KR20010071676A

KR20010071676A - 신규 펩티드 ｙ-2

Info

Publication number: KR20010071676A
Application number: KR1020007014958A
Authority: KR
Inventors: 오사지마가쯔히로; 세끼에이지; 요시다마유미
Original assignee: 오사지마 가즈하루; 센미에끼스 가부시키가이샤
Priority date: 1999-04-28
Filing date: 1999-08-09
Publication date: 2001-07-31
Also published as: CA2300229A1; US20030148923A1; EP1094071A1; EP1094071A4; JP2000312567A; CA2336296A1; KR100653582B1; WO2000066626A1; US7112571B2; JP4053686B2

Abstract

알칼리성 프로테아제로 어육 (정어리 등) 을 처리하고, 이에따라 수득한 펩티드를 펩티드-흡착 수지 (ODS 수지 등) 로 흡착시킨 후 이를 10 % 에탄올 수용액으로 용출하여 수득한 펩티드 (Y-2 분획). 탁월한 혈압-저하 효과를 갖기 때문에, 상기 신규 펩티드는 영양 보충제 및 상술된 건강 식품으로서 사용가능하다. 또한, 혈압강하 약제로서 유리하게 사용될 수 있다.

Description

신규 펩티드 Ｙ-2{NOVEL PEPTIDE Y-2}

본 발명자 등은 어육을 열적으로 변성시킨 후, 그를 중성 또는 알칼리성 프로테아제로 가수분해하고, 사용된 효소를 불활성화시키고, 최종적으로 펩티드를 분리시키는 것을 포함하는 방법을 통하여, ACE-억제 활성을 갖는 펩티드 α-1000 을 앞서 수득하였다 (JP-A-5-271297).

본 발명이 해결해야 할 문제

본 발명은 혈압강하 작용에 탁월할 뿐 아니라 고도로 안전한 물질을 개발하기 위하여, 혈압강하의 중요성을 고려하는 다양한 관점으로부터 조사를 수행하여 왔으며 본 발명의 목적은 본 발명자 등에 의해 이미 개발된 펩티드 α-1000 으로부터 강한 ACE (안지오텐신 전환 효소) 억제 활성을 갖는 신규 펩티드를 단리하는 것이다.

문제 해결 방법

상기 언급된 목적을 성취하기 위하여, 본 발명자 등은 펩티드 α-1000 의 수용액을 펩티드-흡착 수지 (ODS 수지) 로 처리하고 10 % 에탄올로 용출하여 Y-2 분획을 산출하는 예의 연구를 수행하여 왔고, Y-2 분획이 신규 펩티드일 뿐 아니라, 놀랍게도, 테스트할 실제 대상을 사람으로 하여 혈압강하 테스트를 인간의 체내에서 수행함으로써 (큐슈 대학 보건 과학 기구의 인간 조사 검토 위원회에 의해 이미 승인을 받음) 그 효과를 실제 확인하고, 이로써 본 발명자 등은 본 발명을 성취하는데 성공하였다.

따라서, 본 발명은 유효 성분으로서 신규 펩티드인 Y-2 를 사용한 혈압 강하계에 관한 것이고, 본 발명의 매우 큰 특성은 Y-2 가 아직까지 알려지지 않은 신규 물질일 뿐 아니라 탁월한 혈압강하 작용을 갖는 것이 확인되었다는 것이며, 더 나아가 혈압강하 작용이 통상적인 ACE-억제 활성 측정 방법 또는, 다시 말해 간접적인 방법이 아닌, 직접적인 혈압 측정 또는, 다시 말해 직접적인 방법으로 확인되고 또한 혈압강하 작용에 대한 확인이 랫트 및 마우스와 같은 동물을 사용한 통상적인 방법이 아닌 인간의 혈압을 직접적으로 측정한 방법으로 수행되었다는 점이다.

따라서, 본 발명은, 혈압강하 작용 또는 실제, 매우 탁월한 혈압강하 작용이, 동물 테스트나 효소의 억제 정도를 측정하는 간접적인 방법 대신 인간에게 직접 Y-2 를 투여하여 직접적으로 인간의 혈압을 측정하는 직접적인 방법 (임상 테스트) 으로 성공적으로 확인되고 또한 인간에 대하여 투여, 및 약학적 제제 및 식음료품의 제조상의 그의 안정성 및 용이함이 확인되었다는 점에서 매우 획기적이다.

본 발명은 신규 펩티드 및 그의 제조 방법, 더 나아가 그의 혈압강하 용도에 관한 것이다.

도 1 은 펩티드 α-1000 의 UV 스펙트럼 패턴이다.

도 2 는 펩티드 α-1000 의 IR 스펙트럼 패턴이다.

도 3 은 겔 여과 중 펩티드 Y-2 의 분자량 분포 패턴이다.

도 4 는 펩티드 Y-2 의 UV 스펙트럼 패턴이다.

도 5 는 펩티드 Y-2 의 IR 스펙트럼 패턴이다.

도 6 은 HT 그룹 중 피험자의 맥박 및 혈압 데이터를 나타내는 그래프이다.

도 7 은 HT 그룹 중 피험자의 맥박 및 혈압 데이터를 나타내는 그래프이다.

도 8 은 개입 테스트에서의 데이터를 나타내는 그래프이다.

도 9 는 투약량 변화에 관한 혈압 변화를 나타내는 그래프이다.

이제, 본 발명은 이하에서 상세히 기재될 것이다. 먼저 언급될 것은 본 발명의 펩티드 Y-2 의 원 재료로서 사용되는 펩티드 α-1000 이다.

펩티드 α-1000 은 어류 및 갑각류로부터 분리되고, 예를 들어 JP-A-5-271297 에 따라 제조될 수 있다. 먼저, 어류 및 갑각류는 육류 수집기, 골발기 등에서 처리되어 육류를 분리하게 된다. 원료는 가능한 신선한 것이 바람직하다. 분리된 육류를 분쇄하여 각각 약 10 kg 중량의 여러개의 분쇄된 어육 덩어리로 나누고, 상기 육류 덩어리를 그 다음 처리에 적용할 수 있지만, 필요할 경우, -50 내지 -20 ℃ 사이의 온도, 예를 들어 약 -30 ℃ 의 찬 공기를 분무하여 빠르게 냉동시킬 수 있고, 필요할 경우 -25 내지 -20 ℃ 사이의 온도에서 저장시킴으로써 적절하게 사용될 수 있다.

본원에서 사용가능한 어류 및 갑각류는, 예를 들어 정어리, 전갱이류, 다랑어, 보니토, 꽁치, 고등어 등과 같은 적색육을 갖는 어류; 가자미, 돔, 실라지노이드 (sillaginoid), 전어, 대구, 청어, 방어 등과 같은 백색육을 갖는 어류; 상어,가오리 등과 같은 연골 어류; 빙어, 잉어, 곤들매기, "야마메" (송어의 일종) 등과 같은 민물고기; 그라뉼로스 (granulose), 아귀등과 같은 심해 어류; 및 닭새우, 참새우, 새우, 게, 문어, 오포섬 (opossum) 새우 등을 포함한다.

