JPH11228599A - 新規ペプチドｙ−２ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【解決手段】 イワシ等の魚肉をアルカリプロテアーゼ
処理して得たペプチドをペプチド吸着性樹脂（ＯＤＳ樹
脂等）に吸着せしめた後、これを１０％エタノール水で
溶出してペプチド（Ｙ−２画分）を得る。 【効果】 本新規ペプチドは、すぐれた血圧降下作用を
有し、栄養剤、特定保健用食品として使用できるほか、
血圧降下剤としても有利に使用できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規ペプチドに関
するものであり、また、その製法に関し、更にはその血
圧降下用途に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】先に、本発明者らは、魚肉を熱変性処理
した後、中性ないしアルカリプロテアーゼ処理して加水
分解し、酵素を失活せしめた後、分離処理することによ
ってＡＣＥ阻害活性を有するペプチドα−１０００を得
た（特開平５−２７１２９７）。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、血圧降下の
重要性に鑑み、血圧降下作用にすぐれているだけでな
く、安全性も高い物質を開発することとし、各方面から
検討した結果、本発明者らが先に開発したペプチドα−
１０００から強力なＡＣＥ（アンジオテンシン変換酵
素）阻害活性を有する新規ペプチドを単離することを目
的とした。

【０００４】

【課題を解決するための手段】上記目的達成のため、本
発明者らは、鋭意研究した結果、ペプチドα−１０００
の水溶液をペプタイド吸着性樹脂（ＯＤＳ樹脂）処理し
た後、１０％エタノールを用いて溶出してＹ−２画分を
得、Ｙ−２画分が新規ペプチドであることを確認しただ
けでなく、更に、特筆すべきことに、実際にヒトを試験
対象者として（「九州大学健康科学センター倫理委員
会」の審査承認済）、ヒトによるin vivo降圧試験を行
い、その効果を実際に確認し、遂に本発明を完成するの
に成功したものである。

【０００５】すなわち本発明は、新規ペプチドＹ−２を
有効成分として用いる血圧降下システムに関するもので
あって、しかも、Ｙ−２が従来未知の新規物質であるの
みでなくすぐれた血圧降下作用を有することを確認した
だけでなく、そのうえ、血圧降下作用について、従来の
ようにＡＣＥ阻害活性を測定することによって、換言す
れば、間接的な方法によってその作用を確認したもので
はなくて、ダイレクトに血圧を測定することにより、つ
まり直接法によってその作用を確認し、そのうえ更に、
血圧降下作用の確認を従来のようにラットやマウス等の
動物を使用して行うのではなく、ダイレクトにヒトの血
圧を測定することによって行った点にきわめて大きな特
徴を有するものである。

【０００６】つまり本発明は、動物実験や酵素の阻害度
を測定する間接的な方法ではなく、ヒトに対してＹ−２
を直接投与してヒトの血圧を直接測定する直接法（臨床
試験）によって、血圧降下作用、しかもきわめてすぐれ
た血圧降下作用を確認するのに成功したものであり、あ
わせてその安全性、服用や製剤あるいは飲食品製品化等
の容易性もヒトについて確認した点できわめて特徴的で
あり、まさに画期的なものである。

【０００７】以下、本発明について詳述するが、先ず、
本ペプチドＹ−２の起源として用いるペプチドα−１０
００について説明する。

【０００８】ペプチドα−１０００は、魚介類を原料と
して製造するものであって、例えば特開平５−２７１２
９７号にしたがって製造することができ、先ず、魚介類
を採肉機、デボーナー等によって処理して魚肉質を分離
する。原料は出来る限り新鮮なものが好ましい。分離し
た魚肉は、１０ｋｇ程度のすり身に分割し、このまま次
の処理に使用してもよいが、−２０〜−５０℃、例えば
−３０℃程度の冷気を吹き付けて急速連結し、−２０〜
−２５℃に保存しておき、必要に応じてこれを適宜使用
することにしてもよい。

【０００９】魚介類としては、イワシ、アジ、マグロ、
カツオ、サンマ、サバ等赤身魚；ヒラメ、タイ、キス、
コノシロ、タラ、ニシン、ブリ等白身魚；サメ、エイ等
軟骨魚肉；ワカサギ、コイ、イワナ、ヤマメ等淡水魚
肉；アイザメ、アンコウ等深海魚肉のほか、エビ、カ
ニ、タコ、アミ類等も適宜使用できる。

【００１０】採肉した後、粉砕機等によって魚介類を粉
砕し、原料重量に対して１／２量〜２０倍量、好ましく
は等量〜１０倍量の加水を行った後、加熱処理し、もっ
て、自己消化酵素を失活させ、且つ細菌を死滅させると
ともに、タンパク質を熱変性させて後に行う酵素反応効
率を上昇せしめる。加熱条件としては、このような作用
が奏される条件であればすべての条件が利用できるが、
例えば６５℃以上、２〜６０分、好ましくは８０℃以
上、５〜３０分とするのがよい。

