CZ20011358A3

CZ20011358A3 - Nový receptorový protein spojený s G proteinem, DNA a její ligand

Info

Publication number: CZ20011358A3
Application number: CZ20011358A
Authority: CZ
Inventors: Takuya Watanabe; Yasuko Terao; Yasushi Shintani; Tetsuya Ohtaki; Kimiko Kanehashi; Chieko Kitada
Original assignee: Takeda Chemical Industries, Ltd.
Priority date: 1998-10-27
Filing date: 1999-10-26
Publication date: 2001-08-15
Also published as: NO20012059D0; US6699965B1; SK5502001A3; CN1324405A; US7608409B2; BR9914835A; EP1126028A4; WO2000024890A1; AU6230699A; KR20010085974A; JP2000312590A; IL142428A0; HUP0104937A2; PL347553A1; NZ510977A; US7314754B2; EP1126028A1; US20040180407A1; US20080131976A1; CA2347294A1

Description

Oblast techniky

Předložený vynález se týká nového receptorového proteinu spojeného s G proteinem, pocházejícího z krysího malého mozku a z lidského mozku, nebo jeho solí a DNA, která ho kóduje, stejně jako peptidů, které mají ligandovou aktivitu na receptorový protein spojený s G proteinem nebo jeho amidy nebo estery nebo soli.

Dosavadní stav techniky

Rozmanité hormony a neurotransmitery regulují funkce in vivo prostřednictvím specifických receptorových proteinů umístěných v buněčné membráně. Mnoho z těchto receptorových proteinů zprostředkovává přenos intracelulámích signálů aktivací proteinů vázajících guaninový nukleotid (zde někdy dále označované jako G proteiny) s nimiž je tento receptor spojen. Tyto receptorové proteiny mají obvyklou strukturo, tj. sedm transmembránových domén, a jsou tedy souhrnně označovány jako receptory spojené s G-proteinem nebo sedm transmembránových receptorů (7TMR).

Receptorové proteiny spojené s G-proteinem existují na každém funkčním buněčném povrchu buněk a vnitřních orgánů žijícího těla a hrají velmi důležité úlohy jako cíle molekul, například hormonů, neurotransmiterů, fysiologicky aktivních látek a podobných, což jsou molekuly, které kontrolují, regulují nebo upravují funkce buněk a vnitřních orgánů u žijícího těla. Tyto receptorové proteiny zprostředkovávají transdukci signálu v buňce navázáním na fysiologicky aktivní látky a takto přeneseným signálem jsou způsobeny rozmanité reakce, jako je aktivace nebo inhibice buněk.

Pro objasnění vztahu mezi látkami, které regulují komplexní funkce v buňkách a vnitrních orgánech rozmanitých žijících těl a jejich specifických receptorových proteinů, zvláště receptorových proteinů spojených s G proteinem, by se objasnily funkční mechanismy buněk a vnitřních orgánů z různých žijících tělech a získaly by se tak

velmi důležité prostředky pro vývoj nových léčiv, které úzce souvisejí s těmito funkčními mechanismy.

Například v různých orgánech žijícího těla jsou fysiologické funkce kontrolovány regulací mnoha hormony, látkami podobajícími se hormonům, neurotransmitery nebo fysiologicky aktivními látkami. Zvláště pak fysiologicky aktivní látky přítomné v různých místech žijícího těla regulují jeho fysiologické funkce prostřednictvím odpovídajících receptorových proteinů. Ještě existuje mnoho neznámých hormonů, neurotransmiterů nebo jiných fýsiologicky aktivních látek in vivo a pouze u některých receptorových proteinů byla dosud popsána jejich struktura. Navíc ještě stále zůstává nejasné, jestli existují podtypy známých receptorových proteinů.

Pro vývoj farmaceutických prostředků je také velmi důležité objasnit vztah mezi látkami, které regulují komplexní funkce in vivo, a jejich specifickými receptorovými proteiny. Dále pak, pro účinné testování agonistů a antagonistů na receptorové proteiny při vývoji farmaceutických prostředků, je nutné objasnit funkce genů receptorových proteinů exprimovaných in vivo a exprimovat tyto geny v příslušném expresním systému.

V nedávných letech byla aktivně prováděna náhodná analýza cDNA sekvencí jako způsob analyzování genů exprimovaných in vivo. Takto získané sekvence cDNA fragmentů byly registrovány a publikovány v databázích jako Expressed Sequence Tag (EST, exprimované sekvenční tágy). Jelikož většina EST však obsahuje pouze informace o sekvenci, funkci je možné předpovědět pouze s obtížemi.

Látky, které inhibují navázání proteinů spojených s G proteinem na fysiologicky aktivní látky (tj. ligandy), a látky, které se váží na fysiologicky aktivní látky, tak indukují signální transdukce podobné těm, které jsou indukovány fysiologicky aktivními látkami (tj. ligandy), jsou používány pro farmaceutické prostředky jako antagonisté nebo agonisté specifičtí pro receptory pro regulování biologických funkcí. Je tedy velmi důležité objevit nový receptorový protein spojený s G proteinem, který je

9

99 nejen důležitý pro fysiologickou expresi in vivo, ale může být cílem pro vyvinutí farmaceutických prostředků a pro klonování genů (např. cDNA) při hledání specifického ligandu, agonisty a antagonisty nového receptoru spojeného s G proteinem.

Avšak ne všechny receptory spojené s G-proteinem byly již objeveny. Dokonce i nyní existuje mnoho neznámých receptorů spojených s G proteinem a těch, u nichž nejsou identifikovány odpovídající ligandy, to znamená, orgánové receptory. Je tedy vážně očekáváno, že bude zkoumán nový receptor spojený s G proteinem a že bude objasněna jeho funkce.

Receptory spojené s G proteinem jsou užitečné pro hledání nové fysiologicky aktivní látky (1j. ligandu) používajícího signální transdukční aktivitu jako index a při vyhledávání agonistů a antagonistů tohoto receptoru. Dokonce i když se nenajde žádný fysiologický ligand, agonisté a antagonisté receptoru mohou být vyrobeny analyzováním fysiologické aktivity receptoru pomocí pokusů s inaktivací receptoru (knockout zvířata). Očekává se, že ligandy, agonisté a antagonisté receptoru budu používány jako profylaktická/terapeutická a diagnostická léčiva pro onemocnění související s dysfunkcí receptoru spojeného s G proteinem.

Hypofunkce nebo hyperfunkce receptoru spojeného s G proteinem díky genetické variaci receptoru in vivo způsobuje v mnoha případech některé poruchy. V takovém případě se může receptor spojený s G proteinem použít nejen pro podávání antagonistů nebo agonistů receptoru, ale také pro genovou terapii přenosem receptorového genu do těla (nebo jistých specifických orgánů) nebo přenosem antimediátorové nukleové kyseliny do receptorového genu. Při takové genové terapii je informace o nukleotidové sekvenci receptorového genu esenciálně potřebná pro vyhledávání delece nebo mutace v genu. Receptorový gen je aplikovatelný také jako profylaktická/terapeutická a diagnostická léčiva pro onemocnění související s dysfunkcí receptoru.

Navíc, nalezení endogenního ligandú na receptor nebo látky s ligandovou aktivitou umožňuje zkonstruovat systém pro testování antagonistů nebo agonistů na tento receptor.

Podstata vynálezu

Předložený vynález poskytuje nový a užitečný receptorový protein spojený s G proteinem, jak je shora popsáno. To znamená, že předložený vynález poskytuje nový receptorový protein spojený s G proteinem, jeho částečné peptidy a jejich soli stejně jako polynukleotidy (DNA, RNA a jejich deriváty) obsahující polynukleotidy (DNA, RNA a jejich deriváty) kódující receptorový protein spojený s G proteinem a jeho částečné peptidy, rekombinantní vektory obsahující polynukleotidy, transformanty nesoucí rekombinantní vektory, způsoby výroby receptorového proteinu spojeného s G proteinem a jejich soli, protilátky na receptorový protein spojený s G proteinem, jeho částečné peptidy a jejich soli, sloučeniny, které mění expresní hladinu uvedeného receptorového proteinu spojeného s G proteinem, způsoby stanovení ligandú na receptorový protein spojený s G proteinem, způsoby testování sloučenin (antagonistů a agonistů) a jejich solí, které mění vlastnosti vazby ligandů a receptorového proteinu spojeného s G proteinem, sestavy pro použití pro způsob testování, sloučeniny (antagonisty nebo agonisty) nebo jejich soli, které mění vlastnosti vazby ligandú získatelných způsobem testování nebo získatelných použitím testovací sestavy a receptorového proteinu spojeného s G proteinem a farmaceutických prostředků obsahujících sloučeniny (antagonisty a agonisty), které mění vlastnosti vazby ligandů na receptorový protein spojený s G proteinem, nebo sloučeniny nebo jejich soli, které mění hladinu exprese receptorového proteinu spojeného s G proteinem.

Dále pak předložený vynález poskytuje peptidy, které mají ligandovou aktivitu vůči receptorovému proteinu spojenému s G proteinem.

Autoři předloženého vynálezu podnikli rozsáhlé studie. Výsledkem jejich studií bylo to, že uspěli při isolování cDNA kódující nový receptorový protein spojený s G • · proteinem pocházející z krysího malého mozku a z lidského mozku, založené na EST informaci připravené způsobem degenerované PCR, což vedlo k úspěšné analýze úplné nukleotidové sekvence cDNA. Aminokyselinová sekvence odvozená od této nukleotidové sekvence podpořila, že první až sedmá transmembránová doména byla pozorována při hydrofóbní analýze vynesením do grafu, což potvrzuje, že protein kódovaný touto cDNA je transmembránový receptorový protein spojený s G proteinem procházející membránou sedmkrát.

Autoři předloženého vynálezu dále pokračovali s těmito výzkumy zkoumat peptid, který má aktivitu zvyšující intracelulámí hladinu vápenatých iontů v buňkách, které exprimují receptorový protein spojený s G proteinem použitím nových peptidů nalezených v některých známých peptidech nebo na základě genových dat. Výsledkem je to, že se objasnilo, že C-koncový peptid proteinu kódovaný genem KiSS-1 supresoru metastáze rakoviny (Genomics 1998, 54,145 až 148.) má aktivitu aktivující tento receptor. KiSS-1 je gen kódující protein. Autoři tohoto vynálezu směřovali svoji pozornost na sekvenci peptidu sestávajícího z 54 zbytků aminokyselin v KiSS-1 a syntetizovali C-koncové částečné peptidy. Tento peptid byl získán pro testy reaktivity s receptorem, aby se potvrdilo, že tento peptid má ligandovou aktivitu.

O peptidech získaných vyštěpením produktů genu KiSS-1 se očekává, že potlačují metastáze rakoviny, jelikož jejich geny jsou genu supresoru metastáze rakoviny. Kromě toho se o těchto peptidech očekává, že hrají důležitou roli v placentě, při čemž se bere v úvahu, že tento gen je hojné exprimován v placentě a hOT7T175, což je lidský typ receptoru receptorového proteinu spojeného s G proteinem, a je také hojně exprimován v placentě. Exprese receptoru je relativně hojná v lidské slinivce břišní, takže se o tomto peptidu předpokládá, že vykazuje nějakou fysiologickou funkci také ve slinivce břišní.

Na základě těchto zjištění autoři předloženého vynálezu podnikli rozsáhlé studie a jejich výsledkem je získání předloženého vynálezu.

Předložený vynález se tedy týká:

1) proteinu a jeho solí, které obsahují stejnou nebo v podstatě stejnou sekvenci aminokyselin jako je sekvence aminokyselin uvedená jako je sekv. id. č. 1;

2) proteinu nebo jeho solí podle bodu 1), v němž stejná nebo v podstatě stejná sekvence aminokyselin znamená sekvenci sekv. id. č. 5;

3) částečného peptidu proteinu podle bodu 1) nebo jeho esterů nebo jeho amidů nebo jeho solí;

4) polynukleotidu obsahujícího polynukleotid, který má nukleotidovou sekvenci kódující protein podle bodu 1);

5) polynukleotidu podle bodu 4), který znamená DNA;

6) polynukleotidu podle bodu 4), který obsahuje nukleotidovou sekvenci representovanou sekvencí sekv. id. č. 2 nebo sekv. id. č. 6;

7) rekombinantního vektoru obsahujícího polynukleotid podle bodu 4);

8) transformantu transformovaného rekombinantním vektorem podle bodu 7);

9) způsobu výroby proteinu nebo jeho solí podle bodu 1), podle kterého se transformant podle bodu 8) kultivuje a produkuje a akumuluje se protein podle bodu 1):

10) protilátky na protein nebo jeho soli podle bodu 1) a na částečný peptid nebo jeho estery nebo jeho amidy nebo jeho soli podle bodu 3);

I

11) protilátky podle bodu 10), které znamenají neutralizující protilátky pro deaktivování transdukce signálu proteinu podle bodu 1);

12) diagnostického prostředku, který obsahuje protilátky podle bodu 10);

13) ligandu na protein nebo jeho soli podle bodu 1), který je získatelný použitím proteinu nebo jeho solí podle bodu 1) nebo použitím částečného peptidu, jeho esterů, jeho amidů nebo jeho solí podle bodu 3);

14) farmaceutického prostředku, který obsahuje ligand podle bodu 13);

15) způsobu stanovení ligandu na protein nebo jeho soli podle bodu 1), podle kterého se používá protein nebo jeho soli podle bodu 1) nebo částečný peptid, jeho amidy, jeho estery nebo jeho soli podle bodu 3);

16) způsobu testování sloučeniny nebo jejích solí, které mění vlastnosti vazby mezi ligandem a proteinem nebo jeho solemi podle bodu 1), podle kterého se používá protein nebo jeho soli podle bodu 1) nebo částečný peptid, jeho amidy, jeho estery nebo jeho soli podle bodu 3);

17) sestavy pro testování sloučeniny nebo jejích solí, které mění vlastnosti vazby mezi ligandem a proteinem nebo jeho solemi podle bodu 1), podle kterého se používá protein nebo jeho soli podle bodu 1) nebo částečný peptid nebo jeho estery, jeho amidy nebo jeho soli podle bodu 3);

18) sloučenina nebo její soli, která mění vlastnosti vazby mezi ligandem a proteinem nebo jeho solemi podle bodu 1), kterou lze získat použitím způsobu testování podle bodu 16) nebo testovací sestavy podle bodu 17);

19) farmaceutického prostředku, který obsahuje sloučeninu nebo její soli, které mění vlastnosti vazby mezi ligandem a proteinem nebo jeho solemi podle bodu 1),

který lze získat použitím způsobu testování podle bodu 16) nebo testovací sestavy podle bodu 17);

20) způsobu kvantitativního vyhodnocení proteinu podle bodu 1), který zahrnuje použití protilátek podle bodu 10);

21) peptidu, jeho amidů, jeho esterů nebo jeho solí podle bodu 21), který v aminokyselinové sekvenci představované sekvencí sekv. id. č. 10 obsahuje sekvenci aminokyselin 47 až 54 od N-konce a obsahuje 8 až 54 zbytků aminokyselin;

22) peptidu, jeho amidů, jeho esteru nebo jeho solí, který v aminokyselinové sekvenci představované sekvencí sekv. id. č. 10 obsahuje N-koncovou sekvenci aminokyselin 47 až 54 na C-konci a obsahuje 8 až 15 zbytků aminokyselin;

23) amidů nebo solí peptidu podle bodu 21), které obsahují aminokyselinovou sekvenci představovanou sekvencí sek. id. č. 11, sekv. id. č. 12, sekv. id. č. 13 nebo sekv. id. č. 14;

24) způsobu testování podle bodu 16), podle kterého ligand znamená peptid, jeho amidy, jeho estery nebo jeho soli podle bodu 21); a

25) sestavy pro testování podle bodu 16), v níž ligand znamená peptid, jeho amidy, jeho estery nebo jeho soli podle bodu 21).

Předložený vynález dále poskytuje:

26) protein nebo jeho soli podle bodu 1) zahrnující: i) aminokyselinovou sekvenci představovanou sekvencí sekv. id. č. 1, v níž je jedna, dvě nebo více aminokyselin (s výhodou 1 až 30 aminokyselin, výhodněji 1 až 9 aminokyselin, nejvýhodněji několik (jedna nebo dvě) aminokyselin) deletováno, ii) aminokyselinovou sekvenci představovanou sekvencí sekv. id. č. 1, k níž je jedna, dvě nebo více aminokyselin (s • <· ·· ···· ·· ·«·· · · · · · · • ·· · · ··· · ♦ výhodou 1 až 30 aminokyselin, výhodněji 1 až 10 aminokyselin, nejvýhodněji několik (jedna nebo dvě) aminokyselin) pňdáno, iii) aminokyselinovou sekvenci představovanou sekvencí sekv. id. č. 1, v níž je jedna, dvě nebo více aminokyselin (s výhodou 1 až 30 aminokyselin, výhodněji 1 až 10 aminokyselin, a nejvýhodněji několik (jedna nebo dvě) aminokyselin) substituováno jinými aminokyselinami, a iv) kombinaci shora uvedených aminokyselinových sekvencí;

27) způsob testování podle bodu 16), v němž se provádí srovnání mezi i) případem, v němž je protein nebo jeho soli podle bodu 1) nebo částečný peptid, jeho amidy, jeho estery nebo jeho soli podle bodu 3) uveden do kontaktu s ligandem, a ii) případem, v němž je protein nebo jeho soli podle bodu 1) nebo částečný peptid, jeho amidy, jeho estery nebo jeho soli podle bodu 3) uveden do kontaktu s ligandem a testovanou sloučeninou;

28) způsob testování sloučeniny nebo jejích solí, které mění vlastnosti vazby mezi ligandem a proteinem nebo jeho solemi podle bodu 1), který zahrnuje měření a srovnání i) množství značeného ligandu navázaného na protein nebo jeho soli podle bodu 1) nebo částečný peptid, jeho amidy, jeho estery nebo jeho soli podle bodu 3), kde značený ligand je uveden do kontaktu s proteinem nebo jeho solemi podle bodu 1) nebo s částečným peptidem, jeho amidy, jeho estery nebo jeho solemi podle bodu 3), a ii) množství značeného ligandu navázaného na protein nebo jeho soli podle bodu 1) nebo částečný peptid nebo jeho amidy, jeho estery nebo jeho soli podle bodu 3), kde značený ligand a testovaná sloučenina jsou uvedeny do kontaktu s proteinem nebo jeho solemi podle bodu 1) nebo s částečným peptidem, jeho amidy, jeho estery nebo jeho solemi podle bodu 3);

29) způsob testování sloučeniny nebo jejích solí, které mění vlastnosti vazby mezi ligandem a proteinem nebo jeho solemi podle bodu 1), podle kterého se měří a srovnává i) množství značeného ligandu navázaného na buňky obsahující protein podle bodu 1) po uvedení značeného ligandu do kontaktu s buňkami, a ii) množství značeného ligandu navázaného na buňky po uvedení značeného ligandu a testované sloučeniny do kontaktu s buňkami;

30) způsob testování sloučeniny nebo jejích solí, které mění vlastnosti vazby mezi ligandem a proteinem nebo jeho solemi podle bodu 1), podle kterého se měří a srovnává i) množství značeného ligandu navázaného na membránovou frakci buněk obsahující protein podle bodu 1) po uvedení značeného ligandu do kontaktu s membránovou frakcí buněk, a ii) množství značeného ligandu navázaného na membránovou frakci buněk po uvedení značeného ligandu a testované sloučeniny do kontaktu s membránovou frakcí buněk;

31) způsob testování sloučeniny nebo jejích solí, které mění vlastnosti vazby mezi ligandem a proteinem nebo jeho solemi podle bodu 1), podle kterého se měří a srovnává i) množství značeného ligandu navázaného na protein exprimovaný v buněčné membráně uvedeného transformantu z bodu 8) kultivováním transformantu, kde značený ligand se uvede do kontaktu s exprimovaným proteinem, a ii) množství značeného ligandu navázaného na protein exprimovaný v buněčné membráně uvedeného transformantu podle bodu 8) kultivováním transformantu, kde značený ligand a testovaná sloučenina se uvedou do kontaktu s exprimovaným proteinem;

32) způsob testování sloučeniny nebo jejích solí, které mění vlastnosti vazby mezi ligandem a proteinem nebo jeho solemi podle bodu 1), podle kterého se měří a srovnává i) aktivita stimulující buňky zprostředkovaná proteinem, při čemž sloučenina, která aktivuje protein nebo jeho soli podle bodu 1) se uvede do kontaktu s buňkami obsahujícími protein podle bodu 1), a ii) aktivita stimulující buňky zprostředkovaná proteinem, pň čemž sloučenina, která aktivuje protein nebo jeho soli podle bodu 1) a testovaná sloučenina se uvedou do kontaktu s buňkami obsahujícími protein podle bodu 1);

33) způsob testování sloučeniny nebo jejích solí, které mění vlastnosti vazby mezi ligandem a proteinem nebo jeho solemi podle bodu 1), podle kterého se měn a • 44 44 444444

4 4 · · ···

44 44 444 4· srovnává i) aktivita stimulující buňky zprostředkovaná proteinem, při čemž sloučenina, která aktivuje protein nebo jeho soli podle bodu 1), se uvede do kontaktu s proteinem exprimovaným v buněčné membráně transformantu podle bodu 8) kultivováním tohoto transformantu, a ii) aktivita stimulující buňky zprostředkovaná proteinem, při čemž sloučenina, která aktivuje protein nebo její soli podle bodu 1) a testovaná sloučenina se uvedou do kontaktu s proteinem exprimovaným v buněčné membráně transformantu podle bodu 8) kultivováním tohoto transformantu;

34) způsob testování podle bodu 32) nebo bodu 33), v němž sloučenina, která aktivuje protein podle bodu 1) znamená peptid, jeho amidy, jeho estery nebo jeho soli podle bodu 21),

35) sloučenina nebo její soli, které mění vlastnosti vazby mezi ligandem a receptorovým proteinem spojeným s G-proteinem nebo jeho solemi podle bodu 1), kterou je možno získat způsobem pro testování podle bodu 27) až bodu 34);

36) farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje sloučeninu nebo její soli, které mění vlastnosti vazby nebo ligandem a proteinem nebo jeho solemi podle bodu 1), kterou lze získat způsobem testování podle bodu 27) až bodu 34);

37) sestavu pro testování podle bodu 17), vyznačující se tím, že obsahuje buňku obsahující protein podle bodu 1);

38) sestavu pro testování podle bodu 17), vyznačující se tím, že obsahuje buněčnou membránovou frakci buňky obsahující protein podle bodu 1);

39) sestavu pro testování podle bodu 17), vyznačující se tím, že obsahuje protein exprimovaný v buněčné membráně transformantu podle bodu 8) kultivováním tohoto transformantu;

• · • · • ··<

40) sloučeninu nebo její soli, které mění vlastnosti vazby mezi ligandem a proteinem nebo jeho solemi podle bodu 1), kterou lze získat použitím sestavy pro testování podle bodu 37) až bodu 39);

41) farmaceutický prostředek, který obsahuje sloučeninu nebo její soli, které mění vlastnosti vazby mezi ligandem a receptorovým proteinem nebo jeho solemi podle bodu 1) spojeným s G proteinem, který lze získat použitím sestavy pro testování podle bodu 37) až bodu 39);

42) způsob kvantitativního stanovení proteinu nebo jeho solí podle bodu 1) nebo částečného peptidu, jeho amidů, jeho esterů nebo jeho solí podle bodu 3), vyznačující se tím, že se protilátky podle bodu 10) uvedou do kontaktu s proteinem nebo jeho solemi podle bodu 1) nebo částečným peptidem, jeho amidy, jeho estery nebo solemi podle bodu 3);

43) způsob kvantitativního stanovení proteinu nebo jeho solí podle bodu 1) nebo částečného peptidu, jeho amidů, jeho esterů nebo jeho solí podle bodu 3) ve vzorku roztoku, vyznačující se tím, že se kompetitivně nechají zreagovat protilátky podle bodu 10) se vzorkem roztoku a se značeným proteinem nebo jeho solemi podle bodu 1) nebo značeným částečným peptidem, jeho amidy, jeho estery nebo jeho solemi podle bodu 3) a změří se poměr značeného proteinu nebo jeho solí podle bodu 1) nebo značeného částečného peptidu, jeho amidů, jeho esterů nebo jeho solí podle bodu 3), které jsou navázány na protilátky; a

44) způsob kvantitativního stanovení proteinu nebo jeho solí podle bodu 1) nebo částečného peptidu, jeho amidů, jeho esterů nebo jeho solí podle bodu 3) ve vzorku roztoku, vyznačující se tím, že se vzorek roztoku nechá zreagovat současně nebo postupně s protilátkami podle bodu 10) imobilizovanými na nosiči a značenými protilátkami podle bodu 10) a potom se změří aktivita značeného činidla na imobilizovaném nosiči.

. 13

Stručný popis obrázků

Obrázek 1 ukazuje nukleotidovou sekvenci DNA kódující receptorový protein ΓΌΤ7Τ175 spojený s G proteinem pocházející z krysího malého mozku podle předloženého vynálezu, který byl získán v příkladu 1, a aminokyselinovou sekvenci odvozenou od této DNA sekvence (pokračování na obr. 2).

Obrázek 2 ukazuje nukleotidovou sekvenci DNA kódující receptorový protein ΓΟΤ7Τ175 spojený s-G proteinem pocházející z krysího malého mozku podle předloženého vynálezu, který byl získán v příkladu 1, a aminokyselinovou sekvenci odvozenou od této DNA sekvence (pokračování z obr. 1, pokračuje se na obr. 3).

Obrázek 3 ukazuje nukleotidovou sekvenci DNA kódující receptorový protein ΓΟΤ7Τ175 spojený s G proteinem pocházející z krysího malého mozku podle předloženého vynálezu, který byl získán v příkladu 1, a aminokyselinovou sekvenci odvozenou od této DNA sekvence (pokračování z obr. 2).

Obrázek 4 ukazuje hydrofobní vynesení do grafu receptorového proteinu rOT7T175 spojeného s G proteinem pocházejícího z krysího malého mozku podle předloženého vynálezu vyrobeného na základě aminokyselinové sekvence uvedené na obrázcích 1 až 3.

Obrázek 5 ukazuje nukleotidovou sekvenci DNA kódující receptorový protein hOT7T175 spojený s G proteinem pocházející z lidského mozku podle předloženého vynálezu, který byl získán v příkladu 2, a aminokyselinovou sekvenci odvozenou od DNA sekvence (pokračování na obr. 6).

Obrázek 6 ukazuje nukleotidovou sekvenci DNA kódující receptorový protein hOT7T175 spojený s G proteinem pocházející z lidského mozku podle předloženého vynálezu, který byl získán v příkladu 2, a aminokyselinovou sekvenci odvozenou od DNA sekvence (pokračování z obr. 5 s pokračováním na obr. 7).

• ·

Obrázek 7 ukazuje nukleotidovou sekvenci DNA kódující receptorový protein hOT7T175 spojený s G proteinem pocházející z lidského mozku podle předloženého vynálezu, který byl získán v příkladu 2, a aminokyselinovou sekvenci odvozenou od DNA sekvence (pokračování z obr. 6).

Obr. 8 ukazuje hydrofobní vynesení do grafu receptorového proteinu hOT7T175 spojeného s G proteinem pocházejícího z lidského mozku podle předloženého vynálezu vyrobeného na základě aminokyselinové sekvence uvedené na obrázcích 5 až 7.

Obrázek 9 ukazuje výsledky měření aktivity zvyšující hladinu intracelulámího Ca iontu testované v příkladu 3 (1 až 2).

Nejlepší způsob provedení vynálezu

Protein podle předloženého vynálezu (receptorový protein; receptorový protein spojený s G proteinem; zde dále často označovaný jako receptorový protein podle předloženého vynálezu) znamená takový protein, který má stejnou nebo v podstatě stejnou aminokyselinovou sekvenci jako je sekvence představovaná sekv. id. č. 1 (aminokyselinová sekvence uvedená na obrázcích 1 až 3).

Receptorový protein podle předloženého vynálezu může znamenat jakýkoliv peptid odvozený od jakýchkoliv buněk člověka a jiného savce (např. morčete, krysy, myši, králíka, prasete, ovce, hovězího dobytka, opice atd.), například slezinných buněk, nervových buněk, gliových buněk, B-buněk slinivky břišní, buněk kostní dřeně, mesangiálních buněk, Langerhansových buněk, epidermálních buněk, epiteliálních buněk, endoteliálních buněk, fibroblastů, fibrocytú, svalových buněk, tukových buněk, imunocytů (např. makrofágú, T buněk, B buněk, přirozených zabíjecích buněk, žírných buněk, neutrofilů, basofilů, eosinofilů, monocytú atd.), megakaryocytú, synoviálních buněk, chondrocytů, osteocytů, ósteoblastů, osteoklastů, buněk prsní žlázy, hepatocytú nebo intersticiálních buněk, nebo prekursorú buněk, kmenových buněk nebo

•				····	··	•
«· ·		•	• ·	•	• ·	9*
•	··		• ·	···	• ·	•
• ·		•		•	• · ·	•
• ·		•	• *	•	• ·	•
···	··		• t	·*·	··	··♦

rakovinových buněk těchto buněk a podobně; buněk hemocytového typu; nebo jakýchkoliv tkání obsahujících takové buňky, např. mozku, různých částí mozku (např. bulbus olfactorius, mandle, cerebrální bazální ganglie, hippocampus, talamus, hypotalamus, nucleus substanlamicus, kúra mozková, prodloužená mícha, malý mozek, okcipitální pól, čelní lalok, spánkový lalok, putamen, nucleus caudatus, korpus callosum, substantia nigra), míchy, podvězku mozkového, žaludku, slinivky břišní, ledvin, jater, pohlavních žláz, štítné žlázy, žlučníku, kostní dřeně, žlázy nadledvinek, pokožky, svalu, plic, trávícího traktu (např. tlustého střeva, tenkého střeva), krevních destiček, srdce, brzlíku, sleziny, submandibulámí žlázy, periferní krve, periferních hemocytů, prostaty, varlete, varlat, vaječníků, placenty, dělohy, kostí, kloubů, skeletálního svalstva a podobně, zvláště pak mozku a různých částí mozku. Peptid může znamenat také syntetický peptid.

Aminokyselinová sekvence, která má stejnou nebo v podstatě stejnou sekvenci, jako je sekvence představovaná sekvencí sekv. id. č. 1, zahrnuje aminokyselinovou sekvenci, která má alespoň asi 50% homologii, s výhodou alespoň asi 70% homologii, výhodněji alespoň asi 80% homologii, mnohem výhodněji alespoň asi 90% homologii, nejvýhodněji alespoň asi 95% homologii s aminokyselinovou sekvencí representovanou sekvencí sekv. id. č. 1.

Mezi specifické příklady proteinu patří protein, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci představovanou sekvencí sekv. id. č. 5 (aminokyselinová sekvence uvedená na obrázcích 5 až 7).

Výhodný příklad proteinu, který má v podstatě stejnou aminokyselinovou sekvenci, jako je sekvence představovaná sekvencí sekv. id. č. 1, je protein, který má v podstatě stejnou aminokyselinovou sekvenci, jako je sekvence představovaná sekvencí sekv. id. č. 1, a který má v podstatě stejnou aktivitu jako má aminokyselinová sekvence představovaná sekvencí sekv. id. č. 1.

• · • ·

Mezi příklady v podstatě stejné aktivity patří aktivita navázání ligandu, aktivita spočívající v transdukci signálu a podobné. Pojem v podstatě stejný je používán v tom významu, že povahy jejich aktivit jsou navzájem stejné. Výhodné je tedy to, že i když aktivita, jako je aktivita navázání ligandu nebo aktivita spočívající v transdukci signálu, je stejná (například přibližně 0,01 až lOOnásobná, s výhodou asi 0,5 až 20násobná, výhodněji asi 0,5 až dvojnásobná), kvantitativní faktory, jako jsou stupně těchto aktivit a molekulová hmotnost proteinů, se mohou navzájem odlišovat.

Aktivity, jako je aktivita navázání ligandu nebo aktivita spočívající v transdukci signálu, se mohou stanovit podle obecně známých způsobů, například způsobem stanovování ligandú nebo způsobem testování, který bude popsán později.