수합한 어류 및 갑각류 육류를 육류 분쇄기 등으로 분쇄하여, 육류 중량의 1/2 내지 20 배, 바람직하게는 1 내지 10 배의 물을 첨가한다. 그 후, 이를 가열함으로써 그에 존재하는 자기분해 효소를 불활성화시키고 또한 살균시키는 동시에 그를 구성하는 단백질을 열적으로 변성시킴으로써 후속하는 효소 반응 효율을 증가시킨다. 그를 가열하기 위해, 의도된 결과를 초래할 수 있는 임의의 조건을 사용가능한데, 예를 들어 65 ℃ 이상의 온도에서 2 내지 60 분간, 또는 바람직하게는 80 ℃ 이상에서 5 내지 30 분간 가열할 수 있다.

그 다음, 알칼리화제, 예를 들어 수성 암모니아 또는 수산화나트륨 (또는 수산화칼륨) 등의 수용액을 그에 첨가하여 육류가 프로테아제로 처리되기에 적절한 pH 값을 갖도록 한다. (예를 들어, 알칼리성 프로테아제에 대하여, 육류의 pH 는 7.5 이상, 바람직하게는 8 이상일 수 있다.) 그 후 또한 프로테아제에 적절한 온도에서 육류를 가열하고 (예를 들어, 사용되는 프로테아제의 형태에 따라 다르지만, 20 내지 65 ℃ 의 온도; 예를 들어, 알칼리성 프로테아제에 대하여, 육류는 35 내지 60 ℃ 또는, 바람직하게는 40 내지 55 ℃ 의 온도에서 가열됨) 육류를 30 분 내지 30 시간 동안 프로테아제로 처리한다 (예를 들어 알칼리성 프로테아제의 경우, 30 분 내지 25 시간, 바람직하게는 1 내지 17 시간).

중성 또는 알칼리성 조건에서 단백질을 분해시킬 수 있는 임의의 그리고 모든 프로테아제가 본원에서 사용가능하고 하나 이상의 프로테아제가 단독으로 또는 배합되어 사용될 수 있다. 그의 근원으로서, 본원에서 사용되는 프로테아제는 동물 및 식물 뿐 아니라 미생물로부터 유도될 수도 있고, 이들은 예를 들어 펩신, 레닌, 트립신, 키모트립신, 파파인, 브로멜라닌 및 균 프로테아제, 사상세균 프로테아제, 방선균 프로테아제 등을 포함하는 광범위한 각종 프로테아제를 말한다. 적용 및 필요에 따라 달라지지만, 통상적으로, 시장에서 수득가능한 상기 효소가 사용될 수 있고, 또한 비정제 효소 및 고체 또는 액체의 효소-함유 물질, 예를 들어 효소-함유 배양액 및 코지 (맥아쌀 또는 맥아) 가 사용가능하다. 첨가되는 효소의 양은 0.1 % 내지 5.0 % 정도이다.

필요할 경우, 이에따라 처리된 육류가 그 후 중성화되고 70 ℃ 이상 (또는 바람직하게는 80 ℃ 이상) 의 온도에서 2 내지 60 분 (또는, 바람직하게는 5 내지 30 분) 동안 가열되어 사용되는 효소를 불활성화시키고 그로부터 의도하는 펩티드 분리를 촉진시키다. 효소 불활성화를 위해 열처리한 육류를 그 후 그대로 진동 스크린 등을 통과시켜 그로부터 조 불순물들을 제거한 후, 선택적으로 Jector 를 통과시키고 최종적으로 초원심분리시켜서 침전된 불순물 및 부유 (floating) 불순물을 그로부터 제거한다.

다음으로, 수득한 생성물을 여과 보조기, 예를 들어 규조토 등 (예를 들어 셀라이트) 을 사용하여 여과하고, 수득한 여과액을 활성 탄소로 처리하여 그를 탈취, 탈색 및 정제시킨다 (사용되는 활성 탄소의 양은 0.05 내지 20 중량/부피% 또는, 바람직하게는 0.1 내지 10 중량/부피% 이고 활성탄소로의 처리는 20 내지 65℃, 바람직하게는 25 내지 60 ℃ 에서, 15 분 내지 4 시간 동안, 바람직하게는 30 분 내지 2 시간 동안 수행될 수 있음).

정제된 생성물은 그 후 임의의 통상적인 방법, 예를 들어 감압하에서 농축된다 (0 내지 50 ℃ 의 온도에서 30B ×정도로). 필요할 경우, 이를 다시 (초)원심분리 또는 여과하여 펩티드 용액을 수득한다. 이에따라 수득한 펩티드 용액을 살균하고 (UHTST 를 통하여 또는 임의의 다른 통상적인 방법으로), 저장기에 충진하여 생성물을 수득한다 (α-1000 (액체)). 필요할 경우, 이를 더 농축하거나 심지어 희석하거나 분무-건조, 동결-건조 등의 임의의 통상적인 방법을 사용하여 60-메시 정도의 분말 생성물로 분말화할 수 있고 분말을 백 또는 임의의 다른 저장기에 패킹하여 생성물 (α-1000 (분말)) 을 산출할 수 있다. 상기 생성물을 냉장고 또는 냉동기에 저장한다.

이와같이 수득한 액체, 반죽성 또는 분말 펩티드가 α-1000 이다.

펩티드 α-1000 (분무-건조된 분말 형태의) 의 물리화학적 특성이 하기 표 1, 표 2 및 표 3 에 있다.

표 1

펩티드 α-1000 (분말) (1) 의 물리화학적 특성

(A) 분자량:

200 내지 10,000 (Sephadex G-25 컬럼 크로마토그래피로 측정함).

(B) 융점:

119 ℃ 에서 착색됨 (분해점).

(C) 고유광회전도:

[α]_D ²⁰= -22°.

(D) 용매 중 용해도:

물에서 용이하게 용해됨; 그러나 에탄올, 아세톤 및 헥산에서는 거의 불용성임.

(E) 산성, 중성 또는 염기성에서의 화학적 차이:

중성, 5.0 내지 8.0 의 pH (10 % 용액).

(F) 외관, 및 구성 성분:

백색 분말로서, 물 5.14 % (감압에서, 가열 건조법), 단백질 87.5 % (Kjeldahl 방법으로 질소/단백질 전환 계수 6.25), 지질 0 % (Soxhlet 추출법), 및 회분 5 % (직접적인 회분화법) 를 포함함.

표 2

펩티드 α-1000 (분말) 의 물리화학적 특성 (2)

(G) UV 스펙트럼:

도 1 에 나타낸 바와 같음.

(H) IR 스펙트럼:

도 2 에 나타낸 바와 같음.

(I) 특성:

어육으로부터 유래하고 가열에 의해 자기분해 효소를 불활성화시킨 후프로테아제로 가수분해함으로써 수득된 펩티드.

(J) 아미노산 조성:

표 3 에 나타낸 바와 같음.