【００１１】次いで、アンモニア水か、水酸化ナトリウ
ム（カリウム）水溶液等アルカリ剤を加えて、使用する
蛋白分解酵素の適値にｐＨを調整し、（例えばアルカリ
プロテアーゼの場合は、ｐＨ７．５以上、好ましくは８
以上）、温度も酵素適温（使用酵素によって異なるが、
２０〜６５℃、アルカリプロテアーゼの場合は３５〜６
０℃、好ましくは４０〜５５℃）に加温し、蛋白分解酵
素を加えて３０分〜３０時間（アルカリプロテアーゼの
場合は３０分〜２５時間、好ましくは１〜１７時間）処
理する。

【００１２】蛋白分解酵素としては、中性又はアルカリ
性条件下で蛋白質を分解し得る酵素であればすべての酵
素が単独で又は混合して使用し得る。その起源は、動植
物のほかに微生物に求めることができ、ペプシン、レニ
ン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、プロメレ
インのほか、細菌プロテアーゼ、糸状菌プロテアーゼ、
放線菌プロテアーゼ等も広く利用できる。これらの酵素
は、通常、市販されているものが使用されるが、未精製
の酵素、酵素を含有した培養液、麹といった固体又は液
体の酵素含有物も、目的により必要に応じて使用するこ
とができる。酵素の添加量としては０．１％〜５．０％
程度でもよい。

【００１３】次いで必要あれば中和処理を行った後、７
０℃（好適には８０℃）以上の温度に２〜６０分間（好
適には５〜３０分間）保持し、酵素を失活させるととも
に後に行う分離を良好ならしめる。加熱失活処理後、バ
イブスクリーン等によって粗分離し、必要によりジェク
ター処理した後、超遠心分離処理して、浮遊物、沈殿物
を除去する。

【００１４】次に、ケイソウ土等濾過助剤（例えばセラ
イト）を用いて濾過し、濾液を活性炭処理して（０．０
５〜２０％Ｗ／Ｖ、好ましくは０．１〜１０％Ｗ／Ｖ使
用、２０〜６５℃、好ましくは２５〜６０℃、１５分〜
４時間、好ましくは３０分〜２時間）、脱臭、脱色、精
製する。

【００１５】これを減圧濃縮（０〜５０℃）その他常法
にしたがって濃縮し（３０Ｂ×程度にまで）た後、必要
あれば再度（超）遠心分離又は濾過してペプチド原液を
得る。このようにして得たペプチド原液は、殺菌（ＵＨ
ＴＳＴその他常法による）した後、容器に充填して製品
（α−１０００（液体））とする。また、希望するので
あれば、更に濃縮したりあるいは逆に希釈したり、ま
た、噴霧乾燥、凍結乾燥等の常法によって６０メッシュ
程度に粉末化し、これを袋等の容器に充填して製品（α
−１０００（粉末））とすることもできる。これらの製
品は、冷蔵ないし冷凍保管する。

【００１６】このようにして得た、液状、ペースト状な
いし粉末状のペプチドがα−１０００である。

【００１７】ペプチドα−１０００（スプレードライ粉
末）の物理化学的性質は、下記表２、表３、表４に示す
とおりである。

【００１８】

【表２】

【００１９】

【表３】

【００２０】

【表４】

【００２１】このようにして調製したペプチドα−１０
００は、液状の場合はそのまま、粉末の場合は加水した
後、これをＯＤＳ樹脂その他ペプチド吸着性樹脂に通
し、水などで洗浄した後、各種濃度のエタノールなどを
用いて順次溶出し、各画分を得、それらの中から血圧降
下活性の強い画分を分画して、濃縮、乾燥等必要な処理
を行い、血圧降下成分とする。例えば、１０％エタノー
ルで溶出して得られる画分Ｙ−２は、すぐれた血圧降下
活性を示した。

【００２２】本発明に係るペプチドＹ−２は、従来未知
の新規物質であり、すぐれた血圧降下活性を示し、しか
も安全性についても問題はないので、血圧降下剤ないし
血圧降下を目的として特定保健用食品向けペプチドとし
ても使用することができる。したがって本ペプチドは、
調味料、栄養強化用食品といった食品ないしは動物飼料
添加剤として使用されるほか、上記した独特の生理活性
の故に、高血圧性疾病の予防、ある場合には治療のため
に、医薬として、または輸液、健康食品、臨床栄養食品
等としても巾広く使用することができる。