Receptorový protein podle předloženého vynálezu, který se může používat, může znamenat takový protein, který obsahuje i) aminokyselinovou sekvenci představovanou sekvencí sekv. id. č. 1, v níž je jedna, dvě nebo více aminokyselin (s výhodou 1 až 30 aminokyselin, výhodněji 1 až 10 aminokyselin, nejvýhodněji několik (jedna nebo dvě) aminokyselin) deletováno; ii) aminokyselinovou sekvenci představovanou sekvencí sekv. id. č. 1, k níž je jedna, dvě nebo více aminokyselin (s výhodou 1 až 30 aminokyselin, výhodněji 1 až 10 aminokyselin, nejvýhodněji několik (jedna nebo dvě) aminokyselin) přidáno; iii) aminokyselinovou sekvenci představovanou sekvencí sekv. id. č. 1, v níž je jedna, dvě nebo více aminokyselin (s výhodou 1 až 30 aminokyselin, výhodněji 1 až 10 aminokyselin, nejvýhodnéji několik (jedna nebo dvě) aminokyselin) substituováno jinými aminokyselinami; a iv) kombinaci shora uvedených aminokyselinových sekvencí.

Receptorový protein podle předloženého vynálezu, který se může používat, může znamenat také protein, který obsahuje i) aminokyselinovou sekvenci představovanou sekvencí sekv. id. č. 5, v níž je jedna, dvě nebo více aminokyselin (s výhodou 1 až 30 aminokyselin, výhodněji 1 až 10 aminokyselin, nejvýhodněji několik (jedna nebo dvě) aminokyselin) deletováno; ii) aminokyselinovou sekvenci představovanou sekvencí sekv. id. č. 5, k níž je jedna, dvě nebo více aminokyselin (s výho• · · · • ·

dou 1 až 30 aminokyselin, výhodněji 1 až 10 aminokyselin, nejvýhodněji několik (jedna nebo dvě) aminokyselin) podáno; iii) aminokyselinovou sekvenci představovanou sekvencí sekv. id. č. 5, v níž je jedna, dvě nebo více aminokyselin (s výhodou 1 až 30 aminokyselin, výhodněji 1 až 10 aminokyselin, a nejvýhodněji několik Qedna nebo dvě) aminokyselin) substituováno jinými aminokyselinami; a iv) kombinaci shora uvedených aminokyselinových sekvencí.

Receptorový protein podle předloženého vynálezu je označován způsobem popisování peptidú, který je znám z oblasti techniky. To znamená, že levý konec (aminový konec) znamená N-koncovou část a pravý konec (karboxylový konec) znamená C-koncovou část. V receptorovém proteinu podle předloženého vynálezu obsahujícím aminokyselinovou.sekvenci-představovanou-sekvencí-sekv.-id.č.~1;G-koncováčást znamená normálně karboxylovou skupinu (-COOH) nebo karboxylát (-COOj, ale C-koncová část může znamenat amid (-CONH₂) nebo ester (-COOR).

Mezi příklady skupiny R v esterové skupině patří alkylová skupina s 1 až 6 atomy uhlíku, jako je methylová, ethylová, propylová, isopropylová, butylová atd. skupina, cykloalkylová skupina se 3 až 8 atomy uhlíku, jako je cyklopentylová, cyklohexylová atd. skupina, arylová skupina se 6 až 12 atomy uhlíku, jako je fenylová, a-naftylová atd. skupina, aralkylová skupina se 7 až 14 atomy uhlíku, jako je fenylalkyl(s 1 až 2 atomy uhlíku)ová skupina, např. benzylová, fenethylová atd. skupina, a-naftyl-alkyl(s 1 až 2 atomy uhlíku)ová atd. skupina, např. a-naftylmethylová skupina atd. a podobně. Také se dále může používat pivaloyloxymethylová skupina nebo podobná skupina, která je rozsáhle používána jako ester při orálním podávání.

Jestliže receptorový protein podle předloženého vynálezu obsahuje karboxylovou skupinu (nebo karboxylát) v jiné poloze než je C-koncová část, může být amidována nebo esterifikována a takový amid nebo ester je také zahrnut pod pojem receptorový protein podle předloženého vynálezu. Esterová skupina může znamenat stejnou skupinu jako je skupina, která je popsána u shora uvedené C-koncové části.

·· ····

Receptorový protein podle předloženého vynálezu dále zahrnuje deriváty, v nichž aminová skupina N-koncového methioninového zbytku shora uvedeného proteinu je chráněna chránící skupinou (např. acylovou skupinou s 1 až 6 atomy uhlíku, jako je formylová skupina, acetylová skupina atd.); ty, v nichž N-koncová oblast je rozštěpena in vivo a vytvořená glutamylová skupina je pyroglutaminována; a ty, v nichž substituent (např. -OH, -SH, -COOH, aminová skupina, imidazolová skupina, indolová skupina, guanidinová skupina atd.) na postranních řetězcích aminokyseliny v molekule proteinu je chráněn příslušnou chránící skupinou (např. acylovou skupinou s 1 až 6 atomy uhlíku, jako je alkanoylová skupina se 2 až 6 atomy uhlíku, např. formylová skupina, acetylová skupina atd.) nebo konjugované proteiny, jako jsou glykoproteiny s cukernými řetězci na ně napojenými.

Specifické příklady receptorového proteinu podle předloženého vynálezu, které se mohou používat, zahrnují receptorový protein pocházející z krys, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci představovanou sekvencí sekv. id. č. 1, a receptorový protein pocházející z člověka, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci představovanou sekvencí sekv. id. č. 5.

Částečný peptid receptorového proteinu podle předloženého vynálezu (zde dále někdy označovaný jako částečný peptid) může znamenat jakýkoliv částečný peptid, tak dlouhý, že představuje část peptidových oblastí shora popsaného receptorového proteinu podle předloženého vynálezu. Příklady takového částečného peptidu zahrnují místo, které je vystaveno mimo buněčné membrány mezi receptorovou proteinovou molekulu podle předloženého vynálezu a zachovává si aktivitu navázání receptoru.

Příkladem částečného peptidu proteinu obsahujícího aminokyselinovou sekvenci představovanou sekvencí sekv. id. č. 1 je peptid obsahující oblast, která je analyzována jako extracelulámí oblast (hydrofilní oblast nebo místo) při hydrofilní analýze vynesením do grafu, jak je uvedeno na obr. 4. Dalším příkladem částečného peptidu proteinu obsahujícího aminokyselinovou sekvenci představovanou sekvencí sekv. id.

• · · ·

č. 5 je peptid obsahující oblast, která podle analýzy znamená extracelulámí oblast (hydrofilní oblast nebo místo) pň hydrofobní analýze vynesením do grafu, jak je uvedeno na obr. 8. Může se použít rovněž takový peptid, který částečně obsahuje hydrofobní oblast nebo místo. Dále se může použít také peptid, který nezávisle obsahuje každou doménu, i když se může použít také částečný peptid, který obsahuje více domén ve stejném čase.

Počet aminokyselin v částečném peptidu podle předloženého vynálezu je alespoň 20 nebo více, s výhodou 50 nebo více, výhodněji 100 nebo více, v pojmech konstruktivní aminokyselinové sekvence shora popsaného receptorového proteinu podle předloženého vynálezu.

V podstatě stejná aminokyselinová sekvence znamená takovou aminokyselinovou sekvenci, která má alespoň asi 50% homologii, s výhodou alespoň asi 70% homologii, výhodněji alespoň asi 80% homologii, mnohem výhodněji alespoň asi 90% homologii a nejvýhodněji alespoň asi 95% homologii.

Pojem v podstatě stejná aktivita, jak se zde používá, má stejnou definici, jak bylo shora uvedeno. V podstatě stejná aktivita může být testována shora popsaným způsobem.

V částečných peptidech podle předloženého vynálezu může být ve shora popsané aminokyselinové sekvenci deletována jedna, dvě nebo více aminokyselin (s výhodou přibližné 1 až 10 aminokyselin, výhodněji několik (jedná nebo dvě) aminokyselin) deletováno; jedna, dvě nebo více aminokyselin (s výhodou přibližně 1 až 20 aminokyselin, výhodněji 1 až 10 aminokyselin a nejvýhodněji několik (jedna nebo dvě) aminokyselin) může být k aminokyselinové sekvenci přidáno; nebo jedna, dvě nebo více aminokyselin (s výhodou přibližně 1 až 10 aminokyselin, výhodněji několik (jedna nebo dvě) aminokyselin) může být v aminokyselinové sekvenci substituováno jinými aminokyselinami.

• ·

V částečném peptidu podle předloženého vynálezu C-koncová část znamená normálně karboxylovou skupinu (-COOH) nebo karboxylát (-COO ), ale C-koncová část může znamenat amid (-CONH₂) nebo ester (-COOR), jak bylo popsáno u receptorového proteinu podle předloženého vynálezu.

Jak je ve shora popsaném receptorovém proteinu podle předloženého vynálezu popsáno, může částečný peptid podle předloženého vynálezu zahrnovat také konjugované peptidy, jako jsou ty, v nichž aminová skupina N-koncového methioninového zbytku je chráněna chránící skupinou, ty, v nichž N-koncový zbytek je štěpen in vivo a vzniklý Gin je převeden na pyroglutamát, ty, v nichž substituenty v postranních řetězcích aminokyselin v molekule jsou chráněny příslušnými chránícími skupinami,_aty,naněžjsou navázánycukeméřetězce.toznamenáglykopeptidy.—Receptorový protein podle předloženého vynálezu nebo jeho částečný protein se mohou používat ve formě solí s fysiologicky přijatelnými bázemi nebo kyselinami, s výhodou ve formě jejich fýsiologicky přijatelných adičních solí s kyselinami. Příklady takových solí jsou soli s anorganickými kyselinami (např. kyselinou chlorovodíkovou, kyselinou fosforečnou, kyselinou bromovodíkovou a kyselinou sírovou), soli s organickými kyselinami (např. kyselinou octovou, kyselinou mravenčí, kyselinou propionovou, kyselinou fumarovou, kyselinou maleinovou, kyselinou jantarovou, kyselinou vinnou, kyselinou citrónovou, kyselinou jablečnou, kyselinou šťavelovou, kyselinou benzoovou, kyselinou methansulfonovou a kyselinou benzensulfonovou) a podobné.

Receptorový protein podle předloženého vynálezu nebo jeho soli se mohou vyrábět podle obecně známého způsobu čištění receptorového proteinu ze shora popsaných lidských nebo jiných savčích buněk nebo tkání. Receptorový protein podle předloženého vynálezu nebo jeho soli se mohou vyrábět také kultivováním transformantu obsahujícího DNA, která kóduje receptorový protein podle předloženého vynálezu, jak zde bude dále popsáno. Receptorový protein podle předloženého vynálezu nebo jeho soli se mohou dále vyrábět také způsoby syntetizování proteinů, které zde také budou dále popsány, nebo modifikovanými způsoby.

·· · ·

Když se vyrábí receptorový protein nebo jeho soli z lidských nebo savčích tkání nebo buněk, lidské nebo savčí buňky nebo tkáně se homogenizují, potom se extrahují kyselinou nebo podobně a extrakt se isoluje a vyčistí kombinací chromatografických technik, jako je chromatografie na obrácených fázích, chromatografie na iontoměniči a podobně.

Při syntetizování receptorového proteinu, částečného peptidu nebo jeho solí nebo amidů podle předloženého vynálezu se mohou použít komerčně dostupné pryskyřice, které jsou používány pro syntézu proteinů. Mezi příklady takových pryskyřic patří chromethylová pryskyřice, hydroxymethylová pryskyřice, benzhydrylaminová pryskyřice, aminomethylová pryskyřice, 4-benzyloxybenzylalkoholová pryskyřice, j4=methylbenzhydiylaminová-pryskyňce—pryskyrice-PAM—4-hydroxymethylmethylfenyl-acetamodiomethylová pryskyřice, polyakrylamidová pryskyřice, 4-(2',4'-dimethoxyfenol-hydroxymethylfenoxypryskyňce a 4-(2',4'-dimethoxyfenyl-Fmoc-aminoethyl)fenoxy-pryskyřice. Použitím těchto pryskyřic se aminokyseliny, v nichž jsou a-aminové skupiny a funkční skupiny v postranních řetězcích patřičně chráněny, zkondenzují na pryskyřici v pořadí sekvence příslušného proteinu podle různých způsobů kondenzace obecně známých v oblasti techniky. Na konci reakce se protein vyštípne z pryskyřice a ve stejné době se odstraní chránící skupiny. Potom se provede ve vysoce zředěném roztoku reakce, pn které se vytvoří intramolekulámí disulfidová vazba, aby se získal příslušný protein nebo jeho amidy.

Pro kondenzaci shora popsaných chráněných aminokyselin se mohou pro proteinovou syntézu použít rozmanitá aktivační reakční činidla, ale zvláště výhodně se používají karbodiimidy. Mezi příklady takových karbodiimidů patří DCC, N,N'-diisopropylkarbodiimid a N-ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)karbodiimid. Pro aktivování těmito reakčními činidly se chráněné aminokyseliny v kombinaci s inhibitorem racemizace (např. HOBt, HOOBt) pňdají přímo k pryskyřici nebo se chráněné aminokyseliny předem aktivují ve formě symetrických anhydridů kyselin, HOBt esterů nebo HOOBt esterů, načež následuje přidání takto aktivovaných chráněných aminokyselin k pryskyřici.

• · • ·

Rozpouštědla, která jsou vhodná pro použití při aktivování chráněných aminokyselin nebo při kondenzaci s pryskyřicí, mohou být vybrána z rozpouštědel, o kterých je známo, že se mohou používat pro kondenzační reakce proteinů. Příklady takových rozpouštědel jsou amidy kyselin, jako je Ν,Ν-dimethylformamid, N,N-dimethylacetamid a N-rnethylpyrrolidon; halogenované uhlovodíky, jako methylenchlorid a chloroform; alkoholy, jako je trifluorethanol; sulfoxidy, jako je dimethylsulfoxid; ethery, jako je pyridin, dioxan a tetrahydrofuran; nitrily, jako je acetonitril a propionitril; estery, jako je methylacetát a ethylacetát; a příslušné směsi těchto rozpouštědel. Reakční teplota se příslušně vybere z rozsahu, o němž je známo, že je použitelný pro vazebné reakce proteinů a je obvykle vybrána v rozmezí přibližně -20 °C až 50 °C. Aktivované aminokyselinové deriváty se obecně používají v 1,5násobném až čtyřnásobném_nadbytku.-Kondenzace _.se_ sleduje—ninhydrinovou- reakcí—Jestliže-je kondenzace nedostatečná, kondenzaci je možno dokončit zopakováním kondenzační reakce bez odstranění chránících skupin. Jestliže kondenzace ještě není dostatečná, dokonce ještě po zopakování reakce, nezreagované aminokyseliny se acetylují anhydridem kyseliny octové nebo acetylimidazolem, aby se zrušil jakýkoliv možný nepříznivý vliv na následující reakci.

Mezi příklady chránících skupin, které jsou použity pro chránění výchozích aminových skupin, patří Z, Boc, terc.pentyloxykarbonylová, isobomyloxykarbonylová a 4-methoxybenzyloxykarbonylová skupina, Cl-Z, Br-Z, adamantyloxykarbonylová, trifluoracetylová, ftaloylová, formylová, 2-nitrofenylsulfenylová a difenylfosfinothioylová skupina a Fmoc.

Karboxylová skupina může být chráněna např. alkylovou esterifikací (ve formě lineárních, větvených nebo cyklických alkylesterů alkylových skupin, jako je methylová, ethylová, propylová, butylová, terc.butylová, cyklopentylová, cyklohexylová, cykloheptylová, cyklooktylová a 2-adamantylová skupina), aralkylovou esterifikací (např. benzylester, 4-nitrobenzylester, 4-methoxybenzylester, 4-chlorbenzylester a benzyhydrylester), fenacylovou esterifikací, benzyloxykarbonylovou hydrazidací, terc.butoxykarbonylovou hydrazidací a tritylovou hydrazidací.

• ·

Hydroxylová skupina šeřinu může být chráněna například jeho esterifikací nebo etherifikací. Mezi příklady skupin, které jsou příslušně používány pro esterifikací, patří nižší alkanoylová skupina, jako je acetylová skupina, aroylová skupina, jako je benzoylová skupina, a skupina odvozená od kyseliny uhličité, jako je benzyloxykarbonylová skupina a ethoxykarbonylová skupina. Mezi příklady skupin, které jsou příslušně používány pro etherifikací, patří benzylová skupina, tetrahydropyranylová skupina a terc.butylová skupina.

Mezi příklady skupin pro chránění fenolické hydroxylové skupiny tyrosinu patří Bzl, Cl₂-Bzl, 2-nitrobenzylová skupina, Br-Z a terc.butylová skupina.

_______Mezi_pĚíklady_skupin-používaných-prochráněnl·amidazol0véěásti-histidinu-patn Tos, 4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzensulfonylová skupina, DNP, benzyloxymethylová skupina a skupina Bum, Boc, Trt a Fmoc.

Mezi příklady aktivovaných karboxylových skupin ve výchozích aminokyselinách patří odpovídající anhydridy kyselin, azidy kyselin a aktivované estery kyselin (estery s alkoholy, např. pentachlorfenolem, 2,4,5-trichlorfenolem, 2,4-dinitrofenolem, kyanmethylalkoholem, p-nitrofenolem, HONB, N-hydroxysukcinimidem, N-hydroxyftalimidem a HOBt). Jako aktivované aminokyseliny, v nichž jsou aminové skupiny ve výchozím materiálu aktivovány, se používají odpovídající amidy kyseliny fosforečné.

Pro odstranění (odštěpení) chránících skupin se používá katalytická redukce pod průtokem plynného vodíku v přítomnosti takového katalyzátoru, jako je paladiová čem nebo Pd na uhlí, kyselé zpracování s bezvodým fluorovodíkem, methansulfonovou kyselinou, trifluormethansulfonovu kyselinou nebo kyselinou trifluoroctovou nebo směsí roztoku těchto kyselin, zpracování s bází, jako je diisopropylethylamin, triethylamin, piperidin nebo piperazin, a redukce sodíkem v kapalném amoniaku. Shora popsaná eliminační reakce chránící skupiny zpracováním s kyselinou se provádí obecně za teploty přibližně -20 °C až 40 °C. Při kyselém zpracování je účinné

přidat vychytávač kationtú, jako je anisol, fenol, thioanisol, m-kresol, p-kresol, dimethylsulfid, 1,4-butandithiol nebo 1,2-ethandithiol. Dále pak 2,4-dinitrofenylová skupina, která je známa jako chránící skupina pro imdiazolovou část histidinu, se odstraňuje reakcí s thiofenolem. Formylová skupina, použitá jako chránící skupina indolové části tryptofanu, se odstraňuje shora uvedeným zpracováním s kyselinou v přítomnosti 1,2-ethandithiolu nebo 1,4-butandithiolu stejně jako zpracováním s alkálií, jako je zředěný roztok hydroxidu sodného a zředěný amoniak.

Chránění funkčních skupin, který by neměly být zahrnuty v reakci výchozích materiálů, chránící skupiny, odstraňování chránících skupin a aktivace funkčních skupin, které jsou zahrnuty v reakci, může být příslušně vybráno z obecně známých .skupinaobecněznámýchprostredků—----------V jiném způsobu získávání amidovaných proteinů se například a-karboxylová skupina aminové kyseliny s koncovým karboxylem nejdříve chrání amidací a peptidový řetězec (proteinový řetězec) se pak prodlouží na straně aminové skupiny na žádanou délku. Potom se vyrobí protein, v němž byla z peptidu odstraněna pouze chránící skupina N-koncové α-aminoskupiny, a protein, v němž byla odstraněna pouze chránící skupina C-koncové karboxylové skupiny. Tyto dva proteiny se zkondenzují ve směsi shora popsaných rozpouštědel. Podrobnosti kondenzační reakce jsou stejné jak shora popsáno. Po tom, co se chráněný protein získaný kondenzací vyčistí, se shora popsaným způsobem odstraní všechny chránící skupiny. Získá se tak žádaný surový protein. Tento surový protein se vyčistí různými známými prostředky čištění. Lyofilizace hlavní frakce poskytuje amid žádaného proteinu.

Pň výrobě esterifikovaného proteinu se například α-karboxylová skupina na karboxylovém konci aminokyseliny zkondenzuje s žádaným alkoholem. Vyrobí se ester aminokyseliny, který se zpracuje podobným způsobem jako pň přípravě shora uvedeného amidovaného proteinu. Získá se tak žádaný esterifikovaný protein.

• · · ·

Částečný peptid receptorového proteinu podle předloženého vynálezu se může vyrábět obecně známými způsoby syntézy peptidů nebo štěpením receptorového proteinu podle předloženého vynálezu příslušnou peptidasou. Pro způsoby syntézy peptidů se může použít například buď syntéza v pevné fázi nebo syntéza v kapalné fázi. To znamená, že částečný peptid nebo aminokyseliny, které mohou poskytovat konstrukci receptorového proteinu podle předloženého vynálezu, se zkondenzují se zbývající částí receptorového proteinu podle předloženého vynálezu. Jestliže produkt obsahuje chránící skupiny, tyto chránící skupiny se odstraní a získá se tak žádaný peptid. Obecně známé způsoby kondenzace a eliminace chránících skupin jsou popsány níže pod ad 1) až 5).

_______D-BQdanszky-M^aOndetti-M.-A.-^epí/tíeSyňřhes/Srlnersicence-Publishersr New York 1966.

2) Schroeder a Luebke: The Peptide, Academie Press, New York 1965.

3) Izumiya Nobuo a spol.: Peptide Gosei-no-Kiso to Jikken (Basics and Experiments of Peptide Synthesis), publikováno firmou Maruzen Co., 1975.

4) Yajima Haruaki a Sakakibara Shunpei: Seikagaku Jikken Koza (Biochemical Experiment) 1, Tanpakushitsu no Kagaku (Chemistry of Proteins) 1977, IV, 205.

5) Yajima Haruaki (rad.): Žoku lyakuhin no Kaihatsu {A Sequel to Development of Pharmaceuticals), díl 14, Peptide Synthesis, publikováno Hirokawa Shoten.

Po ukončení reakce se produkt může vyčistit a isolovat kombinací konvenčních způsobů čištění, jako je extrakce rozpouštědlem, destilace, chromatografie na koloně, kapalinová chromatografie a rekrystalizace. Získá se tak částečný peptid podle předloženého vynálezu. Jestliže částečný peptid získaný shora uvedeným způsobem existuje ve volné formě, může se tento peptid převést na příslušnou sůl obecně známým způsobem. Jestliže se protein získá ve formě soli, může se převést na volnou formu obecně známým způsobem.

Polynukleotid kódující receptorový protein podle předloženého vynálezu může znamenat jakýkoliv polynukleotid, pokud tento obsahuje nukleotidovou sekvenci (DNA nebo RNA, s výhodou DNA) kódující shora popsaný receptorový protein podle předloženého vynálezu. Takovým polynukleotidem může být DNA a RNA včetně mRNA, která kóduje receptorový protein podle předloženého vynálezu. Polynukleotid může být buď dvouvláknový nebo jednovláknový. Jestliže polynukleotid je dvouvláknový, může znamenat dvouvláknovou DNA nebo hybrid DNA:RNA. Jestliže polynukleotid je jednovláknový, může znamenat negativní vlákno (tj. kódující vlákno) nebo .posjtiyní_vlákno(tj._nekódující-vlákno).--------------<-------------------------——

Použitím polynukleotidu kódujícího receptorový protein podle předloženého vynálezu může být mRNA receptorového proteinu podle předloženého vynálezu kvantitativně vyhodnocena například způsobem publikovaným ve specielním dílu Jíkken Igaku (Experímental Medical Science) New PCR and its application, 1997, 15(7), nebo modifikací tohoto způsobu.

DNA kódující receptorový protein podle předloženého vynálezu může znamenat jakoukoliv genomovou DNA, genomovou DNA knihovnu, cDNA pocházející ze shora popsaných buněk a tkání, cDNA knihovnu pocházející ze shora popsaných buněk a tkání a syntetickou DNA. Vektor, který se používá pro knihovnu, může znamenat jakýkoliv vektor z bakteriofágu, plasmidu, kosmidu a fagemidu. DNA může být přímo amplifikována reversní transkriptasovou polymerasovou řetězcovou reakcí (zde dále zkracovanou jako RT-PCR) použitím celkové RNA nebo mRNA frakce připravené ze shora popsaných buněk a tkání.

Specificky, DNA kódující částečný peptid receptorového proteinu podle předloženého vynálezu může znamenat jakoukoliv DNA, pokud má například DNA mající aminokyselinovou sekvenci představovanou sekvencí sekv. id. č. 2 nebo sekv.

• ♦♦

9· ♦ • · ««· ··

• 9 ·· ·· id. č. 6 nebo má nukleotidovou sekvenci hybridizovatelnou na nukleotidovou sekvenci představovanou sekvencí sekv. id. č. 2 nebo sekv. id. č. 6 za vysoce selektivních podmínek a kóduje protein, který má v podstatě stejné aktivity (tj. aktivitu vázající ligand, signální transdukční aktivitu a podobně), jako jsou aktivity receptorového proteinu podle předloženého vynálezu.

Příklady DNA, která je hybridizovatelná s nukleotidovou sekvencí představovanou sekvencí sekv. id. č. 2 nebo sekv. id. č. 6 zahrnují DNA, která má alespoň asi 70% homologii, s výhodou alespoň asi 80% homologii, výhodněji alespoň asi 90% homologii, nejvýhodněji alespoň asi 95% homologii s aminokyselinovou sekvencí představovanou sekvencí sekv. id. č. 2 nebo sekv. id. č. 6.

Hybridizace se může provádět obecně známými způsoby nebo jejich modifikacemi, například podle způsobu popsaného v Molecular Cloning, druhé vydání, J. Sambrook a spol., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. Také se může použít komerčně dostupná knihovna a to podle pokynů připojeného protokolu výrobce. Hybridizace se může provádět s výhodou za vysoce selektivních podmínek.

Vysoceselektivní podmínky používané podle vynálezu jsou například podmínky spočívající v koncentraci sodíku asi 19 mM až asi 40 mM, s výhodou asi 19 mM až asi 20 mM a teplotě od asi 50 °C do asi 70 °C, s výhodou od asi 60 °C do asi 65 °C. Konkrétně - nejvýhodnější hybridizační podmínky spočívají v koncentraci sodíku asi 19 mM a teplotě asi 65 °C.

Konkrétněji, pro DNA kódující protein, který má aminokyselinovou sekvenci representovanou sekvencí sekv. id. č. 1, se může použít DNA, která má nukleotidovou sekvenci představovanou sekvencí sekv. id. č. 2, a DNA, která má nukleotidovou sekvenci představovanou sekvencí sekv. id. č. 6, se může použít pro DNA kódující protein s aminokyselinovou sekvencí představovanou sekvencí sekv. id. č. 5.

• ·

Polynukleotid, který obsahuje část nukleotidové sekvence DNA kódující receptorový protein podle předloženého vynálezu nebo část nukleotidové sekvence doplňkové k této DNA, je považován za polynukleotid, který zahrnuje nejen DNA kódující částečný peptid podle předloženého vynálezu popsaný níže, ale také RNA.

Podle předloženého vynálezu antimediátorové polynukleotidy (nukleové kyseliny), které mohou inhibovat replikaci nebo expresi genu receptorového proteinu podle předloženého vynálezu, mohou být navrženy a syntetizovány na základě informace o klonované nebo stanovené nukleotidové sekvenci DNA kódující receptorový protein. Takové polynukleotidy (nukleové kyseliny) se mohou hybridizovat s RNA genu proteinu a inhibovat RNA syntézu nebo funkci RNA nebo mohou regulovat/kontrQLoyat.expresi_genu-receptorového-proteinu-prostřednictvím-interakce-s-RNA-sami asociovanými s receptorovým proteinem. Polynukleotidy doplňkové ke specifikovaným sekvencím RNA asociované s receptorovým proteinem a polynukleotidy, které mohou specificky hybridizovat s RNA asociovanou s receptorovým proteinem, jsou užitečné pro regulování a kontrolování exprese genu receptorového proteinu in vivo a in vitro. Tyto polynukleotidy jsou také užitečné pro léčení a diagnostikování onemocnění. Pojem odpovídá je použit při odkazu na homologní nebo doplňkový u specifické sekvence nukleotidů, nukleotidových sekvencí nebo nukleových kyselin včetně genu. Jako u nukleotidů, nukleotidových sekvencí nebo nukleových kyselin a peptidů (proteinů) pojem odpovídající obvykle označuje aminokyseliny peptidu (proteinu), o kterých se uvádí, že jsou odvozeny od sekvence nukleotidů (nukleových kyselin) nebo jejich doplňků. Jako výhodné cílové oblasti mohou být vybrány 5' konec vlásenkové smyčky, 5' konec opakování o 6 párech nukleotidů, 5' konec nepřekládané oblasti, iniciační kodón polypeptidové translace, oblast kódující protein, iniciační kodón ORF translace, 3' nepřekládaná oblast, 3' konec palindromové oblasti a 3' konec vlásenkové smyčky genu receptorového proteinu, i když cílem v genech receptorového proteinu může být jakákoliv oblast.

Vzájemný vztah mezi cílovými nukleovými kyselinami a polynukleotidy doplňkovými k alespoň části cíle, specificky vzájemný vztah mezi cílem a polynukleotidy • · · · • * • >

hydridizovatelnými na cíl, se označuje jako antimediátorový. Antimediátoravé polynukleotidy mohou znamenat polydeoxynukleotidy obsahující 2-deoxy-D-ribosu, polydeoxynukleotidy obsahující D-ribosu, jakékoliv jiné typy polynukleotidů, které jsou N-glykosidy purinové nebo pyrimidinové báze, nebo jiné polymery obsahující nenukleotidové základní skelety (např. proteinové nukleové kyseliny a komerčně dostupné specifické polymery nukleových kyselin se syntetickými sekvencemi) nebo jiné polymery obsahující nestandardní vazby (za předpokladu, že polymery obsahují nukleotidy s takovou konfigurací, která umožňuje párování nukleotidů nebo stohování nukleotidů, jak se nalézá v DNA a RNA). Antimediátoravé polynukleotidy mohou znamenat dvojvláknovou DNA, jednovláknovou DNA, jednovláknovou RNA nebo hybrid DNA:RNA, a dále zahrnují nemodifikované polynukleotidy (nebo nemodifikované oligonukleotidy),_ty,_kterémají-obecněznámé'typymodifikací,napříkladty,'které^_mají značky známé v oblasti techniky, ty, které mají ukončení (čepičky), methylované polynukleotidy, ty, které mají substituci jednoho nebo více přirozeně se vyskytujících nukleotidů jejich analogem, ty, které mají intramolekulámí modifikace nukleotidů, jako jsou ty, které mají nenabité vazby (např. methylfosfonáty, fosfotriestery, fosforamidáty, karbamáty atd.), a ty, které mají nabité vazby nebo vazby obsahující atom síry (např. fosforthioáty, fosfordithioáty atd.), ty, které mají skupiny postranních řetězců, jako jsou proteiny (včetně nukleas, inhibitorů nukleas, toxinů, protilátek, signálních peptidů, poly-L-lysinu atd.) a sacharidy (např. monosacharidy atd.), ty, které jsou s interkalátory (např. akridin, psorálen atd.), ty, které obsahují chelatační činidla (např. kovy, radioaktivní kovy, bor, oxidační kovy atd.), ty, které obsahují alkylační činidla, a ty, které mají modifikované vazby (např. α-anomemí nukleové kyseliny atd.). Pojmy nukleosid, nukleotid a nukleová kyselina jsou zde používány pro označení částí, které obsahují nejen purinové a pyrimidinové báze, ale také jiné heterocyklické báze, které mohou být modifikovány. Mezi tyto modifikace patří methylované puriny a pyrimidiny, acylované puriny a pyrimidiny a další heterocyklické kruhy. Mezi modifikované nukleosidy nebo nukleotidy patří také modifikace na cukerné části, například ty, v nichž jedna nebo více hydroxylových skupin může být nahrazeno atomem halogenu nebo alifatickými skupinami nebo které mohou být převedeny na odpovídající funkční skupiny, jako jsou ethery, aminy nebo podobné.

