더더욱 바람직하게는 몇개 (1 개 또는 2 개)) 의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열 또는 ④ 그들을 조합시킨 아미노산 서열을 함유한 단백질 등을 들 수 있다.
본 명세서의 리셉터 단백질은 펩티드 표지의 관례에 따라 왼쪽 말단이 N 말단 (아미노 말단), 오른쪽 말단이 C 말단 (카르복실 말단) 이다. 서열 번호:1 로 표시되는 아미노산 서열을 함유한 리셉터 단백질을 비롯한 본 발명의 리셉터 단백질은 C 말단이 통상적으로 카르복실기(-COOH) 또는 카르복실레이트(-COO-) 이지만, C 말단이 아미드(-CONH2) 또는 에스테르(-COOR) 이어도 된다.
여기에서 에스테에서의 R 로는 예컨대, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필 또는 n-부틸 등의 C1-6알킬기, 예컨대 시클로펜틸, 시클로헥실 등의 C3-8시클로알킬기, 예컨대 페닐, α-나프틸 등의 C6-12아릴기, 예컨대 벤질, 페네틸 등의 페닐-C1-2알킬기 등의 C7-14아르알킬기 또는 α-나프틸메틸 등의 α-나프틸-C1-2알킬기 외에 경구용 에스테르로서 범용되는 피바로일옥시메틸기 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 리셉터 단백질이 C 말단 이외에 카르복실기 (또는 카르복실레이트) 를 갖고 있는 경우 카르복실기가 아미드화 또는 에스테르화되어 있는 것도 본 발명의 리셉터 단백질에 함유된다. 이 경우 에스테르로는 예컨대 상기한 C 말단의 에스테르 등이 사용될 수 있다.
또, 본 발명의 리셉터 단백질에는, 상기한 단백질에서 N 말단의 메티오닌 잔기의 아미노기가 보호기 (예컨대, 포르밀기, 아세틸 등의 C2-6알카노일기 등의 C1-6아실기 등) 로 보호되어 있는 것, N 말단측이 생체 내에서 절단되어 생성된 글루타밀기가 피로글루타민산화시킨 것, 분자 내의 아미노산의 측쇄 상의 치환기 (예컨대, -OH, -SH, -COOH, 아미노기, 이미다졸기, 인돌기, 구아니디노기 등) 가 적당한 보호기 (예컨대, 포르밀기, 아세틸 등의 C2-6알카노일기 등의 C1-6아실기 등) 로 보호되어 있는 것, 또는 당쇄가 결합된 이른바 당단백질 등의 복합 단백질도 포함된다.
본 발명의 리셉터 단백질의 구체예로는 예컨대 서열 번호:1 로 표시되는 아미노산 서열을 함유한 래트 유래의 리셉터 단백질 또는 서열 번호:5 로 표시되는 아미노산 서열을 함유한 인체 유래의 리셉터 단백질 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 리셉터 단백질의 부분 펩티드 (이하, 부분 펩티드라고 하는 경우가 있다) 로는 상기한 본 발명의 리셉터 단백질의 부분 펩티드이면 어떠한 것이어도 되지만, 예컨대 본 발명의 리셉터 단백질 분자 중 세포막 밖으로 노출된 부위로, 리셉터 결합 활성을 갖는 것이 사용될 수 있다.
구체적으로는 서열 번호:1 로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질의 부분 펩티드로는 도 4 로 나타낸 소수성 플롯 해석에서 세포외 영역 (친수성 부위) 으로 분석된 부분을 포함한 펩티드이다. 또, 서열 번호:5 로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질의 부분 펩티드로는 도 8 로 나타낸 소수성 플롯 해석에서 세포외 영역 (친수성 부위) 로 분석된 부분을 포함한 펩티드이다. 또, 소수성 부위를 일부에 함유한 펩티드도 동일하게 사용할 수 있다. 개개의 영역을 개별로 포함한 펩티드도 사용할 수 있으나, 복수의 영역을 동시에 함유한 부분의 펩티드여도 된다.
본 발명의 부분 펩티드의 아미노산 수는 상기한 본 발명의 리셉터 단백질의 구성 아미노산 서열 중 적어도 20 개 이상, 바람직하게는 50 개 이상, 더 바람직하게는 100 개 이상의 아미노산 서열을 갖는 펩티드 등이 바람직하다.
실질적으로 동일한 아미노산 서열이란 이들 아미노산 서열과 약 50% 이상,바람직하게는 약 70% 이상, 더 바람직하게는 약 80% 이상, 더더욱 바람직하게는 약 90% 이상, 가장 바람직하게는 약 95% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 나타낸다.
여기에서 「실질적으로 동질 활성」이란 상기한 바와 동일한 의미를 나타낸다. 「실질적으로 동질 활성」의 측정은 상기한 바와 동일하게 실시할 수 있다.
또, 본 발명의 부분 펩티드는 상기 아미노산 서열 중 1 또는 2 개 이상 (바람직하게는 1 ∼ 10 개 정도, 더 바람직하게는 몇개 (1 개 또는 2 개)) 의 아미노산이 결실되거나 또는 그 아미노산 서열에 1 또는 2 개 이상 (바람직하게는 1 ∼ 20 개 정도, 더 바람직하게는 1 ∼ 10 개 정도, 더더욱 바람직하게는 몇개 (1 개 또는 2 개)) 의 아미노산이 부가되거나 또는 그 아미노산 서열 중 1 또는 2 개 이상 (바람직하게는 1 ∼ 10 개 정도, 더 바람직하게는 몇개 (1 개 또는 2 개)) 의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되어 있어도 된다.
또, 본 발명의 부분 펩티드는 C 말단이 통상적으로 카르복실기(-COOH) 또는 카르복실레이트(-COO-) 이지만, 상기한 본 발명의 리셉터 단백질과 같이 C 말단이 아미드(-CONH2) 또는 에스테르(-COOR) 여도 된다.
또한, 본 발명의 부분 펩티드에는, 상기한 본 발명의 리셉터 단백질과 마찬가지로 N 말단의 메티오닌 잔기의 아미노기가 보호기로 치환되어 있는 것, N 말단이 생체 내에서 절단되어 생성된 Gln 이 피로글루타민화시킨 것, 분자 내의 아미노산의 측쇄 상의 치환기가 적당한 보호기로 보호되어 있는 것, 또는 당쇄가 결합된 이른바 당펩티드 등의 복합 펩티드 등도 포함된다.
본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 부분 펩티드의 염으로는 생리학적으로 허용되는 염기 또는 산과의 염이 사용될 수 있으며, 특히 생리학적으로 허용되는 산부가염이 바람직하다. 이러한 염으로는 예컨대 무기산 (예컨대, 염산, 인산, 브롬화수소산, 황산) 과의 염, 또는 유기산 (예컨대, 아세트산, 포름산, 프로피온산, 푸마르산, 말레인산, 숙신산, 타르타르산, 시트르산, 말산, 옥살산, 벤조산, 메탄술폰산, 벤젠술폰산) 과의 염 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 염은 상술한 인체나 포유동물의 세포 또는 조직에서 자체 공지된 리셉터 단백질의 정제 방법에 따라 제조할 수도 있고, 후술하는 본 발명의 리셉터 단백질을 코딩하는 DNA 를 함유한 형질 전환체를 배양함으로써 제조할 수 있다. 또, 후술하는 단백질 합성법 또는 그것에 준한 방법에 따라 제조할 수도 있다.
인체나 포유동물의 조직 또는 세포에서 제조하는 경우, 인체나 포유동물의 조직 또는 세포를 호모지나이징한 후 산 등으로 추출하고, 이 추출액을 역상 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피 등의 크로마토그래피를 조합함으로써 정제 단리할 수 있다.
본 발명의 리셉터 단백질, 그 부분 펩티드 또는 그들 염 또는 그들 아미드체의 합성에는 통상적으로 시판되는 단백질 합성용 수지를 사용할 수 있다. 이러한 수지로는 예컨대 클로로메틸수지, 히드록시메틸수지, 벤즈히드릴아민수지, 아미노메틸수지, 4-벤질옥시벤질알콜수지, 4-메틸벤즈히드릴아민수지, PAM 수지, 4-히드록시메틸메틸페닐아세트아미드메틸수지, 폴리아크릴아미드수지, 4-(2',4'-디메톡시페닐-히드록시메틸)페녹시수지, 4-(2',4'-디메톡시페닐-Fmoc-아미노에틸)페녹시수지 등을 들 수 있다. 이러한 수지를 사용하며 α-아미노기와 측쇄 관능기를 적당하게 보호한 아미노산을 목적하는 단백질 서열대로 자체 공지된 각종 축합방법에 따라 수지 상에서 축합시킨다. 반응 마지막에 수지에서 단백질을 잘라냄과 동시에 각종 보호기를 제거하고 다시 고희석용액 중에서 분자 내 디술피드 결합 형성 반응을 실시하여 목적하는 단백질 또는 그들 아미드체를 취득한다.
상기한 보호 아미노산의 축합에 관해서는 단백질 합성에 사용할 수 있는 각종 활성화 시약을 사용할 수 있으나, 특히 카르보디이미드류가 좋다. 카르보디이미드류로는 DCC, N,N'-디이소프로필카르보디이미드, N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프롤릴)카르보디이미드 등이 사용될 수 있다. 이들에 의한 활성화에는 라세미화 억제첨가제 (예컨대, HOBt, HOOBt) 와 함께 보호 아미노산을 직접 수지에 첨가하거나 또는 대칭 산무수물 또는 HOBt 에스테르 또는 HOOBt 에스테르로서 미리 보호 아미노산의 활성화를 실시한 후에 수지에 첨가할 수 있다.
보호 아미노산의 활성화나 수지의 축합에 사용될 수 있는 용매로는 단백질 축합반응에 사용될 수 있음이 알려져 있는 용매에서 적절하게 선택될 수 있다. 예컨대, N,N-디메틸포름아미드, N,N-디메틸아세트아미드, N-메틸피롤리돈 등의 산 아미드류, 염화메틸렌, 클로로포름 등의 할로겐화 탄화수소류, 트리플루오로에탄올 등의 알콜류, 디메틸술폭시드 등의 술폭시드류, 피리딘, 디옥산, 테트라히드로푸란등의 에테르류, 아세토니트릴, 프로피오니트릴 등의 니트릴류, 아세트산메틸, 아세트산에틸 등의 에스테르류 또는 이들의 적절한 혼합물 등이 사용될 수 있다. 반응온도는 단백질 결합 형성 반응에 사용될 수 있음이 알려져 있는 범위에서 적절하게 선택되는데, 통상적으로 약 -20℃ ∼ 50℃ 범위에서 적절하게 선택된다. 활성화된 아미노산 유도체는 통상적으로 1.5 ∼ 4 배 과잉으로 사용될 수 있다. 닌히드린 반응을 사용한 테스트 결과 축합이 불충분한 경우에는 보호기를 탈리하지 않고 축합반응을 반복함으로써 충분한 축합을 할 수 있다. 반응을 반복해도 충분한 결합을 얻을 수 없을 때에는 무수아세트산 또는 아세틸이미다졸을 사용하여 미반응 아미노산을 아세틸화시킴으로써 후 반응에 영향을 미치지 않게 할 수 있다.
원료의 아미노기의 보호기로는 예컨대 Z, Boc, tert-펜틸옥시카르보닐, 이소보르닐옥시카르보닐, 4-메톡시벤질옥시카르보닐, Cl-Z, Br-Z, 아다만틸옥시카르보닐, 트리플루오로아세틸, 프탈로일, 포르밀, 2-니트로페닐술페닐, 디페닐포스페노티오일, Fmoc 등이 사용될 수 있다.
카르복실기는 예컨대 알킬에스테르화 (예컨대, 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, tert-부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실, 시클로부틸, 시클로옥틸, 2-아다만틸 등의 직쇄형, 분지형 또는 고리형 알킬에스테르화), 아르알킬에스테르화 (예컨대, 벤질에스테르, 4-니트로벤질에스테르, 4-메톡시벤질에스테르, 4-클로로벤질에스테르, 벤즈히드릴에스테르화), 페나실에스테르화, 벤질옥시카르보닐히드라지드화, tert-부톡시카르보닐히드라지드화, 트리틸히드라지드화 등에 따라 보호할 수 있다.
세린의 수산기는 예컨대 에스테르화 또는 에테르화에 따라 보호할 수 있다.이 에스테르화에 적합한 기로는 예컨대 아세틸기 등의 저급 알카노일기, 벤조일기 등의 알로일기, 벤질옥시카르보닐기, 에톡시카르보닐기 등의 탄산에서 유도된 기 등이 사용될 수 있다. 또, 에테르화에 적합한 기로는 예컨대 벤질기, 테트라히드로피라닐기, t-부틸기 등이다.
티로신의 페놀성 수산기의 보호기로는 예컨대 Bzl, Cl2-Bzl, 2-니트로벤질, Br-Z, tert-부틸 등이 사용될 수 있다.
히스티딘의 이미다졸의 보호기로는 예컨대 Tos, 4-메톡시-2,3,6-트리메틸벤즈술포닐, DNP, 벤질옥시메틸, Bum, Boc, Trt, Fmoc 등을 들 수 있다.
원료의 카르복실기가 활성화된 것으로는 예컨대 대응하는 산무수물, 아지드, 활성에스테르 [알콜 (예컨대, 펜타클로로페놀, 2,4,5-트리클로로페놀, 2,4-디니트로페놀, 시아노메틸알콜, 파라니트로페놀, HONB, N-히드록시숙시미드, N-히드록시프탈이미드, HOBt) 과의 에스테르] 등이 사용될 수 있다. 원료의 아미노기가 활성화된 것으로는 예컨대 대응하는 인산아미드가 사용될 수 있다.
보호기 제거 (탈리) 방법에 따라는 예컨대 Pd-흑 또는 Pd-탄소 등의 촉매 존재하에서 수소기류중에서의 접촉 환원이나 또 무수 플루오르화 수소, 메탄술폰산, 트리플루오로메탄술폰산, 트리플루오로아세트산 또는 이들 혼합액 등에 의한 산처리나 디이소프로필에틸아민, 트리에틸아민, 피페리딘, 피페라진 등에 의한 염기 처리, 또한 액체암모니아 중 나트륨에 의한 환원 등도 사용될 수 있다. 상기 산처리에 의한 탈리 반응은 일반적으로 -20℃ ∼ 40℃ 온도에서 실시되지만, 산처리에서는 예컨대 아니솔, 페놀, 티오아니솔, 메타크레졸, 파라크레졸, 디메틸술피드, 1,4-부탄디티올, 1,2-에탄디티올 등과 같은 양이온 보족제의 첨가가 유효하다. 또, 히스티딘의 이미다졸 보호기로 사용되는 2,4-디니트로페닐기는 티오페놀 처리로 제거되고, 트립토판의 인돌 보호기로 사용되는 포르밀기는 상기 1,2-에탄디티올, 1,4-부탄디티올 등의 존재하에서 산처리에 의한 탈보호기 이외에 묽은 수산화나트륨 용액, 묽은 암모니아 등에 의한 알칼리 처리로도 제거된다.
원료 반응에 관여하지 않는 관능기 보호 및 보호기, 그리고 그 보호기의 탈리, 반응에 관여하는 관능기 활성화 등은 공지된 기 또는 공지된 수단에서 적절하게 선택할 수 있다.
단백질의 아미드체를 얻은 다른 방법에 따라는 예컨대 먼저 카르복시말단 아미노산의 α-카르복실기를 아미드화시켜 보호한 후, 아미노기측에 펩티드 (단백질) 사슬을 원하는 사슬길이까지 신장시킨 후 이 펩티드사슬의 N 말단의 α-아미노기의 보호기만 제거한 단백질과 C 말단의 카르복실기의 보호기만 제거한 단백질을 제조하고, 이 두 단백질을 상기한 바와 같은 혼합 용액 중에서 축합시킨다. 축합 반응의 상세함에 대해서는 상기한 바와 동일하다. 축합으로 얻은 보호단백질을 정제한 후, 상기 방법에 따라 모든 보호기를 제거하여 원하는 조(粗)단백질을 얻을 수 있다. 이 조 단백질은 이미 알려진 각종 제어수단을 구사하여 정제하고 주요 분획을 동결 건조시킴으로써 원하는 단백질의 아미드체를 얻을 수 있다.
단백질의 에스테르체를 얻기 위해서는 예컨대 카르복시 말단 아미노산의 α-카르복실기를 원하는 알콜류와 결합하여 아미노산 에스테르로 만든 후, 단백질의아미드체와 동일하게 하여 원하는 단백질의 에스테르체를 얻을 수 있다.
본 발명의 리셉터 단백질의 부분 펩티드는 자체 공지된 펩티드 합성법에 따라 또는 본 발명의 리셉터 단백질을 적당한 펩티다아제로 절단함으로써 제조할 수 있다. 펩티드 합성법으로는 예컨대 고상합성법, 액상합성법 어떤것으로도 된다. 즉, 본 발명의 리셉테 단백질을 구성할 수 있는 부분 펩티드 또는 아미노산과 잔여 부분을 축합시키고 생성물이 보호기를 갖는 경우에는 보호기를 탈리함으로써 목적하는 펩티드를 제조할 수 있다. 공지된 결합 방법이나 보호기의 탈리로는 예컨대 아래와 같은 ① ∼ ⑤ 에 기재된 방법을 들 수 있다.
① M.Bodanszky 및 M.A.Ondetti, Peptide Synthesis, Interscience Publishers, New York (1966년)
② Schroeder 및 Luebke, The Peptide, Academic Press, New York (1965년)
③ 이즈미야 노부오 외, 펩티드 합성의 기초와 실험, 마루젠(주) (1975년)
④ 야지마 하루아끼 및 가시와바라 순페이, 생화학실험강좌 1, 단백질의 화학Ⅳ, 205, (1977년)
⑤ 야지마 하루아끼, 속의약품의 개발 제14권 펩티드 합성 히로까와서점
또, 반응 후에는 통상적인 정제법, 예컨대 용매 추출 ·증류 ·칼럼크로마토그래피 ·액체 크로마토그래피 ·재결정 등을 조합하여 본 발명의 부분 펩티드를 정제 단리할 수 있다. 상기 방법에 따라 얻은 부분 펩티드가 유리체인 경우에는 공지 방법에 따라 적당한 염으로 변환할 수 있고, 반대로 염으로 얻은 경우에는 공지 방법에 따라 유리체로 변환할 수 있다.
본 발명의 리셉터 단백질을 코딩하는 폴리누클레오티드로는 상술한 본 발명의 리셉터 단백질을 코딩하는 염기 서열 (DNA 또는 RNA, 바람직하게는 DNA) 을 함유한 것이면 어떠한 것이어도 된다. 이 폴리누클레오티드로는 본 발명의 리셉터 단백질을 코딩하는 DNA, mRNA 등의 RNA 로, 2개 사슬이어도 1개 사슬이어도 된다. 2개 사슬인 경우에는 2개 사슬 DNA 또는 DNA:RNA 의 하이브리드여도 된다. 1개 사슬인 경우에는 센스 사슬 (즉, 코드 사슬) 이어도 앤티센스 사슬 (즉 비코드 사슬) 이어도 된다.
본 발명의 리셉터 단백질을 코딩하는 폴리누클레오티드를 사용하며, 예컨대 공지 실험의학증간 「새 PCR 과 그 응용」15(7), 1997 에 기재된 방법 또는 그것에 준한 방법에 따라 본 발명의 리셉터 단백질의 mRNA 를 정량할 수 있다.
본 발명의 리셉터 단백질을 코딩하는 DNA 로는 게놈 DNA, 게놈 DNA 라이브러리, 상기한 세포 ·조직 유래의 cDNA, 상기한 세포 ·조직 유래의 cDNA 라이브러리, 합성 DNA 중 어느 것이어도 된다. 라이브러리에 사용하는 벡터는 박테리오파지, 플라스미드, 코스미드, 파지미드 등 어느 것이어도 된다. 또, 상기한 세포 ·조직에서 total RNA 또는 mRNA 분획을 조제한 것을 사용하여 직접 역전효소 폴리머라제 사슬 반응 (이하 RT-PCR 법이라고 한다) 으로 증폭할 수도 있다.
구체적으로는 본 발명의 리셉터 단백질을 코딩하는 DNA 로는 예컨대 서열 번호:2 또는 서열 번호:6 으로 표시되는 염기 서열을 함유한 DNA, 또는 서열 번호:2 또는 서열 번호:6 으로 표시되는 염기 서열과 매우 엄격한 조건하에서
하이브리드화하는 염기 서열을 가지며, 본 발명의 리셉터 단백질과 실질적으로 동질인 활성 (예, 리간드 결합 활성, 시그널 정보 전달작용 등) 을 갖는 단백질을 코딩하는 DNA 라면 어떤 것이어도 된다.
서열 번호:2 또는 서열 번호:6 으로 표시되는 염기 서열과 하이브리드화할 수 있는 DNA 로는 예컨대 서열 번호:2 또는 서열 번호:6 으로 표시되는 염기 서열과 약 70 이상, 바람직하게는 약 80% 이상, 더 바람직하게는 약 90% 이상, 가장 바람직하게는 약 95% 이상의 상동성을 갖는 염기 서열을 함유한 DNA 등이 사용될 수 있다.
하이브리드화는 자체 공지 방법 또는 그것에 준한 방법, 예컨대 분자 클로닝 2 판 (J.Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) 에 기재된 방법 등에 따라 실시할 수 있다. 또 시판되는 라이브러리를 사용하는 경우 첨부된 사용설명서에 기재된 방법 등에 따라 실시할 수 있다. 더 바람직하게는 매우 엄격한 조건에 따라 실시할 수 있다.
이 매우 엄격한 조건이란 예컨대 나트륨 농도가 약 19 ∼ 40mM, 바람직하게는 약 19 ∼ 20mM 이고, 온도가 약 50 ∼ 70℃, 바람직하게는 약 60 ∼ 65℃ 조건을 나타낸다. 특히, 나트륨 농도가 약 19mM 이고 온도가 약 65℃ 인 경우가 가장 바람직하다.
더 구체적으로는 서열 번호:1 로 표시되는 아미노산 서열을 함유한 단백질을 코딩하는 DNA 로는 서열 번호:2 로 표시되는 염기 서열을 갖는 DNA 등이 사용될 수 있다. 또, 서열 번호:5 로 표시되는 아미노산 서열을 함유한 단백질을 코딩하는 DNA 로는 서열 번호:6 으로 표시되는 염기 서열을 갖는 DNA 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 리셉터 단백질을 코딩하는 DNA 의 염기 서열 일부, 또는 이 DNA 와 상보적인 염기 서열 일부를 함유하여 이루어진 폴리누클레오티드란 아래와 같은 본 발명의 부분 펩티드를 코딩하는 DNA 를 포함할 뿐 아니라 RNA 도 포함하는 의미로 사용될 수 있다.
본 발명에 따르면 본 발명의 리셉터 단백질 유전자의 복제 또는 발현을 저해할 수 있는 앤티센스 ·폴리누클레오티드 (핵산) 를 클론화시키거나 결정된 단백질을 코딩하는 DNA 의 염기 서열 정보에 의거하여 설계하고 합성할 수 있다. 이러한 폴리누클레오티드 (핵산) 는 단백질 유전자의 RNA 와 하이브리드화할 수 있어 이 RNA 의 합성 또는 기능을 저해할 수 있거나 또는 리셉터 단백질 관련 RNA 와의 상호작용을 통해 리셉터 단백질 유전자의 발현을 조절 제어할 수 있다. 리셉터 단백질 관련 RNA 의 선택된 서열에 상보적인 폴리누클레오티드 및 리셉터 단백질 관련 RNA 와 특이적으로 하이브리드화할 수 있는 폴리누클레오티드는 생체 내 및 생체 외에서 리셉터 단백질 유전자의 발현을 조절 제어하는 데에 유용하며, 또한 병 등의 치료 또는 진단에 유용하다. 용어「대응한다」라는 것은 유전자를 함유한 누클레오티드, 염기 서열 또는 핵산의 특정 서열에 상동성을 갖거나 또는 상보적인 것을 의미한다. 누클레오티드, 염기 서열 또는 핵산과 펩티드 (단백질) 사이에서 「대응한다」라는 것은 누클레오티드 (핵산) 서열 또는 그 상보체에서 유도되는 지령에 의한 펩티드 (단백질)의 아미노산을 통상적으로 가리키고 있다. 리셉터 단백질 유전자의 5' 말단으로 헤어핀 루프, 5' 말단 6-염기쌍 ·반복, 5' 말단 비번역영역, 폴리펩티드 번역 개시 코돈, 단백질 코드 영역, ORF 번역 개시 코돈, 3' 말단 비번역영역, 3' 말단 회문 영역, 및 3' 말단 헤어핀 루프는 바람직한 대상영역으로 선택할 수 있으나, 리셉터 단백질 유전자 내의 어떠한 영역도 대상으로 선택할 수 있다.
목적 핵산과 대상 영역 중 적어도 일부에 상보적인 폴리누클레오티드의 관계는 대상물과 하이브리드화할 수 있는 폴리누클레오티드의 관계는 「앤티센스」라고 할 수 있다. 앤티센스 ·폴리누클레오티드는 2-데옥시-D-리보스를 함유하고 있는 폴리데옥시누클레오티드, D-리보스를 함유하고 있는 폴리데옥시누클레오티드, 퓨린 또는 피리미딘 염기의 N-글리코시드인 그 밖의 타입의 폴리누클레오티드, 또는 비누클레오티드 골격을 갖는 그 밖의 폴리머 (예컨대 시판되는 단백질 핵산 및 합성 서열 특이적인 핵산 폴리머) 또는 특수한 결합을 함유하는 그 밖의 폴리머 (단, 이 폴리머는 DNA 나 RNA 중에 발견되는 염기의 페어링이나 염기 부착을 허용하는 배치를 갖는 누클레오티드를 함유함) 등을 들 수 있다. 이들은 2개 사슬 DNA, 1개 사슬 DNA, 1개 사슬 RNA, 그리고 DNA:RNA 하이브리드일 수 있고, 또 비수식 폴리누클레오티드 (또는 비수식 올리고누클레오티드), 또한 공지 수식이 부가된 것, 예컨대 당해 분야에서 알려진 표지가 있는 것, 캡이 부착된 것, 메틸화된 것, 1 개 이상의 천연 누클레오티드를 유연물로 치환한 것, 분자 내 누클레오티드 수식이 된 것, 예컨대 비전하결합 (예컨대 메틸포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스폴아미데이트, 카르바메이트 등) 을 갖는 것, 전하를 갖는 결합 또는 황함유 결합 (예컨대, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등) 을 갖는 것, 예컨대단백질 (누클레아제, 누클레아제 ·저해제, 톡신, 항체, 시그널펩티드, 폴리-L-리신 등) 이나 당 (예컨대, 모노사카라이드 등) 등의 측쇄기를 갖고 있는 것, 인터킬레이트 화합물 (예컨대 아크리딘, 프소랄렌 등) 을 갖는 것, 킬레이트 화합물 (예컨대, 금속, 방사활성을 갖는 금속, 붕소, 산화성 금속 등) 을 함유하는 것, 알킬화제를 함유하는 것, 수식된 결합을 갖는 것 (예컨대 α아노머형의 핵산 등) 이어도 된다. 여기에서 「누클레오시드」, 「누클레오티드」 및 「핵산」 은 퓨린 및 피리미딘 염기를 함유할 뿐아니라 수식된 그 밖의 복소환형 염기를 갖는 것을 함유하고 있어도 된다. 이러한 수식물은 메틸화된 퓨린 및 피리미딘, 아실화된 퓨린 및 피리미딘, 또는 그 밖의 복소환을 함유하는 것이어도 된다. 수식된 누클레오티드 및 수식된 누클레오티드 또는 당 부분이 수식되어 있어도 좋고, 예컨대 1 개 이상의 수산기가 할로겐이거나 지방족기 등으로 치환되거나 또는 에테르, 아미드 등의 관능기로 변환되어 있어도 된다.
본 발명의 앤티센스 ·폴리누클레오티드 (핵산) 는 RNA, DNA, 또는 수식된 핵산 (RNA, DNA) 이다. 수식된 핵산의 구체예로는 핵산의 황 유도체나 티오포스페이트 유도체, 그리고 폴리누클레오티드아미드나 올리고누클레오티드아미드의 분해에 저항성의 것을 들 수 있는데 그것에 한정되는 것이 아니다. 본 발명의 앤티센스 핵산은 다음과 같은 방침으로 바람직하게 설계될 수 있다. 즉, 세포 내에서의 앤티센스 핵산을 더 안정적인 것으로 하고, 앤티센스 핵산의 세포 투과성을 더 높이며, 목표하는 센스 사슬에 대한 친화성을 더 큰 것으로 하고, 그리고 만일 독성이 있으면 앤티센스 핵산의 독성을 더 작은 것으로 한다.
이렇게 수식은 당해 분야에서 수많이 알려져 있고, 예컨대 J.Kawakami et al., Pharm Tech Japan, Vol.8, pp.247, 1992 ; Vol.8, pp.395, 1992; S.T.Crooke et al.ed., Antisense Research and Applications, CRC Press, 1993 등에 개시되어 있다.
본 발명의 앤티센스 핵산은 변화되거나 수식된 당, 염기, 결합을 함유하고 있어도 되고, 리포좀, 미크로스페어와 같은 특수한 형태로 공여되거나 유전자 치료에 의해 적용되거나 부가된 형태로 부여될 수 있다. 이렇게 부가 형태로 사용되는 것으로는 인산기 골격의 전하를 중화시키도록 작용하는 폴리리신과 같은 폴리양이온체, 세포막과의 상호 작용을 높이거나 핵산 주입을 증대시키는 지질 (예컨대, 포스포리피드, 콜레스테르롤 등) 이란 소수성의 것을 들 수 있다. 부가하는 데에 바람직한 지질로는 콜레스테롤이나 그 유도체 (예컨대 콜레스테릴클로로포르메이트 콜산 등) 를 들 수 있다. 이러한 것은 핵산의 3' 말단 또는 5' 말단에 부착시킬 수 있으며, 염기, 당, 분자내 누클레오티드 결합을 통해 부착시킬 수 있다. 그 밖의 기로는 핵산의 3' 말단 또는 5' 말단에 특이적으로 배치된 캡용 기로, 엑소누클레아제, RNase 등의 누클레아제에 의한 분해를 저지하기 위한 것을 들 수 있다. 이러한 캡용 기로는 폴리에틸렌글리콜, 테트라에틸렌글리콜 등의 글리콜을 비롯한 당해 분야에서 알려진 수산기의 보호기를 들 수 있는데 그들에 한정되는 것은 아니다.
앤티센스 핵산의 저해활성은 본 발명의 형질 전환체, 본 발명의 생체 내 또는 생체 외의 유전자 발현계, 또는 본 발명의 리셉터 단백질의 생체 내나 생체 외의 번역계를 사용하여 조사할 수 있다. 이 핵산 그 자체 공지된 각종 방법에 따라 세포에 적용할 수 있다.
본 발명의 부분 펩티드를 코딩하는 DNA 로는 상술한 본 발명의 부분 펩티드를 코딩하는 염기 서열을 함유하는 것이라면 어떠한 것이어도 된다. 또, 게놈 DNA, 게놈 DNA 라이브러리, 상기한 세포 ·조직 유래의 cDNA, 상기한 세포 ·조직 유래의 cDNA 라이브러리, 합성 DNA 중 어느 것이어도 된다. 라이브러리에 사용되는 벡터는 박테리오파지, 플라스미드, 코스미드, 파지미드 등 어느 것이어도 된다. 또한, 상기한 세포 ·조직에서 mRNA 분획을 조제한 것을 사용하여 직접 Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (이하 RT-PCR 법이라고 한다) 으로 증폭시킬 수도 있다.
구체적으로는 본 발명의 부분 펩티드를 코딩하는 DNA 로는 예컨대 (1) 서열 번호:2 또는 서열 번호:6 으로 표시되는 염기 서열을 갖는 DNA 의 부분 염기 서열을 갖는 DNA, 또는 (2) 서열 번호:2 또는 서열 번호:6 으로 표시되는 염기 서열과 매우 엄격한 조건하에서 하이브리드화하는 염기 서열을 가지며, 본 발명의 리셉터 단백질과 실질적으로 동질인 활성 (예, 리간드 결합 활성, 시그널 정보 전달작용 등) 을 갖는 리셉터 단백질을 코딩하는 DNA 의 부분 염기 서열을 갖는 DNA 등이 사용될 수 있다.
서열 번호:2 또는 서열 번호:6 으로 표시되는 염기 서열 하이브리드화할 수 있는 DNA 로는 예컨대 서열 번호:2 또는 서열 번호:6 으로 표시되는 염기 서열과 약 70%, 바람직하게는 약 80% 이상, 더 바람직하게는 약 90% 이상, 가장 바람직하게는 약 95% 이상의 상동성을 갖는 염기 서열을 함유한 DNA 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 부분 펩티드 (이하 본 발명의 리셉터 단백질이라고 하는 경우가 있다) 를 완전히 코딩하는 DNA 의 클로닝 수단으로는 본 발명의 리셉터 단백질의 부분 염기 서열을 갖는 합성 DNA 프라이머를 사용하여 PCR 법으로 증폭하거나 또는 적당한 벡터로 조합한 DNA 을 본 발명의 리셉터 단백질 일부 또는 전영역을 코딩하는 DNA 단편 또는 합성 DNA 을 사용하여 표지한 것과의 하이브리드화으로 선별할 수 있다. 하이브리드화 방법은 예컨대 분자 클로닝 2 판 (J.Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) 에 기재된 방법 등에 따라 실시할 수 있다. 또, 시판되는 라이브러리를 사용하는 경우 첨부된 사용 설명서에 기재된 방법에 따라 실시할 수 있다.