펩티드 α-1000 (분말) 의 아미노산 조성

분석 테스트을 위한 항목	결과 (%)	분석법
총 아미노산아르기닌리신히스티딘페닐알라닌티로신류신이소류신메티오닌발린알라닌글리신프롤린글루탐산세린트레오닌아스파르트산트립토판시스틴총 양	3.346.863.342.332.016.353.272.264.165.173.592.1512.353.303.708.360.320.4773.33	아미노산 자동 분석법(시스틴을 포름 과산으로 산화시킨 후 염산으로 가수분해시키고, 트립토판을 고성능 액체 크로마토그래피로 분석하는 것을 제외함)

액체일 경우는 직접적으로, 분말일 경우에는 그에 물을 첨가한 후, 이에따라 상기 기재된 방법으로 제조된 펩티드 α-1000 을 ODS 수지 등과 같은 펩티드-흡착 수지에 통과시킨 후, 물 등으로 세척하고, 그 후 각종 농도의 에탄올 등으로 순서대로 용출하여 각 분획을 수득한다. 이 중, 강력한 혈압강하 활성을 갖는 분획을 분별하고, 농축 및 건조와 같은 필요한 처리를 거쳐 혈압강하 성분을 산출한다. 예를 들어, 10 % 에탄올로 용출하여 수득된 분획 Y-2 는 탁월한 혈압강하 활성을 나타내었다.

본 발명에 따른 펩티드 Y-2 는 아직 알려지지 않은 신규한 물질이고, 탁월한 혈압강하 활성을 나타내며, 그의 안정성에 있어서 문제가 없으므로, 혈압강하제 및 혈압강하를 목적으로 하는 구체화된 건강 식품을 위한 펩티드로서 사용될 수있다. 그러므로, 본 펩티드는 조미료 및 영양 보조제와 같은 식품 첨가제 및 동물 사료로서 사용될 수 있고, 또한, 상기 언급된 특정 생리학적 활성으로 인하여, 몇몇의 경우에 있어서는 고혈압 질병 치료를 위한 예방 약제 및 임상용도의 영양 보조제, 건강 식품, 주입액 등으로서 널리 사용될 수 있다.

식품으로서 사용될 경우, 펩티드가 그대로 첨가되거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용되는 것과 같은, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 약제로서 사용될 경우, 경구 또는 비경구로 투여될 수있다. 경구 투여될 경우, 통상적인 방법에 의해 정제, 과립, 분말 제제, 캡슐, 희석된 분말 제제, 드링크 등으로 제조될 수 있다. 비경구 투여될 경우, 예를 들어 주사 제제, 점적제, 좌제 등으로서 사용될 수 있다.

본 발명은 이제 하기 참고예 및 실시예에 의해 더욱 상세히 예시화될 것이다.

참고예

신선한 정어리를 골발기에서 가공하여 육류를 수합하였다. 육류를 분쇄하여 각각 10 kg 중량의 분쇄된 어육 몇 덩어리로 나누고, 상기 육류 덩어리를 -30 ℃ 이하의 온도에서 빠르게 냉동시켰다. 그 후, 각각의 육류 덩어리를 제분기로 제분하고, 여기에 육류와 동일한 양의 물을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 탱크에 공급한 후 그 안에서 100 ℃ 에서 10 분간 가열함으로써 육류 내 자기분해 효소를 불활성화시키고 육류를 열적으로 변성시켰다. 그 다음, 수성 암모니아를 이에 첨가하고, 가공된 육류의 pH 값이 9.5 가 되도록 조절하였다.

상업적으로 수득가능한 알칼리성 프로테아제 0.1 % 용액을 이에 첨가하였다. 그 후, 생성된 육류를 50 ℃ 에서 17.5 시간 동안 가열하여 첨가한 효소로 분해시켰다. 그 다음, 이를 15 시간 동안 비등시켜서 사용된 효소를 불활성화시켰다.

그 후 이를 진동-스크린 (150 메시) 에 통과시킨 후 Jector (5000 rpm) 로 처리한 후, 적당한 원심분리기 (15000 rpm) 로 처리하였다. 그 후, 여과 보조물로서 규조토를 사용하여 이를 여과하고, 생성된 여과액을 펩티드 액체로서 사용하였다.

수득한 펩티드 액체 1 중량/부피 % 에 활성 탄소를 첨가한 후, 30 ℃ 에서 60 분간 교반한 후 여과시켰다. 여과액을 감압하에 통상적인 방법으로 (20 ℃) 농축시킨 후, 역시 통상적인 방법으로 UHTST 로 살균시켜 α-1000 생성물 (액체) 를 수득하였다. 이를 통상적인 방법을 사용하여 60 메시의 입자 크기를 갖는 α-1000 생성물 (분상) 로 더 분무-건조시켰다. 각각의 생성물을 냉동 저장하였다.

이와같이 제조된 펩티드 α-1000 (분상) 을 하기 언급된 조건하에 컬럼 중 Sephadex G-25 겔을 통하여 여과시키고, 그의 분자량이 200 내지 10,000 임을 발견하였다.

컬럼 크기: 16 Φ×950 mm.

용출액: 0.1 M 인산 완충액 (pH 7.0).

분별: 2 ml/튜브.

유동율: 10 ml/시.

분자량 마커: 바시트라신 (분자량: 1450).

상기와 같이 수득한 펩티드 α-1000 (액체) 는 73.6 % 의 물 함량을 가졌고 (감압 열 건조법으로 측정함), 담황색을 띠었다. 그의 10 % 용액은 pH 가 7.5 였다. 이는 어류 냄새가 나지 않고 쓰지 않았다. 그의 성분 분석 및 아미노산 조성 측정을 수행하였고 결과를 하기 표 4 및 표 5 에 나타내었다.

펩티드 α-1000 (액체) 의 성분 분석

분석 테스트 항목	결과	분석법
단백질지질회분섬유당류에너지아미노 형태 질소철칼슘나트륨중금속 (Pb)비소 (As₂O₃)히스타민	24.8 %0 %1.6 %0 %0 %99 kcal/100 g1.2 %0.11 mg/100 g4.5 mg/100 g211 mg/100 g1.9 ppm3.7 ppm검출되지 않음	Kjeldahl 방법 (1)Soxhlet 추출직접 회분화법변형된 Henneberg-stohman 방법(2)(*3)Van Slyke 방법o-페난트롤린 흡광측정법원자 흡착 분광법원자 흡착 분광법나트륨 술피드 열량측정법DDIC-Ag 흡착 분광법HPLC
주:1: 질소 단백질 전환 계수: 6.252: 계산식: 100-(물 함량 + 단백질 + 지질 + 섬유 + 회분)*3: 에너지 전환 계수: 단백질, 4; 지질, 9; 카르보히드레이트 (섬유 + 당류), 4

펩티드 α-1000 (액체) 의 아미노산 조성

분석 테스트 항목	결과 (%)	분석법
총 아미노산아르기닌리신히스티딘페닐알라닌티로신류신이소류신메티오닌발린알라닌글리신프롤린글루탐산세린트레오닌아스파르트산트립토판시스틴총 양	0.931.910.930.650.561.770.910.631.161.441.000.603.440.921.032.330.090.1320.43	아미노산 자동 분석법(시스틴을 포름 과산으로 산화시킨 후 염산으로 가수분해시키고, 트립토판을 고성능 액체 크로마토그래피로 분석하는 것을 제외함)

실시예 1: 펩티드 Y-2 의 제조

탈이온수 26.2 ℓ를 정어리 펩티드 α-1000 (액체) (Brix 45, 단백질 함량 29.6 %) 800 ml 에 첨가하고, 그에 포함된 펩티드가 수지에 흡착되는 ODS 수지 (YMC ODS-AQ120-S50) 로 충진시켰다. 그 후, 컬럼을 탈이온수로 세척하고, 0 %, 10 %, 25 %, 50 % 및 99.5 % 의 에탄올 수용액 각 27 ℓ 로 용출하여 각각 Y-1, Y-2, Y-3, Y-4 및 Y-5 의 분획을 수득하였다. 그 중, Y-2 분획을 40 ℃ 에서 농축하여 그로부터 에탄올을 제거한 후, 냉동-건조하여 정제된, 정어리 펩티드 (Y-2) 를 수득하였다. Y-2 분획은 0.15 % 의 Val-Tyr 를 포함하였다. 본 발명의 신규 펩티드 Y-2 의 물리화학적 특성을 하기 표 6, 표 7 및 표 8 에 나타내었다.

