JPWO2007069716A1 - 内臓脂肪蓄積抑制作用を有する組成物 - Google Patents
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Abstract
本発明は、魚肉蛋白質、魚肉ペプチド、及び／又は、魚肉アミノ酸を、魚肉蛋白質そのまま、脱脂したもの、又は、蛋白分解酵素で分解したものを含有する組成物に関する。原料の魚肉蛋白質は、白身魚、特にタラ類の魚の魚肉蛋白質が好ましい。該組成物は、肥満の中でも注意を要するとされる内臓脂肪の蓄積抑制作用を示し、安全性が高く、食品として摂取することができる。
Description
本発明は、内臓脂肪の蓄積を抑制する組成物に関する。詳細には、魚肉蛋白質、魚肉ペプチド、及び／又は、魚肉アミノ酸を含有する内臓脂肪蓄積抑制作用を有する組成物に関する。
近年、高血圧、高脂血症、糖尿病といった生活習慣病とともに注目されているのが肥満である。肥満は、高血圧、高脂血症、糖尿病を合併しやすく、合併することでより加速度的に動脈硬化、心筋梗塞や脳梗塞など死につながる疾患を引き起こす危険性が高まる。肥満の中でも特に内臓の周囲につく内臓脂肪の危険性が注目されるようになってきた。
肥満を改善するためには、１）食事の摂取量、エネルギーを低下させる、あるいは、吸収阻害剤、食欲抑制剤などによる方法、２）運動量を増やす、あるいは、筋肉における消費エネルギーを増加させる物質の摂取などの方法が知られている。
しかし、食事の摂取量を減少させることや運動量を増加させることは、言うのは簡単であるが実施するのは難しく、また、各種薬物を摂取するのは副作用などの心配を伴うものである。
特許文献１には、「豚肉に対し０．１重量％以上のプロテアーゼを使用して30〜55℃で処理した豚肉酵素処理物を分画して得られる分子量10、000以下の分画物からなる体脂肪減少作用及び筋肉増強作用を有する豚肉分解物。」が記載されている。
タラの魚肉蛋白質についてはインシュリン感受性を改善させるという報告がある（特許文献２、非特許文献１〜３）。また、血中コレステロール等の脂質代謝に対する影響も報告されている（非特許文献４〜６）。
肥満を改善するためには、１）食事の摂取量、エネルギーを低下させる、あるいは、吸収阻害剤、食欲抑制剤などによる方法、２）運動量を増やす、あるいは、筋肉における消費エネルギーを増加させる物質の摂取などの方法が知られている。
しかし、食事の摂取量を減少させることや運動量を増加させることは、言うのは簡単であるが実施するのは難しく、また、各種薬物を摂取するのは副作用などの心配を伴うものである。
特許文献１には、「豚肉に対し０．１重量％以上のプロテアーゼを使用して30〜55℃で処理した豚肉酵素処理物を分画して得られる分子量10、000以下の分画物からなる体脂肪減少作用及び筋肉増強作用を有する豚肉分解物。」が記載されている。
タラの魚肉蛋白質についてはインシュリン感受性を改善させるという報告がある（特許文献２、非特許文献１〜３）。また、血中コレステロール等の脂質代謝に対する影響も報告されている（非特許文献４〜６）。
本発明は、肥満の中でも注意を要するとされる内臓脂肪の蓄積を抑制する効果を有する、食品として摂取することができる安全性の高い組成物を提供することを課題とする。
本発明は、インシュリン感受性を改善することが報告されている魚肉蛋白質の作用について研究していたところ、魚肉蛋白質を摂取させたラットの内臓脂肪の量がコントロールと比較して少ないことを見出し、本発明を完成させた。
本発明は、以下の（１）〜（４）の組成物を要旨とする。
（１）魚肉蛋白質、魚肉ペプチド、及び／又は、魚肉アミノ酸を含有する内臓脂肪蓄積抑制作用を有する組成物。
（２）魚肉蛋白質、魚肉ペプチド、及び／又は、魚肉アミノ酸が、魚肉蛋白質そのまま、脱脂したもの、または、蛋白分解酵素により分解したもののいずれかである（１）の内臓脂肪蓄積抑制作用を有する組成物。
（３）魚肉が白身魚の魚肉である（１）又は（２）の内臓脂肪蓄積抑制作用を有する組成物。
（４）魚肉がタラ類魚肉である（１）又は（２）の内臓脂肪蓄積抑制作用を有する組成物。
本発明は、以下の（１）〜（４）の組成物を要旨とする。
（１）魚肉蛋白質、魚肉ペプチド、及び／又は、魚肉アミノ酸を含有する内臓脂肪蓄積抑制作用を有する組成物。
（２）魚肉蛋白質、魚肉ペプチド、及び／又は、魚肉アミノ酸が、魚肉蛋白質そのまま、脱脂したもの、または、蛋白分解酵素により分解したもののいずれかである（１）の内臓脂肪蓄積抑制作用を有する組成物。
（３）魚肉が白身魚の魚肉である（１）又は（２）の内臓脂肪蓄積抑制作用を有する組成物。
（４）魚肉がタラ類魚肉である（１）又は（２）の内臓脂肪蓄積抑制作用を有する組成物。
また、本発明は、以下の（５）〜（７）の機能性食品、（８）の内臓脂肪蓄積を抑制方法、（９）の使用を要旨とする。
（５）（１）ないし（４）いずれかの組成物を含有する内臓脂肪蓄積抑制機能を有する機能性食品。
（６）（１）ないし（４）いずれかの組成物を添加した内臓脂肪蓄積抑制機能を有する機能性食品。
（７）添加される側の食品が魚肉を含まない食品である（６）の機能性食品。
（８）（１）ないし（４）いずれかの組成物を継続して摂取させることにより内臓脂肪蓄積を抑制させる方法。
（９）（１）ないし（４）いずれかの組成物の内臓脂肪蓄積抑制作用を有する機能性食品製造のための使用。