【００２３】食品として使用する場合には、ペプチドを
そのまま添加したり、他の食品ないしは食品成分と併用
したりして適宜常法にしたがって使用できる。また、医
薬として使用する場合には、経口又は非経口投与するこ
とができる。経口投与の場合には、例えば常法にしたが
い、錠剤、顆粒剤、粉末剤、カプセル剤、散剤、ドリン
ク剤とすることができ、又、非経口投与の場合には、例
えば注射薬製剤、点滴剤、坐剤等として使用することが
できる。

【００２４】以下、本発明を参考例及び実施例によって
更に詳しく説明する。

【００２５】

【参考例】新鮮イワシをボデーナーで処理して採肉し
た。採肉した魚肉質を１０ｋｇのすり身に分割し、これ
を−３０℃以下で急速凍結した後、粉砕機で粉砕した後
等量の水を加え、これをタンクに送り、１００℃で１０
分間加熱して自己消化酵素を失活させ、熱変性させた。
次いでアンモニア水を加えてｐＨを９．５に調整した。

【００２６】これに市販のアルカリプロテアーゼ製品の
０．１％液を加え、５０℃に１７．５時間保持して酵素
分解を行った。次いで１５分間煮沸して酵素を失活せし
めた。

【００２７】これをバイブスクリーン（１５０メッシ
ュ）に通し５０００ｒｐｍでジエクター処理した後、シ
ャープレス遠心分離機で処理し（１５０００ｒｐｍ）、
ケイソウ土を濾過助剤として用い、濾過処理したものを
ペプタイド原液とした。

【００２８】上記で得たペプチド原液に活性炭を１％Ｗ
／Ｖ加え、３０℃で６０分間攪拌した後濾過して濾液を
得た。これを常法にしたがって減圧濃縮（２０℃）した
後、常法にしたがってＵＨＴＳＴ殺菌を行って、α−１
０００（液体）製品を得、これを更に常法にしたがって
噴霧乾燥して粒径６０メッシュのα−１０００（粉末）
製品を得、それぞれこれらの製品は冷凍保管した。

【００２９】このようにして調製したペプチドα−１０
００（粉末）について、セファデックスＧ−２５カラム
を用い、下記の条件でゲル濾過した結果、分子量２００
〜１０，０００であることが判明した。カラムサイズ；
径１６×９５０ｍｍ、溶出剤；０．１Ｍホスフェートバ
ッファー（ｐＨ７．０）、分画：２ｍｌ／チューブ、流
速；１０ｍｌ／ｈ、分子量マーカー；バシトラシン（分
子量１４５０）。

【００３０】上記によって得たα−１０００（液体）
は、水分含量が７３．６％（減圧加熱乾燥法）であっ
て、淡黄色を呈し、その１０％溶液のｐＨは７．５を示
し、魚臭もなく苦味も認められなかった。その成分につ
いての分析、及び、アミノ酸組成についての測定を行っ
た結果、下記する表５及び表６に示す結果が得られた。

【００３１】

【表５】

【００３２】

【表６】

【００３３】

【実施例１：ペプチドＹ−２の調製】イワシペプチドα
−１０００（液体）８００ｍｌ（Ｂｒｉｘ４５、たんぱ
く質含量２９．６％）に２６．２Ｌの脱イオン水を加
え、これをＯＤＳ樹脂（ＹＭＣＯＤＳ−ＡＱ１２０−Ｓ
５０）カラム（１．５×５０ｃｍ）に流してペプチドを
吸着させ、脱イオン水で洗浄し、次に、０％、１０％、
２５％、５０％、９９．５％のエタノール水溶液２７Ｌ
を用いて順次溶出してそれぞれＹ−１、Ｙ−２、Ｙ−
３、Ｙ−４、Ｙ−５の画分を得た。このうちＹ−２画分
を、４０℃で濃縮してエタノールを除去し、凍結乾燥し
てイワシ精製ペプチド（Ｙ−２）を得た。このＹ−２画
分中には、Val-Tyrが０．１５％含有されていた。

【００３４】本発明に係る新規ペプチドＹ−２の物理化
学的物質を下記表７、表８、表９に示す。

【００３５】

【表７】

【００３６】

【表８】

【００３７】

【表９】

【００３８】

【実施例２：ペプチドＹ−２投与による臨床試験】ペプ
チドＹ−２について、実際にヒトに対する機能性を実証
するため、血圧の高いボランティアを募り、ドリンク形
態でのペプチドＹ−２の連続投与による血圧降下作用を
確認した。