DNA 의 염기 서열의 변환은 공지된 키트, 예컨대 MutanTM-G (다까라쥬조(주)), MutanTM-K (다까라쥬조(주)) 등을 사용하여 Gupped duplex 법이나 Kunkel 법 등 자체 공지된 방법 또는 이들에 준한 방법에 따라 실시할 수 있다.
클론화된 본 발명의 리셉터 단백질을 코딩하는 DNA는 목적에 따라 그대로 또는 원하는대로 제한효소로 소화하거나 링커를 부가하여 사용할 수 있다. 이 DNA 는 그 5' 말단측에 번역 개시 코돈으로서의 ATG 를 가지며, 또 3' 말단측에는 번역 종지 코돈으로서의 TAA, TGA 또는 TAG 를 갖고 있어도 된다. 이들 번역 개시 코돈이나 번역 종지 코돈은 적당한 합성 DNA 어댑터를 사용하여 부가할 수도 있다.
본 발명의 리셉터 단백질의 발현 벡터는 예컨대 (가) 본 발명의 리셉터 단백질을 코딩하는 DNA 에서 목적하는 DNA 단편을 잘라내고, (나) 이 DNA 단편을 적당한 발현 벡터 중 프로모터 하류에 연결함으로써 제조할 수 있다.
벡터로는 대장균 유래의 플라스미드 (예, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13), 고초균 유래의 플라스미드 (예, pUB110, pTP5, pC194), 효모 유래 플라스미드 (예, pSH19, pSH15), γ파지 등의 박테리오파지, 레트로 바이러스, 백시니어 바이러스, 바큘로 바이러스 등의 동물 바이러스 등 이외에 pA1-11, pXT1, pRc/CMV, pRc/RSV, pcDNAI/Neo 등이 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 프로모터로는 유전자 발현에 사용되는 숙주에 대응하여 적절한 프로모터이면 어떠한 것이어도 된다. 예컨대 동물세포를 숙주로서 사용하는 경우에는 SRα프로모터, SV40프로모터, LTR프로모터, CMV프로모터, HSV-TK 프로모터 등을 들 수 있다. 이들 중 CMV 프로모터, SRα프로모터 등을 사용하는 것이 바람직하다.
숙주가 에스케리키아 속균인 경우에는 trp 프로모터, lac 프로모터, recA 프로모터, γPL 프로모터, lpp 프로모터 등이 숙주가 바실러스 속균인 경우에는 SPO1 프로모터, SPO2 프로모터, penP 프로모터 등, 숙주가 효모인 경우에는 PHO5 프로모터, PGK 프로모터, GAP 프로모터, ADH 프로모터 등이 바람직하다. 숙주가 곤충세포인 경우에는 폴리헤드린프로모터, P10 프로모터 등이 바람직하다.
발현 벡터에는 이상 이외에 원하는대로 인핸서, 스플라이싱 시그널, 폴리A부가시그널, 선택 마커, SV40 복제 오리진 (이하 SV40ori 라고 하는 경우가 있다) 등을 함유하고 있는 것을 사용할 수 있다. 선택 마커로는 예컨대 디히드로엽산환원효소 (이하 dhfr 라고 하는 경우가 있다) 유전자 (메토트렉세이트(MTX) 내성), 임피실린 내성 유전자 (이하, Ampr라고 하는 경우가 있다), 네오마이신 내성 유전자 (이하, Neo 라고 하는 경우가 있다, G418 내성) 등을 들 수 있다. 특히, CHO(dhfr-)세포를 사용하여 dhfr 유전자를 선택 마커로서 사용하는 경우 목적 유전자를 티미딘을 함유하지 않은 배지에 의해서도 선택할 수 있다.
또, 필요에 따라 숙주에 맞는 시그널 서열을 본 발명의 리셉터 단백질의 N 말단측에 부가한다. 숙주가 에스케리키아 속균인 경우에는 Pho A ·시그널 서열, Omp A ·시그널 서열 등이 숙주가 바실러스 속균인 경우에는 α-아밀라아제·시그널 서열, 서브틸리신·시그널 서열 등이 숙주가 효모인 경우에는 MFα·시그널 서열, SUC2·시그널 서열 등 숙주가 동물세포인 경우에는 인슐린·시그널 서열, α-인터페론·시그널 서열, 항체 분자·시그널 서열 등을 각각 이용할 수 있다.
이렇게 해서 구축된 본 발명의 리셉터 단백질을 코딩하는 DNA 를 함유한 벡터를 사용하며 형질 전환체를 제조할 수 있다.
숙주로는 예컨대 에스케리키아 속균, 바실러스 속균, 효모, 곤충세포, 곤충, 동물세포 등이 사용될 수 있다.
에스케리키아 속균의 구체예로는 Escherichia coli K12 ·DH1 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60권, 160(1968)], JM103[Nucleic Acids Research, 9권, 309(1981)], JA221[Journal of Molecular Biology, 120권, 517(1978)], HB101[Journal of Molecular Biology, 41권, 459(1969)], C600 [Genetics, 39권,440(1954)] 등이 사용될 수 있다.
바실러스 속균으로는 예컨대 바실러스 서브틸리스 MI114 [Gene, 24권, 255(1983)], 207-21 (Journal of Biochemistry), 95권, 87(1984)] 등이 사용될 수 있다.
효모로는 예컨대 사카로마이세스 세레비시애 (Saccharomyces cerevisiae) AH22, AH22R-, NA87-11A, DKD-5D, 20B-12, 시조사카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe) NCYC1913, NCYC2036, 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris) 등이 사용될 수 있다.
곤충세포로는, 예컨대 바이러스가 AcNPV 인 경우에는, 야도 모기의 유충 유래 주화 세포 (Spodoptera frugiperda cell; Sf 세포), 트리코플루시아 (Trichoplusia) ni 의 중장 유래의 MG1 세포, 트리코플루시아 ni 의 난유래의 High FiveTM세포, 마메스트라 브라시캐 (Mamestra brassicae) 유래의 세포 또는 Estigmena acrea 유래의 세포 등이 사용될 수 있다. 바이러스가 BmNPV 인 경우에는, 누에유래 주화 세포 (Bombyxmori N; BmN 세포) 등이 사용될 수 있다. 이 Sf 세포로는, 예컨대 Sf9 세포 (ATCC CRL1711), Sf21 세포 (이상, Vaughn, J.L. 등, In Vivo, 13, 213-217, (1977)) 등이 사용될 수 있다.
곤충으로는, 예컨대 누에의 유충 등이 사용될 수 있다 (마에다 등, Nature, 315권, 592 (1985)).
동물세포로는, 예컨대 원숭이세포 COS-7, Vero, 차이니즈 햄스터 세포 CHO (이하, CHO 세포로 약기), dhfr 유전자 결손 차이니즈 햄스터 세포 CHO (이하, CHO (dhfr-) 세포로 약기), 마우스 L 세포, 마우스 AtT-20, 마우스 미엘로마 세포, 래트 GH3, 인체 FL 세포 등이 사용될 수 있다.
에스케리키아 속균을 형질 전환하기 위해서는, 예컨대 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69권, 2110 (1972) 또는 Gene, 17권, 107 (1982) 등에 기재된 방법에 따라 실시할 수 있다.
바실러스 속균을 형질 전환하기 위해서는, 예컨대 Molecular & General Genetics, 168권, 111 (1979) 등에 기재된 방법에 따라 실시할 수 있다.
효모를 형질 전환하기 위해서는, 예컨대 Methods in Enzymology, 194권, 182-187 (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75권, 1929 (1978) 등에 기재된 방법에 따라 실시할 수 있다.
곤충세포 또는 곤충을 형질 전환하기 위해서는, 예컨대 Bio/Technology, 6. 47-55 (1988) 등에 기재된 방법에 따라 실시할 수 있다.
동물세포를 형질 전환하기 위해서는, 예컨대 세포공학별책 8 신세포 공학실험 프로토콜. 263-267 (1995) (슈쥰샤 발행), Virology, 52권, 456 (1973) 에 기재된 방법을 따라서 실시할 수 있다.
이렇게 하여, 본 발명의 리셉터 단백질 또는 본 발명의 부분 펩티드를 코딩하는 DNA 를 함유하는 발현벡터로 형질 전환된 형질 전환체를 얻을 수 있다.
숙주가 에스케리키아 속균, 바실러스 속균인 형질 전환체를 배양할 때, 배양에 사용되는 배지로는 액체배지가 적당하고, 그중에는 이 형질 전환체의 생육에 필요한 탄소원, 질소원, 무기물 기타가 함유된다. 탄소원으로는, 예컨대 글루코스, 덱스트린, 가용성 전분, 자당 등, 질소원으로는 예컨대 암모늄염류, 질산염류, 콘스팁ㆍ리커, 펩톤, 카제인, 고기 추출물, 대두 찌꺼기, 감자 추출물 등의 무기 또는 유기물질, 무기물로는, 예컨대 염화칼슘, 인산 2 수소나트륨, 염화마그네슘 등을 들 수 있다. 또 효모, 비타민류, 생장촉진인자 등을 첨가해도 된다. 배지의 pH 는 약 5 ~ 8 이 바람직하다.
에스케리키아 속균을 배양할 때의 배지로는, 예컨대 글루코스, 카자미노산을 함유하는 M9 배지 [Miller, Journal of Experiments in Molecular Genetics, 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972] 가 바람직하다. 여기에 필요에 따라서 프로모터를 효율적으로 작용시키기 위하여, 예컨대 3β-인돌릴 아크릴산과 같은 약제를 첨가할 수 있다.
숙주가 에스케리키아 속균인 경우, 배양은 통상적으로 약 15 ~ 43 ℃ 에서 약 3 ~ 24 시간 실시하고, 필요에 따라서 통기 또는 교반을 추가할 수도 있다.
숙주가 바실러스 속균인 경우, 배양은 통상적으로 약 30 ~ 40 ℃ 에서 약 6 ~ 24 시간 실시하고, 필요에 따라서 통기 또는 교반을 추가할 수도 있다.
숙주가 효모인 형질 전환체를 배양할 때, 배지로는 예컨대 Burkholder 최소배지 [Bostian. K. L. 등,「Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77권, 4505 (1980)] 또는 0.5 % 카자미노산을 함유하는 SD 배지 [Bitter, G. A. 등,「Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81권, 5330 (1984)] 를 들 수 있다. 배지의 pH 는 약 5 ~ 8 로 조정하는 것이 바람직하다. 배양은 통상적으로 약 20 ℃ ~ 35 ℃ 에서 약 24 ~ 72 시간 실시하고, 필요에 따라서 통기 또는 교반을 추가한다.
숙주가 곤충세포 또는 곤충인 형질 전환체를 배양할 때, 배지로는 Grace's Insect Medium (Grace, T.C.C., Nature. 195,788 (1962) 에 비동화된 10 % 소 혈청 등의 첨가물을 적절하게 첨가한 것 등이 사용될 수 있다. 배지의 pH 는 약 6.2 ~ 6.4 로 조정하는 것이 바람직하다. 배양은 통상적으로 약 27 ℃ 에서 약 3 ~ 5 일간 실시하고, 필요에 따라서 통기 또는 교반을 추가한다.
숙주가 동물세포인 형질 전환체를 배양할 때, 배지로는 예컨대 약 5 ~ 20 % 의 태아의 소 혈정을 함유한 MEM 배지 [Science, 122권, 501 (1952)], DMEM 배지 [Virology, 8권, 396 (1959)], RPMI 1640 배지 [The Journal of the American Medical Association 199권, 519 (1967)], 199 배지 [Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73권, 1 (1950)] 등이 사용될 수 있다. pH 는 약 6 ~ 8 인 것이 바람직하다. 배양은 통상적으로 약 30 ℃ ~ 40 ℃ 에서 약 15 ~ 60 시간 실시하고, 필요에 따라서 통기 또는 교반을 추가한다.
이상과 같이 하여, 형질 전환체의 세포막에 본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 부분 펩티드를 생성시킬 수 있다.
상기 배양물에서 본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 부분 펩티드를 분리정제하기 위해서는, 예컨대 아래와 같은 방법으로 실시할 수 있다.
본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 부분 펩티드를 배양균체 또는 세포에서 추출할 때에는, 배양후 공지된 방법에 따라 균체 또는 세포를 모아서 이것을 적당한완충액에 현탁하고, 초음파, 리소자임으로의 처리 및/또는 동결융해 등에 의하여 균체 또는 세포를 파괴한 후, 원심분리나 여과에 의하여 본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 부분 펩티드의 조(粗)추출액을 얻는 방법 등이 적절히 사용될 수 있다. 완충액 중에 요소나 염산구아니딘 등의 단백질 변성제 또는 트리톤 X-100TM등의 계면활성제가 포함되어 있어도 된다. 배양액 중에 본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 부분 펩티드가 분비되는 경우에는, 배양종료후 그 자체 공지된 방법에 따라 균체 또는 세포와 상등액을 분리하여 상등액을 모은다.
이렇게 하여 얻은 배양 상등액, 또는 추출액 중에 함유되는 본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 부분 펩티드의 정제는 자체 공지된 분리ㆍ정제법을 적절하게 조합하여 실시할 수 있다. 이들 공지된 분리, 정제법으로는 염석 또는 용매침전법 등의 용해도를 이용하는 방법, 투석법, 한외여과법, 겔여과법, 및 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동법 등의 주로 분자량의 차이를 이용하는 방법, 이온교환 크로마토그래피 등의 전하 차이를 이용하는 방법, 어피니티 크로마토그래피 등의 특이적 친화성을 이용하는 방법, 역상 고속액체 크로마토그래피 등의 소수성의 차를 이용하는 방법, 등전점 전기영동법 등의 등전점 차이를 이용하는 방법이 이용될 수 있다.
이렇게 하여 얻은 본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 부분 펩티드가 유리체로 얻은 경우에는, 자체 공지된 방법 또는 그것에 준하는 방법으로 염으로 변환시킬 수 있고, 반대로 염으로 얻은 경우에는 자체 공지된 방법 또는 그것에 준하는 방법으로 유리체 또는 다른 염으로 변환시킬 수 있다.
또, 재조합체가 생산되는 본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 부분 펩티드를, 정제전 또는 정제후에 적당한 단백 수식효소를 작용시킴으로써, 임의로 수식을 첨가하거나 폴리펩티드를 부분적으로 제거할 수도 있다. 단백 수식효소로는 예컨대 트립신, 키모트립신, 알기닐엔도펩티다제, 프로테인키나제, 글리코시다제 등이 사용될 수 있다.
이렇게 하여 생성되는 본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 염, 본 발명의 부분 펩티드 또는 그 에스테르 또는 아미드 또는 그 염의 활성은, 표지한 리간드와의 결합실험 및 특이항체를 사용한 효소 면역 분석법 등으로 측정할 수 있다.
본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 염, 그 부분 펩티드 또는 그 에스테르 또는 그 아미드 또는 그 염 (이하, 본 발명의 리셉터 단백질 등으로 약기하는 경우가 있다) 또는 본 발명의 리간드 펩티드 (후술) 에 대한 항체는, 본 발명의 리셉터 단백질 등 또는 본 발명의 리간드 펩티드를 인식할 수 있는 항체라면 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 어느 것이어도 된다.
본 발명의 리셉터 단백질 등 또는 그 리간드 펩티드에 대한 항체는, 본 발명의 리셉터 단백질 등 또는 본 발명의 리간드 펩티드를 항원으로 하여 사용하고, 자체 공지된 항체 또는 항혈청의 제조법에 따라 제조할 수 있다.
[모노클로날 항체의 제작]
(a) 모노클로날 항체 생산 세포의 제작
본 발명의 리셉터 단백질 등 또는 본 발명의 리간드 펩티드는, 포유동물에대하여 투여함으로써 항체 생산이 가능한 부위에 그 자체 또는 담체, 희석제와 함께 투여된다. 투여시에 항체 생산능을 높이기 위하여, 완전 프로인트 보강제 또는 불완전 플로인트 보강제를 투여해도 된다. 투여는 통상적으로 2 ~ 6 주마다 1 회씩, 합계 2 ~ 10 회 정도 실시된다. 사용되는 포유동물로는, 예컨대 원숭이, 토끼, 개, 기니아 피그, 마우스, 래트, 양, 염소 등을 들 수 있는데, 마우스 및 래트가 바람직하게 사용된다.
모노클로날 항체 생산 세포의 제작시에는, 항원에 면역된 온혈동물, 예컨대 마우스에서 항체가가 인정된 개체를 선택하고 최종 면역의 2 ~ 5 일 후에 비장 또는 림파절을 채취하고, 그들에 함유된 항체 생산 세포를 골수종 세포와 융합시킴으로써 모노클로날 항체 생산 하이브리도마를 조제할 수 있다. 항혈청 중의 항체가 측정은, 예컨대 후기하는 표지화된 본 발명의 리셉터 단백질 등 또는 본 발명의 리간드 펩티드와 항혈청을 반응시킨 후, 항체에 결합된 표지제의 활성을 측정함으로써 실시할 수 있다. 융합조작은 이미 알려진 방법, 예컨대 퀄라와 밀스타인의 방법 [Nature, 256권, 495페이지 (1975)] 에 따라서 실시할 수 있다. 융합촉진제로는 예컨대 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 또는 센다이 바이러스 등을 들 수 있는데, 바람직하게는 PEG 가 사용될 수 있다.
골수종 세포로는, 예컨대 NS-1, P3U1, SP2/0 등을 들 수 있는데, P3U1 을 바람직하게 사용할 수 있다. 사용되는 항체 생산 세포 (비장세포) 수와 골수종 세포 수의 바람직한 비율은 1:1 ~ 20:1 정도이고, PEG (바람직하게는 PEG 1000 ~ PEG 6000) 가 10 ~ 80 % 정도의 농도로 첨가되고, 약 20 ~ 40 ℃, 바람직하게는 약30 ~ 37 ℃ 에서 약 1 ~ 10 분간 인큐베이팅함으로써 효율적으로 세포융합을 실시할 수 있다.
모노클로날 항체 생산 하이브리도마의 스크리닝에는 여러 가지 방법을 사용할 수 있는데, 예컨대, 본 발명의 리셉터 단백질 등 항원 또는 본 발명의 리간드 펩티드 항원을 직접 또는 담체와 함께 흡착시킨 고상 (예, 마이크로플레이트) 에 하이브리도마 배양 상등액을 첨가하고, 이어서 방사성물질 또는 효소 등으로 표지한 항면역 글로불린 항체 (세포융합에 사용되는 세포가 마우스인 경우, 항마우스 면역 글로불린 항체가 사용될 수 있다.) 또는 프로테인 A 를 첨가하고, 고상으로 결합된 모노클로날 항체를 검출하는 방법, 항면역 글로불린 항체 또는 프로테인 A 를 흡착시킨 고상에 하이브리도마 배양 상등액을 첨가하고, 방사성물질 또는 효소 등으로 표지한 본 발명의 리셉터 단백질 등 또는 본 발명의 리간드 펩티드를 첨가하고, 고상으로 결합한 모노클로날 항체를 검출하는 방법 등을 들 수 있다.
모노클로날 항체의 선별은, 자체 공지되거나 그것에 준하는 방법에 따라 실시할 수 있으나, 통상적으로는 HAT (히포잔틴, 아미노프테린, 티미딘) 를 첨가한 동물세포용 배지 등으로 실시할 수 있다. 선별 및 육종용 배지로는, 하이브리도마를 생육할 수 있는 것이면 어떠한 배지도 사용해도 된다. 예컨대 1 ~ 20 %, 바람직하게는 10 ~ 20 % 의 소 태아 혈청을 함유한 RPMI 1640 배지, 1 ~ 10 % 의 소 태아 혈청을 함유한 GIT 배지 (와꼬오쥰야꾸 고오교 (주)) 또는 하이브리도마 배양용 무혈청 배지 (SFM-101, 닛쓰이세이야꾸 (주)) 등을 사용할 수 있다. 배양온도는 통상적으로 20 ~ 40 ℃, 바람직하게는 약 37 ℃ 이다. 배양시간은통상적으로 5 일 ~ 3 주, 바람직하게는 1 주 ~ 2 주이다. 배양은 통상적으로 5 % 탄산가스하에서 실시할 수 있다. 하이브리도마 배양 상등액의 항체가는 상기 항혈청 중의 항체가 측정과 동일하게 하여 측정할 수 있다.
(b) 모노클로날 항체의 정제
모노클로날 항체의 분리정제는, 통상적인 폴리클로날항체의 분리정제와 동일하게 면역 글로불린의 분리정제법 [예, 염석법, 알코올의 침전법, 등전점 침전법, 전기영동법, 이온교환체 (예, DEAE) 에 의한 흡탈착법, 초원심법, 겔여과법, 항원결합고상 또는 프로테인 A 또는 프로테인 G 등의 활성흡착제로 항체만 채취하고, 결합을 해리시켜 항체를 얻는 특이적 정제법] 에 따라서 실시할 수 있다.
[폴리클로날 항체의 제작]
본 발명의 폴리클로날 항체는, 그 자체 공지 또는 그것에 준하는 방법에 따라 제조할 수 있다. 예컨대, 면역항원 (리셉터 단백질 등 항원) 과 커리어 단백질의 복합체를 만들고, 상기 모노클로날 항체의 제조법과 동일하게 포유동물에게 면역을 실시하고, 이 면역동물에서 본 발명의 리셉터 단백질 등 또는 본 발명의 리간드 펩티드에 대한 항체 함유물을 채취하여 항체의 분리정제를 실시함으로써 제조할 수 있다.
포유동물을 면역하기 위하여 사용되는 면역항원과 커리어 단백질의 복합체에 관하여, 커리어 단백질의 종류 및 커리어와 합텐의 혼합비는, 커리어에 가교시켜 면역한 합텐에 대하여 항체를 효율적으로 할 수 있으면 어떠한 것을 어떠한 비율로 가교시켜도 되지만, 예컨대, 소 혈청 알부민, 소 티로 글로불린, 키홀ㆍ린페트ㆍ헤모시아닌 등을 중량비로 합텐 1 에 대하여 약 0.1 ~ 20, 바람직하게는 약 1 ~ 5 의 비율로 커플링하는 방법이 사용될 수 있다.
또, 합텐과 커리어의 커플링에는 각종 축합제를 사용할 수 있는데, 글루타르알데히드나 카르보디이미드, 말레이미드 활성 에스테르, 티올기, 디티오피리딜기를 함유하는 활성 에스테르 시약 등이 사용될 수 있다.
축합생성물은, 온혈동물에 대하여 항체 생산이 가능한 부위에 그 자체 또는 담체, 희석제와 함께 투여된다. 투여시에 항체 생산능을 높이기 위하여 완전 프로인트 보강제 또는 불완전 프로인트 보강제를 투여해도 된다. 투여는 통상적으로 약 2 ~ 6 주마다 1 회씩, 합계 약 3 ~ 10 회 정도를 실시할 수 있다.
폴리클로날 항체는, 상기 방법에 따라 면역된 포유동물의 혈액, 복수 (腹水) 등, 바람직하게는 혈액에서 채취할 수 있다.
항혈청 중의 폴리클로날 항체가 측정은, 상기 혈청 중의 항체가 측정과 동일하게 하여 측정할 수 있다. 폴리클로날 항체의 분리정제는, 상기 모노클로날 항체의 분리정제와 동일한 면역 글로불린의 분리정제법에 따라서 실시할 수 있다.
본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 염, 그 부분 펩티드 또는 그 에스테르 또는 그 아미드 또는 그 염, 및 그것을 코딩하는 DNA 는, (1) 본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 염에 대한 리간드 (작용물질) 의 결정, (2) 본 발명의 리셉터 단백질의 기능부전에 관련된 질환의 예방 및/또는 치료제, (3) 유전자진단제, (4) 본 발명의 리셉터 단백질에 대한 리간드의 정량, (5) 본 발명의 리셉터 단백질과 리간드의 결합성을 변화시키는 화합물 (작용물질, 길항물질 등) 의 스크리닝, (6) 본 발명의리셉터 단백질과 리간드의 결합성을 변화시키는 화합물 (작용물질, 길항물질) 을 함유하는 각종 질병의 예방 및/또는 치료제, (7) 본 발명의 리셉터 단백질 등의 정량, (8) 본 발명의 리셉터 단백질 등에 대한 항체에 의한 중화, (9) 본 발명의 리셉터 단백질 등을 코딩하는 DNA 를 갖는 비인체 동물의 제작 등에 사용할 수 있다.
특히, 본 발명의 재조합형 리셉터 단백질의 발현계를 사용한 후술하는 본 발명의 리간드와의 리셉터 결합 분석계를 사용함으로써, 인체나 포유동물에 특이적인 본 발명의 리셉터 단백질에 대한 리간드의 결합성을 변화시키는 화합물 (예, 작용물질, 길항물질 등) 을 스크리닝할 수 있고, 이 작용물질 또는 길항물질을 후술하는 각종 질병의 예방ㆍ치료제 등으로서 사용할 수 있다.
본 발명의 리셉터 단백질 등, 본 발명의 리셉터 단백질 등을 코딩하는 DNA (이하, 본 발명의 DNA 로 약기하는 경우가 있다) 및 본 발명의 리셉터 단백질 등에 대한 항체 (이하, 본 발명의 항체로 약기하는 경우가 있다) 의 용도에 대하여, 이하에서 구체적으로 설명한다.
(1) 본 발명의 리셉터 단백질에 대한 리간드 (작용물질) 의 결정
본 발명의 리셉터 단백질 등은, 본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 염에 대한 리간드 (작용물질) 를 탐색하거나 결정하기 위한 시약으로서 유용하다.
즉, 본 발명은 본 발명의 리셉터 단백질 등과, 시험화합물을 접촉시키는 것을 특징으로 하는 본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 염에 대한 리간드의 결정방법을 제공한다.
시험화합물로는, 공지된 리간드 (예컨대, 안지오텐신, 봄베신, 카나비노이드, 콜레시스토키닌, 글루타민, 세로토닌, 멜라토닌, 뉴로펩티드 Y, 오피오이드, 퓨린, 바소프레신, 옥시토신, PACAP, 세크레틴, 글루카곤, 칼시토닌, 아드레노메듈린, 소마토스타틴, GHRH, CRF, ACTH, GRP, PTH, VIP (바소액티브 인테스티널 폴리펩티드), 소마토스타틴, 도파민, 모틸린, 아밀린, 브래디키닌, CGRP (칼시토닌 유전자 관련펩티드), 로이코트리엔, 판크레아스타틴, 프로스타글란딘, 트롬복산, 아데노신, 아드레날린, α및 β-케모카인 (예컨대, IL-8, GROα, GROβ, GORγ, NAP-2, ENA-78, PF4, IP10, GCP-2, MCP-1, HC14, MCP-3, I-309, MIP-1α, MIP-1β, RANTES 등), 엔도텔린, 엔테로가스트린, 히스타민, 뉴로텐신, TRH, 이자 폴리펩티드, 갈라닌 등) 외에, 예컨대, 인체 또는 포유동물 (예컨대, 마우스, 래트, 돼지, 소, 양, 원숭이 등) 의 조직추출물, 세포배양 상등액 등이 사용될 수 있다. 예컨대, 상기 조직추출물, 세포배양 상등액 등 (구체적으로는, KiSS-1 (Welch DR. J. Natl. Cancer Inst. 88, 1731, 1996) 의 특정한 단편 펩티드 (예컨대, 서열 번호: 10 으로 표시되는 아미노산 서열에서, N 말단에서 47 ∼ 54 번째의 아미노산 서열을 함유하고, 8 ∼ 54 개의 아미노산잔기로 이루어진 펩티드 또는 그 아미드 또는 그 에스테르 또는 그 염 등) 을 본 발명의 리셉터 단백질 등에 첨가하고 세포자극활성 등을 측정하면서 분획하여 최종적으로 단일의 리간드를 얻을 수 있다.
구체적으로는, 본 발명의 리간드 결정방법은, 본 발명의 리셉터 단백질 등을 사용하거나, 또는 재조합형 리셉터 단백질 등의 발현계를 구축하고, 상기 발현계를 사용한 리셉터결합 분석계를 사용함으로써, 본 발명의 리셉터 단백질 등에 결합하여 세포자극활성 (예컨대, 아라키돈산 유리, 아세틸콜린 유리, 세포내 Ca2+유리, 세포내 cAMP 생성, 세포내 cGMP 생성, 이노시톨인산 생산, 세포막 전위변동, 세포내 단백질의 인산화, c-fos 활성화, pH 저하 등을 촉진하는 활성 또는 억제하는 활성) 을 갖는 화합물 (예컨대, 펩티드, 단백질, 비펩티드성화합물, 합성화합물, 발효생산물 등) 또는 그 염을 결정하는 방법이다.
본 발명의 리간드 결정방법에서는, 본 발명의 리셉터 단백질과 시험화합물을 접촉시킨 경우 예컨대, 상기 리셉터 단백질에 대한 시험화합물의 결합량이나, 세포자극활성 등을 측정하는 것을 특징으로 한다.
보다 구체적으로는, 본 발명은, ① 표지한 시험화합물을, 본 발명의 리셉터 단백질에 접촉시킨 경우 표지한 시험화합물의 상기 단백질 등에 대한 결합량을 측정하는 것을 특징으로 하는 본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 염에 대한 리간드의 결정방법.
② 표지한 시험화합물을, 본 발명의 리셉터 단백질 등을 함유하는 세포 또는 상기 세포의 막 분획에 접촉시킨 경우 표지한 시험화합물의 상기 세포 또는 상기 막 분획에 대한 결합량을 측정하는 것을 특징으로 하는 본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 염에 대한 리간드의 결정방법.
③ 표지한 시험화합물을, 본 발명의 리셉터 단백질 등을 코딩하는 DNA 을 함유하는 형질 전환체를 배양함으로써 세포막상에 발현한 리셉터 단백질 등에 접촉시킨 경우 표지한 시험화합물의 상기 리셉터 단백질 등에 대한 결합량을 측정하는 것을 특징으로 하는 본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 염에 대한 리간드의 결정방법.