（５）（１）ないし（４）いずれかの組成物を含有する内臓脂肪蓄積抑制機能を有する機能性食品。
（６）（１）ないし（４）いずれかの組成物を添加した内臓脂肪蓄積抑制機能を有する機能性食品。
（７）添加される側の食品が魚肉を含まない食品である（６）の機能性食品。
（８）（１）ないし（４）いずれかの組成物を継続して摂取させることにより内臓脂肪蓄積を抑制させる方法。
（９）（１）ないし（４）いずれかの組成物の内臓脂肪蓄積抑制作用を有する機能性食品製造のための使用。
本発明の組成物を食品に添加して摂取したり、サプリメントとして摂取することにより、内臓脂肪の蓄積を抑制することができる。くせのない食品素材として各種食品に使用することができるので、容易に摂取することができ、食事制限のような苦痛を伴うことなく、また、副作用を心配することなく、内臓脂肪の蓄積抑制効果が得られる。
本発明において、魚肉蛋白質、魚肉ペプチド、及び／又は、魚肉アミノ酸とは魚肉そのまま摂取したものでよいが、摂取エネルギーを減少させたい場合は、脱脂処理により脂質を除いて使用できる。脱脂方法としては、煮る、蒸す、焼く、エタノール、ヘキサンなどを用いて抽出するなどの方法が例示される。また、吸収しやすいように分解して用いることもできる。分解方法としては、パパイン、トリプシン、ペプシン、ブロメライン、フィシン、アルカラーゼプロテアーゼ等のような蛋白質分解酵素を使用することができる。魚肉蛋白質、魚肉ペプチド、又は魚肉アミノ酸のうちのいずれか一種又は複数種を含有する組成物である。
本発明において、原料となる魚肉は白身魚が好ましく、特にタラ類の魚肉蛋白質が好ましい。具体的には、ミナミダラ、ノーザンブルーホワイティング、スケトウダラ、キングクリップ、メルルーサ、マダラ、ホキ等が例示される。
本発明の魚肉蛋白質は医薬品のように強力な効果や副作用を有するものではないので、1日の摂取量に制限はない。白身魚の魚肉蛋白質は色も白く、魚臭さも強くないので、種々の食品に添加して摂取することができる。また、粉末、顆粒、錠剤、カプセルのような形態のサプリメントとして摂取しても良い。
本発明において、原料となる魚肉は白身魚が好ましく、特にタラ類の魚肉蛋白質が好ましい。具体的には、ミナミダラ、ノーザンブルーホワイティング、スケトウダラ、キングクリップ、メルルーサ、マダラ、ホキ等が例示される。
本発明の魚肉蛋白質は医薬品のように強力な効果や副作用を有するものではないので、1日の摂取量に制限はない。白身魚の魚肉蛋白質は色も白く、魚臭さも強くないので、種々の食品に添加して摂取することができる。また、粉末、顆粒、錠剤、カプセルのような形態のサプリメントとして摂取しても良い。
ラット等の動物試験の結果から、ヒトにおける用法用量を換算する場合、医薬品のような場合に比べ、熱量換算が必要な三大栄養素について実験動物とヒトを比較する事は容易ではない。一般的には、一日総摂取量に占める割合で換算する方法と寿命で換算することが行われている。一日総摂取量に占める割合で換算する方法によれば、ヒトでは体重kgあたり1gのタンパク質の摂取が標準なので、本実施例のラットの飼料中のタンパク質をすべてタラ類のタンパク質で置換しているような場合、ヒトの場合では、１日あたり１ｇ／ｋｇのタラ類のタンパク質を摂取することに相当すると考える。ヒトの体重が４０〜８０ｋｇだとすれば、１日当たり４０〜８０ｇのタラ類タンパク質を摂取するということになる。寿命により換算する方法によれば、ラットの寿命は２−３年、ヒトの寿命は６０−９０年であるから、ヒトではラットの１／３０摂取すればよいと考える。ラットでは１日の飼料摂取量は０．１ｇ／ｇ体重程度とされており、本実施例の飼料中のタンパク質は２８％程度なので、ヒトでは、その１／３０である、１日０．９３ｇ／ｋｇとなる。すなわち、ヒトの体重が４０〜８０ｋｇだとすれば、１日当たり４０〜８０ｇのタラ類タンパク質を摂取するということになる。３７−７４ｇのタラ類タンパク質を摂取するということになる。いずれの換算方法でも、1日あたり、３５−８０ｇの摂取量程度となる。これに相当する、タラ類の魚肉、脱脂タンパク質、ペプチド、アミノ酸を摂取することで内臓脂肪蓄積抑制効果が期待できる。
以下に本発明の実施例を記載するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
実施例１：マダラ、スケトウダラを原料とした魚肉蛋白質の製造
マダラの皮付きフィレ（５ｋｇ）の皮とピンボーンを除去し、1cm×6cm×8cm程度の大きさに切断した。切断した試料を凍結乾燥用トレーに一層に並べ、-30℃で４時間凍結後、凍結乾燥機にて４昼夜凍結乾燥した。凍結乾燥試料を手で軽く砕き、ブレンダーミルにて粉砕した。粉砕した凍結乾燥試料にｎ−ヘキサン約３Ｌを加え、４５分間攪拌し、脂溶性成分を溶出させ、3L容ロビン、9cm径部ブフナーロートを用いて、ｎ−ヘキサンを吸引ろ過し、ｎ−ヘキサンを除いた。得られた試料をろ紙上に拡げ、ドラフト内にて一昼夜乾燥し、マダラの魚肉蛋白質（８２２．９ｇ）を得た。
スケトウダラのフィレブロック５ｋｇを用いてマダラの場合と同様の方法でスケトウダラの魚肉蛋白質（９５８．９ｇ）を得た。
マダラ３ｋｇとスケトウダラ３ｋｇを原料とし、再度、上記と同様の製造方法でそれぞれ魚肉蛋白質を製造した。収量はマダラ４９７．１ｇ、スケトウダラ５６３．３ｇであり、この方法で安定して魚肉蛋白質を製造することができることを確認した。