• ·

• · · · · ♦ ♦ · · • · · • · · · ·

Antimediátorový polynukleotid (nukleová kyselina) podle předloženého vynálezu znamená RNA, DNA nebo modifikovanou nukleovou kyselinu (RNA, DNA). Specifickými příklady modifikované nukleové kyseliny jsou, ale bez omezení na ně, sulfurované a thiofosfátové deriváty nukleových kyselin a ty, které jsou odolné vůči degradaci polynukleosidových nebo oligonukleosidových amidů. Antimediátorové nukleové kyseliny podle předloženého vynálezu mohou být modifikovány s výhodou na základě následujícího návrhu, to znamená zvýšením intracelulámí stability antimediátorové nukleové kyseliny, zvýšením buněčné propustnosti antimediátorové nukleové kyseliny, zvýšením afinity nukleové kyseliny na cílové negativní vlákno na vyšší úroveň nebo minimalizováním toxicity, jestliže nějaká existuje, antimediátorové nukleové kyseliny.

Mnohé takové modifikace jsou známy v oblasti techniky, jak je popsáno v J. Kawakami a spol.: Pharm. Těch. Japan 1992, 8, 247; Pharm. Těch. Japan 1992, 8, 395; S. T. Crooke a spol. (red.): Antisense Research and Applications, CRC Press, 1993 atd.

Antimediátorové nukleová kyselina podle předloženého vynálezu může obsahovat změněné nebo modifikované cukry, nukleotidy nebo vazby. Antimediátorové nukleová kyselina se může získávat také ve specializované formě jako liposomy, mikrokuličky nebo se může aplikovat na genovou terapii nebo se může získávat v kombinaci s napojenými částicemi. Mezi tyto napojené částice patří polykationty, jako je polylysin, které působí jako neutralizátory náboje fosfátového základního skeletu, nebo hydrofobní částice, jako jsou lipidy (např. fosfolipidy, cholesteroly atd.), které zvyšují interakci s buněčnými membránami nebo zvyšují příjem nukleové kyseliny. Výhodnými příklady lipidů, které se napojují, jsou cholesteroly nebo jejich deriváty (např. cholesteryl-chlormravenčan, kyselina cholová atd.). Tyto částice mohou být napojeny na 3' nebo 5' konec nukleové kyseliny a mohou být napojeny také prostřednictvím nukleotidu, cukru nebo intramolekulámí nukleosidové vazby. Dalšími částicemi mohou být konec uzavírající částice, které jsou specificky umístěny na 3' nebo 5' koncích nukleové kyseliny, aby se zabránilo degradaci nukleasou, jako je exo• ·

. 31 nukleasa, RNA-asa atd. Mezi tyto konec uzavírající skupiny patří, ale bez omezení na ně, chránící skupiny hydroxylové skupiny známé v oblasti techniky, mezi které patří glykoly, jako je polyethylenglykol, tetraethylenglykol a podobné.

Inhibiční aktivita antimediátorové nukleové kyseliny může být zkoumána použitím transfomantu podle předloženého vynálezu, genového expresního systému podle předloženého vynálezu in vitro a in vivo nebo translačního systému receptorového proteinu podle předloženého vynálezu in vitro a in vivo. Nukleová kyselina může být do buněk aplifikována rozmanitými obecně známými způsoby.

DNA kódující částečný peptid podle předloženého vynálezu může znamenat jakóukoliv_DNA,-pokud-obsahuje-Rukleotidovou-sekvenci~-kódující-shora~popsaný částečný peptid podle předloženého vynálezu, DNA může znamenat také jakoukoliv genomovou DNA, genomovou DNA knihovnu, cDNA pocházející ze shora popsaných buněk a tkání, cDNA knihovnu pocházející ze shora popsaných buněk a tkání a syntetickou DNA. Vektor, který se používá pro knihovnu, může znamenat jakýkoliv vektor z bakteriofágu, plasmidu, kosmidu a fagemidu. DNA může být přímo amplifikována reversní transkriptasovou polymerasovou řetězcovou reakcí (zde dále jednoduše označovanou jako RT-PCR) použitím mRNA frakce připravené ze shora popsaných buněk a tkání.

Mezi specifické příklady DNA kódující částečný peptid podle předloženého vynálezu patří 1) DNA, která má část nukleotidové sekvence DNA obsahující nukleotidovou sekvenci představovanou sekvencí sekv. id. č. 2 nebo sekv. id. č. 6, a 2) DNA, která má nukleotidovou sekvenci hybridizovatelnou na nukleotidovou sekvenci představovanou sekvencí sekv. id. č. 2 nebo sekv. id. č. 6 za vysoce selektivních podmínek a obsahující část nukleotidové sekvence DNA kódující receptorový protein, který má v podstatě stejné aktivity (tj. aktivitu vázající ligand, signální transdukční aktivitu a podobně), jako jsou aktivity receptorového proteinu podle předloženého vynálezu.

• ·

Příklady DNA, která je hybridizovatelná s nukleotidovou sekvencí představovanou sekvencí sekv. id. č. 2 nebo sekv. id. č. 6, zahrnují DNA obsahující nukleotidovou sekvenci, která má alespoň asi 70% homologii, s výhodou alespoň asi 80% homologii, výhodněji alespoň asi 90% homologii, nejvýhodněji alespoň asi 95% homologii s nukleotidovou sekvencí představovanou sekvencí sekv. id. č. 2 nebo sekv. id. č. 6.

Pro klonování DNA, která kompletně kóduje receptorový protein nebo jeho částečný peptid podle předloženého vynálezu (zde dále někdy označovaný jako receptorový protein podle předloženého vynálezu) se DNA může buď amplifikovat PCR použitím syntetických DNA primerů obsahujících část nukleotidové sekvence receptoravého -proteinu—podle-předloženého—vynálezu - nebo—DNA—vložená^do příslušného vektoru se může vybrat hybridizací s označeným DNA fragmentem nebo syntetickou DNA, která kóduje část nebo celou oblast receptorového proteinu podle předloženého vynálezu. Hybridizace se může provádět například podle způsobu popsaného v Molecular Cloning, druhé vydání, J. Sambrook a spol., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. Hybridizace se může provádět také použitím komerčně dostupné knihovny v souladu s protokolem popsaným v pňpojených pokynech.

Konverze nukleotidové sekvence DNA se může provádět podle obecně známých způsobů, jako je Guppedův duplexní způsob nebo Kunkeleho způsob nebo jeho modifikace, použitím obecně známých sestav dostupných jako Mutan™-G nebo Mutan™-K (obě vyráběné firmou Takara Shuzo Co., Ltd., obchodní značka).

Klonovaná DNA kódující receptorový protein podle předloženého vynálezu se může používat jako taková, což závisí na účelu, nebo, jestliže je to žádoucí, po rozštěpení restrikčním enzymem nebo po přidání linkeru. DNA může obsahovat ATG jako iniciační kodón translace na jejím 5' konci a TAA, TGA nebo TAG jako terminační kodón translace na jejím 3' konci. Tyto iniciační a terminační kodóny translace se mohou přidávat použitím příslušného syntetického DNA adapteru.

Expresní vektor receptorového proteinu podle předloženého vynálezu se může vyrábět například a) vyštěpením žádaného DNA fragmentu z DNA kódující receptorový protein podle předloženého vynálezu, a b) následující ligací DNA fragmentu s příslušným expresním vektorem po směru vlákna promotoru ve vektoru.

Mezi příklady vektoru, který se může použít, patří plasmidy odvozené od E. coli (např. pBR322, pBR325, pUC12 a pUC13), plasmidy odvozené od Bacillus subtilis (např. pUB110, pTP5 a pC194), plasmidy odvozené od kvasinek (např. pSH19 a pSH15), bakteriofágy, jako je λ fág atd., živočišné viry, jako je retrovirus, virus vakcinie, baculovirus atd., a také pA1-11, pXT1, pRc/CMV, pRc/RSV, pcDNAI/Neo atd.

Promotor používaný v předloženém vynálezu může znamenat jakýkoliv promotor, jestliže se dobře shoduje s hostitelem, který se používá pro genovou expresi. V případě, že se jako hostitel používají živočišné buňky, mezi příklady promotoru patří SRa promotor, SV40 promotor, LÍR promotor, CMV promotor, HSV-TK promotor atd. Z nich se s výhodou používá promotor SRa.

Jestliže se jako hostitel používá bakterie rodu Escherichia, mezi výhodné příklady promotoru patří trp promotor, lac promotor, recA promotor, XPL promotor, Ipp promotor atd. V případě, že se jako hostitel používá bakterie rodu Bacillus, výhodnými příklady promotorů jsou SPO1 promotor, SPO2 promotor a penP promotor. V případě, že se jako hostitel používají kvasinky, výhodnými příklady promotorů jsou PHO5 promotor, PGK promotor, GAP promotor a ADH promotor. V případě, že se jako hostitel používají hmyzí buňky, mezi výhodné příklady promotoru patří polyhedrinový promotor a p10 promotor.

Vedle předcházejících příkladů může expresní vektor dále popřípadě obsahovat zesilovač, nastavující signál, póly A adiční signál, selekční markér, počátek replikace SV40 (zde někdy zkráceně označovaný jako SV40ori) atd. Mezi příklady selekčního markéru patří dihydrofolát-reduktasový (zde dále někdy zkracovaná jako

dhfr) gen [rezistence na methotrexát (MTX)j, gen rezistence na ampiciiin (zde dále někdy zkráceně označovaný jako Amp^r), gen rezistence na neomycin (zde dále někdy zkráceně označovaný jako neo, G418 rezistence) atd. Podrobně, jestliže se používá buňka CHO (dhfr·) společně s dhfr genem jako selekčním markérem, může se selekce provádět také použitím media, které neobsahuje thymidin.

Jestliže je to nutné a žádoucí, signální sekvence, která se shoduje s hostitelem, se podá na N-konec receptorového proteinu podle předloženého vynálezu. Příklady signální sekvence, která se může použít, jsou Pho A signální sekvence, OmpA signální sekvence atd. v případě, že se jako hostitel použije bakterie z rodu Escherichia, α-amylasová signální sekvence, subtilisinová signální sekvence atd. v .případě, jestliže se-jako-hostitel-použije-bakterie-z-rodu-Bacillus,^—MFa~signální sekvence, SUC2 signální sekvence atd. v případě, jestliže se jako hostitel používají kvasinky, a insulinová signální sekvence, α-interferonová signální sekvence, signální sekvence molekuly protilátky atd., jestliže se jako hostitel používají živočišné buňky.

Transformanty se mohou vyrobit použitím vektoru, který obsahuje DNA kódující takto zkonstruovaný receptorový protein podle předloženého vynálezu.

Příklady hostitelů, kteří se mohou použít, jsou bakterie patřící do rodu Escherichia, bakterie patřící do rodu Bacillus, kvasinky, hmyzí buňky, hmyz a živočišné buňky atd.

Mezi specifické příklady bakterií, které patří do rodu Escherichia, patří Escherichia coli K12 DH1 (Proč. Nati. Acad. Sci. USA 1968, 60, 160.), JM103 (Nucleic Adds Research 1981, 9, 309.), JA221 (Jounal of Molecular Biology 1978, 120, 517.), HB101 (Jounal of Molecular Biology 1969, 41, 459.), C600 (Genetics 1954, 39, 440.) atd.

Mezi příklady bakterií, které patří do rodu Bacillus, patří Bacillus subtilis MI114 (Gene 1983, 24,255.), 207-21 (Joumal of Biochemistry 1984, 95,87.) atd.

Mezi příklady kvasinek patří Saccharomyces cerevisiae AH22, AH22R', NA87-11A, DKD-5D a 20B-12, Schizosaccharomyces pombe NCYC1913 a NCYC2036, Pichia pastoris atd.

Mezi příklady hmyzích buněk patří pro virus AcNPV buňka Spodoptera fnjgiperda (Sf buňka), buňka MG1 pocházející ze střední části střeva Trichoplusia ni, buňka High Five™ pocházející z vajíčka Trichoplusia ni, buňky pocházející z Mamestra brassicae, buňky pocházející z Estigmena acrea atd., a pro virus BmNPV buňka Bombyx moři N (BmM buňka) atd. Mezi příklady buněk Sf, které se mohou používat, patří buňka Sf9 (ATCC CRL1711) a buňka Sf21 (obě buňky jsou popsány ve Vaughn J. L. a spol.: In Vivo 1977, 13, 213 až 217.

Jako hmyz se může použít například larva Bombyx moři (Maeda a spol.: Nátuře 1985, 315, 592.).

Mezi příklady živočišných buněk patří opičí buňka COS-7, Věro, buňka čínského křečka CHO (zde dále označovaná jako buňka CHO), buňka čínského křečka CHO deficitní na gen dhfr (zde dále označovaná jako buňka CHO(dhfr)), myší L buňka, myší AtT-20, myší myelomová buňka, krysí GH 3, lidská FL buňka atd.

Bakterie patřící do rodu Escherichia může být transformována například podle způsobu popsaného v Proč. Natí. Acad. Sci. USA 1972, 69, 2110 nebo v Gene 1982, 17,107.

Bakterie patřící do rodu Bacillus může být transformována například podle způsobu popsaného v Molecularand Generál Genetics 1979,168,111.

Kvasinka může být transformována například podle způsobu popsaného v Methods in Enzymology 1991, 194, 182 až 187 nebo v Přec. Natí. Acad. Sci. USA 1978, 75,1929.

'·«

r->

Hmyzí buňky nebo hmyz mohou být transformovány například podle způsobu popsaného v Bio/Technology 1988, 6, 47 až 55.

Živočišné buňky mohou být trasformovány například podle způsobu popsaného v Saibo Kogaku (Cell Enegineering), zvláštní vydání 8, Shin Saibo Kogaku Jikken Protocol (New Cell Engineeríng Experímental Protocol) 1995, 262 až 267, publikováno Shujunsha, nebo ve Virology 1973, 52,456.

Může se tedy získat transformant transformovaný expresním vektorem obsahujícím DNA kódující receptorový protein nebo částečný peptid podle předloženého vynálezu.

Jestliže hostitelem je bakterie patřící do rodu Escherichia nebo rodu Bacillus, transformant se může příslušně inkubovat v kapalném mediu, které obsahuje materiály potřebné pro růst transformantu, jako jsou zdroje uhlíku, zdroje dusíku, anorganické materiály atd. Mezi příklady zdrojů uhlíku patří glukosa, dextrin, rozpustný škrob, sacharosa atd. Mezi příklady zdrojů dusíku patří anorganické nebo organické materiály, jako jsou amonné soli, dusičnanové soli, kukuřičný extrakt, pepton, kasein, masový extrakt, sojový koláč, bramborový extrakt atd. Příklady anorganických materiálů jsou chlorid vápenatý, dihydrogenfosforečnan sodný, chlorid hořečnatý atd. K mediu se mohou přidat dále také kvasinky, vitaminy, faktory regulující růst atd. Hodnota pH media se s výhodou upraví na asi 5 až asi 8.

Výhodným příkladem media pro inkubaci bakterie patřící do rodu Escherichia je medium M9 doplněné o glukosu a Casaminokyseliny (Millen Journal of Experíments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, str. 431 až 433, New York 1972.). Jestliže je to nutné a žádoucí, může se k mediu přidat chemikálie, jako je 3B-indolylakrylová kyselina, čímž se účinně aktivuje promotor.

ra

Jestliže se jako hostitel používá bakterie, která patří do rodu Escherichia, transformant se obvykle kultivuje při asi 15 °C až asi 43 °C po dobu asi 3 hodin až asi 24 hodin. Jestliže je to nutné a žádoucí, kultura se může provzdušňovat nebo míchat.

Jestliže se jako hostitel používá bakterie, která patří do rodu Bacillus, transformant se kultivuje obecně při asi 30 °C až asi 40 °C po dobu asi 6 hodin až asi 24 hodin. Jestliže je to nutné a žádoucí, kultura se může provzdušňovat nebo míchat.

Jestliže se jako hostitel používají kvasinky, transformant se kultivuje například v Burkholderově minimálním mediu (Bostian K. L. a spol.: Proč. Nati. Acad. Sci. USA 1980, 77, 4505.) nebo v SD mediu doplněném 0,5 % kasamino-kyselin (Bitter G. A. a _spoL :_Proc.. Nati.. Acad.Sci.~USA -1984₁87₇-533Q.).-HodnotapHmediasesvýhodou upraví na asi 5 až asi 8. Obecně se transformant kultivuje při asi 20 °C až asi 35 °C po dobu asi 24 hodin až asi 72 hodin. Jestliže je to nutné a žádoucí, kultura se může provzdušňovat nebo míchat.

Jestliže se jako hostitel používají hmyzí buňky nebo hmyz, transformant se kultivuje například v Graceho hmyzím mediu (Grace T. C. C.: Nátuře, 1962, 195, 788.), ke kterému se přidá příslušná přísada, například se přidá imobilizované 10% hovězí sérum. S výhodou se pH media upraví na asi 6,2 až asi 6,4. Normálně se transformant kultivuje při asi 27 °C po dobu asi 3 dnů až asi 5 dnů, a, jestliže je to nutné a žádoucí, kultura se může provzdušňovat nebo míchat.

Jestliže se jako hostitel používají zvířecí buňky, transformant se kultivuje například v MEM mediu obsahujícím asi 5 % až asi 20 % plodového hovězího sera (Science 1952, 122, 501,), DMEM mediu (Virology 1959, 8, 396.), RPMI 1640 mediu (The Joumal of the Američan Medical Assodation 1967, 199, 519.) 199 mediu (Proceeding ofthe Society forthe Biological Medicine 1950, 73,1.) atd. S výhodou se pH media upraví na asi 6 až asi 8. Transformant se obvykle kultivuje při asi 30 °C až asi 40 °C po dobu asi 15 hodin až asi 60 hodin a, jestliže je to nutné a žádoucí, kultura se může provzdušňovat nebo míchat.

·· ······ _ • ♦ · · ·· • · ··· ·· • · · ♦ ·· • · · · ·Μ «· ····· *

Jak bylo shora popsáno, receptorový protein nebo jeho částečný peptid podle předloženého vynálezu se může vyrábět v buněčné membráně transformantu.

Receptorový protein nebo částečný peptid podle předloženého vynálezu se může ze shora popsané kultury oddělit a vyčistit podle následujících postupů.

Jestliže se receptorový protein nebo částečný peptid podle předloženého vynálezu extrahuje z kultury nebo buněk po kultivaci, transformant nebo buňka se isoluje obecně známým způsobem a suspenduje se v příslušném pufru. Transformant nebo buňka se pak rozbije obecně známými způsoby, jako je působení ultrazvuku, zpracování s lysozymem a/nebo opakujícím se cyklem zmrazení/roztátí, následuje .pdstřeďQvání,-filtrace .atd.-Může se -tedy-získat surovýextrakt receptorovéhoproteinu nebo jeho částečného peptidu podle předloženého vynálezu. Pufr, který se používá pro tyto postupy, může obsahovat modifikátor proteinu, jako je močovina nebo hydrochlorid quanidinu, nebo povrchově aktivní činidlo, jako je Triton X-100™ atd. Jestliže je receptorový protein nebo jeho částečný peptid podle předloženého vynálezu sekretován v kultivačním živném prostředí, supematant se po ukončení kultivace může oddělit od transfomantu nebo buněk, takže se obecně známými způsoby isoluje supematant.

Supematant nebo receptorový protein nebo jeho částečný peptid podle předloženého vynálezu obsažený v takto získaném extraktu se může vyčistit příslušným kombinováním obecně známých způsobů dělení a čištění. Mezi tyto obecně známé způsoby dělení a čištění patří způsob využívající rozdíl v rozpustnosti, jako je vysolování, srážení rozpouštědlem atd., způsob využívající hlavně rozdíly v molekulové hmotnosti, jako je dialýza, ultrafiltrace, gelová filtrace, elektroforéza na SDS-polyakrylamidovém gelu atd., způsob využívající rozdíl v elektrickém náboji, jako je chromatografie na ionexu atd., způsob využívající rozdíl ve specifické afinitě, jako je afinitní chromatografie atd., způsob využívající rozdíl v hydrofóbnosti, jako je vysokoúčinná kapalinová chromatografie na obracených fázích atd., způsob využívající rozdíl v isoelektrickém bodu, jako isoélektrofokusační elektroforéza, a podobně.

♦ · ·

Jestliže takto získaný receptorový protein nebo jeho částečný peptid podle předloženého vynálezu existuje ve volné formě, může být převeden na sůl obecně známými způsoby nebo jejich modifikacemi. Na druhé straně, jestliže se receptorový protein získává ve formě soli, může být převeden na volnou formu nebo na formu jiné soli obecně známými způsoby nebo jejich modifikacemi.

Receptorový protein nebo jeho částečný peptid podle předloženého vynálezu vyrobený rekombinantem se může zpracovat, před nebo po jeho čištění, s příslušným enzymem modifikujícím protein tak, že protein nebo částečný peptid může být příslušně modifikován, aby se odstranil polypeptid. Mezi příklady enzymů modifikujících protein patří trypsin, chymotrypsin, arginyl-endopeptidasa, protein-kinasa, glykosidasaa.podo.bné._________________________—--Aktivita takto vyrobeného receptorového proteinu podle předloženého vynálezu nebo jeho solí, částečného peptidu nebo jeho esterů, amidů nebo solí podle předloženého vynálezu může být stanovena testem navázání na značený ligand a enzymovým imunotestem použitím specifické protilátky.

Protilátky na receptorový protein nebo jeho soli, částečný peptid nebo jeho estery, amidy nebo soli podle předloženého vynálezu (zde dále někdy souhrnně označovaný jako receptorový protein nebo podobné sloučeniny podle předloženého vynálezu) nebo ligandový peptid podle předloženého vynálezu (který bude popsán později) mohou znamenat jakékoliv polyklonální a monoklonální protilátky, pokud jsou schopny rozpoznávat receptorový protein nebo podobné sloučeniny podle předloženého vynálezu nebo ligandový peptid podle předloženého vynálezu.

Protilátka na receptorový protein nebo podobné sloučeniny podle předloženého vynálezu nebo na ligandový peptid podle předloženého vynálezu se může vyrábět obecně známými způsoby výroby protilátek nebo protiser použitím recep torového proteinu nebo podobné sloučeniny podle předloženého vynálezu nebo

·· π

ú 40

Příprava monoklonální protilátky

a) Příprava buněk produkujících monoklonální protilátku

Receptorový protein nebo podobné sloučeniny podle předloženého vynálezu nebo ligandový peptid podle předloženého vynálezu se podává savci, buď samostatně nebo spolu s nosiči nebo ředidly, do místa, které může produkovat protilátku po jejich podání. Aby se zvýšila produktivita protilátky po podání, může se podávat úplné Freundovo adjuvans nebo neúplné Freundovo adjuvans. Podávání se provádí obvykle jednou každé 2 týdny až každých 6 týdnů a celkem přibližně dvakrát až desetkrát. Mezi savce, kteří jsou používáni, patří opice, králík, pes, morče, myš, krysa, i____________ov^,_koza.a podobnLSJím,-že_výhodnýmijsou.myš_a.kcysa____________________

Při přípravě buněk produkujících monoklonální protilátky se živočich, v němž je zaznamenán protilátkový titr, vybere z teplokrevných živočichů imunizovaných antigeny, např. myší, potom se po dvou až pěti dnech po konečné imunizaci odebere slezina nebo lymfatická žláza a buňky produkující protilátku, které jsou v nich obsaženy, se napojí na myelomové buňky, takže se získají hybridomy produkující monoklonální protilátku. Může se stanovit protilátkový titr v antiseru, například reakcí značeného receptorového proteinu nebo podobné sloučeniny podle předloženého vynálezu nebo ligandového peptidu podle předloženého vynálezu, který bude popsán později, s antiserem s následujícím měřením vazebné aktivity značícího činidla navázaného na protilátku. Napojení se může provést například podle způsobu popsaného Koehlerem a Milsteinem (Nátuře 1975, 256, 495.). Příklady urychlovačů napojení jsou polyethylenglykol (PEG), Sendai virus atd. S výhodou se používá PEG.

Mezi příklady myelomových buněk patří NS-1, P3U1 a SP2/0 s tím, že P3U1 jsou výhodné. Poměr počtu buněk produkujících protilátku (slezinných buněk) k počtu myelomových buněk, které se používají, je s výhodou asi 1:1 až asi 20:1. PEG (s výhodou PEG 1000 až PEG 6000) se přidává v koncentraci asi 10 % až asi 80 %.

• ·

Η*

Napojení buněk se může účinně provádět inkubováním obou buněk pň asi 20 °C až ..j¹ asi 40 °C, s výhodou asi 30 °C až asi 37 °C po dobu asi 1 minuty až asi 10 minut.

i Pro testování hybridomu produkujícího monoklonální protilátku se mohou používat různé způsoby. Mezi příklady takových způsobů patří způsob, který zahrnuje pňdání supematantu hybridomu k pevné fázi (např. mikrodescé) s adsorbovaným receptorovým proteinem nebo podobnou sloučeninou podle předloženého vynálezu nebo ligandovým peptidem podle předloženého vynálezu jako antigenem přímo nebo společné s nosičem, pňdání anti-imunoglobulinové protilátky (jestliže se používají pro napojení buněk myší buňky, používá se antimyší imunoglobulinová protilátka) značené radioaktivní látkou nebo enzymem nebo Proteinem A a detegování monoklo.__nálnLprQtilátky_navázané-na-pevnou-fázi,-a-způsob,-který-zahmuje’pňdání-supernatantu hybridomu k pevné fázi s adsorbovanou anti-imunoglobulinovou protilátkou nebo Proteinem A, pňdání receptorového proteinu nebo podobné sloučeniny podle předloženého vynálezu nebo ligandového peptidu podle předloženého vynálezu značeného radioaktivní látkou nebo enzymem a detegování monoklonální protilátky nacházející se v pevné fázi.

Monoklonální protilátka může být vybrána podle obecně známých způsobů nebo jejich modifikací. Obecně se výběr může uskutečnit v mediu pro živočišné buňky doplněném HAT (hypoxanthin, aminopterin a thymidin). Může se použít jakékoliv selekční a růstové medium, pokud v něm hybridom může růst. Pro selekční a růstové medium se může použít například RPMI 1640 medium obsahující 1 % až 20 %, s výhodou 10 % až 20 % plodového hovězího sera, GIT medium (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) obsahující 1 % až 10 % plodového hovězího sera, medium bez sera pro kultivaci hybridomu (SFM-101, Nissui Seiyaku Co., Ltd.) a podobně. Kultivace se provádí obecně pň 20 °C až 40 °C, s výhodou pň 37 °C, po dobu asi 5 dnů až asi 3 týdnů, s výhodou 1 až 2 týdnů, normálně v 6 % CO₂. Protilátkový titr supematantu kultury hybridomu se může stanovit jako pň shora popsaném stanovení protilátkového titru v antiseru.

tri ϊ

b) Čištění monoklonální protilátky

Dělení a čištění monoklonální protilátky se může provádět podle stejného způsobu, jaký byl aplikován na konvenční dělení a čištění polyklonálních protilátek, jako je dělení a čištění imunoglobulinů (například vysolováním, vysrážení alkoholem, vysrážení při isoelektrickém bodu, elektroforéza, adsorpce a desorpce na ionexech (např. DEAE), ultraodstřeďování, gelová filtrace nebo specifický způsob čištění, který zahrnuje isolování pouze protilátky s aktivovaným adsorbentem, jako je pevná fáze vázající antigen, protein A nebo protein G a disociace vazby tak, že se získá protilátka.

PřípraYa-polyklonální-protilátky—------——---------------------------—

Polyklonální protilátka podle předloženého vynálezu se může vyrábět obecně známými způsoby nebo jejich modifikacemi. Například se vytvoří komplex imunogenu (antigen receptorového proteinu nebo podobné sloučeniny) a nosného proteinu a savec se imunizuje tímto komplexem podobným způsobem, jako je shora popsaný způsob pro výrobu monoklonální protilátky. Produkt, který obsahuje protilátku na receptorový protein nebo podobnou sloučeninu podle předloženého vynálezu nebo ligandový peptid podle předloženého vynálezu, se z imunizovaného živočicha isoluje, následuje dělení a vyčištění protilátky.

U komplexu imunogen a nosný protein pro imunizování savců, typ nosného proteinu a poměr míchání nosiče k haptenu mohou znamenat jakýkoliv typ a jakýkoliv poměr, pokud protilátka se účinně produkuje na hapten imunizovaný zesíťováním na nosič. Například hovězí sérový albumin, hovězí thyroglobulin nebo keyhole limpet hemocyanin (KLC) se naváže na hapten s hmotnostním poměrem nosič k haptenu přibližně 0,1 až 20, s výhodou 1 až 5.

Pro navázání nosiče na hapten se mohou používat rozmanitá kondenzační činidla. Pro navázání se používají glutaraldehyd, karbodiimid, maleinimidem aktivo9 ·

váný ester a aktivovaná esterová reakční činidla obsahující thiolovou skupinu nebo dithiopyridylovou skupinu.

Kondenzační produkty se podávají teplokrevným živočichům buď samostatně nebo společně s nosiči či ředidly do místa, které může po podání produkovat protilátku. Aby se zesílila produktivita protilátky po podání, může se podávat úplné Freundovo adjuvans nebo neúplné Freundovo adjuvans. Podávání se provádí obvykle jednou každé 2 týdny až každých 6 týdnů a celkem třikrát až desetkrát.

Polyklonální protilátka se může isolovat z krve, ascitů atd., s výhodou z krve savců imunizovaných shora popsaným způsobem.

Titr polyklonální protilátky v antiseru se může stanovit stejným postupem jako shora popsaný postup u titru protilátky v seru. Polyklonální protilátka se může oddělit a vyčistit podle stejného způsobu dělení a čistění imunoglobulinu, jaký byl použit pro shora popsanou monoklonální protilátku.

Receptorový protein podle předloženého vynálezu nebo jeho soli, částečný peptid nebo jeho estery, amidy nebo jejich soli a DNA, která je kóduje, se mohou používat: 1) pro stanovení ligandu (agonisty) na receptorový protein podle předloženého vynálezu nebo jeho soli, 2) jako činidlo pro předcházení a/nebo léčení onemocnění souvisejícího s dysfunkcí receptorového proteinu podle předloženého vynálezu, 3) jako genetické diagnostické činidlo, 4) pro kvantitativní stanovení ligandu na receptorový protein podle předloženého vynálezu, 5) pro testování sloučeniny (agonisty, antagonisty atd.), která mění vlastnost vazby mezi receptorovým proteinem podle předloženého vynálezu a ligandem, 6) jako činidlo pro předcházení a/nebo léčení různých onemocnění, které obsahuje sloučeninu (agonistu, antagonistu atd.), která mění vlastnosti vazby mezi receptorovým proteinem podle předloženého vynálezu a ligandem, 7) pro kvantitativní hodnocení receptorového proteinu nebo podobné sloučeniny podle předloženého vynálezu, 8) pro neutralizování protilátek na receptorový protein nebo podobnou sloučeninu podle předloženého vynálezu a 9) pro přípravu živočicha, kterým není člověk, který nese DNA kódující receptorový protein nebo podobnou sloučeninu podle předloženého vynálezu.

Podrobně, sloučenina (např. agonista, antagonista atd.), která mění vazebné vlastnosti mezi ligandem a receptorovým proteinem podle předloženého vynálezu specifickým pro člověka nebo jiné savce, může být analyzována použitím testovacího systému navázání ligand-receptor, který je zde popsán později, jeho aplikováním na expresní systém rekombinantního receptorového proteinu podle předloženého vynálezu. Agonista nebo antagonista se může použít jako profýlaktické/terapeutické činidlo pro různá onemocnění, která budou popsána později.

______Dále_jsou_zde._specificky-popsány-společně-s-jejieh-použitím-receptorový protein nebo podobná sloučenina podle předloženého vynálezu, DNA kódující receptorový protein nebo podobnou sloučeninu podle předloženého vynálezu (zde dále někdy také souhrnně označovaná jako DNA podle předloženého vynálezu) a protilátky na receptorový protein nebo podobnou sloučeninu podle předloženého vynálezu (zde dále někdy označovaná jako protilátka podle předloženého vynálezu).

1) Stanovení ligandu (agonisty) na receptorový protein podle předloženého vynálezu

Receptorový protein nebo podobná sloučenina podle předloženého vynálezu je užitečný jako reakční činidlo pro vyhledávání a stanovení ligandu (agonisty) na receptorový protein podle předloženého vynálezu a jeho soli.

To znamená, že předložený vynález poskytuje způsob stanovení ligandu na receptorový protein podle předloženého vynálezu nebo jeho soli, vyznačující se tím, že se receptorový protein podle předloženého vynálezu nebo jeho soli uvedou do kontaktu s testovanou sloučeninou.

