KR20010077015A - 신규한 고도호열성 미생물 서모언에어로박터 연세이ｋｂ-1(ｋｆｃｃ-11116) - Google Patents

신규한 고도호열성 미생물 서모언에어로박터 연세이ｋｂ-1(ｋｆｃｃ-11116) Download PDF

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Abstract

본 발명은 신규한 고도호열성 미생물에 관한 것이다. 본 발명에서는 산업적으로 유용한 고도호열성 미생물을 분리하고자, 인도네시아 자바섬의 실러리지역의 화산지대에서 채취한 시료로부터 KB-1 균주를 순수분리하였다. 전기 KB-1 균주를 동정함으로써, 지금까지 발견되지 않은 새로운 고도호열성 미생물임을 확인하고, 새로이 '서모언에로박터 연세이 KB-1(Thermoanaerobacter yonseiiKB-1)'이라 명명하였다. 본 발명의 신규한 고도호열성 미생물 서모언에어로박터 연세이 KB-1은 극한성 미생물로서, 고온에서도 성장이 가능하다는 특성으로 인하여 산업적으로 유용하게 활용될 것이다. 예를 들면, 본 발명의 서모언에어로박터 연세이 KB-1은 에탄올의 끓는 점인 78.5℃ 이상의 온도에서 활발히 생육함과 동시에 에탄올을 생산하므로, 증류를 위한 가열과정이 생략될 수 있다는 장점을 가지는 바, 순수한 에탄올 생산균주로서 산업적으로 응용될 수 있다.