マダラの皮付きフィレ（５ｋｇ）の皮とピンボーンを除去し、1cm×6cm×8cm程度の大きさに切断した。切断した試料を凍結乾燥用トレーに一層に並べ、-30℃で４時間凍結後、凍結乾燥機にて４昼夜凍結乾燥した。凍結乾燥試料を手で軽く砕き、ブレンダーミルにて粉砕した。粉砕した凍結乾燥試料にｎ−ヘキサン約３Ｌを加え、４５分間攪拌し、脂溶性成分を溶出させ、3L容ロビン、9cm径部ブフナーロートを用いて、ｎ−ヘキサンを吸引ろ過し、ｎ−ヘキサンを除いた。得られた試料をろ紙上に拡げ、ドラフト内にて一昼夜乾燥し、マダラの魚肉蛋白質（８２２．９ｇ）を得た。
スケトウダラのフィレブロック５ｋｇを用いてマダラの場合と同様の方法でスケトウダラの魚肉蛋白質（９５８．９ｇ）を得た。
マダラ３ｋｇとスケトウダラ３ｋｇを原料とし、再度、上記と同様の製造方法でそれぞれ魚肉蛋白質を製造した。収量はマダラ４９７．１ｇ、スケトウダラ５６３．３ｇであり、この方法で安定して魚肉蛋白質を製造することができることを確認した。
得られた魚肉蛋白質の組成分析（一般成分分析（水分、タンパク質、脂質、灰分）、全アミノ酸組成）を行った（於：日本水産式会社分析センター）。表１に一般成分分析(g/100g)の結果、表２に試料アミノ酸組成分析（試料全体に対する％）の結果を示す。
実施例２：高脂肪食を摂取させたラットにおける魚肉蛋白質投与の効果
試験方法：新潟医療福祉大学にて以下の試験を行った。
１．試験デザイン
(1)ウィスター系雄性ラット4週齢を体重が均等になるように、普通食群、高脂肪食群（ともにタンパク質成分はカゼインを使用）、高脂肪食のタンパク質成分をマダラ蛋白質、スケトウダラ蛋白質におきかえた高脂肪食＋マダラ食群、高脂肪食＋スケトウダラ食群の4群に群わけした。
(2)表３の組成を有する試料と水とを自由摂取させ、明暗時間調節動物室（AM6:00-PM6:00 明期、PM6:00-AM6:00暗期）にて4週間飼育。飼育前後および飼育期間中の体重、飼育期間中の摂食量を測定。
(3)飼育終了後、尾部より採血し、血糖値を測定。解剖し、腸管周囲、睾丸周囲、腎臓周囲の脂肪重量を測定した。動物試験において、ヒトにおいて内臓脂肪というとき腸間膜周囲の脂肪をいうが、本試験では、腸管周囲、睾丸周囲、腎臓周囲の内蔵脂肪を摘出し内臓脂肪重量とした。
２．飼料組成
飼料組成を表３に示す。飼料の計算上の各エネルギー値は、普通食3.96kcal/g、高脂肪食5.11kcal/g、高脂肪食＋マダラ食4.93kcal/g、高脂肪食＋スケトウダラ食4.87kcal/gであった。また、各飼料の一般成分分析（g/100g）の結果を表４に、アミノ酸組成分析（飼料全体に対する％）の結果を表５に示す。
試験方法：新潟医療福祉大学にて以下の試験を行った。
１．試験デザイン
(1)ウィスター系雄性ラット4週齢を体重が均等になるように、普通食群、高脂肪食群（ともにタンパク質成分はカゼインを使用）、高脂肪食のタンパク質成分をマダラ蛋白質、スケトウダラ蛋白質におきかえた高脂肪食＋マダラ食群、高脂肪食＋スケトウダラ食群の4群に群わけした。
(2)表３の組成を有する試料と水とを自由摂取させ、明暗時間調節動物室（AM6:00-PM6:00 明期、PM6:00-AM6:00暗期）にて4週間飼育。飼育前後および飼育期間中の体重、飼育期間中の摂食量を測定。
(3)飼育終了後、尾部より採血し、血糖値を測定。解剖し、腸管周囲、睾丸周囲、腎臓周囲の脂肪重量を測定した。動物試験において、ヒトにおいて内臓脂肪というとき腸間膜周囲の脂肪をいうが、本試験では、腸管周囲、睾丸周囲、腎臓周囲の内蔵脂肪を摘出し内臓脂肪重量とした。
２．飼料組成
飼料組成を表３に示す。飼料の計算上の各エネルギー値は、普通食3.96kcal/g、高脂肪食5.11kcal/g、高脂肪食＋マダラ食4.93kcal/g、高脂肪食＋スケトウダラ食4.87kcal/gであった。また、各飼料の一般成分分析（g/100g）の結果を表４に、アミノ酸組成分析（飼料全体に対する％）の結果を表５に示す。
上記試験デザインにしたがって、普通食群(７匹）、高脂肪食群(７匹）、高脂肪食＋マダラ食群(８匹）、高脂肪食＋スケトウダラ食群(８匹）で行った試験結果を以下に示す。
(1)体重とエネルギー摂取量
各群の飼育前後の体重及び、総エネルギー摂取量、血糖値、内蔵脂肪重量を表６に、飼育前後の体重と総エネルギー摂取量を図1に示した。内蔵脂肪重量は、腸管周囲、睾丸周囲、腎臓周囲の合計量を示した。飼育前の体重は各群平均で、普通食群66.3g、高脂肪食群65.0g、高脂肪食＋マダラ食群66.3g、高脂肪食＋スケトウダラ食群65.8gであり、4週間の飼育後、絶食前では、それぞれ各群平均で256.7g、262.9g、261.5g、260.3gであった。また、各群平均の総エネルギー摂取量は、それぞれ1957.5kcal、 1950.0kcal、 1955.2kcal、 2050.3kcalであり、群間に差はなく、飼料が異なることによる飼料摂取エネルギーの差は生じなかった。血糖値は高脂肪食群が普通食群に比べて高い傾向、また、高脂肪食＋マダラ食群、高脂肪食＋スケトウダラ食群が高脂肪食群に比べて低い傾向にあるが、有意差は認められなかった。
(1)体重とエネルギー摂取量