【００３９】Ａ：試験飲料の調製 ペプチドの投与は実際の機能性食品を想定してドリンク
剤タイプの飲料を用いた。連続投与に無理のない飲用量
として１本当たり１００ｍｌ容量とし、ペプチドを含む
True飲料と含まないPlacebo飲料の味の差をなくすた
め、必要最少限の調味を施して、果糖ブドウ糖液糖（日
本コーンスターチ社製、ハイクラフトＭ−７５）９．０
％、精製ハチミツ（藤井養蜂所社製）７．０％、ステビ
ア抽出物（池田糖化工業社製、ハイステビア１００）
０．１２％、酸味料０．２％、香料０．１２％からなる
配合とし、True飲料には粉末のイワシ精製ペプチド２．
０％を添加した。従ってTrue飲料にはイワシ精製ペプチ
ドＹ−２画分粉末が２．０ｇ／１００ｍｌ含有され、Va
l-Tyrとしては試験飲料１本当たり３ｍｇ／１００ｍｌ
を含む量とした。Placebo飲料は、イワシ精製ペプチド
Ｙ−２画分を除き配合水に置き換えた。

【００４０】製造は、実製造ラインにより一括製造し
た。すなわち、１バッチ２００ｋｇ単位で配合し、６０
℃で混合溶解後、１２８℃１０秒のプレート殺菌した
後、十分に洗浄した１００ｍｌ容褐色ビンに９０℃で自
動充填し、室温で放冷後、流水水槽中で急冷した。ラベ
ルはTrue、Placebo全く同じデザインで、ボランティア
及び医師、看護婦には識別不可能な方法で試験に供し
た。

【００４１】Ｂ：試験対象者 （１）倫理委員会の承認 本スタディに先立ち、「九州大学健康科学センター倫理
委員会」の審査承認を得た。

【００４２】（２）対象者の選定 被験者は予め本試験の目的と意義、試験方法及び安全性
について予め説明を受け、本試験内容を十分理解した
後、本試験の同意書に署名した志願者とした。これらの
志願者の中から、医師による問診、心電図、胸部Ｘ線撮
影など諸検査の結果と、過去における定期検診のデータ
から４６例を適格と判定し、被験者として選択した。群
分けは米国合同委員会の基準に基づき、坐位安静時の拡
張期血圧が８５ｍｍＨｇ未満、収縮期血圧が１３０ｍｍ
Ｈｇ未満を血圧正常群（ＮＴ群）、各々の血圧がそれ以
上の高血圧症者及び正常高値血圧者を血圧高値群（ＨＴ
群）とし、ＮＴ群１２名、ＨＴ群３４名に分けた、各々
の群について無作為抽出法により、ペプチド投与のTrue
群と、ペプチド投与しないPlacebo群とに群分けした。
各群の特性を表１０に示した。

【００４３】

【表１０】

【００４４】すなわち表に示したように、被験者を、そ
れぞれの血圧にしたがってＨＴ群とＮＴ群に大別し、各
群の被験者を更にペプチド投与のTrue群とペプチドを投
与しないPlacebo群の割合Ａ〜Ｄからなる４群に群分け
した。 Ａ群：ＳＢＰ≧１３０ｍｍＨｇ、及び／又は、ＤＢＰ≧
８５ｍｍＨｇ。Trueドリンクを２回／日、４週間投与。 Ｂ群：ＳＢＰ≧１３０ｍｍＨｇ、及び／又は、ＤＢＰ≧
８５ｍｍＨｇ。Placeboドリンクを２回／日、４週間投
与。 Ｃ群：ＳＢＰ＜１３０ｍｍＨｇ、及び／又は、ＤＢＰ＜
８５ｍｍＨｇ。Trueドリンクを２回／日、４週間投与。 Ｄ群：ＳＢＰ＜１３０ｍｍＨｇ、及び／又は、ＤＢＰ＜
８５ｍｍＨｇ。Placeboドリンクを２回／日、４週間投
与。

【００４５】なお、各記号はそれぞれ次の意味を示す。
ＳＢＰ：収縮期血圧（ｍｍＨｇ）、ＤＢＰ：拡張期血圧
（ｍｍＨｇ）、ＢＭＩ：Ｂｏｄｙ Ｍａｓｓ Ｉｎｄｅ
ｘ、Ｆ：Ｆ−テスト、ｔ：ｔ−テスト。

【００４６】Ｃ：プロトコール （１）投与量 ペプチド（Ｙ−２画分）４ｇを、体重６０ｋｇ成人男子
を標準とした１日の摂取量とした（Ｙ−２画分中のVal-
Tyr含量は０．１５％とみなした）。なお、亜急性毒性
試験の結果、ラットにおいて、Val-Tyr換算量で２．５
ｍｇ／ｋｇ・日の投与量でも１ヶ月の連続投与の安全性
が確認された。