④ 시험화합물을, 본 발명의 리셉터 단백질 등을 함유하는 세포에 접촉시킨 경우에서의 리셉터 단백질을 매개로 한 세포자극활성 (예컨대, 아라키돈산 유리, 아세틸콜린 유리, 세포내 Ca2+유리, 세포내 cAMP 생성, 세포내 cGMP 생성, 이노시톨인산 생산, 세포막 전위변동, 세포내 단백질의 인산화, c-fos 활성화, pH 저하 등을 촉진하는 활성 또는 억제하는 활성) 을 측정하는 것을 특징으로 하는 본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 염에 대한 리간드의 결정방법 및,
⑤ 시험화합물을, 본 발명의 리셉터 단백질 등을 코딩하는 DHA 를 함유하는 형질 전환체를 배양함으로써 세포막상에 발현한 리셉터 단백질 등에 접촉시킨 경우 리셉터 단백질을 매개로 한 세포자극활성 (예컨대, 아라키돈산 유리, 아세틸콜린 유리, 세포내 Ca2+유리, 세포내 cAMP 생성, 세포내 cGMP 생성, 이노시톨인산 생산, 세포막 전위변동, 세포내 단백질의 인산화, c-fos 활성화, pH 저하 등을 촉진하는 활성 또는 억제하는 활성) 을 측정하는 것을 특징으로 하는 본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 염에 대한 리간드의 결정방법을 제공한다.
특히, 상기 ① ∼ ③ 의 시험을 실시하고 시험화합물이 본 발명의 리셉터 단백질 등에 결합하는 것을 확인한 후에, 상기 ④ ∼ ⑤ 의 시험을 실시하는 것이 바람직하다.
우선, 리간드 결정방법에 사용하는 본 발명의 리셉터 단백질 등으로는, 상기한 본 발명의 리셉터 단백질이면, 어느 것이어도 되지만, 동물세포를 사용하여 대량 발현시킨 본 발명의 리셉터 단백질 등이 적합하다.
본 발명의 리셉터 단백질 등을 제조하기 위해, 상술한 발현방법이 사용될 수 있지만, 상기 리셉터 단백질 등을 코딩하는 DNA 를 포유동물세포나 곤충세포로 발현함으로써 실시하는 것이 바람직하다. 목적하는 단백질부분을 코딩하는 DNA 단편에는, 통상적으로 상보 DNA 가 사용될 수 있지만, 반드시 이것에 제약되는 것은 아니다. 예컨대, 유전자단편이나 합성 DNA 를 사용해도 된다. 본 발명의 리셉터 단백질 등을 코딩하는 DNA 단편을 숙주동물세포에 도입하고, 이들을 효율적으로 발현시키기 위해서는, 상기 DNA 단편을 곤충을 숙주로 하는 바큘로바이러스에 속하는 핵다각체병바이러스 (nuclear polyhedrosis virus; NPV) 의 폴리헤드린 프로모터, SV40 유래의 프로모터, 레트로바이러스의 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터, 인체히트쇼크 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터, SRα프로모터 등의 하류에 결합하는 것이 바람직하다. 발현된 리셉터의 양과 질의 검사는 그 자체 공지된 방법에 따라 실시할 수 있다. 예컨대, 문헌 (Nambi, P. 등, The Journal of Biological Chemistry, 267권, 19555 ∼ 19559p, 1992 년) 에 기재된 방법에 따라 실시할 수 있다.
따라서, 본 발명의 리간드 결정방법에서, 본 발명의 리셉터 단백질 등을 함유하는 것으로는, 그 자체 공지된 방법에 따라 정제한 리셉터 단백질 등이어도 되고, 상기 리셉터 단백질 등을 함유하는 세포 또는 그 세포막 분획을 사용해도 된다.
본 발명의 리간드 결정방법에서, 본 발명의 리셉터 단백질 등을 함유하는 세포를 사용할 경우, 상기 세포를 글루탈알데히드, 포르말린 등으로 고정화해도 된다. 고정화방법은 그 자체 공지된 방법에 따라 실시할 수 있다.
본 발명의 리셉터 단백질 등을 함유하는 세포로는, 본 발명의 리셉터 단백질을 발현한 숙주세포를 말하는데, 상기 숙주세포로는, 대장균, 고초균, 효모, 곤충세포, 동물세포 등이 사용될 수 있다.
세포막 분획으로는, 세포를 파쇄한 후, 그 자체 공지된 방법으로 얻어진 세포막이 많이 함유된 분획을 말한다. 세포의 파쇄방법으로는 Potter-Elvehjem 형 호모지나이저로 세포를 부수는 방법, 워링 블렌더나 폴리트론 (Kinematica 사 제조) 에 의한 파쇄, 초음파에 의한 파쇄, 프렌치프레스 등으로 가압하면서 세포를 가는 노즐로부터 분사시키는 파쇄 등을 들 수 있다. 세포막의 분획에는, 분획 원심분리법 또는 밀도구배 원심분리법 등의 원심력에 의한 분획법이 주로 사용될 수 있다. 예컨대, 세포파쇄액을 저속 (500rpm ∼ 3000rpm) 으로 단시간 (통상적으로 약 1 분 ∼ 10 분) 원심하고, 상등액을 다시 고속 (15000rpm ∼ 30000rpm) 으로 통상적으로 약 30 분 ∼ 2 시간 원심하여 얻어진 침전을 막 분획으로 한다. 상기 막 분획중에는, 발현된 리셉터 단백질과 세포유래의 인지질이나 막단백질 등의 막성분이 많이 포함된다.
상기 리셉터 단백질 등을 함유하는 세포나 그 막 분획중의 리셉터 단백질 등의 양은, 1 세포당 103∼ 108분자인 것이 바람직하고, 105∼ 107분자인 것이 더 바람직하다. 또한, 발현량이 많을수록 막 분획당의 리간드결합 활성 (비활성)이 높아져 고감도의 스크리닝계의 구축이 가능해질 뿐만아니라 동일 로트로 대량의 시료를 측정할 수 있게 된다.
본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 염에 대한 리간드를 결정하는 상기 ① ∼ ③ 의 방법을 실시하기 위해서는, 적당한 리셉터 단백질 분획과 표지한 시험화합물이 필요하다.
리셉터 단백질 분획으로는, 천연형의 리셉터 단백질 분획이나, 또는 그것과 동등한 활성을 갖는 재조합형 리셉터분획 등이 바람직하다. 여기에서, 동등한 활성이란, 자연 발생하는 리셉터 단백질이 갖는 것과 동등한 리간드결합 활성, 시그널정보 전달작용 등을 나타낸다.
표지한 시험화합물로는, [3H], [125I], [14C], [35S] 등으로 표지한 안지오텐신, 봄베신, 카나비노이드, 콜레시스토키닌, 글루타민, 세로토닌, 멜라토닌, 뉴로펩티드 Y, 오피오이드, 퓨린, 바소프레신, 옥시토신, PACAP, 세크레틴, 글루카곤, 칼시토닌, 아드레노메듈린, 소마토스타틴, GHRH, CRF, ACTH, GRP, PTH, VIP (바소액티브 인테스티널 폴리펩티드), 소마토스타틴, 도파민, 모틸린, 아밀린, 브래디키닌, CGRP (칼시토닌유전자 관련펩티드), 로이코트리엔, 판크레아스타틴, 프로스타글란진, 트롬복산, 아데노신, 아드레날린, α및 β-케모카인 (예컨대, IL-8, GROα, GROβ, GORγ, NAP-2, ENA-78, PF4, IP10, GCP-2, MCP-1, HC14, MCP-3, I-309, MIP-1α, MIP-1β, RANTES 등), 엔도텔린, 엔테로가스트린, 히스타민, 뉴로텐신, TRH, 이자 폴리펩티드, 갈라닌 또는 KiSS-1 (Welch DR. J. Natl. Cancer Inst. 88,1731, 1996) 의 특정한 단편 펩티드 (예컨대, 서열 번호: 10 으로 표시되는 아미노산 서열에서, N 말단에서 47 ∼ 54 번째의 아미노산 서열을 함유하고, 8 ∼ 54 개의 아미노산잔기로 이루어진 펩티드 또는 그 아미드 또는 그 에스테르 또는 그 염 등) 등이 바람직하다.
구체적으로는, 본 발명의 리셉터 단백질 등에 대한 리간드의 결정방법을 행하기 위해서는, 우선 본 발명의 리셉터 단백질 등을 함유하는 세포 또는 세포의 막 분획을, 결정방법에 적합한 버퍼에 현탁함으로써 리셉터표품을 제조한다. 버퍼에는, pH 4 ∼ 10 (바람직하게는 pH 6 ∼ 8) 의 인산버퍼, 트리스염산버퍼 등의 리간드와 리셉터 단백질 등의 결합을 저해하지 않는 버퍼이면 어느 것이라도 된다. 또, 비특이적 결합을 저감시키는 목적에서, CHAPS, Tween-80TM(가오-아틀라스사), 디기토닌, 데옥시콜레이트 등의 계면활성제나 소 혈청 알부민이나 젤라틴 등의 각종 단백질을 버퍼에 첨가할 수도 있다. 또한, 프로테아제에 의한 리셉터나 리간드의 분해를 억제하는 목적에서, PMSF, 로이펩틴, E-64 (펩티드 겡꾸쇼 제조), 펩스탄틴 등의 프로테아제 저해제를 첨가할 수도 있다. 0.01ml ∼ 10ml 의 상기 리셉터용액에, 일정량 (5000cpm ∼ 500000cpm) 의 [3H], [125I], [14C], [35S] 등으로 표지한 시험화합물을 공존시킨다. 비특이적 결합량 (NSB) 을 알기 위해 대과잉 미표지 시험화합물을 첨가한 반응튜브도 준비한다. 반응은 약 0℃ 에서 50℃, 바람직하게는 4℃ 에서 37℃ 이며, 약 20 분에서 24 시간, 바람직하게는 약 30 분에서 3 시간 실시한다. 반응 후, 유리섬유여과지 등으로 여과하고, 적당량의 동일 버퍼로 세정한 후, 유리섬유여과지에 잔존하는 방사활성을 액체신틸레이션 카운터 또는 γ-카운터로 계측한다. 전체 결합량 (B) 로부터 비특이적 결합량 (NSB) 을 뺀 카운터 (B-NSB) 가 0cpm 을 초과하는 시험화합물을 본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 염에 대한 리간드 (작용물질) 로서 선택할 수 있다.
본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 염에 대한 리간드를 결정하는 상기 ④ ∼ ⑤ 의 방법을 실시하기 위해서는, 상기 리셉터 단백질을 매개로 하는 세포자극활성 (예컨대, 아라키돈산 유리, 아세틸콜린 유리, 세포내 Ca2+유리, 세포내 cAMP 생성, 세포내 cGMP 생성, 이노시톨인산 생산, 세포막 전위변동, 세포내 단백질의 인산화, c-fos 활성화, pH 저하 등을 촉진하는 활성 또는 억제하는 활성 등) 을 공지된 방법 또는 시판되는 측정용 키트를 사용하여 측정할 수 있다. 구체적으로는, 우선, 리셉터 단백질을 함유하는 세포를 멀티웰플레이트 등에 배양한다. 리간드 결정을 함에 있어서 미리 신선한 배지 또는 세포에 독성을 나타내지 않는 적당한 버퍼로 교환하고, 시험화합물 등을 첨가하여 일정시간 인큐베이트한 후, 세포를 추출 또는 상등액을 회수하여, 생성한 산물을 각각의 방법에 따라 정량한다. 세포작극활성의 지표로 하는 물질 (예컨대, 아라키돈산 등) 의 생성이, 세포가 함유하는 분해효소에 따라 검정이 어려운 경우에는, 상기 분해효소에 대한 저해제를 첨가하여 분석을 실시해도 된다. 또, cAMP 생산 억제 등의 활성에 대해서는, 폴스콜린 등으로 세포의 기초적 생산량을 증대시켜 둔 세포에 대한 생산억제작용으로 검출할 수 있다.
본 발명의 리셉터 단백질 등에 결합하는 리간드 결정용 키트는, 본 발명의 리셉터 단백질 등, 본 발명의 리셉터 단백질 등을 함유하는 세포, 또는 본 발명의 리셉터 단백질 등을 함유하는 세포의 막 분획 등을 함유하는 것이다.
본 발명의 리간드 결정용 키드의 예로는, 다음을 것을 들 수 있다.
1. 리간드 결정용 시약
① 측정용 완충액 및 세정용 완충액
행크 균형 염 용액 (기브코사 제조) 에, 0.05% 의 소 혈청 알부민 (시그마사 제조) 을 첨가한 것.
홀직경 0.45㎛ 의 필터로 여과 멸균하고, 4℃ 로 보존하거나, 또는 사용시 제조해도 된다.
② 리셉터 단백질 표품
본 발명의 리셉터 단백질을 발현시킨 CHO 세포를, 12 홀 플레이트에 5 ×105개/ 홀로 대를 이으며 37℃, 5% CO2, 95% air 에서 2 일간 배양한 것.
③ 표지 시험화합물
시판되는 [3H], [125I], [14C], [35S] 등으로 표지한 화합물, 또는 적당한 방법에 따라 표지화한 것.
수용액 상태의 것을 4℃ 또는 -20℃ 로 보존하고, 사용시에 측정용 완충액으로 1 μM 으로 희석한다. 물에 난용성을 나타내는 시험화합물에 대해서는, 디메틸포름아미드, DMSO, 메탄올 등에 용해한다.
④ 비표지 시험화합물
표지화합물과 같은 것을 100 ∼ 1000 배 진한 농도로 조제한다.
2. 측정법
① 12 홀 조직배양용 플레이트에서 배양한 본 발명의 리셉터 단백질 발현 CHO 세포를, 측정용 완충액 1ml 로 2 회 세정한 후, 490μl 의 측정용 완충액을 각 홀에 첨가한다.
② 표지 시험화합물을 5μl 첨가하여, 실온에서 1 시간 반응시킨다. 비특이적 결합량을 알기 위해서는 비표지 시험화합물을 5μl 첨가해 둔다.
③ 반응액을 제거하고 1ml 의 세정용 완충액으로 3 회 세정한다. 세포에 결합된 표지 시험화합물을 0.2N NaOH-1% SDS 로 용해하고, 4ml 의 액체신틸레이터 A (와꼬오 쥰야꾸 제조) 와 혼합한다.
④ 액체신틸레이션 카운터 (벡만사 제조) 를 사용하여 방사활성을 측정한다.
본 발명의 리셉터 단백질 등에 결합할 수 있는 리간드로는, 예컨대, 뇌, 하수체, 췌장 등에 특이적으로 존재하는 물질 등을 들 수 있고, 구체적으로는 안지오텐신, 봄베신, 카나비노이드, 콜레시스토키닌, 글루타민, 세로토닌, 멜라토닌, 뉴로펩티드 Y, 오피오이드, 퓨린, 바소프레신, 옥시토신, PACAP, 세크레틴, 글루카곤, 칼시토닌, 아드레노메듈린, 소마토스타틴, GHRH, CRF, ACTH, GRP, PTH, VIP (바소액티브 인테스티널 폴리펩티드), 소마토스타틴, 도파민, 모틸린, 아밀린, 브래디키닌, CGRP (칼시토닌유전자 관련펩티드), 로이코트리엔, 판크레아스타틴, 프로스타글란진, 트롬복산, 아데노신, 아드레날린, α및 β-케모카인 (예컨대, IL-8,GROα, GROβ, GORγ, NAP-2, ENA-78, PF4, IP10, GCP-2, MCP-1, HC14, MCP-3, I-309, MIP-1α, MIP-1β, RANTES 등), 엔도텔린, 엔테로가스트린, 히스타민, 뉴로텐신, TRH, 이자 폴리펩티드, 갈라닌, KiSS-1 (Welch DR. J. Natl. Cancer Inst. 88, 1731, 1996) 의 특정한 단편 펩티드 (예컨대, 서열 번호: 10 으로 표시되는 아미노산 서열에서, N 말단에서 47 ∼ 54 번째의 아미노산 서열을 함유하고, 8 ∼ 54 개의 아미노산잔기로 이루어진 펩티드 또는 그 아미드 또는 그 에스테르 또는 그 염 등) 등이 사용될 수 있다.
특히, 후술하는 실시에 3 에서 나타내는 바와 같이, KiSS-1 (Welch DR. J. Natl. Cancer Inst. 88, 1731, 1996) 의 특정한 단편 펩티드 (예컨대, 서열 번호: 10 으로 표시되는 아미노산 서열에서, N 말단에서 47 ∼ 54 번째의 아미노산 서열을 함유하고, 8 ∼ 54 개의 아미노산잔기로 이루어진 펩티드 또는 그 아미드 또는 그 에스테르 또는 그 염 등) 를 본 발명의 리셉터 단백질 등에 결합할 수 있는 리간드로 들 수 있다.
「서열 번호: 10 으로 표시되는 아미노산 서열에서, N 말단에서 47 ∼ 54 번째의 아미노산 서열을 함유하고, 8 ∼ 54 개의 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드」(이하, 「본 발명의 리간드 펩티드」로 약기하는 경우가 있다) 로는, 서열 번호: 10 으로 표시되는 아미노산 서열에서, N 말단에서 47 ∼ 54 번째의 아미노산 서열을 함유하고, 또한 8 ∼ 54 개의 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드이면 어느 것이어도 되지만, 펩티드의 활성 (예컨대, 리간드와 수용체의 결합 활성, 리간드에 의해 유발되는 수용체 발현세포의 세포자극활성 등) 등이 실질적으로 동일함을 의미한다.
본 발명의 리간드 펩티드로서 바람직하게는 예컨대 서열 번호:10 으로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, N 말단에서 47 ∼ 54 번째의 아미노산 서열을 C 말단에 가지고, 8 ∼ 15 개의 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드 등을 들 수 있다.
더욱 바람직하게는 서열 번호:11, 서열 번호:12, 서열 번호:13 또는 서열 번호:14 로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드 (특히 이들의 아미드체) 등을 들 수 있다.
또한 본 발명의 리간드 펩티드는 C 말단 아미노산의 카르복실기가 아미드화된 아미드체인 것이 특히 바람직하다.
이들 펩티드의 아미드체 또는 에스테르화체 및 염에 대해서는 상기 본 발명의 리셉터 단백질의 염, 그의 단편 펩티드의 아미드체, 에스테르체와 동일하다.
본 발명의 리간드 펩티드를 코딩하는 폴리누클레오티드로는 본 발명의 리간드 펩티드를 코딩하는 염기 서열 (DNA 또는 RNA, 바람직하게는 DNA) 을 함유하는 것이면 어떠한 것이라도 좋다. 상기 폴리누클레오티드로는 본 발명의 리간드 펩티드를 코딩하는 DNA, mRNA 등의 RNA 로, 2 개 사슬이어도, 1 개 사슬이어도 된다. 2 개 사슬인 경우에는 2 개 사슬의 DNA 또는 DNA : RNA 의 하이브리드여도 된다. 1 개 사슬인 경우에는 센스 사슬 (즉, 코드 사슬) 이어도, 앤티센스 사슬 (즉, 비코드 사슬) 이어도 된다.
본 발명의 리간드 펩티드를 코딩하는 DNA 로는 게놈 DNA, 게놈 DNA 라이브러리, 상기한 세포·조직 유래의 cDNA, 상기한 세포·조직 유래의 cDNA 라이브러리,합성 DNA 중 어떤 것이라도 좋다. 라이브러리에 사용하는 벡터는 박테리오파지, 플라스미드, 코스미드, 파지미드 등 어떤 것이라도 좋다. 또한 상기한 세포·조직으로부터 총 RNA 또는 mRNA 분획을 사용하여 직접 역전사효소 폴리머라제 체인 리액션 (이하, RT-PCR 법이라고 한다) 에 의해 증폭시킬 수도 있다.
구체적으로는 본 발명의 리간드 펩티드를 코딩하는 DNA 로는 예컨대 서열 번호:10 으로 표시되는 아미노산 서열에서, N 말단에서 47 ∼ 54 번째의 아미노산 서열을 함유하고, 8 ∼ 54 개의 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드를 코딩하는 염기 서열을 갖는 DNA 를 함유하는 DNA 이면 어떤 것이라도 좋다.
본 발명의 리간드 펩티드를 코딩하는 DNA 로서 보다 구체적으로는 예컨대 서열 번호:10 으로 표시되는 아미노산 서열에서, N 말단에서 47 ∼ 54 번째의 아미노산 서열을 C 말단에 가지고, 8 ∼ 15 개의 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드를 코딩하는 염기 서열을 갖는 DNA 를 함유하는 DNA 등을 들 수 있고, 보다 구체적으로는 서열 번호:11, 서열 번호:12, 서열 번호:13 또는 서열 번호:14 로 표시되는 아미노산 서열을 함유하고, 8 ∼ 15 개의 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드를 코딩하는 염기 서열을 갖는 DNA 를 함유하는 DNA 등을 들 수 있다.
또한 본 발명의 리간드 펩티드를 코딩하는 DNA 로는 서열 번호 :15 로 표시되는 염기 서열에서, 5' 말단에서 139 번째 ∼ 162 번째의 염기 서열을 갖는 DNA 를 함유하고, 24 ∼ 162 개의 염기로 이루어진 DNA 등을 들 수 있고, 보다 구체적으로는 서열 번호:15 로 표시되는 염기 서열에서, 5' 말단에서 139 번째 ∼ 162 번째의 염기 서열을 갖는 DNA 를 3' 말단에 가지고, 24 ∼ 45 개의 염기로 이루어진DNA 등을 들 수 있다.
또한 본 발명의 리간드 펩티드를 코딩하는 DNA 로서 구체적으로는 예컨대 서열 번호:16, 서열 번호:17, 서열 번호:18 또는 서열 번호:19 로 표시되는 염기 서열을 갖는 DNA 를 함유하는 DNA 등을 들 수 있다.
여기서 ① 서열 번호 :10 으로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 로는 서열 번호:15 로 표시되는 염기 서열을 갖는 DNA 를 함유하는 DNA, ② 서열 번호:11 로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 로는 서열 번호:16 으로 표시되는 염기 서열을 갖는 DNA 를 함유하는 DNA, ③ 서열 번호:12 로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 로는 서열 번호:17 로 표시되는 염기 서열을 갖는 DNA 를 함유하는 DNA, ④ 서열 번호:13 으로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 로는 서열 번호:18 로 표시되는 염기 서열을 갖는 DNA 를 함유하는 DNA, ⑤ 서열 번호:14 로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 로는 서열 번호:19 로 표시되는 염기 서열을 갖는 DNA 를 함유하는 폴리누클레오티드 등을 구체예로 들 수 있다.
본 발명의 리간드 펩티드 또는 그 에스테르 또는 그 아미드 또는 그 염, 및 이 리간드 펩티드를 코딩하는 폴리누클레오티드의 제조방법은 상기 본 발명의 리셉터 단백질 등 및 이 단백질 등을 코딩하는 폴리누클레오티드의 제조방법과 동일한 방법 등이 사용된다.
본 발명의 리간드 펩티드 또는 그 에스테르 또는 그 아미드 또는 그 염 (이하, 본 발명의 리간드 펩티드 등이라고 하는 경우도 있다), 및 이 리간드 펩티드를코딩하는 폴리누클레오티드는 리간드 활성에 따라 안전하며 저독성인 의약으로서 유용하다.
본 발명의 리간드 펩티드 등 및 리간드 펩티드를 코딩하는 DNA 는 암전이 억제활성을 가지므로, 모든 암 (예컨대 폐암, 위암, 간암, 췌장암, 대장암, 직장암, 결장암, 전립선암, 난소암, 자궁경암, 유방암 등) 의 예방 또는 치료약으로 유용하다.
또한 본 발명의 리간드 펩티드 등 및 리간드 펩티드를 코딩하는 DNA 는 태반기능조절작용을 가지므로, 융모암, 포상기태, 침입기태, 유산, 태아의 발육부전, 당대사 이상, 지질대사 이상 또는 분만유발의 예방 또는 치료약으로 유용하다.
본 발명의 리간드 펩티드 등을 상기 예방·치료제로서 사용하는 경우에는 상투적인 수단에 따라 제제화할 수 있다.
한편, 본 발명의 리간드 펩티드를 코딩하는 DNA (이하, 본 발명의 리간드 DNA 라고 하는 경우가 있다) 를 상기 예방·치료제로서 사용하는 경우에는 본 발명의 리간드 DNA 를 단독 또는 레트로 바이러스 벡터, 아데노 바이러스 벡터, 아데노 바이러스-관련 바이러스 벡터 등의 적당한 벡터에 삽입한 후, 상투적인 수단에 따라 실시할 수 있다. 본 발명의 리간드 DNA 는 그대로 또는 섭취촉진을 위한 보조제와 함께 유전자 총 (gene gun) 이나 하이드로 겔 카테테르와 같은 카테테르로 투여할 수 있다.
예컨대 ① 본 발명의 리간드 펩티드 등 또는 ② 이 리간드 펩티드를 코딩하는 DNA 는 필요에 따라 당의를 실시한 정제, 캡슐제, 엘릭시르제, 마이크로캡슐제등으로서 경구적으로 또는 물 또는 그 이외의 약학적으로 허용될 수 있는 액과의 무균성 용액, 또는 현탁액제 등의 주사제 형태로 비경구적으로 사용할 수 있다. 예컨대 ① 본 발명의 리간드 펩티드 등 또는 ② 이 리간드 펩티드를 코딩하는 DNA 를 생리학적으로 인정되는 공지된 담체, 향미제, 부형제, 베히클, 방부제, 안정제, 결합제 등과 함께 일반적으로 인정된 제제 실시에 요구되는 단위용량형태로 혼합함으로써 제조할 수 있다. 이들 제제에서의 유효성분량은 지시된 범위의 적당한 용량을 얻을 수 있게 하는 것이다.
정제, 캡슐제 등에 혼합할 수 있는 첨가제로는 예컨대 젤라틴, 옥수수전분, 트라칸트, 아라비아고무와 같은 결합제, 결정성 셀룰로오스와 같은 부형제, 옥수수전분, 젤라틴, 알긴산 등과 같은 팽화 (膨化) 제, 스테아르산마그네슘과 같은 윤활제, 자당, 젖당 또는 사카린과 같은 감미제, 페파민트, 빨간색 오일 또는 체리와 같은 향미제 등이 사용될 수 있다. 제조 단위형태가 캡슐인 경우에는 상기 타입의 재료에 추가로 유지와 같은 액상 담체를 함유할 수 있다. 주사를 위한 무균조성물은 주사용 물과 같은 베히클 중의 활성물질, 참기름, 야자유 등과 같은 천연산출 식물유 등을 용해 또는 현탁시키는 등 통상적인 제제실시에 따라 처방할 수 있다. 주사용 수성액으로는 예컨대 생리식염수, 포도당 및 기타 보조약을 포함하는 등장액 (예컨대 D-솔비톨, D-만니톨, 염화나트륨 등) 등이 사용될 수 있고, 적당한 용해보조제, 예컨대 알코올 (예 : 에탄올), 폴리알코올 (예 : 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜), 비이온성 계면활성제 (예 : 폴리솔베이트 80 (TM), HCO-50) 등과 병용해도 된다. 유성액으로는 예컨대 참기름, 대두유 등이 사용되고,용해보조제인 벤조산 벤질, 벤질알코올 등과 병용해도 된다.
또한 상기 예방·치료제는 예컨대 완충제 (예컨대 인산염 완충액, 아세트산나트륨 완충액), 무통화제 (예컨대 염화벤잘코늄, 염산프로카인 등), 안정제 (예컨대 인체 혈청 알부민, 폴리에틸렌클리콜 등), 보존제 (예컨대 벤질알코올, 페놀 등), 산화방지제 등과 배합해도 된다. 제조된 주사액은 통상적으로 적당한 앰플에 충전된다.
이 같은 방법으로 얻은 제제는 안전하며 저독성이므로 예컨대 인체나 포유동물 (예컨대 래트, 마우스, 토끼, 양, 돼지, 소, 고양이, 개, 원숭이 등) 에 대하여 투여할 수 있다.
본 발명의 리간드 펩티드질 등의 투여량은 투여 대상, 대상 장기, 증상, 투여 방법 등에 따라 차이는 있지만, 경구 투여인 경우, 일반적으로 예컨대 암 환자 (60 ㎏) 는 하루에 약 0.1 ㎎ ∼ 100 ㎎, 바람직하게는 1.0 ∼ 50 ㎎, 보다 바람직하게는 약 1.0 ∼ 20 ㎎ 이다. 비경구적으로 투여하는 경우에는 그 1 회 투여량은 투여 대상, 대상 장기, 증상, 투여 방법 등에 따라 다르지만, 예컨대 주사제 형태로는 예컨대 암 환자 (60 ㎏) 는 하루에 약 0.01 ∼ 30 ㎎ 정도, 바람직하게는 약 0.1 ∼ 20 ㎎ 정도, 바람직하게는 약 0.1 ∼ 10 ㎎ 정도를 정맥주사로 투여하는 것이 바람직하다. 다른 동물의 경우에도, 60 ㎏ 당으로 환산한 양을 투여할 수 있다.
본 발명의 리간드 DNA 의 투여량은 투여 대상, 대상 장기, 증상, 투여 방법 등에 따라 차이는 있지만 경구 투여인 경우, 일반적으로 예컨대 암 환자 (60 ㎏)는 하루에 약 0.1 ㎎ ∼ 100 ㎎, 바람직하게는 약 1.0 ∼ 50 ㎎, 보다 바람직하게는 약 1.0 ㎎ ∼ 20 ㎎ 이다. 비경구적으로 투여하는 경우에는 그 1 회 투여량은 투여 대상, 대상 장기, 증상, 투여 방법 등에 따라 다르지만, 예컨대 주사제 형태로는 통상적으로 예컨대 암 환자 (60 ㎏) 는 하루에 약 0.01 ㎎ ∼ 30 ㎎ 정도, 바람직하게는 약 0.1 ∼ 20 ㎎ 정도, 보다 바람직하게는 약 0.1 ㎎ ∼ 10 ㎎ 정도를 정맥주사로 투여하는 것이 바람직하다. 다른 동물의 경우에도 60 ㎏ 당으로 환산한 양을 투여할 수 있다.
(2) 본 발명의 리셉터 단백질의 기능부전에 관련된 질환의 예방 및/또는 치료제
본 발명의 리셉터 단백질 등 또는 리셉터 단백질 등을 코딩하는 DNA 를 본 발명의 리셉터 단백질의 기능부전에 관련된 질환의 예방 및/또는 치료제 등의 의약으로 사용할 수 있다.
예컨대 생체내에서 본 발명의 리셉터 단백질이 감소하고 있기 때문에 리간드의 생리작용을 기대할 수 없는 (상기 리셉터 단백질의 결핍증) 환자가 있는 경우에 ① 본 발명의 리셉터 단백질 등을 이 환자에게 투여하여 이 리셉터 단백질 등의 양을 보충하거나, ② (가) 본 발명의 리셉터 단백질을 코딩하는 DNA 를 이 환자에게 투여하여 발현시킴으로써, 또는 (나) 대상이 되는 세포에 본 발명의 리셉터 단백질 등을 코딩하는 DNA 를 삽입하여 발현시킨 후에, 이 세포를 이 환자에게 이식함으로써, 환자 체내의 본 발명의 리셉터 단백질의 양을 증가시켜 리간드 작용을 충분히 발휘시킬 수 있다. 따라서 본 발명의 리셉터 단백질 등 및 본 발명의 리셉터단백질을 코딩하는 DNA 는 안전하며 저독성인 본 발명의 리셉터 단백질의 기능부전에 관련된 질환의 예방 및/또는 치료제 등의 의약으로서 유용하다.
본 발명의 리셉터 단백질 등 및 본 발명의 리셉터 단백질 등을 코딩하는 DNA 는 암전이 억제활성을 가지므로 모든 암 (예컨대 폐암, 위암, 간암, 췌장암, 대장암, 직장암, 결장암, 전립선암, 난소암, 자궁경암, 유방암 등) 의 예방 또는 치료약으로 유용하다.
또한 본 발명의 리셉터 단백질 등 또는 본 발명의 리간드 펩티드 및 본 발명의 리셉터 단백질 등 또는 본 발명의 리간드 펩티드를 코딩하는 DNA 는 태반기능 조절작용을 가지므로, 융모암, 포상기태, 침입기태, 유산, 태아의 발육부전, 당대사 이상, 지질대사 이상 또는 분만유발의 예방 또는 치료약으로 유용하다.
본 발명의 리셉터 단백질 등을 상기 예방·치료제로서 사용하는 경우에는 상투적인 수단에 따라 제제화할 수 있다.
한편, 본 발명의 리셉터 단백질 등을 코딩하는 DNA (이하, 본 발명의 DNA 라고 하는 경우가 있다) 를 상기 예방·치료제로서 사용하는 경우에는 본 발명의 DNA 를 단독 또는 레트로 바이러스 벡터, 아데노 바이러스 벡터, 아데노 바이러스-관련 바이러스 벡터 등의 적당한 벡터에 삽입한 후, 상투적인 수단에 따라 실시할 수 있다. 본 발명의 DNA 는 그대로 또는 섭취촉진을 위한 보조제와 함께 유전자 총이나 하이드로 겔 카테테르와 같은 카테테르로 투여할 수 있다.