各群の飼育前後の体重及び、総エネルギー摂取量、血糖値、内蔵脂肪重量を表６に、飼育前後の体重と総エネルギー摂取量を図1に示した。内蔵脂肪重量は、腸管周囲、睾丸周囲、腎臓周囲の合計量を示した。飼育前の体重は各群平均で、普通食群66.3g、高脂肪食群65.0g、高脂肪食＋マダラ食群66.3g、高脂肪食＋スケトウダラ食群65.8gであり、4週間の飼育後、絶食前では、それぞれ各群平均で256.7g、262.9g、261.5g、260.3gであった。また、各群平均の総エネルギー摂取量は、それぞれ1957.5kcal、 1950.0kcal、 1955.2kcal、 2050.3kcalであり、群間に差はなく、飼料が異なることによる飼料摂取エネルギーの差は生じなかった。血糖値は高脂肪食群が普通食群に比べて高い傾向、また、高脂肪食＋マダラ食群、高脂肪食＋スケトウダラ食群が高脂肪食群に比べて低い傾向にあるが、有意差は認められなかった。
(2)内蔵脂肪重量
各群の内蔵脂肪重量を図２に示した。内臓脂肪重量は普通食群に比べて、高脂肪食群では、有意(p<0.01）に高値であった。また、高脂肪食群に比べて、高脂肪食＋マダラ食群、高脂肪食＋スケトウダラ食群は、有意に低値(p<0.03)であった。 したがって、脱脂した魚肉に由来する成分が、体脂肪の蓄積を抑制したことが明らかになった。また、体重あたりの内蔵脂肪重量として、各群を比較しても同様の結果が得られた。
各群の内蔵脂肪重量を図２に示した。内臓脂肪重量は普通食群に比べて、高脂肪食群では、有意(p<0.01）に高値であった。また、高脂肪食群に比べて、高脂肪食＋マダラ食群、高脂肪食＋スケトウダラ食群は、有意に低値(p<0.03)であった。 したがって、脱脂した魚肉に由来する成分が、体脂肪の蓄積を抑制したことが明らかになった。また、体重あたりの内蔵脂肪重量として、各群を比較しても同様の結果が得られた。
(3)インスリン抵抗性
飼育終了後、解剖1日前に、各群４匹ずつを用いて、インスリン尾静注を施し、その後の時間経過に伴う血糖値を測定した。その結果を表7および図３に示した。高脂肪食＋マダラ食群、高脂肪食＋スケトウダラ食群におけるインスリン尾静注後の血糖値の上昇は、高脂肪食群のそれに比べて低く抑えられ、インスリン感受性が高く保たれていた。30分後の血糖値は、高脂肪食群に比べて、高脂肪食＋マダラ食群では有意(p<0.05)に低値を示し、60、90分後の血糖値では、高脂肪食群に比べて、高脂肪食＋スケトウダラ食群では有意(p<0.05)に低値を示した。
飼育終了後、解剖1日前に、各群４匹ずつを用いて、インスリン尾静注を施し、その後の時間経過に伴う血糖値を測定した。その結果を表7および図３に示した。高脂肪食＋マダラ食群、高脂肪食＋スケトウダラ食群におけるインスリン尾静注後の血糖値の上昇は、高脂肪食群のそれに比べて低く抑えられ、インスリン感受性が高く保たれていた。30分後の血糖値は、高脂肪食群に比べて、高脂肪食＋マダラ食群では有意(p<0.05)に低値を示し、60、90分後の血糖値では、高脂肪食群に比べて、高脂肪食＋スケトウダラ食群では有意(p<0.05)に低値を示した。
(4)褐色脂肪組織UCP-1への影響
＜方法＞
摘出した褐色脂肪組織を300mMショ糖(10mM Tris-HCl、 pH7.5、 2mMEDTAを含む)でホモジナイズし、3100ｒｐｍ、4℃、5分間遠心した。上清を12000rpm、4℃、10分間遠心し、得られた沈殿を試料とした。定法に基づき電気泳動(4-20%ゲル使用)、ウェスタンブロッティングを行った。各レーンにはタンパク量0.98μgを供した。また、1次抗体としてrabbit anti UCP-1ポリクローナル抗体（CHEMICOM、 カタログ番号AB1426）、2次抗体としてrabbit
IgG-ALP を使用した。検出したバンドは、 コンピュータソフトImageJを用いて数値化した。
＜方法＞
摘出した褐色脂肪組織を300mMショ糖(10mM Tris-HCl、 pH7.5、 2mMEDTAを含む)でホモジナイズし、3100ｒｐｍ、4℃、5分間遠心した。上清を12000rpm、4℃、10分間遠心し、得られた沈殿を試料とした。定法に基づき電気泳動(4-20%ゲル使用)、ウェスタンブロッティングを行った。各レーンにはタンパク量0.98μgを供した。また、1次抗体としてrabbit anti UCP-1ポリクローナル抗体（CHEMICOM、 カタログ番号AB1426）、2次抗体としてrabbit
IgG-ALP を使用した。検出したバンドは、 コンピュータソフトImageJを用いて数値化した。
＜結果＞
UCP-１のウエスタンブロッティングの結果および数値化した値を図４に示した。普通食群、高脂肪食群に比べて、高脂肪食+マダラタンパク質群、高脂肪食+スケトウダラタンパク質食群で多い傾向がみられた。UCP-1の活性の上昇は代謝の亢進を示唆する。したがって、タラタンパク質群における内臓脂肪蓄積の抑制は、代謝の亢進によると考えることができる。
UCP-１のウエスタンブロッティングの結果および数値化した値を図４に示した。普通食群、高脂肪食群に比べて、高脂肪食+マダラタンパク質群、高脂肪食+スケトウダラタンパク質食群で多い傾向がみられた。UCP-1の活性の上昇は代謝の亢進を示唆する。したがって、タラタンパク質群における内臓脂肪蓄積の抑制は、代謝の亢進によると考えることができる。
（５）肝臓酵素活性への影響
＜方法＞