【００４７】（２）投与方法 連続投与試験は、２週間の観察期、１週間のPlacebo投
与期、４週間のTrue投与期のあと４週間の終了期を設け
る無作為二重盲検対照試験を行った。試験飲料はTrue投
与期に、朝食後と夕食前の朝夕２回１本ずつ投与した。
血圧（坐位）、脈拍は１週間に１回、午前９時３０分か
ら１１時３０分の間で各被験者に割り当てた定刻に測定
した。投与開始時、投与終了時に体重、血液、尿検査を
行った。飲料服用、血圧測定、諸検査実施の時間は厳守
させたが、それ以外は自由食、自由行動とした。

【００４８】（３）検査項目及び検査方法 自覚症状の有無及び他覚所見は医師が問診及び診察を行
って記録し、試験期間中の測定、採血はすべて看護婦が
行った。一般生理学的検査として血圧、脈拍、体重につ
いて行った。血圧、脈拍数は、測定の５分以上前より安
静坐位を保たせて、（株）日本コーリン社製連続自動血
圧計ＢＰ−２０３ＲＶ２で約２分間隔で３回連続測定
し、その平均値を個人の血圧値及び脈拍値とした。試験
期間を通じて同一の体位で測定した。臨床検査は投与前
後に行った。

【００４９】Ｄ：統計処理 数値は平均値±標準誤差（ＳＥ）で示し、臨床検査など
の経時的な変動については対応のあるｔ−検定、さら
に、連続投与試験における０〜４週の血圧については分
散分析により、その有意差を調べた。有意水準は危険率
５％以下をとり、検定結果には次の略号を用いた。 ＊＊＊：ｐ＜０．００１，＊＊：ｐ＜０．０１，＊：ｐ
＜０．０５

【００５０】本試験の評価は、投与前の観察期４週間の
平均値に対し、各群の値について、）投与前後のpaired
ｔ−検定、２）True群、Placebo群のgroup検定を行っ
た。介入試験は投与前の観察期を２週間とし、その平均
値に対し投与後とのpairedｔ−検定を行った。

【００５１】Ｅ：結果 １．自覚症状 本試験期間１２週間において、ＮＴ群及びＨＴ群のいず
れも自覚症状はみられなかった。

【００５２】２．血圧及び脈拍数 ＮＴ及びＨＴ群に対し、それぞれペプチドを投与したTr
ue群と非投与のPlacebo群とに分け、観察期４週間、投
与後の終了期４週間における血圧と脈拍数の変化を図
６、図７に示した。

【００５３】図６は血圧高値群（ＨＴ群）の血圧と脈拍
の測定結果であって、図中、■及び□は、それぞれＹ−
２投与群（Ａ群）のＳＢＰ値とＤＢＰ値を示し、●及び
○は、それぞれPlacebo群（Ｂ群）のＳＢＰ値とＤＢＰ
値を示す。また、図７は正常血圧群（ＮＴ群）の血圧と
脈拍の測定結果であって、図中、■及び□は、それぞれ
Ｙ−２投与群（Ｃ群）のＳＢＰ値とＤＢＰ値を示し、●
及び○は、それぞれPlacebo群（Ｄ群）のＳＢＰ値とＤ
ＢＰ値を示す。

【００５４】上記結果から次のことが明らかとなった。

【００５５】１）正常血圧群（ＮＴ群） 収縮期血圧（ＳＢＰ）１３０ｍｍＨｇ未満及び拡張期血
圧（ＤＢＰ）８５ｍｍＨｇ未満のＮＴ群１２名に対し、
イワシ精製ペプチド（Ｙ−２画分）４ｇ／日（Val-Tyr
として６ｍｇ／日）を連続投与した結果、血圧及び脈拍
数ともに、ペプチド投与前後のpaired ｔ−検定及びTru
e群（Ｃグループ７名）とPlacebo群（Ｄグループ５名）
との検定において、有意差のある変動は認められなかっ
た（図７）。

【００５６】２）血圧高値群（ＨＴ群） 収縮期血圧１３０ｍｍＨｇ以上及び／又は拡張期血圧８
５ｍｍＨｇ以上のＨＴ群３４名のうち、Placebo群の５
名は諸般の事情により観察期の間に不参加を表明したの
で対象者から除き、最終的に２９名に対して、同様にイ
ワシ精製ペプチド（Ｙ−２画分）を投与した結果、観察
期（４週間）に対する投与期（４週間）のpaired ｔ−
検定において、Placebo群（Ｂグループ１２名）は血圧
の変動に有意差は認められなかったが、True群（Ａグル
ープ１７名）は有意な血圧降下が認められた（図６）。

【００５７】すなわち、True群（Ａグループ）におい
て、投与開始後１週間目に、収縮期血圧９．７ｍｍＨ
ｇ、拡張期血圧５．２ｍｍＨｇの最大血圧降下が認めら
れ統計的に危険率０．１％で有意であった。この血圧降
下作用はペプチド投与期中１％以下の危険率で持続し、
投与後の終了期においても収縮期血圧は３週間目（ｐ＜
０．０１）、拡張期血圧は８週間目まで（ｐ＜０．０
５）有意に継続した。その後は元の観察期血圧に復帰す
る傾向が見られた。