예컨대 ① 본 발명의 리셉터 단백질 등 또는 ② 이 리셉터 단백질 등을 코딩하는 DNA 는 필요에 따라 당의를 실시한 정제, 캡슐제, 엘릭시르제, 마이크로캡슐제 등으로서 경구적으로 또는 물 또는 그 이외의 약학적으로 허용될 수 있는 액과의 무균성 용액, 또는 현탁액제 등의 주사제 형태로 비경구적으로 사용할 수 있다. 예컨대 ① 본 발명의 리셉터 단백질 등 또는 ② 이 리셉터 단백질 등을 코딩하는 DNA 를 생리학적으로 인정되는 공지된 담체, 향미제, 부형제, 베히클, 방부제, 안정제, 결합제 등과 함께 일반적으로 인정된 제제 실시에 요구되는 단위용량형태로 혼합함으로써 제조할 수 있다. 이들 제제에서의 유효성분량은 지시된 범위의 적당한 용량을 얻을 수 있게 하는 것이다.
정제, 캡슐제 등에 혼합할 수 있는 첨가제로는 예컨대 젤라틴, 옥수수전분, 트라칸트, 아라비아고무와 같은 결합제, 결정성 셀룰로오스와 같은 부형제, 옥수수전분, 젤라틴, 알긴산 등과 같은 팽화제, 스테아르산마그네슘과 같은 윤활제, 자당, 젖당 또는 사카린과 같은 감미제, 페파민트, 빨간색 오일 또는 체리와 같은 향미제 등이 사용될 수 있다. 제조 단위형태가 캡슐인 경우에는 상기 타입의 재료에 추가로 유지와 같은 액상 담체를 함유할 수 있다. 주사를 위한 무균조성물은 주사용 물과 같은 베히클 중의 활성물질, 참기름, 야자유 등과 같은 천연산출 식물유 등을 용해 또는 현탁시키는 등의 통상적인 제제실시에 따라 처방할 수 있다. 주사용 수성액으로는 예컨대 생리식염수, 포도당 및 기타 보조약을 포함하는 등장액 (예컨대 D-솔비톨, D-만니톨, 염화나트륨 등) 등이 사용될 수 있고, 적당한 용해보조제, 예컨대 알코올 (예 : 에탄올), 폴리알코올 (예 : 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜), 비이온성 계면활성제 (예 : 폴리솔베이트 80 (TM), HCO-50) 등과 병용해도 된다. 유성액으로는 예컨대 참기름, 대두유 등이 사용되고,용해보조제인 벤조산 벤질, 벤질알코올 등과 병용해도 된다.
또한 상기 예방·치료제는 예컨대 완충제 (예컨대 인산염 완충액, 아세트산나트륨 완충액), 무통화제 (예컨대 염화벤잘코늄, 염산프로카인 등), 안정제 (예컨대 인체 혈청 알부민, 폴리에틸렌클리콜 등), 보존제 (예컨대 벤질알코올, 페놀 등), 산화방지제 등과 배합해도 된다. 제조된 주사액은 통상적으로 적당한 앰플로 충전된다.
이 같은 방법으로 얻은 제제는 안전하며 저독성이므로 예컨대 인체나 포유동물 (예컨대 래트, 마우스, 토끼, 양, 돼지, 소, 고양이, 개, 원숭이 등) 에 대하여 투여할 수 있다.
본 발명의 리셉터 단백질 등의 투여량은 투여 대상, 대상 장기, 증상, 투여 방법 등에 따라 차이는 있지만, 경구 투여인 경우, 일반적으로 예컨대 암 환자 (60 ㎏) 는 하루에 약 0.1 ㎎ ∼ 100 ㎎, 바람직하게는 1.0 ∼ 50 ㎎, 보다 바람직하게는 약 1.0 ∼ 20 ㎎ 이다. 비경구적으로 투여하는 경우에는 그 1 회 투여량은 투여 대상, 대상 장기, 증상, 투여 방법 등에 따라 다르지만, 예컨대 주사제 형태로는 통상적으로 예컨대 암 환자 (60 ㎏) 는 하루에 약 0.01 ∼ 30 ㎎ 정도, 바람직하게는 약 0.1 ∼ 20 ㎎ 정도, 바람직하게는 약 0.1 ∼ 10 ㎎ 정도를 정맥주사로 투여하는 것이 바람직하다. 다른 동물의 경우에도 60 ㎏ 당으로 환산한 양을 투여할 수 있다.
본 발명의 리셉터 단백질을 코딩하는 DNA 의 투여량은 투여 대상, 대상 장기, 증상, 투여 방법 등에 따라 차이는 있지만 경구투여의 경우, 일반적으로 예컨대 암 환자 (60 ㎏) 는 하루에 약 0.1 ㎎ ∼ 100 ㎎, 바람직하게는 약 1.0 ∼ 50 ㎎, 보다 바람직하게는 약 1.0 ㎎ ∼ 20 ㎎ 이다. 비경구적으로 투여하는 경우에는 그 1 회 투여량은 투여 대상, 대상 장기, 증상, 투여 방법 등에 따라 다르지만, 예컨대 주사제 형태로는 통상적으로 예컨대 암 환자 (60 ㎏) 는 하루에 약 0.01 ㎎ ∼ 30 ㎎ 정도, 바람직하게는 약 0.1 ∼ 20 ㎎ 정도, 보다 바람직하게는 약 0.1 ㎎ ∼ 10 ㎎ 정도를 정맥주사로 투여하는 것이 바람직하다. 다른 동물의 경우에도 60 ㎏ 당으로 환산한 양을 투여할 수 있다.
(3) 유전자 진단제
본 발명의 리셉터 단백질을 코딩하는 DNA 또는 본 발명의 리간드 펩티드를 코딩하는 DNA 는 프로브로서 사용함으로써 인체 또는 포유동물 (예컨대 래트, 마우스, 토끼, 양, 돼지, 소, 고양이, 개, 원숭이 등) 에 있어서의 본 발명의 리셉터 단백질 등 또는 본 발명의 리간드 펩티드를 코딩하는 DNA 또는 mRNA 의 이상 (유전자 이상) 을 검출할 수 있어, 예컨대 이 DNA 또는 mRNA 의 손상, 돌연변이 또는 발현 저하나, 상기 DNA 또는 mRNA 의 증가 또는 발현 과다 등의 유전자 진단제로서 유용하다.
본 발명의 리셉터 단백질을 코딩하는 DNA 또는 본 발명의 리간드 펩티드를 코딩하는 DNA 를 이용하는 상기 유전자 진단은 예컨대, 자체 공지된 노던 하이브리드화이나 PCR-SSCP 법 (Genomics, 제5권, 874~879 p (1989년), Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 제86권, 2766~2770 p (1989년)) 등에 따라 실시할 수 있다.
(4) 본 발명의 리셉터 단백질 등에 대한 리간드의 정량 방법
본 발명의 리셉터 단백질 등은 리간드에 대하여 결합성을 갖고 있어 생체 내에서의 리간드 농도를 감도 높게 정량할 수 있다.
본 발명의 정량 방법은 예컨대, 경합법과 조합함으로써 이용할 수 있다. 즉 피검체를 본 발명의 리셉터 단백질 등과 접촉시킴으로써 피검체중의 리간드 농도를 측정할 수 있다. 구체적으로는 예컨대 이하의 ① 또는 ② 등에 기재된 방법 또는 그것에 준하는 방법에 따라 이용할 수 있다.
① 이리에 히로시편 「라디오 이뮤노 어세이」(고오단샤, 쇼와49(1974)년 발행)
② 이리에 히로시편 「속 라디오 이뮤노 어세이」(고오단샤, 쇼와54(1979)년 발행)
(5) 본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 염과 리간드 (본 발명의 리간드 펩티드) 의 결합성을 변화시키는 화합물 (작용물질, 길항물질 등) 의 스크리닝방법
본 발명의 리셉터 단백질 또는 그 염을 이용하거나 또는 재조합형 리셉터 단백질 등의 발현계를 구축하고, 이 발현계를 이용한 리셉터결합 분석계를 이용함으로써 리간드 (본 발명의 리간드 펩티드) 와 본 발명의 리셉터 단백질 등의 결합성을 변화시키는 화합물 (예컨대, 펩티드, 단백질, 비펩티드성 화합물, 합성화합물, 발효생산물 등) 또는 그 염을 효율적으로 스크리닝할 수 있다.
이와 같은 화합물에는 (가) G 단백질 공액형 리셉터를 매개로 하여 세포자극활성 (예컨대 아라키돈산 유리, 아세틸콜린 유리, 세포내 Ca2+유리, 세포내 cAMP 생성, 세포내 cGMP 생성, 이노시톨인산 생산, 세포막 전위변동, 세포내 단백질의 인산화, c-fos 의 활성화, pH 저하 등을 촉진하는 활성 또는 억제하는 활성 등) 을 갖는 화합물 (이른바 본 발명의 리셉터 단백질 등에 대한 작용물질), (나) 이 세포자극활성을 갖지 않는 화합물 (이른바 본 발명의 리셉터 단백질 등에 대한 길항물질), 또는 (다) 리간드 (본 발명의 리간드 펩티드) 와 본 발명의 리셉터 단백질의 결합력을 감소시키는 화합물 등이 포함된다 (또한 상기 (가) 의 화합물은 상기 리간드 결정방법에 의하여 스크리닝하는 것이 바람직하다).
즉 본 발명은 (i) 본 발명의 리셉터 단백질 등 과 리간드 (본 발명의 리간드 펩티드) 를 접촉시킨 경우와, (ii) 본 발명의 리셉터 단백질 등과 리간드 (본 발명의 리간드 펩티드) 및 시험화합물을 접촉시킨 경우를 비교하는 것을 특징으로 하는 리간드 (본 발명의 리간드 펩티드) 와 본 발명의 리셉터 단백질 등의 결합성을 변화시키는 화합물 또는 그 염의 스크리닝방법을 제공한다.
본 발명의 스크리닝방법에 있어서는, (i) 과 (ii) 의 경우의 예컨대 이 리셉터 단백질 등에 대한 리간드 (본 발명의 리간드 펩티드) 의 결합량, 세포자극활성 등을 측정하여 비교하는 것을 특징으로 한다.
더 구체적으로는, 본 발명은
① 표지한 리간드 (본 발명의 리간드 펩티드) 를 본 발명의 리셉터 단백질 등에 접촉시킨 경우와, 표지한 리간드 (본 발명의 리간드 펩티드) 및 시험화합물을본 발명의 리셉터 단백질 등에 접촉시킨 경우, 표지한 리간드 (본 발명의 리간드 펩티드) 의 이 리셉터 단백질 등에 대한 결합량을 측정하여 비교하는 것을 특징으로 하는 리간드 (본 발명의 리간드 펩티드) 와 본 발명의 리셉터 단백질 등의 결합성을 변화시키는 화합물 또는 그 염의 스크리닝방법,
② 표지한 리간드 (본 발명의 리간드 펩티드) 를 본 발명의 리셉터 단백질 등을 함유하는 세포 또는 이 세포의 막 분획에 접촉시킨 경우와, 표지한 리간드 (본 발명의 리간드 펩티드) 및 시험화합물을 본 발명의 리셉터 단백질 등을 함유하는 세포 또는 이 세포의 막 분획에 접촉시킨 경우, 표지한 리간드 (본 발명의 리간드 펩티드) 의 이 세포 또는 이 막 분획에 대한 결합량을 측정하여 비교하는 것을 특징으로 하는 리간드 (본 발명의 리간드 펩티드) 와 본 발명의 리셉터 단백질 등의 결합성을 변화시키는 화합물 또는 그 염의 스크리닝방법,
③ 표지한 리간드 (본 발명의 리간드 펩티드) 를 본 발명의 DNA 를 함유하는 형질 전환체를 배양함으로써 세포막상에 발현한 리셉터 단백질 등에 접촉시킨 경우와, 표지한 리간드 (본 발명의 리간드 펩티드) 및 시험화합물을 본 발명의 DNA 를 함유하는 형질 전환체를 배양함으로써 세포막상에 발현한 본 발명의 리셉터 단백질 등에 접촉시킨 경우, 표지한 리간드 (본 발명의 리간드 펩티드) 의 이 리셉터 단백질 등에 대한 결합량을 측정하여 비교하는 것을 특징으로 하는 리간드 (본 발명의 리간드 펩티드) 와 본 발명의 리셉터 단백질 등의 결합성을 변화시키는 화합물 또는 그 염의 스크리닝방법,
④ 본 발명의 리셉터 단백질 등을 활성화시키는 화합물 (예컨대, 본 발명의리셉터 단백질 등에 대한 리간드 등) 을 본 발명의 리셉터 단백질 등을 함유하는 세포에 접촉시킨 경우와, 본 발명의 리셉터 단백질 등을 활성화시키는 화합물 및 이 시험화합물을 본 발명의 리셉터 단백질 등을 함유하는 세포에 접촉시킨 경우에 있어서의 리셉터를 통한 세포자극활성 (예컨대, 아라키돈산 유리, 아세틸콜린 유리, 세포내 Ca2+유리, 세포내 cAMP 생성, 세포내 cGMP 생성, 이노시톨인산 생산, 세포막 전위변동, 세포내 단백질의 인산화, c-fos 의 활성화, pH 저하 등을 촉진하는 활성 또는 억제하는 활성 등) 을 측정하여 비교하는 것을 특징으로 하는 리간드 (본 발명의 리간드 펩티드) 와 본 발명의 리셉터 단백질 등의 결합성을 변화시키는 화합물 또는 그 염의 스크리닝방법 및,
⑤ 본 발명의 리셉터 단백질 등을 활성화시키는 화합물 (예컨대, 본 발명의 리셉터 단백질 등에 대한 리간드 (본 발명의 리간드 펩티드) 등) 을 본 발명의 DNA 를 함유하는 형질 전환체를 배양함으로써 세포막상에 발현한 본 발명의 리셉터 단백질 등에 접촉시킨 경우와, 본 발명의 리셉터 단백질 등을 활성화시키는 화합물 및 이 시험화합물을 본 발명의 DNA 를 함유하는 형질 전환체를 배양함으로써 세포막상에 발현한 본 발명의 리셉터 단백질 등에 접촉시킨 경우, 리셉터를 매개로 한 세포자극활성 (예컨대, 아라키돈산 유리, 아세틸콜린 유리, 세포내 Ca2+유리, 세포내 cAMP 생성, 세포내 cGMP 생성, 이노시톨인산 생산, 세포막 전위변동, 세포내 단백질의 인산화, c-fos 의 활성화, pH 저하 등을 촉진하는 활성 또는 억제하는 활성 등) 을 측정하여 비교하는 것을 특징으로 하는 리간드 (본 발명의 리간드 펩티드)와 본 발명의 리셉터 단백질 등의 결합성을 변화시키는 화합물 또는 그 염의 스크리닝방법 등을 제공한다.
본 발명의 리셉터 단백질 등을 얻기 이전에는, G 단백질 공액형 리셉터 작용물질 또는 길항물질을 스크리닝하는 방법, G 단백질 공액형 리셉터 단백질을 함유하는 세포, 조직 또는 그 세포막 분획을 이용하여 G 단백질 공액형 리셉터 단백질과 리간드의 결합을 저해하는지의 여부를 확인하는 방법이 채택되었다. 그러나 세포, 조직 또는 세포막 분획을 그대로 이용하면 다른 리셉터 단백질도 혼재하므로, 목적하는 리셉터 단백질에 대한 작용물질 또는 길항물질을 실제로 스크리닝하는 것은 어려웠다.
그러나 예컨대, 본 발명의 리셉터 단백질 등을 이용함으로써, 리간드와 G 단백질 공액형 리셉터 단백질의 결합을 저해하는 화합물을 효율적으로 스크리닝할 수 있다. 또한 스크리닝된 화합물이 작용물질인지 길항물질인지를 간편하게 평가할 수 있다.
본 발명의 스크리닝방법의 구체적인 설명을 이하에 한다.
먼저 본 발명의 스크리닝방법에 이용되는 본 발명의 리셉터 단백질로는 상기 본 발명의 리셉터 단백질 등을 함유하는 것이면 어느 것이라도 좋으나, 본 발명의 리셉터 단백질 등을 함유하는 포유동물 장기의 세포막 분획이 적합하다. 그러나 스크리닝에 이용하는 대량의 리셉터 단백질을 얻기 위해서는 재조합체를 이용하여 대량 발현시킨 리셉터 단백질 등이 적합하다.
본 발명의 리셉터 단백질 등을 제조하기 위해서는 상술한 방법이 이용되는데, 본 발명의 DNA 를 포유세포나 곤충세포로 발현함으로써 실시하는 것이 바람직하다. 목적하는 단백질부분을 코딩하는 DNA 단편에는 상보 DNA 가 이용되는데, 반드시 이것에 제약되는 것은 아니다. 예컨대, 유전자 단편이나 합성 DNA 를 이용해도 된다. 본 발명의 리셉터 단백질을 코딩하는 DNA 단편을 숙주동물세포에 도입하여 이들을 효율적으로 발현시키기 위해서는, 이 DNA 단편을 곤충을 숙주로 하는 바큘로 바이러스에 속하는 핵다각체병 바이러스 (nuclear polyhedrosis virus; NPV) 의 폴리헤드린 프로모터, SV40 유래의 프로모터, 레트로 바이러스의 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터, 인체 히트쇼크 프로모터, 사이토메갈로 바이러스 프로모터, SRα프로모터 등의 하류에 결합하는 것이 바람직하다. 발현한 리셉터의 양과 질의 검사는 그 자체 공지의 방법으로 실시할 수 있다. 예컨대, 문헌 (Nambi, P. 등, The Journal of Biological Chemistry, 267권, 19555~19559 p, 1992년) 에 기재된 방법에 따라 실시할 수 있다.
따라서 본 발명의 스크리닝방법에 있어서, 본 발명의 리셉터 단백질 등을 함유하는 것으로는 그 자체 공지된 방법에 따라 정제한 리셉터 단백질 등이어도 되고, 이 리셉터 단백질 등을 함유하는 세포를 이용해도 되며, 또한 이 리셉터 단백질 등을 함유하는 세포의 막 분획을 이용해도 된다.
본 발명의 스크리닝방법에 있어서, 본 발명의 리셉터 단백질 등을 함유하는 세포를 이용하는 경우, 이 세포를 글루탈알데히드, 포르말린 등으로 고정화해도 된다. 고정화방법은 그 자체 공지된 방법에 따라 실시할 수 있다.
본 발명의 리셉터 단백질 등을 함유하는 세포로는 이 리셉터 단백질 등을 발현한 숙주세포를 말하는데, 이 숙주세포로는 대장균, 고초균, 효모, 곤충세포, 동물세포 등이 바람직하다.
세포막 분획으로는 세포를 파쇄한 후, 그 자체 공지된 방법으로 얻은 세포막이 다량 함유되는 분획을 말한다. 세포의 파쇄방법으로는 Potter-Elvehjem 형 호모지나이저로 세포를 부수는 방법, 워링블렌더나 폴리트론 (Kinematica 사 제조) 에 의한 파쇄, 초음파에 의한 파쇄, 프렌치프레스 등으로 가압하면서 세포를 가는 노즐에서 분출시키는 것에 의한 파쇄 등을 들 수 있다. 세포막의 분획에는 분획 원심분리법이나 밀도구배 원심분리법 등의 원심력에 의한 분획법이 주로 사용될 수 있다. 예컨대, 세포파쇄액을 저속 (500 rpm ~ 3000 rpm) 으로 단시간 (통상적으로 약 1 분 ~ 10 분) 원심하고, 상등액을 다시 고속 (15000 rpm ~ 30000 rpm) 으로 통상적으로 30 분 ~ 2 시간 원심하여 얻은 침전을 막 분획으로 한다. 이 막 분획중에는 발현한 리셉터 단백질 등과 세포유래의 인지질이나 막단백질 등의 막성분이 다량 함유된다.
이 리셉터 단백질 등을 함유하는 세포나 막 분획중의 리셉터 단백질의 양은 1 세포당 103~ 108분자인 것이 바람직하며, 105~ 107분자인 것이 적합하다. 또한 발현량이 많을수록 막 분획당 리간드 결합성분 (비활성) 이 높아져 고감도의 스크리닝계의 구축이 가능해질 뿐만 아니라 동일 로트로 대량의 시료를 측정할 수 있게 된다.
리간드 (본 발명의 리간드 펩티드) 와 본 발명의 리셉터 단백질의 결합성을변화시키는 화합물을 스크리닝하는 상기 ① ~ ③ 을 실시하게 위해서는, 예컨대 적당한 리셉터 단백질 분획과 표지한 리간드가 필요하다.
리셉터 단백질 분획으로는 천연형 리셉터 단백질 분획이나 또는 그것과 동등한 활성을 갖는 재조합형 리셉터 단백질 분획 등이 바람직하다. 여기서 동등한 활성이란 동등한 리간드 결합 활성, 시그널정보 전달작용 등을 나타낸다.
표지한 리간드로는 표지한 리간드, 표지한 리간드아날로그화합물 등이 사용될 수 있다. 예컨대, 〔3H〕, 〔125I〕, 〔14C〕, 〔35S〕 등으로 표지한 리간드 등이 사용될 수 있다.
구체적으로는 리간드 (본 발명의 리간드 펩티드) 와 본 발명의 리셉터 단백질 등의 결합성을 변화시키는 화합물의 스크리닝을 실시하기 위해서는, 먼저 본 발명의 리셉터 단백질 등을 함유하는 세포 또는 세포의 막 분획을 스크리닝에 적합한 버퍼로 현탁함으로써 리셉터 단백질 표품을 조제한다. 버퍼에는 pH 4 ~ 10 (바람직하게는 pH 6 ~ 8) 의 인산버퍼, 트리스염산버퍼 등의 리간드와 리셉터 단백질의 결합을 저해하지 않는 버퍼라면 어느 것이라도 좋다. 또한 비특이적 결합을 저감시키는 목적에서, CHAPS, 트윈-80TM(가오-아트라스 사), 디기토닌, 디옥시콜레이트 등의 계면활성제를 버퍼에 첨가할 수도 있다. 또한 프로테아제에 의한 리셉터나 리간드 (본 발명의 리간드 펩티드) 의 분해를 억제하는 목적에서, PMSF, 로이펩틴, E-64 (펩티드 겡꾸쇼 제조), 펩스타틴 등의 프로테아제 저해제를 첨가할 수 있다. 0.01 ㎖ ~ 10 ㎖ 의 이 리셉터용액에 일정량 (5000 cpm ~ 500000cpm) 의 표지한 리간드 (본 발명의 리간드 펩티드) 를 첨가하고, 동시에 10-4M ~ 10-10M 의 시험화합물을 공존시킨다. 비특이적 결합량 (NSB) 을 알기 위해 대과잉 미표지 리간드 (본 발명의 리간드 펩티드) 를 첨가한 반응튜브도 준비한다. 반응은 약 0 ℃ 에서 50 ℃, 바람직하게는 약 4 ℃ 에서 37 ℃ 에서, 약 20 분에서 24 시간, 바람직하게는 약 30 분에서 3 시간 실시한다. 반응후, 유리섬유 여과지 등으로 여과하고, 적량의 동 버퍼로 세정한 후, 유리섬유 여과지에 잔존하는 방사활성을 액체 신틸레이션카운터 또는 γ-카운터로 계측한다. 길항 물질이 없는 경우의 카운트 (B0) 에서 비특이적 결합량 (NSB) 을 뺀 카운트 (B0-NSB) 를 100 % 로 하였을 때, 특이적 결합량 (B-NSB) 이 예컨대 50 % 이하가 되는 시험화합물을 길항적으로 저해능력이 있는 후보물질로서 선택할 수 있다.
리간드 (본 발명의 리간드 펩티드) 와 본 발명의 리셉터 단백질 등의 결합성을 변화시키는 화합물 스크리닝하는 상기 ④ ~ ⑤ 의 방법을 실시하기 위해서는, 예컨대 리셉터 단백질을 매개로 한 세포자극활성 (예컨대, 아라키돈산 유리, 아세틸콜린 유리, 세포내 Ca2+유리, 세포내 cAMP 생성, 세포내 cGMP 생성, 이노시톨인산 생산, 세포막 전위변동, 세포내 단백질의 인산화, c-fos 의 활성화, pH 저하 등을 촉진하는 활성 또는 억제하는 활성 등) 을 공지된 방법 또는 시판되는 측정용 키트를 이용하여 측정할 수 있다.
구체적으로는 먼저, 본 발명의 리셉터 단백질 등을 함유하는 세포를 멀티웰플레이트 등에 배양한다. 스크리닝을 할 때는 미리 신선한 배지 또는 세포에 독성을 나타내지 않는 적당한 버퍼로 교환하고, 시험화합물 등을 첨가하여 일정시간 인큐베이팅한 후, 세포를 추출 또는 상등액을 회수하여 생성한 산물을 각각의 방법에 따라 정량한다. 세포자극활성의 지표로 하는 물질 (예컨대, 아라키돈산 등) 의 생성이 세포가 함유하는 분해효소에 의하여 검정이 어려운 경우는 이 분해효소에 대한 저해제를 첨가하여 분석을 실시해도 된다. 또한 cAMP 생산억제 등의 활성에 관해서는 폴스콜린 (forskolin) 등으로 세포의 기초적 생산량을 증대시켜 둔 세포에 대한 생산억제작용으로서 검출할 수 있다.
세포자극활성을 측정하여 스크리닝을 실시하기 위해서는, 적당한 리셉터 단백질을 발현한 세포가 필요하다. 본 발명의 리셉터 단백질 등을 발현한 세포로는 천연형의 본 발명의 리셉터 단백질 등을 갖는 세포주, 상술한 재조합형 리셉터 단백질 등을 발현한 세포주 등이 바람직하다.
시험화합물로는 예컨대, 펩티드, 단백, 비펩티드성 화합물, 합성화합물, 발효생산물, 세포추출액, 식물추출액, 동물조직추출액 등이 사용되며, 이들 화합물은 신규 화합물이어도 되고, 공지된 화합물이어도 된다.
리간드 (본 발명의 리간드 펩티드) 와 본 발명의 리셉터 단백질 등의 결합성을 변화시키는 화합물 또는 그 염의 스크리닝용 키트는 본 발명의 리셉터 단백질 등, 본 발명의 리셉터 단백질 등을 함유하는 세포, 또는 본 발명의 리셉터 단백질 등을 함유하는 세포의 막 분획을 함유하는 것 등이다.
본 발명의 스크리닝용 키트의 예로는 다음을 것을 들 수 있다.
1. 스크리닝용 시약
① 측정용 완충액 및 세정용 완충액
행크 균형 염 용액 (Hanks' Balanced Salt Solution) (기부꼬사 제조) 에 0.05 % 의 소 혈청 알부민 (시그마사 제조) 을 첨가한 것.
홀 직경 0.45 ㎛ 의 필터로 여과 멸균하고, 4 ℃ 에서 보존하거나 또는 사용시 조제해도 된다.
② G 단백질 공액형 리셉터 표품
본 발명의 리셉터 단백질을 발현시킨 CHO 세포를 12 홀 플레이트에 5×105개/홀로 계를 이으며, 37 ℃, 5 % CO2, 95 % 공기에서 2 일간 배양한 것.
③ 표지리간드
시판되는 〔3H〕, 〔125I〕, 〔14C〕, 〔35S〕 등으로 표지한 리간드
수용액 상태의 것을 4 ℃ 또는 -20 ℃ 에서 보존하고, 사용시에 측정용 완충액으로 1 μM 으로 희석한다.
④ 리간드 표준액
리간드를 0.1% 소 혈청 알부민 (시그마사 제조) 을 함유한 PBS 로 1mM 가 되도록 용해시키고 -20℃ 에서 보존한다.
2. 측정법
① 12 홀 조직 배양용 플레이트에서 배양한 본 발명의 리셉터 단백질 발현 CHO 세포를 측정용 완충액 1㎖ 로 2회 세정한 후 490㎕ 의 측정용 완충액을 각 홀에 첨가한다.
② 10-3∼ 10-10M 의 시험화합물 용액을 5㎕ 첨가한 후 표지 리간드를 5㎕ 첨가하고 실온에서 1시간 반응시킨다. 비특이적 결합량을 알기 위해서는 시험화합물 대신에 10-3M 의 리간드를 5㎕ 첨가해둔다.
③ 반응액을 제거하고 1㎖ 의 세정용 완충액으로 3회 세정한다. 세포에 결합된 표지 리간드를 0.2N NaOH-1%SDS 로 용해시키고 4㎖ 액체 신틸레이터 A (와꼬오 쥰야꾸 제조) 와 혼합시킨다.
④ 액체 신틸레이션 카운터 (벡만샤 제조) 를 사용하여 방사활성을 측정하고 최대 결합 백분율 (PMB) 를 다음식으로 구한다.
PMB = [ (B-NSB)/(B0- NSB) ] X 100
PMB : 최대 결합 백분율 (Percent Maximum Binding)
B : 검체를 첨가하였을 때 값
NSB : 비특이적 결합량 (Non-specific Binding)
B0: 최대 결합량
본 발명의 스크리닝 방법 또는 스크리닝용 키트를 사용하여 얻을 수 있는 화합물 또는 그 염은 리간드 (본 발명의 리간드 펩티드) 와 본 발명의 리셉터 단백질의 결합성을 변화시키는 작용을 갖는 화합물로, 구체적으로는 (가) G단백질 공액형 리셉터를 매개로 하여 세포자극활성 (예컨대, 아라키돈산 유리, 아세틸콜린 유리,세포내 Ca2+유리, 세포내 cAMP 생성, 세포내 cGmP 생성,이노시톨인산 생산, 세포막 전위변동, 세포내 단백질의 인산화, c-fos 활성화, pH 저하 등을 촉진시키는 방법 또는 억제하는 활성 등) 을 갖는 화합물 (이른바, 본 발명의 리셉터 단백질에 대한 작용물질), (나) 이 세포자극활성을 갖지 않는 화합물 (이른바, 본 발명의 리셉터 단백질에 대한 길항물질), 또는 (다) 리간드 (본 발명의 리간드 펩티드) 와 본 발명의 리셉터 단백질의 결합력을 감소시키는 화합물이다.
이 화합물로는 펩티드, 단백, 비펩티드성 화합물, 합성화합물, 발효생산물 등을 들 수 있고, 이들 화합물은 신규 화합물이어도 되고, 공지된 화합물이어도 된다.
본 발명의 리셉터 단백질 등에 대한 작용물질은 본 발명의 리셉터 단백질 등에 대한 리간드 (본 발명의 리간드 펩티드) 가 갖는 생리활성과 동일한 작용을 갖고 있어 이 리간드 활성에 따라 안전하며 저독성인 의약으로 유용하다.
구체적으로는 본 발명의 리셉터 단백질 등에 대한 작용물질은 암전이 억제활성을 갖기 때문에 모든 암 (예컨대, 폐암, 위암, 간암, 췌장암, 대장암, 직장암, 결장암, 전립선암, 난소암, 자궁경암, 유방암 등) 의 예방 또는 치료약으로 유용하다.
또, 본 발명의 리셉터 단백질 등에 대한 작용물질은 태반기능 조절작용을 갖기 때문에 융모암, 포상기태, 침입기태, 유산, 유아의 발육부전, 당대사 이상, 지질대사 이상 또는 분만유발의 예방 또는 치료약으로 유용하다.
본 발명의 리셉터 단백질 등에 대한 길항물질은 본 발명의 리셉터 단백질 등에 대한 리간드 (본 발명의 리간드 펩티드) 가 갖는 생리활성을 억제할 수 있어 이 리간드 활성을 억제하는 안전하며 저독성인 의약으로서 유용하다.
리간드 (본 발명의 리간드 펩티드) 와 본 발명의 리셉터 단백질의 결합력을 감소시키는 화합물은 본 발명의 리셉터 단백질 등에 대한 리간드 (본 발명의 리간드 펩티드) 가 갖는 생리활성을 감소시키기 위한 안전하며 저독성인 의약으로서 유용하다.
본 발명의 스크리닝 방법 또는 스크리닝용 키트를 사용하여 얻을 수 있는 화합물 또는 그 염을 상술한 의약조성물로서 사용하는 경우 상투적인 수단에 따라 실시할 수 있다. 예컨대, 상기한 본 발명의 DNA 을 함유한 의약과 동일하게 하여 정제, 캡슐제, 엘릭시르제, 마이크로캡슐제, 무균성 용액, 현탁액제 등으로 할 수 있다.
이렇게 해서 얻은 제제는 안전하며 저독성이기 때문에 예컨대 인체나 포유동물 (예컨대, 래트, 마우스, 토끼, 양, 돼지, 소, 고양이, 개, 원숭이 등) 에 대하여 투여할 수 있다.
이 화합물 또는 그 염 (작용물질의 경우) 의 투여량은 투여 대상, 대상 장기, 증상, 투여 방법 등에 따라 차이는 있지만, 경구 투여인 경우 일반적으로 예컨대 암 환자 (60㎏) 는 하루에 약 0.1 ∼ 100㎎, 바람직하게는 약 1.0 ∼ 50㎎, 더 바람직하게는 약 1.0 ∼ 20㎎ 이다. 비경구적으로 투여하는 경우에는 그 1회 투여량은 투여 대상, 대상 장기, 증상, 투여 방법에 따라서도 다르지만, 예컨대 주사제 형태로는 통상적으로 예컨대 암 환자 (60㎏) 는 하루에 약 0.01 ∼ 30㎎ 정도, 바람직하게는 약 0.1 ∼ 20㎎ 정도, 더 바람직하게는 약 0.1 ∼ 10㎎ 정도를 정맥 주사로 투여하는 것이 바람직하다. 다른 동물의 경우에도 60㎏ 당으로 환산한 양을 투여할 수 있다.
(6) 본 발명의 리셉터 단백질 등과 리간드 (본 발명의 리간드 펩티드) 의 결합성을 변화시키는 화합물 (작용물질, 길항물질) 을 함유한 각종 질병 예방 및/또는 치료제
본 발명의 리셉터 단백질 등은 상술한 바와 같이 예컨대 암전이 억제작용 등 생체 내에서 어떠한 중요한 역할을 다하고 있다. 따라서, 본 발명의 리셉터 단백질 등과 리간드 (본 발명의 리간드 펩티드) 의 결합성을 변화시키는 화합물 (작용물질, 길항물질) 은 본 발명의 리셉터 단백질 등의 기능 부전에 관련된 질환 예방 및/또는 치료제로서 사용할 수 있다.
이 화합물을 본 발명의 리셉터 단백질 등의 기능 부전에 관련된 질환 예방 및/또는 치료제로서 사용하는 경우에는 상투적인 수단에 따라 제제화시킬 수 있다.
예컨대, 이 화합물은 필요에 따라 당의를 실시한 정제, 캡슐제, 엘릭시르제, 마이크로캡슐제 등으로서 경구적으로, 또는 물 또는 그 이외의 약학적으로 허용할 수 있는 액과의 무균성 용액, 또는 현탁액제 등의 주사제 형태로 비경구적으로 사용할 수 있다. 예컨대 이 화합물을 생리학적으로 인정되는 공지된 담체, 향미제, 부형제, 베히클, 방부제, 안정제, 결합제 등과 함께 일반적으로 인정된 제제 실시에 요구되는 단위용량형태로 혼합함으로써 제조할 수 있다. 이들 제제에서의 유효 성분량은 지시된 범위의 적당한 용량을 얻을 수 게 하는 것이다.