１）肝臓のホモジネート作成：凍結保存しておいた肝臓を液体窒素下で採取し、肝臓3gあたり20mlの0.25Mショ糖、1mMEDTA、3mM Tris-HCl (pH7.2)でホモジナイズした。ホモジネートを500ｇ、4℃、10分間遠心し、その上清を9000g4℃、10分間遠心し、上清を試料とした。Bradford法にて試料の蛋白量を測定した。
２）脂肪酸合成酵素の測定：分光光度計の測定用セルに0.4mMEDTAを含む0.2Mリン酸カリウム緩衝液(pH7.0) 500μl、10mMアセチルCoA(/2mM HCl ) 20μl、10mM
NADPH(/精製水) 30μl、肝臓ホモジネート50μl、精製水330μlを入れよく混ぜ、30℃に保温した恒温セルホルダー（分光光度計U-3010）に装着した。340nmの波長でブランク反応を2分間測定し、測定値が一定の値を示すようになってから、ゼロ調整をした。その後、10mMマロニルCo-A 20μｌを加え反応を開始した。続いて、3分間測定を継続し、 反応開始後、90秒から120秒まで30秒間の測定値の差を測定した。
３）グルコース-6-リン酸脱水素酵素活性の測定：同仁化学キット（製品コード番号347-08101）を用いて測定した。
＜方法＞
１）肝臓のホモジネート作成：凍結保存しておいた肝臓を液体窒素下で採取し、肝臓3gあたり20mlの0.25Mショ糖、1mMEDTA、3mM Tris-HCl (pH7.2)でホモジナイズした。ホモジネートを500ｇ、4℃、10分間遠心し、その上清を9000g4℃、10分間遠心し、上清を試料とした。Bradford法にて試料の蛋白量を測定した。
２）脂肪酸合成酵素の測定：分光光度計の測定用セルに0.4mMEDTAを含む0.2Mリン酸カリウム緩衝液(pH7.0) 500μl、10mMアセチルCoA(/2mM HCl ) 20μl、10mM
NADPH(/精製水) 30μl、肝臓ホモジネート50μl、精製水330μlを入れよく混ぜ、30℃に保温した恒温セルホルダー（分光光度計U-3010）に装着した。340nmの波長でブランク反応を2分間測定し、測定値が一定の値を示すようになってから、ゼロ調整をした。その後、10mMマロニルCo-A 20μｌを加え反応を開始した。続いて、3分間測定を継続し、 反応開始後、90秒から120秒まで30秒間の測定値の差を測定した。
３）グルコース-6-リン酸脱水素酵素活性の測定：同仁化学キット（製品コード番号347-08101）を用いて測定した。
＜結果＞
肝臓の脂肪酸合成酵素の測定
脂肪酸合成酵素の活性測定結果を図５に示した．普通食群、高脂肪食群に比べて、高脂肪食+マダラタンパク質群、高脂肪食+スケトウダラタンパク質食群は、有意に低い値であった（図５、p<0.05）。
肝臓のグルコース-6-リン酸脱水素酵素活性測定
肝臓のグルコース-6-リン酸脱水素酵素の活性測定結果を図６に示した．高脂肪食群は普通食群に比べて有意に低く（p<0.02、図６）、高脂肪食+マダラ食群、高脂肪食+スケトウ食群は普通食群、高脂肪食群に比べて有意に低かった(p<0.01、図６)。
上記２つの酵素は脂肪酸合成に関わる酵素である。これらが低かったことから、タラタンパク食摂取群における内臓脂肪蓄積抑制に脂肪酸の合成抑制が関与していると考えられた。
肝臓の脂肪酸合成酵素の測定
脂肪酸合成酵素の活性測定結果を図５に示した．普通食群、高脂肪食群に比べて、高脂肪食+マダラタンパク質群、高脂肪食+スケトウダラタンパク質食群は、有意に低い値であった（図５、p<0.05）。
肝臓のグルコース-6-リン酸脱水素酵素活性測定
肝臓のグルコース-6-リン酸脱水素酵素の活性測定結果を図６に示した．高脂肪食群は普通食群に比べて有意に低く（p<0.02、図６）、高脂肪食+マダラ食群、高脂肪食+スケトウ食群は普通食群、高脂肪食群に比べて有意に低かった(p<0.01、図６)。
上記２つの酵素は脂肪酸合成に関わる酵素である。これらが低かったことから、タラタンパク食摂取群における内臓脂肪蓄積抑制に脂肪酸の合成抑制が関与していると考えられた。
実施例３：高脂肪食を摂取させたラットにおける魚肉蛋白質及びその他のタンパク質投与の効果
（１）試料調製
原料として、スケトウダラ（皮付きフィレを約9kg）、マグロ（キハダブロック約6kg）、トリササミ（商品名「アベドリ」6kg）を用いて以下の方法で試料を調製した。
凍結乾燥、粉砕までは、実施例１の方法に準じて行った。それぞれの凍結乾燥粉末に、表８に示す量のクロロホルム：メタノールを添加し、30分間攪拌し、溶媒を吸引ろ過により除き、得た脱脂試料をろ紙上に拡げ、ドラフト内にて一昼夜乾燥した。乾燥後、80℃で4時間加熱しさらに溶媒を除いた。
（１）試料調製
原料として、スケトウダラ（皮付きフィレを約9kg）、マグロ（キハダブロック約6kg）、トリササミ（商品名「アベドリ」6kg）を用いて以下の方法で試料を調製した。
凍結乾燥、粉砕までは、実施例１の方法に準じて行った。それぞれの凍結乾燥粉末に、表８に示す量のクロロホルム：メタノールを添加し、30分間攪拌し、溶媒を吸引ろ過により除き、得た脱脂試料をろ紙上に拡げ、ドラフト内にて一昼夜乾燥した。乾燥後、80℃で4時間加熱しさらに溶媒を除いた。