Description

신규한 고도호열성 미생물 서모언에어로박터 연세이 ＫＢ-1(ＫＦＣＣ-11116){A Novel Extreme Thermophile of Thermoanaerobacter yonseii KB-1, KFCC-11116}
본 발명은 신규한 고도호열성 미생물에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 인도네시아 화산지대로부터 분리된 신규한 고도호열성 미생물 서모언에어로박터 연세이 KB-1(Thermoanaerobacter yonseiiKB-1)에 관한 것이다.
고도호열성 미생물(extreme thermophile)이란 70℃ 이상의 고온에서도 증식할 수 있는 극한성 미생물이다. 이러한, 고도호열성 미생물에 대한 연구는 최근 미국과 유럽에서 활발히 진행되어 새로운 미생물들이 계속해서 분리되고 있으며, 가까운 미래에 이들 균주로부터 생산된 각종 호열성 및 내열성 효소와 대사산물들이 산업에 직접 응용될 수 있다는 측면에서 가치를 지닌다.
고도호열성 미생물로부터 생산된 효소의 경우, 일반효소와 비교하여 내열성, 유기용매에 대한 내성 등의 안정성이 우수하고, 산업적으로 이용가능한 많은 장점을 지니고 있어, 그 응용범위 또한 매우 다양하다. 따라서, 이들에 대한 연구는 여러 산업적인 화학반응공정과 생물반응공정 사이의 거리를 줄일 수 있을 것으로 기대되고 있는 바, 이미, 미국, 일본, 독일 등에서는 이들 극한미생물의 중요성을 인식하여, 이들의 분리 및 동정을 통한 새로운 미생물의 발견과 이를 통한 새로운 유전정보의 확보에 주력하고 있다. 그러나, 고도호열성 미생물은 산업 분야에서 더욱 많은 이용가치를 가질것으로 예상되어지므로, 앞으로 더욱 많은 연구가 진행되어져야 한다.
이에, 본 발명자들은 산업적으로 많은 가치를 지니는 고도호열성 미생물을 분리하고자 예의 연구노력한 결과, 인도네시아 화산지대로부터 채취한 시료로부터 고도호열성 미생물을 분리 및 동정함으로써, 전기 미생물이 새로운 균주임을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
결국, 본 발명의 목적은 신규한 고도호열성 미생물 서모언에어로박터 연세이 KB-1(Thermoanaerobacter yonseiiKB-1, KFCC-11116)를 제공하는 것이다.
도 1a은 본 발명의 서모언에어로박터 연세이 KB-1 외부형태의 전자현미경 사진이다.
도 1b는 본 발명의 서모언에어로박터 연세이 KB-1 내부형태의 전자현미경 사진이다.
도 2a는 본 발명의 서모언에어로박터 연세이 KB-1 생육의 배양온도에 대한 영향을 나타낸 그래프이다.
도 2b는 본 발명의 서모언에어로박터 연세이 KB1 생육의 pH에 대한 영향을 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 서모언에어로박터 연세이 KB-1의 분자생물학적 계통도이다.
제 4는 본 발명의 서모언에어로박터 연세이 KB-1의 배양 생성물 중 에탄올의 검출을 나타내는 가스크로마토그래피 스펙트럼이다.
이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.
본 발명자들은 산업적으로 유용한 고도호열성 미생물을 분리하기 위하여, 인도네시아 자바섬의 실러리 지역의 화산지대에서 채취한 시료를 멸균증류수에 희석하여 혐기성 배지를 사용하여 혐기적 배양 방법으로 배양하였다. 그런 다음, 희석방법 및 단일 콜로니 분리방법에 의하여, 콜로니를 순수분리하고, 종래의 고도호열성 균주들과 다른 미생물학적 특성을 가지는 새로운 균주 KB-1을 선별하였다.
전기 선별된 KB-1 균주는 절대 혐기성, 고도호열성, 스포어 형성 그리고 자일로오스 자화 박테리아로서, 막대기 모양으로 운동성을 지니며, 균주의 말단에 스포어를 형성한다. 또한, 전기 미생물은 그람양성균이며, 대수증식기에 홀로 존재하거나 쌍으로 존재하고, 24시간 배양 후에는 때때로 균주가 길어지고 실처럼 연결된 형태가 관찰되기도 한다. 아울러, 50 내지 85℃의 범위에서 생육이 관찰되나, 최적생육온도는 75℃이고, pH 4.0 내지 9.0의 범위에서 생육이 관찰되나, 최적생육 pH는 6.5이다.
KB-1 균주는 화학유기영양체(chemoorganotroph)로서 포도당(glucose), 과당(fructose), 자일로오스(D-xylose), 락토오스(lactose), 말토오스(maltose), 설탕(sucrose), 만노오스(mannose), 갈락토오스(galactose), 셀로바이오스(cellobiose), 풀루란(pullulan), 가용성 전분(soluble starch) 등의 다양한 기질을 자화할 수 있으나, 아라비노오스(arabinose), 자일란(xylan), 셀룰로오스(cellulose), 올리브오일(olive oil) 등의 기질에 대한 자화능은 가지고 있지 않다. 예를들면, 포도당(glucose)을 기질로 하여 배양하는 경우, 주배양산물로 젖산(lactate), 초산(acetate) 및 에탄올(ethanol)이 생산되며, 소량의 배양산물로 이소발레르산(isovaleric acid), 부티르산(butyric acid), 프로피온산(propionic acid), 1-펜탄올(1-pentanol) 그리고 이소프로판올(iso-propanol)이 생산된다.