정제, 캡슐제 등에 혼합할 수 있는 첨가제로는 예컨대, 젤라틴, 옥수수전분, 트라칸트, 아라비아고무와 같은 결합제, 결정성 셀룰로오스와 같은 부형제, 옥수수전분, 젤라틴, 알긴산 등과 같은 팽화제, 스테아르산 마그네슘과 같은 윤활제, 자당, 젖당 또는 사카린과 같은 감미제, 페파민트, 빨간색 오일 또는 체리와 같은 향미제 등이 사용될 수 있다. 조제단위형태가 캡슐인 경우에는 상기 타입의 재료에 추가로 유지와 같은 액상 담체를 함유할 수 있다. 주사를 위한 무균 조성물은 주사용 물과 같은 베히클 중의 활성 물질, 참깨유, 야자유 등과 같은 천연산출 식물유 등을 용해 또는 현탁시키는 등 통상적인 제제 실시에 따라 처방할 수 있다. 주사용의 수성액으로는 예컨대 생리식염수, 포도당이나 그 밖의 보조약을 함유한 등장액 (예컨대, D-솔비톨, D-만니톨, 염화나트륨 등) 등이 사용될 수 있고, 적당한 용해보조제, 예컨대 알콜 (예, 에탄올), 폴리알콜 (예, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜), 비이온성 계면활성제 (예, 폴리솔베이트 80(TM), HCO-50) 등과 병용해도 된다. 유성액으로는 예컨대 참깨유, 대두유 등이 사용될 수 있고, 용해보조제인 벤조산벤질, 벤질알콜 등과 병용해도 된다.
또, 상기 예방 ·치료제는 예컨대 완충제 (예컨대, 인산염 완충액, 아세트산나트륨 완충액), 무통화제 (예컨대 염화벤잘코늄, 염산프로카인 등), 안정제 (예컨대 인체 혈청 알부민, 폴리에틸렌글리콜 등), 보존제 (예컨대 벤질알콜, 페놀 등), 산화방지제 등과 배합해도 된다. 조제된 주사액은 통상적으로 적당한 앰플로 충전된다.
이렇게 해서 얻은 제제는 안전하며 저독성이기 때문에 예컨대 인체나 포유동물 (예컨대, 래트, 마우스, 토끼, 양, 돼지, 소, 고양이, 개, 원숭이 등) 에 대하여 투여할 수 있다.
이 화합물 또는 그 염 (작용물질의 경우) 의 투여량은 투여 대상, 대상 장기, 증상, 투여 방법 등에 따라 차이는 있지만, 경구 투여인 경우 일반적으로 예컨대 암 환자 (60㎏) 는 하루에 약 0.1 ∼ 100㎎, 바람직하게는 약 1.0 ∼ 50㎎, 더 바람직하게는 약 1.0 ∼ 20㎎ 이다. 비경구적으로 투여하는 경우에는 그 1회 투여량은 투여 대상, 대상 장기, 증상, 투여 방법에 따라서도 다르지만, 예컨대 주사제 형태로는 통상적으로 예컨대 암 환자 (60㎏) 는 하루에 약 0.01 ∼ 30㎎ 정도, 바람직하게는 약 0.1 ∼ 20㎎ 정도, 더 바람직하게는 약 0.1 ∼ 10㎎ 정도를 정맥 주사로 투여하는 것이 바람직하다. 다른 동물의 경우에도 60㎏ 당으로 환산한 양을 투여할 수 있다.
(7) 본 발명의 리셉터 단백질과 또는 본 발명의 리간드 펩티드의 정량
본 발명의 리셉터 단백질 또는 본 발명의 리간드 펩티드에 대한 항체는 본 발명의 리셉터 단백질과 또는 본 발명의 리간드 펩티드를 특이적으로 인식할 수 있어, 피검액 중의 본 발명의 리셉터 단백질 등 또는 본 발명의 리간드 펩티드의 정량, 특히 샌드위치 면역 측정법에 의한 정량 등에 사용할 수 있다. 즉, 본 발명은 예컨대 (i) 본 발명의 리셉터 단백질 등 또는 본 발명의 리간드 펩티드에 대한 항체와 피검액 및 표지화 리셉터 단백질 등 또는 본 발명의 리간드 펩티드를 경합적으로 반응시키고, 이 항체에 결합된 표지화 리셉터 단백질 등 또는 본 발명의리간드 펩티드의 비율을 측정하는 것을 특징으로 하는 피검액 중의 본 발명의 리셉터 단백질 등 또는 본 발명의 리간드 펩티드의 정량 방법,
(ii) 피검액과 담체 상에 불용화된 본 발명의 리셉터 단백질 등 또는 본 발명의 리간드 펩티드에 대한 항체 및 표지화된 본 발명의 리셉터 단백질 등 또는 본 발명의 리간드 펩티드에 대한 항체를 동시 또는 연속적으로 반응시킨 후, 불용화 담체상의 표지제의 활성을 측정하는 것을 특징으로 하는 피검액 중의 본 발명의 리셉터 단백질 등 또는 본 발명의 리간드 펩티드의 정량 방법을 제공한다.
상기 (ii) 에서는 일측 항체는 본 발명의 리셉터 단백질 등 또는 본 발명의 리간드 펩티드의 N 말단 부위를 인식하는 항체이고, 타측 항체는 본 발명의 리셉터 단백질 등 또는 본 발명의 리간드 펩티드의 C 말단부에 반응하는 항체인 것이 바람직하다.
본 발명의 리셉터 단백질 등 또는 본 발명의 리간드 펩티드에 대한 모노클로날 항체 (이하, 본 발명의 모노클로날 항체라고 하는 경우가 있다) 를 사용하여 본 발명의 리셉터 단백질 등 또는 본 발명의 리간드 펩티드를 측정할 수 있는 것 이외에 조직 염색 등에 의한 검출을 할 수도 있다. 이들 목적에는 항체 분자 그 자체를 사용해도 되고, 또 항체 분자의 F(ab')2, Fab' 또는 Fab 분획을 사용해도 된다. 본 발명의 리셉터 단백질 등 또는 본 발명의 리간드 펩티드에 대한 항체를 사용하는 측정법은 특별히 제한되지 않지만, 피측정액 중의 항원량 (예컨대, 리셉터 단백질량 또는 본 발명의 리간드 펩티드) 에 대응한 항체, 항원 또는 항체-항원복합체의 화학적 또는 물리적 수단으로 검출하고, 그것을 이미 알려진 양의 항원을 함유한 표준액을 사용하여 제작된 표준 곡선에서 산출하는 측정법이면 어떠한 측정법을 사용해도 된다. 예컨대, 네프로메트리, 경합법, 이뮤노 메트릭법 및 샌드위치법이 바람직하게 사용될 수 있으나, 감도, 특이성이라는 점에서 후술하는 샌츠위치법을 사용하는 것이 특히 바람직하다.
표지물질을 사용하는 측정법에 사용되는 표지제로서는 예컨대 방사성 동위원소, 효소, 형광물질, 발광물질 등이 사용될 수 있다. 방사성 동위원소로서는 [125I], [131I], [3H], [14C] 등이 사용될 수 있다. 상기 효소로서는 안정적이며 비활성이 큰 것이 바람직하고, 예컨대 β-갈락토시다아제, β-글루코시다아제, 알칼리포스파타아제, 퍼옥시다아제, 말산탈수소효소 등이 사용될 수 있다. 형광물질로는 예컨대 플루오레스카민, 플루오레센이소티오시아네이트 등이 사용될 수 있다. 발광물질로는 예컨대 루미놀, 루미놀 유도체, 루시페린, 루시게닌 등이 사용될 수 있다. 또한, 항체 또는 항원과 표지제의 결합에 비오틴-아비딘계를 사용할 수도 있다.
항원 또는 항체의 불용화에 있어서는 물리 흡착을 사용해도 되고, 또한 통상적으로 단백질 또는 효소 등을 불용화, 고용화시키는 데에 사용될 수 있는 화학 결합을 사용하는 방법이어도 된다. 담체로는 예컨대 아가로오스, 덱스트란, 셀룰로오스 등의 불용성 다당류, 폴리스티렌, 폴리아크릴아미드, 실리콘 등의 합성수지, 또는 유리 등이 사용될 수 있다.
샌드위치법에서는 불용화된 본 발명의 모노클로날 항체에 피검액을 반응시키고 (1차 반응), 그리고 표지화된 본 발명의 모노클로날 항체를 반응시킨 (2차 반응) 후, 불용화 담체상의 표지제의 활성을 측정함으로써 피검액 중의 본 발명의 리셉터 단백질 또는 본 발명의 리간드 펩티드를 정량할 수 있다. 1차 반응과 2차 반응은 반대 순서로 실시해도 또한 동시에 실시해도 되고 시간을 달리하여 실시해도 된다. 표지화제 및 불용화의 방법은 상기의 그것들에 준할 수 있다.
또, 샌드위치법에 의한 면역측정법에서 고상용 항체 또는 표지용 항체에 사용되는 항체는 반드시 1 종류일 필요는 없고, 측정 감도를 향상시키는 등 목적으로 2종류 이상의 항체의 혼합물을 사용해도 된다.
본 발명의 샌드위치법에 의한 리셉터 단백질 등 또는 본 발명의 리간드 펩티드의 측정법에서는 1차 반응과 2차 반응에 사용되는 본 발명의 모노클로날 항체는 리셉터 단백질 등이 결합된 부위가 상이한 항체가 바람직하게 사용될 수 있다. 즉, 1차 반응과 2차 반응에 사용되는 항체는 예컨대 2차 반응에서 사용되는 항체가 리셉터 단백질 등의 C 말단부를 인식하는 경우 1차 반응에서 사용되는 항체는 바람직하게는 C 말단부 이외, 예컨대 N 말단 부위를 인식하는 항체가 사용될 수 있다.
본 발명의 리셉터 단백질 등 또는 본 발명의 리간드 펩티드에 대한 모노클로날 항체를 샌드위치법 이외의 측정 시스템, 예컨대 경합법, 이뮤노 메트릭법 또는 네프로메트리 등에 사용할 수 있다. 경합법으로는 피검액 중의 항원과 표지 항원을 항체에 대해서 경합적으로 반응시킨 후, 미반응 표지 항원과 (F) 와 항체와 결합한 표지 항원 (B) 을 분리하고 (B/F 분리), B, F 중 어느 하나의 표지량을 측정하여 피검액 중의 항원량을 정량한다. 본 반응법에는 항체로서 가용성 항체를 사용하며 B/F 분리를 폴리에틸렌글리콜, 상기 항체에 대한 제 2 항체 등을 사용하는 액상법 및, 제 1 항체로서 고상화 항체를 사용하거나 또는 제 1 항체는 가용성의 것을 사용하며 제 2 항체로서 고상화 항체를 사용하는 고상화법이 사용될 수 있다.
이뮤노 메트릭법으로는 피검액 중의 항원과 고상화 항원을 일정량의 표지화 항체에 대하여 경합 반응시킨 후 고상과 액상을 분리하거나, 또는 피검액 중의 항원과 과잉량의 표지화 항체를 반응시키고 이어서 고상화 항원을 첨가하여 미반응 표지화 항체를 고상에 결합시킨 후 고상과 액상을 분리한다. 이어서, 어떠한 상의 표지량을 측정하여 피검액 중의 항원량을 정량한다.
또, 네프로메트리에서는 겔 내 또는 용액 중에서 항원 항체 반응의 결과, 발생한 불용성의 침강물 양을 측정한다. 피검액 중의 항원량이 약간이고 소량의 침강물밖에 얻을 수 없는 경우에도 레이저 산란을 이용하는 레이저 네프로메트리 등이 바람직하게 사용될 수 있다.
이들 개개의 면역학적 측정법을 본 발명의 측정방법에 적용함에 있어서는 특별한 조건, 조작 등의 설정은 필요로 하지 않는다. 각각 방법에서의 통상적인 조건, 조작법에 당업자의 통상적인 기술적 배려를 더하여 본 발명의 리셉터 단백질 등 또는 본 발명의 리간드 펩티드의 측정계를 구성하면 된다. 이들 일반적인 기술수단의 상세함에 대해서는 총설, 성서 등을 참조할 수 있다 [예컨대, 이리에 히로시편「라디오 이뮤노 어세이」(고오단샤, 쇼와49(1974)년 발행), 이리에 히로시편「속 라디오 이뮤노 어세이」(고오단샤, 쇼와54(1979)년 발행), 이시까와 에이지 등 편「효소면측정법」(의학서원, 쇼와53(1978)년 발행), 이시까와 에이지 등 편「효소면측정법」(의학서원, 쇼와57(1982)년 발행), 이시까와 에이지 등 편「효소면측정법」(제3판) (의학서원, 쇼와62(1987)년 발행),「Methods in ENZYMOLOGY)」Vol.70(Immunochemical Techniques(Part A)), 동일 서적 Vol.73(Immunochemical Techniques(Part B)), 동일 서적 Vol.74(Immunochemical Techniques(Part C)), 동일 서적 Vol.84(Immunochemical Techniques(Part D : Selected Immunoassays)), 동일 서적 Vol.92(Immunochemical Techniques(Part E : Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods)), 동일 서적.121(Immunochemical Techniques(Part I : Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies)) (이상 아카데믹 프레스사 발행) 등 참조].
이상과 같이 본 발명의 항체를 사용함으로써 본 발명의 리셉터 단백질 등 또는 본 발명의 리간드 펩티드를 감도좋게 정량할 수 있다.
또, 본 발명의 항체를 사용하여 생체 내에서의 본 발명의 리셉터 단백질 등 또는 본 발명의 리간드 펩티드를 정량함으로써 본 발명의 리셉터 단백질의 기능 부전에 관련된 각종 질환을 진단할 수 있다.
또한, 본 발명의 리셉터 단백질 등 또는 본 발명의 리간드 펩티드에 대한 항체는 체액이나 조직 등의 피검체 중에 존재하는 본 발명의 리셉터 단백질 등 또는 본 발명의 리간드 펩티드를 특이적으로 검출하기 위하여 사용할 수 있다. 또, 본 발명의 리셉터 단백질 등 또는 본 발명의 리간드 펩티드를 정제하기 위하여 사용하는 항체 칼럼의 제작, 정제시 각 분획 중의 본 발명의 리셉터 단백질 등의 검출, 피검 세포 내에서의 본 발명의 리셉터 단백질 등 또는 본 발명의 리간드 펩티드 거동의 분석 등을 위하여 사용할 수 있다.
(8) 본 발명의 리셉터 단백질 등 또는 본 발명의 리간드 펩티드에 대한 항체에 의한 중화.
본 발명의 리셉터 단백질 등 또는 본 발명의 리간드 펩티드에 대한 항체가 이들 리셉터 단백질 등 또는 이 리간드 펩티드에 대한 중화 활성이란 즉, 이 리셉터 단백질 등 또는 이 리간드 펩티드가 관여하는 시그널 전달 기능을 불활성화시키는 활성을 의미한다. 따라서, 상기 항체가 중화 활성을 갖는 경우는 상기 리셉터 단백질 등 또는 이 리간드 펩티드가 관여하는 시그널 전달, 예컨대 상기 리셉터 단백질을 매개로 하는 세포 자극 활성 (예컨대, 아라키돈산 유리, 아세틸콜린 유리, 세포내C2+유리, 세포내 cAMP 생성, 세포내 cGMP 생성, 이노시톨인산 생산, 세포막 전위변동, 세포내 단백질의 인산화, c-fos 의 활성화, pH 저하 등을 촉진하는 활성 또는 억제하는 활성 등) 을 불활성화할 수 있다. 따라서, 이 리셉터 단백질 또는 이 리간드 펩티드의 과잉 발현 등에서 기인하는 질환의 예방 및/또는 치료에 사용될 수 있다.
(9) 본 발명의 리셉터 단백질을 코딩하는 DNA 를 갖는 동물의 제작
본 발명의 DNA 를 사용하여 본 발명의 리셉터 단백질을 발현하는 트랜스제닉 동물을 제작할 수 있다. 동물로서는 포유 동물 (예컨대, 래트, 마우스, 토끼,양, 돼지, 소, 고양이, 개, 원숭이 등) 등을 들 수 있는데, 특히 마우스, 토끼 등이 적합하다.
본 발명의 DNA 를 대상 동물에 전이시키는 데 있어서는 상기 DNA 를 동물 세포에서 발현시킬 수 있는 프로모터 하류에 결합된 유전자 구조물로서 사용하는 것이 일반적으로 유리하다. 예컨대, 토끼 유래의 본 발명의 DNA 를 전이시키는 경우, 그것과 상동성이 높은 동물 유래의 본 발명의 DNA 를 동물 세포에서 발현 시킬 수 있는 프로모터 하류에 결합된 유전자 구조물을 예컨대 토끼 수정란으로 마이크로 인젝션함으로써 본 발명의 리셉터 단백질 등을 고생산하는 DNA 전이 동물을 제작할 수 있다. 이 프로모터로서는 예컨대 바이러스 유래의 프로모터, 메탈로티오네인 등의 편재하는 발현 프로모터도 사용할 수 있는데, 바람직하게는 뇌에서 특이적으로 발현하는 NGF 유전자 프로모터나 에놀라아제 유전자 프로모터 등이 사용될 수 있다.
수정란 세포 단계에서의 본 발명의 DNA 전이는 대상 동물의 배아 세포 및 체 세포 모두에 존재하도록 확보된다. DNA 전이 후의 제작된 동물의 배아 세포에서 본 발명의 리셉터 단백질 등이 존재하는 것은 제작된 동물의 자손이 모두 그 배아 세포 및 체세포 모두에 본 발명의 리셉터 단백질 등을 갖는 것을 의미한다. 유전자를 이어 받은 이런 종류의 동물의 자손은 그 배아 세포 및 체세포 모두에 본 발명의 리셉터 단백질 등을 갖는다.
본 발명의 DNA 전이 동물은 교배에 의해 유전자를 안정되게 유지하는 것을 확인하고 이 DNA 보유 동물로서 통상적인 사육 환경에서 사육하여 대를 이을 수 있다. 또한, 목적 DNA 를 보유하는 암수 동물을 교배함으로써, 도입 유전자를 상동 염색체 양쪽에 갖는 호모자이고트 동물을 취득하며, 이 암수 동물을 교배함으로써 모든 자손이 이 DNA 를 갖도록 번식하여 대를 이을 수 있다.
본 발명의 DNA 가 전이된 동물은 본 발명의 리셉터 단백질 등이 고발현되고 있어 본 발명의 리셉터 단백질 등에 대한 작용물질 길항물질의 스크리닝용의 동물 등으로서 유용하다.
본 발명의 DNA 전이 동물을 조직 배양을 위한 세포원으로서 사용할 수도 있다. 예컨대, 본 발명의 DNA 전이 마우스의 조직 중의 DNA 또는 RNA 를 직접 분석하거나 또는 유전자에 의해 발현된 본 발명의 리셉터 단백질이 존재하는 조직을 분석함으로써 본 발명의 리셉터 단백질 등에 대해서 분석할 수 있다. 본 발명의 리셉터 단백질 등을 갖는 조직 세포를 표준 조직 배양 기술로 배양하고, 이들을 사용하여 예컨대 뇌나 말초조직 유래와 같은 일반적으로 배양이 어려운 조직으로부터의 세포 기능을 연구할 수 있다. 또, 그 세포를 사용함으로써 예컨대 각종 조직 기능을 높이는 의약의 선택도 가능하다. 또, 고발현 세포주가 있으면 거기서부터 본 발명의 리셉터 단백질 등을 단리 정제할 수 있다.
본 명세서 및 도면에서 염기나 아미노산 등을 약호로 표시하는 경우, IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature 에 의한 약호 또는 상기 분야에서의 관용 약호에 근거하는 것으로 그 예를 아래와 같이 기술한다. 또, 아미노산에 관하여 광학 이성체가 있을 수 있는 경우는 특별히 명시하지 않으면 L 체를 나타내는 것으로 한다.
DNA : 데옥시리보핵산
cDNA : 상보적 데옥시리보핵산
A : 아데닌
T : 티민
G : 구아닌
C : 시토신
RNA : 리보핵산
mRNA : 메신저리보핵산
dATP : 데옥시아데노신3인산
dTTP : 데옥시티미딘3인산
dGTP : 데옥시구아노신3인산
dCTP : 데옥시시티딘3인산
ATP : 아데노신3인산
EDTA : 에틸렌디아민4아세트산
SDS : 도데실황산나트륨
Gly : 글리신
Ala : 알라닌
Val : 발린
Leu : 로이신
Ile : 이소로이신
Ser : 세린
Thr : 트레오닌
Cys : 시스테인
Met : 메티오닌
Glu : 글루타민산
Asp : 아스파라긴산
Lys : 리신
Arg : 알기닌
His : 히스티진
Phe : 페닐알라닌
Tyr : 티로신
Trp : 트립토판
Pro : 프롤린
Asn : 아스파라긴
Gln : 글루타민
pGlu : 피로글루타민산
Me : 메틸기
Et : 에틸기
Bu : 부틸기
Ph : 페닐기
TC : 티아졸리딘-4(R)-카르복사이드기
또, 본 명세서 중에서 범용되는 치환기, 보호기 및 시약을 아래와 같은 기호로 표기한다.
Tos : p-톨루엔술포닐
CHO : 포르밀
Bzl : 벤질
Cl2Bzl : 2,6-디클로로벤질
Bom : 벤질옥시메틸
Z : 벤질옥시카르보닐
Cl-Z : 2-클로로벤질옥시카르보닐
Br-Z : 2-브로모벤질옥시카르보닐
Boc : t-부톡시카르보닐
DNP : 디니트로페놀
Trt : 트리틸
Bum : t-부톡시메틸
Fmoc : N-9-플루오레닐메톡시카르보닐
HOBt : 1-히드록시벤즈트리아졸
HOOBt : 3,4-디히드로-3-히드록시-4-옥소-1,2,3-벤조트리아진
HONB : 1-히드록시-5-노르보르넨-2,3-디카르복시이미드
DCC : N,N'-디시클로헥실카르보디이미드
BHA : 벤즈히드릴아민
MeBzl : 4-메틸벤질
OcHex : 시클로헥실에스테르
NMP : N-메틸피롤리돈
TFA : 트리플루오로아세트산
본 명세서의 서열표의 서열 번호는 아래와 같은 서열을 나타낸다.
〔서열 번호:1〕
본 발명의 래트 뇌간 주변부 유래의 신규 G 단백질 공액형 리셉터 단백질 rOT7T175 의 아미노산 서열을 나타낸다.
〔서열 번호:2〕
서열 번호:1 로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 본 발명의 래트 뇌간 주변부 유래의 신규 G 단백질 공액형 리셉터 단백질 rOT7T175 를 코딩하는 cDNA 의 염기 서열을 나타낸다.
〔서열 번호:3〕
본 발명의 래트 뇌간 주변부 유래의 신규 G 단백질 공액형 리셉터 단백질 rOT7T175 를 코딩하는 cDNA 를 클로닝하기 위해 사용한 프라이머 1 의 염기 서열을 나타낸다.
〔서열 번호:4〕
본 발명의 래트 뇌간 주변부 유래의 신규 G 단백질 공액형 리셉터 단백질rOT7T175 를 코딩하는 cDNA 를 클로닝하기 위해 사용한 프라이머 2 의 염기 서열을 나타낸다.
〔서열 번호:5〕
본 발명의 인체 뇌 유래의 신규 G 단백질 공액형 리셉터 단백질 hOT7T175 의 아미노산 서열을 나타낸다.
〔서열 번호:6〕
서열 번호:5 로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 본 발명의 인체 뇌 유래의 신규 G 단백질 공액형 리셉터 단백질 hOT7T175 를 코딩하는 cDNA 의 염기 서열을 나타낸다.
〔서열 번호:7〕
본 발명의 인체 뇌 유래의 신규 G 단백질 공액형 리셉터 단백질 hOT7T175 를 코딩하는 cDNA 를 클로닝하기 위해 사용한 프로브의 염기 서열을 나타낸다.
〔서열 번호:8〕
본 발명의 인체 뇌 유래의 신규 G 단백질 공액형 리셉터 단백질 hOT7T175 를 코딩하는 cDNA 를 클로닝하기 위해 사용한 프라이머 1 의 염기 서열을 나타낸다.
〔서열 번호:9〕
본 발명의 인체 뇌 유래의 신규 G 단백질 공액형 리셉터 단백질 hOT7T175 를 코딩하는 cDNA 를 클로닝하기 위해 사용한 프라이머 2 의 염기 서열을 나타낸다.
〔서열 번호:10〕
실시예 3 에 기재된 PEPTIDE(1-54) 의 아미노산 서열을 나타낸다.
〔서열 번호:11〕
실시예 3 에 기재된 PEPTIDE(40-54) 의 아미노산 서열을 나타낸다.
〔서열 번호:12〕
실시예 3 에 기재된 PEPTIDE(45-54) 의 아미노산 서열을 나타낸다.
〔서열 번호:13〕
실시예 3 에 기재된 PEPTIDE(46-54) 의 아미노산 서열을 나타낸다.
〔서열 번호:14〕
실시예 3 에 기재된 PEPTIDE(47-54) 의 아미노산 서열을 나타낸다.
〔서열 번호:15〕
서열 번호:10 으로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 의 염기 서열을 나타낸다.
〔서열 번호:16〕
서열 번호:11 로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 의 염기 서열을 나타낸다.
〔서열 번호:17〕
서열 번호:12 로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 의 염기 서열을 나타낸다.
〔서열 번호:18〕
서열 번호:13 으로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 의 염기 서열을 나타낸다.
〔서열 번호:19〕
서열 번호:14 로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 의 염기 서열을 나타낸다.
〔서열 번호:20〕
실시예 3 에 기재된 Kiss-1 산물의 아미노산 서열을 나타낸다.
〔서열 번호:21〕
실시예 3 에 기재된 PEPTIDE(48-54) 의 아미노산 서열을 나타낸다.
〔서열 번호:22〕
서열 번호:21 로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 의 염기 서열을 나타낸다.
후술하는 실시예 1 에서 얻은 형질 전환체 에스케리키아 콜리 (Escherichia coli) DH10B/pAK-rOT175 는 1998 년 10 월 21 일자로 일본 통상산업성 공업기술원 생명공학 공업기술 연구소 (NIBH) 에 기탁번호 FERM BP-6553 으로, 1998년 10 월 1 일자로 재단법인ㆍ발효연구소 (IFO) 에 기탁번호 IFO 16209 로 기탁되었다.
후술하는 실시예 2 에서 얻은 형질 전환체 에스케리키아 콜리 DH10B/pCMV-hOT175 는 1999 년 2 월 17 일자로 일본 통상산업성 공업기술원 생명공학 공업기술 연구소 (NIBH) 에 기탁번호 FERM BP-6648 으로, 1999년 2 월 9 일자로 재단법인ㆍ발효연구소 (IFO) 에 기탁번호 IFO 16258 로 기탁되었다.
발명의 개시
본 발명은 상기와 같이 유용한 신규 G 단백질 공액형 리셉터 단백질을 제공하는 것이다. 즉, 신규 G 단백질 공액형 리셉터 단백질, 그 부분 펩티드 또는 그들 염, 이 G 단백질 공액형 리셉터 단백질 또는 그 부분 펩티드를 코딩하는 폴리누클레오티드 (DNA, RNA 및 그들 유도체) 를 함유한 폴리누클레오티드 (DNA, RNA 및 그들 유도체), 이 폴리누클레오티드를 함유한 재조합 벡터, 이 재조합 벡터를유지하는 형질 전환체, 이 G 단백질 공액형 리셉터 단백질 또는 그 염의 제조법, 이 G 단백질 공액형 리셉터 단백질, 그 부분 펩티드 또는 그들 염에 대한 항체, 이 G 단백질 공액형 리셉터 단백질의 발현량을 변화시키는 화합물, 이 G 단백질 공액형 리셉터에 대한 리간드의 결정방법, 리간드와 이 G 단백질 공액형 리셉터 단백질의 결합성을 변화시키는 화합물 (길항물질, 작용물질) 또는 그 염의 스크리닝 방법, 이 스크리닝용 키트, 이 스크리닝 방법 또는 스크리닝 키트를 사용하여 얻을 수 있는 리간드와 이 G 단백질 공액형 리셉터 단백질의 결합성을 변화시키는 화합물 (길항물질, 작용물질) 또는 그 염 및, 리간드와 이 G 단백질 공액형 리셉터 단백질의 결합성을 변화시키는 화합물 (길항물질, 작용물질) 또는 이 G 단백질 공액형 리셉터 단백질의 발현량을 변화시키는 화합물 또는 그 염을 함유하여 이루어진 의약 등을 제공한다.
또, 본 발명은 이 G 단백질 공액형 리셉터 단백질에 대한 리간드 활성을 갖는 펩티드 등을 제공한다.
본 발명자들은 예의 연구를 거듭한 결과 분해(degenerated) PCR 법으로 작성한 EST 정보에 의거하여 래트 뇌간 주변부 및 인체 뇌 유래의 신규 G 단백질 공액형 리셉터 단백질을 코딩하는 cDNA 를 단리하고, 그 전체 염기 서열을 해석하는 데에 성공하였다. 그리고, 이 염기 서열을 아미노산 서열로 번역한 바, 제1 ∼ 제7 막 관통영역이 소수성 플롯 상에서 확인되고 이들 cDNA 으로 코딩되는 단백질이 7회 막관통형의 G 단백질 공액형 리셉터 단백질임을 확인하였다.
또, 본 발명자들은 몇가지 이미 알려진 펩티드 또는 유전자 데이터 베이스상에 발현된 신규 펩티드를 사용하여 이 G 단백질 공액형 리셉터 단백질 발현세포에 대한 세포 내 Ca 이온 농도 상승 활성을 갖는 펩티드를 탐색하였다. 그 결과 암 전이 억제 유전자 KiSS-1 (Genomics, 54권, 145p ∼ 148p, 1998년) 로 코딩된 단백질의 C-말단 펩티드가 본 리셉터를 활성화시키는 작용을 갖는 것이 명확해졌다. KiSS-1 은 단백질을 코딩하는 유전자이지만, 이번에 발명자들은 KiSS-1 중의 아미노산 54 잔기로 이루어진 펩티드 서열에 착안하였다. 또한, 그 C 말단의 부분 펩티드를 합성하고 리셉터와의 반응성 시험에 사용하여 리간드 활성을 갖는 것을 확인하였다.
KiSS-1 유전자 산물에서 절취되어 생성된 펩티드는 그 유전자가 암 전이 억제 유전자이기 때문에 암 전이 억제활성을 갖고 있음이 기대된다. 그 이외에도 본 유전자가 태반에 다량으로 발현되어 있는 것이나 이 G 단백질 공액형 리셉터 단백질의 인체형 수용체인 h0T7T175 가 태반에 다량을 발현되어 있음을 감안하여 이 펩티드가 태반에서 중요한 기능을 담당하고 있음도 예상된다. 또, 인체에서는 췌장에도 수용체 발현이 비교적 높고 췌장에서도 본 펩티드는 어떠한 생리 기능을 나타내고 있는 것으로 기대된다.
본 발명자들은 이들 지견에 의거하여 더 연구를 거듭한 결과 본 발명을 완성하는 데에 이르렀다.
즉, 본 발명은
(1) 서열 번호:1 로 표시되는 아미노산 서열과 동일하거나 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 함유한 것을 특징으로 하는 단백질 또는 그 염,
(2) 실질적으로 동일한 아미노산 서열이 서열 번호:5 로 표시되는 아미노산 서열인 상기 (1) 에 기재된 단백질 또는 그 염,
(3) 상기 (1) 에 기재된 단백질의 부분 펩티드 또는 그 에스테르 또는 그 아미드 또는 그 염
(4) 상기 (1) 에 기재된 단백질을 코딩하는 염기 서열을 갖는 폴리누클레오티드를 함유한 폴리누클레오티드,
(5) DNA 인 상기 (4) 에 기재된 폴리누클레오티드,
(6) 서열 번호:2 또는 서열 번호:6 으로 표시되는 염기 서열을 갖는 상기 (4) 에 기재된 폴리누클레오티드,
(7) 상기 (4) 에 기재된 폴리누클레오티드를 함유한 재조합 벡터,
(8) 상기 (7) 에 기재된 재조합 벡터로 형질 전환시킨 형질 전환체,
(9) 상기 (8) 에 기재된 형질 전환체를 배양하고, 상기 (1) 에 기재된 단백질을 생성, 축적시키는 것을 특징으로 하는 상기 (1) 에 기재된 단백질 또는 그 염의 제조법,
(10) 상기 (1) 에 기재된 단백질 또는 그 염, 상기 (3) 에 기재된 부분 펩티드 또는 그 에스테르 또는 그 아미드 또는 그 염에 대한 항체,
(11) 상기 (1) 에 기재된 단백질의 시그널 전달을 불활성화시키는 중화 항체인 상기 (10) 에 기재된 항체,
(12) 상기 (10) 에 기재된 항체를 함유하여 이루어진 진단약,
(13) 상기 (1) 에 기재된 단백질 또는 그 염, 또는 상기 (3) 에 기재된 부분펩티드 또는 그 에스테르 또는 그 아미드 또는 그 염을 사용함으로써 얻을 수 있는 상기 (1) 에 기재된 단백질 또는 그 염에 대한 리간드,
(14) 상기 (13) 에 기재된 리간드를 함유하여 이루어진 의약,
(15) 상기 (1) 에 기재된 단백질 또는 그 염, 또는 상기 (3) 에 기재된 부분 펩티드 또는 그 아미드 또는 그 에스테르 또는 그 염을 사용하는 것을 특징으로 하는 상기 (1) 에 기재된 단백질 또는 그 염에 대한 리간드의 결정방법,
(16) 상기 (1) 에 기재된 단백질 또는 그 염, 상기 (3) 에 기재된 부분 펩티드 또는 그 아미드 또는 그 에스테르 또는 그 염을 사용하는 것을 특징으로 하는 리간드와 상기 (1) 에 기재된 단백질 또는 그 염의 결합성을 변화시키는 화합물 또는 그 염의 스크리닝 방법,