得られた脱脂試料の一般成分分析を株式会社SRLにて、全アミノ酸分析、脂質組成、脂肪酸組成を日本水産（株）食品分析センターにて測定した。それぞれの結果を表９（試料の一般成分分析（100g中）、表１０（試料の全アミノ酸分析）、表１１（試料の脂質組成）、表１２（試料の脂肪酸組成（％））に示した。なお、一般成分分析の結果では、スケトウダラ、マグロの脂質含量はソックスレー抽出法で0%であったが、食品分析センターにてBligh&Dyer法で測定したところ、脂質の残留が確認できたため、脂肪酸組成、脂質組成を行った。試料100g中に含まれるEPA（エイコサペンタエン酸）およびDHA（ドコサヘキサエン酸）は、カゼインが0.78mg、0.58mg、スケトウダラが113.29mg、168mg、マグロが24.93mg、155.30mg、トリササミが3.02mg、11.40mgであり、試料中に含まれるEPA、DHAは0.5%以下であることを確認した。
（２）飼料調製
RDI（LSG株式会社が代理店）に委託して、表１３に示す組成の飼料を製造した。一般成分分析、全アミノ酸分析、脂質組成、脂肪酸組成を日本水産（株）食品分析センターにて測定した。なお、飼料は放射線滅菌して用いた。
一般成分分析、全アミノ酸組成、脂肪酸組成についてそれぞれ表１４、１５、１６に示した。脂質組成は、いずれの飼料もトリグリセリド100%であった。これは、ほとんどが飼料中のラードあるいは、コーン油に由来するものと考えられ、試料中に検出されたコレステロール、リン脂質は微量のため飼料の組成には影響しなかったと考えられた。また、飼料中にはEPA、DHAは検出されなかった。
RDI（LSG株式会社が代理店）に委託して、表１３に示す組成の飼料を製造した。一般成分分析、全アミノ酸分析、脂質組成、脂肪酸組成を日本水産（株）食品分析センターにて測定した。なお、飼料は放射線滅菌して用いた。
一般成分分析、全アミノ酸組成、脂肪酸組成についてそれぞれ表１４、１５、１６に示した。脂質組成は、いずれの飼料もトリグリセリド100%であった。これは、ほとんどが飼料中のラードあるいは、コーン油に由来するものと考えられ、試料中に検出されたコレステロール、リン脂質は微量のため飼料の組成には影響しなかったと考えられた。また、飼料中にはEPA、DHAは検出されなかった。
（３）動物試験
日本SLC株式会社に委託して行った。飼育条件および動物は、実施例２に準じて行い、SDラットを使用した。群分けは、表１３に示す組成の飼料をそれぞれ摂取させる５群とし、それぞれ普通食群(n=7)、高脂肪食群(n=7)、高脂肪食＋スケトウダラ食群(n=7)、高脂肪食＋マグロ食群(n=8)、高脂肪食＋トリササミ食群(n=8)とした。
日本SLC株式会社に委託して行った。飼育条件および動物は、実施例２に準じて行い、SDラットを使用した。群分けは、表１３に示す組成の飼料をそれぞれ摂取させる５群とし、それぞれ普通食群(n=7)、高脂肪食群(n=7)、高脂肪食＋スケトウダラ食群(n=7)、高脂肪食＋マグロ食群(n=8)、高脂肪食＋トリササミ食群(n=8)とした。
（４）結果
１）エネルギー摂取量および飼育終了時体重
動物入荷日、群分け日、試験終了時（解剖直前）に体重を測定し、摂餌量は飼育期間中２日毎に測定した。
飼育期間中（4週間）の摂食量より算出した総エネルギー摂取量は、普通食群1259.1±537.0kcal、高脂肪食群1687.1±738.42kcal、高脂肪食＋スケトウダラ群1819.9±360.7kcal、高脂肪食＋マグロ食群2116.3±175.3kcal、高脂肪食＋トリササミ食群2085.8±222.5kcalであり、普通食群とそれ以外の群との間では当然有意差があったが(p<0.05)、普通食群以外の4群間での有意差は認められず、高脂肪食条件下でタンパク質源を置き換えた場合の摂食量に差がないことを確認した。また、飼育前の体重は、普通食群81.4±2.7ｇ、高脂肪食群81.8±2.6ｇ、高脂肪食＋スケトウダラ群81.6±2.2ｇ、高脂肪食＋マグロ食群81.6±2.5ｇ、高脂肪食＋トリササミ食群81.3±2.5ｇで、4週間飼育後の体重は、普通食群187.0±29.6ｇ、高脂肪食群248.2±40.0ｇ、高脂肪食＋スケトウダラ群186.6±60.5ｇ、高脂肪食＋マグロ食群283.3±21.5ｇ、高脂肪食＋トリササミ食群275.8±18.2ｇであり、５群間に有意な差は認められなかった。
１）エネルギー摂取量および飼育終了時体重
動物入荷日、群分け日、試験終了時（解剖直前）に体重を測定し、摂餌量は飼育期間中２日毎に測定した。
飼育期間中（4週間）の摂食量より算出した総エネルギー摂取量は、普通食群1259.1±537.0kcal、高脂肪食群1687.1±738.42kcal、高脂肪食＋スケトウダラ群1819.9±360.7kcal、高脂肪食＋マグロ食群2116.3±175.3kcal、高脂肪食＋トリササミ食群2085.8±222.5kcalであり、普通食群とそれ以外の群との間では当然有意差があったが(p<0.05)、普通食群以外の4群間での有意差は認められず、高脂肪食条件下でタンパク質源を置き換えた場合の摂食量に差がないことを確認した。また、飼育前の体重は、普通食群81.4±2.7ｇ、高脂肪食群81.8±2.6ｇ、高脂肪食＋スケトウダラ群81.6±2.2ｇ、高脂肪食＋マグロ食群81.6±2.5ｇ、高脂肪食＋トリササミ食群81.3±2.5ｇで、4週間飼育後の体重は、普通食群187.0±29.6ｇ、高脂肪食群248.2±40.0ｇ、高脂肪食＋スケトウダラ群186.6±60.5ｇ、高脂肪食＋マグロ食群283.3±21.5ｇ、高脂肪食＋トリササミ食群275.8±18.2ｇであり、５群間に有意な差は認められなかった。