KB-1 균주는 전자수용체로서 소디움시오설페이트(sodium thiosulfate), 황(sulfur powder), 시스틴(L-cystine), 소디움설파이트(sodium sulfite) 등을 이용하며, 소디움시오설페이트를 사용할 경우, 배양산물로 황화수소(H2S)와 이산화탄소(CO2)를 생산한다. KB-1 균주는 테트라사이클린(tetracycline), 클로람페니콜(chlorampenicol), 페니실린 G(penicillin G), 네오마이신(neomycin),카나마이신(kanamycin), 반코마이신(vancomycin) 및 리팜피신(rifampicin)에 대하여 100㎍/㎖의 농도에서 생육저해를 받으나, 클로람페니콜, 네오마이신의 경우 10㎍/㎖의 농도에서는 생육저해를 받지 않는다.
KB-1 균주 DNA의 G+C 함량은 37mol%이며, 16S 리보솜 DNA의 염기서열 분석 결과, 클로스트리디움 집단 Ⅴ(Clostridiumcluster V)에 속하는 서모언에어로박터(Thermoanaerobacter) 속의 미생물과 가장 높은 상동성을 가지며, 상동성이 가장 높은 서모언에어로박터 브로키이(Thermoanaerobacter brockiisubsp.brockii)와는 92.7%의 상동성을 지닌다.
그러나, 16S 리보솜 DNA의 상동성이 90% 이하일 경우, 새로운 속의 미생물로 판단하는 현재의 미생물 분류학적 추세와, 지금까지 보고된 서모언에어로박터 종 사이의 16S rDNA 상동성이 적어도 93.4% 이상인 점을 감안할 때, 본 발명의 KB-1 균주는 지금까지 발견되지 않은 서모언에어로박터 속의 새로운 고도호열성 미생물임을 확인하고, 새로이 '서모언에로박터 연세이 KB-1(Thermoanaerobacter yonseiiKB-1)'이라 명명하였다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 고도호열성 미생물의 순수분리
인도네시아 화산지대로부터 채취한 시료로부터 80℃ 이상에서 자일로오스를 자화할 수 있는 고도호열성 미생물을 혐기성 배지(참조: 표 1)를 사용하여 혐기적 배양 방법으로 배양하고, 희석방법(serial dilution method) 및 단일 콜로니 분리방법(single colony isolation method)을 통해 본 발명의 균주를 순수분리하였다. 도 1a는 순수분리된 서모언에어로박터 연세이 KB-1의 외부형태 전자현미경 사진이고, 도 1b는 전기 미생물의 내부형태 전자현미경 사진이다. 도 1a 및 1b에서 보듯이, KB-1 균주는 대수증식기에 길이가 3 내지 5㎛ 정도되는 일반적인 막대기 모양으로서, 운동성을 지니며, 그람양성균의 세포막 형태를 가지고 있으나, 종래의 서모언에어로박터 속의 미생물의 세포막과는 차이가 있음을 확인할 수 있었다.
혐기성 배지의 조성
배 지 성 분 첨 가 량(g/L)
NaCl 2.0
CaCl2·2H2O 0.5
MgSO4·7H2O 0.5
MgCl2·6H2O 0.5
KH2PO4 0.5
K2HPO4 0.1
(NH4)2SO4 0.5
KCl 0.1
KBr 0.1
H3BO3 0.03
SrCl2·6H2O 0.03
Na2WO4 0.033㎎
Na2SeO3 0.026㎎
효모 추출물 1.0
D-xylose 5.0
sulfur powder 10
NaHCO3 0.1
Na2S(25%, w/v) 3㎖/L
실시예 2: KB-1 균주의 생육특성 조사
KB-1 균주의 생육특성을 알아보기 위하여, 온도와 배지의 pH가 KB-1 균주의 생육에 미치는 영향을 조사하였다. 호열성 포도당 이성화효소를 생산하는 고도호열성 미생물을 분리하기 위하여는 혐기성 배지조성(참조: 표 1) 중 탄소원으로서 자일로오스를 사용하였으나, 본 발명의 균주가 탄소원으로 자일로스보다 포도당을 선호하므로, 온도의 영향을 조사할 때에는 표 1에 개시된 배지조성 중 자일로오스 대신 포도당을 사용하였다. pH 7.0에서 40℃부터 5℃ 간격으로 90℃까지 배양하고, 분광광도계(spectrophotometer)를 사용하여 600nm에서 흡광도를 측정하고, 이를 보완하기 위하여 혈구계수기(haemocytometer)를 이용한 직접계수법을 사용하여 그 생육속도를 하기식에 의하여 측정하였다:
μ = (ln N2- ln N1)/(t 2-t 1)
상기 식에서, N2와 N1은 600nm에서의 흡광도(또는 세포수)를 나타내며,t 2와t 1는 그 각각의 시간을 나타낸다. 미생물이 모세포로부터 딸세포로 완전히 이분되는데 걸리는 시간, 즉, 세대시간(generation time)은td= (ln 2)/μ식에 대입하여 구하였다. 그 결과, 최적배양온도는 75℃(참조: 도 2a), 최적 pH는 6.5이며(참조: 도 2b), 이때, 딸세포로 이분되는데 걸리는 시간은 53분이었다.
실시예 3: KB-1 균주의 동정