【００５８】また、True群（Ａグループ）とPlacebo群
（Ｂグループ）とによるgroup検定においてもPlacebo群
に対してTrue群は有意に血圧降下を示し、最大の降下差
は投与開始後１週間目に収縮期血圧差１２．１ｍｍＨ
ｇ、拡張期血圧差７．１ｍｍＨｇが認められた。この場
合も投与終了後の終了期においても３週間目まで血圧降
下作用が持続し、その後復帰する傾向が見られた。本試
験中、いずれの群においても脈拍数の異常は認められな
かった。

【００５９】３．臨床検査成績 ペプチド投与前及び投与終了時の末梢血液検査、血液生
化学検査及び２４時間蓄尿における変動値を測定した結
果、末梢血液検査においていずれの群もヘマトクリット
値（Ｈｔ）、赤血球項目値（ＭＣＶ、ＭＣＨ、ＭＣＨ
Ｃ）に統計上有意な差がみられたが、数値変動項目自体
は正常値範囲内の軽微な変動であり、臨床上問題となる
ものではなかった。

【００６０】

【実施例３：介入試験】ＨＴ群のうちTrue群からの７名
について、終了期４週間の後さらに２週間の観察期をコ
ントロールとしてPlacebo投与を行い、介入試験を実施
した（図８）。その結果、True投与期は本試験と同様１
週間目に最大血圧降下（収縮期血圧降下度１０．８ｍｍ
Ｈｇ、拡張期血圧降下度５．３ｍｍＨｇ）を認め、４週
間目まで有意に血圧降下を示した。その後徐々に復帰の
傾向にあり、６週間のwash-out期間をおいてPlacebo投
与した結果、観察期に対して血圧を下げることなく、む
しろ復帰の上昇傾向を維持して、血圧の復帰は緩やか
で、本ペプチドは降圧作用持続性の大きいことが確認さ
れた。

【００６１】図中、●及び○は、それぞれＳＢＰ値及び
ＤＢＰ値を示し、星印は平均血圧値を示し、ＰはPlaceb
oドリンク、ＴはTrueドリンクを示す。有意差に関し、
検定結果には次の略号用いた。＊＊：ｐ＜０．０１，＊
＊＊：ｐ＜０．００１。

【００６２】

【実施例４】ペプチドＹ−２は、４ｇ／日（Val-Tyrと
して６ｍｇ／日）の投与で十分な血圧降下作用が示され
たが、機能性食品としての実用を考えると経済性が大き
な要因となる。そこで血圧降下作用を発言する最少のペ
プチド投与量を確認するため、段階的に投与量を変え
て、有効性が示される限界値を検討した。

【００６３】Ａ：プロトコール 前記に準じた条件下で、最少有効投与量の検討を行っ
た。試験飲料の基本組成、試験対象者の母集団も同様と
した。

【００６４】（１）対象者 今回は血圧に対する最少有効量の確認であるため、前記
の被験者のうち、正常高値高血圧以上のＨＴのみを対象
として、無作為に抽出し、True群を１４例（平均年齢４
５．１±３．５歳、収縮期血圧１４４．５±２．７ｍｍ
Ｈｇ、拡張期血圧９０．７±１．８ｍｍＨｇ）、Placeb
o群５名（平均年齢５０．４±４．９歳、収縮期血圧１
４７．３±２．９ｍｍＨｇ、拡張期血圧９２．０±２．
８ｍｍＨｇ）で行った。

【００６５】（２）投与量 Val-Tyrに換算量に対して前記したin vivo試験では１０
〜１００μｇ／ｋｇの投与量で有効性を認めていたがラ
ットとヒトの差、静注と経口投与方法の差などを考慮し
て、１０μｇ／ｋｇを下回る量からスタートし、順次投
与量を上げて有効性発現の境界値を探ることとした。す
なわち、イワシ精製ペプチド（Ｙ−２画分）０．２５ｇ
／日（Val-Tyr含量６．２５μｇ／ｋｇ・日）、０．５
０ｇ／日（Val-Tyr含量１２．５μｇ／ｋｇ・日）、
１．００ｇ／日（Val-Tyr含量２５μｇ／ｋｇ・日）と
倍量ずつ増やしていくこととした。

【００６６】（２）投与方法 ２週間の観察期をおき、投与開始後２週間単位で投与量
を変更した。試験飲料は前記と同様、朝夕２回１本ずつ
投与し、試験期間は有効性が確認できた時点で終了とし
た。