• ··	• v	····
·· · · • ♦·	• · • ·	• ···
• < ♦ • · · ··· ··	•: : ··	• • ···

·· v · • · • · · • · ·· ·· «··

Mezi příklady sloučenin, které se testují, patří obecně známé ligandy (např, angiotensin, bombesin, kanavinoid, cholecystokinin, glutamin, serotonin, melatonin, neuropeptid Y, opioid, puriny, vasopressin, oxytocin, PACAP, sekretin, glukagon, kalcitonin, adrenomedulin, somatostatin, GHRH, CRF, ACTH, GRP, PTH, vasoaktivní intestinální a příbuzný polypeptid (VIP), somatostatin, dopamin, motilin, amylin, bradykinin, peptid související s genem kalcitoninu (CGRP), leukotrieny, pankreastatin, prostaglandiny, thromboxan, adenosin, adrenalin, a- a β-chemokiny (např. IL-8, GROa, GROB, GROy, NAP-2, ENA-78, PF4, IP10, GCP-2, MCP-1, HC14, MCP-3, I-309, MIP-1a, MIP-1B, RANTES atd.), endothélin, enterogastrin, histamin, neurotensin, TRH, pankreatický polypeptid, galanin atd.) stejně jako další látky, například tkáňové extrakty a supematanty buněčných kultur z lidí a savců (např. myší, krys, ---sviní_r-hovězího-dobytkarovcra-opic).-Napňkladtkáňový'extraktnebo^_supémátáht buněčné kultury (specificky příslušné peptidové fragmenty KiSS-1 popsané ve Welch D. R.: J. Nati. Cancer Inst. 1996, 88, 1731 (např. peptid sestávající z 8 až 54 zbytků aminokyselin a obsahující sekvenci 47 až 54 aminokyselin z N-konce aminokyselinové sekvence představované sekvencí sekv. id. č. 10, nebo jeho amidy, estery nebo soli) se pňdá k receptorovému proteinu nebo podobné sloučenině podle předloženého vynálezu a frakcionuje se, při čemž se testují aktivity stimulující buňky, takže se nakonec získá jediný ligand.

Podrobněji, tento způsob stanovení ligandu podle předloženého vynálezu obsahuje stanovení sloučenin (např. peptidů, proteinů, nepeptidových sloučenin, syntetických sloučenin, fermentačních produktů) nebo jejich solí, které se vážou na receptorový protein nebo podobnou sloučeninu podle předloženého vynálezu, takže se získají aktivity stimulující buňky (např. aktivity, které podporují nebo potlačují uvolňování arachidonové kyseliny, uvolňování acetylcholinu, uvolňování intracelulámího Ca²⁺, produkci intracelulámího cAMP, produkci intracelulámího cGMP, produkci inositolfosfátu, změnu membránového potenciálu buňky, fosforylaci intracelulámích proteinů, aktivaci c-fos a snížení pH), použitím receptoru nebo podobných sloučenin podle předloženého vynálezu nebo použitím zkonstruovaného expresního systému rekombinantního receptorového proteinu v testu navázání receptoru.

··

Způsob stanovení ligandu podle předloženého vynálezu se vyznačuje například měřením množství testované sloučeniny navázané na receptorový protein nebo podobnou sloučeninu podle předloženého vynálezu nebo aktivity stimulující buňky, jestliže se testovaná sloučenina uvede do kontaktu s receptorem nebo podobnou sloučeninou podle předloženého vynálezu.

Podrobněji, předložený vynález poskytuje následující:

1) způsob stanovení ligandu na receptorový protein podle předloženého vynálezu a jeho soli, vyznačující se tím, že se značená testovaná sloučenina uvede do kontaktu s receptorovým proteinem nebo podobnou sloučeninou podle předlo_ženého_vynálezu a změří se množství značené testované sloučeniny navázané na---receptorový protein nebo podobnou sloučeninu;

2) způsob stanovení ligandu na receptorový protein podle předloženého vynálezu a jeho soli, vyznačující se tím, že se značená testovaná sloučenina uvede do kontaktu s buňkou obsahující receptorový protein nebo podobnou sloučeninu podle předloženého vynálezu nebo s membránovou frakcí buňky a změří se množství značené testované sloučeniny navázané na buňky nebo membránovou frakci;

3) způsob stanovení ligandu na receptorový protein podle předloženého vynálezu a jeho soli, vyznačující se tím, že se kultivuje transformant obsahující DNA kódující receptorový protein nebo podobnou sloučeninu podle předloženého vynálezu, značená testovaná sloučenina se uvede do kontaktu s receptorovým proteinem nebo podobnou sloučeninou exprimovanou na buněčné membráně uvedenou kultivací a změří se množství značené testované sloučeniny navázané na exprimovaný protein nebo podobnou sloučeninu;

4) způsob stanovení ligandu na receptorový protein podle předloženého vynálezu a jeho soli, vyznačující se tím, že se testovaná sloučenina uvede do kontaktu s buňkami obsahujícími receptorový protein nebo podobnou sloučeninou podle ·· ·· ···· ·· • · · · · · ·· · · ··· · · předloženého vynálezu a změří se receptorovým proteinem vyvolané aktivity stimulující buňky (např. aktivity, které podporují nebo potlačují uvolňování arachidonové kyseliny, uvolňování acetylcholinu, uvolňování intracelulámího Ca²⁺, produkci intracelulámího cAMP, produkci intracelulámího cGMP, produkci inositolfosfátu, změnu membránového potenciálu buňky, fosforylaci intracelulámích proteinů, aktivaci c-fos a snížení pH), a

5) způsob stanovení ligandú na receptorový protein podle předloženého vynálezu a jeho soli, vyznačující se tím, že se kultivuje transformant obsahující DNA kódující receptorový protein nebo podobnou sloučeninu podle předloženého vynálezu, značená testovaná sloučenina se uvede do kontaktu s receptorovým proteinem nebo podobnou sloučeninou exprimovanou na buněčné membráně uvedenou----- kultivací a změří se receptorovým proteinem vyvolané aktivity stimulující buňku (např. aktivity, které podporují nebo potlačují uvolňování arachidonové kyseliny, uvolňování acetylcholinu, uvolňování intracelulámího Ca²⁺, produkci intracelulámího cAMP, produkci intracelulámího cGMP, produkci inositolfosfátu, změnu membránového potenciálu buňky, fosforylaci intracelulámích proteinů, aktivaci c-fos a snížení pH).

Zvláště je výhodné provádět způsoby 1) až 3), čímž se potvrdí, že testovaná sloučenina se může vázat na receptorový protein nebo podobnou sloučeninu podle předloženého vynálezu, načež se provedou způsoby 4) a 5).

Jakýkoliv protein, který je uveden jako použitelný jako receptorový protein nebo podobná sloučenina podle předloženého vynálezu, se může použít pro způsob podle předloženého vynálezu pro stanovení ligandů. Avšak receptorový protein nebo podobná sloučenina podle předloženého vynálezu, která je hojně exprimována použitím zvířecích buněk, je příslušná podle předloženého vynálezu.

Receptorový protein nebo podobná sloučenina podle předloženého vynálezu se může vyrábět shora popsaným způsobem exprese, s výhodou exprimováním DNA kódující receptorový protein nebo podobnou sloučeninu v savčích nebo hmyzích • ·· ······ ·· • * · · · · · ♦ ·· · · ··· · buňkách. Mezi DNA fragmenty kódující žádanou část proteinu patří, ale bez omezení na ni, doplňková DNA. Mohou se použít například fragmenty genů nebo syntetická DNA. Pro zavedení DNA fragmentu kódujícího receptorový protein nebo podobnou sloučeninu podle předloženého vynálezu do hostitelské živočišné buňky a pro její účinné exprimování je výhodné vložit DNA fragment po směru vlákna polyhedrinového protomoru jaderného polyhedrosis viru (NPV), který znamená hmyzí hostitele s baculovirem, od SV-40 odvozený promotor, promotor retroviru, promotor metallothioneinu, lidský promotor tepelného šoku, promotor cytomegaloviru, SRa promotor nebo podobné. Množství a kvalita exprimovaného receptoru může být stanovena obecně známým způsobem. Například se toto stanovení může provádět způsobem popsaným v literatuře (Nambi P. a spol.: J. Biol. Chem. 1992, 267,19555 až 19559.).

Podle toho tedy subjekt, který obsahuje receptorový protein nebo podobnou sloučeninu ve způsobu podle předloženého vynálezu pro stanovení ligandů, může znamenat receptorový protein nebo podobnou sloučeninu vyčištěnou obecně známým způsobem, buňky obsahující receptorový protein nebo membránovou frakci takových buněk.

Jestliže se buňky, které obsahují receptorový protein nebo podobnou sloučeninu podle předloženého vynálezu, používají pro způsob podle předloženého vynálezu pro stanovení ligandů, buňky mohou být fixovány použitím glutaraldehydu, formalinu atd. Fixace se může provádět obecně známým způsobem.

Buňky obsahující receptorový protein nebo podobnou sloučeninu podle předloženého vynálezu znamenají hostitelské buňky, které exprimují receptorový protein nebo podobnou sloučeninu podle předloženého vynálezu, při čemž mezi tyto buňky patří Escherichia coli, Bacillus subtilis, kvasinky, hmyzí buňky a živočišné buňky.

Buněčná membránová frakce znamená frakci hojně se vyskytující v buněčné membráně získanou rozbitím buněk a následující frakcionací obecné známým způsobem. Mezi užitečné způsoby rozbití buněk patří rozmačkání buněk použitím Potter49 »··· · · · ·· • ·· · · ··· · ·

-Elvehjemova homogenizátoru, rozbití použitím Waringova mísiče nebo zařízení Polytron (vyráběného firmou Kinematica lne.), rozbití působením ultrazvuku a rozbití rozprašováním buněk tenkou tryskou za zvýšeného tlaku použitím francouzského lisu nebo podobného zařízení. Buněčná membránová frakcionace se provádí hlavně frakcionací použitím odstředivé síly, jako je odstřeďování pro frakcionaci a odstřeďování s hustotním gradientem. Například kapalina z rozbitých buněk se odstřeďuje při nízké rychlosti (500 až 3000 otáček za minutu) krátkou dobu (normálně asi 1 až 10 minut), výsledný supematant se potom odstřeďuje při vyšší rychlosti (15 000 až 30 000 otáček za minutu) normálně po dobu 30 minut až 2 hodin. Takto získaná sraženina se použije jako membránová frakce. Membránová frakce je bohatá na exprimovaný receptorový protein nebo podobnou sloučeninu a membránové složky, ______jako jsou fosfolipidy a membránové proteiny pocházející z buňky.----------Množství receptorového proteinu nebo podobné sloučeniny v buňkách obsahujících receptorový protein nebo podobnou sloučeninu v membránové frakci je s výhodou 10³ až 10⁸ molekul na buňku, výhodněji 10⁵až 10⁷ molekul na buňku. Jak se zvyšuje množství exprese, aktivita vázající ligand na jednotku membránové frakce (specifická aktivita) se zvyšuje tak, že lze zkonstruovat nejen vysoce citlivý testovací systém, ale také lze stejným systémem testovat velká množství vzorků.

Pro provedení způsobů 1) až 3) pro stanovení ligandu na receptorový protein podle předloženého vynálezu nebo jeho soli je potřeba příslušná receptorová frakce a značené testovaná sloučenina.

Receptorová proteinová frakce s výhodou znamená frakci přirozeně se vyskytujícího receptorového proteinu nebo frakce rekombinantního proteinu s aktivitou ekvivalentní aktivitě přírodního proteinu. Pojem ekvivalentní aktivita je zde používán pro označení vazebné aktivity ligandu nebo signální transdukční aktivity, což je ekvivalentní s těmi, které existují u přirozeně se vyskytujících receptorových proteinů.

Mezi výhodné příklady značených testovaných sloučenin patří angiotensin, bombesin, kanavinoid, cholecystokinin, glutamin, serotonin, melatonin, neuropeptid Y, opioid, puriny, vasopresin, oxytocin, PACAP, sekretin, glukagon, kalcitonin, adrenomedulin, somatostatin, GHRH, CRF, ACTH, GRP, PTH, vasoaktivní intestinální polypeptid (VIP), somatostatin, dopamin, motilin, amylin, bradykinin, peptid související s genem kalcitoninu (CGRP), leukotrieny, pankreastatin, prastaglandiny, tromboxan, adenosin, adrenalin, a- a β-chemokiny (např. IL-8, GROa, GROB, GROy, NAP-2, ENA-78, PF4, IP10, GCP-2, MCP-1, HC14, MCP-3, I-309, MIP-1a, MIP-1B, RANTES atd.), endothelin, enterogastrin, histamin, neurotensin, TRH, pankreatický polypeptid, galanin atd.) stejně jako příslušné peptidové fragmenty KiSS-1 popsané ve Welch D. R.: J. Nati. Cancer Inst. 1996, 88, 1731 (např. peptid 8 až 54 aminokyselinových —zbytkú-obsahující aminokyselinovou sekvenci 47 až 54~z N4ronce v aminokyselinové' sekvenci představované sekvencí sekv. id. č. 10, nebo jeho amidy, estery nebo soli), které jsou značeny pH], [¹²⁵l], [¹⁴C], (³¾] atd.

Podrobněji, ligand na receptorový protein nebo podobnou sloučeninu podle předloženého vynálezu se stanovuje následujícími způsoby. Nejdříve se připraví standardní receptorový přípravek suspendováním buněk obsahujících receptorový protein nebo podobnou sloučeninu podle předloženého vynálezu nebo jeho membránovou frakci v příslušném pufru vhodném pro použití pro stanovení. Lze použít jakýkoliv pufr, pokud tento pufr neinterferuje s vazbou ligand-receptor. Mezi takové pufry patří fosforečnanový pufr nebo Tris-HCI pufr, který má pH asi 4 až 10 (s výhodou pH asi 6 až 8). Pro účel minimalizování nespecifické vazby se popřípadě může přidat k pufru povrchově aktivní činidlo, jako je CHAPS, Tween-80™ (vyráběný firmou Kao-Atlas lne.), digitonin nebo deoxycholát, a různé proteiny, jako je hovězí sérový albumin nebo želatina. Dále se kvůli potlačení degradace receptoru nebo ligandu proteasou může také přidat inhibitor proteasy, jako je PMSF, leupeptin, E-64 (vyráběný Peptide Institute, lne.) a pepstatin. Dané množství (5000 až 500000 impulsů za minutu) testované sloučeniny označené ^H], [¹²⁵l], [¹⁴C], [^S] nebo jinak, se přidá k 0,01 až 10 ml roztoku receptoru. Pro stanovení množství nespecifického navázání (NSB) se použije také reakční zkumavka obsahující ve velkém nadbytku • · · · neznačenou testovanou sloučeninu. Reakce se provádí přibližně při 0 až 50 °C, s výhodou při 4 až 37 °C po dobu asi 20 minut až 24 hodin, s výhodou asi 30 minut až 3 hodin. Po ukončení reakce se reakční směs zfiltruje filtračním papírem ze skleněného vlákna atd. a promyje se příslušným množstvím stejného pufru. Zbývající radioaktivita na filtračním papíru ze skleněného vlákna se pak změří pomocí kapalinového scintilačního počítače nebo γ-počítače. Testovaná sloučenina převyšující 0 počet ipnpulzů za minutu získaných odečtením nespecifického navázání (NSB) od celkového navázání (B) (B minus NSB) se může vybrat jako ligand (agonista) na receptorový protein podle předloženého vynálezu nebo jeho soli.

Shora uvedený způsob 4) nebo 5) stanovení ligandu na receptorový protein -----------podle předloženého vynálezu nebo jeho soli lze provést následujícím postupem.

Aktivity stimulující buňky vyvolané receptorovým proteinem (např. aktivity, které podporují nebo potlačují uvolňování arachidonové kyseliny, uvolňování acetylcholinu, uvolňování intracelulámího Ca²*, produkci intracelulámího cAMP, produkci intracelulámího cGMP, produkci inositolfosfátu, změnu membránového potenciálu buňky, fosforylaci intracelulámích proteinů, aktivaci c-fos a snížení pH) se mohou stanovit obecně známým způsobem nebo použitím komerčně dostupné testovací sestavy. Konkrétně, buňky, které obsahují receptorový protein, se nejdříve kultivují na desce s mnoha jamkami atd. Před stanovením ligandu se medium nahradí čerstvým mediem nebo příslušným netoxickým pufrem, následuje inkubace po danou dobu v přítomnosti testované sloučeniny atd. Následně se buňky extrahují nebo se supematant isoluje a příslušnými způsoby se kvantitativné vyhodnotí výsledný produkt. Jestliže je obtížné detegovat produkci dané látky pro aktivitu stimulující buňky (např. arachidonové kyseliny) díky degradujícímu enzymu obsažené v buňkách, může se před testem přidat inhibitor proti takovému degradujícímu enzymu. Při detegování aktivit, jako je aktivita potlačení produkce cAMP, základní produkce v buňkách se zvýší forskolinem nebo podobnou sloučeninou a potom lze detegovat potlačující účinek na zvýšenou základní produkci.

• · • · · · ··· · · · • «· · · · · · · · « · · · · · ··» ·

Sestava podle předloženého vynálezu pro stanovení ligandu, který se váže na receptorový protein nebo podobnou sloučeninu podle předloženého vynálezu, obsahuje receptorový protein nebo podobnou sloučeninu podle předloženého vynálezu, buňky obsahující receptorový protein nebo podobnou sloučeninu podle předloženého vynálezu nebo membránovou frakci buněk obsahující receptorový protein nebo podobnou sloučeninu podle předloženého vynálezu.

Příklady sestavy pro stanovení ligandu podle předloženého vynálezu jsou uvedeny níže.

1. Reakční činidla pro stanovení ligandú

1) Pufry pro test a promývání

Hankúv vyrovnaný solný roztok (vyráběný firmou Gibco Co.) doplněný, o 0,05 % hovězího sérového albuminu (Sigma Co ).

Tento roztok se steriluje filtrací 0,45μΓη filtrem a skladuje se při 4 °C. Tento se roztok se může připravit také při použití.

2) Standardní receptorový protein

Buňky CHO, na kterých se exprimuje receptorový protein podle předloženého vynálezu, se podrobí pasážování kultury na desce s 12 jamkami o hustotě 5.10⁵buněk na jamku, následuje kultivování při 37 °C pod 5 % oxidu uhličitého a 95 % vzduchu po dobu dvou dnů.

3) Značené testované sloučeniny

Sloučeniny jsou značeny komerčně dostupným [³H], [¹²⁵l], [¹⁴C] nebo [^S] nebo se sloučeniny označí příslušnými způsoby.

Vodný roztok sloučeniny se skladuje pn 4 °C nebo -20 °C. Tento roztok se zředí na 1 μΜ testovaným pufrem pro použití. Testovaná sloučenina, která je ve vodě špatně rozpustná, se rozpustí v dimethylformamidu, DMSO nebo methanolu.

4) Neznačené sloučeniny

Neznačená forma stejné sloučeniny jako je značená sloučenina se připraví v koncentraci 100krat až 1000krát vyšší než je koncentrace značené sloučeniny.

2. Způsob testování ______________1) Buňky CHO exprimující receptorový pratein podle předloženého vynálezu se kultivují na kultivační desce o 12 jamkách. Po dvojím promytí 1 ml testovacího pufru se do každé jamky přidá 490 μΙ testovacího pufru.

2) Přidá se 5 μ! značené testované sloučeniny a výsledná směs se inkubuje jednu hodinu za teploty místnosti. Pro stanovení nespecifického navázání se k systému přidá 5 μΙ neznačené sloučeniny.

3) Reakční směs se odstraní a jamky se promyjí třikrát 1 ml promývacího pufru. Značená testovaná sloučenina navázaná na buňky se rozpustí v 0,2N NaOH - 1% SDS a potom se smíchá se 4 ml kapalného scintilátoru A (vyráběný Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).

4) Použitím kapalinové scintilační sondy (vyráběna Beckman Co.) se změří radioaktivita.

Mezi ligandy, které se vážou na receptorový protein nebo podobnou sloučeninu podle předloženého vynálezu, patří látky specificky přítomné v mozku, podvězku mozkovém a slinivce břišní. Příklady těchto ligandů jsou angiotensin, bombesin, kanavinoid, cholecystokinin, glutamin, serotonin, melatonin, neuropeptid Y, opioidy, • · » · · · · · · t · • · · · · · · · · · puriny, vasopresin, oxytocin, PACAP, sekretin, glukagon, kalcitonin, adrenomedulin, somatostatin, GHRH, CRF, ACTH, GRP, PTH, vasoaktivní intestinální polypeptid (VIP), somatostatin, dopamin, motilin, amylin, bradykinin, peptid související s genem kalcitoninu (CGRP), leukotrieny, pankreastatin, prostaglandiny, tromboxan, adenosin, adrenalin, a- a β-chemokiny (např. IL-8, GROa, GROB, GROy, NAP-2, ENA-78, PF4, IP10, GCP-2, MCP-1, HC14, MCP-3, I-309, MIP-1a, MIP-1B, RANTES atd.), endothelin, enterogastrin, histamin, neurotensin, TRH, pankreatický polypeptid a galanin) stejně jako příslušné peptidové fragmenty KiSS-1 popsané ve Welch D. R.: J. Nati. Cancer Inst. 1996, 88, 1731 (např. peptid sestávající z 8 až 54 aminokyselinových zbytků obsahující aminokyselinovou sekvenci 47 až 54 z N-konce v aminokyselinové sekvenci představované sekvencí sekv. id. č. 10, nebo jeho amidy, estery nebo soli).

Podrobně, jak bude později popsáno v příkladu 3, příslušné peptidové fragmenty KiSS-1 popsané ve Welch D. R.: J. Nati. Cancer Inst 1996, 88, 1731 (např. peptid sestávající z 8 až 54 aminokyselinových zbytků obsahující aminokyselinovou sekvenci 47 až 54 z N-konce v aminokyselinové sekvenci představované sekvencí sekv. id. č. 10, nebo jeho amidy, estery nebo soli) jsou příklady ligandu, který se váže na receptorový protein nebo podobnou sloučeninu podle předloženého vynálezu.

Pojem peptid sestávající z 8 až 54 aminokyselinových zbytků a obsahující sekvenci 47 až 54 aminokyselin z N-konce v aminokyselinové sekvenci představované sekvencí sekv. id. č. 10 označuje jakýkoliv peptid tak dlouhý, že znamená peptid sestávající z 8 až 54 aminokyselinových zbytků a obsahující sekvenci aminokyselin 47 až 54 z N-konce v aminokyselinové sekvenci představované sekvencí sekv. id. č. 10. Takové peptidy mají v podstatě stejné peptidové aktivity jako jsou aktivity receptorového proteinu nebo podobné sloučeniny podle předloženého vynálezu (např. vlastnost navázání ligand-receptor, buňky stimulující aktivitu buňky exprimující receptor indukovanou ligandem).

Výhodným příkladem ligandového peptidu podle předloženého vynálezu je peptid sestávající z 8 až 15 aminokyselinových zbytků, který obsahuje sekvenci « · ♦ · · · · · * < · · «· ·> · ♦ · · ♦ · ·· < ·· · · ··· · · · aminokyselin 47 až 54 počítáno z N-konce na C-konci v aminokyselinové sekvenci představované sekvencí sekv. id. č. 10.

Výhodněji - ligandový peptid podle předloženého vynálezu zahrnuje peptid (zvláště jeho amidy) představovaný sekvencí sekv. id. č. 11,12,13 nebo 14.

Výhodněji - ligandový peptid podle předloženého vynálezu zahrnuje peptid, v němž je karboxylová skupina na C-konci aminové kyseliny amidována.

Pokud se týká amidů nebo esterů těchto peptidů a jejich solí, aplikuje se stejný popis jako u solí receptorového proteinu podle předloženého vynálezu a amidů a esterů peptidových fragmentů. — U polynukleotidu kódujícího ligandový peptid podle předloženého vynálezu se může použít jakýkoliv polynukleotid tak dlouhý, že obsahuje nukleotidovou sekvenci (DNA nebo RNA, s výhodou DNA) kódující ligandový peptid podle předloženého vynálezu. Takový polynukleotid může znamenat DNA a RNA včetně mRNA kódující ligandový peptid podle předloženého vynálezu. Polynukleotid může být dvojvláknový nebo jednovláknový. Jestliže je polynukleotid dvojvláknový, může znamenat dvouvláknovou DNA nebo hybrid DNA: RNA. Jestliže je polynukleotid jednovláknový, může znamenat negativní vlákno (tj. kódující vlákno) nebo positivní vlákno (tj. nekódující vlákno).

DNA kódující ligandový peptid podle předloženého vynálezu může znamenat jakoukoliv genomovou DNA, genomovou DNA knihovnu, cDNA pocházející ze shora popsaných buněk a tkání, cDNA knihovnu pocházející ze shora popsaných buněk a tkání a syntetickou DNA. Vektor, který se používá pro knihovnu, může znamenat bakteriofág, plasmid, kosmid a fagemid. DNA se může také přímo amplifikovat reversní transkriptasovou polymerasovou řetězcovou reakcí (RT-PCR) použitím celkové RNA nebo mRNA frakce připravené ze shora popsaných buněk a tkání.

• ·· • · 9 • ··	99 • · • ·	···· • • ··	·· 9 • · · ♦ • · ·
• Λ ··	♦ ♦	♦ · ·	• · · ·

Specificky, DNA kódující ligandový peptid podle předloženého vynálezu může znamenat jakoukoliv DNA tak dlouhou, že má sekvenci aminokyselin 47 až 54 počítáno od N-konce v aminokyselinové sekvenci představované sekvencí sekv. id. č. 10 a obsahuje DNA, která má nukleotidovou sekvenci kódující peptid sestávající z 8 až 54 aminokyselinových zbytků.

Mezi specifičtější příklady DNA kódující ligandový peptid podle předloženého vynálezu patří DNA obsahující DNA, která má nukleotidovou sekvenci kódující peptid, který má aminokyselinovou sekvenci 47 až 54 z N-konce na C-konci aminokyselinové sekvence představované sekvencí sekv. id. č. 10 a obsahuje 8 až 15 aminokyselinových zbytků. Podrobněji, DNA kódující ligandový peptid podle předloženého vynálezu zahrnuje DNA obsahující DNA, která má nukleotidovou sekvenci kódující--------peptid, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci představovanou sekvencemi sekv. id. č. 11,12,13 nebo 14 a obsahuje 8 až 15 aminokyselinových zbytků.

DNA kódující ligandový peptid podle předloženého vynálezu znamená například DNA obsahující nukleotidovou sekvenci 139 až 162 z 5' konce v nukleotidové sekvenci představované sekvencí sekv. id. č. 15 a obsahující 24 až 162 nukleotidů nebo podobně. Podrobněji, DNA kódující ligandový peptid podle předloženého vynálezu zahrnuje DNA obsahující nukleotidovou sekvenci 139 až 162 z 5' konce na 3' konec nukleotidové sekvence představované sekvencí sekv. id. č. 15 a obsahující 25 až 45 nukleotidů.

Typické příklady DNA kódující ligandový peptid podle předloženého vynálezu zahrnují DNA, které obsahují DNA nesoucí příslušné nukleotidové sekvence představované sekvencemi sekv. id. č. 16,17,18 a 19.

Specifické příklady DNA kódující každou sekvenci odpovídající sekvenci sekv.

id. č. jsou:

·· ·· ···· ·· t· · · ··· ♦ · • ·· · · ··· · · « * · · « · · · ·' ·

1) pro DNA, která kóduje aminokyselinovou sekvenci představovanou sekvencí sekv. id. č. 10, DNA obsahující DNA, která má nukleotidovou sekvenci představovanou sekvencí sekv. id. č. 15,

2) pro DNA, která kóduje aminokyselinovou sekvenci představovanou sekvencí sekv. id. č. 11, DNA obsahující DNA, která má nukleotidovou sekvenci představovanou sekvencí sekv. id. č. 16,

3) pro DNA, která kóduje aminokyselinovou sekvenci představovanou sekvencí sekv. id. č. 12, DNA obsahující DNA, která má nukleotidovou sekvenci představovanou sekvencí sekv. id. č. 17,

4) pro DNA, která kóduje aminokyselinovou sekvenci představovanou sekvencí sekv. id. č. 13, DNA obsahující DNA, která má nukleotidovou sekvenci představovanou sekvencí sekv. id. č. 18, a

5) pro DNA, která kóduje aminokyselinovou sekvenci představovanou sekvencí sekv. id. č. 14, DNA obsahující DNA, která má nukleotidovou sekvenci představovanou sekvencí sekv. id. č. 19.

Ligandový peptid podle předloženého vynálezu nebo jeho estery, amidy nebo soli stejně jako polynukleotid kódující ligandový peptid může být vyroben podobným způsobem, jako jsou způsoby výroby receptorového proteinu nebo podobné sloučeniny podle předloženého vynálezu a polynukleotidu kódujícího totéž.

Ligandový peptid podle předloženého vynálezu nebo jeho estery, amidy nebo soli (zde dále někdy označovaný jako ligandový peptid nebo podobná sloučenina podle předloženého vynálezu) stejně jako polynukleotid kódující ligandový peptid jsou užitečné jako bezpečné a nízkotoxické léčivo v závislosti na ligandové aktivitě.

• 44 44 ··♦♦44

4 4 4 * · · · ♦· • ·· · · ·'·♦ 44

4 4 4 4 · · 4 ··

444 44 44 444 4 ·44

Ligandový peptid nebo podobná sloučenina podle předloženého vynálezu a DNA kódující totéž mají aktivitu potlačující metastáze rakoviny a jsou tedy užitečné pro profylaktické nebo terapeutické léčivo všech rakovin (např. rakoviny plic, rakoviny žaludku, rakoviny jater, rakoviny slinivky břišní, rakoviny tlustého střeva, rakoviny konečníku, rakoviny tračníku, rakoviny prostaty, rakoviny vaječníků, rakoviny děložního hrdla, rakoviny prsu atd.).

Ligandový peptid nebo podobná sloučenina podle předloženého vynálezu a DNA kódující totéž mají také aktivitu spočívající v regulaci funkci placenty a jsou tedy užitečné pro profylaktické nebo terapeutické léčivo rakoviny cilie, zásnětě hroznové, invazivní zásnětě, spontánního potratu, fetální hypoplazie, dysbolismu cukrů, dysbolisrnu.juků nebojndukceporodu____________________________________________________________________________________

Jestliže se ligandový peptid nebo podobná sloučenina podle předloženého vynálezu používá jako shora popsané profylaktické/terapeutické činidlo, ligandový peptid nebo podobná sloučenina se mohou vyrábět ve formě farmaceutického přípravku obecně známým způsobem.

Jestliže se DNA kódující ligandový peptid podle předloženého vynálezu (zde někdy dále označovaná jako ligandová DNA podle předloženého vynálezu) používá jako shora popsané profylaktické/terapeutické činidlo, ligandová DNA podle předloženého vynálezu se může používat samotná nebo po jejím vložení do příslušného vektoru, jako je vektor retroviru, vektor adenoviru a/nebo vektor související s adenovirem s následujícím podáváním léčiva konvenčními prostředky. Ligandová DNA podle předloženého vynálezu se může podávat také jako nahá DNA nebo s adjuvans, aby se napomohlo jejímu příjmu genovou puškou nebo katetrem, jako je katetr s hydrogelem.

Například 1) ligandový peptid nebo podobná sloučenina podle předloženého vynálezu nebo 2) DNA kódující ligandový peptid se mohou používat orálně ve formě tablet, které mohou být potaženy cukrem, jestliže je to nutné a žádoucí, tobolek, elixírů, mikrotobolek atd. nebo parenterálně ve formě injektovatelných přípravků, jako je sterilní roztok a suspenze ve vodě nebo s jinou farmaceuticky přijatelnou kapalinou. Tyto přípravky lze vyrábět smícháním 1) ligandového peptidu nebo podobné sloučeniny podle předloženého vynálezu nebo 2) DNA kódující ligandový peptid s fysiologicky přijatelným známým nosičem, ochucovacím činidlem, ředidlem, vehikulem, antiseptickým činidlem, stabilizačním činidlem, pojivém atd. v požadované jednotkové dávkové formě obecně přijatelným způsobem aplikovaným na výrobu farmaceutických přípravků. Účinná složka v přípravku je regulována na takovou dávku, aby příslušná dávka byla získána v daném specifikovaném rozmezí.