(17) 상기 (1) 에 기재된 단백질 또는 그 염, 상기 (3) 에 기재된 부분 펩티드 또는 그 아미드 또는 그 에스테르 또는 그 염을 함유하는 것을 특징으로 하는 리간드와 상기 (1) 에 기재된 단백질 또는 그 염의 결합성을 변화시키는 화합물 또는 그 염의 스크리닝용 키트,
(18) 상기 (16) 에 기재된 스크리닝 방법 또는 상기 (17) 에 기재된 스크리닝용 키트를 사용하여 얻을 수 있는 리간드와 상기 (1) 에 기재된 단백질 또는 그 염의 결합성을 변화시키는 화합물 또는 그 염,
(19) 상기 (16) 에 기재된 스크리닝 방법 또는 상기 (17) 에 기재된 스크리닝용 키트를 사용하여 얻을 수 있는 리간드와 상기 (1) 에 기재된 단백질 또는 그 염의 결합성을 변화시키는 화합물 또는 그 염을 함유하여 이루어진 의약,
(20) 상기 (10) 에 기재된 항체를 사용하는 것을 특징으로 하는 상기 (1) 에 기재된 단백질의 정량방법,
(21) 서열 번호:10 으로 표시되는 아미노산 서열에서 N 말단에서 47 ∼ 54 번째의 아미노산 서열을 함유하고, 8 ∼ 54 개의 아미노산 잔기로 이루어진 상기 (21) 에 기재된 펩티드 또는 그 아미드 또는 그 에스테르 또는 그 염,
(22) 서열 번호:10 으로 표시되는 아미노산 서열에서 N 말단에서 47 ∼ 54 번째의 아미노산 서열을 C 말단에 가지며, 8 ∼ 15 개의 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드 또는 그 아미드 또는 그 에스테르 또는 그 염,
(23) 서열 번호:11, 서열 번호:12, 서열 번호:13 또는 서열 번호:14 로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 상기 (21) 에 기재된 펩티드의 아미드 또는 그 염,
(24) 리간드가 상기 (21) 에 기재된 펩티드 또는 그 아미드 또는 그 에스테르 또는 그 염인 상기 (16) 에 기재된 스크리닝 방법 및
(25) 리간드가 상기 (21) 에 기재된 펩티드 또는 그 아미드 또는 그 에스테르 또는 그 염인 상기 (16) 에 기재된 스크리닝용 키드 등에 관한 것이다.
또한,
(26) 단백질이 ① 서열 번호:1 로 표시되는 아미노산 서열, 서열 번호:1 로 표시되는 아미노산 서열 중 1 또는 2 개 이상 (바람직하게는 1 ∼ 30 개 정도, 더 바람직하게는 1 ∼ 9 개 정도, 더더욱 바람직하게는 몇개 (1 개 또는 2 개)) 의 아미노산이 결실된 아미노산 서열, ② 서열 번호:1 로 표시되는 아미노산 서열에 1 또는 2 개 이상 (바람직하게는 1 ∼ 30 개 정도, 더 바람직하게는 1 ∼ 10 개 정도, 더더욱 바람직하게는 몇개 (1 개 또는 2 개)) 의 아미노산이 부가된 아미노산 서열, ③ 서열 번호:1 로 표시되는 아미노산 서열 중 1 또는 2 개 이상 (바람직하게는 1 ∼ 30 개 정도, 더 바람직하게는 1 ∼ 10 개 정도, 더더욱 바람직하게는 몇개 (1 개 또는 2 개)) 의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열 또는 ④ 그들을 조합시킨 아미노산 서열을 함유한 단백질인 상기 (1) 에 기재된 단백질 또는 그 염,
(27) (i) 상기 (1) 에 기재된 단백질 또는 그 염, 또는 상기 (3) 에 기재된 부분 펩티드 또는 그 아미드 또는 그 에스테르 또는 그 염과 리간드를 접촉시킨 경우와, (ii) 상기 (1) 에 기재된 단백질 또는 그 염 또는 상기 (3) 에 기재된 부분 펩티드 또는 그 아미드 또는 그 에스테르 또는 그 염과 리간드 및 시험화합물을 접촉시킨 경우를 비교하는 것을 특징으로 하는 상기 (16) 에 기재된 스크리닝 방법,
(28) (i) 표지한 리간드를 상기 (1) 에 기재된 단백질 또는 그 염, 또는 상기 (3) 에 기재된 부분 펩티드 또는 그 아미드 또는 그 에스테르 또는 그 염에 접촉시킨 경우와, (ii) 표지한 리간드 및 시험화합물을 상기 (1) 에 기재된 단백질 또는 그 염, 또는 상기 (3) 에 기재된 부분 펩티드 또는 그 아미드 또는 그 에스테르 또는 그 염에 접촉시킨 경우에 표지한 리간드의 상기 (1) 에 기재된 단백질 또는 그 염, 또는 상기 (3) 에 기재된 부분 펩티드 또는 그 아미드 또는 그 에스테르 또는 그 염에 대한 결합량을 측정해서 비교하는 것을 특징으로 하는 리간드와 상기 (1) 에 기재된 단백질 또는 그 염의 결합성을 변화시키는 화합물 또는 그 염의 스크리닝 방법,
(29) (i) 표지한 리간드를 상기 (1) 에 기재된 단백질을 함유한 세포에 접촉시킨 경우와, (ii) 표지한 리간드 및 시험화합물을 상기 (1) 에 기재된 단백질을 함유한 세포에 접촉시킨 경우에 표지한 리간드의 이 세포에 대한 결합량을 측정해서 비교하는 것을 특징으로 하는 리간드와 상기 (1) 에 기재된 단백질 또는 그 염의 결합성을 변화시키는 화합물 또는 그 염의 스크리닝 방법,
(30) (i) 표지한 리간드를 상기 (1) 에 기재된 단백질을 함유한 세포의 면 분획에 접촉시킨 경우와, (ii) 표지한 리간드 및 시험화합물을 상기 (1) 에 기재된 단백질을 함유한 세포의 막 분획에 접촉시킨 경우에 표지한 리간드의 이 세포의 면 분획에 대한 결합량을 측정해서 비교하는 것을 특징으로 하는 리간드와 상기 (1) 에 기재된 단백질 또는 그 염의 결합성을 변화시키는 화합물 또는 그 염의 스크리닝 방법,
(31) (i) 표지한 리간드를 상기 (8) 에 기재된 형질 전환체를 배양함으로써 이 형질 전환체의 세포막에 발현된 단백질에 접속시킨 경우와, (ii) 표지한 리간드 및 시험화합물을 상기 (8) 에 기재된 형질 전환체를 배양함으로써 이 형질 전환체의 세포막에 발현된 단백질에 접속시킨 경우에 표지한 리간드의 이 단백질에 대한 결합량을 측정해서 비교하는 것을 특징으로 하는 리간드와 상기 (1) 에 기재된 단백질 또는 그 염의 결합성을 변화시키는 화합물 또는 그 염의 스크리닝 방법,
(32) (i) 상기 (1) 에 기재된 단백질 또는 그 염을 활성화시키는 화합물을 상기 (1) 에 기재된 단백질을 함유한 세포에 접촉시킨 경우와, (ii) 상기 (1) 에 기재된 단백질 또는 그 염을 활성화시키는 화합물 및 시험화합물을 상기 (1) 에 기재된 단백질을 함유한 세포에 접촉시킨 경우에 단백질을 통한 세포자극활성을 측정해서 비교하는 것을 특징으로 하는 리간드와 상기 (1) 에 기재된 단백질 또는 그 염의 결합성을 변화시키는 화합물 또는 그 염의 스크리닝 방법,
(33) 상기 (1) 에 기재된 단백질 또는 그 염을 활성화시키는 화합물을 상기 (8) 에 기재된 형질 전환체를 배양함으로써 이 형질 전환체의 세포막에 발현된 단백질에 접촉시킨 경우와, 상기 (1) 에 기재된 단백질 또는 그 염을 활성화시키는 화합물 및 시험화합물을 상기 (8) 에 기재된 형질 전환체를 배양함으로써 이 형질 전환체의 세포막에 발현된 단백질에 접촉시킨 경우에 단백질을 통한 세포자극활성을 측정해서 비교하는 것을 특징으로 하는 리간드와 상기 (1) 에 기재된 단백질 또는 그 염의 결합성을 변화시키는 화합물 또는 그 염의 스크리닝 방법,
(34) 상기 (1) 에 기재된 단백질을 활성화시키는 화합물이 상기 (21) 에 기재된 펩티드 또는 그 아미드 또는 그 에스테르 또는 그 염인 상기 (32) 또는 상기 (33) 에 기재된 스크리닝 방법,
(35) 상기 (27) ∼ (34) 에 기재된 스크리닝 방법에 따라 얻을 수 있는 리간드와 상기 (1) 에 기재된 단백질 또는 그 염의 결합성을 변화시키는 화합물 또는 그 염,
(36) 상기 (27) ∼ (34) 에 기재된 스크리닝 방법에 따라 얻을 수 있는 리간드와 상기 (1) 에 기재된 단백질 또는 그 염의 결합성을 변화시키는 화합물 또는 그 염을 함유한 것을 특징으로 하는 의약,
(37) 상기 (1) 에 기재된 단백질을 함유한 세포를 함유한 것을 특징으로 하는 상기 (17) 에 기재된 스크리닝용 키트,
(38) 상기 (1) 에 기재된 단백질을 함유한 세포의 막 분획을 함유한 것을 특징으로 하는 상기 (17) 에 기재된 스크리닝용 키트,
(39) 상기 (8) 에 기재된 형질 전환체를 배양함으로써 이 형질 전환체의 세포막에 발현된 단백질을 함유한 것을 특징으로 하는 상기 (17) 에 기재된 스크리닝용 키트,
(40) 상기 (37) ∼ 상기 (39) 에 기재된 스크리닝용 키트를 사용하여 얻을 수 있는 리간드와 상기 (1) 에 기재된 단백질 또는 그 염의 결합성을 변화시키는 화합물 또는 그 염,
(41) 상기 (37) ∼ 상기 (39) 에 기재된 스크리닝용 키트를 사용하여 얻을 수 있는 리간드와 상기 (1) 에 기재된 단백질 또는 그 염의 결합성을 변화시키는 화합물 또는 그 염을 함유한 것을 특징으로 하는 의약,
(42) 상기 (10) 에 기재된 항체와, 상기 (1) 에 기재된 단백질 또는 그 염, 또는 상기 (3) 에 기재된 부분 펩티드 또는 그 아미드 또는 그 에스테르 또는 그 염을 접촉시키는 것을 특징으로 하는 상기 (1) 에 기재된 단백질 또는 그 염, 또는 상기 (3) 에 기재된 부분 펩티드 또는 그 아미드 또는 그 에스테르 또는 그 염의 정량 방법,
(43) 상기 (10) 에 기재된 항체와, 피검액 및 표지한 상기 (1) 에 기재된 단백질 또는 그 염, 또는 상기 (3) 에 기재된 부분 펩티드 또는 그 에스테르 또는 그 아미드 또는 그 염을 경합적으로 반응시키고, 이 항체에 결합된 표지화된 상기 (1)에 기재된 단백질 또는 그 염, 또는 상기 (3) 에 기재된 부분 펩티드 또는 그 에스테르 또는 그 아미드 또는 그 염의 비율을 측정하는 것을 특징으로 하는 피검액 중의 상기 (1) 에 기재된 단백질 또는 그 염, 또는 상기 (3) 에 기재된 부분 펩티드 또는 그 아미드 또는 그 에스테르 또는 그 염의 정량 방법 및,
(44) 피검액과 담체 상에 불용화된 상기 (10) 에 기재된 항체 및 표지화된 상기 (10) 에 기재된 항체를 동시 또는 연속적으로 반응시킨 후, 불용화 담체상의 표지제의 활성을 측정하는 것을 특징으로 하는 피검액 중의 상기 (1) 에 기재된 단백질 또는 그 염, 또는 상기 (3) 에 기재된 부분 펩티드 또는 그 아미드 또는 그 에스테르 또는 그 염의 정량 방법 등을 제공한다.
이하에 실시예를 나타내며, 본 발명을 보다 상세하게 설명하는데, 이들은 본발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 대장균을 사용한 유전자 조작법은 분자 클로닝에 기재되어 있는 방법에 따른다.
실시예 1
래트 뇌간 주변부의 G 단백질 공액형 리셉터 단백질을 코딩하는 cDNA 의 클로닝과 염기 서열의 결정
래트 뇌간 주변부 cDNA 를 주형으로 하고 2 개의 프라이머, 프라이머 1 (서열 번호:3) 및 프라이머 2 (서열 번호:4) 를 사용하여 PCR 반응을 실시하였다. 상기 반응에서 반응액 조성은 상기 cDNA 의 10 분의 1 량을 주형으로 사용하고, 어드밴티지 cDNA 폴리머라제 믹스 (CLONTECH 사) 1/50 량, 프라이머 1 (서열 번호:3) 및 프라이머 (서열 번호:4) 를 각 0.2 μM, dNTPs 200 μM 및, 효소에 첨부된 버퍼를 첨가하여 50 ㎕ 액체량으로 하였다. PCR 반응은 ① 94 ℃ㆍ2분 후, ② 94 ℃ㆍ30초, 72 ℃ㆍ2분의 사이클을 3 회, ③ 94 ℃ㆍ30초, 68 ℃ㆍ2분의 사이클을 3 회, ④ 94 ℃ㆍ30초, 64℃·30초, 68 ℃ㆍ2분의 사이클을 30 회 반복하고, ⑤ 마지막에 68 ℃ㆍ8분의 신장 반응을 실시하였다. 상기 PCR 반응 후의 반응 산물을 TA 클로닝키트 (Invitrogen 사) 의 처방에 따라 플라스미드 벡터 pCR2.1 (Invitrogen 사) 로 서브클로닝하였다. 이것을 대장균 DH 5 α에 도입하고 cDNA 를 갖는 클론을 앰피실린을 함유하는 LB 한천 배지 중에서 선택한 후 개개의 클론 서열을 해석한 결과, 신규 G 단백질 공액형 리셉터 단백질을 코딩하는 cDNA 서열 (서열 번호:2) 을 얻었다. 이 cDNA 에서 도출되는 아미노산 서열 (서열 번호:1) 을 함유하는 신규 G 단백질 공액형 리셉터 단백질을 rOT7T175 라 명명하였다.
본 발명의 래트 뇌간 주변부 유래의 G 단백질 공액형 리셉터 단백질 rOT7T175 를 코딩하는 cDNA (서열 번호:2) 가 서브클로닝된 플라스미드 pAK-rOT7T175 를, 자체 공지된 방법에 따라 대장균 (Escherichia coil) DH10B 에 도입하여, 형질 전환체 : 대장균 (Escherichia coil) DH10B/pAK-rOT175 를 얻었다.
실시예 2
인체 뇌 유래의 신규 G 단백질 공액형 리셉터 단백질 hOT7T175 의 cDNA 의 클로닝과 염기 서열의 결정
cDNA 의 클로닝은 GENE TRAPPER (Life Technologies사) 의 처방에 따라 실시하였다. 프로브 (서열 번호:7) 를 비오틴화한 후, 1개 사슬로 한 인체 뇌 cDNA 라이브러리 (수퍼스크립트 cDNA 라이브러리, Life Technologies사) 와 하이브리드화하여 얻은 1개 사슬 유전자를 프라이머 1 (서열 번호:8) 을 사용하여 2개 사슬로 하였다. 이 유전자를 전기천공법 (일렉트로포레이션법) 으로 대장균 DH10B 에 도입한 후, 앰피실린함유 선택 플레이트 상에서 생육한 형질 전환체를 얻었다. 일렉트로포레이션은 E.coli 펄서 (BIORAD사) 를 사용하며 전압 1.8 ㎸ 에서 실시하였다. 얻은 형질 전환체를 프로브 (서열 번호:7) 와 프라이머 2 (서열 번호:9) 를 사용한 콜로니 PCR 에 의해 선택하고, 형질 전환체 : 대장균 (Escherichia coil) DH10B/pCMV-hOT175 를 얻었다. 이 cDNA 에서 도출되는 아미노산 서열 (서열 번호:5) 을 함유하는 신규 G 단백질 공액형 리셉터 단백질을 hOT7T175 라고 명명하였다. 콜로니 PCR 은, 어드밴티지 cDNA 폴리머라제 믹스 (CLONTECH사)1/50량, 프라이머 1 (서열 번호:7) 및 프라이머 2 (서열 번호:9) 를 각 0.2 μM, dNTPs 200μM, DMSO1/25량 및 효소에 첨부된 버퍼를 첨가하여, 10 ㎕ 액체량으로 하였다. PCR 반응은, ①94℃·10분후, ②94℃·10초, 60℃·10초, 68℃·1분의 사이클을 25회 반복하여 실시하였다. 이 PCR 반응후의 반응산물을 TA 클로닝키트 (Invitrogen사) 의 처방에 따라 플라스미드벡터 pCR2.1 (Invitrogen사) 로 서브클로닝하였다. 이것을 대장균 dh10b 에 도입하고 cDNA 를 갖는 클론을 앰피실린을 함유하는 LB 한천 배지중에서 선택한 후 개개의 클론 서열을 해석한 결과, 신규 G 단백질 공액형 리셉터 단백질을 코딩하는 cDNA 서열 (서열 번호:6) 를 얻었다. 이 cDNA 에서 도출되는 아미노산 서열 (서열 번호:5 ) 를 함유하는 신규 G 단백질 공액형 리셉터 단백질을 hOT175 라고 명명하였다.
실시예 3
rOT7T175 (오펀 리셉터) 를 활성화시키는 펩티드의 스크리닝 (1-1) 펩티드 합성
유전자 데이터베이스상에 발견된 암전이 억제유전자 (KiSS-1) 산물중 (서열 번호:20) 중의 제 68 번째 (Gly) ∼ 제 121 번째 (Phe) 의 54 아미노산잔기로 이루어진 서열 (서열 번호:10) 로 이루어진 펩티드 (이하, PEPTIDE (1-54) 라고 한다) 는 아래와 같은 방법으로 합성할 수 있다.
또한, 이하에 서술하는 방법에 따라, PEPTIDE(1-54) (서열 번호:10) 의 C 말단 펩티드 PEPTIDE (40-54)(서열 번호:11), PEPTIDE (45-54)(서열 번호:12), PEPTIDE (46-54)(서열 번호:13), PEPTIDE (47-54)(서열 번호:14), PEPTIDE (48-54)(서열 번호:21) 를 합성하였다.
① PEPTIDE (40-54) 의 제조
시판되는 p-메틸 BHA 수지 (0.77 mmole/g 수지) 를 펩티드 합성기 ABI 430A 의 반응조에 넣고, Boc-기법 (NMP-HOBt) 펩티드 합성방법으로 Boc-Phe, Boc-Arg(Tos), Boc-Leu, Boc-Gly, Boc-Phe, Boc-Ser(Bzl), Boc-Asn, Boc-Trp(CHO), Boc-Asn, Boc-Tyr(Br-Z), Boc-Asn, Boc-Pro, Boc-Leu, Boc-Asp(OcHex), Boc-Lys(Cl-Z) 을 순서대로 도입하여 목적하는 보호 펩티드수지를 얻었다. 이 수지 0.12g 을 p-크레졸 1 ㎖, 1,4-부탄티디올 1.2 ㎖ 와 함께 무수 플루오르화수소 10 ㎖ 중 0℃ 에서 60분 교반한 후 플루오르화수소를 감압하 증류제거하고 잔류물에 디에틸에테르를 첨가하여 침전을 여과하였다. 이 침전에 50% 아세트산수를 첨가하여 추출하며 불용부분을 제거하고, 추출액을 충분히 농축한 후, 50% 아세트산수로 충전한 세파덱스 (상품명) G-25 칼럼 (2.0×80㎝) 을 사용하여, 동일 용매로 전개, 주요 분획을 모아 동결건조시켜 백색분말 40 ㎎ 을 얻었다. 절반량을 LiChroprep (상품명) RP-18 을 충전한 역상 크로마토칼럼 (2.6×6㎝) 을 사용하여 0.1% TFA수 200 ㎖ 로 세정하고, 0.1% TFA수 300 ㎖ 와 0.1% TFA 함유 33% 아세토니트릴수 300 ㎖ 를 사용한 선형 구배용출을 실시하고 주요 분획을 모아 동결건조시켜 목적하는 펩티드 4.1 ㎎ 을 얻었다.
질량 분석에 의한 (M+H)+1869.9 (계산값 1969.9)
HPLC 용출시간 18.6분
칼럼조건
칼럼 Wakosil 5Cl8T 4.6×100㎜
용리액 : A 액-0.1% TFA 수, B액-0.1% TFA 함유 아세토니트릴을 사용하며 A/B : 95/5 ∼ 45/55 로 직선형 농도구배용출 (25 분)
유속 : 1.0 ㎖/분
② PEPTIDE (45-54) 의 제조
시판되는 p-메틸 BHA 수지 (0.77 mmole/g 수지) 를 펩티드 합성기 ABI 430A 의 반응조에 넣고, Boc-기법 (NMP-HOBt) 펩티드 합성방법으로 Boc-Phe, Boc-Arg(Tos), Boc-Leu, Boc-Gly, Boc-Phe, Boc-Ser(Bzl), Boc-Asn, Boc-Trp(CHO), Boc-Asn, Boc-Tyr(Br-Z) 을 순서대로 도입하여 목적하는 보호 펩티드수지를 얻었다. 이 수지 0.11g 을 상기 ① 과 동일하게 탈보호 정제하여 목적하는 펩티드 2.2 ㎎ 을 얻었다.
질량 분석에 의한 (M+H)+1302.5 (계산값 1302.6)
HPLC 용출시간 18.7분
칼럼조건
칼럼 Wakosil 5Cl8T 4.6×100㎜
용리액 : A 액-0.1% TFA 수, B액-0.1% TFA 함유 아세토니트릴을 사용하며 A/B : 95/5 ∼ 45/55 로 직선형 농도구배용출 (25 분)
유속 : 1.0 ㎖/분
③ PEPTIDE (46-54) 의 제조
시판되는 p-메틸 BHA 수지 (0.77 mmole/g 수지) 를 펩티드 합성기 ABI 430A 의 반응조에 넣고, Boc-기법 (NMP-HOBt) 펩티드 합성방법으로 Boc-Phe, Boc-Arg(Tos), Boc-Leu, Boc-Gly, Boc-Phe, Boc-Ser(Bzl), Boc-Asn, Boc-Trp(CHO), Boc-Asn 을 순서대로 도입하여 목적하는 보호 펩티드수지를 얻었다. 이 수지 0.11g 을 상기 ① 과 동일하게 탈보호 정제하여 목적하는 펩티드 3.4 ㎎ 을 얻었다.
질량 분석에 의한 (M+H)+1139.6 (계산값 1139.6)
HPLC 용출시간 18.1분
칼럼조건
칼럼 Wakosil 5Cl8T 4.6×100㎜
용리액 : A 액-0.1% TFA 수, B액-0.1% TFA 함유 아세토니트릴을 사용하며 A/B : 95/5 ∼ 45/55 로 직선형 농도구배용출 (25 분)
유속 : 1.0 ㎖/분
④ PEPTIDE (47-54) 의 제조
시판되는 p-메틸 BHA 수지 (0.77 mmole/g 수지) 을 펩티드 합성기 ABI 430A 의 반응조에 넣고, Boc-기법 (NMP-HOBt) 펩티드 합성방법으로 Boc-Phe, Boc-Arg(Tos), Boc-Leu, Boc-Gly, Boc-Phe, Boc-Ser(Bzl), Boc-Asn, Boc-Trp(CHO) 을 순서대로 도입하여 목적하는 보호 펩티드수지를 얻었다. 이 수지 0.12g 을 상기 ① 과 동일하게 탈보호 정제하여 목적하는 펩티드 13.0 ㎎ 을 얻었다.
질량 분석에 의한 (M+H)+1025.5 (계산값 1025.5)
HPLC 용출시간 17.6분
칼럼조건
칼럼 Wakosil 5Cl8T 4.6×100㎜
용리액 : A 액-0.1% TFA 수, B액-0.1% TFA 함유 아세토니트릴을 사용하며 A/B : 95/5 ∼ 45/55 로 직선형 농도구배용출 (25 분)
유속 : 1.0 ㎖/분
⑤ PEPTIDE (48-54) 의 제조
시판되는 p-메틸 BHA 수지 (0.77 mmole/g 수지) 를 펩티드 합성기 ABI 430A 의 반응조에 넣고, Boc-기법 (NMP-HOBt) 펩티드 합성방법으로 Boc-Phe, Boc-Arg(Tos), Boc-Leu, Boc-Gly, Boc-Phe, Boc-Ser(Bzl), Boc-Asn 을 순서대로 도입하여 목적하는 보호 펩티드수지를 얻었다. 이 수지 0.16g 을 p-크레졸 1 ㎖ 와 함께 무수 플루오르화수소 10 ㎖ 중 0℃ 에서 60분 교반한 후, 상기 ① 과 동일하게 처리, 정제하여 목적하는 펩티드 29.0 ㎎ 을 얻었다.
질량 분석에 의한 (M+H)+839.5 (계산값 839.5)
HPLC 용출시간 15.6분
칼럼조건
칼럼 Wakosil 5Cl8T 4.6×100㎜
용리액 : A 액-0.1% TFA 수, B액-0.1% TFA 함유 아세토니트릴을 사용하며 A/B : 95/5 ∼ 45/55 로 직선형 농도구배용출 (25 분)
유속 : 1.0 ㎖/분
⑥ PEPTIDE(1-54) 의 제조
PEPTIDE(1-54) 는 시판되는 p-메틸 BHA 수지 (0.77 mmole/g 수지) 를 펩티드 합성기 ABI 430A 의 반응조에 넣고, Boc-기법 (NMP-HOBt) 펩티드 합성방법으로
을 순서로 도입하여 목적하는 보호 펩티드수지를 얻고, 이 수지를 상기 ① 의 PEPTIDE(40-54) 의 제조법에 기재된 바와 동일하게 탈보호 정제하여 얻을 수 있다.
(1-2) FLIPR 을 사용한 세포내 Ca 이온농도 상승활성의 측정
rOT7T175 안정 발현세포주는 동물세포 발현용 플라스미드 pAK-rOT175 를 CHO/dhfr-세포에 CellPhect 트랜스펙션 키트 (Amersham Pharmacia Biotech사) 를 사용하여 형질도입함으로써 취득하였다. 먼저, 증류수 240 ㎖ 에 용해한 플라스미드 DNA 9.6 ㎎ 에 대하여 버퍼 A (CellPhect 트랜스펙션 키트에 첨부) 240 ㎖ 를 첨가하고 교반하여, 10 분산 정치한 후, 버퍼 B (CellPhect 트랜스펙션 키트에 첨부) 480 ㎖ 를 첨가하고 심하게 교반하여, 이 DNA 을 함유하는 리포솜을 형성시켰다. 4×105개의 CHO/dhfr-세포 (ATCC 에서 입수) 를 60 ㎜ 샤레에 파종하여, 10% 의 소 태아 혈청 (BIO WHITTAKER 사) 을 함유하는 Ham's F-12 배지 (닛쓰이세이야꾸 주식회사) 중 37℃ 에서 5% 탄산가스중에서 2 일간 배양한 후, 이 리포솜 480 ㎖ 를 샤레의 이 세포상에 적가시켰다. 이것을, 37℃, 5% 탄산가스중에서 6 시간 배양한 후, 혈청을 함유하지 않은 Ham's F-12 배지에서 2 회 세포를 세정하고, 샤레의 이 세포상에 15% 글리세롤 3 ㎖ 를 첨가하면서 2 분간 처리하였다. 이것을, 다시 혈청을 함유하지 않은 Ham's F-12 배지에서 2 회 세정한 후, 10% 의 소 태아 혈청을 함유하는 Ham's F-12 배지중에서 37℃, 5% 탄산가스중에서 15 시간 배양하였다. 이 세포를 트립신처리로 분산시켜 샤레로부터 회수하여, 1.25×104개씩 6-웰 플레이트에 파종하고 투석이 완료된 10% 소 태아 혈청 (JRH BIOSCIENCES 사) 을 함유하는 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM) (닛쓰이세이야꾸 주식회사) 중에서 37℃, 5% 탄산가스중에서 배양을 개시하였다. 플라스미드가 도입된 형질 전환 CHO 세포는 이 배지 중에서 생육되지만 비도입세포는 서서히 사멸되어 가므로, 배양개시 1 일째 및 2 일째에 배지를 교환하여 사멸세포를 제거하였다. 배양개시 8-10 일후에 생육해온 형질 전환 CHO 세포의 콜로니를 약 20 개 선택하였다. 각각 선택된 세포로부터 RNA 를 시판되는 RNA 단리용키트를 사용하여 회수하고, 이후 공지된 RT-PCR 법으로 rOT7T175 리셉터 유전자를 고발현하는 rOT7T175 발현 CHO 세포 23 번 클론 (이후 rOT7T175-23 라고 한다) 을 선별하였다.
또, 대조로서 ETA 발현 CHO 세포 24 번 클론 (이후 ETA24 라고 한다) Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 279권, 675-685p, 1996년 참조) 을 사용하였다.
상기 (1-1) 에서 얻어진 합성펩티드에 대하여, rOT7T175-23 및 ETA24 에서의 세포내 Ca 이온농도 상승활성의 측정을 FLIPR (Molecular Devices사) 를 사용하여 실시하였다.
rOT7T175-23 세포, ETA24 세포 모두 10% 투석처리가 완료된 소 태아 혈청 (이후 d FBS 라고 한다) 을 첨가한 DMEM 으로 대를 이으며 배양하고 있는 것을 사용하였다. rOT7T175-23 세포, ETA24 세포를 각각 15×104cells/㎖ 이 되도록 배지 (10% dFBS-DMEM) 에 현탁하고, FLIPR 용 96 홀 플레이트 (Black plate clear bottom, Coster사) 로, 분주기를 사용하여 각 웰에 200 ㎕씩 파종하고 (3.0×104Cells/200 ㎕/웰), 5% CO2인큐베이터내에서 37℃에서 하룻밤 배양한 후 사용하였다 (이후 세포 플레이트라고 한다). HANKS/HBSS(HANKS' 9.8g, 탄산수소나트륨 0.35g, 1M HEPES 20㎖, 1N 수산화나트륨으로 pH7.4 에 맞춘 후, 필터멸균처리) 21 ㎖, 250 mM Probenecid 210 ㎕, 소 태아 혈청 (FBS) 210 ㎕ (HANKS/HBSS-Probenecid-FBS) 를 혼합하였다. 또, Fluo3-AM 2 바이얼 (50 ㎍/바이얼) 을 디메틸술폭사이드 42 ㎕, 20% Pluronic acid 42 ㎕ 에 용해하고, 이것을 상기HANKS/HBSS-Probenecid-FBS 20 ㎖ 에 첨가하여 혼합한 후, 배양액을 제거한 세포 플레이트에 8련 피펫을 사용하여 각 웰 100 ㎕씩 부으며 5% CO2인큐베이터내에서 37℃ 에서 1 시간 인큐베이팅하였다 (색소로딩). 펩티드를 1×10-3M 이 되도록 디메틸술폭시드에 용해하였다. 펩티드의 디메틸술폭시드용액 0.002 ㎖ (1×10-3M) 에, 2.5 mM Probenecid, 0.2% BSA 를 함유하는 HANK'S/HBSS 0.066 ㎖ 를 첨가하여 희석하였다 (활성측정시, 최종농도 1×10-6M). 또한, 펩티드의 디메틸술폭시드용액 0.001 ㎖ (1×10-3M) 에 디메틸술폭시드 0.009 ㎖ 를 첨가하여 희석하고, 이것을 0.002 ㎖ 분취한 후, 2.5 mM Probenecid, 0.2% BSA 를 함유하는 HANK'S/HBSS 0.066 ㎖ 를 첨가하여 희석하였다 (최종농도 1×10-5M). 동일하게 최종농도 1×10-10M 까지 희석을 실시하며 FLIPR용 96 홀 플레이트 (V-Bottom 플레이트, Coster사) 로 옮겼다 (이후, 샘플 플레이트로 함). 세포 플레이트의 색소 로딩이 종료된 후, HANK'S/HBSS 에 2.5 mM Probenecid 를 첨가한 세정 버퍼로 플레이트 워셔를 사용하여 세포 플레이트를 4 회 세정하고, 세정후 100 ㎕ 의 세정 버퍼를 남겼다. 이 세포 플레이트와 샘플 플레이트를 FLIPR 에 세팅하고, FLIPR 장치로 자동적으로 샘플 플레이트에서 0.05 ㎖ 샘플을 세포 플레이트로 옮겨 세포의 응답반응을 촉구하였다. 180초간의 세포내 칼슘 이온농도의 변화를 시간 경과에 따라 측정하였다.
그 결과, 상기 (1-1) 에서 합성한 펩티드가 rOT7T175 발현세포 특이적으로 세포내 칼슘 이온농도의 상승을 일으키는 것이 명확해졌다. 그 도즈리스 폰스 커브 (도 9) 를 비교하면, PEPTIDE (40-54), PEPTIDE (45-54) 가 가장 높은 활성을 갖고 있음이 명확하다.
본 발명의 G단백질 공액형 리셉터 단백질, 그 부분 펩티드 또는 그들 염 및 그들을 코딩하는 폴리누클레오티드 (예컨대, DNA, RNA 및 그들 유도체) 는, ① 리간드 (본 발명의 리간드 펩티드) (작용물질) 의 결정, ② 항체 및 항혈청의 입수, ③ 재조합형 리셉터 단백질의 발현계의 구축, ④ 동발현계를 사용한 리셉터 결합 분석계의 개발과 의약품 후보화합물의 스크리닝, ⑤ 구조적으로 유사한 리간드·리셉터의 비교에 의거한 드랙디자인의 실시, ⑥ 유전자진단에서의 프로브나 PCR 프라이머의 작성을 위한 시약, ⑦ 트랜스제닉 동물의 제작 또는 ⑧ 유전자 예방·치료제 등의 의약 등으로서 사용할 수 있다.