표 6

Y-2 분획의 물리화학적 특성 (1)

(1) 분자량:

200 내지 10,000 (Asahipak GS-320 컬럼 크로마토그래피로 측정) (도 3).

(2) 융점:

138 ℃ 에서 착색됨 (분해점). ([Japanese Standards for Food Additives, 5 th Ed.] 에 기재된 바와 같은 통상적인 테스트 방법에 따라 융점 측정법으로 측정)

(3) 고유광회전도:

[α]_D ²⁰= -51°([Japanese Standards for Food Additives, 5 th Ed.] 에 기재된 바와 같은 통상적인 테스트 방법에 따라 고유광회전도 측정법으로 측정)

(4) 용매에서의 용해도:

물에서 쉽게 용해됨; 그러나 에탄올, 아세톤 및 헥산에서는 거의 불용성임. (12 번째 개정판 [Japanese Pharmacopoeia] 에 기재된 바와 같은 통상적인 규정에 따라 측정)

(5) 산성, 중성 또는 염기성에서의 화학적 차이:

중성, 5.0 내지 8.0 의 pH (10 % 용액).

(6) 외관:

백색 또는 담황색 분말

(7) 구성 성분:

물 5.4 % (정상압, 가열 건조법), 단백질 95.3 % (Kjildahl 방법, 질소/단백질 전환 계수 6.25 인), 지질 0 % (Soxhlet 추출법), 및 회분 1.1 % (직접 회분화법).

표 7

Y-2 분획의 물리화학적 특성 (2)

(8) UV 스펙트럼:

(도 4 에 나타낸 바와 같음; [Japanese Standards for Food Additives, 5th Ed.] 에 기술된 일반적인 테스트법에 따른 흡착 측정법으로 측정)

샘플: 0.1 % 수용액.

사용된 장치: Shimadzu Seisakusho Co. 에 의해 제조된 UV-240

(9) IR 스펙트럼:

(도 5 에 나타낸 바와 같음; KBr 정제법으로 측정).

샘플 제조: 브롬화칼륨과 혼합하여 정제를 형성.

측정 조건:

사용된 장치: Nikole Co. 에 의해 제조된 FT-IR Magna 560.

해상도: 8 ㎝.

통합: 32 회.

(10) 아미노산 조성:

표 9 에 나타낸 바와 같음.

사용된 장치: Shimadzu Seisakusho Co. 에 의해 제조된 LC-6A 시스템

검출: OPA 방법

Y-2 분획의 아미노산 조성

아미노산	분석 데이터 (%)	분석법
아스파르트산트레오닌세린글루탐산글리신알라닌발린메티오닌이소류신류신티로신페닐알라닌히스티딘리신아르기닌	10.974.102.9012.524.915.066.202.555.559.472.964.752.8310.077.50	아미노산 자동 분석법(Shimadzu 의 LC-6A 시스템)

실시예 2: 펩티드 Y-2 투여에 의한 임상 검사

인간에 있어서 펩티드 Y-2 의 기능을 확인하기 위하여, 드링크 형태의 펩티드 Y-2 를 고혈압인 지원자에게 투여함으로써 테스트 지원자에게서의 펩티드의 혈압 저하 효과를, 펩티드 Y-2 를 이들에게 계속적으로 투여하여 확인하였다.

A: 테스트 드링크의 제조

펩티드의 투여에 있어서, 실제 기능성인 식품을 고려한 드링크 형태의 음료가 사용되었다. 한 병은 100 ml 의 드링크를 포함하고, 이는 인간에게 계속적으로 투여하기 용이하다. 펩티드를 포함하는 진드링크 (true drink) 및 포함하지 않는 플라시보 드링크간의 맛의 차이를 없애기 위하여, 필수적인, 그러나 최소한의 조미를 사용하여 둘 모두의 드링크를 처리하였다. 따라서, 드링크는 액체 프룩토스-글루코스 9.0 % (Nippon Corn Starch 에 의해 제조된 High-Craft M-75), 순수 꿀 (Fujii Yohosho 에 의해 제조됨) 7.0 %, 스테비아 추출물 0.12 % (Ikeda Toka Kogyo 에 의해 제조된 High Stevia 100), 사우어 0.2 %, 및 조미료 0.12 % 를 포함하는 한편, 진드링크에만, 2.0 % 의 정제된, 분말 정어리 펩티드를 첨가하였다. 따라서, 진드링크는 2.0 g/100 ml 양의 정제된, 정어리 펩티드 Y-2 분획 분말을 포함하고, 하나의 진드링크의 Val-Tyr 함량은 3 mg/100 ml 였다. 플라시보 드링크에는, 정제된 정어리 펩티드 Y-2 분획을 첨가하지 않고 물로 대신하였다.

모든 드링크를 실질적인, 통합된 제조라인에서 제조하였다. 따라서, 200 kg/배치 중량의 구성성분을 제형화하고, 혼합하고 60 ℃ 에서 용해시킨 후, 128 ℃ 에서 10 초간 플레이트 살균화하고, 90 ℃ 에서 미리 잘 세척된 갈색 100 ml 병에 자동으로 충진시켰다. 이에따라 드링크로 충진된 병을 실온에서 놔두어 냉각시킨 후 탱크 안에서 흐르는 물로 빠르게 냉각시켰다. 동일한 도안의 라벨을 모든 진드링크 병 및 플라시보 드링크 병에 부착하여 본 임상 테스트에 참여하는 지원자, 심지어는 의사 및 간호사 까지도 병을 구별하지 못하도록 하였다.

B: 피험자

(1) 인간 조사 검토 위원회에 의한 승인

본 연구 이전, 임상 테스트는 "큐슈 대학, 보건 과학 기구의 인간 조사 검토 위원회" 에 의해 승인받았다.