摂食量に関しては、有意差はないものの、高脂肪食＋スケトウダラ群が他の群と比較して少ない傾向にあった。これは、飼育初期段階の飼育3日間の1日当たりの平均摂食量が高脂肪食＋マグロ食群、高脂肪食＋トリササミ食群で10.85g、 10.11gであるのに対し、高脂肪食＋スケトウダラ群では7.44gと少なく、飼育初期段階の摂食量の減少が飼育期間中の総エネルギー摂取量に影響したものであると考えられる。なぜならば、飼育16-19日での3日間の1日当たりの平均摂食量は、それぞれ15.77g、15.65gおよび15.08gとほぼ同等に追いついているためである。つまり、タラタンパク質の内蔵脂肪蓄積抑制効果が摂食量の差によるものではないと結論できる。
２）血糖値、血漿脂質プロフィール
試験終了時に飽食下無麻酔で尾静脈より採血し、簡易血糖測定器（ワンタッチウルトラ：Johnson&Johnson）を用いて血糖値を測定した。その後エーテル麻酔下で腹大動脈より、ヘパリン入りの採血管に全量を採血し、血漿を採取した。株式会社 SRL にて血漿中総コレステロール、HDL-コレステロール、中性脂肪を測定した。
解剖前の血糖値は、普通食群128.7±17.3mg/dl、高脂肪食群128.7±11.7mg/dl、高脂肪食＋スケトウダラ群128.6±30.1mg/dl、高脂肪食＋マグロ食群139.1±18.2mg/dl、高脂肪食＋トリササミ食群134.8±11.0mg/dlであり、５群間での有意な差は認められなかった。
血漿中総コレステロール、HDL-コレステロール、中性脂肪を測定した結果を表１７に示した。各測定項目とも普通食群と他の4群において有意な差が認められたが、普通食以外の4群間では、有意な差は認められなかった。
試験終了時に飽食下無麻酔で尾静脈より採血し、簡易血糖測定器（ワンタッチウルトラ：Johnson&Johnson）を用いて血糖値を測定した。その後エーテル麻酔下で腹大動脈より、ヘパリン入りの採血管に全量を採血し、血漿を採取した。株式会社 SRL にて血漿中総コレステロール、HDL-コレステロール、中性脂肪を測定した。
解剖前の血糖値は、普通食群128.7±17.3mg/dl、高脂肪食群128.7±11.7mg/dl、高脂肪食＋スケトウダラ群128.6±30.1mg/dl、高脂肪食＋マグロ食群139.1±18.2mg/dl、高脂肪食＋トリササミ食群134.8±11.0mg/dlであり、５群間での有意な差は認められなかった。
血漿中総コレステロール、HDL-コレステロール、中性脂肪を測定した結果を表１７に示した。各測定項目とも普通食群と他の4群において有意な差が認められたが、普通食以外の4群間では、有意な差は認められなかった。
３）内臓脂肪重量
採血後、肝臓、腸間膜周囲脂肪、腎臓周囲脂肪および睾丸周囲脂肪を採取し、湿重量を測定した。内蔵脂肪重量を図７に示した。
高脂肪食＋スケトウダラ群の内蔵脂肪重量は、高脂肪食群、高脂肪食＋マグロ食群、高脂肪食＋トリササミ食群の内臓脂肪量に比べて有意に低かった(p<0.05、図７)。
採血後、肝臓、腸間膜周囲脂肪、腎臓周囲脂肪および睾丸周囲脂肪を採取し、湿重量を測定した。内蔵脂肪重量を図７に示した。
高脂肪食＋スケトウダラ群の内蔵脂肪重量は、高脂肪食群、高脂肪食＋マグロ食群、高脂肪食＋トリササミ食群の内臓脂肪量に比べて有意に低かった(p<0.05、図７)。
４）血漿インスリン濃度
血漿インスリン濃度はシバヤギ レビス インスリンーラット(Sタイプ) (製品コード：AKRIN-010S)を使用して測定した。血漿インスリン濃度を図８に示した。
高脂肪食＋スケトウダラ群の血漿インスリン濃度は、高脂肪食群、高脂肪食＋マグロ食群、高脂肪食＋トリササミ食群のインスリン濃度に比べて有意に低かった(p<0.03、 図８)。
通常、高脂肪食では、インスリン抵抗性があがるため、血漿インスリンは上昇する。しかしながら、高脂肪食条件でタンパク質源スケトウダラに置き換えた高脂肪食＋スケトウダラ群では、高脂肪食群、高脂肪食＋マグロ食群、高脂肪食＋トリササミ食群に比べて血漿インスリン濃度が低くインスリン抵抗性を防止した。
スケトウダラ以外のタンパク質源では、効果みられなかったことから、タラタンパク質特有の作用であると思われる。
血漿インスリン濃度はシバヤギ レビス インスリンーラット(Sタイプ) (製品コード：AKRIN-010S)を使用して測定した。血漿インスリン濃度を図８に示した。
高脂肪食＋スケトウダラ群の血漿インスリン濃度は、高脂肪食群、高脂肪食＋マグロ食群、高脂肪食＋トリササミ食群のインスリン濃度に比べて有意に低かった(p<0.03、 図８)。
通常、高脂肪食では、インスリン抵抗性があがるため、血漿インスリンは上昇する。しかしながら、高脂肪食条件でタンパク質源スケトウダラに置き換えた高脂肪食＋スケトウダラ群では、高脂肪食群、高脂肪食＋マグロ食群、高脂肪食＋トリササミ食群に比べて血漿インスリン濃度が低くインスリン抵抗性を防止した。
スケトウダラ以外のタンパク質源では、効果みられなかったことから、タラタンパク質特有の作用であると思われる。
５）血漿アディポネクチン濃度