【００６７】Ｂ：結果 得られた結果を図９に示す。図９は、血圧高値群（ＨＴ
群）のペプチドＹ−２投与量の変化による血圧測定値の
変化を示したものであって、図中、■及び□は、それぞ
れＹ−２投与群のＳＢＰ値とＤＢＰ値を示し、●及び○
は、それぞれPlacebo群のＳＢＰ値とＤＢＰ値を示し

【００６８】図９に示すとおり、イワシ精製ペプチド
（Ｙ−２画分）を０．２５ｇ／日の投与からスタート
し、２週間目に収縮期血圧で５．６ｍｍＨｇ、拡張期血
圧で３．２ｍｍＨｇ投与前より下降し、いずれの期も危
険率５％で統計的有意差を認めた。さらに３週間目から
投与量を０．５０ｇ／日に増やしたところ、３週間目で
収縮期血圧が８．２ｍｍＨｇ、拡張期血圧が３．３ｍｍ
Ｈｇ下がり、収縮期血圧において危険率１％で統計的有
意差が認められた。検定結果には次の略号を用いた。＊
＊：ｐ＜０．０１，＊：ｐ＜０．０５。

【００６９】一方、Placebo群は、ほとんど血圧変動が
みられず、また両群とも脈拍の異常は認められなかっ
た。従って本ペプチドのヒトに対する有効性は０．２５
ｇ／日（Val-Tyr含量６．２５μｇ／ｋｇ・日）で統計
的にその傾向が認められ、０．５０ｇ／日（Val-Tyr含
量１２．５μｇ／ｋｇ・日）では危険率１％で有効性が
確認された。投与量０．２５ｇ／日（Val-Tyr含量６．
２５μｇ／ｋｇ・日）においても投与開始後から徐々に
降下を続けており、同投与量でも長期間継続すれば実用
上十分な効果が得られると判断された。また実用上の最
少有効量を０．２５ｇ／日（Val-Tyr含量６．２５μｇ
／ｋｇ・日）とすれば、前節の試験においてその１６倍
量の２８日間連続投与に対しても、血液生化学上及び臨
床上問題となる変化は認められず、また現在市販されて
いるＡＣＥ阻害剤にみられる副作用も問診による報告で
は皆無であった。

【００７０】

【実施例５：ドリンクの製造】 （配合） 果糖ブドウ糖液糖 ９．０％ 精製ハチミツ ７．０％ ステビア抽出物 ０．１２％ 酸味料（クエン酸） ０．２％ 香料 ０．１２％ ペプチドＹ−２ ０．１２５％ 精製水 全 量

【００７１】上記配合を６０℃で混合溶解した後、１２
８℃、１０秒のプレート殺菌した。次いでこれを充分に
洗浄した１００ｍｌ容褐色ビンに９０℃で充填し、室温
で放冷後、流水水槽中で急冷してドリンクを製造した。

【００７２】得られたドリンクについて、分析試験及び
アミノ酸組成の測定を行い、それぞれ、表１１及び表１
２の結果を得た。

【００７３】

【表１１】

【００７４】

【表１２】

【００７５】

【発明の効果】本発明によって次のような顕著な効果が
奏される。すなわち、イワシタンパク質中に潜在してい
るＡＣＥ阻害ペプチドを顕在化・高濃度化することによ
って、嗜好性と生体内安定性に優れ、安全性の高い機能
性食品素材としうるとの前章までの知見に基づき、実際
の機能性ドリンクを調製し、軽症高血圧を含む正常高値
血圧者に対する臨床的検討を行って次の効果を確認し
た。

【００７６】１）ＯＤＳ処理１０％エタノール溶出画分
であるイワシ精製ペプチド（Ｙ−２）画分を２．０ｇ／
本（Val-Tyrとして３ｍｇ／本）含有した飲料（１００
ｍｌ／本）を調製した。収縮期血圧１３０ｍｍＨｇ未
満、拡張期血圧８５ｍｍＨｇ未満の正常血圧ボランティ
ア１２名を７名と５名の２群に分け、７名にペプチド含
有のTrue飲料を、５名にブランクであるPlacebo飲料を
１日２本ずつ（True群のVal-Tyr投与量として６ｍｇ／
日）４週間投与して、無作為二重盲検対照試験を行った
ところ、血圧の変動に有意差はなく、本ペプチドはＮＴ
の血圧及び脈拍数に対して何らの影響を与えないことが
示された。

【００７７】２）同試験において、ペプチド投与開始直
前と４週間投与後に採血及び２４時間蓄尿により血液生
化学検査及び尿検査を行った結果、いくつかの項目に変
動がみられたが、正常値範囲内の軽微な変動であり、臨
床上問題となるものではなかった。その他の臨床検査及
び自覚症状に異常はなく、本ペプチドの正常血圧者に対
する臨床上の安全性に全く問題がないことが示された。