Claims (25)

  1. 서열 번호:1 로 표시되는 아미노산 서열과 동일하거나 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 함유하는 것을 특징으로 하는 단백질 또는 그 염.
  2. 제 1 항에 있어서, 실질적으로 동일한 아미노산 서열이 서열 번호:5 로 표시되는 아미노산 서열인 단백질 또는 그 염.
  3. 제 1 항에 기재된 단백질의 부분 펩티드, 또는 그 에스테르, 또는 그 아미드, 또는 그 염.
  4. 제 1 항에 기재된 단백질을 코딩하는 염기 서열을 갖는 폴리누클레오티드를 함유하는 폴리누클레오티드.
  5. 제 4 항에 있어서, DNA 인 폴리누클레오티드.
  6. 제 4 항에 있어서, 서열 번호:2 또는 서열 번호:6 으로 표시되는 염기 서열을 갖는 폴리누클레오티드.
  7. 제 4 항에 기재된 폴리누클레오티드를 함유하는 재조합 벡터.
  8. 제 7 항에 기재된 재조합 벡터로 형질 전환시킨 형질 전환체.
  9. 제 8 항에 기재된 형질 전환체를 배양하고, 제 1 항에 기재된 단백질을 생성, 축적시키는 것을 특징으로 하는 제 1 항에 기재된 단백질 또는 그 염의 제조법.
  10. 제 1 항에 기재된 단백질 또는 그 염, 및 제 3 항에 기재된 부분 펩티드 또는 그 에스테르 또는 그 아미드 또는 그 염에 대한 항체.
  11. 제 10 항에 있어서, 제 1 항에 기재된 단백질의 시그널 전달을 불활성화시키는 중화 항체인 항체.
  12. 제 10 항에 기재된 항체를 함유하여 이루어진 진단약.
  13. 제 1 항에 기재된 단백질 또는 그 염, 또는 제 3 항에 기재된 부분 펩티드,또는 그 에스테르, 또는 그 아미드, 또는 그 염을 사용함으로써 얻을 수 있는, 제 1 항에 기재된 단백질 또는 그 염에 대한 리간드.
  14. 제 13 항에 기재된 리간드를 함유하여 이루어진 의약.
  15. 제 1 항에 기재된 단백질 또는 그 염, 또는 제 3 항에 기재된 부분 펩티드, 또는 그 아미드, 또는 그 에스테르, 또는 그 염을 사용하는 것을 특징으로 하는 제 1 항에 기재된 단백질 또는 그 염에 대한 리간드의 결정 방법.
  16. 제 1 항에 기재된 단백질 또는 그 염, 또는 제 3 항에 기재된 부분 펩티드, 또는 그 아미드, 또는 그 에스테르, 또는 그 염을 사용하는 것을 특징으로 하는, 리간드와 제 1 항에 기재된 단백질 또는 그 염 간의 결합성을 변화시키는 화합물 또는 그 염의 스크리닝 방법.
  17. 제 1 항에 기재된 단백질 또는 그 염, 또는 제 3 항에 기재된 부분 펩티드, 또는 그 아미드, 또는 그 에스테르, 또는 그 염을 사용하는 것을 특징으로 하는, 리간드와 제 1 항에 기재된 단백질 또는 그 염 간의 결합성을 변화시키는 화합물 또는 그 염의 스크리닝용 키트.
  18. 제 16 항에 기재된 스크리닝 방법 또는 제 17 항에 기재된 스크리닝용 키트를 사용하여 얻을 수 있는, 리간드와 제 1 항에 기재된 단백질 또는 그 염 간의 결합성을 변화시키는 화합물 또는 그 염.
  19. 제 16 항에 기재된 스크리닝 방법 또는 제 17 항에 기재된 스크리닝용 키트를 사용하여 얻을 수 있는, 리간드와 제 1 항에 기재된 단백질 또는 그 염 간의 결합성을 변화시키는 화합물 또는 그 염을 함유하여 이루어진 의약.
  20. 제 10 항에 기재된 항체를 사용하는 것을 특징으로 하는 제 1 항에 기재된 단백질의 정량 방법.
  21. 서열 번호:10 으로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, N 말단에서 47 ∼ 54 번째의 아미노산 서열을 함유하고, 8 ∼ 54 개의 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드, 또는 그 아미드, 또는 그 에스테르, 또는 그 염.
  22. 제 21 항에 있어서, 서열 번호:10 으로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, N 말단에서 47 ∼ 54 번째의 아미노산 서열을 C 말단에 가지며, 8 ∼ 54 개의 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드, 또는 그 아미드, 또는 그 에스테르, 또는 그 염.
  23. 제 21 항에 있어서, 서열 번호:11, 서열 번호:12, 서열 번호:13 또는 서열 번호:14 로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드의 아미드 또는 그 염.
  24. 제 16 항에 있어서, 리간드가 제 21 항에 기재된 펩티드, 또는 그 아미드, 또는 그 에스테르, 또는 그 염인 스크리닝 방법.
  25. 제 16 항에 있어서, 리간드가 제 21 항에 기재된 펩티드, 또는 그 아미드, 또는 그 에스테르, 또는 그 염인 스크리닝용 키트.
KR1020017005344A 1998-10-27 1999-10-26 신규 ｇ 단백질 공액형 리셉터 단백질, 그 ｄｎａ 및 그에대한 리간드 KR20010085974A (ko)