Mezi přísady mísitelné s tabletami, tobolkami atd. patří vazebné činidlo, jako je - želatina, kukuřičný škrob, traganta arabská guma, excipiens, jako je krystalická celulosa, bobtnací činilo, jako je kukuřičný škrob, želatina a kyselina alginová, mazadlo, jako je stearát hořečnatý, sladící činidlo, jako je sacharosa, laktosa a sacharin, a ochucovací činidlo, jako je máta pepmá, akamonový olej a višňový extrakt. Jestliže jednotková dávka je ve formě tobolek, mohou se dále použít kapalné nosiče, jako jsou oleje a tuky, společně se shora popsanými přísadami. Sterilní prostředek pro injekce může být sestaven podle konvenčního způsobu používaného pro výrobu farmaceutických prostředků, např. rozpuštěním nebo suspendováním účinných složek v ředidle, jako je voda pro injekce s přirozeně se vyskytujícím rostlinným olejem, jako je sezamový olej a kokosový olej atd., takže se vyrobí farmaceutický prostředek. Mezi příklady vodného media pro injekce patří fysiologický solný roztok a isotonický roztok obsahující glukosu a další pomocná činidla (např. D-sorbitol, D-mannitól a chlorid sodný) a může se používat v kombinaci s příslušnými činidly napomáhajícími rozpouštění, jako je alkohol (např. ethanol), polyalkohol (např. propylenglykol a polyethylenglykol), neiontové povrchově aktivní činidlo (např. polysorbát 80™ a HCO-50) atd. Jako olejové medium se může používat například sezamový olej a sojový olej, které se mohou používat v kombinaci s činidlem napomáhajícím rozpouštění, jako je benzylbenzoát a benzylalkohol.

Dále se mohou shora popsaná profylaktická/terapeutická činidla sestavovat také spolu s pufrem (např. fosforečnanovým pufrem a pufrem octanu sodného), uklidňujícím činidlem (např. benzalkoniumchloridem a hydrochloridem prokainu), stabilizátorem (např. lidským sérovým albuminem a polyethylenglykolem), ochranným činidlem (např. benzylakoholem a fenolem), antioxidačním činidlem atd. Takto vyrobená kapalina pro injekce se normálně naplní do příslušné ampule.

Jelikož takto získaný farmaceutický přípravek je bezpečný a nízkotoxický, může se tento přípravek podávat člověku nebo savcům (např. kryse, myši, králíkovi, ovci, praseti, hovězímu dobytku, kočce, psu, opici atd.).

......Dávka ligandového peptidů nebo podobné sloučeniny podle předloženého vynálezu se mění podle subjektu, kterému se podává, podle cílového orgánu, příznaku, cesty podávání atd. U orálního podávání je dávka normálně asi 0,1 až asi 100 mg, s výhodou asi 1,0 až asi 50 mg, výhodněji asi 1,0 až asi 20 mg za den u pacienta s rakovinou (o hmotnosti 60 kg). U parenterálního podávání se jednotlivá dávka mění podle subjektu, kterému se podává, podle cílového orgánu, příznaku, cestě podávání atd., ale je výhodné podávat účinnou složku intravenózně v denní dávce asi 0,01 až asi 30 mg, s výhodou asi 0,1 až asi 20 mg, výhodněji asi 0,1 až asi 10 mg u pacienta s rakovinou (o hmotnosti 60 kg). U jiných živočišných druhů se může podávat odpovídající dávka, což je taková dávka, která se získá převodem na 60 kg hmotnosti.

Dávka ligandové DNA podle předloženého vynálezu se mění v závislosti na subjektu, kterému se podává, na cílovém orgánu, na příznaku, cestě podávání atd.; při orálním podávání je tato dávka normálně asi 0,1 až asi 100 mg, s výhodou asi 1,0 až asi 50 mg, výhodněji asi 1,0 až asi 20 mg za den u pacienta s rakovinou (o hmotnosti 60 kg). U parenterálního podávání se jednotlivá dávka se mění podle subjektu, kterému se podává, podle cílového orgánu, příznaku, cestě podávání atd., ale je výhodné podávat účinnou složku intravenózně v denní dávce asi 0,01 až asi 30 mg, s výhodou asi 0,1 až asi 20 mg, výhodněji asi 0,1 až asi 10 mg u pacienta s

• 4 4	44	····	4«	4
44 4 ·	•	•	4	• 4	4 4
4 44	4	4	4 44	• 4	4
					4
4 4 4	4	4	4	4 4	4
44 4 4 4		44	444	4 4	4 4

rakovinou (o hmotnosti 60 kg). U jiných živočišných druhů se může podávat odpovídající dávka, což je taková dávka, která se získá převodem na 60 kg hmotnosti.

2) Profylaktická a/nebo terapeutická činidla pro onemocnění související s dysfunkcí receptorového proteinu podle předloženého vynálezu

Receptorový protein nebo podobná sloučenina podle předloženého vynálezu nebo DNA kódující receptorový protein nebo podobnou sloučeninu se mohou použít jako profylaktická a/nebo terapeutická činidla pro onemocnění související s dysfunkcí _—Například, jestliže nemůže být očekávána jakákoliv fysiologické aktivita receptorového proteinu podle předloženého vynálezu díky snížené hladině receptorového proteinu u pacienta (deficit receptorového proteinu), ligandová aktivita může být dosažena následujícími způsoby: 1) receptorový protein nebo podobná sloučenina podle předloženého vynálezu se podává pacientovi pro doplnění množství receptorového proteinu nebo podobné sloučeniny nebo 2) množství receptorového proteinu podle předloženého vynálezu se u pacienta zvýší: a) podáním DNA kódující receptorový protein podle předloženého vynálezu pacientovi pro expresi nebo b) insercí DNA kódující receptorový protein podle předloženého vynálezu do cílových buněk pro expresi a buňky takto exprimované jsou pak transplantovány do pacienta. Množství receptorového proteinu podle předloženého vynálezu může být tedy u pacienta zvýšeno, při čemž ligandová aktivita může být dostatečné vykazována. Receptorový protein nebo podobná sloučenina podle předloženého vynálezu nebo DNA kódující receptorový protein podle předloženého vynálezu je tedy užitečná jako bezpečné a nízkotoxické profylaktické a/nebo terapeutické léčivo pro onemocnění související s dysfunkcí receptorového proteinu podle předloženého vynálezu.

Receptorový protein nebo podobná sloučenina podle předloženého vynálezu a DNA kódující receptorový protein nebo podobnou sloučeninu podle předloženého vynálezu vykazují aktivitu potlačování metastází rakoviny a jsou tedy užitečné pro

•	♦ ·	44	4444 44
4	4 4 4	4	4 >4	4 4
•	44 4	4	♦ ♦· 4 4
4	4 4 4 4	4	4 4 4 4
44	44	4·	444 44	44

profylaktické nebo terapeutické léčivo všech rakovin (např. rakoviny plic, rakoviny žaludku, rakoviny jater, rakoviny slinivky břišní, rakoviny tlustého střeva, rakoviny konečníku, rakoviny tračníku, rakoviny prostaty, rakoviny vaječníku, rakoviny děložního hrdla, rakoviny prsu atd.).

Receptorový protein nebo podobná sloučenina podle předloženého vynálezu nebo ligandový peptid podle předloženého vynálezu a DNA kódující receptorový protein nebo podobnou sloučeninu podle předloženého vynálezu nebo ligandový peptid podle předloženého vynálezu také vykazují aktivitu spočívající v regulaci funkci placenty a jsou tedy užitečné pro profylaktické nebo terapeutické léčivo rakoviny cilie, zásnětě hroznové, invazivní zásnětě, spontánního potratu, fetální hypoplazie, dysbolismu cukrů, dysbolismu tuků nebo indukce porodu.

Jestliže se receptorový protein nebo podobná sloučenina podle předloženého vynálezu používá jako profylaktické/terapeutické činidlo jak shora popsáno, receptorový protein nebo podobná sloučenina se může vyrábět ve formě farmaceutického přípravku podle obecně známých způsobů.

Jestliže se DNA kódující receptorový protein nebo podobnou sloučeninu podle předloženého vynálezu (zde dále někdy označovaná jako DNA podle předloženého vynálezu) používá jako profýlaktické/terapeutické činidlo jak shora popsáno, DNA podle předloženého vynálezu se může používat samotná nebo po vložení do příslušného vektoru, jako je vektor retroviru, vektor adenoviru nebo vektor viru související s adenovirem a následujícím podáváním léčiva konvenčními prostředky. DNA podle předloženého vynálezu se může podávat také jako nahá DNA nebo s adjuvans, aby se napomohlo jejímu příjmu genovou puškou nebo katetrém, jako je katetr s hydrogelem.

Například 1) receptorový protein nebo podobná sloučenina podle předloženého vynálezu nebo 2) DNA kódující receptorový protein nebo podobnou sloučeninu se mohou používat orálně ve formě tablet, které mohou být potaženy cukrem, « · • ♦· ·· ··· ·· ···♦ • · · • · ♦··

φ ♦ φ *

·♦« jestliže je to nutné a žádoucí, tobolek, elixírů, mikrotobolek atd., nebo parenterálně ve formě injektovatelných přípravků, jako je sterilní roztok a suspenze ve vodě nebo s jinou farmaceuticky přijatelnou kapalinou. Tyto přípravky se mohou vyrábět smícháním 1) receptorového proteinu nebo podobné sloučeniny podle předloženého vynálezu nebo 2) DNA kódující receptorový protein nebo podobnou sloučeninu fysiologicky přijatelným známým nosičem, ochucovacím činidlem, ředidlem, vehikulem, antiseptickým činidlem, stabilizačním činidlem, pojivém atd. v požadované jednotkové dávkové formě obecně pňjatelným způsobem aplikovaným na výrobu farmaceutických přípravků. Účinná složka v přípravku je regulována na takovou dávku, že příslušná dávka se získá v daném specifikovaném rozmezí.

Mezi přísady mísitelné s tabletami, tobolkami atd. patří vazebné činidlo, jako je želatina, kukuřičný škrob, tragant a arabská guma, excipiens, jako je krystalická celulosa, bobtnací činidlo, jako je kukuřičný škrob, želatina a kyselina alginová, mazadlo, jako je stearát hořečnatý, sladící činidlo, jako je sacharosa, laktosa a sacharin, a odlučovači činidlo, jako je máta pepmá, akamonový olej a višňový extrakt. Jestliže jednotková dávka existuje ve formě tobolek, mohou se dále používat kapalné nosiče, jako jsou oleje a tuky, společně se shora popsanými přísadami. Sterilní prostředek pro injekce může být sestaven podle konvenčního způsobu používaného pro výrobu farmaceutických prostředků, např. rozpuštěním nebo suspendováním účinných složek v ředidle, jako je voda pro injekce s přirozeně se vyskytujícím rostlinným olejem, jako je sezamový olej a kokosový olej atd., takže se vyrobí farmaceutický prostředek. Mezi příklady vodného media pro injekce patří fýsiologický solný roztok a isotonický roztok obsahující glukosu a další pomocná činidla (např. D-sorbitol, D-mannitol a chlorid sodný) a mohou se používat v kombinaci s příslušnými činidly napomáhajícími rozpouštění, jako je alkohol (např. ethanol), polyalkohol (např. propylenglykol a polyethylenglykol), neiontové povrchově aktivní činidlo (např. polysorbát 80™ a HCO-50) atd. Jako olejové medium se může používat například sezamový olej a sojový olej, které se mohou používat v kombinaci s činidlem napomáhajícím rozpouštění, jako je benzylbenzoát a benzylalkohol.

<· ♦4 ♦·<· * · • ···

Dále se mohou sestavovat také shora popsaná profylaktická/terapeutická činidla spolu s pufrem (např. fosforečnanovým pufrem a pufrem octanu sodného), uklidňujícím činidlem (např. benzalkoniumchloridem a hydrochloridem prokainu), stabilizátorem (např. lidským sérovým albuminem a polyethylenglykolem), ochranným činidlem (např. benzylakoholem a fenolem), antioxidačním činidlem atd. Takto vyrobená kapalina pro injekce se normálně naplní do příslušné ampule.

Jelikož takto získaný farmaceutický přípravek je bezpečný a nízkotoxický, může se tento přípravek ppdávat člověku nebo savcům (např. kryse, myši, králíkovi, ovci, praseti, hovězímu dobytku, kočce, psu, opici atd.).

_____________Dávka receptorového proteinu nebo podobné sloučeniny podle předloženého vynálezu se mění podle subjektu, kterému se podává, podle cílového orgánu, příznaku, cesty podávání atd.; u orálního podávání je dávka normálně asi 0,1 až asi 100 mg, s výhodou asi 1,0 až asi 50 mg, výhodněji asi 1,0 až asi 20 mg za den u pacienta s rakovinou (o hmotnosti 60 kg). U parenterálního podávání se jednotlivá dávka mění v závislosti na subjektu, kterému se podává, podle cílového orgánu, příznaku, cestě podávání atd., ale je výhodné podávat účinnou složku intravenózně v denní dávce asi 0,01 až asi 30 mg, s výhodou asi 0,1 až asi 20 mg, výhodněji asi 0,1 až asi 10 mg u pacienta s rakovinou (o hmotnosti 60 kg). U jiných živočišných druhů se může podávat odpovídající dávka, což je taková dávka, která se získá převodem na 60 kg hmotnosti.

Dávka DNA kódující receptorový protein podle předloženého vynálezu se mění v závislosti na subjektu, kterému se podává, na cílovém orgánu, na příznaku, cestě podávání atd.; pň orálním podávání je tato dávka normálně asi 0,1 až asi 100 mg, s výhodou asi 1,0 až asi 50 mg, výhodněji asi 1,0 až asi 20 mg za den u pacienta s rakovinou (o hmotnosti 60 kg). U parenterálního podávání se jednotlivá dávka mění v závislosti na subjektu, kterému se podává, podle cílového orgánu, příznaku, cestě podávání atd., aleje výhodné podávat účinnou složku intravenózně v denní dávce asi 0,01 až asi 30 mg, s výhodou asi 0,1 až asi 20 mg, výhodněji asi 0,1 až asi 10 mg u • ♦· ♦« ♦··♦ *· · · ♦ ♦ · · · · ·· • «· · · ··· · · · φ · φ φ · φ φ φ · φφφ φφ ·♦ φφφ ♦♦ φφφ pacienta s rakovinou (ο hmotnosti 60 kg). U jiných živočišných druhů se může podávat odpovídající dávka, což je taková dávka, která se získá převodem na 60 kg hmotnosti.

3) Genové diagnostické činidlo

Použitím jako sondy DNA kódující receptorový protein podle předloženého vynálezu nebo DNA kódující ligandový peptid podle předloženého vynálezu může být detegována abnormalita (genová abnormalita) DNA nebo mRNA kódující receptorový protein nebo podobnou sloučeninu podle předloženého vynálezu nebo ligandový peptid podle předloženého vynálezu u člověka nebo savce (např. krysy, myši, králíka, ovce, prasete, hovězího dobytka, kočky, psa, opici atd.). DNA podle předloženého vynálezu je tedy užitečná jako genové diagnostické činidlo pro poškození DNA nebo mRNA, jejich mutaci nebo jejich sníženou expresi nebo zvýšenou expresi nebo nadexpresi DNA nebo mRNA.

Shora popsaná genová diagnosa použitím DNA kódující receptorový protein podle předloženého vynálezu nebo DNA kódující ligandový peptid podle předloženého vynálezu se může provádět například obecně známým Northemovým hybridizačním testem nebo PCR-SSCP testem (Genomics 1989, 5, 874 až 879); Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of Ameríca 1989, 86, 2766 až 2770.).

4) Kvantitativní hodnocení ligandu na receptorový protein nebo podobnou sloučeninu podle předloženého vynálezu

Jelikož receptorový protein nebo podobná sloučenina podle předloženého vynálezu má vlastnosti vazby na ligand, ligandová aktivita může být kvantitativně vyhodnocena in vivo s vysokou citlivostí.

tt

Způsob kvantitativního hodnocení podle předloženého vynálezu se může provádět například v kombinaci s kompetitivním způsobem. Vzorek, který má být stanoven, se tedy uvede do kontaktu s receptorovým proteinem nebo podobnou sloučeninou podle předloženého vynálezu, při čemž se může stanovit koncentrace ligandú ve vzorku. Konkrétně, kvantitativní vyhodnocení se může provádět podle následujícího níže uvedeného způsobu 1) nebo 2) nebo podle jeho modifikace:

1) Hiroshi Irie (red.): Radioimmunoassaý', publikováno Kodansha, Japonsko, 1974, a

2) Hiroshi Irie (red.): Radioimmunoassaý, Second Senes”, publikováno

Kodansha, Japonsko, 1979. -------------------------------------- -----------

5) Způsob testování sloučeniny (agonisty, antagonisty atd.), která mění vlastnosti vazby mezi receptorovým proteinem, jeho solemi a ligandem podle předloženého vynálezu (ligandový peptid podle předloženého vynálezu)

Použitím receptorového proteinu podle předloženého vynálezu nebo jeho solí nebo zkonstruováním expresního systému rekombinantního receptorového proteinu nebo podobné sloučeniny a použitím systému testování navázání receptoru via expresní systém, lze provést účinné testování sloučeniny (např. peptidu, proteinu, nepeptidové sloučeniny, syntetické sloučeniny, fermentačního produktu atd.) nebo jejích solí, které mění vlastnosti vazby mezi ligandem (ligandovým peptidem podle předloženého vynálezu) a receptorovým proteinem nebo podobnou sloučeninu podle předloženého vynálezu.

Mezi příklady shora uvedených sloučenin patří a) sloučenina, která vykazuje aktivity stimulování buňky zprostředkované receptorem spojeným s G proteinem (např. aktivity, které podporují nebo potlačují uvolňování arachidonové kyseliny, uvolňování acetylcholinu, uvolňování intracelulámího Ca²⁺, produkci intracelulámího cAMP, produkci intracelulámího cGMP, produkci inositolfosfátu, změnu membrá·♦ ··#♦ • · • ··· nového potenciálu buňky, fosforylaci intracelulámích proteinů, aktivaci c-fos a snížení pH) (tak zvaní agonisté receptorového proteinu nebo podobné sloučeniny podle předloženého vynálezu), b) sloučenina, která nevykazuje aktivitu stimulování buněk (tak zvaní antagonisté receptorového proteinu nebo podobné sloučeniny podle předloženého vynálezu), nebo c) sloučenina, která snižuje vlastnost navázání mezi ligandem (ligandovým peptidem podle předloženého vynálezu) a receptorovým proteinem nebo podobnou sloučeninou podle předloženého vynálezu (sloučenina ad a)) je testována s výhodou způsobem stanovení shora popsaného ligandu).

Předložený vynález poskytuje také způsob testování sloučeniny nebo její soli, která mění vlastnosti vazby mezi receptorovým proteinem nebo podobnou sloučeninu podle předloženého vynálezu a ligandem (ligandovým peptidem podle předloženého vynálezu), který zahrnuje srovnání následujících dvou případů: i) případu, v němž se receptorový protein nebo podobná sloučenina podle předloženého vynálezu uvede do kontaktu s ligandem (ligandovým peptidem podle předloženého vynálezu) a ii) případu, v se němž receptorový protein nebo podobná sloučenina podle předloženého vynálezu uvede do kontaktu s ligandem (ligandovým peptidem podle předloženého vynálezu) a testovanou sloučeninou.

Při způsobu testování podle předloženého vynálezu se provádí srovnání mezi případy a i) a ii) v pojmech např. množství ligandu (ligandového peptidu podle předloženého vynálezu), který se váže na receptorový protein nebo podobnou sloučeninu, nebo aktivit stimulujících buňku.

Podrobněji, předložený vynález poskytuje následující způsoby.

1) Způsob testování sloučeniny nebo jejích solí, které mění vlastnosti vazby mezi ligandem (ligandovým peptidem podle předloženého vynálezu) a receptorovým proteinem nebo podobnou sloučeninou podle předloženého vynálezu, vyznačující se tím, že se měří množství značeného ligandu (ligandového peptidu podle předloženého vynálezu) navázaného na receptorový protein nebo podobnou sloučeninu • ♦· <··· «· • · · · ♦ · ♦ · · · * «· · · ··· ♦ · • · · · · · · · podle předloženého vynálezu v tom případě, kdy značený ligand (ligandový peptid podle předloženého vynálezu) se uvede do kontaktu s receptorovým proteinem nebo podobnou sloučeninou podle předloženého vynálezu, a v případě, kdy se značený ligand (ligandový peptid podle předloženého vynálezu) a testovaná sloučenina uvedenou do kontaktu s receptorovým proteinem nebo podobnou sloučeninu, a srovná se navázané množství značeného ligandu v těchto dvou případech.

2) Způsob testování sloučeniny nebo její soli, která mění vlastnosti vazby mezi ligandem (ligandovým peptid podle předloženého vynálezu) a receptorovým proteinem nebo podobnou sloučeninou podle předloženého vynálezu, vyznačující se tím, že se měří množství značeného ligandu (ligandový peptid podle předloženého vynálezu) navázaného na buňky obsahující receptorový protein nebo podobnou sloučeninu podle předloženého vynálezu nebo jeho buněčnou frakci v případě, kdy se značený ligand (ligandový peptid podle předloženého vynálezu) uvede do kontaktu s buňkami obsahujícími receptorový protein nebo podobnou sloučeninu podle předloženého vynálezu nebo buněčnou membránou, a v případě, kdy se značený ligand (ligandový peptid podle předloženého vynálezu) a testovaná sloučenina uvedou do kontaktu s buňkami obsahujícími receptorový protein nebo podobnou sloučeninu nebo buněčnou membránou, a srovnává se navázané množství značeného ligandu v těchto dvou případech.

3) Způsob testování sloučeniny nebo její soli, která mění vlastnosti vazby mezi ligandem (ligandovým peptidem podle předloženého vynálezu) a receptorovým proteinem nebo podobnou sloučeninou podle předloženého vynálezu, vyznačující se tím, že se měří množství značeného ligandu (ligandového peptidu podle předloženého vynálezu) navázaného na receptorový protein nebo podobnou sloučeninu podle předloženého vynálezu v případě, kdy se značený ligand (ligandový peptid podle předloženého vynálezu) uvede do kontaktu s receptorovým proteinem nebo podobnou sloučeninou exprimovanou v buněčné membráně kultivováním transformantu obsahujícího DNA podle předloženého vynálezu, a v případě, kdy se značený ligand (ligandový peptid podle předloženého vynálezu) a testovaná sloučenina uvedou do

4	4«	• 4	• 44·	♦ · 4
44 ·	4	4 4 4	4 * 44
4	4*	4	• 44·	*44
• 44	44	• 4	444	4 4 444

kontaktu s receptorovým proteinem nebo podobnou sloučeninou exprimovanou v buněčné membráně kultivováním transformantu obsahujícího DNA podle předloženého vynálezu, a srovnává se množství navázaného značeného ligandu v těchto dvou případech.

4) Způsob testování sloučeniny nebo její soli, která mění vlastnosti vazby mezi ligandem (ligandovým peptidem podle předloženého vynálezu) a receptorovým proteinem nebo podobnou sloučeninou podle předloženého vynálezu, vyznačující se tím, že se měří receptorem zprostředkované aktivity stimulující buňky (např. aktivity, které podporují nebo potlačují uvolňování arachidonové kyseliny, uvolňování acetylcholinu, uvolňování intracelulámího Ca²⁺, produkci intracelulámího cAMP, produkci intrace-

--------lulámího cGMP, produkci inositolfosfátu, změnu membránového potenciálu buňky,’·” fosforylaci intracelulámích proteinů, aktivaci c-fos a snížení pH) v případě, kdy sloučenina (např. ligand na receptorový protein nebo podobnou sloučeninu podle předloženého vynálezu), které aktivuje receptorový protein nebo podobnou sloučeninu podle předloženého vynálezu, se uvede do kontaktu s buňkami obsahujícími receptorový protein nebo podobnou sloučeninu podle předloženého vynálezu, a v případě, kdy se uvedená sloučenina, které aktivuje receptorový protein nebo podobnou sloučeninu podle předloženého vynálezu a testovaná sloučenina uvedou do kontaktu s buňkami obsahujícími receptorový protein nebo podobnou sloučeninu podle předloženého vynálezu, a srovnávají se aktivity stimulace buněk v těchto dvou případech.

5) Způsob testování sloučeniny nebo její soli, které mění vlastnosti vazby mezi ligandem (ligandovým peptidem podle předloženého vynálezu) a receptorovým proteinem nebo podobnou sloučeninou podle předloženého vynálezu, vyznačující se tím, že se měň receptorem zprostředkované aktivity stimulující buňky (např. aktivity, které podporují nebo potlačují uvolňování arachidonové kyseliny, uvolňování acetylcholinu, uvolňování intracelulámího Ca²⁺, produkci intracelulámího cAMP, produkci intracelulámího cGMP, produkci inositolfosfátu, změnu membránového potenciálu buňky, fosforylaci intracelulámích proteinů, aktivaci c-fos a snížení pH) v případě, kdy sloučenina, které aktivuje ligandový peptid nebo podobnou sloučeninu podle předlože70

• 99	99		• 99·	99
99 « 9	•	•	•	9	•	9 9
• 99	•	•	• 99	•	•
9 9·	•	•	•	• 9
··· 99	99		• 99	99	• 9

něho vynálezu (např. ligand (ligand podle předloženého vynálezu) na receptorový protein nebo podobnou sloučeninu podle předloženého vynálezu), se uvede do kontaktu s receptorovým proteinem nebo podobnou sloučeninou podle předloženého vynálezu exprimovaným v buněčné membráně kultivováním transformantu obsahujícího DNA podle předloženého vynálezu, a v případě, kdy se uvedená sloučenina, která aktivuje receptorový protein nebo podobnou sloučeninu podle předloženého vynálezu, a testovaná sloučenina uvedou do kontaktu s receptorovým proteinem nebo podobnou sloučeninou podle předloženého vynálezu exprimovanou v buněčné membráně kultivováním transformantu obsahujícího DNA podle předloženého vynálezu, a srovnávají se aktivity stimulace buněk v těchto dvou případech.

------------Předtím. než se získá receptorový protein nebo podobná sloučenina podle předloženého vynálezu, by se mělo provést testování agonisty nebo antagonisty receptoru spojeného s G proteinem, pokud jde o to, jestli by kandidátní sloučenina inhibovala nebo neinhibovala navázání mezi receptorovými proteiny spojenými s G proteinem a ligandy, použitím buněk, tkání nebo frakcí buněčné membrány obsahující receptorové proteiny spojené s G proteinem. Jestliže se buňky, tkáně nebo frakce buněčné membrány používají jako takové, nevyhnutelně však existují také jiné receptorové proteiny. Bylo tedy obtížné testovat agonisty nebo antagonisty na žádané receptorové proteiny.

Použití receptorového proteinu nebo podobné sloučeniny podle předloženého vynálezu umožňuje účinně testovat sloučeninu, která inhibuje navázání mezi ligandem a receptorovým proteinem spojeným s G proteinem. Kromě toho se může jednoduše vyhodnotit to, jestli testovaná sloučenina je agonista nebo antagonista.

Dále zde bude podrobněji popsán způsob testování podle předloženého vynálezu.

Za prvé, receptorový protein nebo podobná sloučenina podle předloženého vynálezu, která se používá pň způsobu testování podle předloženého vynálezu, může i

• ·· • · · • ··	·· • · • ·	···· • ···	·· • · • ·	··
• · ·	• ·	•	• ·
·· ··	··	···	··	··

znamenat jakýkoliv protein, pokud obsahuje shora popsaný receptorový protein nebo podobnou sloučeninu podle předloženého vynálezu, i když se s výhodou používá membránová frakce savčích orgánů. Pro testování, které vyžaduje větší množství receptorového proteinu, je výhodné použít receptorové proteiny hojně exprimované rekombinantem.

Při výrobě receptorového proteinu nebo podobné sloučeniny podle předloženého vynálezu se mohou používat shora popsané způsoby, i když DNA podle předloženého vynálezu se s výhodou exprimuje v savčích buňkách nebo hmyzích buňkách. Jako DNA fragment kódující oblast cílového proteinu se může použít doplňková DNA, ale bez omezení na ni. Například se jako DNA fragment mohou — použít také genové fragmenty nebo syntetická DNA. Aby se zavedl DNA fragment kódující receptorový protein podle předloženého vynálezu do hostitelských živočišných buněk a aby se účinně exprimoval, s výhodou se DNA fragment zahrne do polyhedronového promotoru jaderného polyhedrosis viru (NPV) patřícího k baculoviru, promotoru odvozeného od SV-40, promotoru retroviru, promotoru metallothioneinu, lidského promotoru tepelného šoku, promotoru cytomegaloviru, SRa promotoru atd. po směru jejich vlákna. Množství a kvalita takto exprimovaných receptorů se může zkoumat obecně známým způsobem, například způsobem popsaným v Nambi P. a spol.: J. Biol. Chem. 1992, 267,19555 až 19559.

Ve způsobu testování podle předloženého vynálezu může tedy látka obsahující receptorový protein nebo podobnou sloučeninu podle předloženého vynálezu znamenat receptorový protein nebo podobnou sloučeninu, která je vyčištěna obecné známými způsoby. Rovněž se mohou použít buňky obsahující receptorový protein nebo podobnou sloučeninu podle předloženého vynálezu nebo frakce buněčné membrány buněk obsahující receptorový protein nebo podobnou sloučeninu podle předloženého vynálezu.

Jestliže se při způsobu testování podle předloženého vynálezu používají buňky obsahující receptorový protein nebo podobnou sloučeninu podle předloženého

; ⁷² vynálezu, tyto buňky mohou být fixovány glutaraldehydem, formalinem atd. Fixace se může provádět obecně známým způsobem.

Buňky obsahující receptorový protein nebo podobnou sloučeninu podle předloženého vynálezu znamenají hostitelské buňky exprimující receptorový protein nebo podobnou sloučeninu. Mezi příklady takových hostitelských buněk patří Escherichia coli, Bacillus subtilis, kvasinky, hmyzí buňky a živočišné buňky.

Buněčná membránová frakce znamená takovou frakci, která hojně obsahuje buněčné membrány připravené obecně známým způsobem po rozbití buněk. Mezi příklady rozbití buňky patří rozdrcení buněk použitím Potter-Elvehjemova homogeniL-----------------zátoru, rozbití použitím Waringova mísiče nebo zařízení Polytron (vyráběného firmou —

Kinematica lne.), rozbití působením ultrazvuku a rozbití rozprašováním buněk tenkou tryskou za zvýšeného tlaku použitím francouzského lisu nebo podobného zařízení.

*. Buněčná membránová frakcionace se provádí hlavně frakcionací použitím odstředivé síly, jako je odstřeďování pro frakcionací a odstřelování s hustotním gradientem. Například kapalina z rozbitých buněk se odstřeďuje při nízké rychlosti (500 až 3000 otáček za minutu) krátkou dobu (normálně asi 1 až 10 minut), výsledný supematant se potom odstřeďuje při vyšší rychlosti (15 000 až 30 000 otáček za minutu) normálně po dobu 30 minut až 2 hodin. Takto získaná sraženina se použije jako membránová frakce. Membránová frakce je bohatá na exprimovaný receptorový protein nebo podobnou sloučeninu a membránové složky, jako jsou fosfolipidy a membránové proteiny pocházející z buňky.

Množství receptorového proteinu obsaženého v buňkách obsahujících receptorový protein nebo podobnou sloučeninu v membránové frakci je s výhodou 10³ až 10⁸ molekul na buňku, výhodněji 10⁵ až 10⁷ molekul na buňku. Jak se zvyšuje množství exprese, aktivita vázající ligand na jednotku membránové frakce (specifická aktivita) se zvyšuje, takže lze zkonstruovat nejen vysoce citlivý testovací systém, ale také lze stejným systémem testovat velká množství vzorků.

« ·

Pro provedení způsobů 1) až 3) pro testování sloučeniny, která mění vlastnosti vazby mezi ligandem (ligandový peptid podle předloženého vynálezu) a receptorovým proteinem nebo podobnou sloučeninu podle předloženého vynálezu je potřeba příslušná frakce receptorového proteinu a značený ligand.

Receptorová proteinová frakce s výhodou znamená frakci přirozeně se vyskytujícího receptorového proteinu nebo frakci rekombinantního receptorového proteinu s aktivitou ekvivalentní aktivitě přirozené se vyskytujícího proteinu. Pojem ekvivalentní aktivita je zde zamýšlen tak, že znamená vazebnou aktivitu ligandu nebo signální transdukční aktivitu, což je ekvivalentní s těmi, které existují u přirozeně se vyskytujících receptorových proteinů.

Mezi příklady značených ligandů patří ligandy, které jsou značeny [³H], [¹²⁵l], [¹⁴C] nebo [^S],

Podrobněji, sloučenina, která mění vlastnost vazby mezi ligandem (ligandovým peptidem podle předloženého vynálezu) a receptorovým proteinem nebo podobnou sloučeninu podle předloženého vynálezu, se stanovuje následujícími způsoby. Nejdříve se suspendováním buněk obsahujících receptorový protein nebo podobnou sloučeninu podle předloženého vynálezu nebo jeho membránovou frakci v příslušném pufru pro použití při způsobu stanovení připraví standardní receptorový přípravek. Lze použít jakýkoliv pufr, pokud tento pufr neinterferuje s vazbou ligand-receptor. Příklady takových pufrú jsou fosforečnanový pufr nebo Tris-HCI pufr s hodnotou pH asi 4 až 10 (s výhodou pH asi 6 až 8). Pro účel minimalizování nespecifické vazby se popřípadě může přidat k pufrům povrchově aktivní činidlo, jako je CHAPS, Tween-80™ (vyráběný firmou Kao-Atlas lne.), digitonin nebo deoxycholát. Dále se pro účel potlačení degradace receptoru nebo ligandu (ligandový peptid podle předloženého vynálezu) proteasou může také přidat inhibitor proteasy, jako je PMSF, leupeptin, E-64 (vyráběný Peptide Institute, lne.) a pepstatin. Dané množství (5000 až 500 000 impulsů za minutu) značeného ligandu (ligandový peptid podle předloženého vynálezu) se přidá k 0,01 až 10 ml roztoku receptoru, v němž je současně přítomno • ·

W⁴ M až 10‘¹⁰ M testované sloučeniny. Pro stanovení množství nespecifického navázání (NSB) se použije také reakční zkumavka obsahující ve velkém nadbytku neznačený ligand (ligandový peptid podle předloženého vynálezu). Reakce se provádí přibližné při 0 až 50 °C, s výhodou při 4 až 37 °C po dobu asi 20 minut až 24 hodin, s výhodou asi 30 minut až 3 hodiny. Po ukončení reakce se reakční směs zfiltruje filtračním papírem ze skleněného vlákna atd. a promyje se příslušným množstvím stejného pufru. Zbývající radioaktivita na filtračním papíru ze skleněného vlákna se pak změří pomocí kapalinové scintilační sondy nebo γ-počítače. Jestliže se nespecifické navázání (NSB) odečte od počtu impulsů (B_o), když není přítomna žádná antagonizující látka a výsledný počet impulsů (B_o minus NBS) tvoří 100 %, testovaná sloučenina vykazující specifické vazebné množství (B minus NBS), např. 50 nebo -. méně %, může být vybrána jako kandidátní sloučenina.---------- —-----------------Shora uvedený způsob 4) nebo 5) testování sloučeniny, která mění vlastnost vazby mezi ligandem (ligandovým peptidem podle předloženého vynálezu) a receptorovým proteinem nebo podobnou sloučeninou podle předloženého vynálezu, se může provádět následujícím způsobem. V jednom provedení se aktivity stimulující buňky vyvolané receptorovým proteinem (např. aktivity, které podporují nebo potlačují uvolňování arachidonové kyseliny, uvolňování acetylcholinu, uvolňování intracelulámího Ca²⁺, produkci intracelulámího cAMP, produkci intracelulámího cGMP, produkci inositolfosfátu, změnu membránového potenciálu buňky, fosforylaci intracelulámích proteinů, aktivaci c-fos a snížení pH) se mohou stanovovat obecně známým způsobem nebo použitím komerčně dostupné testovací sestavy.

Konkrétně, buňky, které obsahují receptorový protein nebo podobnou sloučeninu podle předloženého vynálezu, se nejdříve kultivují na desce s mnoha jamkami atd. Před testováním se medium nahradí čerstvým mediem nebo příslušným netoxickým pufrem, následuje inkubace po danou dobu v přítomnosti testované sloučeniny atd. Následné se buňky extrahují nebo se supematant isoluje a příslušnými způsoby se kvantitativně vyhodnotí výsledný produkt. Jestliže je obtížné detegovat produkci látky s indexem aktivity stimulující buňky (např. arachidonovou kyselinu) díky

degradačnímu enzymu obsaženému v buňkách, může se před testem přidat inhibitor proti takovému degradujícímu enzymu. Pro detegování aktivit, jako je aktivita potlačení produkce cAMP, se základní produkce v buňkách zvýší forskolinem nebo podobným způsobem a potom lze detegovat potlačující účinek na zvýšenou základní produkci.

Pro testování během měření aktivit stimulujících buňky jsou nutné buňky, v nichž je exprimován příslušný receptorový protein. Výhodné buňky, v nichž je receptorový protein nebo podobná sloučenina podle předloženého vynálezu exprimována, jsou přirozeně se vyskytující buněčná linie obsahující receptorový protein nebo podobnou sloučeninu podle předloženého vynálezu a shora uvedená buněčná linie, v níž je exprimován rekombinantní typ receptorového proteinu nebo podobné sloučeniny.

Mezi příklady testované sloučeniny patří peptidy, proteiny, nepeptidové sloučeniny, syntetické sloučeniny, femnentační produkty, buněčné extrakty, rostlinné extrakty a živočišné tkáňové extrakty. Tyto testované sloučeniny mohou být nové nebo mohou být obecně známé.

Sestava pro testování sloučeniny nebo její soli, která mění vlastnost vazby mezi ligandem (ligandovým peptidem podle předloženého vynálezu) a receptorovým proteinem nebo podobnou sloučeninou podle předloženého vynálezu obsahuje, receptorový protein nebo podobnou sloučeninu podle předloženého vynálezu, buňky obsahující receptorový protein nebo podobnou sloučeninu podle předloženého vynálezu nebo membránovou frakci buněk obsahující receptorový protein nebo podobnou sloučeninu podle předloženého vynálezu.

• · ·

Příklady testovací sestavy obsahují následující složky.

1. Reakční činidlo pro testování

1) Pufry pro test a promývání

Hankův vyrovnaný solný roztok (vyráběný firmou Gibco) doplněný o 0,05 % 'V hovězího sérového albuminu (vyráběného firmou Sigma).

Tyto pufry se mohou sterilovat filtrací membránovým filtrem s velikostí pórů 0,45 μΓΠ a skladují se při 4 °C nebo se mohou připravit také při použití.

2) Přípravek receptorového proteinu spojeného s G proteinem

Buňky CHO, v nichž se exprimuje receptorový protein podle předloženého vynálezu, se předkultivují v množství 5.10⁵ buněk na jamku na desce s 12 jamkami, následuje kultivování při 37 °C pod 5 % oxidu uhličitého a 95 % vzduchu po dobu dvou dnů.

3) Značený ligand

Ligand, který je značen a je komerčně dostupný, obsahuje [³H], [¹²⁵l], [¹⁴C], (³¾] atd.

Produkt ve formě vodného roztoku se skladuje při 4 °C nebo -20 °C a ředí se na 1μΜ pufrem pro test při použití.

4) Standardní ligandový roztok

Ligand se rozpustí v PBS obsahujícím 0,1 % hovězího sérového albuminu (vyráběného firmou Sigma), aby se tak vyrobil 1mM roztok a ten se skladuje při -20 °C.

2. Způsob testování

1) Buňky CHO exprimující receptorový protein podle předloženého vynálezu se kultivují na kultivační desce o 12 jamkách. Po dvojím promytí CHO-buněk exprimujících receptorový protein 1 ml pufru pro každý test se do každé jamky přidá _ 490 μΙ stejného pufru. --------------------------------------------------------- -------- ---------------

2) Přidá se po 5 μΙ roztoku testované sloučeniny v množství 10'³ M až 1O’^{4 * * * * * 10} M. K systému se přidá 5 μ! značeného ligandu a následuje inkubace za teploty místnosti po dobu jedné hodiny. Pro stanovení množství nespecifické vazby se k systému, místo testované sloučeniny, přidá 5 μΙ ligandu v množství 10‘³ M.

3) Reakční směs se z jamky odstraní a třikrát se promyje 1 ml pufru pro test. Značený ligand navázaný na buňky se rozpustí v 0,2N NaOH -1% SDS a potom se smíchá se 4 ml kapalného scintilátoru A (vyráběný Wako Pure Chemical, Japonsko).

4) Kapalinovou scintilační sondou (vyráběna Beckmann) se změří radioaktivita a podle následující rovnice se vypočte PMB (procento maximálního navázání):

PMB = [(B - NSB)/(B₀ -NSB)]. 100 , kde PMB znamená procento maximální vazby,

B znamená hodnotu, když se přidá vzorek,

NSB znamená nespecifickou vazbu a

Bo znamená maximální vazbu.

‘ 78 u*

Sloučenina nebo její sůl, která se může získat způsobem testování nebo pomocí testovací sestavy podle předloženého vynálezu, znamená sloučeninu, která funguje pro změnění vlastností vazby mezi ligandem (ligandovým peptidem podle předloženého vynálezu) a receptorovým proteinem nebo podobnou sloučeninu podle předloženého vynálezu. Podrobněji - tato sloučenina zahrnuje a) sloučeninu vykazující aktivity stimulující buňky zprostředkované receptorem spojeným s G proteinem (např. aktivity, které podporují nebo potlačují uvolňování arachidonové kyseliny, uvolňování acetylcholinu, uvolňování intracelulámího Ca²*, produkci intracelulámího cAMP, produkci intracelulámího cGMP, produkci inositolfosfátu, změnu membránového potenciálu buňky, fosforylaci intracelulámích proteinů, aktivaci c-fos a snížení pH) (tak zvaní agonisté na receptorový protein podle předloženého vynálezu), b) sloučeniny, které nemají tuto aktivitu stimulace buňky (tak zvaní antagonisté na receptorový protein podle předloženého vynálezu), a c) sloučeniny, které snižují ζ vlastnosti vazby mezi ligandem (ligandovým peptidem podle předloženého vynálezu) v a receptorovým proteinem podle předloženého vynálezu.

Mezi příklady takových sloučenin patří peptidy, proteiny, nepeptidové sloučeniny, syntetické sloučeniny a fermentační produkty. Tyto sloučeniny mohou být buď nové nebo jsou obecně známé.

Agonista na receptorový protein nebo podobnou sloučeninu podle předloženého vynálezu má stejnou fysiologickou aktivitu jako má ligand (ligandový peptid podle předloženého vynálezu) na receptorový protein nebo podobnou sloučeninu podle předloženého vynálezu. Proto je agonista užitečný jako bezpečný a nízkotoxický farmaceutický přípravek, podle ligandové aktivity.

Podrobněji, agonista na receptorový protein nebo podobnou sloučeninu podle předloženého vynálezu má aktivitu potlačující metastáze rakoviny a je tedy užitečný pro profylaxi nebo terapii všech rakovin (např. rakoviny plic, rakoviny žaludku, rakoviny jater, rakoviny slinivky břišní, rakoviny tlustého střeva, rakoviny konečníku, rako-

• · · • ·· • · · · • · · ··· ·· £

ΰ· viny tračníku, rakoviny prostaty, rakoviny vaječníkú, rakoviny děložního hrdla, rakoviny prsu atd.).

Agonista na receptorový protein nebo podobnou sloučeninu podle předloženého vynálezu má také aktivitu spočívající v regulaci funkci placenty a je tedy užitečný pro profylaktické nebo terapeutické léčivo rakoviny cilie, zásnétě hroznové, invazivní zásnétě, spontánního potratu, fetální hypoplazie, dysbolismu cukrů, dysbolismu tuků nebo indukce porodu.

Antagonista receptorového proteinu nebo podobné sloučeniny podle předloženého vynálezu může potlačit fýsiologickou aktivitu, kterou má ligand (ligandový _________peptid podle předloženého vynálezu) na receptorový protein nebo podobnou slou------------ceninu podle předloženého vynálezu. Antagonista je tedy užitečný jako bezpečný a ' nízkotoxický farmaceutický přípravek pro potlačování ligandové aktivity.

Sloučenina, která snižuje vazbu mezi ligandem (ligandovým peptidem podle předloženého vynálezu) a receptorovým proteinem podle předloženého vynálezu, je užitečná jako bezpečný a nízkotoxický farmaceutický přípravek pro snížení fysiologické aktivity, kterou má ligand (ligandový peptid podle předloženého vynálezu) na receptorový protein nebo podobnou sloučeninu podle předloženého vynálezu.

Jestliže se sloučenina nebo její sůl, které lze získat způsobem testování nebo testovací sestavou podle předloženého vynálezu, používá jako shora popsaný farmaceutický přípravek, pro výrobu tohoto prostředku se používají konvenční zařízení. Například se sloučenina nebo její sůl mohou vyrobit ve formě tablet, tobolek, elixírů, mikrotobolek, sterilních roztoků, suspenzí atd.

Jelikož takto získaný přípravek je bezpečný a nízkotoxický, může se podávat člověku nebo savcům (např. kryse, myši, králíkovi, ovci, praseti, hovězímu dobytku, kočce, psu, opici atd.).

*· • · · * · • · ♦·· · · • · · · · ·

Dávka sloučeniny nebo její soli (v případě agonisty) se mění v závislosti na subjektu, kterému se podává, podle cílového orgánu, příznaku, cesty podávání atd. U orálního podávání je dávka normálně asi 0,1 až asi 100 mg, s výhodou asi 1,0 až asi 50 mg, výhodněji asi 1,0 až asi 20 mg za den u pacienta s rakovinou (o hmotnosti 60 kg). U parenteralního podávání jediná dávka se mění podle závislosti na subjektu, kterému se podává, podle cílového orgánu, příznaku, způsobu podávání atd., ale je výhodné podávat účinnou složku intravenózně v denní dávce asi 0,01 až asi 30 mg, s výhodou asi 0,1 až asi 20 mg, výhodněji asi 0,1 až asi 10 mg u pacienta s rakovinou (o hmotnosti 60 kg). U jiných živočišných druhů je odpovídající podávaná dávka taková dávka, která se získá převodem na 60 kg hmotnosti.

6)_____Prostředek pro profylaxi a/nebo terapii různých onemocnění zahrnujících sloučeninu (agonistu, antagonistu), která mění vazebné vlastnosti mezi receptorovým proteinem nebo podobnou sloučeninou podle předloženého vynálezu a ligandem (ligandovým peptidem podle předloženého vynálezu)

Jak bylo shora uvedeno, receptorový protein nebo podobná sloučenina podle předloženého vynálezu hraje důležitou úlohu in vivo, jako je aktivita potlačující metastáze rakoviny. Sloučenina (agonista, antagonista), která mění vlastnost vazby mezi receptorovým proteinem nebo podobnou sloučeninou podle předloženého vynálezu a ligandem (ligandovým peptidem podle předloženého vynálezu), se může používat pro profylaktické a/nebo terapeutické činidlo onemocnění souvisejících s dysfunkcí receptorového proteinu nebo podobné sloučeniny podle předloženého vynálezu.

Jestliže se shora uvedená sloučenina používá jako farmaceutický prostředek pro prevenci a/nebo léčení onemocnění souvisejících s dysfunkcí receptorového proteinu nebo podobné sloučeniny podle předloženého vynálezu, mohou se pro výrobu prostředku použít konvenční zařízení.

··

Například sloučenina se může vyrábět ve formě tablet potažených cukrem, tobolek, elixírů nebo mikrotobolek pro orální podávání a pro parenterální podávání ve formě injektovatelných přípravků, jako je sterilní roztok a suspenze ve vodě nebo s jinou farmaceuticky přijatelnou kapalinou. Tyto přípravky lze vyrábět šmidláním sloučeniny s fysiologicky přijatelným známým nosičem, ochucovacím činidlem, ředidlem, vehikulem, antiseptickým činidlem, stabilizačním činidlem, pojivém atd. v požadované jednotkové dávkové formě obecně přijatelným způsobem pro výrobu farmaceutických přípravků. Účinná složka v přípravku je regulována na takovou dávku, že se příslušná dávka získá v daném specifikovaném rozmezí.

Mezi přísady mísitelné s tabletami nebo tobolkami patří vazebné činidlo, jako je želatina, kukuřičný škrob, tragant a arabská guma, excipiens, jako je krystalická celulosa, bobtnací činilo, jako je kukuřičný škrob, želatina a kyselina alginová, mazadlo, jako je stearát hořečnatý, sladící činidlo, jako je sacharosa, laktosa a sacharin, a ochucovací činidlo, jako je máta pepmá, akamonový olej a višňový extrakty. Jestliže jednotková dávka je ve formě tobolek, mohou se dále použít kapalné nosiče, jako jsou oleje a tuky, společně se shora popsanými přísadami. Sterilní prostředek pro injekce může být sestaven obecně známým způsobem používaným při výrobě farmaceutických prostředků, např. rozpuštěním nebo suspendováním účinných složek v ředidle, jako je voda pro injekce s přirozeně se vyskytujícím rostlinným olejem, jako je sezamový olej a kokosový olej atd., takže se vyrobí farmaceutický prostředek. Mezi příklady vodného media pro injekce patří fysiologický solný roztok a isotonický roztok obsahující glukosu a další pomocná činidla (např. D-sorbitol, D-mannitol a chlorid sodný) a mohou se používat v kombinaci s příslušnými činidly napomáhajícími rozpouštění, jako je alkohol (např. ethanol), polyalkohol (např. propylenglykol a polyethylenglykol), neiontovým povrchově aktivním činidlem (např. polysorbátem 80™ a HCO-50) atd. Jako olejové medium se může používat například sezamový olej a sojový olej, které se mohou používat v kombinaci s činidlem napomáhajícím rozpouštění, jako je benzylbenzoát a benzylalkohol.

·· ··♦· ··

* ⁸²

Dále se může sestavovat také shora popsané profylaktické/terapeutické činidlo spolu s pufrem (např. fosforečnanovým pufrem a pufrem octanu sodného), uklidňujícím činidlem (např. benzalkoniumchloridem a hydrochloridem prokainu), stabilizátorem (např. lidským sérovým albuminem a polyethylenglykolem), ochranným činidlem (např. benzylakoholem a fenolem), antioxidačním činidlem atd. Takto vyrobená kapalina pro injekce se normálně naplní do příslušné ampule.

_______ Dávka sloučeniny nebo její soli (v případě agonisty) se mění podle subjektu, kterému se podává, podle cílového orgánu, příznaku, cesty podávání atd. U orálního r podávání je dávka normálně asi 0,1 až asi 100 mg, s výhodou asi 1,0 až asi 50 mg, í výhodněji asi 1,0 až asi 20 mg za den u pacienta s rakovinou (o hmotnosti 60 kg). U parenterálního podávání se jediná dávka mění podle závislosti na subjektu, kterému se podává, podle cílového orgánu, příznaku, způsobu podávání atd., ale je výhodné podávat účinnou složku intřavenózně v denní dávce asi 0,01 až asi 30 mg, s výhodou asi 0,1 až asi 20 mg, výhodněji asi 0,1 až asi 10 mg u pacienta s rakovinou (o hmotnosti 60 kg). U jiných živočišných druhů je odpovídající podávaná dávka taková dávka, která se získá převodem na 60 kg hmotnosti.

7) Kvantitativní vyhodnocení receptorového proteinu nebo podobné sloučeniny podle předloženého vynálezu nebo ligandového peptidu podle předloženého vynálezu

Protilátka na receptorový protein nebo podobnou sloučeninu podle předloženého vynálezu nebo na ligandový peptid podle předloženého vynálezu je schopna specificky rozpoznávat receptorový protein nebo podobnou sloučeninu podle předloženého vynálezu nebo ligandový peptid podle předloženého vynálezu a tedy se může používat pro kvantitativní vyhodnocení receptorového proteinu nebo

podobné sloučeniny podle předloženého vynálezu nebo ligandového peptidu podle předloženého vynálezu v roztoku testovaného vzorku, zvláště při kvantitativním hodnocení sendvičovým imunotestem. Předložený vynález tedy poskytuje například následující způsoby kvantitativního hodnocení:

i) způsob kvantitativního hodnocení receptorového proteinu nebo podobné sloučeniny podle předloženého vynálezu nebo ligandového peptidu podle předloženého vynálezu v testovaném kapalném vzorku, který obsahuje kompetitivné reagující protilátku na receptorový protein nebo podobnou sloučeninu podle předloženého vynálezu nebo ligandový peptid podle předloženého vynálezu, testovaný kapalný vzorek a značený receptorový protein nebo podobnou sloučeninu podle předloženého vynáíezu nebo značený ligandový peptid podle předloženého vynálezu, a měření poměru značeného receptorového proteinu nebo podobné sloučeniny podle předloženého vynálezu nebo značeného ligandového peptidu podle předloženého vynálezu navázaného na uvedenou protilátku, a ii) způsob kvantitativního hodnocení receptorového proteinu nebo podobné sloučeniny podle předloženého vynálezu nebo ligandového peptidu podle předloženého vynálezu v testovaném kapalném vzorku, který obsahuje současně nebo kontinuálně reagující testovaný kapalný vzorek s protilátkou na receptorový protein nebo podobnou sloučeninu podle předloženého vynálezu nebo ligandový peptid podle předloženého vynálezu imobilizovaný na nerozpustném nosiči a značenou protilátku na receptorový protein nebo podobnou sloučeninu podle předloženého vynálezu nebo ligandový peptid podle předloženého vynálezu, a měření aktivity značeného činidla na nerozpustném nosiči.

Ve shora popsaném způsobu ii) je výhodné, aby jedna protilátka byla schopna rozpoznávat N-koncovou oblast receptorového proteinu nebo podobné sloučeniny podle předloženého vynálezu nebo ligandového peptidu podle předloženého vynálezu, zatímco jiná protilátka je schopna rozpoznávat C-koncovou oblast receptoro-

, 84 vého proteinu nebo podobné sloučeniny podle předloženého vynálezu nebo ligandového peptidu podle předloženého vynálezu.

Monoklonální protilátka na receptorový protein nebo podobnou sloučeninu podle předloženého vynálezu nebo ligandový peptid podle předloženého vynálezu (zde dále někdy nazývaná jako monoklonální protilátka podle předloženého vynálezu) se může používat pro testování receptorového proteinu nebo podobné sloučeniny podle předloženého vynálezu nebo ligandového peptidu podle předloženého vynálezu. Navíc receptorový protein nebo podobná sloučenina podle předloženého vynálezu nebo ligandový peptid podle předloženého vynálezu může být detegován také pomocí vybarvování tkání. Pro tyto účely se může použít také molekula protilátky jako taková nebo F(abj₂, Fab' nebo Fab frakce molekuly protilátky. Neexistuje žádné zvláštní omezení způsobu testování používajícího protilátku na receptorový protein nebo podobnou sloučeninu podle předloženého vynálezu nebo ligandový peptid podle předloženého vynálezu; lze použít jakýkoliv způsob, pokud se týká způsobu, v němž může být množství protilátky, antigenu nebo komplexu protilátka-antigen detegováno chemickými nebo fyzikálními prostředky, při čemž závisí na nebo odpovídá množství antigenu (např. množství receptorového proteinu nebo podobné sloučeniny podle předloženého vynálezu nebo ligandového peptidu podle předloženého vynálezu) v testovaném kapalném vzorku, který má být testován. Potom se vypočte použitím standardní křivky připravené standardním roztokem, který obsahuje známé množství antigenu. S výhodou se používá například nefrometrie, kompetitivní způsob, imunometrický způsob a sendvičový způsob; v pojmech citlivosti a specifičnosti je zvláště výhodný sendvičový způsob, který bude popsán později.

Příklady značícího činidla používaného ve způsobu testování použitím značící látky jsou radioisotopy, enzymy, fluorescenční látky, luminiscenční látky atd. Příklady radioisotopů jsou [³H], [¹²⁵l], [¹³¹l], [¹³C] atd. Výhodnými příklady enzymů jsou ty enzymy, které jsou stabilní a které mají vysokou specifickou aktivitu, mezi něž patří β-galaktosidasa, β-glukosidasa, alkalická fosfotasa, peroxidasa a jablečnanová dehydrogenasa. Příklady fluorescenční látky jsou fluoreskamin, isothiokyanát fluoresceinu

⁸⁵ atd. Příklady luminiscenčních látek jsou luminol, luminolový derivát, luciferin, lucigenin atd. Dále se může pro navázání protilátky nebo antigenu na značící činidlo použít také biotin-avidinový systém.

Při imobilizaci antigenů nebo protilátek se může použít fyzikální adsorpce. Rovněž se může použít také chemická vazba, která se konvenčně používá pro imobilizaci proteinů nebo enzymů. Mezi příklady nosiče patří nerozpustné polysacharidy, jako jsou agarosa, dextran a celulosa, syntetické pryskyřice, jako je polystyren, polyakrylamid a silikon, sklo atd.

U sendvičového způsobu se testovaný kapalný vzorek nechá zreagovat s imobilizovanou monoklonální protilátkou podle předloženého vynálezu (první reakce), potom se nechá zreagovat se značenou monoklonální protilátkou podle předloženého vynálezu (druhá reakce) a testuje se aktivita značícího činidla na nerozpustném nosiči, při čemž se stanoví množství receptorového proteinu nebo ligandového peptidu podle předloženého vynálezu v testovaném kapalném vzorku. První a druhá reakce se mohou provádět v opačném pořadí, současně nebo postupné s časovým intervalem. Typ značícího činidla a způsob imobilizace mohou být stejné jako jsou ty, které jsou shora popsány.

Při imunotestu sendvičovým způsobem není vždy nutné, aby protilátka použitá pro značenou protilátku a pro pevnou fázi musela být jednoho typu nebo jednoho druhu, ale kvůli zlepšení citlivosti měření atd. lze použít směs dvou nebo více protilátek.

Při způsobu testování receptorového proteinu nebo podobné sloučeniny podle předloženého vynálezu nebo ligandového peptidu podle předloženého vynálezu sendvičovým způsobem podle předloženého vynálezu výhodné monoklonální protilátky podle předloženého vynálezu použité pro první a druhou reakci jsou protilátky, jejichž vazebná místa na receptorový protein nebo podobnou sloučeninu podle předloženého vynálezu jsou navzájem různá. Protilátky použité v první a druhé reakci

jsou tedy ty protilátky, v nichž protilátka použitá v druhé reakci rozpoznává C-koncovou oblast receptorového proteinu nebo podobné sloučeniny, protilátka rozpoznávající jiné místo než jsou C-koncové oblasti, např. rozpoznávající N-koncovou oblast, se s výhodou používá v první reakci.

Monoklonální protilátka na receptorový protein nebo podobnou sloučeninu podle předloženého vynálezu nebo ligandový peptid podle předloženého vynálezu se může použít v jiném testovacím systému než je sendvičový způsob, jako je kompetitivní způsob, imunometrický způsob a nefrometrie. U kompetitivního způsobu se antigen v testovaném roztoku a značený antigen nechají kompetitivně zreagovat s protilátkou, potom se nezreagovaný značený antigen (F) a značený antigen navázaný na protilátku (B) oddělí (tj. rozdělení B/F) a změří se značené množství bucf B nebo F, aby se stanovilo množství antigenu v testovaném roztoku. Pn reakcích tohoto způsobu existuje způsob kapalné fáze, při kterém se jako protilátka používá rozpustná protilátka a rozdělení B/F se provádí polyethylenglykolem, při čemž se používá druhá protilátka na protilátku, a způsob pevné fáze, v němž se imobilizovaná protilátka používá jako první protilátka nebo se rozpustná protilátka použije jako první protilátka a imobilizovaná protilátka se používá jako druhá protilátka.

Pň imunometrickém způsobu se antigen v testovaném roztoku a imobiíizovaný antigen nechají kompetitivně zreagovat s daným množstvím značené protilátky a následuje oddělení pevné fáze od kapalné fáze; nebo se nechá zreagovat antigen v testovaném roztoku a nadbytečné množství značené protilátky, potom se přidá imobiíizovaný antigen, aby se navázala nezreagovaná značená protilátka na pevnou fázi a pevná fáze se oddělí od kapalné fáze. Potom se změří značené množství jakékoliv fáze, aby se stanovilo množství antigenu v testovaném roztoku.

U nefrometrie se měří množství nerozpustného sedimentu, který se vyrobí jako výsledek reakce antigen-antigen v gelu nebo v roztoku. I když je množství antigenu v testovaném roztoku malé a získá se pouze malé množství sedimentu, vhodně se může použít laserová nefrometrie používající laserový rozptyl.

·· ···♦ ·

» ··*

⁸⁷

Pň aplikování každého z těchto imunotestů na způsob testování podle předloženého vynálezu nejsou vyžadovány žádné zvláštní podmínky nebo pracovní postupy. Testovací systém pro receptorový protein nebo podobnou sloučeninu podle předloženého vynálezu nebo ligandový peptid podle předloženého vynálezu může být zkonstruován vedle podmínek nebo pracovních postupů konvenčně používaných pro každý z těchto způsobů, pň čemž se vezmou v úvahu technické úvahy zručného odborníka z oblasti techniky. Pro podrobnosti takových konvenčních technických prostředků lze odkázat na rozmanité souhrnné články, knihy s odkazy atd. (například Hiroshi lne (rad.): Radioimmunoassaf (publikováno Kodansha, 1974), Hiroshi lne (red.): Radioimmunoassay; Second Senes (publikováno Kodansha, 1979); Eiji Ishikawa a spol. (red.): Enzyme Immunoassaý' (publikováno Igaku Shoin, 1978); Eiji Ishikawa a.spol.(red.}: Enzyme lmmunoassaý'(druhé vydání) (publikováno lgaku Shoin, 1982); Eiji Ishikawa a spol. (red.)·. Enzyme Immunoassaý' (třetí vydání) (publikováno Igaku Shoin, 1987); Methods in Enzymologý', díl 70 (Immunochemical Techniques (část A)); tamtéž, díl 73 (Immunochemical Techniques (část B)); tamtéž, díl 74 (Immunochemical Techniques (část C)); tamtéž, díl 84 (Immunochemical Techniques (část D: Selected Immunoassays)); tamtéž, díl 92 (Immunochemical Techniques (část E: Monoclonal Antibodies and Generál Immunoassaý Methods)); tamtéž, díl 121 (Immunochemical Techniques (část I: Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies)) (publikováno Academie Press) atd.).

Jak bylo shora popsáno, receptorový protein nebo podobná sloučenina podle předloženého vynálezu nebo ligandový peptid podle předloženého vynálezu může být kvantitativné stanoven s vysokou citlivostí použitím protilátky podle předloženého vynálezu.

Dále pak receptorový protein nebo podobná sloučenina podle předloženého vynálezu nebo ligandový peptid podle předloženého vynálezu může být kvantitativně stanoven s vysokou citlivostí pň použití protilátky podle předloženého vynálezu tak, že diagnostikuje různá onemocnění související s dysfunkcí receptorového proteinu podle předloženého vynálezu.

• <4 e··· • · • ··♦

Protilátka na receptorový protein nebo podobnou sloučeninu podle předloženého vynálezu nebo ligandový peptid podle předloženého vynálezu se může používat pro specifické detegování receptorového proteinu nebo podobné sloučeniny podle předloženého vynálezu nebo ligandového peptidu podle předloženého vynálezu, které mohou být přítomny v roztoku testovaného vzorku, jako je tělesná kapalina, tkáň atd. Protilátka se může použít také pro přípravu kolony s protilátkou pro vyčištění receptorového proteinu nebo podobné sloučeniny podle předloženého vynálezu nebo ligandového peptidu podle předloženého vynálezu, detekci receptorového proteinu nebo podobné sloučeniny podle předloženého vynálezu ve frakcích po vyčištění a analýze chování na receptorový protein nebo podobnou sloučeninu podle předloženého vynálezu nebo ligandový peptid podle předloženého vynálezu v buňkách, které jsou zkoumány.-----.—----------------------------------—

8) Neutralizace protilátkou na receptorový protein nebo podobnou sloučeninu podle předloženého vynálezu nebo ligandový peptid podle předloženého vynálezu

Aktivita protilátky na receptorový protein nebo podobnou sloučeninu podle předloženého vynálezu nebo ligandový peptid podle předloženého vynálezu, která neutralizuje receptorový protein nebo podobnou sloučeninu podle předloženého vynálezu nebo ligandový peptid představuje aktivitu deaktivování funkce signální transdukce, které se účastní receptorový protein nebo podobná sloučenina nebo ligandový peptid. Proto jestliže má protilátka neutralizující aktivitu, může tato protilátka deaktivovat signální transdukci, které se účastní receptorový protein nebo podobná sloučenina nebo ligandový peptid, například aktivity stimulující buňky zprostředkované receptorovým proteinem (např. aktivit, které podporují nebo potlačují uvolňování arachidonové kyseliny, uvolňování acetylcholinu, uvolňování intracelulámího Ca²⁺, produkci intracelulámího cAMP, produkci intracelulámího cGMP, produkci inositolfosfátu, změny membránového potenciálu buňky, fosforylaci intracelulámích proteinů, aktivaci c-fos a snížení pH). Protilátka se tedy může používat pro prevenci

•		····		*
·· 4	• « ·	•	e	•	• ·
•	·· · ·	···	•	•	9
• ·	4 · · ·	•	• ·	•	•
·	4 · ·	•	•	•	•
4 4·	·· ··	···	··	• ··

a/nebo léčení onemocnění způsobených nadexpresí receptorového proteinu nebo ligandového peptidů.

9) Příprava živočichů obsahujících DNA, která kóduje receptorový protein podle předloženého vynálezu

Použitím DNA podle předloženého vynálezu se mohou připravit transgenní živočichové, kteří exprimují receptorový protein nebo podobnou sloučeninu podle předloženého vynálezu. Příklady těchto živočichů, kteří se mohou použít, jsou savci (např. krysa, myš, králík, ovce, prase, hovězí dobytek, kočka, pes, opice atd.). Zvláště výhodnými jsou myši a králíci.

Pro přenos DNA podle předloženého vynálezu do cílového živočicha se obecně s výhodou použije DNA v genové konstrukci ligované po směru vlákna promotoru schopného exprimovat DNA v živočišné buňce. Například, jestliže DNA pocházející od králíka podle předloženého vynálezu se přenáší například genovou konstrukcí, v níž je DNA ligována po směru vlákna promotoru, který může exprimovat DNA podle předloženého vynálezu pocházející ze živočicha, která je vysoce homologní s DNA podle předloženého vynálezu, mikroinjekčně se podá do králičího oplodněného vajíčka. Může se tedy popravit živočich s přenesenou DNA, který je schopen produkovat vysokou hladinu receptorového proteinu nebo podobné sloučeniny podle předloženého vynálezu. Příklady promotoru, který se může použít, jsou promotor odvozený od viru a všudypřítomný expresní promotor, jako je metallothionein, ale s výhodou jsou používány NGF genový promotor a enolasový genový promotor, které jsou specificky exprimovány v mozku.

Přenos DNA podle předloženého vynálezu ve stadiu oplodněné buňky vajíčka zajišťuje přítomnost DNA ve všech zárodečných a somatických buňkách v cílovém živočichovi. Přítomnost receptorového proteinu nebo podobné sloučeniny podle předloženého vynálezu v zárodečných buňkách v živočichovi s přenesenou DNA znamená, že všechny zárodečné a somatické buňky obsahují receptorový protein nebo podobnou sloučeninu podle předloženého vynálezu ve všech potomcích tohoto živočicha. Potomci tohoto živočicha, kteří přebírají gen, obsahují receptorový protein nebo podobnou sloučeninu podle předloženého vynálezu ve všech zárodečných a somatických buňkách.

Transgenní živočich, do kterého je DNA podle předloženého vynálezu přenesena, může být podroben spáření a rozmnožení na generace za obvyklých podmínek množení jako živočich nesoucí DNA, po potvrzení, že gen může být stabilně zachován. Navíc, samčí i samičí živočichové, kteří mají žádanou DNA, se spáří tak, že poskytují homozygota, který má transdukovaný gen v obou homologních chromosomech a potom se samčí a samičí živočichové spáří tak, že lze takto množením vytvořit generace, jejichž potomci obsahují tuto DNA.----------------------------—~transgenní živočich, do kterého se přenese DNA podle předloženého vynálezu, je užitečný jako živočich pro testování agonisty nebo antagonisty na receptorový protein nebo podobnou sloučeninu podle předloženého vynálezu, jelikož receptorový protein nebo podobná sloučenina podle předloženého vynálezu je hojně exprimována.

Transgenní živočich, do kterého se přenese DNA podle předloženého vynálezu, může být použit také jako buněčný zdroj pro tkáňovou kulturu. Receptorový protein nebo podobná sloučenina podle předloženého vynálezu může být analyzován například přímou analýzou DNA nebo RNA ve tkáních myši s přenesenou DNA podle předloženého vynálezu nebo analyzováním tkání obsahujících receptorový protein exprimovaný z genu. Buňky ze tkání, které obsahují receptorový protein nebo podobnou sloučeninu podle předloženého vynálezu, se kultivují technikou standardní tkáňové kultury. Použitím těchto buněk lze studovat funkci buněk z tkání, které je obvykle obtížné kultivovat, například buněk pocházejících z mozku a periferních tkání. Použitím těchto buněk je možné vybrat taková farmaceutická činidla, která například zvyšují funkci různých tkání. Když je dostupná buněčná linie s vysokou expresí, může být z

této buněčné linie isolován a vyčištěn receptorový protein nebo podobná sloučenina podle předloženého vynálezu.

V popisu a obrázcích jsou uvedeny kódy nukleotidů a aminokyselin v souladu s IUPAC-IUB komisí pro biochemickou nomenklaturu obvyklými kódy z oblasti techniky, jejichž příklady jsou uvedeny níže. U aminokyselin, které mohou mít optický isomer, je přítomna L forma, pokud není jinak uvedeno.

DNA:	deoxyribonukleová kyselina
cDNA: A:	komplementární deoxyribonukleová kyselina adenin

Tť----G: C: RNA: mRNA: dATP: dTTP: dGTP: dCTP: ATP: EDTA: SDS: Gly: Ala: Val: Leu: lle: Sec Thc Cys:

thymin -----------------------guanin cytosin ribonukleová kyselina mesengerová ribonukleová kyselina dexoxyadenosin-trifosfát deoxythymidin-trifosfát deoxyguanosin-trifosfát deoxycytidin-trifosfát adenosin-trifosfát kyselina ethylendiamintetraoctová dodecylsulfát sodný glycin alanin valin leucin isoleucin serin threonin cystein

Met: methionin

Glu: kyselina glutamová

Asp: kyselina aspartová

Lys: lysin

Arg: arginin

His: histidin

Phe: fenylalanin

Tyr tyrosin

Trp: tryptofan

Pro: prolin

Asn: asparagin

Gin:---------glutamin----------------------------pGlu: pyroglutamová kyselina

Me: methylová skupina

Et: ethylová skupina

Bu: butylová skupina

Ph: fenylová skupina

TC: thiazolidin-4(R)-karboxamidová skupina

Substituenty, chránící skupiny a reakční činidla obvykle používaná v tomto spisu jsou označena níže uvedenými kódy.

Tos:	p-toluensulfonyl
CHO:	formyl
Bzl:	benzyl
CIzBzl:	2,6-dichlorbenzyl
Bom:	benzyloxymethyl
Z:	benzyloxykarbonyl
Cl-Z:	2-chlorbenzyloxykarbonyl
Br-Z:	2-brombenzyloxykarbonyl
Boc:	terc.butoxykarbonyl

DNP: dinitrofenol

Trt: trityl

Bum: terc.butoxymethyl

Fmoc: N-9-fluorenylmethoxykarbonyl

HOBt: 1-hydroxybenztriazol

HOOBt: 3,4-dihydro-3-hydroxy-4-oxo-1,2,3-benzotriazin

HONB: 1 -hydroxy-5-norbomen-2,3-dikarboximid

DCC: Ν,Ν'-dichlorhexylkarbodiimid

BHA: benzhydrylamin

MeBzl: 4-methylbenzyl

OcHex: cyklohexylester

NMP:—---N-methylpyrrolidon --------------------------------------TFA: trifluoroctová kyselina

Čísla identifikující sekvence (sekv, id. č.) v seznamu sekvencí tohoto spisu znamenají následující sekvence.

Sekv. id. č. 1

Aminokyselinová sekvence receptorového proteinu spojeného s G proteinem rOT7T175 podle předloženého vynálezu pocházejícího z krysího malého mozku.

Sekv. id. č. 2

Nukleotidová sekvence cDNA kódující receptorový protein spojený s G proteinem ΌΤ7Τ175 podle předloženého vynálezu z krysího malého mozku obsahující aminokyselinovou sekvenci představovanou sekvencí sekv. id. č. 1.

Sekv. id. č. 3

Nukleotidová sekvence primeru 1 použitého pro klonování cDNA kódující receptorový protein spojený s G proteinem ΓΌΤ7Τ175 podle předloženého vynálezu z krysího malého mozku.

• ·· ·· ···· ·· • · · · · · · · · ·

Sekv. id. č. 4

Nukleotidová sekvence primeru 2 použitého pro klonování cDNA kódující receptorový protein spojený s G proteinem hOT7T175 podle předloženého vynálezu z krysího malého mozku.

Sekv. id. č. 5

Aminokyselinová sekvence receptorového proteinu spojeného s G proteinem hOTTT 175 podle předloženého vynálezu z lidského mozku.

Sekv. id. č. 6

Nukleotidová sekvence cDNA kódující receptorový protein spojený s G proteinem hOT7T175 podle předloženého vynálezu z lidského mozku obsahující aminokyselinovou sekvenci představovanou sekvencí sekv. id. č. 5.

Sekv. id. č. 7

Nukleotidová sekvence sondy použité pro klonování cDNA kódující receptorový protein spojený s G proteinem hOT7T175 podle předloženého vynálezu z lidského mozku.

Sekv. id. č. 8

Nukleotidová sekvence primeru 1 použitého pro klonování cDNA kódující receptorový protein spojený s G proteinem hOT7T175 podle předloženého vynálezu z lidského mozku.

Sekv. id. č. 9

Nukleotidová sekvence primeru 2 použitého pro klonování cDNA kódující receptorový protein spojený s G proteinem hOT7T175 podle předloženého vynálezu z lidského mozku.

Sekv. id. č. 10 r

Aminokyselinová sekvence peptidu (1 až 54) popsaného v příkladu 3.

Sekv. id. č. 11

Aminokyselinová sekvence peptidu (40 až 54) popsaného v příkladu 3.

Sekv. id. č. 12

Aminokyselinová sekvence peptidu (45 až 54) popsaného v příkladu 3.

Sekv. id. č. 13

Aminokyselinová sekvence peptidu (46 až 54) popsaného v příkladu 3.

Sekv. id. č. 14

Aminokyselinová sekvence peptidu (47 až 54) popsaného v příkladu 3.

Sekv id. č. 15

Nukleotidové sekvence DNA kódující aminokyselinovou sekvenci uvedenou jako sekvence sekv. id. č. 10.

Sekv. id. č. 16

Nukleotidová sekvence DNA kódující aminokyselinovou sekvenci uvedenou jako sekvence sekv. id. č. 11.

Sekv. id. č. 17

Nukleotidová sekvence DNA kódující aminokyselinovou sekvenci uvedenou jako sekvence sekv. id. č. 12.

Sekv. id. č. 18

Nukleotidová sekvence DNA kódující aminokyselinovou sekvenci uvedenou jako sekvence sekv. id. č. 13.

Sekv. id. č. 19

Nukleotidová sekvenče DNA kódující aminokyselinovou sekvenci uvedenou jako sekvence sékv. id. č. 14.

Sekv. id. č. 20

Aminokyselinová sekvence produktu KiSS-1 popsaného v příkladu 3.

Sekv. id. č. 21

Aminokyselinová sekvence peptidu (48 až 54) popsaného v příkladu 3.

Sekv. id. č. 22

Nukleotidová sekvence DNA kódující aminokyselinovou sekvenci uvedenou jako sekvence sekv. id. č. 21.

Escheríchia coli transformant DG10B/pAK-rOT175 získaný v níže popsaném příkladu 1 byl uložen u Ministerstva pro mezinárodní obchod a průmysl, Agentury pro průmyslovou vědu a technologii, Národního ústavu pro biovědy a lidskou technologii (Ministry of Intemational Trade and Industry, Agency for Industrial Science and Technology, National Institute of Bioscience and Human Technology (NIBH)) pod přístupovým číslem FERM BP-6553 21. října 1998 a u Ústavu pro fermentaci, Osaka (Institute for Fermentation, Osaka; IFO) pod přístupovým číslem IFO 16 209 1. října 1998.

Escheríchia coli transformant DG1 OB/pCMV-hOT 175 získaný v níže popsaném příkladu 2 byl uložen u Ministerstva pro mezinárodní obchod a průmysl, Agentury pro průmyslovou vědu a technologii, Národního ústavu pro biovědy a lidskou technologii (Ministry of Intemational Trade and Industry, Agency for Industrial Science and Technology, National Institute of Bioscience and Human Technology (NIBH)) pod přístupovým číslem FERM BP-6648 21. února 1999 a u Ústavu pro fermentaci, Osaka (Institute for Fermentation, Osaka; IFO) pod přístupovým číslem IFO 16 258 9. února 1999.

Příklady provedení vynálezu

Předložený vynález je níže popsán podrobné pomocí příkladů, ale bez úmyslu omezit na ně rozsah předloženého vynálezu. Způsoby genové manipulace používající Escheríchia coli byly prováděny podle způsobů popsaných v Molekulárním klonování.

·· · · • ·

Příklad 1

Klonování cDNA kódující receptorový protein spojený s G proteinem pocházející z krysího malého mozku a stanovení nukleotidové sekvence

Použitím cDNA krysího malého mozku jako templátu a dvou primerů, konkrétně primeru 1 (sekv. id. č. 3) a primeru 2 (sekv. id. č. 4) se provede PCR. Reakční roztok ve shora uvedené reakci sestával z 1/10 objemu cDNA pro templát, 1/50 objemu směsi Advantage cDNA Polymerase Mix (Clontec lne ), 0,2 μΜ primeru 1 (sekv. id. č. 3), 0,2 μΜ primeru 2 (sekv. id. č. 4), 200 μΜ dNTP a pufru přidaného k enzymu tak, aby konečný objem byl 50 μΙ. Pň PCR reakci 1) reakční roztok se zahřívá 2 minuty na 94 °C, 2) cyklus zahřívání na 94 °C po dobu 30 vteřin s následujícími 2 minutami při 72 °C se třikrát zopakuje, 3) cyklus zahřívání na 94 °C po dobu 30 vteřin s následujícími 2 minutami při 68 °C se třikrát zopakuje, 4) cyklus zahřívání na 94 °C po dobu 30 vteřin s následujícími 30 vteřinami při 64 °C a 2 minutami pň 68 °C se zopakuje tňcetkrát a 5) konečně se provádí prodlužovací reakce 8 minut pň 68 °C. Po ukončení PCR reakce se produkt subklonuje do plasmidového vektoru pCR2.1 (Invitrogen lne.) podle instrukcí pňpojených k sestavě TA cloning kit (Invitrogen lne.), který se pak zavede do Escherichia coli DH5a a provede se selekce klonů obsahujících cDNA na LB agarových plotnách obsahujících ampicilin. Sekvence každého klonu se analyzuje na získání cDNA sekvence (sekv. id. č. 2) kódující nový receptorový protein spojený s G proteinem. Nový receptorový protein spojený s G proteinem obsahující aminokyselinovou sekvenci (sekv. id. č. 1) odvozenou od cDNA byl označen rOT7T175.

Plasmid pAK-rOT7T175, v němž byla subklonována cDNA (sekv. id. č. 2) kódující receptorový protein spojený s G proteinem rOT7T175 podle předloženého vynálezu z krysího malého mozku byl zaveden do Escherichia coli DH10B podle obecně známého způsobu. Získal se transformant Escherichia coli DH10B/pAK-rOT175.

Příklad 2

Klonování cDNA kódující receptorový protein spojený s G proteinem pocházející z lidského mozku a stanovení nukleotidové sekvence

Klonování cDNA bylo prováděno podle protokolu GENE TRAPPER (Life Technologies, lne.). Po biotínylaci sondy (sekv. id. č. 7) byla sonda hybridizována jednovláknovou lidskou mozkovou cDNA knihovnou (Superscipt cDNA Library, Life Technologies, lne ). Takto získaný jednovláknový gen byl převeden na dvojvlákno použitím primeru 1 (sekv. id. č. 8). Po tom, co byl tento gen zaveden elektroporací do Escherichia coli DH1 OB, byl tento gen nechán růst na selekční plotně doplněné o ampicilin, aby se získaly transformanty. Elektroporace byla prováděna při napětí 1,8 kV použitím zařízení E. coli pulser (BIORAD, lne.). Takto získané transformanty byly podrobeny selekci kolonií PCR použitím sondy (sekv. id. č. 7) a primeru 2 (sekv. id. č. 9). Byl získán transformant E. coli DH10B/pCMF-hOT175. Nový receptorový protein spojený s G proteinem obsahující aminokyselinovou sekvenci (sekv. id. č. 5) odvozený od cDNA byl označen hOT7T175. U PCR kolonie reakční roztok sestával z 1/50 objemu směsi Advantage cDNA Polymerase Mix (Clontec lne.), 0,2 μΜ primeru 1 (sekv. id. č. 7), 0,2 μΜ primeru 2 (sekv. id. č. 9), 200 μΜ dNTP, 1/25 objemu DMSO a pufru přidaného k enzymu tak, aby konečný objem byl 10 μΙ. Při PCR reakci 1) reakční roztok se zahřívá 10 minut na 94 °C a 2) cyklus zahřívání na 94 °C po dobu 10 vteřin s následujícími 10 vteřinami při 60 °C a 1 minutou při 68 °C se zopakuje dvacet pětkrát. Po ukončení PCR reakce se produkt subklonuje do plasmidového vektoru pCR2.1 (Invitrogen lne.) podle instrukcí připojených k sestavě TA cloning kit (Invitrogen lne.), který se pak zavede do Escherichia coli DH10B. Potom se provede selekce klonů obsahujících cDNA na LB agarovém mediu obsahujícím ampicilin. Sekvence každého klonu se analyzuje na získání cDNA sekvence (sekv. id. č. 6) kódující nový receptorový protein spojený s G proteinem. Nový receptorový protein spojený s G proteinem obsahující aminokyselinovou sekvenci (sekv. id. č. 5) odvozený od cDNA byl označen hOT175.

• · · 99 ······

9 9 9 9 9 9 99

99 99 999 ··

Příklad 3

Testování peptidu aktivujícího rOT 175 (osiřelý receptor)

1-1 Syntéza peptidu

Peptid, který má sekvenci (sekv. id. č. 10) 54 aminokyselinových zbytků od 68 (Gly) do 121 (Phe) v produktu genu potlačujícího metastázi rakoviny (KiSS-1), nalezený v genové databázi může být syntetizován následujícím způsobem (při čemž peptid je zde dále označován jako peptid (1 až 54).

Navíc byly následujícím postupem syntetizovány C-koncové peptidy peptidu (1 až 54) (sekv. id. č. 10), konkrétně peptid (40 až 54) (sekv. id. č. 11), peptid (45 až 54) (sekv. id. č. 12), peptid (46 až 54) (sekv. id. č. 13), peptid (47 až 54) (sekv. id. č. 14), a peptid (48 až 54) (sekv. id. č. 21).

1) Příprava peptidu (40 až 54)

Komerčně dostupná pryskyřice p-methyl-BHA (0,77 mmolu/g pryskyřice) byla naplněna do reakční nádrže syntetizátoru peptidů ABI 430A. Potom byly do pryskyřice v tomto pořadí podle Boc-strategie (NMP-HOBt) syntézy peptidů zavedeny Boc-Phe, Boc-Arg(Tos), Boc-Leu, Boc-Gly, Boc-Phe, Boc-Ser(Bzl), Boc-Asn, Boc-Trp(CHO), Boc-Asn, Boc-Tyr(Br-Z), Boc-Asn, Boc-Pro, Boc-Leu, Boc-Asp(OcHex) a Boc-Lys(CI-Z), aby se získala žádaná chráněná peptidové pryskyřice. Tato pryskyřice, 0,12 g, byla míchána 60 minut při 0 °C v 10 ml bezvodého fluorovodíku, který obsahoval 1 ml p-kresolu a 1,2 ml 1,4-butandiolu. Potom byl fluorovodík oddestilován ve vakuu. Ke zbytku byl podán diethylether a sraženina byla odfiltrována. Ke sraženině byl pro extrakci přidán 50% vodný roztok kyseliny octové a nerozpustné materiály byly odstraněny. Když byl extrakt dostatečně zkoncentrován, byl koncentrát nanesen na kolonu (2,0 krát 80 cm) se Sephadexem (obchodní název) G-25 naplněnou 50% vodným roztokem kyseliny octové. Následovalo vyvíjení

100 stejným rozpouštědlem. Hlavní frakce byly spojeny a lyofilizovány. Získá se 40 mg bílých prášků. Polovina objemu těchto prášků byla nanesena na chromatografickou kolonu s obrácenými fázemi (2,6 krát 60 cm) naplněnou LiChropnepem (obchodní název) RP-18 s následujícím promytím 200 ml vody, která obsahuje 0,1% TFA. Potom byla prováděna eluce lineárním hustotním gradientem s 300 ml 0,1% TFA a 300 ml 0,1% TFA obsahující 33 % acetonitrilu. Hlavní frakce byly spojeny a lyofilizovány. Získá se tak 4,1 mg žádaného peptidu. Hmotnostní spektrum (M+H)⁺ 1869,9 (vypočteno 1969,9). Eluční doba na HPLC: 18,6 minuty. Podmínky na koloně: kolona: Wakosil 5C18T, 4,6 krát 100 mm, eluent: eluce lineárním hustotním gradientem s eluenty A/B od 95/5 do 45/55 s použitím vodné 0,1% TFA jako eluentu A a acetonitrilu obsahujícího 0,1% TFA (25 minut). Průtok: 1,0 ml/min.

2) Příprava peptidu (45 až 54)

Komerčně dostupná pryskyřice p-methyl-BHA (0,77 mmolu/g pryskyřice) byla naplněna do reakční nádrže syntetizátoru peptidů ABI 430A. Potom byly do pryskyřice v tomto pořadí podle Boc-strategie (NMP-HOBt) syntézy peptidů zavedeny Boc-Phe, Boc-Arg(Tos), Boc-Leu, Boc-Gly, Boc-Phe, Boc-Ser(Bzl), Boc-Asn, Boc-Trp(CHO), Boc-Asn a Boc-Tyr(Br-Z), aby se získala žádaná chráněná peptidová pryskyřice. Tato pryskyřice, 0,11 g, byla zpracována podobným způsobem jako ve shora uvedeném způsobu ad 1) pro odstraňování chránících skupin. Získá se tak 2,2 mg žádaného peptidu. Hmotnostní spektrum (M+H)⁺ 1302,5 (vypočteno 1302,6). Eluční doba na HPLC: 18,7 minuty. Podmínky na koloně: kolona: Wakosil 5C18T, 4,6 krát 100 mm, eluent: eluce lineárním hustotním gradientem s eluenty A/B od 95/5 do 45/55 s použitím vodné 0,1% TFA jako eluentu A a acetonitrilu obsahujícího 0,1 % TFA (25 minut). Průtok: 1,0 ml/min.

3) Příprava peptidu (46 až 54)

Komerčně dostupná pryskyřice p-methyl-BHA (0,77 mmolu/g pryskyřice) byla naplněna do reakční nádrže syntetizátoru peptidů ABI 430A. Potom byly do

101

• ·· 99 · ♦ • ♦·	99 • 9 9 9	• 9 99 9 99 9	·· · • · 99 • 99
99· 99	9 9	999	• 9 99 9

pryskyřice v tomto pořadí podle Boc-strategie (NMP-HOBt) syntézy peptidů zavedeny Boc-Phe, Boc-Arg(Tos), Boc-Leu, Boc-Gly, Boc-Phe, Boc-Ser(Bzl), Boc-Asn, Boc-Trp(CHO) a Boc-Asn, aby se získala žádaná chráněná peptidová pryskyřice. Tato pryskyřice, 0,11 g, byla zpracována podobným způsobem jako ve shora uvedeném způsobu ad 1) pro odstraňování chránících skupin. Získá se tak 3,4 mg žádaného peptidu. Hmotnostní spektrum (M+H)* 1139,6 (vypočteno 1139,6). Hluční doba na HPLC: 18,1 minuty. Podmínky na koloně: kolona: Wakosil 5C18T, 4,6 krát 100 mm, eluent: eluce lineárním hustotním gradientem s eluenty A/B od 95/5 do 45/55 s použitím vodné 0,1% TFA jako eluentu A a acetonitrilu obsahujícího 0,1% TFA (25 minut). Průtok: 1,0ml/min.

4) Příprava peptidu (47 až 54)

Komerčně dostupná pryskyřice p-methyl-BHA (0,77 mmolu/g pryskyřice) byla naplněna do reakční nádrže syntetizátoru peptidů ABI 430A. Potom byly do pryskyřice v tomto pořadí podle Boc-strategie (NMP-HOBt) syntézy peptidů zavedeny Boc-Phe, Boc-Arg(Tos), Boc-Leu, Boc-Gly, Boc-Phe, Boc-Ser(Bzl), Boc-Asn a Boc-Trp(CHO), aby se získala žádaná chráněná peptidová pryskyřice. Tato pryskyřice, 0,12 g, byla zpracována podobným způsobem jako ve shora uvedeném způsobu ad 1) pro odstraňování chránících skupin. Získá se tak 13,0 mg žádaného peptidu. Hmotnostní spektrum (M+H)* 1025,5 (vypočteno 1025,5). Eluční doba na HPLC: 17,6 minuty. Podmínky na koloně: kolona: Wakosil 5C18T, 4,6 krát 100 mm, eluent: eluce lineárním hustotním gradientem s eluenty A/B od 95/5 do 45/55 s použitím vodné 0,1% TFA jako eluentu A a acetonitrilu obsahujícího 0,1 % TFA (25 minut). Průtok: 1,0 ml/min.

5) Příprava peptidu (48 až 54)

Komerčně dostupná pryskyřice p-methyl-BHA (0,77 mmolu/g pryskyřice) byla naplněna do reakční nádrže syntetizátoru peptidů ABI 430A. Potom byly do pryskyřice v tomto pořadí podle Boc-strategie (NMP-HOBt) syntézy peptidů zavedeny

102 • 99 99 ·<♦· 99♦ • 99 9 · ·· 9 99 9 • 99 9 9 999 99·

Boc-Phe, Boc-Arg(Tos), Boc-Leu, Boc-Gly, Boc-Phe, Boc-Ser(Bzl) a Boc-Asn, aby se získala žádaná chráněná peptidová pryskyřice. Tato pryskyřice, 0,16 g, byla míchána v 10 ml bezvodého fluorovodíku spolu s 1 ml p-kresolu 60 minut při 0 ^QC. Reakční směs byla pak zpracována podobným způsobem jako ve shora uvedeném způsobu ad 1). Získá se tak 29,0 mg žádaného peptidu. Hmotnostní spektrum (M+H)⁺ 839,5 (vypočteno 839,5). Eluční doba na HPLC: 15,6 minuty. Podmínky na koloně: kolona: Wakosil 5C18T, 4,6 krát 100 mm, eluent: eluce lineárním hustotním gradientem s eluenty A/B od 95/5 do 45/55 s použitím vodné 0,1 % TFA jako eluentu A a acetonitrilu obsahujícího 0,1% TFA (25 minut). Průtok: 1,0 ml/min.

6) Příprava peptidu (1 až 54)

Peptid (1 až 54) se může připravit tak, že se komerčně dostupná pryskyřice p-methyl-BHA (0,77 mmolu/g pryskyřice) naplní do reakční nádrže syntetizátoru peptidů ABI 430A. Potom se v následujícím pořadí zavedou: Boc-Phe, Boc-Arg(Tos), Boc-Leu, Boc-Gly, Boc-Phe, Boc-Ser(Bzl), Boc-Asn, Boc-Trp(CHO), Boc-Asn, Boc-Tyr(Br-Z), Boc-Asn, Boc-Pro, Boc-Leu, Boc-Asp(OcHex), Boc-Lys(CI-Z), Boc-Glu(OcHex), Boc-Arg(Tos), Boc-GIn, Boc-Val, Boc-Leu, Boc-Val, Boc-Ala, Boc-Gly, Boc-GIn, Boc-Pro, Boc-Ala, Boc-Pro, Boc-lle, Boc-GIn, Boc-Arg(Tos), Boc-Ser(Bžl), Boc-His(Bom), Boc-Pro, Boc-Ala, Boc-Ser(Bzl), Boc-Leu, Boc-Gly, Boc-Pro, Boc-GIn, Boc-GIn, Boc-Arg(Tos), Boc-Ser(Bzl), Boc-Gly, Boc-Ser(Bzl), Boc-Ser(Bzl), Boc-Glu(OcHex), Boc-Pro, Boc-Pro, Boc-Pro, Box-Ser(Bzl), Boc-Leu, Boc-Ser(Bzl), Boc-Thr(Bzl) a Boc-Gly, aby se získala žádaná chráněná peptidová pryskyřice. Potom se z chráněné peptidové pryskyřice odstraní chránící skupiny stejně jako v ad 1) shora uvedeného způsobu výroby peptidu (40 až 54).

-2) Měření aktivity zvyšující koncentraci intracelulámího Ca iontu použitím FLIPR

Stabilní expresní buněčná linie rOT7T175 byla získána transdukcí expresního plasmidu pAK-rOT175 pro živočišnou buňku do buňky CHO/dhfr použitím sestavy CellPhect Transfection Kit (Amersham Pharmacia Biotech, lne.). Nejdříve se 240 ml ·♦ ♦

103 pufru A (připojený k sestavě CellPhect Transfection Kit) přidá k 9,6 mg plasmidové DNA rozpuštěné ve 240 ml destilované vody. Směs se pak míchá. Po tom, co se směs nechá 10 minut usazovat, se k směsi přidá 480 ml pufru B (připojený k sestavě CellPhect Transfection Kit). Směs se intenzivně míchá. Vytvoří se liposomy obsahující DNA. Potom se na 60mm Petriho misku naočkuje 4.10⁵ buněk CHO/dhfr (získané od ATCC). Po kultivování buněk v Hamově F-12 mediu (Nissui Seiyaku Co., Ltd.) doplněném 10% plodovým hovězím šerem (Bio Whittaker, lne.) 2 dny při 37 °C v 5 % plynného oxidu uhličitého se k buňkám v Petriho misce pnkape 480 ml liposomů. Po 6 hodinách kultivace buněk při 37 °C v 5 % plynného oxidu uhličitého se buňky dvakrát promyjí Hamovým F-12 mediem bez sera. K buňkám v Petriho misce se přidá 15 % glycerol a následuje zpracování pro dobu 2 minut. Buňky se opět dvakrát promyjí Hamovým F-12 mediem bez sera. Následuje inkubace v Hamově F-12 mediu doplněném 10 % plodového hovězího sera po dobu 15 hodin při 37 °C v 5 % plynného oxidu uhličitého. Buňky se dispergují zpracováním s trypsinem, aby se isolovaly z Petriho misky. Isolované buňky se naočkují na desku se šesti jamkami v množství 1,25.10⁴buněk/jamku a započne se s inkubací po dobu 15 hodin při 37 °C v Dulbeccem modifikovaném Eagleho mediu (DMEM) (Nissui Seiyaku Co., Ltd.) obsahujícím 10 % dialyzovaného plodového hovězího sera (JRH Bioscience, lne.) v 5 % plynného oxidu uhličitého. Plasmidem transdukóvané transformanty CHO buněk rostly v mediu, ale netransdukované buňky postupně zemřely. Medium bylo vyměněno první a druhý den, aby se odstranily zemřelé buňky. Sletováno bylo přibližně 20 kolonií transformantů CHO buněk, které si udržely růst osmý až desátý den po inkubaci. Ze selektovaných buněk byla isolována DNA použitím komerčně dostupné sestavy pro isolaci RNA. Aplikováním obecně známého způsobu RT-PCR na následující stupně byl vybrán dvacátý třetí klon rOT7T 175 exprimující CHO buňky (zde dále zkracovaný jako rOT7T175-23), který exprimuje receptorový gen rOT7T175 ve vysoké hladině.