血漿アディポネクチン濃度は大塚製薬株式会社 マウス/ラットアディポネクチンELISAキット(カタログ番号：410713)を使用して測定した。血漿アディポネクチン濃度を図９に示した。高脂肪食＋スケトウダラ群の血漿アディポネクチン濃度は、高脂肪食群、高脂肪食＋マグロ食群、高脂肪食＋トリササミ食群の血漿アディポネクチン濃度に比べて有意に高かった(p<0.05、 図９)。これは、高脂肪食＋スケトウダラ群がインスリン抵抗性を防止している理由の１つとして考えられる。
血漿アディポネクチン濃度は大塚製薬株式会社 マウス/ラットアディポネクチンELISAキット(カタログ番号：410713)を使用して測定した。血漿アディポネクチン濃度を図９に示した。高脂肪食＋スケトウダラ群の血漿アディポネクチン濃度は、高脂肪食群、高脂肪食＋マグロ食群、高脂肪食＋トリササミ食群の血漿アディポネクチン濃度に比べて有意に高かった(p<0.05、 図９)。これは、高脂肪食＋スケトウダラ群がインスリン抵抗性を防止している理由の１つとして考えられる。
６）肝臓の脂肪酸合成酵素活性測定
肝臓の脂肪酸合成酵素の測定は実施例２の方法に準じて行った。
脂肪酸合成酵素の測定結果は、30秒間あたりの340nmOD値の変化で、普通食群は0.028±0.01、高脂肪食群は0.018±0.00、高脂肪食＋スケトウダラ群は0.017±0.01、高脂肪食＋マグロ食群は0.021±0.00、高脂肪食＋トリササミ食群は0.012±0.00であり、高脂肪食＋トリササミ食群はいずれの群と比較しても有意に低い(p<0.02)値となり、また、普通食群に比べ高脂肪食群、高脂肪食＋スケトウダラ群、高脂肪食＋マグロ食群は有意に低い値(p<0.05)となったが、高脂肪食群、高脂肪食＋スケトウダラ群、高脂肪食＋マグロ食群の3群間では、有意な差は認められなかった。
肝臓の脂肪酸合成酵素の測定は実施例２の方法に準じて行った。
脂肪酸合成酵素の測定結果は、30秒間あたりの340nmOD値の変化で、普通食群は0.028±0.01、高脂肪食群は0.018±0.00、高脂肪食＋スケトウダラ群は0.017±0.01、高脂肪食＋マグロ食群は0.021±0.00、高脂肪食＋トリササミ食群は0.012±0.00であり、高脂肪食＋トリササミ食群はいずれの群と比較しても有意に低い(p<0.02)値となり、また、普通食群に比べ高脂肪食群、高脂肪食＋スケトウダラ群、高脂肪食＋マグロ食群は有意に低い値(p<0.05)となったが、高脂肪食群、高脂肪食＋スケトウダラ群、高脂肪食＋マグロ食群の3群間では、有意な差は認められなかった。
６）肝臓のグルコース-6-リン酸脱水素酵素活性測定
肝臓のグルコース-6-リン酸脱水素酵素活性の測定は実施例２の方法に準じて行った。
肝臓のグルコース-6-リン酸脱水素酵素活性測定結果を図１０に示した。高脂肪食＋スケトウダラ群、高脂肪食＋マグロ食群、高脂肪食＋トリササミ食群は普通食群に比べて有意に低い値であった（図１０、p<0.01）。また、高脂肪食＋トリササミ食群は、高脂肪食群に比べ有意に低い値であった（図１０、p<0.01）が、高脂肪食群、高脂肪食＋スケトウダラ群、高脂肪食＋マグロ食群の3群間では、有意な差は認められなかった。
肝臓のグルコース-6-リン酸脱水素酵素活性の測定は実施例２の方法に準じて行った。
肝臓のグルコース-6-リン酸脱水素酵素活性測定結果を図１０に示した。高脂肪食＋スケトウダラ群、高脂肪食＋マグロ食群、高脂肪食＋トリササミ食群は普通食群に比べて有意に低い値であった（図１０、p<0.01）。また、高脂肪食＋トリササミ食群は、高脂肪食群に比べ有意に低い値であった（図１０、p<0.01）が、高脂肪食群、高脂肪食＋スケトウダラ群、高脂肪食＋マグロ食群の3群間では、有意な差は認められなかった。
本発明の組成物は、各種生活習慣病との関連が大きいと考えられている内臓脂肪の蓄積を抑制する効果を有する。肥満、特に内臓脂肪の蓄積が気になる人に、本発明の組成物を添加した食品や本発明の組成物を含有するサプルメントを提供することができる。
Claims (9)
- 魚肉蛋白質、魚肉ペプチド、及び／又は、魚肉アミノ酸を含有する内臓脂肪蓄積抑制作用を有する組成物。
- 魚肉蛋白質、魚肉ペプチド、及び／又は、魚肉アミノ酸が、魚肉蛋白質そのまま、脱脂したもの、または、蛋白分解酵素により分解したもののいずれかである請求項１の内臓脂肪蓄積抑制作用を有する組成物。
- 魚肉が白身魚の魚肉である請求項１又は２の内臓脂肪蓄積抑制作用を有する組成物。
- 魚肉がタラ類魚肉である請求項１又は２の内臓脂肪蓄積抑制作用を有する組成物。
- 請求項１ないし４いずれかの組成物を含有する内臓脂肪蓄積抑制機能を有する機能性食品。
- 請求項１ないし４いずれかの組成物を添加した内臓脂肪蓄積抑制機能を有する機能性食品。
- 添加される側の食品が魚肉を含まない食品である請求項６の機能性食品。
- 請求項１ないし４いずれかの組成物を継続して摂取させることにより内臓脂肪蓄積を抑制させる方法。
- 請求項１ないし４いずれかの組成物の内臓脂肪蓄積抑制作用を有する機能性食品への使用。
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| JPN6012067936; 岡 弘康ら: 'バイオテクノロジー利用による新製品の開発研究 魚肉ペーストの製法（第３報）' 愛媛県工業技術センター業務年報 , 1987, ｐ．１１１-１１５ * |
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