(2) 피험자 선발:

모든 피험자에게 본 테스트의 의미 및 목적, 테스트 방법, 및 테스트에서의 안정성에 대하여 알려주고, 테스트의 세부사항을 잘 이해시켰다. 그 후, 이들에게 테스트에 대한 동의를 구하여 동의 증명서에 사인하도록 하였다. 임상 검사에 참여하는 의사들은 이들을 면담으로 체크하였고, 심전계, 흉부의 X-선 사진 등을 포함하는 그들의 의학적 검사 데이터를 더 체크하였다. 이렇게 체크된 지원자들의 의학적 데이터 및 이들의 예비 정기 의학 검사 데이터에 기초하여, 의사들은 테스트에 적절한 46 명의 피험자를 선정하였다. 이와같이 선택된 46 명의 피험자에 대하여 본 임상 검사하였다. US Joint National Committee 에 의해 규정된 기준에 근거하여 이들을 두 그룹으로 나누었다. 쉬는 상태의 앉은 자세에서, 심장 확장기의 혈압이 85 mmHg 미만이고 심장 수축기의 혈압이 130 mmHg 미만인 피험자를 정상 혈압을 가진 그룹 (NT 그룹); 반면에 85 mmHg 이상의 심장 확장기 혈압 및/또는 130 mmHg 이상의 심장 수축기 혈압 둘 모두를 갖는 고-정상 혈압을 갖는 피험자 및 고혈압 피험자가 다른 고혈압 그룹 (HT 그룹) 에 있다. 구체적으로는, NT 그룹에 12 명의 피험자; HT 그룹에 34 명의 피험자가 있다. 랜덤 샘플링을 통하여 각각의 두 그룹의 피험자를, 펩티드 투여를 위한 진그룹 (true group) 및 펩티드 미투여를 위한 플라시보 그룹으로 더 분류하였다. 각 그룹의 피험자의 특성을 하기 표 9 에 나타내었다.

상기 표에 나타낸 바와 같이, 혈압에 따라 HT 그룹 및 NT 그룹으로 분류된 피험자를, 펩티드 투여를 위한 진그룹 및 펩티드 미투여를 위한 플라시보 그룹으로 더 분류하였다. 따라서, 이들은 하기와 같은 A 내지 D 의 4 개의 그룹으로 분류되었다:

A 그룹:

하루에 2 회, 4 주간 계속적으로 진드링크를 투여하게 되는 SBP ≥130 mmHg 및/또는 DBP ≥85 mmHg 인 피험자.

B 그룹:

하루에 2 회, 4 주간 계속적으로 플라시보 드링크를 투여하게 되는 SBP ≥130 mmHg 및/또는 DBP ≥85 mmHg 인 피험자.

C 그룹:

하루에 2 회, 4 주간 계속적으로 진드링크를 투여하게 되는 SBP <130 mmHg 및/또는 DBP < 85 mmHg 인 피험자.

D 그룹:

하루에 2 회 4 주간 계속적으로 플라시보 드링크를 투여하게 되는 SBP <130 mmHg 및/또는 DBP < 85 mmHg 인 피험자.

약어의 의미를 하기한다:

SBP : 심장 수축기의 혈압 (mmHg).

DBP : 심장 확장기의 혈압 (mmHg).

BMI : 신체 질량 지수.

F : F-테스트.

t : t-테스트.

C: 프로토콜

(1) 투약

펩티드 (Y-2 분획) 4 g 은 체중이 60 kg 인 표준 성인 남성에 대한 일일 투약량이다 (Y-2 분획의 Val-Tyr 함량은 0.15 % 인 것으로 생각됨). 랫트에 대한 아급성 독성 테스트에서, 한달간 랫트에 2.5 mg/kg·일 (그에 존재하는 Val-Tyr 에 관하여) 의 계속적인 투여에 있어서의 그의 안정성을 확인하였다.

(2) 투여 방법

계속적인 투여에 대하여 본원에서는 피험자를 있는 그대로 2 주간 관찰한후, 플라시보 드링크를 이들에게 1 주간 투여한 후, 진드링크를 4 주간 투여하고, 최종적으로 피험자를 다시 4 주간 관찰하는, 랜덤화 이중맹검 플라시보-제어 연구를 수행하였다. 진드링크 투여 기간에서, 피험자들은 아침에 아침식사 후, 저녁에 저녁식사 전, 하루에 2 회 진드링크를 취하였다. 오전 9:30 에서 11:30 사이의 미리결정된 시간에, 일주일에 한번 피험자의 혈압 (앉은 자세에서) 및 맥박을 체크하였다. 드링크 투여 전과 후, 각 피험자의 체중을 측정하고 각 피험자의 혈액 및 소변을 분석하였다.

드링크 투여, 혈압 측정 및 의학적 검사 시간 모두를 엄격하게 제한하지만, 이들의 식사 및 행동을 포함하는 다른 것들에 대해서는, 모든 피험자들이 자유롭도록 하였다.

(3) 테스트 항목 및 테스트 방법

의사들은 면접 및 의학적 진단, 및 이들의 기록된 데이터에 의해 임의의 주관적인 증상의 존재 및 부재 및 객관적인 징후를 체크하였다. 테스트 기간 동안, 간호사들은 데이터 측정 및 혈액 수집을 수행하였다. 통상적인 생리학적 테스트는 혈액, 맥박 및 체중 측정을 포함한다. 혈압 및 맥박 측정에 있어서, 피험자들은 측정하기 전 5 분 이상 앉아서 쉬도록 하였다. Nippon Colin Co. 에 의해 제조된 BP-203RV2, 자동 혈압 측정기를 연속으로 사용하여, 약 2 분의 간격을 두고 연속 3 회 혈압 및 맥박을 측정하고, 데이터를 평균화하였다. 각 피험자의 혈압 및 맥박으로서 평균치를 기록하였다. 테스트 기간 동안, 매번 동일한 자세로 측정을 수행하였다. 드링크 투여 전후에 의학적 테스트을 수행하였다.

D: 통계적 분석

평균치 ±표준 오차 (SE) 에 관하여 데이터를 나타내었다. 의학적 테스트에 있어서의 시간-의존적 변화는 t-테스트에 따라 분석하였다. 연속적인 투여 테스트에 있어서 0 내지 4 주간 동안 혈압의 변화에 대하여, 데이터를 분산분석하여 유의차를 측정하였다. 유의 수준은 5 % 이하이고, 테스트 데이터 기호는 하기와 같다:

***:p < 0.001, **:p < 0.01, *:p < 0.05.

하기와 같이 테스트 결과를 분석하고 평가하였다. 따라서, 각 그룹의 데이터를 투여 전 관찰 기간 동안의 4 주 안에 각 그룹의 평균과 비교하여, (1) 투여 전후의 짝 t-테스트 및 (2) 진그룹과 플라시보 그룹에 대한 그룹 테스트를 실시하였다. 개입 테스트에 대하여, 투여 전 예비-관찰 기간이 2 주였고, 투여 후 데이터를, 예비-관찰 기간에서의 평균에 관하여 짝 t-테스트 하였다.

E: 결과

1. 주관적인 증상

12 주 간의 테스트 기간 동안, NT 그룹 및 HT 그룹 모두의 모든 피험자들이 주관적인 증상을 보이지 않았다.

2. 혈압 및 맥박

NT 그룹 및 HT 그룹을 각각 펩티드를 투여한 진그룹 및 펩티드를 투여하지 않은 플라시보 그룹으로 더 분류하고, 4 주간의 테스트 기간 및 투여 테스트 후 4 주간의 후-테스트 기간 안에 상기 모든 그룹의 피험자의 혈압 및 맥박을 체크하였다. 도 6 및 도 7 은 테스트한 피험자의 혈압 및 맥박에 있어서의 변화를 나타낸다.

도 6 은및가 각각 Y-2 투여 그룹 (A 그룹) 피험자의 SBP 및 DBP 데이터를 가리키고,및가 각각 플라시보 그룹 (B 그룹) 피험자의 SBP 및 DBP 데이터를 가리키는, 고혈압 그룹 (HT 그룹) 의 피험자의 혈압 및 맥박 데이터를 나타낸다. 도 7 은및가 각각 Y-2 투여 그룹 (C 그룹) 피험자의 SBP 및 DBP 데이터를 가리키고,및가 각각 플라시보 그룹 (D 그룹) 피험자의 SBP 및 DBP 데이터를 가리키는, 정상혈압 그룹 (NT 그룹) 피험자의 혈압 및 맥박 데이터를 나타낸다.

상기에 따른 시험 결과가 하기와 같음을 확인하였다:

1) 정상혈압 그룹 (NT 그룹)

130 mmHg 미만의 심장 수축기 혈압 (SBP) 및 85 mmHg 미만의 심장 확장기 혈압 (DBP) 을 갖는, NT 그룹의 12 명의 피험자에게 4 g/일 의 투약량 (이는 6 mg/일 의 Val-Tyr 투여량에 해당함) 으로 정제된 정어리 펩티드 (Y-2 분획) 를 연속적으로 투여하였다. 결과로서, 진그룹 (C 그룹 의 7 명의 피험자) 및 플라시보 그룹 (D 그룹 의 5 명의 피험자) 의 그룹 테스트 및 펩티드 투여 전후의 짝 t-테스트에서, 혈압 및 맥박 모두에 있어서 유의차가 나타나지 않았다 (도 7).

2) 고혈압 그룹 (HT 그룹)

130 mmHg 이상의 심장 수축기 혈압을 및/또는 85 mmHg 이상의 심장 확장기 혈압을 갖는 HT 그룹의 34 명의 피험자 중에서, 플라시보 그룹 중 5 명의 피험자가, 관찰 기간 동안 이들이 언급한 불가피한 사정으로 인하여 테스트에 참여하지 않기를 원하여 테스트를 그만두었다. 결국, HT 그룹 중 29 명의 피험자가 테스트에 참여하였다. 이들에게, 상기와 같은 동일한 정제된 정어리 펩티드 (Y-2 분획, Val-Try 를 포함) 를 투여하였다. 결과로서, 관찰 기간 (4 주) 동안의 피험자와 비교하여 투여 기간 (4 주) 동안의 피험자에 대한 짝 t-테스트에 있어서, 플라시보 그룹 (B 그룹 의 12 명의 피험자) 중 피험자의 혈압에 있어서 유의차 변화가 나타나지 않았으나, 진그룹 (A 그룹 의 17 명의 피험자) 에게서 유의한 혈압 저하가 관찰되었다 (도 6).

따라서, 펩티드 투여 시작 1 주 후 SBP 에서 최대 9.7 mmHg 의 혈압 저하 및 DBP 에서 최대 5.2 mmHg 의 혈압 저하가 관찰되었다. 상기 데이터는 유의 수준 0.1 % 에서 통계적으로 중요하였다. 1 % 미만의 유의 수준에서 펩티드 투여 기간, 심지어는 투여 후 후-관찰 기간 동안 혈압 저하, 3 주 이내에 유의한 SBP 저하 (p < 0.01) 및 8 주 내에 현저한 DBP 저하 (p < 0.05) 가 지속되었다. 상기 기간 후, 피험자의 혈압은 초기 관찰 기간과 같은 본래 상태로 회복되었다.

진그룹 (A 그룹) 및 플라시보 그룹 (B 그룹) 의 그룹 테스트에 있어서, 진그룹 피험자들은 플라시보 그룹 피험자에 비하여 유의한 혈압 저하를 나타내었다. 구체적으로는, 펩티드 투여 시작 후 최대 SBP 저하는 12.1 mmHg 이었고 최대 DBP 저하는 7.1 mmHg 이었다. 또한 상기 그룹에 있어서, 혈압 저하는 투여 기간에 후속하는 후-관찰 기간 중 3 주 이내로 유의하게 지속되었다. 상기 기간 후, 피험자의 혈압이 예비-관찰 기간에서와 같은 본래 상태로 회복되었다.

테스트 동안, 모든 그룹에서의 모든 피험자가 맥박에 있어서 비정상적이지 않았다.

3. 임상 검사 결과

투여 테스트 전후, 피험자들을 말초 혈액 및 생화학적 혈액 검사 및 24 시간 소변 테스트하고, 그 확인된 결과를 기록하였다. 말초 혈액 검사 통계치 중 적혈구용적치 (Ht) 및 적혈구 관계치 (MCV, MCH, MCHC) 평가에 있어서 임의의 그룹이 유의차를 나타내었지만, 모든 데이터 변화가 정상적인 변화 범위안에 있기 때문에 임상 측면에서 무시할 수 있었다.

실시예 3: 개입 테스트

HT 그룹 중 진그룹의 피험자 7 명을, 실제 투여 기간 후 4 주간의 후-투여 기간에 이어 2 주간의 대조구 관찰 기간 후 플라시보 드링크를 취하는, 개입 테스트하였다. 결과로서, 진 (true) 투여 기간에서, 이들은 이미 개시된 테스트에서와 같이, 1 주 후 최대 혈압 저하 (SBP 10.8 mmHg 및 DBP 5.3 mmHg) 를 보였고, 이들에게 유의한 혈압 저하가 4 주간 지속되었다. 상기 기간 후, 혈압이 본래 상태로 서서히 되돌아갔다. 6 주간의 워시-아웃 (wash-out) 기간 후 이들에게 플라시보 드링크를 투여하였다. 플라시보 투여 기간 동안, 피험자의 혈압이 후-관찰 기간에 비하여 감소하지 않고, 다소 회복되어 증가하였다. 상기 기간 동안, 혈압 회복은 점진적이었다. 데이터는 본 발명의 펩티드의 장기간 지속되는 혈압-강하 효과를 입증한다.

도면에서,및는 테스트된 피험자의 SBP 값 및 DBP 값을 가리키고; 별표는 평균 혈압을 가리키고; P 는 플라시보 드링크를 가리키고; T 는 진드링크를 가리킨다. 유의 수준과 관련하여, 테스트 데이터에 대한 기호는 하기와 같다:**:p < 0.01, ***:p < 0.001.

실시예 4

펩티드 Y-2 는 4 g/일 의 투약량 (이는 6 mg/일 의 Val-Tyr 양에 해당함) 에서 만족스러운 혈압 저하 효과를 나타내었다. 기능성 식품에 있어서의 그의 실용적인 용도를 위하여, 경제적인 측면은 중요한 요소가 될 것이다. 본 연구는 펩티드 투약량을 변경하여 펩티드의 효과에 대한 제한치를 찾아내는, 효과적인 혈압 저하를 위한 최소한의 펩티드 투약량을 확인하는 것이다.

A: 프로토콜

이미 언급한 바와 같은 동일한 조건 하에, 피험자들에게 최소한의 효과적인 펩티드 Y-2 의 투약량을 테스트하였다. 테스트 드링크의 기본 조성 및 피험자 그룹은 이전과 동일하다.

(1) 피험자

본 연구는 혈압 저하를 위한 펩티드 Y-2 의 최소한의 유효 투약량을 확인하는 것이다. 그러므로, HT 그룹 중 정상적인 높은 혈압보다 높은 혈압을 갖는 피험자들만 랜덤 샘플링하여 본원에서 테스트하였다. 이들을 14 명의 진그룹 (평균 연령 45.1 ±3.5, 심장 수축기 혈압 144.5 ±2.7 mmHg 및 심장 확장기 혈압 90.7 ±1.8 mmHg, 둘 모두 평균임), 및 5 명의 플라시보 그룹 (평균 연령 50.4 ±4.9, 심장 수축기 혈압 147.3 ±2.9 mmHg 및 심장 확장기 혈압 92.0 ±2.8 mmHg, 둘 모두 평균임) 으로 분류하였다.

(2) 투약

앞선 생체내 테스트에서, 펩티드 Y-2 가 펩티드 중 Val-Tyr 에 관하여 10 내지 100 μg/kg 의 투약량에서 효과적임이 증명되었다. 그러나, 랫트와 인간의 차이 및 정맥내 주사와 경구 투여의 차이를 고려하여, 본 연구의 최저 투약량은 10 μg/kg 미만이었고, 투약량을 점진적으로 늘려서 펩티드의 효능 발현을 위하여 필수불가결한 한계 투약량을 찾아내었다. 구체적으로는, 정제된 정어리 펩티드 (Y-2 분획) 의 투약을 0.25 g/일 (펩티드 Val-Tyr 함량에 관하여 6.25 μg/kg·일) 에서 0.50 g/일 (펩티드 Val-Tyr 함량에 관하여 12.5 μg/kg·일) 로, 그리고 1.00 g/일 (펩티드 Val-Tyr 함량에 관하여 25 μg/kg·일) 로 점차 증가시켰다.

(3) 투여 방법

2 주간의 관찰 기간 후, 진드링크를 2 주 동안의 예비 결정된 투약량으로 피험자에게 투여하고, 투약량을 2 주의 간격으로 변화시켰다. 앞서 기재된 테스트에서와 같이, 피험자는 아침과 저녁, 하루에 2 회 각각 드링크를 취하고, 혈압 저하에 대한 펩티드의 효과가 확인될 경우 기간 후 테스트를 멈추었다.

B. 결과

수득한 데이터를 도 9 에 나타내었다. 도 9 는 펩티드 Y-2 (정어리 펩티드) 투약량의 변화에 따른 고혈압 그룹 (HT 그룹) 의 환자에 있어서 혈압 변화를 나타낸다 (및가 각각 진그룹의 Y-2 투여 그룹 피험자의 SBP 및 DBP 값을 가리키고,및가 각각 플라시보 그룹의 플라시보 투여 피험자의 SBP 및 DBP 값을 가리킴).

도 9 에서 나타낸 바와 같이, 정제된 정어리 펩티드 (Y-2 분획) 를 초기 투약량 0.25 g/일 로 진그룹의 환자에게 투여하였다. 2 주 후, 피험자의 심장 수축기 혈압이 초기값과 비교하여 5.6 mmHg 만큼 감소하고 그의 심장확장기 혈압이 동일하게 비교하여 3.2 mmHg 만큼 감소하였다. SBP 및 DBP 둘 모두에 있어서, 유의차가 통계학 상으로 인정되었고, 그에 대한 유의 수준은 5 % 였다. 세번째 주의 초기 단계 후, 투약량을 0.50 g/일 로 증가시키자, 세번째 주 후, 피험자의 심장수축기 혈압이 초기값과 비교하여 8.2 mmHg 만큼 감소하고, 그의 심장확장기 혈압이 동일하게 비교하여 3.3 mmHg 만큼 감소하였다. SBP 에 있어서, 유의차가 통계학적으로 인정되었고, 그에 대한 유의 수준이 1 % 였다. 유의 수준과 관련하여, 테스트 데이터에 대한 기호는 하기와 같다: **:p < 0.01, *:p < 0.05.

한편, 플라시보 그룹에서는 혈압에 거의 변화가 없었다. 두 그룹의 피험자에게서 비정상적인 맥박도 관찰되지 않았다. 상기와 같은 데이터로부터, 본 발명의 펩티드가 통계학 상으로, 0.25 g/일 의 투약량 (펩티드의 Val-Tyr 함량에 대하여 6.25 μg/kg·일) 에서 인간의 혈압 저하에 효과가 있었고, 0.50 g/일 의 유효 투약량 (펩티드의 Val-Tyr 함량에 대하여 12.5 μg/kg·일) 에서 유의 수준이 1 % 였다. 심지어 0.25 g/일 (펩티드의 Val-Tyr 함량에 대하여 6.25 μg/kg·일) 의 투약량에서도, 피험자의 혈압은 펩티드 투여 시작 직후 점진적으로 감소하였다. 그러므로, 본 발명의 펩티드는 펩티드 투여가 장기간 계속되는 한 심지어 0.25 g/일 의 최소 투약량에서도 인간의 혈압 저하에 실질적으로 매우 효과적일 것으로 이해된다. 펩티드의 실질적인 최소 유효 투약량을 0.25 g/일 (펩티드의 Val-Tyr 함량에 대하여 6.25 μg/kg·일) 로 간주할 경우, 심지어 상기 최소 유효 투약량의16 배량을 사용하는 28 일간의 상기 기재된 테스트에서와 같은 펩티드 투여에서도, 혈액의 생화학적 측면 및 다른 임상 측면에 있어서 문제가 되는 변화는 발견되지 않았다. 또한, 의사의 질문에 대한 피험자의 대답이 상업적으로-수득가능한 ACE 억제제의 경우에서와 같이 임의의 부작용을 보이지 않았다.

실시예 5: 드링크의 제조

(제형)

액체 프룩토스-글루코스 9.0 %

순수 꿀 7.0 %

스테비아 추출물 0.12 %

사우어 (시트르산) 0.2 %

조미료 0.12 %

펩티드 Y-2 0.125 %

첨가되는 순수 물 총 100 %

상기와 같은 구성 성분을 혼합하고 60 ℃ 에서 용해시키고 128 ℃ 에서 10 초간 플레이트 살균화하였다. 이를 잘 세척된 갈색 100 ml 병에 충진시키고 실온에서 냉각되도록 한 후, 드링크가 제조되는 탱크에서 흐르는 물로 빠르게 냉각시켰다.

생성된 드링크를 분석 테스트 및 아미노산 조성물에 관해 측정하고, 수득한 결과를 표 10 및 표 11 에 각각 나타내었다.

분석 테스트 결과

분석 테스트 항목	결과	해설	분석법
물단백질지질섬유회분당류에너지나트륨	86.9 g/100 g0.3 g/100 g0 g/100 g0 g/100 g0 g/ 100 g12.8 g100 g52 kcal/100 g1.1 mg/100 g	123	진공 가열 건조법Kjeldahl 방법Soxhlet 방법개선된 Henneberg Stohman 방법직접 회분법원자 흡착분광법

주 1: 질소 단백질 전환 계수: 6.25

주 2: 계산식: 100 - (물 + 단백질 + 지질 + 섬유 + 회분)

주 3: 에너지 전환 계수: 단백질, 4; 지질, 9; 탄수화물 (섬유 + 당류), 4

아미노산 조성 (mg/100 g 샘플)

	아미노산 총량
아스파르트산트레오닌세린글루탐산프롤린글리신알라닌시스틴발린메티오닌이소류신류신티로신페닐알라닌히스티딘리신아르기닌	23.28.66.930.018.018.411.7-14.76.313.119.73.611.66.719.117.1
총	228.7 mg

주: (-) = 검출되지 않음

본 발명의 이점

본 발명에 따라, 하기 유의한 이점이 성취된다. 따라서, 정어리 단백질에잠재적으로 존재하는 ACE-억제 펩티드가 실제로 존재하게 하고 고농도로 제조되도록 함으로써 상기 펩티드가 탁월한 맛과 생체내 안정성을 가지며, 높은 안정성을 보이는 기능성 식품으로 제조될 수 있다는 발견에 기초하여 실제 기능성 드링크를 제조하고, 적당한 고혈압을 포함하는 정상적인 고혈압 피험자에게 그의 임상 테스트를 수행하여 하기 이점을 확인하였다.