【００７８】３）収縮期血圧１３０ｍｍＨｇ以上及び／
又は拡張期血圧８５ｍｍＨｇ以上の血圧高値を示したボ
ランティアを無作為抽出法によりTrue群とPlacebo群の
２群に分け、計２９名に対して同様に無作為二重盲検対
照試験を実施したところ、paired ｔ−検定においてTru
e群は１週間目に収縮期血圧が９．７ｍｍＨｇ、拡張期
血圧が５．２ｍｍＨｇと有意に（ｐ＜０．００１）降下
し、本ペプチドのヒトに対する降圧作用が明らかに示さ
れた。

【００７９】４）上記試験において、ペプチドの投与期
間は４週間とし、５週目以降は投与をやめたにもかかわ
らず、７週目まで３週間にわたり有意に（ｐ＜０．０
５）血圧降下が認められ、本ペプチドの降圧作用持続性
が確認された。

【００８０】５）また、ＨＴ群から７名を無作為抽出し
て、True投与からPlacebo投与への介入試験を行ったと
ころ、True投与時には有意な血圧降下が認められたが、
Placebo投与時には血圧降下は認められず本試験の降圧
作用が本ペプチドによるものであることを裏付けた。

【００８１】６）一方、投与前後の臨床試験結果におい
て、いくつかの項目に変動がみられたがいずれも軽微で
正常範囲内の変動であり、臨床的には何ら問題がなく、
自覚症状の発現も皆無で、本ペプチドの連続投与におけ
る安全性が示された。

【００８２】７）イワシペプチドの機能性食品としての
実用化のために、最少有効量の検討を行ったところ、Va
l-Tyr投与量として０．７５ｍｇ／日で収縮期血圧８．
２ｍｍＨｇ、拡張期血圧３．３ｍｍＨｇの有意な（ｐ＜
０．０１）効果がみられた。

【００８３】８）全試験期間を通じて現在市販されてい
るＡＣＥ阻害剤にみられる咳や発疹等の副作用は皆無で
あり、本ペプチドが日常摂取する機能性食品としては極
めて安全で有効性の高い素材であることが確認された。

【００８４】食品から機能性の高い食品素材を分離抽出
する場合には、その安全性は必須条件であり、本ペプチ
ドの臨床的検討の結果、軽症高血圧及び正常高値血圧者
に対し十分な降圧効果が認められ、咳などの副作用のな
い安全性の高さが確認できたことは今後の高齢化社会に
向かい、非常に意義のある食品素材であると期待され
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】ペプチドα−１０００のＵＶスペクトルを示
す。

【図２】ペプチドα−１０００のＩＲスペクトルを示
す。

【図３】ペプチドＹ−２のゲル濾過よる分子量分布を示
す。

【図４】ペプチドＹ−２のＵＶスペクトルを示す。

【図５】ペプチドＹ−２のＩＲスペクトルを示す。

【図６】ＨＴ群の血圧と脈拍の測定結果を示す。

【図７】ＨＴ群の血圧と脈拍の測定結果を示す。

【図８】介入試験の結果を示す。

【図９】投与量の変化による血圧の変化を示す。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記の物理化学的性質を有する新規ペプ
   チドＹ−２。 （Ａ）分子量：２００〜１０，０００（ＡＳＡＨＩＰＡ
   Ｋ ＧＳ−３２０ 高速液体クロマトグラフィーによ
   る） （Ｂ）融点：１３８℃で着色、分解する。 （Ｃ）溶剤に対する溶解性：水に易溶であるが、エタノ
   ール、アセトン、ヘキサンにほとんど溶解しない。 （Ｄ）物質の外観：白色〜淡黄色粉末。 （Ｅ）成分：水分５．４％（常圧加熱乾燥法）：蛋白質
   ９５．３％（ケルダール法）：脂質０％（ソックスレー
   抽出法）：灰分１．１％（直接灰化法）。 （Ｆ）アミノ酸組成：下記の表１に示すとおり。 【表１】
2. 【請求項２】 請求項１に記載の新規ペプチドＹ−２を
   有効成分とすることを特徴とする血圧降下剤。
3. 【請求項３】 請求項１に記載の新規ペプチドＹ−２を
   有効成分とすることを特徴とする血圧降下性機能食品。
4. 【請求項４】 該食品がドリンク形態であることを特徴
   とする請求項３に記載の食品。
5. 【請求項５】 魚肉から得たペプチドα−１０００をＯ
   ＤＳ樹脂などのペプチド吸着性樹脂に吸着せしめた後、
   これを１０％エタノールで溶出し、Ｙ−２画分を得るこ
   と、を特徴とする新規ペプチドＹ−２の製造方法。