Applications Claiming Priority (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP1998-305949 1998-10-27
JP30594998 1998-10-27
JP1999-27710 1999-02-04
JP2771099 1999-02-04
JP1999-57207 1999-03-04
JP5720799 1999-03-04
JP1999-276225 1999-09-29
JP27622599A JP4486187B2 (ja) 1998-10-27 1999-09-29 新規ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質、そのｄｎａおよびそのリガンド
PCT/JP1999/005905 WO2000024890A1 (fr) 1998-10-27 1999-10-26 Nouvellesroteines receptrices couplees aux proteines g, leurs adn et leursigands

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20010085974A true KR20010085974A (ko) 2001-09-07

Family

ID=27458743

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020017005344A KR20010085974A (ko) 1998-10-27 1999-10-26 신규 ｇ 단백질 공액형 리셉터 단백질, 그 ｄｎａ 및 그에대한 리간드

Country Status (19)

Country Link
US (3) US6699965B1 (ko)
EP (1) EP1126028B1 (ko)
JP (1) JP4486187B2 (ko)
KR (1) KR20010085974A (ko)
CN (1) CN1324405A (ko)
AT (1) ATE394485T1 (ko)
AU (1) AU6230699A (ko)
BR (1) BR9914835A (ko)
CA (1) CA2347294A1 (ko)
CZ (1) CZ20011358A3 (ko)
DE (1) DE69938666D1 (ko)
HU (1) HUP0104937A2 (ko)
ID (1) ID28288A (ko)
IL (1) IL142428A0 (ko)
NO (1) NO20012059L (ko)
NZ (1) NZ510977A (ko)
PL (1) PL347553A1 (ko)
SK (1) SK5502001A3 (ko)
WO (1) WO2000024890A1 (ko)

Families Citing this family (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000050563A2 (en) * 1999-02-24 2000-08-31 Merck & Co., Inc. G protein-coupled receptor resembling galanin receptors
AU2001244609A1 (en) * 2000-03-30 2001-10-15 Takeda Chemical Industries Ltd. Novel protein, dna thereof and process for producing the same
EP1168259A3 (en) 2000-06-28 2003-12-17 Hitachi, Ltd. Data management method and system for IC card
EP1314781A4 (en) * 2000-08-30 2004-11-03 Endo Yaeta Dr DESIGN AND CONSTRUCTION OF A TRANSCRIPTION MODEL OF ACELLULAR PROTEIN SYNTHESIS, AND DISCONTINUOUS DILUTION METHOD FOR USE IN SYNTHESIS OF ACELLULAR WHEAT GERM PROTEIN
JP2002109169A (ja) 2000-09-29 2002-04-12 Hitachi Ltd 作業支援方法並びにシステム及び作業支援方法を記録した記録媒体
AU2002224124A1 (en) 2000-12-01 2002-06-11 Takeda Chemical Industries Ltd. Method for producing preparation containing bioactive substance
WO2002059344A2 (en) * 2000-12-18 2002-08-01 Merck & Co., Inc. Gpr54 g protein-coupled receptor
WO2002057309A1 (fr) * 2001-01-18 2002-07-25 Takeda Chemical Industries, Ltd. Nouvelle proteine receptrice couplee a la proteine g et adn de cette proteine
WO2002072816A1 (fr) * 2001-02-26 2002-09-19 Takeda Chemical Industries, Ltd. Proteine de recepteur murin de type kiss-1 et adn correspondant
WO2002083735A1 (fr) * 2001-04-06 2002-10-24 Takeda Chemical Industries, Ltd. Nouvelle proteine receptrice et son adn
NZ531674A (en) 2001-09-18 2009-03-31 Genentech Inc Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
AU2008202007B2 (en) * 2001-09-18 2010-12-16 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
CA2460803A1 (en) * 2001-09-19 2003-04-03 Takeda Chemical Industries, Ltd. Antibody against metastin and use thereof in diagnosing pregnancy
CA2472423A1 (en) * 2002-01-11 2003-07-24 Takeda Chemical Industries, Ltd. Process for producing kiss-1 peptide
AU2003276874B2 (en) * 2002-09-11 2009-09-03 Genentech, Inc. Novel compositions and methods for the treatment of immune related diseases
CN1761680A (zh) 2002-12-26 2006-04-19 武田药品工业株式会社 肿瘤迁移抑制素衍生物及其用途
US6800611B2 (en) * 2003-01-06 2004-10-05 Takeda Chemical Industries, Ltd. Metastin derivatives and their use
JP4639052B2 (ja) * 2003-03-12 2011-02-23 武田薬品工業株式会社 性腺機能改善剤
EP1604682A4 (en) * 2003-03-12 2009-06-24 Takeda Chemical Industries Ltd AGENTS IMPROVING GONADIC FUNCTION
EP1464652A1 (en) * 2003-04-02 2004-10-06 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) GPR54 receptor agonist and antagonist useful for the treatment of gonadotropin related diseases
AU2004234399A1 (en) * 2003-04-28 2004-11-11 Wyeth Methods utilising G-protein coupled receptor 54
WO2004101747A2 (en) * 2003-05-07 2004-11-25 The General Hospital Corporation Identification and use of gpr54 and its ligands for reproductive disorders and contraception
WO2005040833A1 (en) * 2003-10-21 2005-05-06 Bayer Healthcare Ag Regulation of human metastin recognising receptors
CN101863971A (zh) 2004-06-25 2010-10-20 武田药品工业株式会社 转移素衍生物及其用途
US20090099334A1 (en) * 2005-12-22 2009-04-16 Takeda Pharmaceutical Company Limited Metastin derivatives and use thereof
US8404643B2 (en) 2005-12-22 2013-03-26 Takeda Pharmaceutical Company Limited Metastin derivatives and use thereof
TWI386417B (zh) 2005-12-22 2013-02-21 Takeda Pharmaceutical 轉移抑素衍生物及其用途
ITMI20061607A1 (it) 2006-08-09 2008-02-10 Maria Vincenza Carriero Peptidi con attivita farmacologica
TWI404726B (zh) 2006-10-25 2013-08-11 Takeda Pharmaceutical 腫瘤轉移抑制素衍生物及其用途
JPWO2009131191A1 (ja) * 2008-04-24 2011-08-25 武田薬品工業株式会社 メタスチン誘導体およびその用途
JP5698977B2 (ja) 2008-07-30 2015-04-08 武田薬品工業株式会社 メタスチン誘導体およびその用途
EP2340047A1 (en) * 2008-09-19 2011-07-06 Nektar Therapeutics Polymer conjugates of kiss1 peptides
WO2010033207A1 (en) * 2008-09-19 2010-03-25 Nektar Therapeutics Polymer conjugates of therapeutic peptides
US8716228B2 (en) 2009-05-27 2014-05-06 Yeda Research And Development Co. Ltd. GPR54 agonists or antagonists for treatment of diseases presenting behavioral abnormalities
JP6224586B2 (ja) 2012-07-10 2017-11-01 武田薬品工業株式会社 注射用製剤
TW202334178A (zh) 2017-07-05 2023-09-01 大陸商尚華醫藥科技（江西）有限公司 一種Kiss1肽類化合物、其應用及含其的組合物
CN109212217B (zh) * 2018-11-07 2021-09-10 李玉民 基于amy1a蛋白胃癌检测试剂盒及其使用方法

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5436155A (en) * 1991-12-31 1995-07-25 Arch Development Corporation Isolated DNA encoding a somatostatin receptor
AU4426296A (en) 1994-08-11 1996-03-07 Takeda Chemical Industries Ltd. G protein coupled receptor protein, production, and use thereof
AU7399296A (en) 1995-10-11 1997-04-30 Penn State Research Foundation, The A metastasis suppressor gene
US6010877A (en) * 1997-01-10 2000-01-04 Smithkline Beecham Corporation cDNA clone HE8CS41 that encodes a novel 7-transmembrane receptor
US5851798A (en) * 1997-01-27 1998-12-22 Smithkline Beecham Corporation Nucleic acid encoding human GPR14 receptor
WO1998039448A2 (en) 1997-03-07 1998-09-11 Human Genome Sciences, Inc. 186 human secreted proteins
US6420526B1 (en) * 1997-03-07 2002-07-16 Human Genome Sciences, Inc. 186 human secreted proteins
WO2000050563A2 (en) * 1999-02-24 2000-08-31 Merck & Co., Inc. G protein-coupled receptor resembling galanin receptors
US20020077469A1 (en) * 1999-03-10 2002-06-20 Borowsky Beth E. DNA encoding orphan SNORF11 receptor
EP1604682A4 (en) * 2003-03-12 2009-06-24 Takeda Chemical Industries Ltd AGENTS IMPROVING GONADIC FUNCTION

Also Published As

Publication number Publication date
DE69938666D1 (de) 2008-06-19
US7314754B2 (en) 2008-01-01
WO2000024890A1 (fr) 2000-05-04
EP1126028A1 (en) 2001-08-22
US20080131976A1 (en) 2008-06-05
JP4486187B2 (ja) 2010-06-23
ATE394485T1 (de) 2008-05-15
EP1126028B1 (en) 2008-05-07
SK5502001A3 (en) 2002-01-07
NZ510977A (en) 2002-10-25
IL142428A0 (en) 2002-03-10
JP2000312590A (ja) 2000-11-14
US6699965B1 (en) 2004-03-02
CN1324405A (zh) 2001-11-28
US7608409B2 (en) 2009-10-27
BR9914835A (pt) 2002-06-18
EP1126028A4 (en) 2002-11-27
NO20012059D0 (no) 2001-04-26
HUP0104937A2 (hu) 2002-04-29
CA2347294A1 (en) 2000-05-04
US20040180407A1 (en) 2004-09-16
PL347553A1 (en) 2002-04-08
CZ20011358A3 (cs) 2001-08-15
AU6230699A (en) 2000-05-15
NO20012059L (no) 2001-06-26
ID28288A (id) 2001-05-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR20010085974A (ko) 신규 ｇ 단백질 공액형 리셉터 단백질, 그 ｄｎａ 및 그에대한 리간드
KR20010103766A (ko) 신규 ｇ 단백질 공역형 리셉터 단백질 및 그 ｄｎａ
EP1103562A1 (en) Novel g-protein coupled receptor protein and dna thereof
EP1207201A1 (en) Novel g protein-coupled receptor protein and dna thereof
EP1122313A1 (en) Novel g protein-coupled receptor protein and dna thereof
EP1118620A1 (en) Novel g protein-coupled receptor protein and dna thereof
EP1118621A1 (en) Novel g protein-coupled receptor protein and dna thereof
EP1103563A1 (en) Novel g protein-conjugated receptor protein and dna thereof
EP1138693A1 (en) Novel g protein-coupled receptor protein and dna thereof
EP1126029A1 (en) Novel g protein-coupled receptor proteins and dnas thereof
JP2002345491A (ja) 新規ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質およびそのｄｎａ
US20040101956A1 (en) Novel g protein-coupled receptor protein
EP1207169A1 (en) Novel g protein-coupled receptor protein and dna thereof
JP2000295995A (ja) 新規ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質およびそのｄｎａ
JP2003047472A (ja) 新規ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質およびそのｄｎａ
JP2002355052A (ja) 新規ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質およびそのｄｎａ
JP2003024088A (ja) 新規ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質およびそのｄｎａ
US20040048263A1 (en) Novel g protein-coupled receptor protein and dna thereof
JP2004049213A (ja) 新規ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質およびそのｄｎａ
MXPA01004177A (en) Novel g protein-coupled receptor proteins, dnas thereof and ligands to the same
JP2001136981A (ja) 新規ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質およびそのｄｎａ
JP2002335977A (ja) 新規ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質およびそのｄｎａ
JP2003000277A (ja) 新規ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質およびそのｄｎａ
JP2001017186A (ja) 新規ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質およびそのｄｎａ
JP2002360281A (ja) 新規ｇタンパク質共役型レセプタータンパク質およびそのｄｎａ

Legal Events

Date Code Title Description
WITN Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid