KR20010079080A - 신규한 dna 중합효소의 dna 서열 및 그로부터 유래된 단백질 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신규한 호열성 DNA 중합효소의 DNA 서열 및 그로부터 유래된 아미노산 서열에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 화산지대에서 채취한 고온균 (thermophile) 서모언에어로박터 연세이(Thermoanaerobacter yonseii)로부터 분리한 신규한 DNA 중합효소(DNA polymerase)의 DNA 서열 및 그로부터 번역되는 아미노산 서열에 관한 것이다. 본 발명의 화산지대에서 채취한 서모언에어로박터 연세이로부터 분리한 신규한 DNA 중합효소(DNA polymerase)의 DNA 서열은 재조합 대장균, 효모에서 확립된 발현시스템에 의하여 발현될 수 있으며, 이와 같은 방법으로 다량 생산된 DNA 중합효소는 DNA 중합효소 연쇄반응과 DNA 염기서열 결정 등에 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

Description

신규한 DNA 중합효소의 DNA 서열 및 그로부터 유래된 단백질{Nucleotide sequences and amino acid sequences encoding a DNA polymerase}

본 발명은 신규한 호열성 DNA 중합효소의 DNA 서열 및 그로부터 유래된 아미노산 서열에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 화산지대에서 채취한 고온균(thermophile) 서모언에어로박터 연세이(Thermoanaerobacter yonseiiKB1; 특허균주 기탁 번호 - (KFCC 11116: 한국종균협회))로부터 분리한 신규한 DNA 중합효소 (DNA polymerase)의 DNA 서열 및 그로부터 번역되는 아미노산 서열에 관한 것이다.

고온 균으로부터의 DNA 중합효소는 높은 온도에 대한 그들의 저항성에 기인하여 많은 관심에 집중되어 왔다. 더욱이 미생물 유래의 DNA 중합효소들은 DNA 중합효소 연쇄반응과 DNA 염기서열 결정 그리고 역 전사 DNA 중합효소 연쇄반응 등의 분자 생물학적인 실험의 도구로서 상업적으로 중요한 효소들 중의 하나이다. 가장 잘 알려진 열 안정성 DNA 중합효소로는 Pyrococcus furiosus로부터 유래한 Pfu DNA polymerase와 Thermus aquaticus로부터 유래한 Taq DNA polymerase 가 있다(참조: Chien, A., D.B. Edgar and J.M. Trela. J. Bacteriol 127: 1550-1557(1976), Lundberg KS, Shoemaker DD, Adams MW, Short JM, Sorge JA, Mathur EJ. Gene Dec 1;108(1):1-6 (1991)). DNA 중합효소의 기능 중 가장 많이 쓰이는 DNA 중합효소연쇄 중합반응은 목표로 하는 서열의 반대편에 있는 특정 서열에 올리고 핵산 프라이머를 혼성화 하여 연장과 혼성 화를 반복하여 새로운 두 사슬이 DNA 중합효소에 의해 생성되게 하는 것이다. 이 반응에서 한번 순환의 산물은 그 다음 반응의 주형으로 사용되며 각 순환반응의 반복으로 인하여 반응에서 특정 서열의 양은 exponential하게 증폭되게 된다. 연쇄 중합반응은 온도의 반복 순환 과정에 의하여 이루어진다. 이 온도의 순환 반복은 다음 순환을 시작하게 하기 위해 필요한 올리고 프라이머의 혼성화를 가능하게 해준다. 주로 90-100℃에서 DNA의 이중사슬 풀어짐 반응을 시키고, 곧바로 온도를 낮춰줌으로써 올리고의 주형과의 혼성화와 그에 이어지는 연장반응을 하게 된다. 이 순환과정은 20-50번 정도 반복하게 되며 증폭하고자 목표하는 DNA의 양에 따라 그 정도를 조절하게 된다. 이 DNA중합효소 연쇄반응은 산업적으로 그리고 의학적으로 혹은 그 외의 많은 분야에서 응용이 되어지고 있다. 따라서 이 기술에는 필수 적으로 열 안정성 DNA 중합효소 이용되므로 많은 고온 균으로부터 더 나은 기능을 가진 DNA 중합효소들이 분리되어 지고 있다. 이에, 본 발명의 발명자들은 화산지대로부터 채취한 고온균 서모언에어로박터 연세이의 게놈 DNA 라이브러리로부터 클로닝한 DNA 중합효소의 DNA 및 그로부터 번역되는 아미노산 서열이 신규하다는 것을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명은 화산지대에서 채취한 고온균(thermophile) 서모언에어로박터 연세이(Thermoanaerobacter yonseii)로부터 분리한 신규한 DNA 중합효소(DNA polymerase)의 DNA 서열 및 그로부터 번역되는 아미노산 서열을 제공하는 것을 목적으로 한다.

도 1은 화산지대에서 채취한 고온균(thermophile) 서모언에어로박터 연세이(Thermoanaerobacter yonseii)의 게놈 DNA 라이브러리 제조과정을 나타내는 모식도이다.

도 2은 신규한 DNA 중합효소 DNA서열과 게시된 DNA 서열로부터 번역되는 아미노산 서열을 나타낸다.

도 3는 신규한 DNA 중합효소 및 공지된 미생물 DNA 중합효소들의 아미노산 서열을 비교하여 나타낸 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위한 본 발명은 미생물의 DNA 중합효소에 잘 보존되어있는 아미노산 부위에 대한 올리고 뉴클레오티드 프라이머들과 서모언에어로박터 연세이의 게놈 DNA 라이브러리로부터 PCR 산물을 프로브로 사용하여, 2.6kb의 DNA 중합효소를 코딩하는 DNA를 클로닝 하였다. 클로닝된 DNA는 872개의 아미노산을 코딩하는 2616개의 뉴클레오티드의 개방 해독틀을 갖으며, 아미노산 서열로부터 추정 분자량이 약 100kD이고 아미노산 성분으로부터 등전점 (pI)이 5.42로 추정되었다. 한편, 단백질의 정보검색결과로부터, 이 DNA 중합효소는 공지된 다른 미생물의 DNA 중합효소들과 50%의 아미노산 서열상의 유사성이 있음이 확인되었다.

본 발명의 고온균 서모언에어로박터 연세이로부터 분리한 신규한 유사 DNA중합효소 (DNA polymerase)의 DNA 서열은 재조합 대장균, 효모에서 확립된 발현시스템에 의하여 발현될 수 있으며, 이와 같은 방법으로 다량 생산된 DNA 중합효소는 DNA 중합효소 연쇄반응과 DNA 서열 분석 등에 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

이하 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 상세하게 설명한다. 그러나 다음의 실시예 및 실험예 들은 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 고온균 서모언에어로박터의 게놈 DNA 추출 및 라이브러리 제조

고온균 서모언에어로박터 연세이를 2ℓ, 80℃에서 정치 배양하여 이로부터 게놈 DNA를 추출하였다. 20분간 5,000×g로 원심분리하여 수확된 고온균은 Lysozyme과 단백질 가수분해효소 K에 반응시킨 후 동량의 chloroform/isoamyl alcohol (24:1)을 넣어 단백질, 탄수화물 복합체를 추출하고 20분간 13,000×g로 원심분리하고 상등액을 새 튜브에 옮기고, 동량의 phenol/ chloroform/ isoamyl alcohol (25:24:1)을 넣어 재차 추출하여 20분간 원심분리한 후 상등액의 0.7배 부피의 isopropanol과 3M sodium acetate를 넣고 멸균된 파스퇴르 피펫으로 용액 속의 게놈 DNA를 건져내었다. 70% 에탄올로 세척하여 잔존하는 염을 제거하고, cleanbench에서 건조시킨 후 DNA pellet을 1㎖의 TE 완충액으로 현탁시켜 게놈 DNA를 조제하였다. 제조된 게놈 DNA를Sau3AI 제한효소로 부분 절단하여 람다 ZAP Express(Stratagene, USA)에 삽입하고 실험실적 패키징(in vitro packaging)을 거쳐 라이브러리를 완성하였다. 게놈 DNA 라이브러리는 10⁶개의 독립된 플라크를 포함하는 것으로 검정되었다. 고온균 서모언에어로박터 연세이로부터 게놈 DNA 라이브러리를 제조하는 과정은 도 1에 모식적으로 나타내었다.