Pro kontrolu byl použit 24. klon CHO buněk exprimující ETA (zde dále zkracovaný jako ETA24; viz Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 1996, 279, 675 až 685).

·· ·« · 9 · · 9 9 9 9

99 9 9 999 9 9

104

Byla stanovena aktivita zvyšující koncentraci intracelulámího Ca iontu syntetických peptidu získaných v ad 1-1) popsaná shora v rOT7T175-23 a ETA24 použitím FLIPR (Molecular Devices, lne.).

Jak rOT7T175-23 tak ETA24 buňky byly použity po subkultivování těchto buněk v DMEM doplněném 10 % dialyzovaného plodového hovězího sera (zde dále zkracováno jako dFBS). Buňky rOT7T175-23 a ETA24 byly suspendovány v mediu (10% dFBS-DME) v množství 15.10⁴ buněk/ml. Každých 200 μΙ (3,0.10⁴ buněk/200 μΙ) suspenze bylo naočkováno na desku s 96 jamkami pro FLIPR (černá deska s čirým dnem, Coster, lne.) dodávacím zařízením. Následuje inkubace přes noc pn 37 °C v inkubátoru s 5 % CO₂. Byly použity takto inkubované buňky (zde dále označované jako buňky z desky). Potom bylo smícháno 21 ml HANKS/HBSS (9,8 g Hankova media, 0,35 g hydrogenuhličitanu sodného, 20 ml 1M HEPES media; po upravení na pH 7,4 1N hydroxidem sodným byla směs sterilována filtrem, 210 μ! 250mM Probenecidu a 210 μΙ plodového hovězího sera (FBS) (HANKS/HBSS-Probenecid-FBS). Dále se dvě ampulky Fluo3-AM (50 pg/ampulku) rozpustí ve 42 μΙ dimethylsulfoxidu a 42 μΙ 20% pluronové kyseliny. Výsledný roztok se přidá ke 20 ml shora popsaného HANKS/HBSS-Probenecid-FBS a směs se promíchá. Když se odstraní kultivační roztok, k buňkám z desky se dodá 100 μΙ této směsi na každou jamku použitím osmistranné pipety. Následuje inkubace jednu hodinu při 37 °C v inkubátoru s 5 % CO₂(pigmentová náplň). Peptid se rozpustí v dimethylsulfoxidu na koncentraci 1.10’³ Μ. K 0,002 ml (1,10^1)/1) tohoto peptidového roztoku v dimethylsulfoxidu se pro zředění (konečná koncentrace 1.10⁵ M pro test aktivity) přidá 0,066 ml HANK/HBSS obsahujícího 2,5mM Probenecid a 0,2% BSA. Potom se pro zředění pňdá 0,009 ml dimethylsulfoxidu k 0,001 ml (1.10^1)/1) peptidového roztoku v dimethylsulfoxidu. Po dodání 0,002 ml tohoto ředění se k systému pro ředění přidá 0,066 ml HANK/HBSS obsahujícího 2,5mM Probenecid a 0,2% BSA (konečná koncentrace 1.1 θ'⁶ M). Podobně se v ředění pokračuje až na konečnou koncentraci 1,10’¹⁰ M a potom se toto ředění přenese na desku s 96 jamkami pro FLIPR (deska se dnem ve tvaru V, Coster, lne.) (zde dále označovaný jako vzorek z desky). Po ukončení pigmentového naplnění na buňky z desky se buňky z desky čtyřikrát promyjí promývacím pufrem, který byl

105 získán podáním 2,5 mM Probenecidu k HANK/HBSS použitím promývače desek, aby po promývání zůstalo 100 μΙ promývacího pufru. Buňky z desek a vzorek z desek se nastaví do FLIPRu. 0,05 ml vzorku ze vzorku z desek se automaticky přenese k buňkám z desek zařízením FLIPR, aby se podpořila odpověď buněk. Změny koncentrace intracelulámího iontu vápníku byly měřeny po dobu 180 vteřin.

Výsledky ukázaly, že peptidy syntetizované ve shora popsané části 1-1) indukovaly zvýšení koncentrace intracelulámího iontu vápníku specificky u rO I Z1175 exprimujících buněk. Ze srovnání křivek závislosti odpovědi na dávce (obr. 9) je jasné, že peptid (40 až 54) a peptid (45 až 54) vykazují nejvyšší aktivitu.

Průmyslová použitelnost

Receptorový protein spojený s G proteinem podle předloženého vynálezu, jeho částečný peptid nebo jeho soli stejně jako polynukleotid kódující totéž (např. DNA, RNA a jejich deriváty) se mohou použít: 1) pro stanovení ligandu (ligandového peptidu podle předloženého vynálezu) (agonisty), 2) pro přípravu protilátek a antiser pro ně, 3) pro konstrukci expresního systému rekombinantního receptorového proteinu, 4) pro vyvinutí testovacího systému vazby receptoru použitím expresního systému a testováním farmaceutické sloučeniny, která přichází v úvahu, 5) pro navržení léčiva na základě srovnání se strukturně podobným ligandem-receptorem, 6) jako reakční činidlo pro přípravu sondy nebo PCR primeru v genové diagnostice, 7) pro přípravu transgenních živočichů nebo 8) jako profylaktické/terapeutické činidlo v genové terapii.

ΛοΑ

1/14

Výpis sekvencí

<110> Takeda Chemica 1 Industries, Ltd.

Nový receptorový protein spojený s G proteinem, DNA a její ligand ,<130> 2562WOOP <150> JP 10-305949 <151> 1998-10-27 <150> JP 11-027710 <151> 1999-02-04 ' <150> JP 1.1-057.207 <151> 1999-03-04 <150> JP 11-276225 <151> 1999-09-29 <160> 22 <210> 1 <211> 396 <212> PRT <213> Rat <400> 1

Mel

Ala

Glu

Ala

Thr

Leu

Gly

Pro

Asn

Val

Ser

Trp

AI a

Pro

5

10

15

Ser

Asn

Ala

Ser

Gly

Cys

Pro

Gly

Cys

Gly

Val

Asn

Ala

Ser

Asp

Gly

20

25

30

Pro

Gly

Ser

Ala

Pro

Arg

Pro

Leu

Asp

Ala

Trp

Leu

Val

Pro

Leu

Phe

35

40

45

Phe

Ala

Leu

Met

Leu

Gly

Leu

Vaí

Gly

Asn

Ser

Leu

Val

Ile

. · 4 • 4

4 4444 ·

444

2/14 »4 * 4 4 4

444 44 444

. Phe

i Val

Pie

Cys

Arg

; His

Lys

His

Met

Gin

Thr

Val

Thr

Asn

Phe

Tyr

65

70

75

80

I le

Ala

Asn

Leu

Ala

Thr

Asp

Val

Thr

Phe

Leu

Cys

Val

85

·’. . -

. 90

95

Pro

Phe

Thr

Ala

Leu

J.yr

Pro

Leu

Pro

Thr

•;T.rp

.Val.

, Leu

Gly

Asp

.p-

100

-

1.05

110

Phe

Met

Cy.s

Lys

Phe

Val

Ásn

Tyr

I le

Gin

Val

Ser

Val

Gin

Ala

¹¹⁵

120

125

Thr

Cys

Ala

Th-r

-L-eu

Thr

Ala

Met

Ser

Val

Asp

Arg

Trp

Tyr

Val

Thr

130

135

140

Val

.Phe

Pro

Leu

Arg

Ala

Leu

His

Arg

Thr

Pro

Arg

Leu

Ala

Leu

145

150

155

160

Thr

•Val

Ser

Leu

Ser

I le

Trp

Val

Gly

Ser

Ala

Val

Ser

‘Ala

Pro

165

170

-...

'175

Val

Leu

AI a

Leu

His

Arg

Leu

Ser

Pro

Gly

Pro

His

Thr

Tyr

Cys

Ser

180

185

190

Glu

Ala

Phe

Pro

Ser

Arg

Ala

Leu

Glu

Arg

Ala

Phe

Ala

Leu

Tyr

Asn

195

200

205

Leu

Ala

Leu

Tyr

Leu

Pro

Leu

Ala

Thr

Cys

Ala

Cys

Tyr

210

215

220

Gly

Ala

Met

Leu

Arg

His

Leu

Gly

Arg

Ala

Val

Arg

Pro

Ala

Pro

225

230

235

240

Thr

Asp

Gly

Ala

Leu

Gin

Gly

Gin

Leu

Ala-

Gin

Arg

Ala

Gly

Ala

245

250

255

Val

Arg

Thr

Lys

Val

Ser

Arg.

Leu

Val

Ala

Val

Leu

Phe

>·

260

265 '

270

-í

3/14

Ala Ala Cys Trp Gly Pro Ile Gin Leu Phe Leu . 275280

Gly Pro Ser Gly Ala Trp His'Pro Arg Ser, Tyr ^_290 ' . 295'./

Lys Ile Trp Ala His Cys Mel Ser Tyr Ser Ash

305 310.315

Leu Leu Tyr Ala Phe Leu Gly Ser His Phe ,’Arg

325330

Val Cys Pro Cys Gly Pro.....G1n Arg Gln Arg Arg

340345 • · ·

9 9

His

Ser

Asp

Arg

Ala

Pro

His

Ser

Val

Pro

His

Ser

Arg

Ala

-

355

360

365

‘His

Pro

Val

. Arg

Val

Arg

Thr

Pro

Glu

Pro

Gi y.

Asn

Pro

Val

Arg

370

375

380

Ser

Pro

Ser

Val

Gin

Asp

Glu

His

Thr

Ala

Pro

Leu

385

390

395

396

<2I0> 2 <211> 1191 <212> DNA <213> Rat <400> 2

ATGGCCGCAG AGGCGACGTT GGGTCCGAAC GTGAGCTGGT GGGCTCCGTC CAACGCTTCG' 60

GGATGCCCGG GCTGCGGTGT CAATGCCTCG GATGGCCCAG GCTCCGCGCC AAGGCCCCTG120

GATGCCTGGCTGGTGCCCCT GTTTTTCGCT GCCCTAATGT TGCTGGGGCT AGTCGGGAAC 180

TCACTGGTCA TCTTCGTTAT CTGCCGCCAC AAGCACATGC AGACCGTCAC CAATTTCTAC*240

ATCGCTAACC TGGCGGCCAC AGATGTCACT TTCCTTCTGT GCTGCGTACC CTTCACCGCG300 λ_··♦··· ···· * ··· · · . · · · · rAs | · · · · · ··«·· · · ···

4/14 , TV £j&oA - /)3^

CTCCTCTATC	CGCTGCCCAC	CTGGGTGCTG	GGAGACTTCA	TGTGCAAATT	CGTCAACTAC	360
ATCCAGCAGG	TCTCGGTGCA	AGCCACATGT	GCCACTTTGA	CAGCCATGAG	TGTGGAČCGC	420
TGGTACGTGA	CTGTGTTCCC	GCTGCGTGCA	CTTCACCGCC	GCACTCCGCG	CCTGGCCCTG	480
ACTGTCAGCC	TTAGCATCTG	GGTGGGTTCC	GCAGCTGTTT	CCGCCCCGGT	GCTGGCT.CTG	540
CACCGCCTGT	CGCCCGGGCC	TCACACCTAC; TGCAGTGAGG	CGTTTCCCAG	CCGTGCCCTG	600
GAGCGCGCTT	TCGCGCTCTA	CAACCTGCTG	GCCCTATACC	TGCTGCCGCT	GCTCGCCACC	660
TGCGCCTGCT	ACGGTGCCAT	GCTGCGCCAC	CTGGGCCGCG	CCGCTGTACG	CCCCGCACCC	720
AČTGATGGCG	CCCTGCAGGG	GCAGCTGCTA	GCACAGCGCG	CTGGAGCAGT	GCGCACCAAG	780
GTCTCCCGGC	TGGTGGCCGC TGTCGTCCTG	CTCTTCGCCG	CCTGCTGGGG	CCCGATCCAG	840
CTGTTCCTGG	TGCTTCAAGC	CCTGGGCCCC	TCGGGGGCCT	GGCACCCTCG	AAGCTATGCC	900
GCCTACGCGC	TCAAGATCTG	GGCTCACTGC	ATGTCCTACA	GCAATTCTGC	GCTCAACCCG	960
CTGCTCTATG	CCTTCCTGGG	TTCCCACTTC	AGACAGGCCT	TCTGCCGCGT	GTGCCCCTGC	1020
GGCCCGCAAC	GCCAGCGTCG	GCCCCACGCG	TCAGCGCACT	CGGACCGAGC	CGCACCCCAT	1080
AGTGTGCCGC	ACAGCCGGGC	TGCGCACCCT	GTCCGGGTCA	GGACCCCCGA	GCCTGGGAAC	1140
CCTGTGGTGC	GCTCGCCCTC	TGTTCAGGAT	GAACACACTG	CCCCACTCTG	A	1191

<210> 3 <211> 30 <212> DNA <213/* _uměiá sekvence <220>

<223>

<400> 3

GTCGACATGG CCGCAGAGGC GACGTTGGGT ’ 30 <210> 4 / <211> 30 <212> DNA . · ·. ·

<2 1 3> umělá sekvence	5/14	• ·· · · · · · · · · · • · · · ··· ···· 9 ·· · · ··· 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 · · ··· ·· 99 999 99 999 PV 4 - Λ
<22O>
<223>
<400> 4

ACTAGTTCAG AGTGGGGCAG TGTGTTCATC <210> 5 <211> 398 <212> PRT <213> lidská <400> 5

Met

Hi s

Thr

Val

Ala

Thr

Ser

Gly

Pro

Asn

Ala

Ser

Trp

Gly

Ala

Pro

5

10

15

Ala

Asn

Ala

Ser

Gly

Cys

Pro

Gly

Cys

Gly

Ala

Asn

Ala

Ser

Asp

Gly

20

25

30

Pro

Val

Pro

Ser

Pro

Arg

Ala

Val

Asp

Ala

Trp

Leu

Val

Pro

Leu

Phe

35

40

45

Phe

AI a

Ala

Leu

Met

Leu

Gly

Leu

Val

Gly

Asn

Ser

Leu

Val

Ile

50

55

60

Tyr

Val

Ile

Cys

Arg

His

Lys

Pro

Met

Arg

Thr

Val

Thr

Asn

Phe

Tyr

65

70

75

80

11 e

Ala

Asn

Leu

Ala

Thr

Asp

Val

Thr

Phe

Leu

Cys

Val

85

90

95

Pro

Phe

Thr

Ala

Leu

Tyr

Pro

Leu

Pro

Gly

Trp

Val

Leu

Gly

Asp

100

105

110

Phe

Me l

Cýs

Lys

Phe

Val

Asn

Tyr

Ile

Gin

Val

Ser

Val

Gin

Ala

120

125

Thr Cys Ala Thr Leu Thr Ala Mel

130 135

Val Phe Pro Leu Arg Ala Leu His

145 150 .

Ala Val Ser Leu Ser Ile Trp Val

165

Val Leu Ala Leu His Arg Leu Ser

180

Glu AI a Phe Pro Ser Arg Ala Leu

195200

Leu Leu Ala Leu Tyr Leu Leu Pro

210215

Ala Ala Met Leu Arg His Leu Gly

225230

Ala Asp Ser Ala Leu Gin Gly Gín

245

Val Arg Ala Lys Val Ser Arg Leu

260

Ala Ala Cys Trp Gly Pro Ile Gin

275280

Gly Pro Ala Gly Ser Trp. His Pro

290295

Lys Thr Trp Ala His Cys Met Ser

305310

Leu Leu Tyr Ala Phe Leu Gly Ser

325

	44Λ 6/14	• •	• ·· • · · « • ·· « • · · · • · ·· z	• · ···· ·· · • · · · · · • · · · · · · • · · · · * · · · · · W · · ·
	4 -— φ-
Ser	Val	Asp	Arg Trp	Tyr	Val	Thr
			140
Arg Arg	Thr	Pro	Arg	Leu	Ala	Leu
		155					160
Gly	Ser	Ala	Ala	Val	Ser	Ala	Pro
	170					175
Pro	Gly	Pro	Arg	Ala	Tyr	Cys	Ser
185					190
Glu	Arg	Ala	Phe	Ala	Leu	Tyr	Asn'
				205
Leu	Leu	Ala	Thr	Cys	Ala	Cys	Tyr
			220
Arg	Val	Ala	Val	Arg	Pro	Ala	Pro
		235					240
Val	Leu	Ala	Glu	Arg	Ala	Gly	Ala
	250					255
Val	Ala	Ala	Val	Val	Leu	Leu	Phe
265					270
Leu	Phe	Leu	Val	Leu	Gin	Ala	Leu
				285
Arg	Ser	Tyr	Ala	Ala	Tyr	Ala	Leu
			300
Tyr	Ser	Asn	Ser	Ala	Leu	Asn	Pro
		315					320
His	Phe.	Arg	Gin	Ala.	Phe.	Arg	Arg
λ.	330					335

·· ·· ···· ·· • · · · · · · ·· · · ··· · ·

/I/Uj

7/14

Val

Cys

Pro

Cys

Ala

Pro

Arg

Pro

Arg

Pro

Arg

Pro

Gly

340

345

350

Pro

Ser

Asp

Pro

Ala

Pro

His

Ala

Glu

Leu

His

Arg

Leu

Gly

Ser

355

360

365

His

P.ro

Ala

Pro

Ala

Arg

AI a

Gin

Lys

Pro

Gly

Ser.

Ser

Gly'

Leu ·

Ala

370

375

380

Ala

Arg

Gly

Leu

Cys

Val

Leu

Gly

Glu

Asp

Asn

Ala

Pro

Leu

385

390

395

398

<210> 6 <211> 1197 <212> DNA <213> lidská.

<400> 6

ATGCACACCG TGGCTACGTC CGGACCCAAC GCGTCCTGGG GGGCACCGGC CAACGCCTCC60

GGCTGCCCGG GCTGTGGCGC CAACGCCTCG GACGGCCCAG TCCCTTCGCC GCGGGCCGTG120

GACGCCTGGC TCGTGCCGCT CTTCTTCGCG GCGCTGATGC TGCTGGGCCT GGTGGGGAAC180

TCGCTGGTCA TCTACGTCAT CTGCCGCCAC AAGCCGATGC GGACCGTGAC CAACTTCTAC240

ATCGCCAACC-TGGCGGCCAC GGACGTGACC TTCCTCCTGT GCTGCGTCCC CTTCACGGCC 300

CTGCTGTACC CGCTGCCCGG CTGGGTGCTG GGCGACTTCA TGTGCAAGTT CGTCAACTAC360

ATCCAGCAGG TCTCGGTGCA GGCCACGTGT GCCACTCTGA CCGCCATGAG TGTGGACCGC420

TGGTACGTGA CGGTGTTCCC GTTGCGCGCC CTGCACCGCC GCACGCCCCG CCTGGCGCTG480

GCTGTCAGCC TCAGCATCTG GGTAGGCTCT GCGGCGGTGT CTGCGCCGGT GCTCGCCCTG540

CACCGCCTGT CACCCGGGCC GCGCGCCTAC TGCAGTGAGG CCTTCCCCAG CCGCGCCCTG600

GAGCGCGCCT TCGCACTGTA CAACCTGCTG GCGCTGTACC TGCTGCCGCT GCTCGCCACC660

TGCGCCTGCT ATGCGGCCAT GCTGCGCCAC CTGGGCCGGG TCGCCGTGCG CCCCGCGCCC720

GCCGATAGCG CCCTGCAGGG GCAGGTGCTG GCAGAGCGCG CAGGCGCCGT GCGGGCCAAG'780

840

8/14

GTCTCGCGGC TGGTGGCGGC CGTGGTCCTG CTCTTCGCCG CCTGCTGGGG

CTGTTCCTGG

GCCTACGCGC

CTGCTCTACG

GCGCCGCGCC

GCGGAGCTGC

AGTGGGCTGG <210> 7 <211> 26 <212>

<220>

<223>

<400>

DNA

TGCTGCAGGC

TTAAGACCTG

CCTTCCTGGG

GCCCCGGCCG

GCTGGGCCCC

GGCTCACTGC

CTCGCACTTC

GCGGGCTCCT

ATGTCCTACA

CGACAGGCCT·

CCCCCGCCGG CCCGGÁCCCT

ACCGCCTGGG.GTCCCACCCG GCCCGCGCCA • · ¹ · « · ·· · · • · · ♦ « · · • · ♦·· · · · · 9 9 ·· ,99 9 99 · ··· ·

V <£je>o A — 1 Jimž

CCCCATCCAG

GGCACCCACG

GCAACTCCGC

TCČGCCGCGT

CGGACCCCGC

GGGCGCAGAA

CCGCGCGCGG GCTGTGCGTC CTGGGGGAGG ACAACGCCCC umělá sekvence

GACCGTGACC AACTTCTACA TCGCCA <210>

<211>

<212>

<213>

<220>

<223>

<400>

DNA umělá sekvence

ATGCACACCG TGGCTACGTC CG <

<210> 9 <211> 21

CAGCTACGCC

GCTGAACCCG

CTGCCCGTGC

AGCCCCACAC

GCCAGGGAGC

TCTCTGA

900

960

1140 *·

··· ·· ♦'· ··· ·· ···

- 43 rg

9/14 <213> umělá sekvence <2207 <223> .

<4007 9 ' . ..... ? ‘ ·. '

CCTGTCGGAA GTGCGAGCC.C A ' . ’ ' ' ' / '..21 <210> 10 ' i · ;·'·· <211> 54 . : ,: .

<212> PRT / '<, <2137 umělá sekvence- - —·— . .—<220>

<223> C-konec polypepťidu je amidová forma (—C0NH₂)‘ <400> 10 > -'

Gly

Thr

Ser

Leu

Ser

Pro

•Pro

Gl-u

Ser

Gly

Ser

Arg

Gin

Gin·

1

5

' 10

15

Pro

Gly

Leu

Ser

Ala

Pro

His

Ser

Arg

Gin

11 e

Pro

Ala

Pro

Gin

Gly

20

25

30

Ala

Val

Leu

Val

Gin

Arg

Glu

Lys

Asp

Leu

Pro

Asn

Tyr

Asn

Trp

Asn

35

40

45

Ser

Phe

Gly

Leu

Arg

Phe

50

54

<210> 11 <211> 15 <212> PRT <2137 sekvence <2207 . \ ‘ ·. ·.. ..· * <2237 C-konec polypeptidu je amidová forma (~C0NH_z)

10/14 '

V ο2εο 1 — 4 a <400> 11

Lys Asp Leu Pro*Asn Tyr Asn Trp Asn Ser Phe Gly Leu Arg Phe <210> 12 <211> ío ;

<212> PRT <213>

umělá sekvence <220>

<223> C-konec polypeptidu je amidová forma (—C0NH₂) <400> 12

Tyr Asn Trp Asn Ser Phe Gly Leu. Arg Phe

5 10 ^;<210> 13 _ ’ .

<211> 9 <212> PRT <213> umělá sekvence <220>

<223/ C-konec polypeptidu je amidová forma (-C0NH₂) <400> 13

Asn Trp Asn Ser Phe Gly Leu Arg Phe

59 <210> 14 <211> 8 ··.·'.

<212> PRT \;.’· <213> umělá sekvence <220> ...

ΛΛΪ

11/14

• • · e	• i · ··	44 (»··· • 4 '4 4 4 4 4 ·
1.· · ·	··	·· 4 *4	·· 4« ·

<223/ C-konec polypeptidu je amidová forma (—QOjVH^) <400> 14

Trp Asn Ser Phe Gly Leu Arg Phe . 5 8 <210> 15 .

<211> 152' <212> DNA <21 3/ umělá sekvence <220> ............ . .....'. ......

<223>

<400> 15

GGGACCTCGC TGTCCCCGCC CCCCGAGAGC TCCGGGAGCC GCGAGCAGCC GGGCCTGTCC60

GCCCCCCACA GCCGCCAGAT CCCCGCACCC CAGGGCGCGG TGCTGGTGCA GCGGGAGAAG120

GACCTGCCGA ACTACAACTG GAACTCCTTC GGCCTGCGCT TC ·162 <210> 16 <211> 45 <212> DNA <213/ umělá sekvence <220>

<223>

<400> 16

AAGGACCTGC CGAACTACAA CTGGAACTCC TTCGGCCTGC GCTTC 45 <210> 17 <211> 30 <212> DNA <213>

umělá sekvence

12/14

τ’ϋ \ — /1 <22Ο>

<223>

<400> 17

TACAACTGGA ACTCCTTCGG CCTGCGCTTC <210> 18 <211> 27 <212> DNA <213/ umělá sekvence <220>

<223/ <400/ 18

AACTGGAACT CCTTCGGCCT GCGCTTC <210/ 19 <211/ 24 <212> DNA <213/ umělá sekvence <220/ <223/ <400/ 19

TGGAACTCCT TCGGCCTGCG CTTC <210/ 20 <211> 145 <212> PRT <213/ lidská <400/ 20

Met Asn Ser Leu Val Ser Trp'Gin Leu Leu Leu Phe Leu Cys Ala Thr

Μ*

13/14

9'9 9-999 '999·

9 9 * * .9 9 9 99 9 • · · 9 ·'·'· · ·4 • ’ 4 · · ♦ '9 9 9 9 ·,· · • · · 9 9 9 '9 9· ··· 99 99 999 99999

1

.5

10

15

His

Phe

Gly

Glu

Pro

Leu

G1U

Lys

Val

Ala

^JSer

Val

Gly

Asn

Ser

Arg

20

25

30

Pro

Thr

Gly

Gin

Leu

Glu

Ser

Leu

Gly

Leu

Ala

Pro

Gly

Glu

35

40

45

Gin

Ser

Leu

Pro

Cys

Thr

Glu

Arg

Lys

Pro

Ala

Thr

Ala

Arg

Leu

50

55

60

Ser

Arg

Gly

Thr

Ser

Leu

Ser

Pro

Glu

Ser

Gly

Ser

6-5-

7-0-

-

75 -

80

Arg

Gin

Pro

Gly

Leu

Ser

Ala

Pro

His

Ser

Arg

Gin

Ile

Pro

Ala

85

90

95

Pro

Gin

Gly

Ala

Val

Leu

Val

Gin

Arg

Glu

Lys

Asp

Leu

Pro

Asn

Tyr

100

105

110

Asn

Trp

Asn

Ser

Phe

Gly

Leu

Arg

Phe

Gly

Lys

Arg

Glu

Ala

Pro

115

120

125

Gly

Asn

His

Gly

Arg

Ser

AI a

Gly

Arg

Gly

Trp

Gly

Ala

Gly

Ala

Gly

130

135

140

Gin

145 <210> 21 <211> 7 <212> PRT <213>

umělá sekvence <220> . ·.· <223/ c-konec polypeptidu je amidová forma (-C0NHJ <400> 21

44^

14/14 .4 ·· ♦ · ···· ··,·

·.· · · 4 4 4 4 · ··« '* 44 4 4 . 4 4 4 · .44 ··’··· « 4 44 • 44 44 44 44· 4444»

Asn.Ser Phe Gly Leu Arg Phe 1 5 7 <210> 22 <211> 21 <212> DNA /213/ umělá sekvence <220/ <223>

<400> 22 ..........A AACTCCTTCG GCCTGCGCTT C • ·♦ 99 9999 9t9

9-9 9 · 9 ·9 9 999

99 .9 '9 ‘99 9 9 94

9 .9 » ‘9 9 9 (9 9 ·' 4

9 9 9 9. · · 9 99

9.9 9.9 ,4ι4 4·· 9 9 99 9

Claims

1. Protein a jeho soli, které obsahují stejnou nebo v podstatě stejnou sekvenci aminokyselin jako je sekvence aminokyselin uvedené jako sekvence sekv. íd. č. 1.

2. Protein a jeho soli podle nároku 1, v němž stejná nebo v podstatě stejná sekvence aminokyselin znamená sekvenci sekv. id. č. 5.

3. Částečný peptid proteinu podle nároku 1 nebo jeho estery nebo jeho amidy nebo jeho soli; .......... ~~

4. Polynukleotid obsahující polynukleotid, který má sekvenci baží kódující protein podle nároku 1.

5. Polynukleotid podle nároku 4, který znamená DNA. ’

6. Polynukleotid podle nároku 4, který obsahuje sekvenci baží _rep_re_ sentovanou sekvencí sekv. id. č. 2 nebo sekv. id. č. 6.

7. Rekombinantní vektor obsahující polynukleotid podle nároku 4.

8. Transformant transformovaný rekombinantním vektorem podle nároku 7.

9. Způsob výroby proteinu nebo jeho solí podle nároku 1, vyznačující se t í m, že se kultivuje tranformant podle nároku 8 a že se produkuje a akumuluje protein podle nároku 1.

10. Protilátka ná protein nebo jeho soli podle nároku 1 a na částečný peptid nebo jeho estery nebo jeho amidy nebo jeho soli podle nároku 3.

11. Protilátka podle nároku 10, která znamená neutralizující protilátku pro deaktivování transdukce signálu proteinu podle nároku 1.

12. Diagnostický prostředek, vyznačující se t í m, že obsahuje protilátku podle nároku 10.

13. Ligand na protein nebo jeho soli podle nároku 1, vyznačující se tím, že je získatelný použitím proteinu nebo jeho solí podle nároku 1 nebo použitím částečného peptidu, jeho esterů, jeho amidů nebo jeho solí podle nároku 3.

14. - Farmaceutický prostředek, vyznačující s e t í m, že obsahuje ligand podle nároku 13.

15. Způsob stanovení ligandu na protein nebo jeho soli podle nároku 1, vyznačující set í m, že se používá protein nebo jeho soli podle nároku 1 nebo částečný peptid, jeho amidy, jeho estery nebo jeho soli podle nároku 3.

16. Způsob testování sloučeniny nebo jejích solí, které mění vlastnosti vazby mezi ligandem a proteinem nebo jeho solemi podle nároku 1,vyznačující se t í m, že se používá protein nebo jeho soli podle nároku 1 nebo částečný peptid nebo jeho amidy, jeho estery nebo jeho soli podle nároku 3.

17. Sestava pro testování sloučeniny nebo jejích solí, které mění vlastnosti vazby mezi ligandem a proteinem nebo jeho solemi podle nároku 1, v y z n a č u j í c í se t í m, že zahrnuje protein nebo jeho soli podle nároku 1 nebo částečný peptid nebo jeho amidy, jeho estery nebo jeho soli podle nároku 3.

18. Sloučenina nebo její soli, které mění vlastnosti vazby mezi ligandem a proteinem nebo jeho solemi podle nároku 1, kterou je možno získat použitím způsobu testování podle nároku 16 nebo testovací sestavy podle nároku 17.

r

• ·· 4« ··#· ·♦ * · ♦ • · • • • Φ · • ·· • · ··· « • • • i · • · • • * • ·· ♦ · • · »·· ·« «·

/íÁJb ipzr

19. Farmaceutický prostředek, vyznačující se t í m, že obsahuje sloučeninu nebo její soli, které mění vlastnosti vazby mezi ligandem a proteinem nebo jeho solemi podle nároku 1, který je možno získat použitím způsobu testování podle nároku 16 nebo testovací sestavy podle nároku 17.

20. Způsob kvantitativního vyhodnocení proteinu podle nároku 1, vyznačující se t í m, že zahrnuje použití protilátky podle nároku 10.

21. Peptid, jeho amid, jeho ester nebo jeho sůl, který v aminokyselinové sekvenci představované sekvencí sekv. id. č. 10 obsahuje sekvenci N-koncových aminokyselin 47 až 54 a obsahuje 8 až 54 zbytků aminokyselin.

22. Peptid, jeho amid, jeho ester nebo jeho sůl podle nároku 21, který v aminokyselinové sekvenci představované sekvencí sekv. id. č. 10 obsahuje N-koncovou sekvenci aminokyselin 47 až 54 na C-konci a obsahuje 8 až 15 zbytků aminokyselin.

23. Amid nebo sůl peptidu podle nároku 21, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci představovanou sekvencí sekv. id. č. 11, sekv. id. č. 12, sekv. id. č. 13 nebo sekv. id. č. 14.

24. Způsob testování podle nároku 16, v y z n a č u j í c í se t í m, že ligand znamená peptid nebo jeho amid, jeho ester nebo jeho sůl podle nároku 21.

25. Sestava pro testování podle nároku 16, vyznačující se tím, že ligand znamená peptid nebo jeho amid, jeho ester nebo jeho sůl podle nároku 21.