KB-1 균주를 최적배양조건에서 2ℓ배양하고, 대수증식기에 있는 균주를 원심분리하여 모은 다음, 살균된 배지로 한번 세척하고, 바로 70% 2-프로판올(2-propanol)에 현탁하여 4℃에 보관하였다. KB-1 균주로부터 DNA 분리는 비수바나탄(Visuvanathan) 등의 방법으로 HPLC를 이용하여 DNA 염기조성을 분석한 결과, G+C 함량이 37mol%였다(참조: Visuvanathan, S. et al., Simple Enzymatic Method for Isolation of DNA from Diverse Bacteria,J. Microbiol. Methods,10:59-64, 1989). 하룻동안 최적배양조건에서 배양한 본 발명의 균주를 차보니어(Charbonnier)의 방법에 따라 DNA를 분리하고(참조: Charbonnier, F. andP. Forterre, Purification of Plasmid from Thermophilic and Hyperthermophilic Archaea,InF. T. Robb and A. A. R. Place (ed.), Archaea, a laboratory manual, Thermophiles, Laboratory Press, Cold Spring Habor, 1995), 이로부터 16S 리보좀의 유전자를 증폭하기 위하여, 드롱(Delong)에 의해 고안된 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다(참조: Delong, E. R., Archaea in Coastal Marine Environments,Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A., 89:5685-5689, 1992). 전기 PCR 산물을 자동염기서열분석기(ABI 373S, automated DNA sequencer; Perkin Elmer/Applied Biosystems Co., U.S.A.)를 이용하여 DNA 염기서열을 분석하고, GenBank™에서 종래의 공지된 박테리아의 염기서열과 비교하여 표 2에 나타내었다.
표 2에서 보듯이, 본 발명의 미생물은 클로스트리디움 집단 Ⅴ(Clostridiumcluster Ⅴ)에 속하며, 가장 가까운 속은 서모언에어로박터(Thermoanaerobacter)이나 같은 종(species)은 존재하지 않는 것으로 확인되었다. 전기 결과를 프로그램(tree view 1.5)을 사용하여 분자생물학적 계통도를 도 3에 나타내었으며, 이때, 막대기(scale bar)가 나타내는 길이는 100개의 염기 당 10개의 염기가 치환된 정도를 표시한다. 따라서, 본 발명의 KB-1 균주는 지금까지 발견되지 않은 새로운 고도호열성 미생물임을 확인하고, 새로이 '서모언에로박터 연세이 KB-1(Thermoanaerobacter yonseiiKB-1)'이라 명명하여, 그를 1999년 11월 23일 사단법인 한국종균협회(KFCC)에 기탁번호 KFCC-11116으로 기탁하였다.
실시예 4: KB-1 균주의 그람염색 및 배양액 분석
KB-1 균주를 후커(Hucker)의 방법으로 그람염색을 실시하여 그람양성균임을 확인하였다(참조: Hucker's method, Brock & Madigan, 1988). 전자수용체로 시오설페이트(Na2S2O3, 2g/ℓ)를 사용하였을 때, 배양산물로 황화수소(H2S)가 생성되는 것은 대수증식기에 있는 KB-1 균주 배양액에 0.2g/ℓ 농도의 FeSO4·7H2O를 첨가하여 배지색이 검게 변하는 것을 통해 확인하였다. 배양산물로 이산화탄소가 생성되는 것은 바륨카보네이트의 침전이 형성되는 것으로 확인하고, 휘발성 지방산과 알콜은 가스 크로마토그래피(Sigma 2000, Perkin Elmer, U.S.A.)를 사용하여 플레임이온화검출기(flame ionization detector)로 분석하였다. 도 4는 본 발명의 고도호열성 미생물 서모언에어로박터 연세이 KB-1의 배양 생성물 중 에탄올의 검출을 나타내는 가스크로마토그래피 스펙트럼이다. 도 4에서 보듯이, 80℃에서 배양한 KB-1 균주 배양액을 시료로 하였을 때, 시료주입 후 2.411분 후에 나타난 피크(peak)가 에탄올에 해당되는 피크로서, 배양생성물로 에탄올이 생성되는 것을 가스크로마토그래피를 이용하여 확인할 수 있었다. 따라서, 본 발명의 KB-1 균주는 에탄올의 끓는 점인 78.5℃ 이상의 온도에서 활발히 생육함과 동시에 에탄올을 생산하므로, 증류를 위한 가열과정이 생략될 수 있다는 장점을 가지는 바, 순수한 에탄올 생산균주로서 산업적으로 응용될 수 있다.
이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 신규한 고도호열성 미생물 서모언에어로박터 연세이 KB-1(Thermoanaerobacter yonseiiKB-1, KFCC-11116)을 제공한다. 본 발명의 신규한 고도호열성 미생물 서모언에어로박터 연세이 KB-1은 극한성 미생물로서, 고온에서도 성장이 가능하다는 특성으로 인하여 산업적으로 유용하게 활용될 것이다. 예를 들면, 본 발명의 서모언에어로박터 연세이 KB-1은 에탄올의 끓는 점인 78.5℃ 이상의 온도에서 활발히 생육함과 동시에 에탄올을 생산하므로, 증류를 위한 가열공정이 생략될 수 있다는 장점을 가지는 바, 순수한 에탄올 생산균주로서 산업적으로 응용될 수 있다.

Claims (1)

  1. 고도호열성 미생물 서모언에어로박터 연세이 KB-1(Thermoanaerobacter yonseiiKB-1)(KFCC-11116).
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