실시예 2: 프로브의 제조

실시예 1에서 제조한 게놈 DNA를 이용하여 DNA 중합효소를 스크리닝하기 위한 프로브를 선정하기 위하여, 미생물의 DNA 중합효소들에서 잘 보존된 아미노산 부위에 대한 올리고뉴클레오티드 프라이머들을 합성하였다.: 즉,

5'-프라이머로는 다른 미생물들에서의 DNA 중합효소의 유사성이 높은 부분의 아미노산 서열인 PNLQNIP에 근거하여, 5'- CCN AAY YTN CAR AAY ATH CCN -3' 서열을 보유하는 축퇴 올리고 뉴클레오티드를 사용하였고; 마찬가지고 3‘-프라이머로는 QV(I)HDEL에 근거하여 5’- NAR YTC RTC NAY YTG -3‘서열을 보유하는 축퇴 올리고 뉴클레오티드 프라이머를 사용하였다(상기에서, Y는 C와 T가 혼합된 뉴클레오티드; N은 A, G, C, T; H는 A, T, C ; R은 A, G 의 각 뉴클레오티드를 나타낸다).

실시예 1에서 제조된 게놈 DNA를 주형으로 상기 프라이머들과 Taq DNA중합효소를 이용하여 96℃에서 2분, 45℃-51℃에서 30초, 72℃에서 20초씩의 조건으로, 30회의 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction: PCR)을 수행한 결과, 633bp PCR 산물을 수득하였다. 얻어진 PCR 산물을 플라스미드 pGEM T easy(Promega, USA)에 서브클로닝하고 DNA서열을 결정하였다.

DNA 서열로부터 유래된 아미노산 서열 (PCR 633)은 공지된 DNA 중합효소, 즉Anaerocellum thermophilum로 부터 분리한 DNA 중합효소 및 Bacillus Stearothermophilus 로부터 분리한 DNA 중합효소와 각각 62%의 유사성을 보유함이 확인되었다. 따라서 실제 DNA 라이브러리의 스크리닝에는 633bp PCR 산물을 사용하였다.(도 2에 밑줄로 표시)

실시예 3: 게놈 DNA 라이브러리의 스크리닝

실시예 1에서 제조한 게놈 DNA 라이브러리를E.coliXL-1 Blue에 도입하고 플레이팅하여 전체 1.2×10⁵개의 플라크를 얻었다. 플라크를 니트로 셀룰로오스 막으로 옮긴 다음, 막을 변성용액(0.5N NaOH, 1.5M NaCl)에 2분, 중화용액(0.5M Tris HCl(pH7.4), 1.5M NaCl)에 5분간 처리하고, 2×SSC에서 30초간 세척하였다. 막을 UV crosslinker에서 2분 처리한 다음, 6×SSC, 5×Denhardt 용액, 0.5% SDS , 100㎍/㎖ 연어정액(single strand salmon sperm) DNA를 포함하는 용액에서 65℃, 3시간 전혼성화(prehybridization)하였다. 실시예 2에서 선정한 프로브를 [α-³²P]dCTP로 무작위 표지(random- label)하여 1 ×10⁶cpm/㎖의 농도로 상기의 전혼성화 용액에 첨가한 후, 65℃, 4시간 동안 혼성화하였다. 그런 다음, 막을 2×SSC, 0.1% SDS를 포함하는 용액에서 상온, 15분씩 2회 세척을 하고 1×SSC, 0.1% SDS를 포함하는 용액에서 65℃, 15분씩 2회 세척을 하고 0.1×SSC, 0.1% SDS를 포함하는 용액에서 65℃, 15분씩 2회 세척을 하였다.