1) 각 병에, ODS-처리된 10 % 에탄올성 용출된 분획인 정제된 정어리 펩티드 (Y-2 분획) 2.0 g (Val-Tyr 3 mg) 을 포함하는 드링크 (100 ml/병) 를 제조하였다. 정상 혈압 (130 mmHg 미만의 심장수축기 혈압 및 85 mmHg 미만의 심장확장기 혈압) 을 갖는 12 명의 지원자를 7 명으로 구성된 한 그룹과 5 명으로 구성된 또 다른 그룹의 두 그룹으로 분류하였다. 4 주간 하루에 2 병 (진그룹의 Val-Tyr 투약량으로서 6 mg/일) 의 투약량으로, 펩티드를 포함하는 진드링크를 7 명의 지원자에게 투여하는 한편 플라시보 드링크 (공란) 를 5 명의 지원자에게 투여하고, 랜덤 이중맹검 제어 테스트를 수행하여 혈압의 변화에 유의차가 없으며 본 펩티드가 NT 그룹의 혈압 및 맥박에 전혀 영향이 없음을 보였다.

2) 상기 테스트에 있어서, 펩티드 투여 개시 직전 및 투여 4 주 후 혈액을 수합하고 또한 24 시간 동안 소변을 수합하여 혈액 생화학 테스트 및 소변 테스트를 수행하였다. 어떤 항목에 있어서는 변화가 관찰되기도 했지만, 이들은 정상적인 데이터 범위 안에 있는 미미한 것이었고, 임상학적으로 문제가 되지 않았다. 다른 임상 테스트 및 주관적인 증상에서도 비정상성이 없었고, 정상 혈압을 보이는 피험자에 대한 본 펩티드의 임상적인 안정성에 대해서도 전혀 문제가 없었다.

3) 130 mmHg 이상의 심장수축기 혈압 및/또는 85 mmHg 이상의 심장확장기 혈압을 보이는 지원자를 랜덤 샘플링에 의해 진그룹과 플라시보 그룹으로 분류하고 총 29 명에 대한 랜덤 이중맹검 제어 테스트를 수행한 후, 짝 t-테스트에서, 심장수축기 혈압 및 심장확장기 혈압이 진그룹에서 첫번째 주 후에 각각 9.7 mmHg 및 5.2 mmHg 정도로 유의하게 하강하였다 (p < 0.001). 따라서, 인간에 대한 본 펩티드의 혈압강하 효과를 확인하였다.

4) 펩티드 투여 기간이 4 주일 경우에도, 상기 테스트에서 투여를 멈춘 5 번째 주 또는 그 후, 7 번째 주까지 3 주 동안 혈압강하가 여전히 유의하게 관찰되었고 (p < 0.05) 본 펩티드의 혈압강하 유효 기간을 확인하였다.

5) HT 그룹으로부터 7 가지 경우를 랜덤 샘플링하고 진 투여로부터 플라시보 투여까지의 개입 테스트를 수행할 경우, 진드링크 투여의 경우에서 유의한 혈압 저하가 관찰되는 한편 플라시보 투여 후에는 혈압 강하가 관찰되지 않아, 본 테스트의 혈압 저하 효과가 본 펩티드로 인한 것임을 뒷받침하였다.

6) 한편, 투여 전후의 임상 테스트에서, 어떤 항목에서는 변화가 관찰되었지만 그 모두가 미미하고 정상적인 변화 범위 안에 있기 때문에 임상학적으로 문제가 되지 않았다. 주관적인 증상 발병 역시 전혀 없었다. 따라서, 계속적인 투여에 의한 본 펩티드의 안정성을 나타내었다.

7) 기능성 식품으로서의 정어리 펩티드의 실질적인 적용을 위하여, 그의 최소한의 유효 투약량에 대한 조사를 수행하였고, 0.75 mg (Val-Tyr 로서)/일 의 투약량에서, 심장수축기 혈압 및 심장확장기 혈압에 대하여 각각 8.2 mmHg 및 3.3mmHg 정도의 유의한 (p < 0.01) 저하 효과를 관찰하였다.

8) 전체적인 테스트 기간을 통하여, 통상적으로 사용가능한 ACE 억제제에서 관찰되었던 감기 및 발진과 같은 부작용이 없어서, 본 펩티드가 매우 안정하고 통상적으로 취해지는 기능성 식품으로서 매우 효과적인 물질임을 확인하였다.

식품으로부터 고기능을 갖는 식품 물질의 분리 및 추출의 경우, 그 안정성은 필수적인 조건이고, 본 펩티드는 적당한 고혈압 및 정상 고혈압을 갖는 사람에게 충분한 혈압강하 효과를 갖는 것으로 관찰되고 임상 조사 결과 감기와 같은 부작용 없이 매우 안정함을 나타내는 것으로 확인되어, 본 펩티드는 이제 미래 사회에서 매우 중요한 식품 재료가 될 것으로 기대한다.

Claims

하기 물리화학적 특성을 갖는 신규 펩티드 Y-2.

(A) 분자량:

200 내지 10,000 (Asahipak GS-320 을 사용한 고성능 액체 크로마토그래피로 측정함).

(B) 융점:

138 ℃ 에서 착색 및 분해됨.

(C) 용매 중 용해도:

물에서 쉽게 용해됨; 그러나 에탄올, 아세톤 및 헥산에서는 거의 불용성.

(D) 물질의 외관: 백색 내지 담황색 분말.

(E) 성분:

물, 5.4 % (정상압에서, 가열 건조법); 단백질, 95.3 % (Kjeldahl 방법); 지질, 0 % (Soxhlet 추출법); 회분, 1.1 % (직접 회분화법).

(F) 아미노산 조성: 하기 표에 나타낸 바와 같음.

Y-2 분획의 아미노산 조성

아미노산 분석 데이터 (%) 분석법 아스파르트산트레오닌세린글루탐산글리신알라닌발린메티오닌이소류신류신티로신페닐알라닌히스티딘리신아르기닌 10.974.102.9012.524.915.066.202.555.559.472.964.752.8310.077.50 아미노산 자동 분석법
제 1 항에 따른 신규 펩티드 Y-2 가 유효 성분인 혈압강하제.
제 1 항에 따른 신규 펩티드 Y-2 가 유효 성분인 혈압강하 기능성 식품.
제 3 항에 있어서, 식품이 드링크 형태인 것을 특징으로 하는 식품.
어육으로부터 수득한 펩티드 α-1000 를 ODS 수지와 같은 펩티드-흡착 수지로 흡착시키고 10 % 에탄올로 용출시켜 Y-2 분획을 수득하는 것을 특징으로 하는 신규 펩티드 Y-2 의 제조 방법.