막은 증감 스크린(Intensifying screen)하에서 X-ray 필름에 -70℃, 14시간 노출시켰다. 그 결과 X-ray 필름상의 복사물(duplicate)에서, 동일 위치에스팟(spot)이 형성된 30개의 양성클론(positive clone)을 찾아내었다.

동일한 플레이트로부터 니트로 셀룰로스막으로 옮겨진 파아지 플라크를 혼성화한 다음, X-ray 필름에 노출시킨 후에 낮은 희석 배수로 플레이팅하여 2차 스크리닝을 위와 동일한 방법으로 반복한 결과, 각각 독립된 플라크를 얻었다.

각 클론은 pBK-CMV 벡터(Stratagene, USA)에 서브클로닝 하였으며, 제한효소의 처리 결과, 그 삽입체 크기가 2.3kb에서 3.3kb로 확인되었다. 각 클론의 부분 서열을 결정하여 5개의 클론이 동일한 유전자의 일부를 보유하고 있는 것으로 확인되어, 그 중 가장 긴 3.3kb의 클론 전체의 서열을 결정하였다.

실시예 4: DNA서열의 결정

3.3kb 클론의 서열의 결정은 전체 삽입체 3.3kb 중, 전체 개방 해독틀을 포함하는 부위에 대하여 중점적으로 수행하였으며, 그 결과 2616bp의 서열을 결정하였다. 5‘부근의 진한 글자로 된 ATG는 개시 코돈을 나타내며, 3’부근의 진한 글자로 된 TGA는 정치 코돈을 나타낸다(도 2).

실시예 5: DNA서열의 분석

클로닝된 DNA는 872개의 아미노산을 코딩하는 2616 뉴클레오티드의 개방 해독틀을 갖으며, 이 DNA polymerase는 아미노산 서열로부터의 추정 분자량이 100kD이고 아미노산 성분으로부터 등전점(pI)이 5.42로 추정되었다.

이 클론과 실시 예 2에서 얻어진 633bp의 PCR 산물의 DNA 서열(PCR 633) 및 아미노산 서열을 비교한 결과, 잘 보존된 부위와 이외의 뉴클레오티드와 그에 따른 아미노산이 동일하다는 것을 발견하였다.

한편, Blast를 이용한 단백질의 정보검색 결과로부터, 이 DNA 중합효소는 공지된 다른 미생물의 DNA 중합효소들과 39%-47%의 아미노산 서열상의 동일성이 있고, 58%-68%의 아미노산 서열상의 유사성이 있음이 확인되었다 (도 3).

상기와 같이 본 발명은 화산지대에서 채취한 고온균(thermophile) 서모언에어로박터 연세이 (Thermoanaerobacter yonseii)로부터 분리한 신규한 호열성 DNA 중합효소 (DNA Polymerase)의 DNA 서열 및 그로부터 번역되는 아미노산 서열을 제공한다. 본 발명의 고온균 서모언에어로박터 연세이로부터 분리한 신규한 DNA 중합효소(DNA polymerase)의 DNA 서열은 재조합 대장균, 효모에서 확립된 발현시스템에 의하여 발현될 수 있으며, 이와같은 방법으로 다량 생산된 DNA 중합효소는 DNA 중합효소 연쇄반응과 DNA 염기서열 결정 등의 여러 방면에 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

Claims (4)

1. 화산지대에서 채취한 고온균(thermophile) 서모언에어로박터 연세이(Thermoanaerobacter yonseii)로부터 분리된 다음과 같은 서열 전체 또는 일부를 가지는 신규한 호열성 DNA 중합효소 (DNA polymerase)의 DNA 서열:
2. 제 1항에 게시된 DNA의 라이브러리 스크리닝에 사용하는 다음과 같은 서열을 가지는 PCR 프라이머와 프로브:
3. 제 1항에 게시된 DNA로부터 유래한 다음과 같은 서열 전체 또는 일부를 가지는 아미노산 서열
4. 제 3항의 아미노산 서열을 가지는 서모언에어로박터 연세이(Thermoanaerobacter yonseii)로부터 분리된 DNA 중합효소.